CN106018807A - 一种快速诊断和监控肺癌的免疫层析检测条及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的一种快速诊断和监控肺癌的免疫层析检测条及其制备方法,采用双抗体夹心法原理检测小细胞肺癌和/或非小细胞肺癌的肿瘤标志物(抗原),从而判断肺癌是否发生。本发明提供的免疫层析检测条便于携带和保存;操作简单,方法稳定,且在10分钟完成测试。具有可定量、半定量和定性检测的特点,能反映肺癌的肿瘤标志物的浓度范围和变化趋势,明显方便临床诊断和治疗检测的使用。本发明还可使用测试仪器,能简单快速的检测样品中的肿瘤标志物(抗原)。
Description
技术领域
本发明属于生物医药和医学检验技术领域,尤其涉及一种快速诊断和监控肺癌的免疫层析检测条及其制备方法。
背景技术
肺癌是目前全世界癌症死因的第一名,我国现在也是世界第一肺癌大国。肺癌是引发死亡率最高的癌症,在过去的三十年里,中国人肺癌死亡率增加了464.15%,非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌比例的85%。鳞状细胞癌,腺癌和大细胞癌都属于非小细胞肺癌的子型。小细胞肺癌所占比例不高,但恶性强度很高。中国人肺癌发生率每年递增20%。在过去的二十年肺癌病患的存活率非常低。
早期检测肺癌是抗争肺癌的最好方式。目前市场上已有影像学检测,例如CT扫描、核磁(MRI)扫描能够看到肺癌的发生部位、大小,以及是否已经转移、转移部位等信息,但这种方法不能频繁使用,对患者的身体辐射较大而且费用较为昂贵。此外,肺组织穿刺细胞学检查对肺癌的早期诊断及确诊率也有重要的临床价值,采用手术肺穿刺取活体检测标本经固定、包埋、切片、染色后由经验丰富的病理学医师验片诊断,细胞学检测肺癌很大程度上依赖专业经验才能准确给出诊断结果,并且操作繁琐、获取诊断结果周期较长,同时患者的身体和精神伤害较大,不能满足人们快速检测的需要。
血液肿瘤标志物的检测在肺癌的早期诊断和早期治疗中具有重要参考价值,但由于肺癌细胞多型性的特点,现有的单一肺癌血液肿瘤标志物灵敏度较低,例如,近年来,检测肺癌标记物的免疫检测方法有化学发光法和酶标法,这些方法虽然具有快速、准确、特异性高的特点,但是操作需检测设备和专业人员操作,灵敏度也有待提高。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种快速诊断和监控肺癌的免疫层析检测条,使该检测条具有较高的灵敏度和较准确的检测结果,同时还能完成定性和定量的检测。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种快速诊断和监控肺癌的免疫层析检测条,包括底板,所述底板上由下向上次为样品吸收区、固相标记抗体区、反应区和吸水区,所述反应区设有检测线T和质控线C,所述检测线T设置有一条或两条,所述质控线C设置一条或多条;所述检测线包被有检测小细胞肺癌和/或非小细胞肺癌的肿瘤标志物对应的抗体;所述固相标记抗体区有检测小细胞肺癌和/或非小细胞肺癌的肿瘤标志物对应的标记抗体。
优选的,所述小细胞肺癌的肿瘤标志物SCLC神经化烯醇化酶为NEC、胃泌素释放肽前体pro-GRP。
优选的,所述非小细胞肺癌的肿瘤标志物NSCLC抗原为角蛋白类抗原CYFRA21-1、磷状细胞抗原SCC或组织多肽特异性抗原TPS。
优选的,所述标记抗体的标记物为金颗粒、或酶、或光或碳粒。
优选的,所述检测线上包被的肿瘤标志物对应抗体的包被的浓度为1~3mg/ml。
优选的,所述免疫检测条还包括盛装检测条的塑料壳。
优选的,所述样品吸收区吸收的样品为血液,血清或血浆。
优选的,所述检测线T的显色情况用肉眼观察或根据读数器测定的数据得到定量检测结果,或者以对照区质控线C的强度未对照,得到半定量检测结果。
本发明还提供了上述技术方案所述的快速诊断和监控肺癌的免疫层析检测条的制备方法,其特征在于,包括下列步骤:
1)将标记抗体溶解于缓冲液中,得到稀释的标记抗体,将所述的稀释的标记抗体喷涂在固相膜,如,玻璃纤维纸。然后在真空干燥器进行干燥;
2)将包被抗体溶液划线于反应区上的检测区形成T线,将划线的反应区放在25~37℃环境下烘干10~20分钟;
3)将样品吸收区、固相标记抗体区、反应区和吸水区进行裁剪后后按照由上向下的顺序依次固定在底板上,上端再贴上吸水区,切割成条,得到免疫检测条;
本发明提供的一种快速诊断和监控肺癌的免疫层析检测条,包括底板,所述底板上由下向上次一次设置有样品吸收区、固相标记抗体区、反应区和吸水区,所述反应区设有检测线T和质控线C,所述检测线T设置有一条或两条,所述质控线C设置一条或多条;所述检测线包被有检测小细胞肺癌和/或非小细胞肺癌的肿瘤标志物对应的抗体;所述固相标记抗体区有检测小细胞肺癌和/或非小细胞肺癌的肿瘤标志物对应的标记抗体。本发明采用双抗体夹心法原理检测肺癌的肿瘤标志物,本发明选用合适的肺癌肿瘤标志物,以同时采用美国JAJ international,Inc.San Diego公司生产的具有与各肿瘤标志物抗原高度特异性的抗体得到具有高灵敏度的免疫检测条。所述免疫检测条便于携带和保存;操作简单,方法稳定、可单个测试,且在10分钟完成测试。具有可定量和半定量测定的特点,能反映肺癌的肿瘤标志物的浓度范围和变化趋势,明显方便临床诊断和治疗检测的使用。本发明还可使用测试仪器,能简便、快速的检测样品中的肿瘤标志物。
进一步的,本发明所述免疫检测条检测非小细胞肺癌的肿瘤标志物CYFRA 21-1,结果表明所述免疫检测条的灵敏度为5ng/ml;本发明所述免疫检测条检测小细胞肺癌的肿瘤标志物NEC,结果表明所述免疫检测条的灵敏度为15ng/ml;本发明所述免疫检测条检测小细胞肺癌的肿瘤标志物ProGRP,结果表明所述免疫检测条的灵敏度为15ng/ml。
附图说明
图1为本发明实施例1得到的非小细胞肺癌肿瘤标志物CYFRA 21-1定性检测阳性结果;
图2为本发明实施例1得到的非小细胞肺癌肿瘤标志物CYFRA 21-1定性检测阴性结果;
图3为本发明实施例1得到的非小细胞肺癌肿瘤标志物CYFRA 21-1定量检测结果;
图4为本发明实施例2得到的小细胞肺癌的肿瘤标志物NSE定性检测阳性结果;
图5为本发明实施例2得到的小细胞肺癌的肿瘤标志物NSE定性检测阴性结果;
图6为本发明实施例2得到的小细胞肺癌的肿瘤标志物NSE定量检测结果;
图7为本发明实施例3得到的小细胞肺癌pro-GRP定性检测阳性结果;
图8为本发明实施例3得到的小细胞肺癌pro-GRP定性检测阴性结果;
图9为本发明实施例3得到的小细胞肺癌pro-GRP定量检测结果;
图10为本发明实施例4得到的CYFRA 21-1和NSE二个肺癌肿瘤标志物在同一个检测条上的定性检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种快速诊断和监控肺癌的免疫层析检测条,所述检测条上由下向上次依次设置有样品吸收区、固相标记抗体区、反应区和吸水区,所述反应区设有检测线T和质控线C,所述检测线T设置有一条或两条,所述质控线C设置一条或多条;所述检测线包被有检测小细胞肺癌和/或非小细胞肺癌的肿瘤标志物对应的抗体;所述固相标记抗体区有检测小细胞肺癌和/或非小细胞肺癌的肿瘤标志物对应的标记抗体。
本发明采用双抗体夹心法原理检测肺癌的肿瘤标志物,所述免疫检测条具有检测结果准确、灵敏度高的特点,且便于携带和保存;操作简单,方法稳定、可单个测试,且在10分钟完成测试。具有可定量和半定量测定的特点,能反映肺癌的肿瘤标志物的浓度范围和变化趋势,明显方便临床诊断和治疗检测的使用。本发明还可使用测试仪器,能快速的检测样品中的肿瘤标志物。
本发明提供的免疫检测条包括底板。本发明对所述底板的材质、尺寸和来源没有特殊的限制,采用本领域技术人员熟知的用于免疫检测条中的底板即可。在本发明中,所述底板的材质优选为塑料或胶片材料。本发明实施例中所用的底板为PVC板,为市售商品。
本发明提供的免疫检测条包括设置在所述底板上的样品吸收区。在本发明中,所述样品吸收区的材料优选为玻璃纤维。本发明对所述玻璃纤维的来源没有任何限制,本领域技术人员所熟知的玻璃纤维即可。本发明对所述样品吸收区粘帖在底板的下端,将所述样品吸收区的下边缘与底板下边缘平齐。
本发明中,所述样品吸收区吸收的样品为血液,血清或血浆。所述血液的来源没有限制,采用本领域技术人员所熟知的血液或血清、血浆即可。本发明实施例中添加的样品也可以为手指血。
本发明提供的免疫检测条包括设置在底板上的固相标记抗体区,所述固相标记抗体区位于样品吸收区上方,并且所述固相标记抗体区与样品吸收区的重叠1.5mm。在本发明中,所述固相标记抗体区的材料优选为玻璃纤维。
本发明提供的免疫检测条包括设置在所述底板上的反应区,所述反应区紧邻所述固相标记抗体区,位于所述固相标记抗体区的上方,并且所述反应区和所述固相标记抗体区重叠1.5mm。在本发明中,所述反应区的材料优选为硝酸纤维素膜。
在本发明中,所述反应区设置有检测线T和质控线C。所述检测线T位于质控线C的下面,所述检测线T靠近固相标记抗体区,所述质控线C靠近吸水区段。
本发明对所述检测线T的条数为一条或两条,当所述检测线T为一条时,所述检测线T包被有检测小细胞肺癌或非小细胞肺癌的肿瘤标志物对应的抗体;当所述检测线为两条时,两条检测线T分别包被有小细胞肺癌和非小细胞肺癌的肿瘤标志物所对应的抗体。所述两条检测线T包被小细胞肺癌和非小细胞肺癌的肿瘤标志物所对应的抗体的上下位置关系没有特殊限制。在本发明中,所述抗体的包被浓度优选为2~3mg/ml。
本发明中,所述的小细胞肺癌的肿瘤标志物优选为NEC、胃泌素释放肽前体pro-GRP。
本发明中,所述非小细胞肺癌的肿瘤标志物抗原优选为角蛋白类抗原CYFRA 21-1、磷状细胞抗原SCC或组织多肽特异性抗原TPS。
本发明的实施例中,所述肿瘤标志物对应的抗体和标记抗体的一抗体来源均来自JAJ international,Inc.San Diego,CA,USA。本发明实施例中所述的非小细胞肺癌的肿瘤标志物CYFRA 21-1的包被抗体的产品型号为#CY-0402,非小细胞肺癌的肿瘤标志物CYFRA 21-1的标记抗体的产品型号为#CY-0128;所述的小细胞肺癌的肿瘤标志物NEC的包被抗体产品型号为#EC-0222,所述的小细胞肺癌的肿瘤标志物NEC的标记抗体产品型号为#NEC-0128;所述的小细胞肺癌的肿瘤标志物Pro GRP的包被抗体产品型号为#GRP-0512,所述的小细胞肺癌的肿瘤标志物Pro GRP的标记抗体产品型号为#GRP-0518。
本发明中,所述检测线T的显色情况用肉眼观察或根据读数器测定的数据得到定量检测结果,或者以对照区质控线C的强度为对照,得到半定量检测结果。
本发明提供的免疫检测条包括设置在所述底板上的吸水区,所述吸水区紧邻反应区,设置在所述反应区的上方,并且所述反应区与底板的上边缘平齐。本发明对所述吸水纸的来源没有任何限制,本领域技术人员所熟知的吸水纸即可。
本发明提供免疫检测条优选还包括盛装检测条的塑料壳。在本发明中,所述塑料壳包括底盖和与所述底盖配合的顶盖,所述底盖有宽度与检测条对应的凹槽,检测条的长度和宽度与凹槽的大小吻合,所述顶盖上设置有与反应区和样品添加区大小相同的孔洞,以便操作者观察检测结果。
本发明提供的上述技术方案所述免疫检测条的制备方法,包括下列步骤:
1)将标记抗体溶解于缓冲液中,将所述的稀释的标记抗体喷涂在固相膜,如,玻璃纤维纸,然后在真空干燥器进行干燥;
2)将抗体溶液划线于反应区上形成检测线T线,同时将兔抗鼠IgG溶液划线与反应区上形成质控线C线,将划线的反应区放在25~37℃环境下烘干10~20分钟;
3)将样品吸收区、固相标记抗体区、层析膜吸水纸固定在底板上,切割成条,得到免疫检测条;
本发明对所述标记“抗体金颗粒”没有特殊限制,采用本领域技术人员所熟知的标记“抗体金颗粒”液即可。
将一抗体溶液划线于反应区上形成检测线T线,将兔抗鼠IgG溶液划线于反应区上形成质控线C线,得到划线的反应区。本发明对所述划线的方式并没有限制,采用本领域技术人员熟知的标记抗体喷涂方式即可。本发明实施例中划线采用划线仪进行划线,所述划线仪的型号为Biodot ZX-1000CA,USA。在本发明中,所述包被液的浓度优选为2mg/ml;所述包被液喷涂量优选为每20cm硝酸纤维素膜喷涂80ul/秒
得到划线的反应区后,本发明将划线的反应区放在25~37℃环境下烘干10~20分钟,得到烘干的反应区。本发明对所述烘干的方法没有特殊限制,采用本领域技术人员所熟知的烘干方法即可。
得到固相标记抗体区和反应区后,本发明将样品吸收区、固相标记抗体区、反应区和吸水区进行裁剪后固定在底板上,得到组装的底板。
本发明对所述组装优选为先在底板由下而上依次粘帖样品吸收区、固相标记抗体区、反应区、吸水区,所述粘帖使所述各区的交叠1.5~2mm。
得到组装的底板后,本发明将组装的底板进行切条,得到免疫检测条。本发明对所述切条的方法没有特殊限制,采用本领域技术人员所熟知的切条方法即可。本发明实施例中切条采用切条机切条,所述切条机型号为Kinemitic2360CA,USA。
本发明中,所述切条的宽度优选为2.5~5mm,更优选为4mm。
下面结合实施例对本发明提供的一种快速诊断和监控肺癌的免疫层析检测条及其制备方法进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将产品型号为#CY-0128的抗体加入胶体金溶液,对所述标记抗体-胶体金没有特殊限制,采用本领域技术人员所熟知的标记抗体胶体金液即可,
将所述的稀释的标记抗体浸泡固相膜,如玻璃纤维纸10分钟,浸泡后的玻璃纤维膜在真空环境,37℃进行干燥。将产品型号为#CY-0402的溶于磷酸缓冲液,形成包被液,将浓度为2mg/ml的包被液划线于反应区上形成检测线T,同时将兔抗鼠IgG溶液划线与反应区上形成质控线C线,使T线在C线的下面,将划线的反应区放在37℃环境下烘干15分钟。将样品吸收区、固相标记抗体区、反应区进行裁剪后固定在底板上,上端再贴上吸水纸,切割成条,得到免疫检测条。
预先梯度稀释待检标准抗原肿瘤标志物CYFRA 21-1浓度(ng/ml)为0、2.5、5、10、25、50,在免疫检测条上分别滴2-3滴稀释的待检液,同时以磷酸缓冲液作为阴性对照,取出免疫检测条平放桌面上,观察层析液迁移,10分钟后观察反应区的结果。
检测结果用肉眼观察,阳性肺癌的液检测结果如图1所示,当肿瘤标志物CYFRA 21-1的浓度大于5ng/ml时T线和C线同时显色,当肿瘤标志物CYFRA 21-1的浓度小于5ng/ml时只有C线显色,而T线不显色,由此可以看出,本发明提供的免疫肺癌检测条的肿瘤标志物CYFRA 21-1的灵敏度为5ng/ml。
将检测结果放置在读数仪上QicKTech4000(来自JAJ international,Inc.SanDiego,CA,USA)下进行检测,检测结果如表1所示。根据表1结果数据绘制标准曲线得图3,其中横轴表示待检样品的浓度(单位ng/ml),纵轴表示颜色强度。经过计算得到方程y=-0.00038x2+0.07088x+0.07792,R2=1。可以看出,发明所述免疫检测条检测肿瘤标志物CYFRA 21-1的定量检测结果线性相关系数为1,表明检测值和理论值能较好的吻合,检测结果准确可信。
表1本发明实施例1得到的肿瘤标志物CYFRA 21-1定量检测数据表
实施例2
将产品型号为#NEC-0128的抗体加入胶体金溶液,对所述标记抗体-胶体金没有特殊限制,采用本领域技术人员所熟知的标记抗体胶体金液即可。将产品型号为#EC-0222的抗体溶于磷酸缓冲液,形成包被液,将浓度为2mg/ml的包被液划线于反应区上形成检测线T线,同时将兔抗鼠IgG溶液划线与反应区上形成质控线C线,使T线在C线的下面,将划线的玻璃纤维膜放在37℃环境下烘干15分钟。将有关组份、进行裁剪后固定在底板上,上端再贴上吸水纸,切割成条,得到免疫检测条。预先梯度稀释待检样品,使标志物NSE浓度(ng/ml)为0、5、15、40、100、200,在免疫检测条上分别滴2-3滴稀释的待检液中,同时以磷酸缓冲液作为阴性对照,取出免疫检测条平放桌面上,观察层析液迁移,10分钟后观察反应区的结果。
检测结果用肉眼观察,阳性肺癌的液检测结果如图4所示,当肿瘤标志物NSE的浓度大于15ng/ml时T线和C线同时显色,当肿瘤标志物NSE的浓度小于15ng/ml时只有C线显色,而T线不显色,检测结果如图5所示,只有C线显色,而T线不显色。由此可以看出,本发明免疫肺癌检测条的肿瘤标志物NSE的灵敏度为15ng/ml。
将检测结果放置在读数仪下进行检测,检测结果如表2所示。根据表2结果数据绘制标准曲线得图6,其中横轴表示待检样品的浓度(单位ng/ml),纵轴表示颜色强度。经过计算得到方程y=-0.00038x2+0.07088x+0.07792,R2=1。可以看出,发明所述免疫检测条检测肿瘤标志物NSE的定量检测结果线性相关系数为1,表明检测值和理论值能较好的吻合,检测结果准确可信。
Claims (10)
1.一种快速诊断和监控肺癌的免疫层析检测条,检测条依次由样品吸收区S,免疫层析条,固相标记抗体区,检测肺癌特异抗原的检测区T,对照区C和吸水区组成。
2.根据权利要求1加入检测对象血样予样品吸收区S,借助或不借助一种缓冲液推动血样液体沿层析膜上行,血样中的肺癌特异抗原或称肿瘤标志物,先与固相标记区标记抗体形成“标记抗体---肺癌抗原”免疫复合物,经由层析原理沿免疫层析条继续上行,在检测区T与检测区固相化的配对特异抗体吸附,形成“标记抗体---肺癌抗原---固相化抗体”沉淀物。该沉淀物的浓度与肺癌抗原在血样的浓度成正比例。
3.根据权利要求1标记抗体为金颗粒标记,或酶标记,或光标记,或碳粒标记。
4.根据权利要求1检测检测区T浓度可用肉眼检测,或可以置予读数器下定量检测,亦可以用对照区C,一条线或多条线的强度作比较,以做出半定量检测。
5.根据权利要求1肺癌肿瘤标记物,或称肺癌肿瘤抗原,为非小细胞肺癌标记物NSCLC如角蛋白类抗原Cytokeratin Fragment Antigen 21-1简称Cyfra 21—1,磷状细胞抗原Squamous Cell CarcinomaAntigen简称SCC时;组织多肽特异性抗原Tissue Polypeptide Specific Antigen,简称TPS.也可以小细胞肺癌标记物SCLS,胃泌素释放肽前体,Progastring Peptide,简称ProGRP神经化烯醇化酶Neuron Specific Endolase,简称NSE。
6.根据权利要求1肺癌免疫层析检测条可置予塑料壳中组成检测。
7.根据权利要求1待测样品可为血液,血清或血浆,也可为手指血。
8.根据权利要求1一条检测条上可同时检测多种肺癌指标。
9.根据权利要求1肺癌检测条也可以与同其它的肿瘤指标合并使用,如肿瘤胚胎抗原CEA以增强检测率。
10.根据权利要求1肿瘤检测设定临界值,检测区T检测强度低于临界值为阴性检测结果。检测区T检测强度高于临界值则为阳性。
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