JP6549570B2 - 膀胱癌バイオマーカー - Google Patents
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Description
本出願は、2013年11月5日に出願されたシンガポール仮出願第201308203-7号の優先権の恩典を主張するものであり、その内容は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、特定のバイオマーカーにおける生化学に関するものである。特に、本発明は、膀胱癌に関連したバイオマーカー、ならびに患者が膀胱がんまたは早期ステージの膀胱がんもしくは後期ステージの膀胱がんに罹患する可能性、またはその再発を示す可能性を判定するための当該バイオマーカーの使用方法に関する。
膀胱がん(または膀胱癌)は先進国において、特に男性の間で、高頻度に見られる。膀胱がんはまた、5番目に多いがんであり、かなりの罹患率および死亡率をもたらす。膀胱がんは、それがステージ2(T2)に達するや否や、最も攻撃的な腫瘍の一つになることで有名である。こうした腫瘍は高頻度で再発し、最終的にT2ステージに進行することがよく知られているので、早期ステージの膀胱がん(Ta、T1ステージ)患者の早期発見およびモニタリングは非常に重要である。
[本発明1001]
コロニン-1A、アポリポタンパク質A-IV、セメノゲリン-2、γシヌクレインおよびDJ-1、ならびにこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1つである、膀胱がんタンパク質バイオマーカー。
[本発明1002]
早期ステージ(Ta/T1)および/または後期ステージ(T2/T3)の膀胱がんの指標となる、本発明1001の膀胱がんバイオマーカー。
[本発明1003]
サンプル中で検出されると考えられる、前記本発明のいずれかの膀胱がんバイオマーカー。
[本発明1004]
サンプルが液状サンプルである、本発明1003の膀胱がんバイオマーカー。
[本発明1005]
液状サンプルが尿または排泄された尿である、本発明1004の膀胱がんバイオマーカー。
[本発明1006]
コロニン-1A、アポリポタンパク質A-IV、セメノゲリン-2、γシヌクレインおよびDJ-1を含む、前記本発明のいずれかの膀胱がんバイオマーカー。
[本発明1007]
以下を含む、検出システム:
a)膀胱癌に罹患している疑いがある患者からのサンプルを受け取るための受取セクションであって、該サンプルが、本発明1001〜1006のいずれかの1つ以上のバイオマーカーを含む疑いがある、受取セクション、および
b)本発明1001〜1006のいずれかの1つ以上のバイオマーカーを検出することができる物質(複数可)を含む検出セクション。
[本発明1008]
検出セクションが、本発明1001〜1006のいずれかの1つ以上のバイオマーカーに結合することができるまたは特異的に結合することができる物質を含む、本発明1007の検出システム。
[本発明1009]
物質が、抗体またはその抗原結合フラグメント、相互作用性の融合タンパク質、アプタマーおよびアフィボディからなる群より選択される生物特異的捕捉試薬である、本発明1008の検出システム。
[本発明1010]
バイオチップまたはテストストリップまたはマイクロタイタープレートである、本発明1007〜1009のいずれかの検出システム。
[本発明1011]
サンプルが液状サンプルである、本発明1007〜1010のいずれかの検出システム。
[本発明1012]
患者が膀胱がんまたは早期ステージの膀胱がんもしくは後期ステージの膀胱がんに罹患しているか、またはその再発を示すかどうかを判定する方法であって、本発明1001〜1006のいずれかの1つ以上のバイオマーカーの存在を検出する段階を含む、方法。
[本発明1013]
バイオマーカーがサンプルから検出される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
サンプルが液状サンプルである、本発明1013の方法。
[本発明1015]
液状サンプルが尿または排泄された尿である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
検出が分子生物学的方法を用いて行われる、本発明1012〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
分子生物学的方法がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ウェスタンブロット、ドットブロット、質量分析法および免疫学的方法からなる群より選択される、本発明1016の方法。
[本発明1018]
1つ以上のバイオマーカーが患者から得られたサンプル中に含まれるかどうかに関する表示が、対照グループとの結果の比較に基づいて行われる、本発明1012〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
対照グループが膀胱がんに罹患していない患者を含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
本発明1007〜1011のいずれかの検出システムを使用する、本発明1012〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
本発明1007〜1011のいずれかの検出システム、および
本発明1012〜1020のいずれかの方法を実施するために必要な物質
を含む、キット。
表1は、本開示の実験セクションの実施例1の健常者/非がん患者およびがん患者研究コホートの人口統計学的および臨床病理学的特性を示す。
表2Aは、本開示の実験セクションの実施例1のウェスタンブロットおよびドットブロット分析に用いられる抗体を示す。
表2Bは、本開示の実験セクションの実施例1の免疫組織化学的分析に用いられる抗体を示す。
表3は、本開示の実験セクションの実施例1の各患者グループで検出された尿中のマーカーの数を示す。
表4は、補体Hと比較したときの、本開示のバイオマーカーを用いた検出のウェスタンブロット分析の結果を示す。
表5は、本開示の個々のバイオマーカーおよび3つの異なる組み合わせの性能値を示す。
表6は、本開示の実験セクションの実施例2で検討された患者の臨床情報を示す。
表7は、本開示の実験セクションの実施例2に用いられる定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)用のプライマー配列を示す。
表8は、本開示の実験セクションの実施例2に記載されるウェスタンブロット、免疫染色およびELISAアッセイのために使用される抗体およびELISAキットを示す。
表9Aは、本開示の実験セクションの実施例2のTa/T1膀胱がんを診断する際の組み合わせモデルの精度の検討結果を示す。
表9Bは、本開示の実験セクションの実施例2のT2/T3膀胱がんを診断する際の組み合わせモデルの精度の検討結果を示す。
表10は、血漿中の本開示のバイオマーカーの濃度(データベースから得られたデータ)を示す。
表11は、本開示の実験セクションの実施例2の血漿および白血球中のバイオマーカーレベルのピアソン相関分析の結果を示す。
表12Aは、本開示の実験セクションの実施例2に示されるように、尿サンプルのデータ解析にELISAとウェスタンブロットの両方を用いてTa/T1を診断する際のバイオマーカーの精度および閾値の検討結果を示す。
表12Bは、本開示の実験セクションの実施例2に示されるように、尿サンプルのデータ解析にELISAとウェスタンブロットの両方を用いてT2/T3を診断する際のバイオマーカーの精度および閾値の検討結果を示す。
膀胱がん(癌)は、世界中で最もよく見られる5つの悪性疾患のうちの1つである。膀胱がんの80%以上は非筋肉浸潤性(Ta/T1)であり、>90%の5年生存率を有する。しかし、これらの病変を有する患者の約70%は、初期診断の2年以内に腫瘍の再発を生じる。治療しないまま放置すると、初期には非浸潤性の腫瘍(Ta/T1)が、顕著に減少した5年生存率を有する筋肉浸潤性の腫瘍(T2/T3)に進行することがある。この臨床観察は、膀胱がんまたは膀胱がんの再発の早期発見のための正確な診断法の開発を促す。
を認識する抗体、米国Abcam社製);抗セメノゲリンII抗体、例えばAB108085 (ヒトセメノゲリンII(NP_002999)の内部アミノ酸42-91:
内の領域に相当する合成ペプチドを認識する抗体、米国Abcam社製);抗γシヌクレイン抗体、例えばAB55424 (ヒトγシヌクレイン由来の合成ペプチドを認識する抗体、米国Abcam社製);抗DJ-1抗体、例えばSC-27006 (ヒト起源のDJ-1のC末端に位置するペプチドに対して惹起された抗体、米国Santa Cruz社製)およびNB100-483 (ヒトPark7タンパク質のC末端部分(残基100-189間)[UniProt Q99497]に相当する合成ペプチドを認識する抗体、米国Novus Biologicals社製)など。
実施例1
実施例1は、本開示のバイオマーカーに関する予備的研究およびデータを記述する。
材料(臨床検体):
排泄尿サンプルおよび関連する臨床情報は、治験審査委員会の承認とインフォームドコンセントを受けて(IRB # 205-001, 2012-527-B)、この研究を実施する際に収集した。約20mLの排泄尿を健常者と膀胱がん患者から尿採取・保存用チューブ(Norgen Biotek社, カタログ# 18118, 米国)中に採取した。排泄尿サンプルは3つの別々のグループで採取した。第1グループ(コホート1)は、尿路上皮細胞癌、肉眼的血尿、活動性尿路感染症または尿路結石症の病歴がこれまでにない30人から成っていた。これらの検体を対照として用いた。第2グループ(コホート2)は、初期の尿路上皮癌(TaまたはT1)を有する36人から構成され、第3グループ(コホート3)は、後期の尿路上皮癌(T2またはT3)を有する22人から構成されていた。検査室での処理の前に各尿アリコートに独自の識別番号を割り当てた。尿タンパク質を、3kDa遠心フィルターを用いてメーカー(Millipore社, Carrigtwohill, アイルランド)の指示に従って濃縮した。簡単に述べると、14mLの尿サンプルを8000g、4℃で30分間遠心分離した。血液が肉眼で見える検体は除外した。さらなる処理までサンプルを-80℃で保存した。
質量分析
高分解能質量分析(MS)ベースの定量的プロテオミクスアプローチは、2つ以上の異なる条件下でのプロテオームの定量的比較に用いられて成功を収めている。タンパク質レベルを比較し、正確に定量するための最も一般的に使用される方法は、差次的同位体標識の使用に頼っている。SILACなどの代謝標識法は、細胞培養ベースの研究にのみ適用される。タンパク質またはペプチドレベル(採取後の段階)での化学的標識は、生体液を含めて、どのような種類のタンパク質サンプルにも適している。これらのアプローチの中で、安定同位体還元ジメチル(R-diMe)標識は、非常に簡単で、高速かつ安価なマルチプレックス定量的プロテオミクス法であり、この方法はLTQ-Orbitrapのような高分解能MS機器を使用して1回の実験で何千ものタンパク質を定量化することができる。オープンソースの十分に確立されたMaxQuantプログラムは、R-diMeデータを解析するために直接使用することができる。MaxQuantは、タンパク質の同定、相対比率、混合エラーを修復するための比率の正規化、および比率の有意性などの他の関連する統計情報を実行する。
全RNAは、ZR尿RNA単離キット(カタログ番号ZYR.R1039, CA, 米国)を用いて尿の脱落細胞から単離した。排泄尿30mlをシリンジからZRC GF(商標)フィルター[該キットに付属]に押し込んで、該フィルター中に脱落細胞を単離した。次いで、メーカーの説明書に従ってRNAを精製した。RNA濃度およびA260/A280比をNanoDrop(登録商標)ND-1000分光光度計で測定した。RNAの純度をさらに定量化し、80で保存するか、またはリアルタイムPCRに使用した。
全RNA(500ng)は、SuperScript(登録商標)IIIファーストストランド合成システム(Invitrogen社, カタログ番号18080-051, CA, 米国)を用いて逆転写した。RT-PCR前増幅反応は、Premixed ROXを含むEXPRESS SYBR(登録商標)GreenER(商標)qPCRスーパーミックス(Invitrogen社, カタログ番号11794-01K, CA, 米国)を用いて実施した。各反応/ウェルにつき、qPCRスーパーミックス10μLを各希釈cDNAサンプル8μLおよびプライマー2μLと混合して最終容量20μLを得た。プライマー配列は実施例2で表6に示したものと同じであり、次のとおりである:
熱サイクル条件は次のとおりであった:高速リアルタイムPCR反応は、95℃初期テンプレート変性、および40サイクルの95℃変性と60℃アニーリング/伸長から成っていた。この反応は、7900HT高速リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems社)で行った。この反応は、7900 HT高速リアルタイムPCRシステム(Applied Bio systems社)で行った。
タンパク質アッセイキット(Pierce(商標)BCAタンパク質アッセイキット, カタログ番号23225, Rockford, IL, 米国)を用いて尿タンパク質を推定した。個々のサンプルからの尿タンパク質(100μg)をSDSゲル上で分離し、PVDF(ポリフッ化ビニリデン)膜(Bio-Rad Laboratories, カタログ番号162-0177, CA, 米国)に電気泳動的に転写した。この膜をTBST(0.1%Tween-20を含むTris緩衝生理食塩水)中の5%BSA(ウシ血清アルブミン)により室温で1時間ブロックした。表2Aに示した以下の一次抗体をウェスタンブロット分析用に使用した。膜を、最初に一次抗体と、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体とインキュベートすることによってプローブし、増強化学発光検出法(Immobilonウェスタン化学発光HRP基質, EMD Millipore社, 米国)を用いて発色させた。
このアッセイではニトロセルロース膜(BioTrace, Pall Gleman Laboratory, 米国)を使用した。ブロットされる領域を示すために鉛筆でグリッド(格子)を描いた。個々の患者からの処理された排泄尿タンパク質(200μg)をニトロセルロース膜上のグリッドの中心にスポットした。サンプルを膜上にゆっくり加えることで吸着溶液の領域を最小化した。次に膜を1時間放置して乾燥させた。膜上の非特異的部位は、TBS-T中の5%BSAに膜を室温で1時間浸漬することによってブロックした。その後、それをTBS-T中の5%BSAに溶解した一次抗体(希釈範囲1:100〜1:10000)と室温で1時間インキュベートし、続いてTBS-Tを用いて10分間隔で3回洗浄した。HRP結合二次抗体とのインキュベーションを室温で1時間行った後、TBS-Tを用いて10分間隔で3回洗浄した。その膜をECL(Immobilonウェスタン化学発光HRP基質, EMD Millipore社, 米国)とインキュベートし、化学発光イメージングGboxのために露光した。
(Pierce 96ウェルプレート-コーナーノッチ, カタログ番号15041, 米国)(TBS中のSuperBlockブロッキングバッファー, カタログ番号37535, Thermo Fisher Scientific社, 米国)(1-Step(商標)Ultra TMB-ELISA, カタログ番号34028, Thermo Fisher Scientific社, 米国)。各バイオマーカーおよび補体因子Hの尿中タンパク質濃度は、それぞれのELISAキット(USCN Lifescience社, Wuhan, Hubei)を用いて、メーカーの説明書に従って(三つ組で)測定した。これらのキットは表8に示される。尿中のバイオマーカー量は、ELISAプレートの各ウェルに等しい濃度の総タンパク質をロードすることによって標準化した。
各膀胱生検サンプルの一部を10%NBF中で48時間固定し、70%エタノールに移し、次いでパラフィン中に包埋した。サンプルを5μm間隔で10の連続層の薄片に切り分け、組織病理学的検査のためにヘマトキシリンとエオシンで染色した。
高分解能質量分析(MS)ベースの定量的プロテオミクスアプローチは、2つ以上の異なる条件下でのプロテオームの定量的比較に用いられて成功を収めている。タンパク質レベルを比較し、正確に定量するための最も一般的に使用される方法は、代謝的または化学的のいずれかによる、差次的同位体標識の使用に依存している。SILACなどの代謝的標識方法は、細胞培養ベースの研究にのみ直接適用され得る。タンパク質またはペプチドレベルでの化学的標識は、生体液を含めて、どのような種類のタンパク質サンプルにも適している。これらのアプローチの中で、安定同位体還元ジメチル(R-diMe)標識は、非常に簡単で、高速かつ安価なマルチプレックス定量的プロテオミクス法であり、LTQ-Orbitrapのような高分解能MS機器を使用して1回の実験で何千ものタンパク質を定量化することができる。オープンソースの十分に確立されたMaxQuantプログラムは、R-diMeデータを解析するために直接使用することができる。3重標識R-diMe分析を、健常者(対照)、Ta/T1およびT2/T3患者からの濃縮尿サンプルについて実施した。サンプルを、標準的な手順を用いてLys-Cで、続いてトリプシンで消化した。サンプルの複雑さを低減するために、(差次的に標識した尿サンプルから)得られたペプチド混合物を、Agilent 3100 OFFGELフラクショネータでの等電点電気泳動を用いて分画化した。各画分をnanoHPLC (Proxeon, Thermo Scientific社)-LTQ Orbitrap質量分析に供した。生データは、uniprot DROME fasta(18787配列)によりMaxQuantバージョン1.2.0.18を用いて処理した。ジメチルLys4、ジメチルNter4、ジメチルLys8、ジメチルNter8をそれぞれ軽い、中間、重い標識として選択した。最大偽発見率は、タンパク質とペプチドの両方について0.01に設定した。タンパク質は、6アミノ酸の最小長さを有する少なくとも1つの固有のペプチドにより裏付けられた場合に、同定されたと見なした。
膀胱がんバイオマーカーの発見における尿プロテオームの比較分析の評価
最初に、qMS分析は、「方法」に記載したように、4人のボランティアからの等量の尿サンプルをプールすることによって用意された尿サンプルで実施した。実験誤差を最小にするために、生物学的反復(異なるプール)と技術的反復(同じサンプルに対して異なる標識ならびに異なるMSラン)を加えた。最後に、全てのデータセットを組み合わせて、尿サンプル中に存在するタンパク質の平均倍率変化を得た。正常な尿サンプルと比較して2倍以上の変化を有するタンパク質はどれも、過剰分泌タンパク質と見なした(表3)。
実施例2は、実施例1の継続的な最新の研究であり、本開示のバイオマーカーの信頼性を検証するために、基本的に同じ実験が(より大きなサンプルサイズで)行われた。
尿サンプル
排泄尿サンプルおよび関連する臨床情報(表6)は、治験審査委員会の承認とインフォームドコンセントを受けて収集した。初期スクリーニングのために、排泄尿20mlを健常者と膀胱癌患者から保存チューブ内に集めて、-80℃で保存した(Norgen Biotek社, カナダ)。3つの別々のグループが構成された:尿路上皮細胞癌、肉眼的血尿、活動性の尿路感染症または尿路結石症の病歴がこれまでにない健常者に相当する、対照グループ;非筋肉浸潤性の膀胱癌があることを特徴とする、TaおよびT1膀胱癌患者により構成された、第2グループ;および筋肉浸潤性膀胱癌があることを特徴とする、T2およびT3膀胱癌患者を含む、第3グループ。検査室での処理の前に、各尿アリコートに独自の識別番号を割り当てた。目視検査により判定して、またはディップスティック尿検査(Combur9, Roche Diagnostics社, Basel, スイス)に基づいて、かなりの血液汚染がある尿サンプルは除外した。さらに処理するまでサンプルを-80℃で保存した。
尿タンパク質は、3kDa遠心フィルターを用いてメーカー(Millipore社, Carrigtwohill, アイルランド)の指示に従って濃縮した。各コホート、すなわち健常、Ta/T1およびT2/T3膀胱癌ステージ、からの4つのサンプルをプールし、8000×g、4℃で30〜60分間遠心分離した。アセトン沈殿したサンプルを100mM重炭酸アンモニウム中の8M尿素120μlの中に再調製した。1Mジチオスレイトールを各サンプル中5mMの最終濃度にまで添加することによりサンプルを還元し、次いで室温で30分間インキュベートした。0.5Mヨードアセトアミドを10mMの最終濃度にまで添加することによりアルキル化を実施し、サンプルを暗所で30分間インキュベートした。次に、全てのサンプルを、100mM重炭酸アンモニウムを用いて初期8M尿素から6M尿素に希釈し、その後Lys-C(酵素対タンパク質比1:100)と共に37℃で一晩インキュベートした。消化混合物を50mM重炭酸アンモニウムの添加により1M尿素の最終濃度に調整し、続いてトリプシン(酵素対タンパク質比1:50)と共に37℃で4時間インキュベートした。
全RNAは、ZR尿RNA単離キット(Zymo Research社, Irvine, CA)を用いて尿サンプル5ml中の脱落細胞から単離した。全RNA(500ng)を、SuperScript(登録商標)IIIファーストストランド合成システム(Invitrogen社, Carlsbad, CA)を用いて逆転写した。RT-PCR前増幅反応は、Premixed ROXを含むEXPRESS SYBR(登録商標)GreenER(商標)qPCRスーパーミックス(Invitrogen社)を用いて実施した。プライマー配列は表7に示される。
ウェスタンブロットは、尿サンプルを遠心分離して細胞を除去したもので実施した。タンパク質の濃度は、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce社, Rockford, IL)を用いて推定した。個々のサンプルからのタンパク質(100μg)をドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)に電気泳動的に転写した。この膜を、0.1%Tween-20を含むTris緩衝生理食塩水(TBST)中の5%ウシ血清アルブミン(BSA)により室温で1時間ブロックし、続いて表8に示した一次抗体を用いてプローブした。
各バイオマーカー(コロニン-1A、アポリポタンパク質A4、セメノゲリン-2、γシヌクレイン、およびDJ-1)の尿中タンパク質濃度ならびにFDA承認の補体因子Hのそれは、それぞれのELISAキット(表8)(USCN Lifescience社, Wuhan, Hubei)を用いて測定した。アッセイはメーカーの指示に従って行った、全ての試験を三つ組で行った。尿中のバイオマーカー量は、ELISAプレートの各ウェルに総タンパク質の等濃度をロードすることによって標準化した。測定は、自動マイクロプレートリーダーInfinite(登録商標)M1000 PRO (Tecan社, Mannedorf, スイス)を用いて450nmで行った。
膀胱癌生検サンプルを10%中性緩衝ホルマリン(NBF)中で48時間固定し、70%エタノールに移し、次いでパラフィン中に包埋した。4μmの組織切片を組織病理学的検査のためにヘマトキシリンとエオシンで染色した。熱誘導性エピトープ回復は、Bond(商標)Epitope Retrieval Solution 2(pH9.0用)を用いて100℃で40分間実施した。免疫組織化学的染色は、Leica Bond(商標)自動染色装置を用いて行ったが、この装置は専用のBond(商標)Detection Refine Kit (Leica社, Solms, ドイツ)を使用する。全ての免疫蛍光標識は、表8に示した抗体の希釈率を用いて実施した。
全てのデータは、GraphPad Prism(登録商標)5.0ソフトウェアを用いて分析した。RT-PCRデータでは、健常者、Ta/T1およびT2/T3患者間のバイオマーカー発現の有意差または倍率変化を、両側マン・ホイットニーU検定を用いて評価した。ウェスタンブロットデータの強度は、画像処理プログラムImageJ (National Institute of Health, Bethesda, MD)を用いて定量化した。バイオマーカーと血漿との何らかの関連性については、ピアソンの相関試験を行った。5つのバイオマーカーを組み合わせる診断モデルは、Matlab(登録商標)R2012a統計ツールボックスバージョン8.0(Math Works社, Natick, MA)からLasso回帰モデルを用いて開発した。較正曲線は、ELISAキットにより提供された精製タンパク質を用いて作成した。受信者動作特性(ROC)曲線およびAUCは、Graphpad Prism(登録商標)(GraphPad Software社, La Jolla, CA)を用いて作成した。より高いAUC(>0.5)は偶然よりも強い予測因子を示した。各バイオマーカーの閾値は、ヨーデン指標J=感度+特異度−1に基づいて選択した。感度、特異度、陽性予測値(PPV)、陰性予測値(NPV)、および全体的な精度は、診断のために選択された閾値を用いて計算した。p<0.05(両側)のp値を有意と見なした。
定量的MSを用いた膀胱癌検出のための候補バイオマーカーの同定
非筋肉浸潤性(Ta/T1)および筋肉浸潤性(T2/T3)の膀胱癌を診断するための潜在的なバイオマーカーを同定するために、MS分析を、等量の4人のボランティアからのプールされた尿サンプルを用いて実施した。実験誤差を最小にするために、生物学的反復(異なるプール)と技術的反復(同じサンプルに対して異なる標識ならびに異なるMSラン)を含めた。最後に、全体のデータセットを組み合わせて、健康な尿サンプルと比較して、膀胱癌の尿サンプル中に存在するタンパク質の平均倍率変化を得た。健常者からのサンプルと比較して、(少なくとも1つのステージで)少なくとも2回の比率カウントにより2倍以上の変化を有するタンパク質を過剰分泌タンパク質と見なした。過剰分泌タンパク質は、広範囲にわたるオンラインデータベース文献検索を通じて精査され、その新規性、以前に発表された癌との関連性、および細胞内局在に基づいて選抜された。
一次選考を経て残った潜在的なバイオマーカーは、3つのグループ:対照グループ(健常者)、Ta/T1膀胱癌(非筋肉浸潤性)グループ;およびT2/T3膀胱癌(筋肉浸潤性)グループの各々につき10個のサンプルを用いたRT-PCRによる初期検証のために検討された。mRNA発現解析の結果に基づいて、5つの候補バイオマーカー、すなわちコロニン-1A、アポリポタンパク質A4、セメノゲリン-2、γシヌクレイン、およびDJ-1は、健常者と比較して、非筋肉浸潤性(Ta/T1)および筋肉浸潤性(T2/T3)膀胱癌患者において有意に高い発現の倍率変化を有していた。補体因子Hもまた、膀胱癌患者の尿において、より高いmRNA発現を示した(図8)。
30人の健常者、72人の非筋肉浸潤性膀胱癌(Ta/T1)患者および55人の筋肉浸潤性膀胱癌(T2/T3)患者からの尿サンプルを分析した。非筋肉浸潤性膀胱癌と筋肉浸潤性膀胱癌の全ての尿サンプルは、5つのうち少なくとも3つのバイオマーカーの上昇したレベルを示した(図9)。バンド強度値を用いて確立されたROC曲線は、5つのバイオマーカーの組み合わせを用いて、健常vs非筋肉浸潤性膀胱癌(Ta/T1)および健常vs筋肉浸潤性膀胱癌(T2/T3)について、それぞれ0.98および1.0のAUCを示した(図7b、表9Aおよび9B)。
血尿は尿路疾患を有する多くの患者において発生し、そのため、血尿は本開示の所定のバイオマーカーを用いた膀胱癌の診断に影響を与える可能性がある。というのは、これらのタンパク質は、低レベルではあるが、血液中にも見られるからである。表10は、データベース検索に基づいて、血漿中のバイオマーカー類のうち4種の保有率を提供する。
血中のアルブミンの濃度(文献で報告)=40μg/μl;
BCa患者の尿サンプル中のアルブミンの(我々の実験分析から推定された)濃度範囲=0.012〜2.56μg/μl(さらなる計算は該範囲の上限を用いて行った);
BCa患者の尿サンプル中の平均アルブミン濃度=1.18μg/μl;
それ故に、尿中の血液のおおよその量=(1/40)*1.18=0.0295μl[前提:アルブミン源はもっぱら血液である];
WBC数/血液μl(文献で報告)=約5000個;
それ故に、尿中の0.0295μlの血液は、(5000*0.0295)=147.5個のWBCを含む;
単一細胞の重量(文献で報告)=3.5*10-3μg;
タンパク質量/細胞(文献で報告)=0.0007μg[タンパク質の重量は細胞の重量の20%である]
バフィーコートから得られた溶解WBCの約40μgは、(1/0.0007)*40=57142.86個のWBC[約57,000個のWBC]に由来するであろう;
57,000個のWBCの溶解物のコロニン-1Aブロット強度=34403である[本研究が行われている研究室で実施されたWB実験から得られた];
それ故に、147.5個のWBCは、尿中に溶解された場合、(34,403/57000)*147.5=89.025の強度をもたらすであろう;
BCa尿サンプルのブロットから得られた実際のコロニン-1A強度=25,788.58(平均値);
理論的に由来したものと比較された実際のブロット強度の倍率変化=(25,788.58/89.025)=289.68。
膀胱がんにおける本開示のバイオマーカーの特異性をさらに評価するために、非膀胱がん患者からの84の尿サンプルおよび多様な慢性疾患を抱える患者からの120の尿サンプルについてウェスタンブロット分析を実施した(表6)。サンプルの大多数は、これら5つのバイオマーカーについて完全に陰性であった;にもかかわらず、いくつかの例では、1つのバイオマーカーの散発的な発現が観察された(図12a、図12bおよび図13)。
本研究は、5つ全ての尿バイオマーカーの異なる組み合わせの臨床的有用性を評価するために、Lasso回帰を用いて診断モデルを開発した(表12Aおよび12B)。
略語:AUC, 曲線下面積;PPV, 陽性予測値;NPV, 陰性予測値
略語:AUC, 曲線下面積;PPV, 陽性予測値;NPV, 陰性予測値
Claims (21)
- コロニン-1A、アポリポタンパク質A-IV、セメノゲリン-2、γシヌクレインおよびDJ-1、ならびにこれらの変異体からなる群より選択される少なくとも3つである、膀胱がんタンパク質バイオマーカー。
- 早期ステージ(Ta/T1)および/または後期ステージ(T2/T3)の膀胱がんの指標となる、請求項1に記載の膀胱がんバイオマーカー。
- サンプル中で検出される、請求項1または2に記載の膀胱がんバイオマーカー。
- サンプルが液状サンプルである、請求項3に記載の膀胱がんバイオマーカー。
- 液状サンプルが尿または排泄された尿である、請求項4に記載の膀胱がんバイオマーカー。
- コロニン-1A、アポリポタンパク質A-IV、セメノゲリン-2、γシヌクレインおよびDJ-1からなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の膀胱がんバイオマーカー。
- 以下を含む、検出システム:
a)膀胱癌に罹患している疑いがある患者からのサンプルを受け取るための受取セクションであって、該サンプルが、請求項1〜6のいずれか一項に記載の1つ以上のバイオマーカーを含む疑いがある、受取セクション、および
b)請求項1〜6のいずれか一項に記載のバイオマーカーを検出することができる1つまたは複数の物質を含む、検出セクション。 - 検出セクションが、請求項1〜6のいずれか一項に記載のバイオマーカーに結合することができるまたは特異的に結合することができる物質を含む、請求項7に記載の検出システム。
- 物質が、抗体またはその抗原結合フラグメント、相互作用性の融合タンパク質、アプタマーおよびアフィボディからなる群より選択される生物特異的捕捉試薬である、請求項8に記載の検出システム。
- バイオチップまたはテストストリップまたはマイクロタイタープレートである、請求項7〜9のいずれか一項に記載の検出システム。
- サンプルが液状サンプルである、請求項7〜10のいずれか一項に記載の検出システム。
- 患者が膀胱がんまたは早期ステージの膀胱がんもしくは後期ステージの膀胱がんに罹患しているか、またはその再発を示すかどうかの判定を補助するインビトロの方法であって、請求項1〜6のいずれか一項に記載のバイオマーカーの存在を検出する段階を含む、方法。
- バイオマーカーがサンプルから検出される、請求項12に記載の方法。
- サンプルが液状サンプルである、請求項13に記載の方法。
- 液状サンプルが尿または排泄された尿である、請求項14に記載の方法。
- 検出が分子生物学的方法を用いて行われる、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 分子生物学的方法がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ウェスタンブロット、ドットブロット、質量分析法および免疫学的方法からなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
- バイオマーカーが患者から得られたサンプル中に含まれるかどうかに関する表示が、対照グループとの結果の比較に基づいて行われる、請求項12〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 対照グループが膀胱がんに罹患していない患者を含む、請求項18に記載の方法。
- 請求項7〜11のいずれか一項に記載の検出システムを使用する、請求項12〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項7〜11のいずれか一項に記載の検出システムを含む、キット。
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