CN114875128A - 与皮肤修复相关的miRNA标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种与皮肤修复相关的miRNA标志物及其应用，本发明开发了基于实时定量PCR技术的组织miRNA的两步法检测试剂、试剂盒和检测方法。本发明所述miRNA包括miR‑7a‑5p、miR‑335‑5p和miR‑501‑3p中的一种或多种。所述试剂盒含有检测上述miRNA的探针组合，本发明所述miRNA可作为标志物用于皮肤修复过程研究、皮肤修改相关药物筛选，也可以作为标志物用于检测皮肤炎症和细胞凋亡。本发明提供的检测试剂盒和检测方法具有使用样本量小，自动化程度高，特异性好的优点，结合其他检测指标和临床症状，可显著提高检测效率，便于皮肤外伤修复药物的批量筛选及临床检测使用。

Description

与皮肤修复相关的miRNA标志物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言本发明提供了与皮肤修复相关的miRNA标志物、及其在皮肤修复过程检测、相关药物筛选中应用，以及相关的miRNA检测试剂、试剂盒。
背景技术
皮肤由表皮、真皮、皮下组织和皮下附属器4个部分组成，是保护人体不受外来有害因素损害的天然屏障，也是人体的第一道防线。皮肤的重量达人全身体重的5％～15％，而皮肤的全部面积可达1.5～2平方米。日常生活中，皮肤外伤、皮肤疾病、大面积烧伤、慢性溃疡或者手术创伤的皮肤缺损经常会导致化脓、疼痛、肿痛等状况，影响病患的工作及生活质量，严重时还会引发败血症、破伤风等疾病，对患者的生命健康造成威胁。
皮肤受损后，正常的创面修复过程通常会经历以血小板聚集活化的凝血阶段、以炎性细胞浸润吞噬细胞碎片和细菌为主的炎症阶段，还有以再上皮化、肉芽组织形成为主的增殖阶段和细胞外基质重塑阶段。皮肤创伤的修复是一个连续且相互重叠的过程，创面修复时，成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞等不同细胞分泌多类型的细胞因子，有序实现细胞的增殖、迁移和凋亡等程序，同时维持细胞外基质的沉积与降解之间的动态平衡，最终实现创面的愈合。
MicroRNA（miRNA）是一类高度保守的非编码单链RNA分子，长度约22个核苷酸，由较长的双链前体miRNA（pre-miRNA）经核糖核酸酶III Dicer处理而成。miRNA可通过靶向结合信使RNA（mRNA）并使其降解或抑制其翻译，实现转录后基因表达调控。miRNA作为基因表达的重要调控分子，几乎参与了机体所有的生理和病理过程，如炎症、脂代谢、自噬等。近年多项研究结果显示，miRNA 参与调控皮肤及其附属器的形成和稳态，且与皮肤再生修复密切相关。皮肤创面愈合的不同阶段中miRNA的表达各不相同，miRNA的异常表达可能会导致创面的畸形愈合。
由于miRNA 在维持皮肤正常结构功能及创面再生修复过程中的重要作用，寻找在创面再生修复不同阶段与正常皮肤之间存在差异表达的miRNA，并建立相应的检测体系，不仅可以明确这些特异性的miRNAs在皮肤创面愈合中的作用，还能为其调控机制的研究提供基础，同时为皮肤创面愈合药物的筛选和评价提供靶点。
发明内容
本发明旨在提供一种皮肤修复相关的miRNA组合及其应用，以及相关的检测试剂、试剂盒。从而为解决本领域中皮肤修复、皮肤创面愈合中过程的监控、相关药物研发、皮肤炎症和细胞凋亡诊断相关问题提供解决方案。
为实现上述申请目的，本发明结合结合miRNA的特点，检测皮肤受损后，正常的创面修复过程的凝血阶段、炎症阶段、增殖阶段和重塑阶段中miRNA的表达情况进行检测，筛选出了与皮肤外伤修复相关的miRNA分子标志物。
在一个方案中，本发明提供的miRNA分子可以作为标志物用于皮肤修复过程检测，所述miRNA分子为miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p中的一种或多种。
在一个方案中，本发明提供了miRNA分子作为靶标在皮肤修复相关药物筛选中的应用，所述miRNA分子为miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p中的一种或多种。所述药物通过调控或影响miRNA分子miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p中的一种或多种的表达，进而影响皮肤的创伤修复，所述药物可以是化学药、生物药、小分子药物、生物药物药物可以是蛋白、抗体、核酸分子例如DNA、RNA分子。
在一个方案中，本发明提供了miRNA分子作为皮肤炎症和细胞凋亡标志物的应用，其特征在于：所述miRNA分子为miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p中的一种或多种。通过检测miRNA的表达进而判断皮肤的炎症程度、皮肤是否恶化、皮肤细胞凋亡程度，指示皮肤修复过程的和皮肤修复程度、进程的好与不良。
在一个方案中，本发明提供了miRNA分子在制备皮肤修复过程检测试剂、皮肤炎症和细胞凋亡诊断试剂中的应用，所述miRNA分子为miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p中的一种或多种。
在一个方案中，本发明提供了miRNA分子在制备皮肤修复过程检测试剂盒、皮肤炎症和细胞凋亡诊断试剂盒中的应用，所述miRNA分子为miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p中的一种或多种。
在一个方案中，本发明述试剂/试剂盒为基于PCR平台进行分子生物检测的试剂/试剂盒，PCR平台的检测技术包括常规PCR检测方法、荧光定量PCR、数字PCR、环介导等温扩增技术等。优选的，本发明的相关试剂/试剂盒为miRNA两步法检测试剂/试剂盒。
在一个方案中，本发明所述试剂/试剂盒包括miRNA分子特异性茎环结构转录引物、看家基因转录引物、探针序列、PCR正向引物引物、PCR通用下游引物；优选的所述看家基因为U6。
本发明的试剂盒还可以包括PCR反应常用试剂，例如转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，无RNA酶的水和Taq DNA聚合酶。
在一个方案中，本发明所述的miRNA分子为miR-7a-5p，或miR-335-5p，或miR-501-3p，或miR-7a-5p与miR-335-5p联合，或miR-7a-5p与miR-501-3p联合，或miR-335-5p与miR-501-3p联合，或miR-7a-5p、miR-335-5p与miR-501-3p联合；其中所述的miRNA分子的序列分别为：
所述miR-7a-5p的序列为 UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU（SEQ ID NO.1）；
所述miR-335-5p的序列为 UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU（SEQ ID NO.2）；
所述miR-501-3p的序列为AAUGCACCCGGGCAAGGAUUUG（SEQ ID NO.3）。
本发明所述看家基因U6选自以下的序列：
UGCUCGCUUCGGCAGCACAUAUACUAAAAUUGGAACGAUACAGAGAAGAUUAGCAUGGCCCCUGCGCAAGGAUGACACGCAAAUUCGUGAAGCGUUCCAUAUUUUUGCUGAGGCAAAUCCUCUUAAGAGGUUGUCUGGGGAUGAAUAUAAAAGAAAAUGGGUUCAGUUAGCUUCUUGGUUGUCAUCACAGAAGCAGUCAAUGAGAAGCUCCUAAAGGUAUUUUUACAAAAUUACUUCAGAGAGAGAAUAUUUAUACAAACUCCAAAGUAGGACUGAAUGUUAGAAAAAUGUAAAGUAGGGAAUAAAGCUUACUUCACUUAAAAAGUGGAAUUACUUCAAAAGGUUUUGAAGUUUAAUUGAGACAUGUAUAUAUCUCUUCUGGAGUUGGCCUGNGGUGAUUUUUAGACUAAAGCCAAGAUGAUUUUUAAUGGCAUCCUUACAGUGAUAAAGUCCUGUUCCUUUGUGUUCAAAUUAUGUCCCCUUCAUUUUUACACCUCAAAUAUGUAGAUGCUUACAAGUGAAAUGCAACUUCUCAUGUUUAUAGGUUAUACUCAGUUCCUUUGCUUACAACGAUCUCACAAGCUAAGCCAUCUUAUAU（SEQ ID NO.4）。
在一个方案中，本发明中miR-7a-5p对应的转录引物为：
5'-GACACAAGAGTCAGCTGTGCTAACTGGTGATGTGACTCTTGTGTCACAACA-3'（SEQ IDNO.5），
miR-7a-5p PCR正向引物序列为：5'-CTCGTGCATGATGGAAGACTA-3'（SEQ ID NO.6），
miR-7a-5p探针序列为：5'-FAM-CTTGTGTCACAACAAAATCAC-TAMRA-3'（SEQ IDNO.7），miR-7a-5pPCR反向引物序列为miRNA通用下游引物，5'-GCTGTGCTAACTGGTGATGTGACT-3'（SEQ ID NO.14）；
miR-335-5p对应的转录引物为：
5'-GACACAAGAGTCAGCTGTGCTAACTGGTGATGTGACTCTTGTGTCACATTT-3'（SEQ IDNO.8），
miR-335-5p PCR正向引物序列为5'-CTCCTCCCTATCAAGAGCAA-3'（SEQ ID NO.9），
miR-335-5p探针序列5'-FAM-CTTGTGTCACATTTTTCGTTA-TAMRA-3'（SEQ IDNO.10），
miR-335-5p反向引物序列为miRNA通用下游引物，5'-GCTGTGCTAACTGGTGATGTGACT-3'（SEQ ID NO.14）；
生物标志物miR-501-3p对应的转录引物为
5'-GACACAAGAGTCAGCTGTGCTAACTGGTGATGTGACTCTTGTGTCCAAATC-3'（SEQ IDNO.11），
miR-501-3pPCR正向引物序列为5'-CCTTCCACAATGCACCCG-3'（SEQ ID NO.12），
miR-501-3p探针序列为5'-FAM-CTTGTGTCCAAATCCTTGCC-TAMRA-3'（SEQ IDNO.13），
miR-501-3pPCR反向引物序列为miRNA通用下游引物为5'-GCTGTGCTAACTGGTGATGTGACT-3'（SEQ ID NO.14）；
看家基因U6对应的转录引物为：
5'-GACACAAGAGTCAGCTGTGCTAACTGGTGATGTGACTCTTGTGTCAAAAAT-3'（SEQ IDNO.15），
看家基因U6 PCR正向引物序列为5'-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3'（SEQ ID NO.16），
看家基因U6探针序列为5'-HEX-CGATACAGAGAAGATTAGCATGGC-BHQ1-3'（SEQ IDNO.17），
看家基因U6 PCR反向引物序列为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'（SEQ ID NO.18）。
在一个方案中，本发明提供了皮肤修复的检测试剂/试剂盒的使用方法包括：
（1）皮肤总RNA提取；
（2）cDNA合成；
（3）荧光定量PCR检测分析：每个cDNA样品设置3个重复，加样至96孔板的PCR反应板中，按照两步法进行扩增，同时以等体积的ddH2O代替cDNA进行阴性对照样本的荧光定量PCR扩增；荧光定量PCR反应程序为95℃预变性2 min；95℃变性10 sec，60℃延伸/退火20sec，共40个循环。
在一个方案中，本发明提供了一种基于miRNA双通道检测体系，所述体系包含miRNA分子标志物miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p；FAM及HEX标记的分子杂交探针；miRNA分子标志物特异性茎环结构转录引物、PCR正向引物、PCR通用下游引物。本发明的分子杂交探针不一定采用FAM、HEX，只要是能够起到标记作用的标记即可。miRNA分子转录引物、PCR正向引物、PCR通用下游引物可以根据相关的引物设计原则设计、通过分子生物学检测方法进行筛选获得。
本发明的一个方面，本发明的miRNA分子源于皮肤组织。
本发明的一个方面，本发明的试剂/试剂盒中还包括核酸提取试剂。
本发明的一个方面，本发明的核酸提取试剂包括Trizol试剂。
本发明的一个方面，本发明的试剂/试剂盒中包括核酸检测试剂，所述核酸检测试剂含有转录缓冲液、转录酶、PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs中的至少一种。
本发明的一个方面，本发明的试剂/试剂盒还包括PCR反应常用试剂，包括转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，无RNA酶的水和TaqDNA聚合酶，miRNA分子标志物特异性茎环结构转录引物、PCR正向引物，PCR通用下游引物、用于检测miRNA分子标志物的探针等。本发明的miRNA检测试剂/试剂盒还包括相应的纸质的或电子的说明书，指示如何进行检测、筛选和评估。
本发明的一个方面，本发明检测皮肤外伤炎症和细胞凋亡的步骤如下：
（1）皮肤样本采集：采集不同外伤阶段的皮肤样本；
（2）从受试皮肤组织样本中提取总RNA；
（3）总RNA的转录；
（4）采用实时荧光定量PCR方法检测作为检测标志物的miRNA和看家基因U6,所述miRNA为miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p中的一种或多种。
本发明的一个方面，本发明的特异性茎环结构转录引物茎部的loop环部设计非连续互补碱基对GACACAAGAGTCA与TGACTCTTGTGTC构成钥匙状结构，转录反应时通过转录引物3´粘性末端与靶miRNA3´末端借助氢键相连。
本发明的一个方面，本发明的试剂盒为基于PCR平台miRNA的两步法检测试剂盒，包括以下组分：
转录引物：利用特异性的转录引物结合了茎环引物（Stem-loop RT-PCR）法和key-like法的设计优点：（1）Stem-loop RT转录引物颈部Stem碱基对延长；（2）Stem的3′末端与目标miRNA的3′末端有6个碱基完全互补，miRNA与转录引物无需通过酶连接既可高效结合，增加了转录反应的效率及特异性；（3）本发明的Stem-loop RT引物对miRNA的转录产物也可用于SybrGreenⅠ法PCR检测。
PCR正向及反向引物：正向引物长度为22~24 bp，与目标miRNA一致的序列长度超过10 bp，正向引物的5′端加有长度为12nt随机序列，确保最终形成的引物长度在20~22bp，每条正向引物的Tm值约为50.9 ℃，不同的正向引物可以与相同序列的反向引物进行组合，检测特定miRNA的转录产物，确保了每个miRNA的上、下游引物结合效率及后续扩增效率的一致性。
探针：本发明采用Taqman技术的设计方法，设计一条与特定miRNA的转录产物部分序列互补的特异性水解探针，增强检测的特异性。
本发明的一个方面，本发明皮肤修复包括各种因素引起的皮肤损伤修复、例如皮肤创伤、烫伤、放射性损伤、化学溶剂损伤、微生物感染损伤、光损伤。
有益效果：
(1)本发明阐明了与皮肤修复相关的miRNA分子标志物、为在皮肤修复过程研究提供了指示标记、为皮肤修复相关药物筛选提供了靶标；本发明的还未皮肤外伤炎症和细胞凋亡研究和探索提供了相关标志物，为皮肤修复机理的研究以及皮肤修复治疗提供基础。
（2）本发明对现有检测方法进行了优化改进，开发出基于PCR平台皮肤组织miRNA两步法的相对定量检测试剂盒，可根据检测的目的选择相应的检测靶标进行定量检测，仅需少量样品即可快速、准确地完成靶标分子的定量检测，对皮肤外伤修复药物进行评价，或对皮肤外伤炎症和细胞凋亡进行辅助诊断或检测。与目前miRNA检测常用的进口试剂盒相比，本发明试剂成本大幅降低，自动化程度高，准确率高，具有巨大的现实意义和实用价值。
附图说明：
图1：为本发明miRNA检测的方法示意图
图2：为本发明实施例提供的转录引物Stem-loop结构1的二级结构图。
图3：为本发明实施例提供的转录引物Stem-loop结构2的二级结构图。
图4：为本发明实施例提供的转录引物Stem-loop结构3的二级结构图。
图5：为本发明实验例提供的miR-7a-5p3种不同Stem-loop结构转录引物产物的实时定量PCR融解曲线分析结果，从上至下分别为Stem-loop结构1、Stem-loop结构2和Stem-loop结构3的结构转录引物产物的实时定量PCR融解曲线分析结果。
图6：为本发明实验例提供的miR-335-5p 3种不同Stem-loop结构转录引物产物的实时定量PCR融解曲线分析结果，从上至下分别为Stem-loop结构1、Stem-loop结构2和Stem-loop结构3的结构转录引物产物的实时定量PCR融解曲线分析结果。
图7：为本发明实验例提供的miR-501-3p 3种不同Stem-loop结构转录引物产物的实时定量PCR融解曲线分析结果，从上至下分别为Stem-loop结构1、Stem-loop结构2和Stem-loop结构3的结构转录引物产物的实时定量PCR融解曲线分析结果。
图8：为本发明实验例提供的miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p在不同创口造模样品正常生理条件（第0天），皮肤外伤的炎症阶段（第7天）、增殖阶段（第14天）和重塑阶段（第21天）miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p相对表达量的方差分析结果。
具体实施方式
本发明中所用的所有科学和技术用语，除非另有说明，具有本领域技术人员通常理解的含义。下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中具体实验操除非具体说明，未注明具体条件者，均采用本领域技术人员所知的常规操作和程序，或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例涉及的核苷酸序列如下表1-表2所示
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表1 本发明的miRNA和看家基因U6的序列
Figure 162071DEST_PATH_IMAGE002
表2 本发明的miRNA和看家基因U6的相关引物
实施例1：皮肤损伤造模与皮肤采集
选取体重相近的成年雌性小鼠9只，分为3组，分别使用打孔器对小鼠背部皮肤进行创口的造模，采集皮肤作为0天的样品。之后分别在创口造模的第7天，14天，21天对这3组小鼠的伤口边缘皮肤进行采集。皮肤采集完成后经液氮速冻转移至-80℃保存，直至进行RNA的提取。
实施例2：皮肤总RNA提取
取50~100mg皮肤样品，加入6粒直径为2mm和2粒直径为5mm的金属球和1mLInvitrogen公司的Trizol试剂，扣紧离心管管盖后，使用净信组织研磨仪对样品进行70Hz、90s的低温研磨；研磨好的样品管于4℃冰箱放置5min后，每管加入200μL三氯甲烷，扣紧离心管管盖后，手摇震荡，4℃冰箱放置5min，4℃12000rpm离心15 min，使管内液体分为清晰的3层；准备一新的无核酸酶的1.5 mL离心管并编号，每管加入500μL异丙醇，将离心后的标本拿出，小心吸取上层透明液体500μL至对应编号的离心管中，扣紧离心管管盖后，旋涡震荡5s，4℃冰箱放置15min，于4℃12000rpm离心10 min，小心吸弃上清液；在EP管中加入1mL预冷后的75%乙醇，扣紧离心管管盖后，上下颠倒离心管以洗涤沉淀；4℃12000rpm离心5min后，吸弃上清液，并将管子再次放入离心机，4℃12000rpm离心3 min并吸弃上清；干燥3min，加8μL无酶水，扣紧离心管管盖后，旋涡震荡数秒，4℃3000rpm离心30s。吸取1μL RNA溶液，使用NanoDrop One超微量紫外分光光度计检测样品的总RNA浓度和纯度，确保获得的RNA溶液A260/A280数值在1.8~2.1之间。
实施例3：miRNA的高通量测序
miRNA的文库的构建与测序，之后进行差异表达基因的鉴定，使用 Benjamini &Hochberg 方法调整 P 值。默认情况下，将校正后的 P 值 0.05 或 0.01 设置为显着差异表达的阈值。在差异表达miRNA的靶基因候选上，采用基因本体（GO）富集分析。基于 GOseq的 Wallenius 非中心超几何分布可以调整基因长度偏差，用于 GO 富集分析。通过 KEEG通路富集预测 miRNA 的潜在功能。使用KOBAS软件测试KEGG通路中目标基因候选的统计富集。确定创面修复过程相关的候选miRNA，通过筛选确定，最终筛选发现miRNA miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p在创面的修复过程中起到了关键性的作用。
实施例4：miRNA转录引物和扩增引物的设计
参见图2-图4，设计了3种不同的茎环引物和key-like的转录引物Stem-loop结构，这3种转录引物Stem-loop结构均通过Stem-loop RT转录引物颈部Stem碱基对延长转录产物，区别在于特异性茎环结构转录引物loop环部结构和钥匙状结构在长度和序列上存在差异，但最终进行转录反应时，这些转录引物均通过3´粘性末端的6个碱基与靶miRNA3´末端通过氢键互补。其中，转录引物Stem-loop结构1转录引物长度为57bp，loop区结构长度25bp，Stem互补区域长度为13bp，最小解链自由能12.70 kcal/mol；转录引物Stem-loop结构2转录引物长度为49bp，loop区结构长度19bp，Stem互补区域长度为12bp，最小解链自由能10.43 kcal/mol；转录引物Stem-loop结构3转录引物长度为51bp，loop区结构长度19bp，Stem互补区域长度为13bp，最小解链自由能11.48 kcal/mol。
miRNA PCR正向及反向引物原则为：正向引物长度为22~24 bp，与目标miRNA一致的序列长度超过10 bp，正向引物的5′端加有长度为12nt随机序列，确保最终形成的引物长度在20~22 bp，每条正向引物的Tm值约为50.9℃，不同的正向引物可以与相同序列的反向引物进行组合，检测特定miRNA的转录产物，确保每个miRNA的上、下游引物结合效率及后续扩增效率一致。
实施例5：cDNA的合成
使用Tiosbio™ Polestar1st cDNA Synthesis Kit (gDNA removal) 的说明书进行操作，选取miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3pStem-loop结构1转录引物，miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3pStem-loop结构2转录引物，miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3pStem-loop结构3转录引物，按下表3配制反转录反应液体系，其中转录引物序列如表5所示。
Figure 535283DEST_PATH_IMAGE003
表3： cDNA反应体系
cDNA合成反应程序为：37℃ 25 min，85℃ 5min以失活MLV。获得的产物即为转录好的cDNA，可于-20℃冻存，或是直接进行荧光定量PCR。
荧光定量PCR：每个cDNA样品设置3个重复，加样至96孔板的PCR反应板中，按照两步法进行扩增。同时以等体积的ddH2O代替cDNA进行阴性对照样本的荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR反应程序为95℃预变性2 min；95℃变性10 sec，60℃延伸/退火20 sec，共40个循环。
使用TORIVD公司的SYBR Green qPCR master Mix反应试剂（货号QST-100）进行Sybr法的荧光定量PCR反应，反应体系如表4所示，其中相关的扩增引物序列如表5所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE005A
表4： 荧光定量PCR反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE006
表5：正向扩增引物、不同Stem-loop结构的转录引物、通过反向扩增引物
实施例6：Stem-loop结构转录引物的筛选
使用未修饰的miRNA通用正向扩增引物，及与转录产物对应的反向扩增引物进行实时定量PCR，获得同一个miRNA的不同Stem-loop结构转录引物的不同转录产物，并进行Sybr Green法的实时定量PCR检测，分析各自扩增产物的融解曲线（参见图5-图7），同时对扩增产物进行克隆测序。
Stem-loop结构筛选标准为，①该结构Stem-loop转录产物可使用未修饰的miRNA通用正向扩增引物和与Stem-loop结构转录引物对应的未修饰的通用反向扩增引物进行扩增，并形成的单一的扩增产物，即扩增产物的实时定量PCR融解曲线为尖锐的单峰；②扩增产物测序结果和预期序列完全一致。确定符合这两个标准的即为适用于该miRNA检测的Stem-loop结构转录引物。
实施例7：双体系实时定量PCR检测
经过筛选确定Stem-loop结构转录引物3为最佳转录引物，并使用与该转录引物配套的修饰引物体系进行创口造模样品正常生理条件（第0天），皮肤外伤的炎症阶段（第7天）、增殖阶段（第14天）和重塑阶段（第21天）miR-7a-5p、miR-335-5p与miR-501-3p的相对定量分析。
荧光定量PCR：每个cDNA样品设置3个重复，加样至96孔板的PCR反应板中，按照两步法进行扩增。同时以等体积的ddH2O代替cDNA进行阴性对照样本的荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR反应程序为95℃预变性2 min；95℃变性10 sec，60℃延伸/退火20 sec，共40个循环。
使用TORIVD公司的5G qPCR Premix反应试剂（货号QPT-200）进行Taqman法的荧光定量PCR反应，反应体系如下：
Buffer 5μL
目的miRNA通用正向扩增引物 0.5μL
目的miRNA探针 0.2μL
miRNA Stem-loop结构3对应的通用反向扩增引物 0.5μL
内参U6正向扩增引物 0.5μL
内参U6探针 0.2μL
内参U6反向扩增引物 0.5μL
cDNA 0.8μL
补足H<sub>2</sub>O至 10μL
通过荧光定量PCR扩增，获得每个样品miR-7a-5p、miR-335-5p与miR-501-3p和U6的CT值，并按所检测miRNA计算出相应的表达量，并进行不同创口造模样品正常生理条件（第0天），皮肤外伤的炎症阶段（第7天）、增殖阶段（第14天）和重塑阶段（第21天）miR-7a-5p、miR-335-5p与miR-501-3p相对表达量的方差分析。
参见图8，定量结果显示，miR-7a-5p在皮肤外伤的炎症阶段（第7天）和重塑阶段（第21天）的表达量显著高于正常生理条件下的表达（p<0.05）；miR-335-5p在皮肤外伤的炎症阶段（第7天）和增殖阶段（第14天）的表达量显著高于正常生理条件的表达（p<0.05）；miR-501-3p在发生皮肤创伤的炎症阶段（第7天）和重塑阶段（第21天）的表达量显著高于正常生理条件的表达（p<0.05）。
综上所述，本发明通过研究发现皮肤中miR-7a-5p、miR-335-5p与miR-501-3p的相对达量与创伤愈合过程密切相关，可作为皮肤外伤修复过程研究的标志物，或作为皮肤修复相关药物筛选的靶标，或为皮肤外伤炎症和细胞凋亡提供标志物，本发明提供的检测引物等具有较好的检测准确性。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.miRNA分子作为标志物在皮肤修复过程检测中的应用，其特征在于：所述miRNA分子为miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p中的一种或多种。
2.miRNA分子作为靶标在皮肤修复相关药物筛选中的应用，其特征在于：所述miRNA分子为miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p中的一种或多种。
3.miRNA分子作为皮肤炎症和细胞凋亡标志物的应用，其特征在于：所述miRNA分子为miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p中的一种或多种。
4.miRNA分子在制备皮肤修复过程检测试剂、皮肤炎症和细胞凋亡诊断试剂中的应用，其特征在于：所述miRNA分子为miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p中的一种或多种。
5.miRNA分子在制备皮肤修复过程检测用试剂盒、皮肤炎症和细胞凋亡诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述miRNA分子为miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p中的一种或多种。
6.根据权利要4或权利要求5所述的应用，所述试剂/试剂盒为基于PCR平台miRNA两步法检测试剂/试剂盒。
7.根据权利要4或权利要求5所述的应用，所述试剂/试剂盒包括miRNA分子特异性茎环结构转录引物、看家基因U6转录引物、探针序列、PCR正向引物引物、PCR反向引物、PCR通用下游引物；其中，
miR-7a-5p对应的转录引物如SEQ ID NO.5所示，miR-7a-5pPCR正向引物序列如SEQ IDNO.6所示，miR-7a-5p探针序列如SEQ ID NO.7所示；
miR-335-5p对应的转录引物为如SEQ ID NO.8所示，miR-335-5p PCR正向引物序列如SEQ ID NO.9所示，miR-335-5p探针序列如SEQ ID NO.10所示；
miR-501-3p对应的转录引物如SEQ ID NO.11所示，miR-501-3pPCR正向引物序列为如SEQ ID NO.12所示，miR-501-3p探针序列为如SEQ ID NO.13所示，
miRNA分子miR-7a-5p、miR-335-5p和miR-501-3p的PCR反向引物序列为miRNA PCR通用下游引物，所述miRNA PCR通用下游引物序列如SEQ ID NO.14所示；
看家基因U6对应的转录引物如SEQ ID NO.15所示，看家基因U6 PCR正向引物序列如如SEQ ID NO.16所示，看家基因U6探针序列如SEQ ID NO.17所示，看家基因U6 PCR反向引物序列如SEQ ID NO.18所示。
8.一种基于miRNA双通道检测体系，其特征在于：所述体系包含miRNA分子标志物miR-7a-5p、miR-335-5p、miR-501-3p；标记物标记的分子杂交探针；miRNA分子标志物特异性茎环结构转录引物、PCR正向引物引物、PCR通用下游引物。
9.根据权利要求1-7任一所述的应用，或权利要求8所述的体系，其特征在于：
所述miR-7a-5p的序列为UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU（SEQ ID NO.1）；
所述miR-335-5p的序列为UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU（SEQ ID NO.2）；
所述miR-501-3p的序列为AAUGCACCCGGGCAAGGAUUUG（SEQ ID NO.3）。
10.根据权利8所述的体系，其特征在于，所述标记物为荧光标记，优选所述标记为FAM、HEX标记。
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