JP6549570B2

JP6549570B2 - 膀胱癌バイオマーカー

Info

Publication number: JP6549570B2
Application number: JP2016526794A
Authority: JP
Inventors: ジーンポールティエリー; パラシャントクマー; ジャヤンタグナラトネ
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 2013-11-05
Filing date: 2014-11-05
Publication date: 2019-07-24
Anticipated expiration: 2034-11-05
Also published as: EP3066474A4; CN105899953A; US20160274113A1; EP3066474A1; EP3066474B1; US10509034B2; CN105899953B; JP2016536585A; WO2015069187A1

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2013年11月5日に出願されたシンガポール仮出願第201308203-7号の優先権の恩典を主張するものであり、その内容は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

発明の分野
本発明は、特定のバイオマーカーにおける生化学に関するものである。特に、本発明は、膀胱癌に関連したバイオマーカー、ならびに患者が膀胱がんまたは早期ステージの膀胱がんもしくは後期ステージの膀胱がんに罹患する可能性、またはその再発を示す可能性を判定するための当該バイオマーカーの使用方法に関する。

発明の背景
膀胱がん(または膀胱癌)は先進国において、特に男性の間で、高頻度に見られる。膀胱がんはまた、5番目に多いがんであり、かなりの罹患率および死亡率をもたらす。膀胱がんは、それがステージ2(T2)に達するや否や、最も攻撃的な腫瘍の一つになることで有名である。こうした腫瘍は高頻度で再発し、最終的にT2ステージに進行することがよく知られているので、早期ステージの膀胱がん(Ta、T1ステージ)患者の早期発見およびモニタリングは非常に重要である。

膀胱がんの早期発見には、確定診断のための侵襲的方法が必要である。例えば、膀胱鏡検査と細胞診は、いまだに、膀胱癌の発見と経過観察のための究極の判断基準である。しかしながら、こうした方法は、現場の小さな癌のような、特定の病変を検出することができず、患者が他の臨床的兆候を呈するたびに使用されることが多い。

非侵襲的尿検査は患者と健康管理システムの両方にとって非常に望ましいので、膀胱鏡検査などの侵襲的診断の代わりに用いるか、それを補完するために、膀胱がんバイオマーカーを開発する数多くの試みがなされている。

DNAメチル化プロファイリング、点変異およびマイクロRNAに基づいた、新たなバイオマーカーが、膀胱がんの検出に使用される多くの提案されたタンパク質バイオマーカーに加えて、確立されている。市販の尿ベースの診断用タンパク質マーカーも開発されている。しかし、これまで、当技術分野で知られている単一バイオマーカーアッセイのどれも、膀胱がんの早期発見に適切に対処していない。例えば、核マトリックスタンパク質22(NMP22)および膀胱腫瘍抗原(BTA)を測定する検査は、現在市販されており、米国食品医薬品局(FDA)によって膀胱癌診断用に承認されている。しかし、こうした検査は、特異性を欠くことが知られている単一マーカーアッセイに依存する。

当技術分野で知られている単一バイオマーカーアッセイのいずれも、膀胱がんの早期発見に適切に対処していないので、膀胱がんの早期発見に対処することができる代替アッセイを提供する必要がある。例えば、10のバイオマーカーまたは8のバイオマーカーの2つのマルチプレックスタンパク質シグネチャー(multiplex protein signature)が開発されて、当技術分野で知られている。しかしながら、これらの現在利用可能な診断マーカーアッセイのいずれも、外来診療所で日常的に使用するのに十分な感度および特異性を提供していない。

上記を考えると、代替膀胱がんタンパク質バイオマーカーを提供する必要がある。また、患者における膀胱がんの非侵襲的検出のための代替検出システムを提供する必要がある。さらに、患者が膀胱がんまたは早期ステージの膀胱がんもしくは後期ステージの膀胱がんに罹患しているか、またはその再発を示すかどうかを判定する代替方法を提供する必要がある。

一局面においては、膀胱がんタンパク質バイオマーカーが提供され、該バイオマーカーは、コロニン-1A(Coronin-1A)、アポリポタンパク質A-IV、セメノゲリン-2(Semenogelin-2)、γシヌクレインおよびDJ-1からなる群より選択される少なくとも1つである。

別の局面においては、検出システムが提供され、該システムは、a)膀胱がんに罹患している疑いがある患者からの液状サンプルを受け取るための受取セクションであって、該液状サンプルが、本開示による1つ以上のバイオマーカーを含む疑いがある、受取セクション、およびb)本開示による1つ以上のバイオマーカーを検出することができる物質(複数可)を含む検出セクション、を含む。

さらに別の局面では、患者が膀胱がんまたは早期ステージの膀胱がんもしくは後期ステージの膀胱がんに罹患しているか、またはその再発を示すかどうかを判定する方法が提供され、該方法は、本開示による1つ以上のバイオマーカーの存在を検出する段階を含む。

さらに別の局面では、本開示による検出システム、および本開示による方法を実施するために必要な物質、を含むキットが提供される。
[本発明1001]
コロニン-1A、アポリポタンパク質A-IV、セメノゲリン-2、γシヌクレインおよびDJ-1、ならびにこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1つである、膀胱がんタンパク質バイオマーカー。
[本発明1002]
早期ステージ(Ta/T1)および/または後期ステージ(T2/T3)の膀胱がんの指標となる、本発明1001の膀胱がんバイオマーカー。
[本発明1003]
サンプル中で検出されると考えられる、前記本発明のいずれかの膀胱がんバイオマーカー。
[本発明1004]
サンプルが液状サンプルである、本発明1003の膀胱がんバイオマーカー。
[本発明1005]
液状サンプルが尿または排泄された尿である、本発明1004の膀胱がんバイオマーカー。
[本発明1006]
コロニン-1A、アポリポタンパク質A-IV、セメノゲリン-2、γシヌクレインおよびDJ-1を含む、前記本発明のいずれかの膀胱がんバイオマーカー。
[本発明1007]
以下を含む、検出システム：
a)膀胱癌に罹患している疑いがある患者からのサンプルを受け取るための受取セクションであって、該サンプルが、本発明1001〜1006のいずれかの1つ以上のバイオマーカーを含む疑いがある、受取セクション、および
b)本発明1001〜1006のいずれかの1つ以上のバイオマーカーを検出することができる物質(複数可)を含む検出セクション。
[本発明1008]
検出セクションが、本発明1001〜1006のいずれかの1つ以上のバイオマーカーに結合することができるまたは特異的に結合することができる物質を含む、本発明1007の検出システム。
[本発明1009]
物質が、抗体またはその抗原結合フラグメント、相互作用性の融合タンパク質、アプタマーおよびアフィボディからなる群より選択される生物特異的捕捉試薬である、本発明1008の検出システム。
[本発明1010]
バイオチップまたはテストストリップまたはマイクロタイタープレートである、本発明1007〜1009のいずれかの検出システム。
[本発明1011]
サンプルが液状サンプルである、本発明1007〜1010のいずれかの検出システム。
[本発明1012]
患者が膀胱がんまたは早期ステージの膀胱がんもしくは後期ステージの膀胱がんに罹患しているか、またはその再発を示すかどうかを判定する方法であって、本発明1001〜1006のいずれかの1つ以上のバイオマーカーの存在を検出する段階を含む、方法。
[本発明1013]
バイオマーカーがサンプルから検出される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
サンプルが液状サンプルである、本発明1013の方法。
[本発明1015]
液状サンプルが尿または排泄された尿である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
検出が分子生物学的方法を用いて行われる、本発明1012〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
分子生物学的方法がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ウェスタンブロット、ドットブロット、質量分析法および免疫学的方法からなる群より選択される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
1つ以上のバイオマーカーが患者から得られたサンプル中に含まれるかどうかに関する表示が、対照グループとの結果の比較に基づいて行われる、本発明1012〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
対照グループが膀胱がんに罹患していない患者を含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
本発明1007〜1011のいずれかの検出システムを使用する、本発明1012〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
本発明1007〜1011のいずれかの検出システム、および
本発明1012〜1020のいずれかの方法を実施するために必要な物質
を含む、キット。

本発明は、非限定的な実施例および添付の図面と併せて検討する場合に、詳細な説明を参照してよりよく理解されるであろう。
健常者(すなわち、正常な個体)と比較したときの、Ta/T1およびT2/T3膀胱癌患者サンプルにおける(A)補体H(BTA-TRAKアッセイ)、(B)コロニン-1A、(C)アポリポタンパク質A、(D)セメノゲリン-2、(E)γ-シヌクレイン、および(F)DJ-1のmRNA発現を検証する定量的リアルタイムPCR解析の結果を示す。グラフは、各グループからの5人の対象者の、特定のマーカーの発現に関する解析データを表す。補体HのmRNA発現(BTA-TRAKアッセイ)もまた、比較基準のために検査した。すべての値は、p値≦0.05で統計的に有意である。 (A)健常者、Ta/T1(非筋肉浸潤性)およびT2/T3(筋肉浸潤性)膀胱癌患者のプールされた尿サンプル；(B)3人の健常者および11人のTa/T1(非筋肉浸潤性)膀胱癌患者の尿サンプル；または(C)3人の健常者および7人のT2/T3(筋肉浸潤性)膀胱癌患者の尿サンプルから得られたサンプルにおける本開示の5つのバイオマーカーの発現を比較するウェスタンブロット分析を示す。バイオマーカーのタンパク質発現は、補体因子HのためのBTA-TRAKアッセイと比較された。図2は、本開示のバイオマーカーが補体因子Hのための市販のBTA-TRAKアッセイに少なくとも匹敵することを示す。図3は、本開示のバイオマーカーを利用するドットブロットアッセイを用いた膀胱癌の迅速ベースの検出の結果を示す。尿サンプルは、健常者、Ta/T1(非筋肉浸潤性)およびT2/T3(筋肉浸潤性)膀胱癌患者から取得した。ドットブロットアッセイの結果は次のとおりである：健常者は検出可能なレベル(陰性；低いまたはなし)を示す；Ta/T1はマーカーの検出可能なレベル(＋)を示す；およびT2/T3は標的マーカーの高レベル(＋＋)を示す。したがって、本開示のバイオマーカーを示すことは、健常者とTa/T1(非筋肉浸潤性)およびT2/T3(筋肉浸潤性)膀胱癌患者を検出して区別する上で、補体因子Hに匹敵する。図3の続きである。図3の続きである。高グレード膀胱癌における悪性尿路上皮細胞(×20)の無秩序な増殖を示す組織学的膀胱標本染色のコレクション、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色(a)、コロニン1-A(b)、セミノゲリン-2(c)、γシヌクレイン(d)、DJ-1(e)、およびアポリポタンパク質A4(f)である。核はDAPIで対比染色され、この図では明るい色として見える。図5は、さまざまな組み合わせでの5つのバイオマーカーの診断表示である。以下のA〜Dから収集されたデータを比較するために、ROCグラフをプロットした。ROC曲線下面積(AUROC)に基づいて、感度と特異度の合計が最大となるヨーデン指標(Youden's Index)カットオフ値を各バイオマーカーおよび組み合わせたバイオマーカーについて測定した。図5は、さまざまな組み合わせでの本開示のバイオマーカーが、BTA-TRAK試験と比較して、感度および特異度試験でより良い結果を収めることを明確に示している。したがって、本開示のバイオマーカーを証明することは、膀胱癌患者のためのより高感度で特異的な試験を提供する。A. 5-バイオマーカーの組み合わせ(コロニン-1A、アポリポタンパク質A1、セメノゲリン-2、γシヌクレイン、およびDJ-1)。 B. 4-バイオマーカーの組み合わせ(コロニン-1A、アポリポタンパク質A1、セメノゲリン-2、およびγシヌクレイン)。 C. 3-バイオマーカーの組み合わせ(コロニン-1A、アポリポタンパク質A1、およびセメノゲリン-2)。 D. BTA-TRAK試験。 Ta/T1(非筋肉浸潤性)膀胱癌患者、T2/T3(筋肉浸潤性)膀胱癌患者、および健常者の尿サンプル中の、対照の補体因子Hと比較したときの、本開示の5つのバイオマーカー(コロニン-1A、アポリポタンパク質A4、セメノゲリン-2、γシヌクレイン、およびDJ-1)の発現のウェスタンブロット分析の結果の箱ひげ図(box and whisker plot)を示す。健常者の血漿中のバイオマーカーのレベルは、アルブミンに対する相対強度(log2)としても示される。結果は、健常者(n＝30)、血漿(n＝4)、Ta/T1(n＝66)、およびT2/T3(n＝28)の尿サンプルのものである。箱は、下位四分位点、中央値、および上位四分位点を表す；ひげは、最小値および最大値を示す。マン・ホイットニー検定(Mann-Whitney test)を使用して有意性を計算した。正常との比較のためのp値：*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。血漿との比較のためのp値：#p＜0.05、##p＜0.01、###p＜0.001。したがって、図6は、本開示の5つのバイオマーカーの全部のレベルが、健常者の尿サンプルまたは血漿と比較して、Ta/T1およびT2/T3の尿サンプルで有意に高いことを示している。かくして、本開示のバイオマーカーを確認することは、膀胱がんに特異的であり、かつ膀胱癌患者から得られた尿サンプルでの検出に特異的である。図7aは、健常者に対するTa/T1(非筋肉浸潤性)膀胱癌の患者および健常者に対するT2/T3(筋肉浸潤性)膀胱癌の患者における、本開示のバイオマーカーを用いたELISAの全体的な診断精度を示す受信者動作特性(Receiver Operating Characteristic: ROC)グラフを示す。このモデルは、ELISA分析から得られたデータに基づいて、非筋肉浸潤性(NMI; Ta/T1)および筋肉浸潤性(MI; T2/T3)の両方の膀胱癌を健常者から区別するためのバイオマーカー効率性を評価する。図7aは、本開示のバイオマーカーが、尿サンプルのELISA分析に使用することができる、Ta/T1(非筋肉浸潤性)膀胱癌とT2/T3(筋肉浸潤性)膀胱癌の両方のための高感度で特異的なバイオマーカーを提供することを示す。図7bは、健常者に対するTa/T1(非筋肉浸潤性)膀胱癌の患者および健常者に対するT2/T3(筋肉浸潤性)膀胱癌の患者における、本開示のバイオマーカーを用いたウェスタンブロット分析の全体的な診断精度を示す受信者動作特性(ROC)グラフを示す。このモデルは、尿サンプルのウェスタンブロットデータ分析から得られたデータに基づいて、非筋肉浸潤性(NMI; Ta/T1)および筋肉浸潤性(MI; T2/T3)の両方の膀胱癌を健常者から区別するためのバイオマーカー効率性を評価する。図7bは、本開示のバイオマーカーが、尿サンプルのウェスタンブロット分析に使用することができる、Ta/T1(非筋肉浸潤性)膀胱癌とT2/T3(筋肉浸潤性)膀胱癌の両方のための高感度で特異的なバイオマーカーを提供することを示す。健常者(n＝2)、Ta/T1(非筋肉浸潤性；NMI)膀胱癌の患者(n＝5)、およびT2/T3(筋肉浸潤性；MI)膀胱癌の患者(n＝5)における本開示の5つのバイオマーカー(ならびに対照の補体因子H)のRT-PCRを用いたmRNA発現分析の箱ひげ図を示す。バイオマーカーCt値はβ-アクチン内因性対照に対して正規化されている。健常との比較のためのp値：*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。図8は、Ta/T1(非筋肉浸潤性)膀胱癌の患者およびT2/T3(筋肉浸潤性)膀胱癌の患者から得られた尿サンプルにおける発現の有意に高い倍率変化(fold change)を、健常者のそれと比較して示す。したがって、本開示のバイオマーカーを示すことは、対象者における膀胱癌の非侵襲的検出のために使用することができる。 30人の健常者、72人の非筋肉浸潤性膀胱癌(Ta/T1)患者、および55人の筋肉浸潤性膀胱癌(T2/T3)患者由来の尿サンプルから得られたサンプルにおける本開示の5つのバイオマーカー(ならびに対照の補体因子H)の発現を比較するウェスタンブロット分析を示す。健常者、非筋肉浸潤性(NMI; Ta/T1)および筋肉浸潤性(MI; T2/T3)膀胱癌患者の各排泄尿サンプルからのタンパク質100μgをウェスタンブロットした。5つのバイオマーカーの発現を補体因子Hと比較した。各バイオマーカーの発現と血尿の間に相関があるかどうかを確立するために、各サンプルについてヒト血清アルブミンタンパク質をもウェスタンブロットした。図9は、本開示の5つのバイオマーカーのうち少なくとも3つが膀胱癌患者に存在することが一貫して見出されることを示す。したがって、本開示のバイオマーカーを証明することは、対象者における膀胱癌の非侵襲的検出のために確実に使用することができる。健常者(n＝30)、Ta/T1(n＝72)およびT2/T3(n＝55)膀胱癌の全ての尿サンプルから5つのバイオマーカーおよび補体因子Hについてプロットした、図8におけるウェスタンブロットの結果のlog2バンド強度の箱ひげ図を示す。箱は、下位四分位点、中央値、および上位四分位点を表す；ひげは、最小値および最大値を示す。マン・ホイットニー検定を使用して有意性を計算した。正常との比較のためのp値：***p＜0.001。健常者、非筋肉浸潤性(Ta/T1)および筋肉浸潤性(T2/T3)膀胱癌のサンプル中の選択されたバイオマーカーの定量化を示す代表的な質量スペクトルである。図11は、三重標識尿サンプルの分析からの潜在的なマーカーの相対的存在量vs質量電荷比(m/z)を示す。健常者の尿、Ta/T1およびT2/T3患者のサンプルに由来するそれぞれのタンパク質のペプチドは、各ピークをそれぞれ表示する矢印とテキストで示される。候補バイオマーカーは、多重ペプチド安定同位体標識(すなわち、還元ジメチル標識および質量分析法)により同定した。図12は、表6に記載するような84人の非膀胱癌患者および多様な慢性疾患を抱える患者から得られた尿サンプル中の本開示の5つのバイオマーカー(ならびに対照の補体因子Hおよび、バイオマーカー発現と血尿の間に相関があるかどうかを確立するために各サンプルについて測定された、ヒト血清アルブミン)の発現を比較するウェスタンブロット分析を示す。図12は、さまざまなタイプの慢性疾患を抱える患者(n＝120)から得られた各排泄尿サンプルからのタンパク質100μgを用いて、本開示のバイオマーカーの特異性を検証する。図12は、本開示のバイオマーカーが非膀胱癌患者から得られたサンプル中に一貫して存在しないことを示しており、したがって、膀胱癌に対する本開示のバイオマーカーの特異性を実証する。図12の続きである。他の種類のがんを患っている非膀胱がん患者から得られた尿サンプル中の本開示の5つのバイオマーカー(ならびに対照の補体因子Hおよび、バイオマーカー発現と血尿の間に相関があるかどうかを確立するために各サンプルについて測定された、ヒト血清アルブミン)の発現を比較するウェスタンブロット分析を示す。図13は、さまざまな種類のがんを患っている患者(n＝88)から得られた各排泄尿サンプルからのタンパク質100μgを用いて、本開示のバイオマーカーの特異性を検証する。図13は、本開示のバイオマーカーが他の種類の癌を患っている非膀胱癌患者から得られたサンプル中に一貫して存在しないことを示しており、したがって、膀胱癌に対する本開示のバイオマーカーの特異性を実証する。本開示の5つのバイオマーカーが膀胱癌組織に等しく豊富であることを示す、膀胱癌患者から得られた組織サンプルの免疫組織化学的染色である。したがって、本開示の5つのバイオマーカーを示すことは、膀胱癌を検出するために使用することができ、膀胱がんに特異的である。

表の簡単な説明
表1は、本開示の実験セクションの実施例1の健常者/非がん患者およびがん患者研究コホートの人口統計学的および臨床病理学的特性を示す。
表2Aは、本開示の実験セクションの実施例1のウェスタンブロットおよびドットブロット分析に用いられる抗体を示す。
表2Bは、本開示の実験セクションの実施例1の免疫組織化学的分析に用いられる抗体を示す。
表3は、本開示の実験セクションの実施例1の各患者グループで検出された尿中のマーカーの数を示す。
表4は、補体Hと比較したときの、本開示のバイオマーカーを用いた検出のウェスタンブロット分析の結果を示す。
表5は、本開示の個々のバイオマーカーおよび3つの異なる組み合わせの性能値を示す。
表6は、本開示の実験セクションの実施例2で検討された患者の臨床情報を示す。
表7は、本開示の実験セクションの実施例2に用いられる定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)用のプライマー配列を示す。
表8は、本開示の実験セクションの実施例2に記載されるウェスタンブロット、免疫染色およびELISAアッセイのために使用される抗体およびELISAキットを示す。
表9Aは、本開示の実験セクションの実施例2のTa/T1膀胱がんを診断する際の組み合わせモデルの精度の検討結果を示す。
表9Bは、本開示の実験セクションの実施例2のT2/T3膀胱がんを診断する際の組み合わせモデルの精度の検討結果を示す。
表10は、血漿中の本開示のバイオマーカーの濃度(データベースから得られたデータ)を示す。
表11は、本開示の実験セクションの実施例2の血漿および白血球中のバイオマーカーレベルのピアソン相関分析の結果を示す。
表12Aは、本開示の実験セクションの実施例2に示されるように、尿サンプルのデータ解析にELISAとウェスタンブロットの両方を用いてTa/T1を診断する際のバイオマーカーの精度および閾値の検討結果を示す。
表12Bは、本開示の実験セクションの実施例2に示されるように、尿サンプルのデータ解析にELISAとウェスタンブロットの両方を用いてT2/T3を診断する際のバイオマーカーの精度および閾値の検討結果を示す。

本発明の詳細な説明
膀胱がん(癌)は、世界中で最もよく見られる5つの悪性疾患のうちの1つである。膀胱がんの80％以上は非筋肉浸潤性(Ta/T1)であり、＞90％の5年生存率を有する。しかし、これらの病変を有する患者の約70％は、初期診断の2年以内に腫瘍の再発を生じる。治療しないまま放置すると、初期には非浸潤性の腫瘍(Ta/T1)が、顕著に減少した5年生存率を有する筋肉浸潤性の腫瘍(T2/T3)に進行することがある。この臨床観察は、膀胱がんまたは膀胱がんの再発の早期発見のための正確な診断法の開発を促す。

伝統的には、膀胱鏡検査および尿細胞診が患者における膀胱癌のための標準的な診断検査である。しかし、膀胱鏡検査は、患者を不快にさせる侵襲的な手法であり、比較的費用のかかる局所または全身麻酔を必要とし、かつ出血のために視認性が低下することがあるので感度に欠ける。また、膀胱鏡検査は、現場の小さい癌などの特定の病変を検出することができない。尿細胞診もまた、訓練を受けた細胞病理学者を検出に必要とし、低感度で高コストであるといった欠点を有する。さらに、膀胱鏡検査と尿細胞診はどちらも、患者がより進行したステージにある可能性があることを知らせる、他の臨床症状を患者が有する場合に行われるにすぎない。上述したように、治療しないまま放置すると、膀胱癌は、患者の生存率を大幅に低下させ得る、より進行したステージにエスカレートすることがある。かくして、膀胱がんを非侵襲的に検出するための代替方法を提供する必要がある。

膀胱がんの信頼できる腫瘍マーカーを検出するために、多くの努力が払われてきた。市販のアッセイに基づいたFDA承認の診断法には、膀胱腫瘍抗原(BTA-STAT)および核マトリックスタンパク質22(NMP-22)が含まれる。しかし、こうしたバイオアッセイは、その感度が限られていることで知られている。さらに、これらの公知のアッセイは、一般的に個体(対象者)間に見つかる膀胱癌の複雑さに対処することができない。

上記の問題を考慮して、本開示の発明者らは、膀胱がんのための代替のバイオマーカー(複数可)を提供することを目指してきた。これに応じて、膀胱がんタンパク質バイオマーカーが提供される。本明細書で使用する場合、用語「膀胱がん」(bladder cancer)または「膀胱癌」(bladder carcinoma)は、相互に交換可能に使用され、尿を蓄える器官である膀胱の組織に形成されるがんを意味する。本明細書で使用する用語「膀胱がん」は、移行上皮癌(通常は膀胱の内層を構成する細胞で始まるがん）、扁平上皮癌(薄い、平らな細胞で始まるがん）、および腺癌(粘液や他の体液を作って放出する細胞で始まるがん)を含むことができる。一例では、この用語は、先進国では膀胱がんの90％を占める尿路上皮癌(「移行上皮癌」、「移行膀胱癌」または「移行膀胱がん」の別名でも知られる)を指す。膀胱がんに伴う症状および予想される影響は、当技術分野でよく知られており、例えば、尿中の血液、排尿時の痛み、頻尿、または排尿することができずに尿意を感じることである。一例では、「膀胱がん」は、膀胱の内側を覆う細胞がそれらの増殖を調節する能力を失って、結果的に腫瘍を形成する細胞塊をもたらす疾患を指す。一例では、この用語は、膀胱の悪性増殖の多くのタイプを包含する。膀胱がんが広範囲の侵襲性とリスクをかかえていることは周知である。したがって、一例では、本明細書で使用する膀胱がんまたは膀胱癌は、以下の2つの主要なステージに分けることができる膀胱癌の異なるステージを指す：早期ステージまたは非筋肉浸潤性の膀胱癌(Ta/T1)および後期ステージまたは筋肉浸潤性の膀胱癌(T2/T3)。早期ステージまたは非筋肉浸潤性の膀胱癌は、次のような明確に区別されるステージを含む：Tisは、癌がその場にある(「平らな腫瘍」)と定義される；Taは、癌が非浸潤性の乳頭状であることが発見されるときである；T1は、癌が上皮下結合組織に浸潤していることが発見されるときである。後期ステージまたは筋肉浸潤性の膀胱癌は、明確に区別される3つのステージを含み、T2は、癌が筋肉に浸潤していることが発見されるときである；T3は、癌が膀胱周囲の組織(すなわち、膀胱に近い組織)に浸潤していることが発見されるときである；T4は、癌が前立腺、子宮もしくは膣などの隣接器官に、その後骨盤壁または腹壁に浸潤していることが発見されるときである。T2は2つのサブステージにさらに細分することができ、T2aは、癌が浅層筋肉(内側の半分)に浸潤していることが発見されるときであり、T2bは、癌が深部筋肉(外側の半分)に浸潤していることが発見されるときである。T3もまた、2つのサブステージにさらに細分することができ、T3aは、癌が膀胱周囲の組織に浸潤していることが顕微鏡的に発見されるときであり、T3bは、癌が膀胱周囲の組織に浸潤していることが肉眼的(膀胱外の塊)に発見されるときである。

本明細書で使用する用語「バイオマーカー」は、特定の病気または疾患の存在もしくは非存在および/または重症度を決定するために用いることができる特定の生物学的特性、生化学的特徴または様相(facet)の分子指標を指す。本開示では、用語「バイオマーカー」は、膀胱がんに関連しているポリペプチド、そのようなポリペプチドの断片または変異体を指す。ポリペプチドの変異体には、保存的アミノ酸置換の存在のために、そのアミノ酸配列が異なっているポリペプチドが含まれる。例えば、そのような変異体は、特定のポリペプチドのアミノ酸配列に対して、全配列領域にわたり少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を有する。変異体は対立遺伝子変異体、スプライス変異体、または他の種に特異的なホモログ、パラログ、もしくはオルソログであり得る。一例では、同一性パーセントは、当技術分野で公知のアルゴリズムによって決定することができる。パーセント(％)で上に記載した配列同一性の値は、好ましくは、Blastなどの当技術分野で公知のアルゴリズムを用いて決定されるべきである。

本明細書で使用する用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、交換可能に使用され、その最も広い意味では2つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣体の化合物を指す。サブユニットはペプチド結合で連結され得る。タンパク質またはペプチドは少なくとも2個のアミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限が加わることはない。本明細書で使用する用語「アミノ酸」は、天然および/または非天然もしくは合成のアミノ酸、例えばグリシンおよびD体とL体の両光学異性体、アミノ酸類似体、ならびにペプチド模倣体を指す。

一例では、本開示の膀胱がんタンパク質バイオマーカーは、コロニン-1A、アポリポタンパク質A-IV、セメノゲリン-2、γ-シヌクレインおよびDJ-1からなる群より選択されるバイオマーカーの少なくともいずれか1つを含むことができる。これら5つのタンパク質のそれぞれは重要な生物学的機能を有しており、これについては以下でさらに説明する。

コロニン-1Aは、造血系において高度に発現されており、胸腺細胞中のF-アクチン含量を調節しているタンパク質を指す。遺伝子発現研究は、リンパ腫および他の血液学的悪性腫瘍におけるその発現の変化を示している。コロニン-1Aはまた、CIS(clinically isolated syndrome)および多発性硬化症に関する新規な抗体標的として同定されている。

アポリポタンパク質A-4は、apoA-IV、apoAIV、またはapoA4の別名でも知られているが、主に腸内で合成されて、血漿中に分泌されるタンパク質を指す。アポリポタンパク質A-4は、コレステロール逆輸送経路内で脂質の吸収、輸送および代謝において中心的な役割を果たし、食後の満腹シグナル伝達因子として、および酸化防止剤として作用することができる。このバイオマーカーはまた、胃、膵臓および卵巣のがんを含めて、さまざまな種類のがんとの関連性を示す。

3番目のバイオマーカーであるγシヌクレインは、αおよびβサブタイプをも含む、タンパク質のシヌクレインファミリーの一員を指す。γシヌクレインは、進行した乳がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、肝臓がん、結腸がん、膵臓がん、および膀胱がんで見つかっており、インビトロおよび動物モデルの両方において癌の浸潤および転移を促進することが示されている。

4番目のバイオマーカーであるセメノゲリン-2は、ヒト精液の凝固物の液状化および運動精子Aの漸進的な放出に関与する分泌タンパク質を指す。セメノゲリン-2は、小細胞肺癌細胞株で検出される。

最後に、DJ-1は、PARK7(パーキンソン病7)のタンパク質産物を指し、これはアンドロゲン受容体依存性の転写を上方に調節する。DJ-1の過剰発現および腫瘍進行との相関は、乳房、肺、血液、前立腺、子宮頸部、甲状腺および膵臓の悪性腫瘍において報告されている。

以下の実験セクションに示すように、本開示の膀胱がんタンパク質バイオマーカーは、個々に、または互いに組み合わせて使用することができる。したがって、一例では、膀胱がんタンパク質バイオマーカーは、コロニン-1A、アポリポタンパク質A-IV、セメノゲリン-2、γ-シヌクレインおよびDJ-1を含むバイオマーカーのいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ全部を含むことができる。タンパク質バイオマーカーの種々の組み合わせ例は、以下の実験セクションに、例えば表9A、9Bおよび4に例示される。一例では、該バイオマーカーはコロニン-1A、アポリポタンパク質A-IV、セメノゲリン-2、γ-シヌクレインおよびDJ-1を含むことができる。別の例では、該バイオマーカーはコロニン-1A、アポリポタンパク質A-IV、γ-シヌクレインを含むことができる(例えば、図5および表5)。さらに別の例では、該バイオマーカーはコロニン-1A、アポリポタンパク質A-IV、およびDJ-1を含むことができる(例えば、表9A中)。さらに別の例では、該バイオマーカーはコロニン-1A、アポリポタンパク質A-IV、セメノゲリン-2、およびDJ-1を含むことができる(例えば、表9A中)。実験セクションに示すように、本開示のバイオマーカーは、互いに組み合わすことができ、それでもまだ膀胱がん患者の高感度で特異的な判定を提供する。本開示のバイオマーカーの組み合わせの可能性は、個体(対象者)間でかなりの遺伝的異質性と複雑な体細胞変異を有することで有名な膀胱がんの検出を確実にするので、有利である。

さらに、本開示の発明者らは、本明細書に記載のバイオマーカーが膀胱がんのさまざまなステージを示すものであることを見出した。一例では、本開示のバイオマーカーは、早期ステージ(Ta/T1)の膀胱がんの指標となり得る。例えば、表9Aおよび表12Aは、(個々に、または互いに組み合わせて使用する場合の)本開示のバイオマーカー(複数可)が、FDA承認の膀胱がんバイオマーカーである補体Hと比較して、より良好な感度、特異度および全体的精度を提供することを示している。別の例では、該バイオマーカーは後期ステージ(T2/T3)の膀胱がんの指標となり得る。表9Bおよび表12Bは、(個々に、または組み合わせて使用する場合の)本開示のバイオマーカー(複数可)が、FDA承認の補体Hと比較して、より良好な感度、特異度および全体的精度を提供することを示している。さらに別の例では、該バイオマーカーは、早期ステージ(Ta/T1)および後期ステージ(T2/T3)の膀胱がんの指標となり得る。一例では、膀胱がんの後期ステージ(T2/T3)の指標となり得るバイオマーカーは、コロニン-1A、アポリポタンパク質A4、セメノゲリン-2、γシヌクレインおよびDJ-1からなる群より選択されるバイオマーカーの少なくとも1つを含むことができる。すなわち、後期ステージ(T2/T3)の膀胱がんの指標となり得るバイオマーカーは、コロニン-1A、アポリポタンパク質A4、セメノゲリン-2、γシヌクレインおよびDJ-1を含むバイオマーカーのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ全部であり得る。別の例では、早期ステージ(Ta/T1)の膀胱がんの指標となり得るバイオマーカーは、コロニン-1A、DJ-1、γシヌクレイン、アポリポタンパク質A4、およびセメノゲリン-2からなる群より選択されるバイオマーカーの少なくとも1つであるバイオマーカーを含み得る。すなわち、早期ステージ(Ta/T1)の膀胱がんの指標となり得るバイオマーカーは、コロニン-1A、DJ-1、γシヌクレイン、およびアポリポタンパク質A4を含むバイオマーカーのうちの1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ全部を含むことができる。一例では、5つ全てのバイオマーカーが選択されて、患者の膀胱がんを検出するのに有利に使用されるであろう。なぜならば、それは、民族および国から生じる異質性に逆らうことなく、膀胱がんが個体間で広範囲に異質であるという事実に対処するからである。例えば、本開示の実施例2は、米国食品医薬品局(FDA)により承認されたことが知られている対照の補体Hと比べて、対象者の膀胱がんを検出する際の本開示のバイオマーカー(複数可)の優位性を一貫して実証した(図6、図8、表9A、表9B、表12Aおよび表12Bを参照されたい)。さらに、図6に示すように、本開示のバイオマーカー(複数可)は、膀胱がんの早期発見のために使用することができる。

本開示の実験セクションに示すように、本開示の発明者らは、本開示のバイオマーカーが本明細書に記載されるさまざまな種類のサンプル中で検出され得ることを見出した。例えば、該バイオマーカーは組織切片(例えば、図14、図4に示した組織切片)および尿サンプル(例えば、実験セクション全体、図6、図8、図9、図11、図1、図2、および図3)において明らかに検出された。したがって、本開示の一例では、本開示のバイオマーカーをサンプル中で検出することができる。例えば、サンプルは、肺、筋肉、脳、肝臓、皮膚、膵臓、胃、膀胱などの全ての適切な器官からの生検材料の組織切片であり得る。別の例では、サンプルは、以下のような体液に由来するかまたは体液を含む液状サンプルを包含し得る：全血、血清、血漿、涙、唾液、鼻液、痰、耳液、生殖器液、乳房液、乳、初乳、胎盤液、羊水、汗、滑液、腹水液、脳脊髄液、胆汁、胃液、房水、硝子体液、胃腸液、滲出液、漏出液、胸水、心嚢液、精液、上気道液、腹膜液、免疫反応の部位から採取した液体、収集部位から採取しプールした液体、気管支洗浄液、有核細胞サンプル、粘膜表面、毛髪または皮膚に関連した液体、および尿。一例では、液状サンプルは尿または排泄尿である。尿中の本開示のバイオマーカーの検出は、患者の膀胱がんの非侵襲的検出を可能にするので望ましい。また、実験セクションの実施例2では、該バイオマーカーは、検出の特異度または精度を損なうことなく、血尿をも有する患者における膀胱がんの存在を予測または検出するために使用され得ることが実証された。

別の局面では、本明細書に記載のバイオマーカーは、膀胱がんを有する患者もしくは対象者の可能性を診断する、検出する、または予測することが可能であると考えられる。したがって、本明細書に記載のバイオマーカーは、膀胱がんを有する患者の可能性を予測もしくは判定するための診断ツール、検出システム、または診断方法に組み込むことができる。

別の局面では、検出システムが提供される。本開示の検出システムは、a)膀胱癌に罹患している疑いがある患者からのサンプルを受け取るための受取セクションであって、該サンプルが、本開示の1つ以上のバイオマーカーを含む疑いがある、受取セクション、およびb)本開示の1つ以上のバイオマーカーを検出することができる物質(複数可)を含む検出セクション、を含むことができる。一例では、サンプルは、液状サンプル、例えば尿または排泄尿サンプルであり得る。

本開示のバイオマーカーの検出を助けるために、本開示の検出システムは、本開示の1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ全てのバイオマーカーに結合するまたは特異的に結合することができる物質を含むことができる。一例では、該物質は、生物特異的な捕捉試薬、例えば、該バイオマーカーおよび/またはその変異体を認識する抗体(もしくはその抗原結合フラグメント)、相互作用性の融合タンパク質、アプタマーまたはアフィボディ(3ヘリックスバンドルタンパク質ドメインに基づく非免疫グロブリン由来の親和性タンパク質である)であり得る。一例では、該物質を固相に結合させることができ、その場合、該バイオマーカーは質量分析によって検出されるか、または生物特異的捕捉試薬から該バイオマーカーを溶出し、溶出されたバイオマーカーを伝統的なMALDIもしくはSELDIで検出することによって検出され得る。別の例では、検出システムはバイオチップ、テストストリップ(試験片)、またはマイクロタイタープレートであり得る。

一例では、該抗体は、コロニン-1A、アポリポタンパク質A4、セメノゲリンII、γシヌクレイン、またはDJ-1を特異的に認識することが当技術分野で知られている抗体を含むことができる。本発明を実施するために用いることができる抗体の例には、以下の表8および表2Aに示した抗体が含まれる。一例では、該抗体またはその抗原結合フラグメントとして、以下を挙げることができる：抗コロニン-1A抗体、例えばNB110-58867 (大腸菌(E. coli)で発現され精製された全長組換えヒトコロニン-1A [UniProt# P31146]を認識する抗体、米国Novus Biologicals社製)；抗アポリポタンパク質A4抗体、例えばAB59036 (ヒトAPOA4の内部配列アミノ酸359-371に相当する合成ペプチド：

を認識する抗体、米国Abcam社製)；抗セメノゲリンII抗体、例えばAB108085 (ヒトセメノゲリンII(NP_002999)の内部アミノ酸42-91：

内の領域に相当する合成ペプチドを認識する抗体、米国Abcam社製)；抗γシヌクレイン抗体、例えばAB55424 (ヒトγシヌクレイン由来の合成ペプチドを認識する抗体、米国Abcam社製)；抗DJ-1抗体、例えばSC-27006 (ヒト起源のDJ-1のC末端に位置するペプチドに対して惹起された抗体、米国Santa Cruz社製)およびNB100-483 (ヒトPark7タンパク質のC末端部分(残基100-189間)[UniProt Q99497]に相当する合成ペプチドを認識する抗体、米国Novus Biologicals社製)など。

別の例では、検出システムは、本明細書に記載される1つ、2つ、3つ、4つまたは5つ全てのバイオマーカーを個別にまたは互いに組み合わせて検出するように構成することができる。

一例では、検出システムは、患者において膀胱がんのリスクを予測するために、または膀胱がんを診断するために使用することができる。本明細書で使用する用語「リスクを予測する」とは、対象者において膀胱がんを発症する可能性を評価することを指す。

別の局面では、患者が膀胱がんまたは早期ステージの膀胱がんもしくは後期ステージの膀胱がんに罹患しているか、または膀胱がんの再発を示すかどうかを判定する方法が提供される。この方法は、本開示の1つ以上のバイオマーカーの存在を検出する段階を含む。

本明細書で使用する用語「患者」または「対象者」または「個体」は、交換可能に使用することができ、動物、例えば、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、およびヒトなどの哺乳動物に関する。本開示の患者は、膀胱がんに罹患している疑いがあるか、以前に膀胱がんに罹患したことがある。例えば、本発明の方法は、膀胱がんに罹患している疑いがある対象者に適用され得る。別の例では、本開示の方法は、膀胱がんの再発の疑いがある対象者に適用され得る。本明細書で使用する用語「再発」は、膀胱癌に罹患していないと見なされている患者に膀胱癌が再び現れることまたは再発見されることを指す。

一例では、本開示の方法において使用される場合、バイオマーカーはサンプル、例えば液状サンプル、から検出され得る。一例では、液状サンプルは尿または排泄された尿であってよい。有利なことに、本明細書に開示されるバイオマーカーの特異性および感度は、本開示の検出システムまたは方法が少ない尿量、例えば約1μl〜約30ml、しか必要でないことを可能にしている。一例では、尿サンプルは、約1μl、約5μl、約10μl、約15μl、約20μl、約25μl、約30μl、約35μl、約40μl、約45μl、約50μl、約100μl、約150μl、約200μl、約250μl、約300μl、約350μl、約400μl、約450μl、約500μl、約550μl、約600μl、約650μl、約700μl、約750μl、約800μl、約850μl、約900μl、約950μl、約1ml、約2ml、約3ml、約4ml、約5ml、約6ml、約7ml、約8ml、約9ml、約10ml、約11ml、約12ml、約13ml、約14ml、約15ml、約16ml、約17ml、約18ml、約19ml、約20ml、約21ml、約22ml、約23ml、約24ml、約25ml、約26ml、約27ml、約28ml、約29ml、約30mlまで、またはそれらの間の任意の値であり得る。本明細書で使用する用語「約」は、尿サンプルの量との関連で、一般的には、記載された値の+/-5％、より一般的には、記載された値の+/-4％、より一般的には、記載された値の+/-3％、より一般的には、記載された値の+/-2％、さらに一般的には、記載された値の+/-1％、さらに一般的には、記載された値の+/-0.5％を意味する。

バイオマーカーは、当技術分野で公知の方法を用いて、排泄尿などのサンプル中で検出することができる。当業者は、当技術分野で公知のどのアッセイが本開示のバイオマーカーを検出するのに適しているかを理解している、と認められる。例えば、本開示のバイオマーカーの検出は、該バイオマーカーの存在または非存在の観察に関する。検出は直接的または間接的に行うことができる。直接検出はポリペプチド自体から得られるシグナルに基づいたポリペプチドの検出に関し、その強度はサンプル中に存在するポリペプチドの分子数と直接相関する。このようなシグナルは、時に強度シグナルとも呼ばれており、例えば、ポリペプチドの特定の物理的または化学的特性の強度値を測定することによって、得ることができる。間接測定は、二次成分(すなわち、ポリペプチド自体ではない成分)または生物学的リードアウト(read out)系、例えば、測定可能な細胞応答、リガンド、標識、または酵素反応産物から得られるシグナルの測定を含む。例えば、その検出は分子生物学的方法を用いて実施することができる。分子生物学的方法には、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、例えばリアルタイムまたは定量PCR、ウェスタンブロット、ドットブロット、質量分析法、免疫学的方法、例えば抗体を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などが含まれる。例えば、本開示の実験セクションでは、ウェスタンブロット、ドットブロット、リアルタイム(RT)PCRおよびELISAが使用される(実施例1および2参照)。

一例では、患者から得られたサンプル中に1つ以上のバイオマーカーが存在するかどうかの指示は、その結果を対照グループと比較することで行うことができる。例えば、本開示の方法は対照グループを含むことができ、対照グループは膀胱がんに罹患していない患者を含み得る。図12および図13に示すように、本開示のバイオマーカーは膀胱がんに特異的であるので、対照グループは、膀胱がんに罹患していない任意の患者であってよく、例えば、健康である(すなわち、どのような既知の慢性疾患もない)患者、がんとは関係のない既知の慢性疾患がある患者、または膀胱がん以外のがんがある患者であり得る。

一局面では、本明細書に記載の検出システムと、本明細書に記載の方法を実施するために必要な物質とを含むキットが提供される。

また、本開示のバイオマーカーを含有しうる組成物も開示される。一例では、該組成物は、本明細書に記載される検出システム、判定方法、またはキットにおいて使用することができる。

一例では、本開示のバイオマーカー、方法、検出システムまたは組成物は、膀胱がんの治療を受けていてもいなくてもよい患者または膀胱がんの治療を受けたことがある患者において、膀胱がんの転帰を予測するのに有用であり得る。本開示のバイオマーカー、方法、検出システムまたは組成物はまた、膀胱がんの治療を受けていてもいなくてもよい患者または膀胱がんの治療を受けたことがある患者において、再発を発見または予測するのに有用であり得る。一例では、患者は表在性の膀胱がん(すなわち、非筋肉浸潤性などの早期ステージ、Ta/T1)を有し、経尿道的切除術で治療されるか、カルメット・ゲラン菌(BCG)治療を受ける患者であり得る。

本明細書に例示的に記載された本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素(複数可)または限定(複数可)の非存在下で適切に実施することができる。したがって、例えば、用語「含む」、「包含する」、「含有する」などは、拡張的にかつ限定なしに読まれるものとする。さらに、本明細書で用いられる用語および表現は、限定の用語としてではなく、説明の用語として使用されており、このような用語および表現の使用において、示されかつ説明された特徴またはその部分の均等物を排除する意図はなく、クレームされた本発明の範囲内でさまざまな変更が可能であることが認識される。したがって、当然のことながら、本発明は好ましい態様および選択的特徴により具体的に開示されているが、本明細書に開示されそこに具体化された本発明の変更および変形は当業者により採用され得ることであり、そのような変更および変形は本発明の範囲内であると考えられる。

本発明は、本明細書に広範かつ一般的に記述されている。一般的開示(generic disclosure)内に入るより狭い種および亜属のグループのそれぞれもまた、本発明の一部を形成する。これは、任意の主題を属(genus)から除外する但し書きまたは消極的な限定を含む本発明の一般的記述を、除かれた材料が本明細書に具体的に記載されているか否かに関わらず、包含する。

他の態様は、以下の特許請求の範囲内であり、かつ非限定的な例である。さらに、本発明の特徴または側面がマーカッシュグループの形式で記載されている場合、当業者は、本発明がマーカッシュグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループによっても記載されていることを認識するであろう。

実験セクション
実施例1
実施例1は、本開示のバイオマーカーに関する予備的研究およびデータを記述する。
材料(臨床検体)：
排泄尿サンプルおよび関連する臨床情報は、治験審査委員会の承認とインフォームドコンセントを受けて(IRB # 205-001, 2012-527-B)、この研究を実施する際に収集した。約20mLの排泄尿を健常者と膀胱がん患者から尿採取・保存用チューブ(Norgen Biotek社, カタログ# 18118, 米国)中に採取した。排泄尿サンプルは3つの別々のグループで採取した。第1グループ(コホート1)は、尿路上皮細胞癌、肉眼的血尿、活動性尿路感染症または尿路結石症の病歴がこれまでにない30人から成っていた。これらの検体を対照として用いた。第2グループ(コホート2)は、初期の尿路上皮癌(TaまたはT1)を有する36人から構成され、第3グループ(コホート3)は、後期の尿路上皮癌(T2またはT3)を有する22人から構成されていた。検査室での処理の前に各尿アリコートに独自の識別番号を割り当てた。尿タンパク質を、3kDa遠心フィルターを用いてメーカー(Millipore社, Carrigtwohill, アイルランド)の指示に従って濃縮した。簡単に述べると、14mLの尿サンプルを8000g、4℃で30分間遠心分離した。血液が肉眼で見える検体は除外した。さらなる処理までサンプルを-80℃で保存した。

(表１)健常者/非がんおよびがん研究コホートの人口統計学的および臨床病理学的特性

方法
質量分析
高分解能質量分析(MS)ベースの定量的プロテオミクスアプローチは、2つ以上の異なる条件下でのプロテオームの定量的比較に用いられて成功を収めている。タンパク質レベルを比較し、正確に定量するための最も一般的に使用される方法は、差次的同位体標識の使用に頼っている。SILACなどの代謝標識法は、細胞培養ベースの研究にのみ適用される。タンパク質またはペプチドレベル(採取後の段階)での化学的標識は、生体液を含めて、どのような種類のタンパク質サンプルにも適している。これらのアプローチの中で、安定同位体還元ジメチル(R-diMe)標識は、非常に簡単で、高速かつ安価なマルチプレックス定量的プロテオミクス法であり、この方法はLTQ-Orbitrapのような高分解能MS機器を使用して1回の実験で何千ものタンパク質を定量化することができる。オープンソースの十分に確立されたMaxQuantプログラムは、R-diMeデータを解析するために直接使用することができる。MaxQuantは、タンパク質の同定、相対比率、混合エラーを修復するための比率の正規化、および比率の有意性などの他の関連する統計情報を実行する。

濃縮した尿サンプルを、8M尿素、100mM重炭酸アンモニウム(ABC, Sigma- Aldrich社)中に懸濁させた。このタンパク質サンプルを、最終濃度5mM DTTまで1M DTTを添加することにより室温で30分間還元し、続いて10mMヨードアセトアミド(IAA)を用いて暗所で30分間アルキル化した。還元したサンプルを6M尿素に調整し、Lys-C (Promega社)(1：100)と共に37℃で一晩インキュベートした。その混合物を1M尿素に希釈した後、サンプルをトリプシン(ブタ、修飾化シークエンスグレード；Promega社)(1：50)で37℃にて4時間消化した。ジメチル標識は、いくつかの変更を加えてHsuら(Anal. Chem. 2003. 75, 6843-6852)に記載されるように行った。消化物(ペプチド混合物)を1％トリフルオロ酢酸(TFA)100μlで酸性化してから、C18-SD固相抽出(SPE)カートリッジ(3M Empore(商標))でのジメチル標識へと進めた。このカラムは、最初にメタノールで、続いて0.1％TFA/70％ACNおよび0.1％TFAで平衡化した。ペプチドを3つの異なるカラムにロードし、その後「軽い」(45mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5、ホルムアルデヒド(CH₂0)(37％v/v))、「中間」(45mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5、ホルムアルデヒド(CH₂0)(20％, 98％D, Isotec社)、0.3Mシアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH₃CN)(Fluka社))、および「重い」(45mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5、ホルムアルデヒド(CH₂0)(20％, 99％13C, 98％D, Isotec社)、0.3Mシアノ重水素化ホウ素ナトリウム(NaBH₃CN)(96%D, Sigma-Aldrich社))試薬をカラムに通した。フォワード標識実験では、「軽い」、「中間」および「重い」試薬を、それぞれ健常(対照)、Ta/T1およびT2/T3サンプル含有カラムに通した。リバース実験では、「軽い」、「中間」および「重い」試薬を、それぞれT2/T3、健常(対照)およびTa/T1サンプル含有カラムに通した。0.1％TFAで洗浄した後、標識されたペプチドを0.1％TFA/70％ACNで溶出して混合し、その後高速真空濃縮器を用いて濃縮した。少量の個別の標識ペプチドを質量分析で標識取り込みについてチェックした。それに応じて残部を混合した。IEFはAgilent 3100 OFFGELフラクショネータ(Agilent社, G3100AA)で行った。簡単に述べると、トレーに取り付けた12ウェルフレームを用いて13cm ImmobilineDryStrip pH3〜10 (Scimed社)を再水和した後、ペプチド混合物を12ウェル間に均等にロードした。12ウェルフレームをカバーシールで覆い、湿った電極パッド上のトレーに電極を固定し、その後トレーを該フラクショネータに取り付けた。左右の電極にグリセロールをカバー液として加えてから、勾配を用いて合計50kVhを流した。集めた画分を、以下のようにC18ステージチップを用いて脱塩した。3枚の固相抽出ディスク、C18膜ディスク(3M Empore)を200μLピペットチップに充填した。ステージチップは、最初にメタノール、続いて80％ACN/0.1％ギ酸(FA)および0.1％FAで遠心分離によりコンディショニングした。コンディショニングの間に、ステージチップの流速を決定した。次にサンプルをステージチップ上にロードし、所定の流速で遠心分離した。次にステージチップを0.1％FAで洗浄し、その後ペプチドを80％ACN/0.1％FAで溶出した。溶出されたペプチドを高速真空濃縮器で15分間濃縮し、0.1％FAを全量20μlになるまで満たしてから質量分析計に導入した。真空乾燥させたペプチドサンプルを0.1％ギ酸中に再調製し、LTQ Orbitrap XL (Thermo FisherScientific社)に連結したnanoHPLC (Proxeon, Thermo Scientific社)を用いて分析した。ペプチドをC18プレカラム上に捕捉し、溶媒Aとして2％アセトニトリル/0.1％ギ酸および溶媒Bとして80％アセトニトリル/0.1％ギ酸を用いて、分析カラムで分離した。5％から50％溶媒Bまでの120分勾配、続いて50％から100％溶媒Bまでの5分勾配を250nL/分の流速で用いた。サーベイフルスキャン(Survey full scan)MSスペクトル(m/z 300〜1400)は、m/z 400での分解能r＝60,000、AGCターゲット1e6、および最大射出時間500msで取得した。各サーベイスキャンにおいてイオン強度＞2000カウントおよび荷電状態≧2を有する10個の最強ペプチドイオンをターゲット値1e4に順次単離して、35％の正規化衝突エネルギーを用いた衝突誘起解離によって線形イオントラップ内でフラグメント化した。動的排除(dynamic exclusion)は、リピートカウント1、リピート、および排除期間30秒と共に最大排除リスト500を用いて適用した。データは、uniprot DROME fasta(18787配列)によりMaxQuantバージョン1.2.0.18を用いて検索した。データベース検索は、未切断部位数(missed cleavage)最大2および標識アミノ酸2個を可能にするトリプシン切断部位特異性、ならびに前駆体イオンでは7ppmおよびフラグメントイオンでは0.5Daの初期質量許容差(initial mass tolerance)を用いて行った。システインのカルバミドメチル化を不変的な修飾として検索し、また、N-アセチル化および酸化メチオニンを可変的な修飾として検索した。ジメチルLys4、ジメチルNter4、ジメチルLys8、ジメチルNter8は、それぞれ軽いおよび重い標識として選択した。最大偽発見率は、タンパク質とペプチドの両方について0.01に設定した。タンパク質は、6アミノ酸の最小長さを有する少なくとも1つの固有のペプチドにより裏付けられた場合に、同定されたと見なした。

RNAの単離および特性解析
全RNAは、ZR尿RNA単離キット(カタログ番号ZYR.R1039, CA, 米国)を用いて尿の脱落細胞から単離した。排泄尿30mlをシリンジからZRC GF(商標)フィルター[該キットに付属]に押し込んで、該フィルター中に脱落細胞を単離した。次いで、メーカーの説明書に従ってRNAを精製した。RNA濃度およびA260/A280比をNanoDrop(登録商標)ND-1000分光光度計で測定した。RNAの純度をさらに定量化し、80で保存するか、またはリアルタイムPCRに使用した。

リアルタイムPCR解析
全RNA(500ng)は、SuperScript(登録商標)IIIファーストストランド合成システム(Invitrogen社, カタログ番号18080-051, CA, 米国)を用いて逆転写した。RT-PCR前増幅反応は、Premixed ROXを含むEXPRESS SYBR(登録商標)GreenER(商標)qPCRスーパーミックス(Invitrogen社, カタログ番号11794-01K, CA, 米国)を用いて実施した。各反応/ウェルにつき、qPCRスーパーミックス10μLを各希釈cDNAサンプル8μLおよびプライマー2μLと混合して最終容量20μLを得た。プライマー配列は実施例2で表6に示したものと同じであり、次のとおりである：

熱サイクル条件は次のとおりであった：高速リアルタイムPCR反応は、95℃初期テンプレート変性、および40サイクルの95℃変性と60℃アニーリング/伸長から成っていた。この反応は、7900HT高速リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems社)で行った。この反応は、7900 HT高速リアルタイムPCRシステム(Applied Bio systems社)で行った。

ウェスタンブロット分析
タンパク質アッセイキット(Pierce(商標)BCAタンパク質アッセイキット, カタログ番号23225, Rockford, IL, 米国)を用いて尿タンパク質を推定した。個々のサンプルからの尿タンパク質(100μg)をSDSゲル上で分離し、PVDF(ポリフッ化ビニリデン)膜(Bio-Rad Laboratories, カタログ番号162-0177, CA, 米国)に電気泳動的に転写した。この膜をTBST(0.1％Tween-20を含むTris緩衝生理食塩水)中の5％BSA(ウシ血清アルブミン)により室温で1時間ブロックした。表2Aに示した以下の一次抗体をウェスタンブロット分析用に使用した。膜を、最初に一次抗体と、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体とインキュベートすることによってプローブし、増強化学発光検出法(Immobilonウェスタン化学発光HRP基質, EMD Millipore社, 米国)を用いて発色させた。

(表２Ａ)ウェスタンブロットおよびドットブロット分析で使用された抗体

ドットブロットアッセイ
このアッセイではニトロセルロース膜(BioTrace, Pall Gleman Laboratory, 米国)を使用した。ブロットされる領域を示すために鉛筆でグリッド(格子)を描いた。個々の患者からの処理された排泄尿タンパク質(200μg)をニトロセルロース膜上のグリッドの中心にスポットした。サンプルを膜上にゆっくり加えることで吸着溶液の領域を最小化した。次に膜を1時間放置して乾燥させた。膜上の非特異的部位は、TBS-T中の5％BSAに膜を室温で1時間浸漬することによってブロックした。その後、それをTBS-T中の5％BSAに溶解した一次抗体(希釈範囲1：100〜1：10000)と室温で1時間インキュベートし、続いてTBS-Tを用いて10分間隔で3回洗浄した。HRP結合二次抗体とのインキュベーションを室温で1時間行った後、TBS-Tを用いて10分間隔で3回洗浄した。その膜をECL(Immobilonウェスタン化学発光HRP基質, EMD Millipore社, 米国)とインキュベートし、化学発光イメージングGboxのために露光した。

ELISAによる定量
(Pierce 96ウェルプレート-コーナーノッチ, カタログ番号15041, 米国)(TBS中のSuperBlockブロッキングバッファー, カタログ番号37535, Thermo Fisher Scientific社, 米国)(1-Step(商標)Ultra TMB-ELISA, カタログ番号34028, Thermo Fisher Scientific社, 米国)。各バイオマーカーおよび補体因子Hの尿中タンパク質濃度は、それぞれのELISAキット(USCN Lifescience社, Wuhan, Hubei)を用いて、メーカーの説明書に従って(三つ組で)測定した。これらのキットは表8に示される。尿中のバイオマーカー量は、ELISAプレートの各ウェルに等しい濃度の総タンパク質をロードすることによって標準化した。

組織病理学および免疫染色
各膀胱生検サンプルの一部を10％NBF中で48時間固定し、70％エタノールに移し、次いでパラフィン中に包埋した。サンプルを5μm間隔で10の連続層の薄片に切り分け、組織病理学的検査のためにヘマトキシリンとエオシンで染色した。

免疫組織化学的分析は、ホルマリン固定パラフィン切片を用いて行った。熱誘導性エピトープ回復(retrieval)は、Bond(商標)Epitope Retrieval Solution 2(pH9用)を用いて100℃で40分間実施した。免疫組織化学的染色は、Leica Bond(商標)自動染色装置を用いて行ったが、この装置は染色プロトコルにおいて専用のBond(商標)Detection Refine Kit (Leica社, カタログ番号：DS9800)を使用する。全ての免疫蛍光反応は、表2Bに記載した抗体希釈率により実施した。二次抗体は、該検出キットの一部であるが、トリス緩衝生理食塩水/0.9％ProClin(商標)950中の抗ウサギポリHRP-IgG含有10％(v/v)動物血清からなる。この溶液は希釈せずに使用される。

(表２Ｂ)IHCで使用された抗体

尿タンパク質の質量分析：安定同位体還元ジメチル標識
高分解能質量分析(MS)ベースの定量的プロテオミクスアプローチは、2つ以上の異なる条件下でのプロテオームの定量的比較に用いられて成功を収めている。タンパク質レベルを比較し、正確に定量するための最も一般的に使用される方法は、代謝的または化学的のいずれかによる、差次的同位体標識の使用に依存している。SILACなどの代謝的標識方法は、細胞培養ベースの研究にのみ直接適用され得る。タンパク質またはペプチドレベルでの化学的標識は、生体液を含めて、どのような種類のタンパク質サンプルにも適している。これらのアプローチの中で、安定同位体還元ジメチル(R-diMe)標識は、非常に簡単で、高速かつ安価なマルチプレックス定量的プロテオミクス法であり、LTQ-Orbitrapのような高分解能MS機器を使用して1回の実験で何千ものタンパク質を定量化することができる。オープンソースの十分に確立されたMaxQuantプログラムは、R-diMeデータを解析するために直接使用することができる。3重標識R-diMe分析を、健常者(対照)、Ta/T1およびT2/T3患者からの濃縮尿サンプルについて実施した。サンプルを、標準的な手順を用いてLys-Cで、続いてトリプシンで消化した。サンプルの複雑さを低減するために、(差次的に標識した尿サンプルから)得られたペプチド混合物を、Agilent 3100 OFFGELフラクショネータでの等電点電気泳動を用いて分画化した。各画分をnanoHPLC (Proxeon, Thermo Scientific社)-LTQ Orbitrap質量分析に供した。生データは、uniprot DROME fasta(18787配列)によりMaxQuantバージョン1.2.0.18を用いて処理した。ジメチルLys4、ジメチルNter4、ジメチルLys8、ジメチルNter8をそれぞれ軽い、中間、重い標識として選択した。最大偽発見率は、タンパク質とペプチドの両方について0.01に設定した。タンパク質は、6アミノ酸の最小長さを有する少なくとも1つの固有のペプチドにより裏付けられた場合に、同定されたと見なした。

同定されたタンパク質のリストを、種々の免疫化学的技術を用いてさらに分析した。発見段階から17の候補を選んで、早期および後期ステージの膀胱がん患者からの個々の尿サンプル中のそれらの存在量を調べた。各バイオマーカーの相対的能力と豊富さをウェスタンブロット、RT-PCRおよびドットブロットで評価した。本研究から、5つの候補バイオマーカーが、個別にまたは組み合わせて、膀胱癌検出のために選択された。さらに、個々のバイオマーカーのレベルを、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて、尿サンプルでモニターした。評価される各タンパク質の精製標準品を使用して較正曲線を作成した。BCa検出のための5つのバイオマーカーの診断価値を判定した。応答変数として膀胱癌状態を、予測変数としてバイオマーカーを用いて、ロジスティック回帰手法を適用した。ひとたび予測モデルが作成されたら、偽陽性率に対する感度値のプロットを提供するGraphpad Prism(登録商標)を用いて、受信者動作特性(ROC)曲線を作成した。我々が選択したバイオマーカーの異なる組み合わせの相対的能力は、Graphpad Prism(登録商標)を用いてROC曲線下面積(AUC)を計算することにより推定した。AUCが高いほど、より強い予測因子を示している。各バイオマーカーの閾値は、最高ヨーデン指標(Youden's Index)に基づいて選択した。その後、感度、特異度、陽性予測値(PPV)、陰性予測値(NPV)、および全体的な精度を、診断のために選択された閾値を用いて算出した。

結果
膀胱がんバイオマーカーの発見における尿プロテオームの比較分析の評価
最初に、qMS分析は、「方法」に記載したように、4人のボランティアからの等量の尿サンプルをプールすることによって用意された尿サンプルで実施した。実験誤差を最小にするために、生物学的反復(異なるプール)と技術的反復(同じサンプルに対して異なる標識ならびに異なるMSラン)を加えた。最後に、全てのデータセットを組み合わせて、尿サンプル中に存在するタンパク質の平均倍率変化を得た。正常な尿サンプルと比較して2倍以上の変化を有するタンパク質はどれも、過剰分泌タンパク質と見なした(表3)。

(表３)各患者グループで検出された尿中のマーカーの数

このタンパク質のリストから、17の潜在的な候補が、それらの機能、細胞内局在および疾患関連性に基づいて、初期検証のために選択された。これらの選択されたマーカーを検証するために、異なる生化学的技法を適用した：RT-PCRは、同定されたヒットのmRNA発現を定量するために使用し、ウェスタンブロッティングは、選択されたバイオマーカーの発現レベルを調べるために使用した。mRNA発現解析の結果に基づいて、5つの候補バイオマーカーは、非筋肉浸潤性と筋肉浸潤性の両方のBC患者では、健常者と比較して、それらのmRNA発現レベルが上昇していることが示された。コロニン-1A、アポリポタンパク質A4、セメノゲリン-2、γシヌクレイン、およびDJ-1のRNA発現の倍率変化は、広範な発現を示した。最も重要なことは、全てのマーカーが健常者と比較して高レベルの倍率変化を示したことである。これらのデータを、FDA承認のBTA-TRAKアッセイ因子である補体Hとさらに比較した(図1)。遺伝子レベルのデータを我々のMSデータと比較した。上記の潜在的なマーカーの代表的なMSスペクトルもまた、それらが患者サンプル中により高いレベルで存在することを明確に示した(図11)。

その後、コロニン-1A、アポリポタンパク質A4、セメノゲリン-2、γシヌクレイン、およびDJ-1のレベルを、プールした尿サンプル(図2A)、ならびに個々の非筋肉浸潤性BC患者からの24の尿サンプル(図2B、図3)および筋肉浸潤性BC患者サンプルの24の尿サンプル(図2C)においてウェスタンブロッティングにより分析した。正規化した後、5つの候補タンパク質の相対的タンパク質レベルは、上昇した発現レベルを示し、表4に示される。ウェスタンブロット分析およびRT-PCRにより得られたデータは一致した。

(表４)ウェスタンブロット分析

また、膀胱がん患者の尿サンプル中の5つの発見されたマーカーを検出するために、単純で、非侵襲的で、迅速なドットブロットアッセイを開発した。この技術は、該マーカーが検出されてリングを形成する(すなわち陽性試験)場合、生じた着色ドットの半定量的な読み取りを可能にする。図3に示すように、マーカーが検出されなかった(すなわち陰性試験)場合には、無色のドットが形成されるか、またはリングの形成が生じなかった。全てのアッセイにおいて、本開示のバイオマーカーにより得られた全てのデータは、FDA承認のBTA-TRAKアッセイ因子である補体Hと比較される。

本開示のバイオマーカーの診断性能をさらに評価するために、これらの発現を高グレード膀胱がん患者から入手した生検サンプルで調べた。免疫組織学を5つ全てのバイオマーカーに対して実施した。その結果から、図4に示すように、組織切片での5つのバイオマーカー全ての陽性染色が明らかに確認された。

先進的なMSベースの同位体ジメチル標識アプローチは、新規バイオマーカーのパネルを同定するために設計された。この方法は、生体液のプロテオームの定量的な比較を可能にする効率的な化学的標識に基づいた、非常に簡単で、高速かつ安価なマルチプレックス定量的プロテオミクスアプローチである。本研究では、膀胱がん患者と健常者との間の差を分析するために、LTQ-Orbitrapなどの高分解能MS機器を使用するマルチプレックス定量的プロテオミクス法と組み合わせて尿サンプルが使用された。本開示で実施した質量分析法の研究から、早期Ta/T1、後期T2/T3、およびTa/T1とT2/T3の両方の膀胱がんにおいて上昇したタンパク質のリストが得られた(図示せず)。

重要性と関連性に基づいたフィルタリング手法に従って、17のマーカーが選択され、mRNA発現とウェスタンブロット研究の後で5つの潜在的マーカーにさらに絞り込まれた。これら5つのバイオマーカーをドットブロットおよびELISA技術によってさらに検証し、それらが非侵襲性のマーカーとして使用できることを確認した。本研究から収集されたデータは、該バイオマーカーの特異度および感度を得るために統計的に分析された。本開示のバイオマーカーのパネル(コロニン-1A、アポリポタンパク質A4、セミノゲリン-2、γシヌクレイン、およびDJ-1/PARK 7)では、BC検出用の最も正確なマルチアナライトベースのアッセイが88人の対象者コホートにおいて実施された。追加のバイオマーカーを組み入れることは、特異度と感度に影響を与える可能性がある。全ての可能な組み合わせを試験して、5つのバイオマーカーのパネルのうち3つ(コロニン-1A、ApoA4およびγシヌクレイン)の組み合わせは、100％の全体的な精度をもたらし、かつ高い感度(100％)と特異度(100％)の両方を保持することが見出された(図5)。したがって、実施例1は、3つのバイオマーカーの組み合わせが非筋肉浸潤性および筋肉浸潤性の膀胱癌の信頼できる診断を提供し得ることを示唆している(表5)。この発見を検証するために、より大きなサンプルサイズを用いたさらなる研究を以下の実施例2で行った。

(表５)個々および3つの異なる組み合わせの性能値

実施例2
実施例2は、実施例1の継続的な最新の研究であり、本開示のバイオマーカーの信頼性を検証するために、基本的に同じ実験が(より大きなサンプルサイズで)行われた。

材料および方法
尿サンプル
排泄尿サンプルおよび関連する臨床情報(表6)は、治験審査委員会の承認とインフォームドコンセントを受けて収集した。初期スクリーニングのために、排泄尿20mlを健常者と膀胱癌患者から保存チューブ内に集めて、-80℃で保存した(Norgen Biotek社, カナダ)。3つの別々のグループが構成された：尿路上皮細胞癌、肉眼的血尿、活動性の尿路感染症または尿路結石症の病歴がこれまでにない健常者に相当する、対照グループ；非筋肉浸潤性の膀胱癌があることを特徴とする、TaおよびT1膀胱癌患者により構成された、第2グループ；および筋肉浸潤性膀胱癌があることを特徴とする、T2およびT3膀胱癌患者を含む、第3グループ。検査室での処理の前に、各尿アリコートに独自の識別番号を割り当てた。目視検査により判定して、またはディップスティック尿検査(Combur9, Roche Diagnostics社, Basel, スイス)に基づいて、かなりの血液汚染がある尿サンプルは除外した。さらに処理するまでサンプルを-80℃で保存した。

(表６)患者詳細(n＝365)

略語：n/a, 適用せず；BCa, 膀胱癌

検証スクリーニングのために、追加の排泄尿5mlを慢性疾患、膀胱癌および他の種類のがんに罹患した患者から集めた。

尿サンプルの定量的質量分析
尿タンパク質は、3kDa遠心フィルターを用いてメーカー(Millipore社, Carrigtwohill, アイルランド)の指示に従って濃縮した。各コホート、すなわち健常、Ta/T1およびT2/T3膀胱癌ステージ、からの4つのサンプルをプールし、8000×g、4℃で30〜60分間遠心分離した。アセトン沈殿したサンプルを100mM重炭酸アンモニウム中の8M尿素120μlの中に再調製した。1Mジチオスレイトールを各サンプル中5mMの最終濃度にまで添加することによりサンプルを還元し、次いで室温で30分間インキュベートした。0.5Mヨードアセトアミドを10mMの最終濃度にまで添加することによりアルキル化を実施し、サンプルを暗所で30分間インキュベートした。次に、全てのサンプルを、100mM重炭酸アンモニウムを用いて初期8M尿素から6M尿素に希釈し、その後Lys-C(酵素対タンパク質比1：100)と共に37℃で一晩インキュベートした。消化混合物を50mM重炭酸アンモニウムの添加により1M尿素の最終濃度に調整し、続いてトリプシン(酵素対タンパク質比1：50)と共に37℃で4時間インキュベートした。

トリプシン消化ペプチド混合物を、Swa, H. L., A. A. Shaik, et al. (2014). "Mass spectrometry-based quantitative proteomics and integrative network analysis accentuates modulating roles of Annexin-1 in mammary tumorigenesis." Proteomics. Using a triple-labelling approachに記載されるように、オンカラムでの安定同位体ジメチル標識に供した。差次的に標識した尿サンプルを混合し、Agilent 3100 OFFGELフラクショネータ(12分画)での等電点電気泳動を用いて分画化した。そのサンプルを、セルフ充填型C18ステージチップを用いてクリーンアップし、前述(Swa, Shaik et al. 2014)のように、質量分析に供した。生データは、2013-07_uniprotヒトfastaデータベース(88354エントリ)を用いてMaxQuantバージョン1.3.0.5で処理した。最大偽発見率は、タンパク質とペプチドの両方について0.01に設定した。タンパク質は、7アミノ酸の最小長さを有する少なくとも1つの固有のペプチドにより裏付けられた場合に、同定されたと見なした。

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
全RNAは、ZR尿RNA単離キット(Zymo Research社, Irvine, CA)を用いて尿サンプル5ml中の脱落細胞から単離した。全RNA(500ng)を、SuperScript(登録商標)IIIファーストストランド合成システム(Invitrogen社, Carlsbad, CA)を用いて逆転写した。RT-PCR前増幅反応は、Premixed ROXを含むEXPRESS SYBR(登録商標)GreenER(商標)qPCRスーパーミックス(Invitrogen社)を用いて実施した。プライマー配列は表7に示される。

(表７)定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)のためのプライマー配列

ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロットは、尿サンプルを遠心分離して細胞を除去したもので実施した。タンパク質の濃度は、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce社, Rockford, IL)を用いて推定した。個々のサンプルからのタンパク質(100μg)をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)に電気泳動的に転写した。この膜を、0.1％Tween-20を含むTris緩衝生理食塩水(TBST)中の5％ウシ血清アルブミン(BSA)により室温で1時間ブロックし、続いて表8に示した一次抗体を用いてプローブした。

(表８)ウェスタンブロット、免疫染色およびELISAアッセイに使用した抗体およびELISAキット

ELISAによるタンパク質定量
各バイオマーカー(コロニン-1A、アポリポタンパク質A4、セメノゲリン-2、γシヌクレイン、およびDJ-1)の尿中タンパク質濃度ならびにFDA承認の補体因子Hのそれは、それぞれのELISAキット(表8)(USCN Lifescience社, Wuhan, Hubei)を用いて測定した。アッセイはメーカーの指示に従って行った、全ての試験を三つ組で行った。尿中のバイオマーカー量は、ELISAプレートの各ウェルに総タンパク質の等濃度をロードすることによって標準化した。測定は、自動マイクロプレートリーダーInfinite(登録商標)M1000 PRO (Tecan社, Mannedorf, スイス)を用いて450nmで行った。

組織病理学
膀胱癌生検サンプルを10％中性緩衝ホルマリン(NBF)中で48時間固定し、70％エタノールに移し、次いでパラフィン中に包埋した。4μmの組織切片を組織病理学的検査のためにヘマトキシリンとエオシンで染色した。熱誘導性エピトープ回復は、Bond(商標)Epitope Retrieval Solution 2(pH9.0用)を用いて100℃で40分間実施した。免疫組織化学的染色は、Leica Bond(商標)自動染色装置を用いて行ったが、この装置は専用のBond(商標)Detection Refine Kit (Leica社, Solms, ドイツ)を使用する。全ての免疫蛍光標識は、表8に示した抗体の希釈率を用いて実施した。

統計分析
全てのデータは、GraphPad Prism(登録商標)5.0ソフトウェアを用いて分析した。RT-PCRデータでは、健常者、Ta/T1およびT2/T3患者間のバイオマーカー発現の有意差または倍率変化を、両側マン・ホイットニーU検定を用いて評価した。ウェスタンブロットデータの強度は、画像処理プログラムImageJ (National Institute of Health, Bethesda, MD)を用いて定量化した。バイオマーカーと血漿との何らかの関連性については、ピアソンの相関試験を行った。5つのバイオマーカーを組み合わせる診断モデルは、Matlab(登録商標)R2012a統計ツールボックスバージョン8.0(Math Works社, Natick, MA)からLasso回帰モデルを用いて開発した。較正曲線は、ELISAキットにより提供された精製タンパク質を用いて作成した。受信者動作特性(ROC)曲線およびAUCは、Graphpad Prism(登録商標)(GraphPad Software社, La Jolla, CA)を用いて作成した。より高いAUC(＞0.5)は偶然よりも強い予測因子を示した。各バイオマーカーの閾値は、ヨーデン指標J＝感度＋特異度−1に基づいて選択した。感度、特異度、陽性予測値(PPV)、陰性予測値(NPV)、および全体的な精度は、診断のために選択された閾値を用いて計算した。p＜0.05(両側)のp値を有意と見なした。

結果
定量的MSを用いた膀胱癌検出のための候補バイオマーカーの同定
非筋肉浸潤性(Ta/T1)および筋肉浸潤性(T2/T3)の膀胱癌を診断するための潜在的なバイオマーカーを同定するために、MS分析を、等量の4人のボランティアからのプールされた尿サンプルを用いて実施した。実験誤差を最小にするために、生物学的反復(異なるプール)と技術的反復(同じサンプルに対して異なる標識ならびに異なるMSラン)を含めた。最後に、全体のデータセットを組み合わせて、健康な尿サンプルと比較して、膀胱癌の尿サンプル中に存在するタンパク質の平均倍率変化を得た。健常者からのサンプルと比較して、(少なくとも1つのステージで)少なくとも2回の比率カウントにより2倍以上の変化を有するタンパク質を過剰分泌タンパク質と見なした。過剰分泌タンパク質は、広範囲にわたるオンラインデータベース文献検索を通じて精査され、その新規性、以前に発表された癌との関連性、および細胞内局在に基づいて選抜された。

排泄尿の脱落細胞におけるバイオマーカーmRNAの倍率変化
一次選考を経て残った潜在的なバイオマーカーは、3つのグループ：対照グループ(健常者)、Ta/T1膀胱癌(非筋肉浸潤性)グループ；およびT2/T3膀胱癌(筋肉浸潤性)グループの各々につき10個のサンプルを用いたRT-PCRによる初期検証のために検討された。mRNA発現解析の結果に基づいて、5つの候補バイオマーカー、すなわちコロニン-1A、アポリポタンパク質A4、セメノゲリン-2、γシヌクレイン、およびDJ-1は、健常者と比較して、非筋肉浸潤性(Ta/T1)および筋肉浸潤性(T2/T3)膀胱癌患者において有意に高い発現の倍率変化を有していた。補体因子Hもまた、膀胱癌患者の尿において、より高いmRNA発現を示した(図8)。

健常、非浸潤性および浸潤性BCaステージの尿サンプルのウェスタンブロット分析
30人の健常者、72人の非筋肉浸潤性膀胱癌(Ta/T1)患者および55人の筋肉浸潤性膀胱癌(T2/T3)患者からの尿サンプルを分析した。非筋肉浸潤性膀胱癌と筋肉浸潤性膀胱癌の全ての尿サンプルは、5つのうち少なくとも3つのバイオマーカーの上昇したレベルを示した(図9)。バンド強度値を用いて確立されたROC曲線は、5つのバイオマーカーの組み合わせを用いて、健常vs非筋肉浸潤性膀胱癌(Ta/T1)および健常vs筋肉浸潤性膀胱癌(T2/T3)について、それぞれ0.98および1.0のAUCを示した(図7b、表9Aおよび9B)。

(表９Ａ)Ta/T1(非筋肉浸潤性)膀胱がんを診断するときの組み合わせモデルの精度

略語：AUC, 曲線下面積；PPV, 陽性予測値；NPV, 陰性予測値

(表９Ｂ)T2/T3(筋肉浸潤性)膀胱がんを診断するときの組み合わせモデルの精度

略語：AUC, 曲線下面積；PPV, 陽性予測値；NPV, 陰性予測値

ウェスタンブロット分析からのデータ(図9)は、RT-PCRデータ(図8)との完全な一致を示し、5つのバイオマーカーが、健常者の尿サンプルと比較して、膀胱がん患者の該サンプル中では有意に富化されたことを示した。5つの潜在的マーカーの代表的なMSスペクトルもまた、RT-PCRおよびウェスタンブロットのデータとよく一致している(図11)。

尿中のバイオマーカーおよび血尿
血尿は尿路疾患を有する多くの患者において発生し、そのため、血尿は本開示の所定のバイオマーカーを用いた膀胱癌の診断に影響を与える可能性がある。というのは、これらのタンパク質は、低レベルではあるが、血液中にも見られるからである。表10は、データベース検索に基づいて、血漿中のバイオマーカー類のうち4種の保有率を提供する。

(表１０)データベースから得られた血漿中のバイオマーカー濃度

全てのデータは、http://www.plasmaproteomedatabase.org/から取得される。

文献検索はまた、該バイオマーカーの濃度のかなり大きな変動を示した。したがって、本研究では、ウェスタンブロット分析を用いて、4つの血液サンプルからの血漿および白血球におけるこれら5つのバイオマーカーの発現を調べた。該バイオマーカーの全てが血漿において発現されたが、白血球抽出物においてはコロニン-1Aの発現のみが可視的であった。これらのバイオマーカーと血漿との相関を算定するために、血液および尿サンプル中のバイオマーカーのウェスタンブロット強度を定量化し、各サンプル中のヒト血清アルブミン(HSA)の値に対して正規化した。箱ひげ図(Box and Whiskers plot)を使用して分析した場合、データは、5つのバイオマーカーの全てが、健常者の尿サンプルまたは血漿と比較して、Ta/T1およびT2/T3の尿サンプルでは有意に高い相対的発現レベルを有することを説明した(図6)。さらに、コロニン-1Aのみは、ピアソン相関試験を用いて、ヒト血清アルブミンレベルとの周辺相関(marginal correlation)を示す(表11)。したがって、本開示の尿バイオマーカーはサンプル中の血尿の結果として発現されたものではない、と結論される。

(表１１)血漿および白血球とバイオマーカーとのピアソンの相関分析：健常者、Ta/T1膀胱癌(非筋肉浸潤性, NMI)患者、およびT2/T3膀胱癌(筋肉浸潤性, MI)患者からの尿および血漿サンプル中のバイオマーカーについてのピアソンの相関係数(r)

次に、本開示は、ヒト血清アルブミンが腎臓のろ過機能不全に由来するのではなく、血液のみに由来すると仮定して、コロニン-1Aの発現を白血球数と相関させようとした。本研究では、尿中のコロニン-1Aの実際のバンド強度は、理論的に白血球に由来した可能性があるものと比較して、少なくとも289倍増加することが見出された(下記参照)。したがって、この分析により、コロニン-1A含量への白血球のどのような大きな寄与も排除することができる。

血尿中の白血球(WBC)とコロニン-1Aバイオマーカー発現の相関分析
血中のアルブミンの濃度(文献で報告)＝40μg/μl；
BCa患者の尿サンプル中のアルブミンの(我々の実験分析から推定された)濃度範囲＝0.012〜2.56μg/μl(さらなる計算は該範囲の上限を用いて行った)；
BCa患者の尿サンプル中の平均アルブミン濃度＝1.18μg/μl；
それ故に、尿中の血液のおおよその量＝(1/40)*1.18＝0.0295μl[前提：アルブミン源はもっぱら血液である]；
WBC数/血液μl(文献で報告)＝約5000個；
それ故に、尿中の0.0295μlの血液は、(5000*0.0295)＝147.5個のWBCを含む；
単一細胞の重量(文献で報告)＝3.5*10^-3μg；
タンパク質量/細胞(文献で報告)＝0.0007μg[タンパク質の重量は細胞の重量の20％である]
バフィーコートから得られた溶解WBCの約40μgは、(1/0.0007)*40＝57142.86個のWBC[約57,000個のWBC]に由来するであろう；
57,000個のWBCの溶解物のコロニン-1Aブロット強度＝34403である[本研究が行われている研究室で実施されたWB実験から得られた]；
それ故に、147.5個のWBCは、尿中に溶解された場合、(34,403/57000)*147.5＝89.025の強度をもたらすであろう；
BCa尿サンプルのブロットから得られた実際のコロニン-1A強度＝25,788.58(平均値);
理論的に由来したものと比較された実際のブロット強度の倍率変化＝(25,788.58/89.025)＝289.68。

したがって、本研究から、血清アルブミンとコロニン-1A発現との間に相関関係はなく、今回、統計的に算出されたこのバイオマーカーの発現と実験的に得られたものとの差は、BCa患者の尿中のコロニン-1Aの主な寄与因子が溶解した白血球ではなく膀胱腫瘍であることを証明することが確認された。

非膀胱がん患者および種々の慢性疾患にかかっている患者からの尿サンプル中のバイオマーカーの保有率
膀胱がんにおける本開示のバイオマーカーの特異性をさらに評価するために、非膀胱がん患者からの84の尿サンプルおよび多様な慢性疾患を抱える患者からの120の尿サンプルについてウェスタンブロット分析を実施した(表6)。サンプルの大多数は、これら5つのバイオマーカーについて完全に陰性であった；にもかかわらず、いくつかの例では、1つのバイオマーカーの散発的な発現が観察された(図12a、図12bおよび図13)。

5つのバイオマーカーの組み合わせを分析するための診断モデル
本研究は、5つ全ての尿バイオマーカーの異なる組み合わせの臨床的有用性を評価するために、Lasso回帰を用いて診断モデルを開発した(表12Aおよび12B)。

(表１２Ａ)ELISAとウェスタンブロットの両方の尿サンプルデータ解析を用いたTa/T1診断におけるバイオマーカーの精度および閾値

略語：AUC, 曲線下面積；PPV, 陽性予測値；NPV, 陰性予測値

(表１２Ｂ)ELISAとウェスタンブロットの両方の尿サンプルデータ解析を用いたT2/T3診断におけるバイオマーカーの精度および閾値

略語：AUC, 曲線下面積；PPV, 陽性予測値；NPV, 陰性予測値

5つのバイオマーカーの各々の診断性能は、ELISAおよびウェスタンブロットデータを用いて、別々にまたはいろいろな組み合わせで算出された。感度および特異度を、各バイオマーカーのカットオフ値と共に、表12Aおよび12Bに示す。実施例1の結果とは対照的に、ELISAからの発現データを使用して、この最新の研究(実施例2)は、5つ全てのバイオマーカーを組み合わせた診断モデルが最も正確であり、Ta/T1膀胱がん患者を健常者から区別するのに表9Aで0.92のAUCおよび85.3％の全体的な精度(感度79.2％；特異度100％)を達成したことが判明した。同様に、最新の研究(実施例2)においてT2/T3膀胱がん患者を診断するために、この診断モデルは、0.94のAUCおよび90.6％の全体的な精度(感度86.4％；特異度100％；表9B)を達成した。比較して、補体因子Hは、Ta/T1膀胱がんの診断では0.72のAUCおよび73.3％の全体的な精度(感度80％；特異度60％)、ならびにT2/T3膀胱がんの診断では0.51のAUCおよび64.3％の全体的な精度(感度77.8％；特異度40％)を示した(表9Aおよび9B)。

同様に、ウェスタンブロットデータを使用して、この最新の研究(実施例2)は、5つ全てのバイオマーカーを組み合わせた診断モデルが最も正確であり、Ta/T1膀胱がんの診断では0.98のAUCおよび94.8％の全体的な精度(感度93.9％；特異度96.7％)を達成したことが判明した。このように、5つ全てのバイオマーカーを組み合わせた診断モデルは、感度と特異度が非常に高く、FDA承認の補体因子Hを27〜30％上回り、また、Ta/T1膀胱がんの診断のためにこれまでに報告された従来の細胞診または既存のバイオマーカーよりも優れていた。

先進的なMSベースの同位体ジメチル標識技術は、本開示の発明者らが膀胱がん診断のための高精度の新規バイオマーカーのパネルを同定することを可能にした。本研究では、この最先端のアプローチを用いて尿サンプルを分析し、膀胱癌患者の尿プロテオームを健常者のそれに対して相対的に定量化した。広範なフィルタリングおよび文献検索後にMSデータから5つのバイオマーカーを選択した。その後、5つの推定上のバイオマーカーをRT-PCR、ウェスタンブロット、およびELISAアッセイによって検証した。これら5つのバイオマーカーの尿中濃度は、健常者のそれと比較して、膀胱癌を有する患者において上昇した。

ELISAおよびウェスタンブロットからのデータを用いて、膀胱癌検出のためのこれら5つの推定上のバイオマーカーの診断性能を精力的に検証したところ、一例では、正確な診断のために5つ全てのバイオマーカーを組み合わせることが必要であると判明した。健常者は一人も、これら5つのバイオマーカーの検出可能な濃度を有していなかった。本研究では、本開示の5つのバイオマーカーはまた、FDA承認のバイオマーカーである補体因子Hをはじめとする最近のバイオマーカーとも比較された。補体因子Hは、良性腎疾患および尿路感染症、ならびに前立腺がんまたは腎臓がんなどの他の種類のがんに対して60％の特異度を示した。補体因子Hとは異なり、本開示の尿バイオマーカーは、血尿を伴うことがある炎症性膀胱、良性前立腺過形成または腎結石などの良性疾患を有する患者から膀胱癌患者を区別することができた。本明細書に記載した実験的研究は、本研究で試験された慢性疾患またはいくつかの種類のがんにかかった患者の尿中に、本開示のマーカーの一部をまれにしか検出しなかった。

FDA承認のバイオマーカーであるNMP22は、血尿によって影響を受けることが分かっている。そこで、本研究では、血液汚染によるこれらのバイオマーカーの起こり得る寄与をも検討した。尿中のヒト血清アルブミンのレベルはかなりばらつきがあり、健常者においても検出されることがある。特に、糖尿病などの慢性疾患を有する患者からの尿は、本開示で観察された膀胱癌患者の多くからの尿よりも非常に高いレベルのヒト血清アルブミンを含有する。したがって、ヒト血清アルブミンは、血液汚染を必ずしも反映するとは限らない。さらに、血漿または白血球汚染からのこれらのバイオマーカーの寄与は、尿の低速遠心分離後に検出されたこれらのバイオマーカーのレベルを説明することができない。

実施例2では、5つ全てのバイオマーカーは、免疫組織化学的に染色された膀胱癌組織において同様に豊富な発現を示し(図14)、統計分析からは、膀胱癌検出のための5つ全てのバイオマーカーを用いた診断モデルの重要性が実証された。

Claims

コロニン-1A、アポリポタンパク質A-IV、セメノゲリン-2、γシヌクレインおよびDJ-1、ならびにこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも3つである、膀胱がんタンパク質バイオマーカー。
早期ステージ(Ta/T1)および/または後期ステージ(T2/T3)の膀胱がんの指標となる、請求項1に記載の膀胱がんバイオマーカー。
サンプル中で検出される、請求項１または２に記載の膀胱がんバイオマーカー。
サンプルが液状サンプルである、請求項3に記載の膀胱がんバイオマーカー。
液状サンプルが尿または排泄された尿である、請求項4に記載の膀胱がんバイオマーカー。
コロニン-1A、アポリポタンパク質A-IV、セメノゲリン-2、γシヌクレインおよびDJ-1からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の膀胱がんバイオマーカー。
以下を含む、検出システム：
a)膀胱癌に罹患している疑いがある患者からのサンプルを受け取るための受取セクションであって、該サンプルが、請求項1〜6のいずれか一項に記載の1つ以上のバイオマーカーを含む疑いがある、受取セクション、および
b)請求項1〜6のいずれか一項に記載のバイオマーカーを検出することができる1つまたは複数の物質を含む、検出セクション。
検出セクションが、請求項1〜6のいずれか一項に記載のバイオマーカーに結合することができるまたは特異的に結合することができる物質を含む、請求項7に記載の検出システム。
物質が、抗体またはその抗原結合フラグメント、相互作用性の融合タンパク質、アプタマーおよびアフィボディからなる群より選択される生物特異的捕捉試薬である、請求項8に記載の検出システム。
バイオチップまたはテストストリップまたはマイクロタイタープレートである、請求項7〜9のいずれか一項に記載の検出システム。
サンプルが液状サンプルである、請求項7〜10のいずれか一項に記載の検出システム。
患者が膀胱がんまたは早期ステージの膀胱がんもしくは後期ステージの膀胱がんに罹患しているか、またはその再発を示すかどうかの判定を補助するインビトロの方法であって、請求項1〜6のいずれか一項に記載のバイオマーカーの存在を検出する段階を含む、方法。
バイオマーカーがサンプルから検出される、請求項12に記載の方法。
サンプルが液状サンプルである、請求項13に記載の方法。
液状サンプルが尿または排泄された尿である、請求項14に記載の方法。
検出が分子生物学的方法を用いて行われる、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
分子生物学的方法がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ウェスタンブロット、ドットブロット、質量分析法および免疫学的方法からなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
バイオマーカーが患者から得られたサンプル中に含まれるかどうかに関する表示が、対照グループとの結果の比較に基づいて行われる、請求項12〜17のいずれか一項に記載の方法。
対照グループが膀胱がんに罹患していない患者を含む、請求項18に記載の方法。
請求項7〜11のいずれか一項に記載の検出システムを使用する、請求項12〜19のいずれか一項に記載の方法。
請求項7〜11のいずれか一項に記載の検出システムを含む、キット。