CN111487406A - 一种γ突触核蛋白(SNCG)的胶体金试纸条及其制备方法和用途 - Google Patents

一种γ突触核蛋白(SNCG)的胶体金试纸条及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种SNCG胶体金试纸条，所述试纸条从加样端开始依次为样本垫、金结合物垫、反应膜和吸收垫，所述金结合物垫含有第一鼠抗SNCG单克隆抗体，所述反应膜上还有第二鼠抗SNCG单克隆抗体。本发明制备的SNCG胶体金试纸条，除了可以在医院完成常规检测外，还可以带至家中自行完成检测，相比ELISA，具有方便、快捷、经济、高效的特点，更加适用于肿瘤的普筛。

Description

一种γ突触核蛋白(SNCG)的胶体金试纸条及其制备方法和 用途
技术领域
本发明属于肿瘤标志物检测领域，具体地，本发明涉及用于检测肿瘤的γ突触核蛋白(SNCG)的胶体金试纸条及其制备方法和用途。
背景技术
近年来，恶性肿瘤已成为全球范围内严重危害人类健康及生命的重大疾病之一。人们谈癌色变，并普遍认为癌症为不治之症，这主要源于其治愈率、死亡率高并具有广泛的分布性。数据显示，2015年，我国新发癌症病例429.2万例，死亡281.4万例。我国癌症发病率接近世界水平，但死亡率高于世界水平。
癌症死亡率居高不下，一个重要原因在于我国癌症发现较多处于中晚期。美国近些年来癌症的发病率有所下降，其5年生存率大约在60％至70％，而我国肿瘤患者5年生存率大约在30％左右。
现有数据表明，2015年全国新发病例最多的是肺癌，其次是胃癌、食管癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌和膀胱癌等(Wanqing Chen等，Cancer Statistics in China，2015.CACANCER J CLIN 2016；66:115–132.)。癌症高发，增加的不仅仅是患者的伤痛，还给家庭、社会带来沉重的经济负担。相关资料估计，每年全国因肿瘤造成的门诊和住院花费数百亿元，远高于其他慢性病的医疗费用，是卫生总费用上涨的重要因素之一。
癌症的高致死率主要由于癌细胞具有转移和侵袭能力，约90％的癌症病人死于癌细胞的转移，然而早期的治疗干预则会提高治疗效果。在肿瘤确诊之前若病灶已经发生多处微小转移，即便有些癌症仍可能治愈，但希望大大降低。因此，早期诊断和治疗对于提高癌症病人的生存率具有至关重要的意义。发展中国家癌症患者的死亡率高于发达国家的一个很重要原因即是诊断不及时，未在早期及时发现癌症。
当前一些较为常见的检测手段，如X线、超声、PET-CT、核磁共振成像等影像学方法在癌症诊断方面的作用是值得肯定的，但由于准确度等问题，它们在临床应用上仍存在着局限性，有时甚至会与病理诊断结果存在出入，对于一般家庭而言，多次使用核磁共振检测所需花费太大，这就导致了在癌症检测时间上的延误；一些有一定放射性的检测方法，如X线、CT、PET或其组合，也不适于频繁检测；而通过穿刺获取病人组织样本进行组织化学分析这一方法，耗时长、操作复杂且对病人损害较大。相比而言，肿瘤早期检测期望实现具有对正常人群及疑似患病人群初步诊断并允许频繁检测的目标，从这些角度来看，以上方法不适合作为广泛人群癌症早期检测。
发展成本低、易操作、便携式、低损伤、高准确性和快速的癌症早期检测方法为当前所急需。随着科技日新月异，飞速发展，基因类分子诊断的研究也正蓬勃发展，但由于检测指标的成熟度及项目准入审批等原因，目前临床应用仍较少。
肿瘤蛋白标记物是肿瘤细胞产生和释放的某种物质，常以抗原、酶、蛋白或肽类激素等代谢产物的形式存在于病人肿瘤细胞组织内或宿主体液、排除物中，根据其生化或免疫特性可以识别或诊断肿瘤。肿瘤蛋白标记物在临床上主要用于对原发肿瘤的发现、肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断肿瘤治疗效果的观察和评价以及肿瘤复发和预后的预测等。近年来，新的肿瘤标记物不断发现、检查手段不断完善和改进，使得其灵敏性和准确性不断提高，为肿瘤患者的早期诊断和早期治疗提供更确切充足的依据。在免疫试剂产品的实际检测应用中，抗原抗体反应是关键。
γ突触核蛋白(γ-synuclein，γ-SYN)是通过比较cDNA文库的方法筛选出的一个在浸润性乳腺癌文库中高表达而在正常乳腺组织中无表达的基因，序列比对发现其与已知的生长因子和癌基因没有同源性，但与一类神经相关泛白SYN有着很好的同源性，从而作为SYN家族第3个成员而被命名为γ-SYN。γ-SYN作为SYN家族的一员，与该家族的另两个成员α-SYN、β-SYN的基因定位于不同染色体区域，分别位于4q21.3-q22(α-SYN)、5q35(β-SYN)和10q23(γ-SYN)。γ-SYN与α-SYN、β-SYN有着55.9％和54.3％的氨基酸序列同源性，SYN家族蛋白是14000大小的细胞浆蛋白，在生理状态下主要特异性地表达在神经试剂盒。γ-SYN被证实在肿瘤尤其是雌激素相关肿瘤中发挥着与肿瘤增生、浸润和转移相关的重要作用。
γ-SYN作为一种与乳腺癌发生、转移相关的癌基因，其过表达并不是由于γ-SYN基因扩增引起的。通过序列分析也并未发现γ-SYN点突变的存在，预示γ-SYN的过表达实在mRNA转录调控水平上发生了改变，通过对γ-SYN启动子调控区进行分析，发现在γ-SYN的第1个外显子区存在一个CpG岛，而高表达的乳腺癌细胞系和组织中该CpG岛均有去甲基化现象，不同肿瘤中存在不同的去甲基化谱这与γ-SYN表达的组织特异性有关。
RNA印迹分析(Northern blot)发现γ-SYN在大脑黑质、丘脑中呈高度表达，而在正常的乳腺、肝、前列腺、肺和小肠等组织中均无表达，但在乳腺癌组织中，通过反转录聚合酶链反应和原位杂交的方法均检测到了γ-SYN的异常表达，随后在蛋白水平上利用印迹分析(Western blot)和组织化学的方法均检测到了γ-SYN的表达，并发现其表达与乳腺癌分期相关。Liu等(Liu H等，Loss of epigenetic control of synuclein-gamma gene as amolecular indicator of metastasis in a wide range of human cancers.CancerRes.2005Sep 1；65(17):7635-7643)利用免疫组化的方法，发现γ-SYN(即SNCG，以下简称SNCG)在肝癌、胃癌、食管癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌和子宫内膜癌等肿瘤中均存在较高的表达，而与之对应的正常组织几乎没有表达，同时在I期肿瘤中SNCG的表达低于II、III期肿瘤，表明SNCG的表达与多种肿瘤的分期均有相关性。
发明内容
目前，在临床检测领域尚无SNCG的检测方法，在专利和科研文献领域，有使用ELISA技术平台检测SNCG的报道，但ELISA相比胶体金而言，检测过程要繁琐和耗时，且无法实现床边检测(POCT),因此，当前对更方便、快捷、经济、高效的SNCG检测方法存在需求。
基于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种SNCG的胶体金试纸条，本发明还提供了该试纸条的制备方法及其在制备癌症检测试剂盒中的用途。
本发明涉及一种SNCG胶体金试纸条，所述试纸条从加样端开始依次为样本垫、金结合物垫、反应膜和吸收垫，所述金结合物垫含有第一鼠抗SNCG单克隆抗体，所述反应膜上还有第二鼠抗SNCG单克隆抗体。
在一具体方面中，本发明的试纸条的第一鼠抗SNCG单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.2469的杂交瘤细胞株分泌。
在一具体方面中，本发明的试纸条的第二鼠抗SNCG单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.2468的杂交瘤细胞株分泌。
所述保藏号为CGMCC NO.2469的杂交瘤细胞株和保藏号为CGMCC NO.2468的杂交瘤细胞株制备SNCG单克隆抗体的方法，描述于申请号为200810105770.7，发明名称为“SNCG单克隆抗体及其应用”的中国专利申请，通过引用将其整体并入本文。
在一具体方面中，本发明的试纸条的金结合物垫上第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为0.1-0.2μg/cm2，优选为0.12～0.18μg/cm2，进一步优选为0.13-0.17μg/cm2，最优选为0.133-0.167μg/cm2。。
在一具体方面中，本发明的试纸条的金结合物垫上酪蛋白钠的含量为0.02-0.09mg/cm2，优选为0.03-0.08mg/cm2，进一步优选为0.04-0.07mg/cm2，最优选为0.042-0.067mg/cm2。在一具体方面中，本发明的试纸条的金结合物垫上Triton X-100的含量为0.04-0.15mg/cm2，优选为0.05-0.13mg/cm2，进一步优选为0.06-0.11mg/cm2，最优选为0.067-0.1mg/cm2。
在一具体方面中，本发明的试纸条的反应膜上第二鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为1.0-10.0μg/cm2，优选为2.0-9.0μg/cm2，进一步优选为3.0-8.0μg/cm2，最优选为5.0-6.0μg/cm2。
在一具体方面中，本发明试纸条上的检测线为1～3条，优选为1条。
在一具体方面中，本发明的试纸条的样本垫和金结合物垫之间设置有全血滤膜。
本发明还涉及一种SNCG胶体金试纸条的制备方法，所述方法包括：
制备胶体金颗粒；
将胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG单克隆抗体结合，形成胶体金标记的鼠抗SNCG抗体胶体金结合物；
将所述SNCG抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂、干燥得到金结合物垫；
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜，其中分别将含有第二鼠抗SNCG单克隆抗体的溶液和含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线；
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上，使样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列，并裁切得到试纸条。
在一具体方面中，上述制备方法中第一鼠抗SNCG单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.2469的杂交瘤细胞株分泌。
在一具体方面中，上述制备方法中第二鼠抗SNCG单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.2468的杂交瘤细胞株分泌。
在一具体方面中，上述制备方法中所述将胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG抗体结合，所述胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG单克隆抗体的质量比为5-40:1，优选为10-35:1，最优选为15-30:1。
在一具体方面中，上述制备方法中所述将所述SNCG抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂，包括将所述胶体金结合物用金结合物重悬液复溶，复溶后所述第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为1-20μg/mL，优选为3-15μg/mL，进一步优选为5-12μg/mL，最优选为8-10μg/mL。
在一具体方面中，上述制备方法中所述将胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG单克隆抗体结合，包括使用酪蛋白钠作为稳定剂，所述酪蛋白钠与所述第一鼠抗SNCG单克隆抗体的质量比为50-500:1，进一步优选为100-450:1，最优选为150-375:1。在一具体方面中，上述制备方法中所述金结合物重悬液含有Triton X-100，所述Triton X-100的含量为1-10g/L，优选为2-8g/L，进一步优选为3-7g/L，最优选为4-6g/L。
在一具体方面中，上述制备方法中所述含有第二鼠抗SNCG单克隆抗体的溶液中第二鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为0.1-1.0mg/mL，优选为0.2-0.8mg/mL，进一步优选为0.4-0.7mg/mL，最优选为0.5-0.6mg/mL。在一具体方面中，上述制备方法中所述将含有第二鼠抗SNCG单克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成1～3条检测线。
在一具体方面中，上述制备方法还包括将全血滤膜粘贴在样本垫和金结合物垫之间。
本发明还涉及上述试纸条的制备方法，所述方法包括：
制备胶体金颗粒；
将胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG单克隆抗体结合，形成胶体金标记的鼠抗SNCG抗体胶体金结合物；
将所述SNCG抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂、干燥得到金结合物垫；
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜，其中分别将含有第二鼠抗SNCG单克隆抗体的溶液和含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线；
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上，使样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列，并裁切得到试纸条。
本发明还涉及上述试纸条在制备癌症检测试剂盒中的用途，所述癌症选自膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胃癌、食管癌中的一种或多种。
在一具体方面中，上述用途用于检测选自血液、血清、血浆、尿液中的一种或多种样本。
在一具体方面中，所述用途包括：
将一定量的样本滴加到试剂盒的样品垫；
一段时间后，将试剂盒插入检测仪中，判读结果。
在一具体方面中，所述用途中检测样本的用量为80-120μL。
在一具体方面中，所述用途中一段时间为8-10min。
本发明还涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含上述试纸条或利用上述方法制备的试纸条。
在一具体方面中，上述试剂盒用于癌症的检测，所述癌症选自膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胃癌、食管癌中的一种或多种。
在一具体方面中，上述试剂盒用于检测选自血液、血清、血浆、尿液中的一种或多种样本。
具体来说，本发明涉及如下方面：
1一种SNCG胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条从加样端开始依次为样本垫、金结合物垫、反应膜和吸收垫，所述金结合物垫含有第一鼠抗SNCG单克隆抗体，所述反应膜上还有第二鼠抗SNCG单克隆抗体。
2如项1所述的试纸条，其特征在于，所述第一鼠抗SNCG单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.2469的杂交瘤细胞株分泌。
3如项1所述的试纸条，其特征在于，所述第二鼠抗SNCG单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.2468的杂交瘤细胞株分泌。
4如项1所述的试纸条，其特征在于，所述金结合物垫上第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为0.1-0.2μg/cm2，优选为0.12～0.18μg/cm2，进一步优选为0.13-0.17μg/cm2，最优选为0.133-0.167μg/cm2。
5如项1所述的试纸条，其特征在于，所述金结合物垫上酪蛋白钠的含量为0.02-0.09mg/cm2，优选为0.03-0.08mg/cm2，进一步优选为0.04-0.07mg/cm2，最优选为0.042-0.067mg/cm2。
6如项1所述的试纸条，其特征在于，所述金结合物垫上Triton X-100的含量为0.04-0.15mg/cm2，优选为0.05-0.13mg/cm2，进一步优选为0.06-0.11mg/cm2，最优选为0.067-0.1mg/cm2。
7如项1所述的试纸条，其特征在于，所述反应膜上第二鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为1.0-10.0μg/cm2，优选为2.0-9.0μg/cm2，进一步优选为3.0-8.0μg/cm2，最优选为5.0-6.0μg/cm2。
8如项1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条上的检测线为1～3条，优选为1条。
9如项1所述的试纸条，其特征在于，在所述样本垫和金结合物垫之间设置有全血滤膜。
10一种SNCG胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
制备胶体金颗粒；
将胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG单克隆抗体结合，形成胶体金标记的鼠抗SNCG抗体胶体金结合物；
将所述SNCG抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂、干燥得到金结合物垫；
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜，其中分别将含有第二鼠抗SNCG单克隆抗体的溶液和含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线；
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上，使样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列，并裁切得到试纸条。
11如项10所述的制备方法，其特征在于，所述第一鼠抗SNCG单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.2469的杂交瘤细胞株分泌。
12如项10所述的制备方法，其特征在于，所述第二鼠抗SNCG单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.2468的杂交瘤细胞株分泌。
13如项10所述的制备方法，其特征在于，所述将胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG抗体结合，所述胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG单克隆抗体的质量比为5-40:1，优选为10-35:1，最优选为15-～30:1。
14如项10所述的制备方法，其特征在于，所述将所述SNCG抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂，包括将所述胶体金结合物用金结合物重悬液复溶，复溶后所述第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为1-20μg/mL，优选为3-15μg/mL，进一步优选为5-12μg/mL，最优选为8-10μg/mL。
15如项10所述的制备方法，其特征在于，所述将胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG单克隆抗体结合，包括使用酪蛋白钠作为稳定剂，所述酪蛋白钠与所述第一鼠抗SNCG单克隆抗体的质量比为50-500:1，进一步优选为100-450:1，最优选为150-375:1。16如项14所述的制备方法，其特征在于，所述金结合物重悬液含有Triton X-100，所述Triton X-100的含量为1-10g/L，优选为2-8g/L，进一步优选为3-7g/L，最优选为4-6g/L。
17如项10所述的制备方法，其特征在于，所述含有第二鼠抗SNCG单克隆抗体的溶液中第二鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为0.1-1.0mg/mL，优选为0.2-0.8mg/mL，进一步优选为0.4-0.7mg/mL，最优选为0.5-0.6mg/mL。
18如项10所述的制备方法，其特征在于，所述将含有第二鼠抗SNCG单克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成1～3条检测线。
19如项10所述的制备方法，其特征在于，还包括将全血滤膜粘贴在样本垫和金结合物垫之间。
20如项1-9所述的试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
制备胶体金颗粒；
将胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG单克隆抗体结合，形成胶体金标记的鼠抗SNCG抗体胶体金结合物；
将所述SNCG抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂、干燥得到金结合物垫；
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜，其中分别将含有第二鼠抗SNCG单克隆抗体的溶液和含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线；
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上，使样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列，并裁切得到试纸条。
21项1-9所述的试纸条在制备癌症检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述癌症选自膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胃癌、食管癌中的一种或多种。
22如项21所述的用途，其特征在于，所述试剂盒用于检测选自血液、血清、血浆、尿液中的一种或多种样本。
23如项21所述的用途，其特征在于，所述用途包括：
将一定量的样本滴加到试剂盒的样品垫；
一段时间后，将试剂盒插入检测仪中，判读结果。
24如项23所述的用途，其特征在于，所述检测样本的用量为80-120μL。
25如项23所述的用途，其特征在于，所述一段时间为8-10min。
26一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒其包含权利要求1-9中任一项所述的试纸条或者利用权利要求10-20所述的方法制备的试纸条。
27如项26所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于癌症的检测，所述癌症选自膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胃癌、食管癌中的一种或多种。
28如项26或27所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测选自血液、血清、血浆、尿液中的一种或多种样本。
本发明制备的SNCG胶体金试纸条，除了可以在医院完成常规检测外，还可以带至家中自行完成检测，相比ELISA，具有方便、快捷、经济、高效的特点，更加适用于肿瘤的普筛。
附图说明
图1本发明的胶体金试纸条的结构图。
附图标记说明：1-样本垫、2-金结合物垫、3-反应膜、31-检测线、32-质控线、4-吸收垫。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
如图1所示，本发明的SNCG胶体金试纸条包括从加样端依次排列的样本垫1，金结合物垫2，反应膜3和吸收垫4。其中反应膜3上有检测线31和质控线32。
其中，样本垫1用于滴加检测样本，材质为玻璃纤维素膜。
具体的，金结合物垫2是在玻璃纤维素膜上喷点胶体金标记的鼠抗SNCG抗体胶体金结合物形成的。金结合物垫2含第一鼠抗SNCG单克隆抗体，第一鼠抗SNCG单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.2469的杂交瘤细胞株分泌，含量为0.1-0.2μg/cm2，优选为0.12～0.18μg/cm2，进一步优选为0.13-0.17μg/cm2，最优选为0.133-0.167μg/cm2。金结合物垫2还可含有酪蛋白钠，含量为0.02-0.09mg/cm2，优选为0.03-0.08mg/cm2，进一步优选为0.04-0.07mg/cm2，最优选为0.042-0.067mg/cm2。金结合物垫2还可含有Triton X-100，含量为0.04-0.15mg/cm2，优选为0.05-0.13mg/cm2，进一步优选为0.06-0.11mg/cm2，最优选为0.067-0.1mg/cm2。具体的，反应膜3的材质为硝酸纤维素膜。其中，将含有第二鼠抗SNCG单克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成检测线31，将含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成质控线。反应膜3上第二鼠抗SNCG单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.2468的杂交瘤细胞株分泌，含量为1.0-10.0μg/cm2，优选为2.0-9.0μg/cm2，进一步优选为3.0-8.0μg/cm2，最优选为5.0-6.0μg/cm2，最优选为0.5-0.6μg/cm2。检测线31为1～3条，例如可以是1条，2条或3条，优选为1条。
进一步的，样本垫1和金结合物垫2之间有全血滤膜，用于血液相关样本的检测。
本发明还提供了一种SNCG胶体金试纸条的制备方法，所述方法包括：
制备胶体金颗粒；
将胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG单克隆抗体结合，形成胶体金标记的鼠抗SNCG抗体胶体金结合物；
将所述SNCG抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂、干燥得到金结合物垫；
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜，其中分别将含有第二鼠抗SNCG单克隆抗体的溶液和含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线；
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上，使样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列，并裁切得到试纸条。
具体的，所述将胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG抗体结合，所述胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG单克隆抗体的质量比为5-40:1，优选为10-35:1，最优选为15-30:1。
具体的，所述将所述SNCG抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂，包括将所述胶体金结合物用金结合物重悬液复溶，复溶后所述第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为1-20μg/mL，优选为3-15μg/mL，进一步优选为5-12μg/mL，最优选为8.-10μg/mL。
具体的，所述将胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG单克隆抗体结合，包括使用酪蛋白钠作为稳定剂，所述酪蛋白钠与所述第一鼠抗SNCG单克隆抗体的质量比为50-500:1，进一步优选为100-450:1，最优选为150-375:1。
具体的，所述金结合物重悬液含有Triton X-100，所述Triton X-100的含量为1-10g/L，优选为2-8g/L，进一步优选为3-7g/L，最优选为4-6g/L。
具体的，所述含有第二鼠抗SNCG单克隆抗体的溶液中第二鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为0.1-1.0mg/mL，优选为0.2-0.8mg/mL，进一步优选为0.4-0.7mg/mL，最优选为0.5-0.6mg/mL。
本发明还提供了所述的试纸条在制备癌症检测试剂盒中的用途，所述癌症选自膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胃癌、食管癌中的一种或多种。
其中，所述试剂盒用于检测选自血液、血清、血浆、尿液中的一种或多种样本。
具体的，所述用途包括：
将一定量的样本滴加到试剂盒的样品垫；
一段时间后，将试剂盒插入检测仪中，判读结果。
检测样本的用量为80-120μL，例如可以是80μL，90μL，100μL，110μL，120μL。一段时间为8-10min，例如可以是8min，8.5min，9min，9.5min，10min。
检测仪可以是定量检测仪也可以是半定量检测仪。对于半定量检测仪，检测结果的判断标准如下：
①结果大于4ng/mL：仪器显示阳性；
②结果≥2ng/mL，≤4ng/mL：仪器显示可疑；
③结果小于2ng/mL：仪器显示阴性；
④无效：仪器提示无显示或结果错误，表明试验无效。对于无效的检测结果，应用新的检测试纸条重新测试。
对于定量检测仪，直接读取检测结果的数值即可。
另外，也可以直接将样本滴加到试纸条的样品垫，然后肉眼判读检测结果。其中，检测结果的判断标准如下：
①阴性：只在质控区出现一条红色条带，检测区无红色条带出现；
②阳性：在检测区与质控区均出现一条红色条带；
③无效：质控区和检测区均无红色条带出现，或只在检测区出现一条红色条带。
本发明还涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含上述试纸条或利用上述方法制备的试纸条。
其中，上述试剂盒用于癌症的检测，所述癌症选自膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胃癌、食管癌中的一种或多种。
其中，上述试剂盒用于检测选自血液、血清、血浆、尿液中的一种或多种样本。
本发明制备的试纸条和试剂盒能够有效的检测膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、胃癌、食管癌，并且具有很高的灵敏性和特异性。其中，检测膀胱癌的灵敏性能达到75.0％以上，肾癌的灵敏性能达到60％以上，前列腺癌的灵敏性能达到55.6％以上，子宫内膜癌的灵敏性能达到55.6％以上，乳腺癌的灵敏性能达到55.6％以上，食管癌的灵敏性能达到50.0％以上，胃癌的灵敏性能达到55.6％以上，在正常人中的特异性能达到100％。
在本文中，灵敏性是指患有明确临床疾病的患者的样本，其检测结果呈阳性的比率。正常人中的特异性是指没有特定临床疾病的患者的样本，其检测结果呈阴性的比率。
实施例1
在下述实施例中，除非另外说明，实施例中使用的物质均为市售的产品。
(1)制备胶体金颗粒
取氯金酸1.0g，平衡至室温，量取2.0mL纯化水，加入装有氯金酸的玻璃瓶中，反复吹打至氯金酸完全溶解。将溶解的氯金酸倒入容器中，并用纯化水反复冲洗氯金酸玻璃瓶5次，洗液倒回容器中。用纯化水将溶液定容至10.0mL。盖紧瓶盖，充分摇晃15分钟，混合均匀，配制成10％的氯金酸溶液。
量取10％氯金酸溶液0.3mL，加入到100.0mL纯化水中，边加热边搅拌至沸腾。量取0.6mL的10％柠檬酸三钠溶液，迅速、一次性加入到沸腾的氯金酸溶液中，继续加热煮沸2min，关掉热源用预热加热5min。冷却至室温后加纯化水定容至100.0mL，得到含有胶体金颗粒的溶液。
(2)第一鼠抗SNCG单克隆抗体和第二鼠抗SNCG单克隆抗体的制备
采用申请号为200810105770.7，发明名称为“SNCG单克隆抗体及其应用”的中国专利申请中描述的SNGG单克隆抗体的制备方法，用保藏号为CGMCC NO.2469的杂交瘤细胞株分泌第一鼠抗SNCG单克隆抗体，用保藏号为CGMCC NO.2468的杂交瘤细胞株分泌第二鼠抗SNCG单克隆抗体。
(3)胶体金标记的鼠抗SNCG抗体胶体金结合物的制备
取100.0mL(0.03g)胶体金于三角瓶中，准确加入3.5mL 0.1M的碳酸钾溶液，混匀，静置10分钟。取0.85mg步骤(2)中制备的第一鼠抗SNCG单克隆抗体，在快速搅拌条件下，将第一鼠抗SNCG单克隆抗体逐滴加入到三角瓶中，室温放置40分钟。取1.5mL的10g/100mL酪蛋白钠溶液，在快速搅拌条件下，逐滴加入到三角瓶中，室温静置15分钟。得到胶体金标记的鼠抗SNCG抗体胶体金结合物。
(4)金结合物垫的制备
将上述胶体金结合物在12000rpm，4℃下离心40分钟，小心弃去上清液，加入胶体金结合物重悬液至原体积，将胶体金结合物用胶体金重悬液复溶，使得复溶后第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为8.5μg/mL，将复溶液在玻璃纤维膜上喷涂，喷涂量为0.0166mL/cm2，干燥得到金结合物垫。喷涂完毕后置于干燥间干燥5小时即得金结合物垫，之后于室温干燥器内保存。
其中，胶体金结合物重悬液的制备如下：
将硼酸0.124g，硼砂0.762g，蔗糖150.0g，牛血清白蛋白7.0g，酪蛋白钠1.0g，吐温20 5g，聚乙烯吡咯烷酮K30 5g，聚乙二醇-20000 1g，加纯化水700.0mL，搅拌使充分溶解后，加入浓盐酸适量，搅拌均匀，调节pH至7.4。充分搅拌溶解后定容至1000mL。
(5)在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜。
取步骤(2)中制备的第二鼠抗SNCG抗体加入到5.0mL 0.05M PBS中，充分混匀后用0.05MPBS缓冲液定容至终体积10.0mL，使第二鼠抗SNCG的终浓度为0.56mg/mL。将含有第二鼠抗SNCG单克隆抗体的溶液按照喷涂量10μL/cm2喷涂到硝酸纤维素膜上，形成检测线3条。
取羊抗鼠多克隆抗体15.0mg，加入到5.0mL 0.05M PBS缓冲液中，充分混匀后用0.05MPBS缓冲液定容至终体积10.0mL，使羊抗鼠多克隆抗体的终浓度为1.5mg/mL。将含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液按照10μL/cm2喷涂到硝酸纤维素膜上，形成质控线。将包被完毕检测线和质控线的反应膜放入干燥车间干燥5小时。
(6)将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上，使样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列，并使裁切得到试纸条。
经计算，制备得到的试纸条上，金结合物垫上第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为0.142μg/cm2，金结合物垫上酪蛋白钠的含量为0.042mg/cm2，反应膜上第二鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为5.6μg/cm2。
实施例2
(1)制备胶体金颗粒
制备步骤与实施例1相同。
(2)第一鼠抗SNCG单克隆抗体和第二鼠抗SNCG单克隆抗体的制备
制备步骤与实施例1相同。
(3)胶体金标记的鼠抗SNCG抗体胶体金结合物的制备
与实施例1中的区别在于，取0.8mg第一鼠抗SNCG单克隆抗体。将1.5mL的10g/100mL酪蛋白钠溶液换为1.0mL的10g/100mL牛血清白蛋白溶液，其它反应条件与实施例1相同。
(4)金结合物垫的制备
与实施例1中的区别在于，使得复溶后第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为8.0μg/mL，喷涂完毕后置于干燥间干燥6小时即得金结合物垫。胶体金结合物重悬液制备中使用4gTriton X-100代替吐温20 5g。其它反应条件与实施例1相同。
(5)在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜。
与实施例1中的区别在于，使第二鼠抗SNCG的终浓度为0.53mg/mL。＝形成的检测线为2条。其它反应条件与实施例1相同。
(6)与实施例1中的步骤相同。。
经计算，制备得到的试纸条上，金结合物垫上第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为0.133μg/cm2，金结合物垫上Triton X-100的含量0.067mg/cm2，反应膜上第二鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为5.3μg/cm2。
实施例3
(1)制备胶体金颗粒
制备步骤与实施例1相同。
(2)第一鼠抗SNCG单克隆抗体和第二鼠抗SNCG单克隆抗体的制备
制备步骤与实施例1相同。
(3)胶体金标记的鼠抗SNCG抗体胶体金结合物的制备
与实施例1中的区别在于，取0.9mg第一鼠抗SNCG单克隆抗体。将1.5mL的10g/100mL酪蛋白钠溶液换为2.5mL的10g/100mL酪蛋白钠溶液，其它反应条件与实施例1相同。
(4)金结合物垫的制备
与实施例1中的区别在于，使得复溶后第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为9.0μg/mL，喷涂完毕后置于干燥间干燥6小时即得金结合物垫。胶体金结合物重悬液制备中使用5.5g Triton X-100代替吐温20 5g。其它反应条件与实施例1相同。(5)在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜。
与实施例1中的区别在于，使第二鼠抗SNCG的终浓度为0.50mg/mL。形成的检测线为1条。其它反应条件与实施例1相同。
(6)与实施例1中的步骤相同。
经计算，制备得到的试纸条上，金结合物垫上第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为0.15μg/cm2，金结合物垫上酪蛋白钠的含量为0.058mg/cm2，金结合物垫上Triton X-100的含量0.092mg/cm2，反应膜上第二鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为5.0μg/cm2。
实施例4
(1)制备胶体金颗粒
制备步骤与实施例1相同。
(2)第一鼠抗SNCG单克隆抗体和第二鼠抗SNCG单克隆抗体的制备
制备步骤与实施例1相同。
(3)胶体金标记的鼠抗SNCG抗体胶体金结合物的制备
与实施例1中的区别在于，取1.0mg第一鼠抗SNCG单克隆抗体。将1.5mL的10g/100mL酪蛋白钠溶液换为2.0mL的10g/100mL酪蛋白钠溶液，其它反应条件与实施例1相同。
(4)金结合物垫的制备
与实施例1中的区别在于，使得复溶后第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为10μg/mL，喷涂完毕后置于干燥间干燥6小时即得金结合物垫。胶体金结合物重悬液制备中使用6.0g Triton X-100代替吐温20 5g。其它反应条件与实施例1相同。(5)在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜。
与实施例1中的区别在于，使第二鼠抗SNCG的终浓度为0.58mg/mL。形成的检测线为1条。其它反应条件与实施例1相同。
(6)与实施例1中的步骤相同。
经计算，制备得到的试纸条上，金结合物垫上第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为0.167μg/cm2，金结合物垫上酪蛋白钠的含量为0.05mg/cm2，金结合物垫上Triton X-100的含量0.1mg/cm2，反应膜上第二鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为5.8μg/cm2。
实施例5
(1)制备胶体金颗粒
制备步骤与实施例1相同。
(2)第一鼠抗SNCG单克隆抗体和第二鼠抗SNCG单克隆抗体的制备
制备步骤与实施例1相同。
(3)胶体金标记的鼠抗SNCG抗体胶体金结合物的制备
与实施例1中的区别在于，取0.95mg第一鼠抗SNCG单克隆抗体。将1.5mL的10g/100mL酪蛋白钠溶液换为3.0mL的10g/100mL酪蛋白钠溶液，其它反应条件与实施例1相同。
(4)金结合物垫的制备
与实施例1中的区别在于，使得复溶后第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为9.5μg/mL，喷涂完毕后置于干燥间干燥6小时即得金结合物垫。胶体金结合物重悬液制备中使用5.0g Triton X-100代替吐温20 5g。其它反应条件与实施例1相同。(5)在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜。
与实施例1中的区别在于，使第二鼠抗SNCG的终浓度为0.60mg/mL。形成的检测线为1条。其它反应条件与实施例1相同。
(6)将样本垫、全血滤膜、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上，使样本垫、全血滤膜、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列，并使裁切得到试纸条。
经计算，制备得到的试纸条上，金结合物垫上第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为0.158μg/cm2，金结合物垫上酪蛋白钠的含量为0.067mg/cm2，金结合物垫上Triton X-100的含量0.083mg/cm2，反应膜上第二鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为6.0μg/cm2。
上述5个实施例制备试纸条的具体的反应条件如表1所示。
表1.不同实施例制备试纸条的反应条件
Figure BDA0002313439220000171
实施例6
将实施例1中制备的试纸条，用于膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、食管癌、胃癌等7种癌症的半定量检测。
具体的，将实施例1制备的试纸条插入胶体金免疫层析分析仪器(GD-010)中，分别取120μL癌症(7种不同癌症)患者的尿液和正常人的尿液，其中，正常人16例，膀胱癌12例，肾癌10例，前列腺癌9例，子宫内膜癌9例，乳腺癌9例，食管癌10例，胃癌9例。将不同的尿液滴加到试纸条的样本垫上，加样8min后判读结果。
其中，①结果大于4ng/mL：仪器显示阳性；
②结果≥2ng/mL，≤4ng/mL：仪器显示可疑；
③结果小于2ng/mL：仪器显示阴性；
④若无效：仪器提示无显示或结果错误，表明试验无效。
测试结果如表2所示。根据表2的检测结果，本试剂盒检测膀胱癌的灵敏性为83.3％(10/12)，肾癌的灵敏性为60.0％(6/10)，前列腺癌的灵敏性为66.7％(6/9)，子宫内膜癌的灵敏性为55.6％(5/9)，乳腺癌的灵敏性为55.6％(5/9)，食管癌的灵敏性为50.0％(5/10)，胃癌的灵敏性为66.7％(6/9)，在正常人中的特异性为93.8％(15/16)。
表2. 7种癌和正常人尿液样本检测结果
Figure BDA0002313439220000181
Figure BDA0002313439220000191
实施例7
将实施例2中制备的试纸条，用于膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌等7种癌症的定量检测。
具体的，将实施例2制备的试纸条插入胶体金免疫层析分析仪器(GD-010)中，分别取100μL癌症(7种不同癌症)患者的尿液和正常人的尿液，其中，正常人16例，膀胱癌12例，肾癌10例，前列腺癌9例，子宫内膜癌9例，乳腺癌9例，食管癌10例，胃癌9例。将不同的尿液滴加到试纸条的样本垫上，加样10min后判读结果。
测试结果如表3所示。根据表3的检测结果(检测结果大于4ng/ml为阳性，小于等于4ng/ml为阴性)，本试剂盒检测膀胱癌的灵敏性为75.0％(9/12)，肾癌的灵敏性为70.0％(7/10)，前列腺癌的灵敏性为55.6％(5/9)，子宫内膜癌的灵敏性为55.6％(5/9)，乳腺癌的灵敏性为55.6％(5/9)，食管癌的灵敏性为50.0％(5/10)，胃癌的灵敏性为55.6％(5/9)，在正常人中的特异性为87.5％(14/16)。
表3. 7种癌和正常人尿液样本检测结果
Figure BDA0002313439220000192
Figure BDA0002313439220000201
实施例8
将实施例3中制备的试纸条，用于膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌等7种癌症的定量检测。
具体的，将实施例3制备的试纸条插入胶体金免疫层析分析仪器(GD-010)中，分别取90μL癌症(7种不同癌症)患者(5例)的尿液和正常人(2例)的尿液，其中，正常人16例，膀胱癌12例，肾癌10例，前列腺癌9例，子宫内膜癌9例，乳腺癌9例，食管癌10例，胃癌9例。将不同的尿液滴加到试纸条的样本垫上，滴加到试纸条的样本垫上，加样9min后判读结果。
测试结果如表4所示。根据表4的检测结果(检测结果大于4ng/ml为阳性，小于等于4ng/ml为阴性)，本试剂盒检测膀胱癌的灵敏性为91.7％(11/12)，肾癌的灵敏性为70.0％(7/10)，前列腺癌的灵敏性为66.7％(6/9)，子宫内膜癌的灵敏性为55.6％(5/9)，乳腺癌的灵敏性为55.6％(5/9)，食管癌的灵敏性为60.0％(6/10)，胃癌的灵敏性为66.7％(6/9)，在正常人中的特异性为93.8％(15/16)。
表4. 7种癌和正常人尿液样本检测结果
Figure BDA0002313439220000202
Figure BDA0002313439220000211
实施例9
将实施例4中制备的试纸条，用于膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌等7种癌症的定量检测。
具体的，将实施例4制备的试纸条插入胶体金免疫层析分析仪器(GD-010)中，分别取80μL癌症(7种不同癌症)患者(5例)的尿液和正常人(2例)的尿液，其中，正常人16例，膀胱癌12例，肾癌10例，前列腺癌9例，子宫内膜癌9例，乳腺癌9例，食管癌10例，胃癌9例。将不同的尿液滴加到试纸条的样本垫上，滴加到试纸条的样本垫上，加样8min后判读结果。
测试结果如表5所示。根据表5的检测结果(检测结果大于4ng/ml为阳性，小于等于4ng/ml为阴性)，本试剂盒检测膀胱癌的灵敏性为91.7％(11/12)，肾癌的灵敏性为80.0％(8/10)，前列腺癌的灵敏性为66.7％(6/9)，子宫内膜癌的灵敏性为66.7％(6/9)，乳腺癌的灵敏性为55.6％(5/9)，食管癌的灵敏性为60.0％(6/10)，胃癌的灵敏性为66.7％(6/9)，在正常人中的特异性为100.0％(16/16)。
表5. 7种癌和正常人尿液样本定量检测结果
Figure BDA0002313439220000212
Figure BDA0002313439220000221
实施例10
将实施例5中制备的试纸条，用于膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌等7种癌症的定量检测。
具体的，将实施例1制备的试纸条插入胶体金免疫层析分析仪器(GD-010)中，分别取100μL癌症(7种不同癌症)患者(5例)的血浆和正常人(2例)的血浆，其中，正常人16例，膀胱癌12例，肾癌10例，前列腺癌9例，子宫内膜癌9例，乳腺癌9例，食管癌10例，胃癌9例。将不同的血浆滴加到试纸条的样本垫上，滴加到试纸条的样本垫上，加样10min后判读结果。
测试结果如表6所示。根据表6的检测结果(检测结果大于4ng/ml为阳性，小于等于4ng/ml为阴性)，本试剂盒检测膀胱癌的灵敏性为91.7％(11/12)，肾癌的灵敏性为70.0％(7/10)，前列腺癌的灵敏性为66.7％(6/9)，子宫内膜癌的灵敏性为55.6％(5/9)，乳腺癌的灵敏性为55.6％(5/9)，食管癌的灵敏性为50.0％(5/10)，胃癌的灵敏性为66.7％(6/9)，在正常人中的特异性为93.8％(15/16)。
表6. 7种癌和正常人血浆样本检测结果
Figure BDA0002313439220000222
Figure BDA0002313439220000231

Claims (10)

1.一种SNCG胶体金试纸条，其特征在于，所述试纸条从加样端开始依次为样本垫、金结合物垫、反应膜和吸收垫，所述金结合物垫含有第一鼠抗SNCG单克隆抗体，所述反应膜上还有第二鼠抗SNCG单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述第一鼠抗SNCG单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.2469的杂交瘤细胞株分泌。
3.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述第二鼠抗SNCG单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.2468的杂交瘤细胞株分泌。
4.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述金结合物垫上第一鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为0.1-0.2μg/cm2，优选为0.12-0.18μg/cm2，进一步优选为0.13-0.17μg/cm2，最优选为0.133-0.167μg/cm2。
5.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述金结合物垫上酪蛋白钠的含量为0.02-0.09mg/cm2，优选为0.03-0.08mg/cm2，进一步优选为0.04-0.07mg/cm2，最优选为0.042-0.067mg/cm2。
6.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述金结合物垫上Triton X-100的含量为0.04-0.15mg/cm2，优选为0.05-0.13mg/cm2，进一步优选为0.06-0.11mg/cm2，最优选为0.067-0.1mg/cm2。
7.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述反应膜上第二鼠抗SNCG单克隆抗体的含量为1.0-10.0μg/cm2，优选为2.0-9.0μg/cm2，进一步优选为3.0-8.0μg/cm2，最优选为5.0-6.0μg/cm2。
8.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条上的检测线为1～3条，优选为1条。
9.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，在所述样本垫和金结合物垫之间设置有全血滤膜。
10.一种SNCG胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
制备胶体金颗粒；
将胶体金颗粒与第一鼠抗SNCG单克隆抗体结合，形成胶体金标记的鼠抗SNCG抗体胶体金结合物；
将所述SNCG抗体胶体金结合物在玻璃纤维膜上喷涂、干燥得到金结合物垫；
在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜，其中分别将含有第二鼠抗SNCG单克隆抗体的溶液和含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液喷涂到硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线；
将样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上，使样本垫、金结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列，并裁切得到试纸条。
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