CN101641599A - 作为肺癌标志物的apex - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肺癌的评估。它公开了蛋白质APEX在肺癌的评估中的用途。此外，它还涉及通过测量样品中的APEX利用从个体得到的液体样品体外评估肺癌的方法。例如，APEX的测量可以用于肺癌患者的早期检测或跟踪。

Description

作为肺癌标志物的APEX
本发明涉及帮助评估肺部癌症或肺癌(＝LC)、特别是帮助评估非小细胞肺癌(NSCLC)的方法。它公开了AP核酸内切酶(＝APEX)作为LC、特别是NSCLC的标志物的用途。此外，它特别涉及通过测量来自个体的液体样品中的APEX从所述样品评估肺癌的方法。例如，APEX的测量可以用于肺癌的早期检测，或用于经历手术的患者的监护。
尽管在检测和治疗方面有进展，癌症仍然是主要的公共卫生挑战。在各种类型的癌中。LC是西方世界常见的癌症，是癌症相关死亡的最常见的原因之一。这很大部分由于疾病的早期检测的诊断缺口。LC在它的早期主要是无症状的。所有肺癌的大部分在晚期被检出，此时疾病已经变得不能手术。
大部分LC肿瘤可以分成小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。SCLC占所有肺癌病例的约20-25％。SCLC是LC的侵袭性的神经内分泌的类型，具有非常差的预后，即使在早期被检出。SCLC很少能通过切除术来洽愈性地治疗。由于疾病进展的速度，SCLC一般仅用两期来分类：即，有限的和大范围的疾病，而不用更复杂的TNM分期系统(见下文)。约75-80％的LC病例被分类到NSCLC的类别中，包括鳞状细胞癌(癌＝CA)、腺CA(包括腺泡CA、乳头状CA、支气管肺泡肿瘤、实体肿瘤和混合亚型的亚类)，以及大细胞癌(包括巨细胞瘤、透明细胞CA、腺鳞CA和未分化的CA的亚类)。
如果在晚期测出，NSCLC也具有非常差的预后。癌症的分期是就程度、进展、细胞类型和肿瘤级别而言的疾病的分类。它将癌症患者分组，从而关于预后和治疗选择可以进行普遍化。
当今，TNM系统是根据癌症的解剖学程度最广泛使用的分类系统。它代表了国际公认的、统一的分期系统。其中有三种基本变量：T(原发肿瘤的程度)、N(区域性淋巴结的状态)和M(远距离转移的存在或不存在)。由UICC(国际抗癌联合会)公开了TNM指标、1997版(Sobin，L.H.，和Fleming，I.D.，TNM 80(1997)1803-4)。
原发肿瘤的外科切除术作为早期NSCLC的选择治疗是广泛接受的。随着NSCLC进展，更具体地，从IIIa期(T3N1M0、T1N2M0、T2N2M0、T3N2M0)到IIIb期(T4N0M0、T4N1M0、T4N2M0)的转变，出现了医师的方法方面的显著变化。然而，如果癌症在更早期被检出(Ia-IIIa；优选的最多到T3N1M0期)，五年存活率在35％和80％之间。在Ia期((T1N0M0)；小肿瘤大小，无转移)检出具有明显最好的预后，五年存活率最高达80％。
如果有的话，手术很少用于NSCLC的IIIb-IV期的处理。IV期相应于远距离转移，即疾病散布超过肺和局部的淋巴结。在后面的III和IV期五年存活率分别跌至低于15％和1％之间。
特别重要的是，NSCLC的早期诊断翻译为好得多的预后。在早至Ia(T1N0M0)、Ib(T2N0M0)、IIa(T1N1M0)、IIb(T3N0M0)和IIIa(T3N1M0)期诊断的患者，如果适当地治疗，具有诊断后最高达80％的5年存活率。这必须与一旦已存在远距离转移诊断的患者低于1％的5年存活率相比较。
在本发明的意义上，LC的早期评估是指如上文定义的Ia和IIIa之间的肿瘤阶段的评估。
优选的是，LC在Ia和IIIa之间的阶段被评估。
大多数肺癌在它们变得有症状时被检出。当前的检测方法包括胸部X射线、螺旋式计算机断层摄影术、痰细胞学和支气管镜检(bronchioscopy)。然而，对于这些方法用于大规模筛查的适用性存在论争。
许多肺癌的血清肿瘤标志物处于临床使用之中。细胞角蛋白(cytoceratin)19的可溶性30kDa片段(CYFRA21-1)、癌胚发生抗原(CEA)、神经元特异的烯醇酶(NSE)和鳞状细胞癌抗原(SCC)是最常见的重要LC标志物。然而，它们都不能满足筛查工具所需的敏感性和特异性的指标(Thomas，L.，Labor und Diagnose(2000)THBooks Verlagsgesellschaft，Frankfurt/Main，Germany)。
为了具有临床实用性，作为单一标志物的新的诊断标志物应当至少与本领域已知的其他标志物可比较，或更好。或者，新的标志物应当产生诊断敏感性和/或特异性方面的进展，如果分别地单独使用或与一种或更多种其他标志物组合使用。测试的诊断敏感性和/或特异性通过它的接受者工作特征来最好地评定，其将在下文详细描述。
全血、血清或血浆是在临床常规实验中最广泛使用的样品来源。将帮助可靠的癌症检测或提供早期预后信息的早期LC肿瘤标志物的鉴定可以产生将大大地帮助这种疾病的诊断和管理的方法。因而，存在着急迫的临床需求来改善LC的体外评估。改善LC的早期诊断是特别重要的，因为与在疾病的进展期诊断的那些患者相比，早期诊断的患者存活机会要高得多。
近来已经综述了生物化学标志物在肺癌中的临床实用性(Duffy，M.J.，Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38(2001)225-262)。
CYFRA21-1当前被认为是目前已知的最好的肺癌肿瘤标志物。虽然没有器官特异性，它主要地在肺组织中存在。在针对其他良性肺部疾病95％的特异性下，CYFRA21-1对于肺癌的敏感性被描述为在46-61％之间。CYFRA 21-1的提高的血清水平还与显著的良性肝脏疾病、肾机能不全和侵入性膀胱癌相关。CYFRA 21-1测试被推荐用于手术后的治疗监护。
CEA属于癌胚抗原的类别，通常在胚胎发生期间产生。CEA不具有器官特异性，主要用于结肠直肠癌症的监测。除了恶性肿瘤之外，还有几种良性的疾病例如肝硬化、支气管炎、胰腺炎和自体免疫疾病与提高的CEA血清水平相关。在针对良性的肺部疾病95％的特异性下，它对肺癌的敏感性被报告为29-44％。CEA的优选的用途是肺癌的治疗监护。
NSE是SCLC的肿瘤标志物。一般地，提高的NSE血清水平被发现与神经外胚层和神经内分泌肿瘤相关。提高的血清水平还被发现于患有良性的肺部疾病和脑部疾病，例如脑膜炎或脑部的其他炎症性疾病，以及对头部的外伤性损伤，的患者中。虽然在95％特异性下对SCLC的敏感性被报告为60-87％，NSE测试对于NSCLC的性能是不良的(7-25％的敏感性)。NSE被推荐用于SCLC的治疗监护。
ProGRP是肿瘤标志物，在SCLC的检测和监测中有用。提高的血清水平还在患有非恶性肺部/胸膜疾病，例如特发性肺纤维化或结节病的患者中发现。而在SCLC的领域中proGRP的敏感性(在95％的特异性下)被报告为47-86％，proGRP测试在NSCLC领域的性能是不良的，因为敏感性被报告低于10％。
SCC最初在宫颈的鳞状细胞CA中鉴定。SCC对LC的敏感性一般是低的(18-27％)。因而，SCC测试被认为不适合于筛查。然而，由于对鳞状细胞CA的更高敏感性，SCC优选的用途是治疗监护，虽然CYFRA 21-1一般表现得更好。
对于标志物分布和针对改善的肺癌诊断，公开了一种方法(Schneider，J.等Int.J.Clin.Oncol.7(2002)145-151)，利用基于模糊逻辑的分类算法来组合CYFRA 21-1、NSE和作为一般炎症标志物的C-反应性蛋白(CRP)的血清水平。作者报告了在95％的特异性下92％的敏感性。然而在这项研究中，例如CYFRA 21-1作为单一肿瘤标志物的敏感性被报告为在95％特异性下72％，其显著高于许多其他的报道的研究。Duffy，M.J.，in Critical Reviews in Clinical LaboratorySciences 38(2001)225-262报道了46％和61％之间的敏感性。Schneider等人实现的异乎寻常的高性能引起了一些怀疑，可能是由于几个事实。首先，对照患者的集体似乎比患者集体年轻，即，组不是良好地年龄匹配的，患者集体包含了许多的晚期。第二和更为关键的，算法的性能是对于训练集(training set)的样品检查的，所述训练集的样品被用于模糊逻辑合格者的确定。因此，这些合格者严格来说是对这个集合“修整得到的”，不能应用于独立的验证集。在正常的情况下，要预期的是，同样的算法用于更大的、独立的以及良好平衡的验证集将产生显著降低的总体性能。
本发明的任务是研究是否可以鉴定出可以在评估LC中使用的生物化学标志物。
令人惊讶地，发现的是，标志物APEX的使用可以至少部分地克服当前本领域现有技术已知的标志物的一些难题。
本发明涉及体外评估肺癌的方法，包括测量样品中APEX的存在和/或浓度，以及将所述测量结果，特别是所测定的浓度用于肺癌的评估。
本发明还涉及通过生物化学标志物体外评估LC的方法，包括测量样品中APEX以及一种或更多种其他LC标志物的存在和/或浓度，以及将所述测量结果，特别是所测定的浓度用于LC的评估。优选的是，所述一种或更多种其他LC标志物选自CYFRA 21-1、CEA、NSE、proGRP和SCC。
在优选的实施方式中，本发明还涉及至少包含APEX和CYFRA21-1的标志物组在LC的评估中的用途。
本发明还涉及至少包含APEX和CEA的标志物组在LC的评估中的用途。
本发明还涉及至少包含APEX和SCC的标志物组在LC的评估中的用途。
本发明还提供了进行根据本发明的方法的试剂盒，至少包含分别特异性地测量APEX和CYFRA21-1所需的试剂，以及任选用于进行所述测量的辅助试剂。
本发明还提供了进行根据本发明的方法的试剂盒，至少包含分别特异性地测量APEX和CEA所需的试剂，以及任选用于进行所述测量的辅助试剂。
本发明还提供了进行根据本发明的方法的试剂盒，至少包含分别特异性地测量APEX和SCC所需的试剂，以及任选用于进行所述测量的辅助试剂。
在优选的实施方式中，本发明涉及体外评估肺癌的方法，包括测量样品中a)APEX，和b)任选一种或更多种其他肺癌标志物的存在和/或浓度，以及c)将所述测量结果，特别是步骤(a)和任选步骤(b)中测定的浓度用于肺癌的评估。
术语“测量”包括样品中APEX的定性的或定量的测量。在优选的实施方式中，所述测量是定性的或半定量的测量，即，它测定了APEX是存在还是缺乏，或它测定了APEX的浓度是高于还是低于截止值。熟练的技术人员将理解，在是-(存在)或否-(缺乏)分析中，分析敏感性通常被设置为匹配所述截止值。例如，截止值可以从一组健康个体的测试来确定。
优选的，所述截止被设置为产生90％的特异性，还优选的是所述截止被设置为产生95％的特异性，或还优选的是所述截止被设置为产生98％的特异性。例如，存在或高于截止值的值是存在肺癌的指示。在进一步优选的实施方式中，所述测量是定量测量。在这个实施方式中，APEX的浓度与基础的诊断问题如疾病的分期、疾病进展或对治疗的反应相关。
AP核酸内切酶APEX(Swiss-Prot.P27695)的特点在于SEQ IDNO：1中给出的序列。未加工的前体分子由318个氨基酸组成，具有35.6kDa的分子量。APEX涉及DNA修复并切割DNA链的无嘌呤或无嘧啶位点。这样的无碱基位点相对频繁地自发地或通过化学试剂、或通过移动特定异常碱基的DNA糖基化酶来产生。
AP位点是诱变前的病变，其可以阻止正常DNA复制，因此细胞含有鉴定和修复这种位点的系统。(Gil Barzilay，Ian D.Hickson，1995，Bioessays 17(18)pp 713-719)。3D结构被阐明了，鉴定了涉及核酸内切酶活性的氨基酸(Barizilay G.等，1995，Nature structural biology2(7)，pp 561-567；Gorman M.A.等，1997，EMBO Journal，16(21)pp 6548-58；Beernink P.等，2001，J.Mol.Biol.307，pp 1023-1034)。APEX也是各种转录因子例如c-Fos、c-Jun、NF-KB和HIF-1的氧化还原调节物。这种活性似乎与核酸内切酶活性无关。两种功能位于蛋白质的不同结构域上(Gil Barzilay，Ian D.Hickson，1995，Bioessays 17(18)pp 713-719)。APEX被蛋白激酶C磷酸化提高了氧化还原活性，而未磷酸化的形式涉及DNA修复(Yacoub A.等(1997；CancerRes.57，pp 5457-59)。一个磷酸化位点Y261(根据Swissprot序列)被Rush J.等，(2005，Nature Biotech，23(1)pp 94-101)鉴定。
还观察到APEX活化p53DNA结合活性(Jayaraman L等，1997，Genes Dev.，11(5，p558-70)。Gaiddon等人研究了APEX对p53的体内调节(1999，EMBO Journal，18(20)，pp 5606-5621)。p53在肿瘤发生中的作用是明确确立的。
WO97/47971公开了脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶作为鉴定恶变前或恶性状况的标志物的用途。实施例描述了在子宫颈癌症和前列腺癌症组织中的APEX染色。没有描述组织提取物或体液中APEX的测定。进一步的，该文献不含有APEX可能是与肺癌相关的标志物的任何数据。
WO 02/076280公开了测定受试者发展癌症的风险的方法，其中受试者的组织中DNA修复/损伤防止酶的活性水平的指示性参数的水平被测定，根据所述水平，确定受试者发展癌症的风险。所述DNA损伤防止酶可以是APEX。所述鉴定涉及OGG活性DNA修复测试，其中所述DNA修复活性利用合成的寡核苷酸底物来测试。所述样品是从人类外周血淋巴细胞制备的蛋白质提取物。由于DNA修复是复杂的过程，OGG活性不能与APEX严格地相关。发现的是低OGG活性是肺癌中的风险因素。然而没有描述APEX与肺癌的直接相关性。
WO 2006/091734描述了在自身抗体分布的检测中利用肽微阵列，以及利用这样的自身抗体分布来得到诊断或预后信息。总共列出了1480个表位，包括来自APEX的4个肽序列。该文献没有描述APEX与肺癌的任何相关性。
Duguid等人(Cancer Res.55(1995)，6097-6102)描述了通过在不同组织，例如脑部和肝脏中APEX的免疫染色、细胞质和核染色，人类APEX的差异性细胞和亚细胞表达的确定。
Tanner等人(Gynecologic Oncol.92(2004)，568-577)描述了核APEX表达的提高与卵巢癌的进展。
Kakolyris等人(J.Pathol.189(1999)，351-357)描述了人类APEX的核定位与早期可手术的NSCLC的预后相关。在正常的肺中，APEX的染色被发现在肺泡的肺细胞中的核和细胞质中。支气管上皮的浅表纤毛细胞显示了细胞质的染色，而对基底细胞的染色主要是核的。支气管腺细胞表现了混合的核和细胞质的染色。肺癌显示了APEX的所有表达模式。在鳞状癌中，观察到显著的间接相关，即，APEX的提高的(阳性)核染色与降低的(阴性)p53染色是平行的。作者断定，核的APEX定位可能与它作为DNA修复蛋白质和/或作为野生型p53的活化物的作用相关，因而与在患者的亚群中所见更好的后果相关。
Puglisi等人(Anticancer Res.21(2001)，4041-4050描述了亚细胞APEX定位作为患有NSCLC的患者中的预后指示物的潜在作用。特别是，该蛋白质的细胞质的定位看起来与患者亚群中纯预后相关。
有趣地，上述文件都没有暗示组织提取物和体液中APEX的鉴定将容许评估肺癌。根据现有技术，仅仅APEX的亚细胞染色将容许癌症评估。令人惊讶地，在本发明中发现的是，在组织溶胞产物样品和/或体液中APEX的存在和/或数量的测定，而不用亚细胞分析、特别是不用测定亚细胞定位，容许肺癌的评估。再更令人惊讶地，发现的是，APEX的提高存在和/或浓度与肺癌相关。
如在此使用的，以下每一个术语具有与在本节中的它相关的含义。
在此使用的冠词“一”是指冠词的一或超过一(即，至少一)的语法宾语。举例来说，“一种标志物”是指一种标志物或超过一种标志物。术语“至少”被用于表明任选可以存在一个或更多个进一步的宾语。举例来说，至少包含(标志物)APEX和CYFRA 21-1的标志物组可以任选包含一种或更多种其他标志物。
表述“一或更多”表示1到50，优选的1到20，还优选的2、3、4、5、6、7、8、9、10、12或15。
在此使用的术语“标志物”或“生物化学标志物”是指用作目标用于分析患者的测试样品的分子。在一个实施方式中，这样的分子目标的实例是蛋白质或多肽。用作本发明中的标志物的蛋白或多肽预期包括所述蛋白的天然存在的变体以及所述蛋白或所述变体的片段，特别是免疫学可检测的片段。免疫学可检测的片段优选的包含所述标志物多肽的至少6、7、8、10、12、15或20个连续的氨基酸。本领域的技术人员将认识到，例如，在炎症期间由细胞释放的或细胞外基质中存在的蛋白质可能损伤，并可能被降解或裂解成这样的片段。某些标志物以无活性的形式合成，其随后可以通过蛋白水解作用活化。熟练技术人员将理解，蛋白或其片段也可以作为复合物的部分存在。这种复合物也可以用作本发明意义上的标志物。标志物多肽的变体由相同的基因编码，但是例如作为可选择的mRNA或前mRNA加工的结果，在它们的等电点(＝PI)或分子量(＝MW)、或这两者方面可以不同。变体的氨基酸序列将95％或更高地相同于相应的标志物序列。此外，在可选择的标志物多肽或其变体中可以带有翻译后的修饰。优选的翻译后修饰是糖基化、酰化和/或磷酸化。
优选的，所述标志物APEX是通过使用特异结合试剂从样品中特异性地测量的。
特异结合试剂是，例如，APEX的受体、结合APEX的凝集素或APEX的抗体。特异结合试剂对它相应的目标分子具有至少107l/mol的亲和力。特异结合试剂优选的对它的目标分子具有108l/mol、或还优选的109l/mol的亲和力。本领域技术人员将理解，术语“特异”被用于指示样品中存在的其他生物分子不显著地结合所述特异于APEX的结合试剂。优选的，结合除目标分子以外的生物分子的水平产生了结合亲和力，其是与目标分子的亲和力的最多仅10％或更低、仅5％或更低、仅2％或更低、或仅1％或更低。优选的特异结合试剂将满足亲和力以及特异性的上述两种最小指标。
特异结合试剂优选的是与APEX反应的抗体。术语抗体是指多克隆抗体、单克隆抗体、这些抗体的抗原结合片段、单链抗体以及包含抗体的结合结构域的遗传构建体。
可以使用保持了特异结合试剂的上述指标的任何抗体片段。抗体通过现有技术的操作产生，例如，Tijssen(Tijssen，P.，Practice andtheory of enzyme immunoassays，11，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam，全书，特别是43-78页)中所描述的。此外，熟练的技术人员都知道基于免疫吸附剂的方法，其可以用于抗体的特异性分离。通过这些方法，多克隆抗体的质量以及由此它们在免疫分析中的性能可以被增强。(Tijssen，P.，上文，pages 108-115).
对于在本发明中公开的成果，可以使用兔子中产生的多克隆抗体。然而，明显的是，还可以使用来自不同物种，例如大鼠或豚鼠的多克隆抗体，以及单克隆抗体。由于单克隆抗体可以以恒定的性能以任何所需的数量产生，它们代表了临床的常规分析的开发中的理想工具。在根据本发明的方法中针对APEX的单克隆抗体的产生和用途分别代表了其他优选的实施方式。
熟练的技术人员现在将理解，APEX已经被鉴定为在肺癌的评估中有用的标志物，各种免疫诊断操作可以用于实现与本发明的成果可比较的结果。例如，可以使用可选择的策略来产生抗体。这些策略包括代表了APEX的表位的合成肽用于免疫的使用，等等。做为选择，可以使用DNA免疫，也称为DNA疫苗接种。
对于测量，从个体获得的样品可以在适合于结合试剂APEX复合物的形成的条件下与APEX的特异结合试剂孵育。这样的条件不必指定，因为熟练的技术人员无需任何创造性的工作可以容易地鉴定这种合适的孵育条件。测量结合试剂APEX-复合物的数量并用于肺癌的评估中。熟练的技术人员将理解，存在着许多方法来测量特异结合试剂APEX复合物的数量，所有都在相关的教科书中详细描述了(参见例如Tijssen P.，上文，或Diamandis，E.P.and Christopoulos，T.K.(eds.)，Immunoassay，Academic Press，Boston(1996))。
优选的，APEX在夹层式分析形式中检测。在这样的分析中，第一特异结合试剂被用于将APEX捕获在一侧，被标记以被直接或间接检测的第二特异性结合试剂被用于另一侧。
在本发明的意义上的“肺癌的标志物”是任何标志物，其如果与标志物APEX组合添加了LC评估中的相关信息。对于LC的评估，如果在给定特异性下的敏感性，或如果在给定的敏感性下的特异性分别可以通过将所述标志物包括到已经包含了标志物APEX的标志物组合中来改善，该信息被认为是相关的或具有附加价值。优选的，分别在敏感性或特异性方面的改善在p＝.05、.02、.01或更低的显著性水平上是统计学上显著的。优选的，所述一种或更多种其他LC标志物选自CYFRA 21-1、CEA、NSE、proGRP和SCC。
在此使用的术语“样品”是指为了体外评估的目的获得的生物样品。在本发明的方法中，样品或患者样品优选地可以包含任何体液或组织提取物。优选的测试样品包括血液、血清、血浆、痰和支气管灌洗液。优选的样品是全血、血清、血浆、支气管灌洗液或痰，血浆或血清是最优选的。
术语“评估肺癌”被用于表明，例如，根据本发明的方法将(单独地或与其他标志物或变量如UICC阐述的指标(参见上文)一起)，例如，帮助医师确定或确认LC的不存在或存在，或在预后、复发的检测(手术后患者的跟踪)和/或治疗、特别是化疗的监测方面帮助医师。
熟练技术人员将理解，任何这样的评定是在体外进行的。患者样品后来被丢弃。患者样品仅仅用于本发明的体外诊断方法，患者样品的材料不转移回患者体内。一般地，所述样品是液体样品，例如全血、血清或血浆。
在优选的实施方式中，本发明涉及通过生物化学标志物体外评估LC的方法，包括测量样品中APEX的浓度并将所测定的浓度用于LC的评估。
本发明的发明人令人惊讶地能够在显著百分比的来自患有LC的患者的样品中检测标志物APEX。再更令人惊讶的，他们已经能够证明，在从个体获得的这种样品中APEX的存在和/或浓度可以用于肺癌的评估。
诊断的理想情况将是一种情况，其中单独的事件或过程将引起相应的疾病，例如在传染性疾病中。在所有其他情况下，正确的诊断结论将是非常困难的，特别是当疾病的病因不被完全理解时，如LC的情况。熟练的技术人员将理解，对于给定的多因素疾病，例如LC，没有生物化学标志物是具有100％特异性同时具有100％敏感性的诊断性的。然而，生物化学标志物，例如CYFRA21-1、CEA、NSE、proGRP、SCC或在此显示的APEX可以用于以某些可能性或预测价值评估，例如，疾病的存在、缺乏或严重度。因而在常规临床诊断中，一般地各种临床症状和生物标志物在隐晦的疾病(underlying disease)的诊断、治疗和管理中一起考虑。
生物化学标志物可以分别地测定，或在本发明的优选的实施方式中，它们可以使用基于芯片或珠子的阵列技术同时地测定。然后为每个标志物使用单独的截断值独立地解释生物标志物的浓度，或组合它们用于解释。
在进一步优选的实施方式中，根据本发明的LC评估以一方法进行，包括测量样品中a)APEX和b)一种或更多种其他肺癌标志物的存在和/或浓度，以及c)将所述测量结果，例如步骤(a)和步骤(b)中分别测定的浓度用于肺癌的评估。
在LC的评估中，标志物APEX将在一个或更多个以下方面中有利：筛查、诊断辅助、预后、疗法例如化学治疗、放射治疗和免疫治疗的监测。
筛查：
筛查被定义为测试的系统性应用，来鉴定个体，例如有风险的个体的疾病的指示物，例如肺癌的存在。优选的，筛查群体由已知具有比肺癌的平均风险更高风险的个体组成，如吸烟者、戒烟者、以及暴露于铀、石英或石棉的工作者。在一个优选的实施方式中，痰被用作肺癌的筛查中的样品。
对于许多疾病，在循环中总是没有单一的生物化学标志物满足筛查目的所需的敏感性和特异性指标。这看起来对于肺癌也是成立的。要预计的是，包含复数种标志物的标志物组将用于LC筛查中。本发明中确定的数据表明，标志物APEX将形成适合于筛查目的的标志物组的不可缺的部分。因而本发明涉及APEX作为LC标志物组的一种标志物的用途，即，包含APEX和一种或更多种其他用于LC筛查目的的标志物的标志物组。当前的数据进一步表明，标志物的某些组合将在LC的筛查中是有益的。因而，本发明还涉及了包含APEX和CYFRA 21-1的标志物组、或包含APEX和CEA的标志物组、或包含APEX和NSE的标志物组、或包含APEX和SCC的标志物组、或包含APEX和proGRP的标志物组、或包含APEX和选自CYFRA 21-1、CEA、NSE、proGRP和SCC的两种或更多种标志物的标志物组，用于LC筛查目的的用途。
诊断辅助：
标志物可以帮助特定器官中良性对恶性疾病的鉴别诊断，帮助区分肿瘤的不同组织学类型、或建立手术前的基线标志物值。
今天，在肺癌的检测中使用的重要方法是放射学和/或计算机断层摄影(CT)扫描。小的结节，即，疑似组织的小的区域可以通过这些方法显现。然而，这些结节中的许多，CT超过90％，代表了良性的组织改变，仅少数结节代表癌性组织。标志物APEX的使用可以帮助良性和恶性结节的区分。
在优选的实施方式中，标志物APEX被用于免疫组织学方法以建立或确认LC的不同的组织学类型。
由于APEX作为单一标志物可能优于其他LC标志物如CEA或NSE，预计的是APEX将用作诊断辅助，特别是通过建立手术之前的基准值。因而本发明还涉及APEX用于在LC手术之前确定基准值的用途。
预后：
预后指示物可以定义为癌症患者和他们的肿瘤的临床的、病理的、或生物化学的特征，其以某些可能性预测疾病结局。它们主要作用是帮助合理地规划病人管理，即，分别避免侵袭性疾病(aggressivedisease)的处理不足和无痛疾病(indolent disease)的过度处理。MolinaR.等，Tumor Biol.(2003)24：209-218评估了NSCLC中CEA、CA125、CYFRA 21-1、SSC和NSE的预后价值。在他们的研究中，标志物NSE、CEA和LDH(乳酸脱氢酶)的异常血清水平看起来指示了更短的存活。
由于单独的APEX显著地有助于LC患者与健康对照的区分，预计的是，它将帮助评估患有LC的患者的预后。手术前APEX的水平将最可能地与一种或更多种其他LC标志物和/或TNM分期系统组合。在优选的实施方式中，APEX被用于患有LC的患者的预后。
化疗的监测：
Merle，P.等，Int.J.of Biological Markers(2004)19：310-315评估了用诱导化疗治疗的患有局部晚期NSCLC的患者中CYFRA 21-1血清水平变化。他们断定，CYFRA 21-1血清水平的早期监测是III期NSCLC患者中肿瘤反应和存活的有用的预后工具。此外，有报道描述了CEA在监测患有LC的患者的治疗方面的用途(Fukasawa T.等，Cancer & Chemotherapy(1986)13：1862-1867)。大多数这些研究是回顾性的、非随机的，并含有少量的患者。在用CYFRA 21-1研究的情况下，CEA研究认为：a)当接受化学治疗时具有CEA水平降低的患者，比CEA水平未能降低的患者具有更好的结局，和(b)对于几乎所有患者，CEA水平的提高与疾病进展相关。
预计的是，对于化学治疗的监测，APEX将是至少分别与CYFRA21-1或CEA一样好的标志物。因而本发明还涉及APEX在化疗的LC患者的监测中的用途。
跟踪：
经历了目的在于癌组织的完全去除的外科切除术的大部分LC患者，以后发展出复发性的或转移性的疾病(Wagner，H.，Chest(2000)117：110-118；Buccheri，G.等，Ann.Thorac.Surg.(2003)75：973-980)。大多数这些复发发生在手术后前2-3年。因为如果检测太晚复发性/转移性疾病总是致死的，相当多的研究已经集中于在早期并因而是潜在可治疗阶段时的LC复发。
因此，许多LC患者经历了手术后的监护计划，其常常包括CEA的常规监测。外科切除术之后一年的CEA连续监测已经显示了在大约97％的特异性下以大约29％的敏感性检出早期术后复发/转移性疾病，甚至在没有怀疑的症状或病征的情况下(Buccheri，G.等，Ann.Thorac.Surg.(2003)75：973-980)。因而，患有LC的患者在手术后的跟踪是合适的生物化学标志物的用途的最重要的领域之一。由于APEX在所研究的LC患者中的高度敏感性，很可能的是，单独的APEX或与一种或更多种其他标志物组合将大大帮助LC患者的跟踪，特别是手术后的LC患者。包含APEX和一种或更多种其他LC标志物的标志物组在LC患者的跟踪方面的使用代表了本发明的进一步优选的实施方式。
本发明在优选的实施方式中涉及了分别在LC的诊断领域或在LC的评估中APEX的用途。
在又进一步的实施方式中，本发明涉及与一种或更多种肺癌标志物分子组合的APEX作为肺癌的标志物分子在获自个体的液体样品的肺癌评估中的用途。可以与APEX的测量组合的优选的其他选定LC标志物是CYFRA21-1、CEA、NSE、proGRP和/或SCC。再进一步优选的，在LC的评估中使用的标志物组包含APEX和选自CYFRA 21-1和CEA的至少一种其他标志物分子。
本领域技术人员将理解，存在着许多方法来使用两种或更多种标志物的测量以改善在研究中的诊断问题。在十分简单的、但尽管如此常常有效的方法中，如果样品对于研究的至少一种标志物是阳性的，假定阳性结果。例如，当诊断传染性疾病如AIDS时，这是这种情况。
然而，经常地，评估标志物的组合。优选的，对标志物组的标志物，例如对于APEX和CYFRA 21-1测量的值被数学地组合，组合的值与基础的诊断问题相关联。可以通过任何适合的本领域的数学方法组合标志物值。将标志物组合与疾病相关联的公知的数学方法采用了一些方法，如，辨别分析(DA)(即，线性的、二次的、正规化的(regularized)DA)、核(Kernel)方法(即，SVM)、非参数方法(即，k-最近邻分类法)、PLS(偏最小二乘方)、基于树的方法(即，逻辑回归，CART，随机森林法，Boosting/Bagging方法)、一般化的线性模型(即，逻辑回归)、基于主分量的方法(即，SIMCA)、一般化的加法模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练的技术人员在选择合适的方法来评估本发明的标志物组合方面将没有困难。优选的，在将本发明的标志物组合与例如LC的不存在或存在相关联中使用的方法选自DA(即，线性的、二次的、正规化的辨别分析)、核(Kernel)方法(即，SVM)、非参数方法(即，k-最近邻分类法)、PLS(偏最小二乘方)、基于树的方法(即，逻辑回归，CART，随机森林法，Boosting/Bagging方法)或一般化的线性模型(即，逻辑回归)。关于这些统计方法的细节在以下参考文献中找到：Ruczinski，I.，等，J.of Computational and GraphicalStatistics，12(2003)475-511；Friedman，J.H.，J.of the AmericanStatistical Association 84(1989)165-175；Hastie，Trevor，Tibshirani，Robert，Friedman，Jerome，The Elements of Statistical Learning，SpringerSeries in Statistics，2001；Breiman，L.，Friedman，J.H.，Olshen，R.A.，Stone，C.J.(1984)Classification and regression trees，California：Wadsworth；Breiman，L.，Random Forests，Machine Learning，45(2001)5-32；Pepe，M.S.，The Statistical Evaluation of Medical Tests forClassification and Prediction，Oxford Statistical Science Series，28(2003)；and Duda，R.O.，Hart，P.E.，Stork，D.G.，PatternClassification，Wiley Interscience，2nd Edition(2001)。
本发明的优选的实施方式是使用关于生物标志物的基础组合的优化的多元截止，以及辨别状态A与状态B，例如患病与健康。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是形成标志物组。
通过诊断方法的接受者工作特征(ROC)最好地描述了诊断方法的精确性(特别参见Zweig，M.H.，and Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC图表是在所观察数据的整个范围上连续改变判断阈值产生的所有的敏感性/特异性配对的标绘图。
实验室测试的临床性能取决于它的诊断精确性，或正确地将受试者分类到临床上相关的亚群中的能力。诊断精确性衡量了所述测试正确地区分被研究受试者的两种不同状况的能力。这些状况例如健康和患病，或者良性对恶性疾病。
在每种情况下，通过在判定阈值的完整范围上标绘出敏感性对1-特异性，ROC标绘图描绘了两种分布之间的重叠。在Y轴上是敏感性，或者真阳性分数[定义为(真阳性测试结果的数量)/(真阳性的数量+假阴性测试结果的数量)]。这也被称作存在疾病或状况的阳性。它单独地从受影响的亚群中计算。在X轴上是假阳性分数，或1-特异性[定义为(假阳性结果的数量)/(真阴性的数量+假阳性结果的数量)]。它是特异性的指数，完全从未受影响的亚群中计算。因为使用来自两个不同亚群的测试结果完全独立地计算真阳性和假阳性分数，ROC标绘独立于样品中的疾病患病率。在ROC标绘图上的每个点代表了相应于特定的判断阈值的敏感性/1-特异性配对。具有理想辨别力(在结果的两个分布中没有重叠)的测试具有穿过左上角的ROC标绘线，其中真阳性分数是1.0，或100％(理想的敏感性)、假阳性分数是0(理想的特异性)。没有辨别力的测试的理论标绘图(两个组的结果分布相同)是从左下角到右上角的45°对角线。大多数标绘图落入这两个极端之间。(如果ROC绘图完全落入45°对角线以下，这容易通过将“阳性”的指标从“大于”转换成“小于”来补救，或反之亦然。)定性地，标绘图越靠近左上角，试验的总体精确度越高。
定量实验室测试的诊断精确性的一个优选的途径是通过单个数字表示它的性能。例如，这种总体参数是所谓的“总误差”或作为选择“曲线下面积＝AUC”。最常见的全局度量是ROC标绘图下的面积。按照惯例，这个面积永远≥0.5(如果不是，人们可以反转判断规则使它这样)。值在1.0(两个组的测试值的理想分离)和0.5(在测试值的两个组之间没有明显的分布差异)之间。该面积不仅取决于标绘图的特定部分，例如最靠近对角线的点或在90％特异性下的敏感性，还取决于整个标绘图。这是ROC标绘图多么接近理想标绘图(面积＝1.0)的定量的、描述性的表述。
在优选的实施方式中，本发明涉及改善相对于健康对照的LC诊断精确度的方法，通过分别测量样品中至少APEX和CYFRA 21-1的浓度，以及任选地CEA、proGRP、NSE和/或SCC的浓度，并且将所测定的浓度与LC的存在或不存在相关联，与基于任何单独的研究的标志物的分类法相比，所述改善使得更多的患者被正确地分类为患有LC对健康对照。
在根据本发明的优选的方法中，分别测定至少生物标志物APEX和CYFRA 21-1的浓度，标志物组合用于LC的评估。
在根据本发明的进一步优选的方法中，分别测定至少生物标志物APEX和CEA的浓度，标志物组合用于LC的评估。
在根据本发明的进一步优选的方法中，分别测定至少生物标志物APEX、CYFRA 21-1和CEA的浓度，标志物组合用于LC的评估。
在根据本发明的进一步优选的方法中，分别测定至少生物标志物APEX、CYFRA 21-1和proGRP的浓度，标志物组合用于LC的评估。
在根据本发明的再进一步优选的方法中，分别测定至少生物标志物APEX、CYFRA 21-1和SCC的浓度，标志物组合用于LC的评估。
提供以下的实施例和附图来帮助理解本发明，它们的真实范围在附随的权利要求中阐述。要理解的是，可以在所列的步骤中进行修改而不背离本发明的精神。
附图说明
附图1附图1显示了与获自30位明显健康个体和30位表面上健康的吸烟者的60个对照样品比较，获自LC患者的60个样品的评估的接受者工作特征(ROC)的标绘图。
附图2附图2显示了肺癌组织溶胞产物的Western印迹分析。20个肺癌组织溶胞产物(10个腺CA和10个鳞状细胞CA)的5μg总蛋白和匹配的对照组织溶胞产物如实施例5中描述的进行分析。
M＝分子量标记；
T＝肿瘤组织溶胞产物；
N＝匹配的对照组织溶胞产物；
PP＝来自健康供体的血浆库(约60kD范围内的条带推测起来是由于非特异性背景反应)
rec.AG＝重组产生的APEX(每泳道10、3或1ng)；
箭头指出APEX的位置。
实施例1
APEX作为肺癌标志物的鉴定
组织的来源：
为了鉴定作为肺癌的诊断标志物的肿瘤特异性蛋白质，进行了利用蛋白质组方法的两种不同类型组织的分析。
总共分析了来自11位患有肺癌的患者的组织样本。从每个患者中，从治疗性切除术采集两种不同的组织类型：肿瘤组织(＞80％肿瘤)(T)和邻近的健康组织(N)。后者充当匹配的健康对照样品。组织在切除术后立即速冻(snap frozen)，处理之前保存在-80℃。肿瘤通过组织病理学指标来诊断。
组织制备：
0.8-1.2g冷冻组织切成小块，转移到混合器球磨的冷却的研磨缸中，通过液氮完全冷冻。组织在球磨中粉碎，溶于10倍体积(w/v)的裂解缓冲液中(40mM柠檬酸钠、5mM MgCl2、1％Genapol X-080、0.02％叠氮化钠、
Figure A20088000950400201
EDTA-free[Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，Cat.No.1873580])，随后在
Figure A20088000950400202
玻璃匀浆器(20×松配合，20×密配合)中匀化。匀浆物进行离心(5,000×g 10’)，上清液转移到另一个小瓶中，再次进行离心(20,000×g 15’)。产生的上清液含有可溶的蛋白质，用于进一步的分析。
用于LC-ESI-MSMS分析的样品制备：
可溶蛋白质部分的蛋白质浓度使用Bio-Rad蛋白质分
Figure A20088000950400203
(Cat.No.500-0006；Bio-Rad Laboratories GmbH，München，Germany)根据供应商手册的指导来测定。向相应于200μg蛋白质的体积中添加4mL还原缓冲液(9M尿素、2mM DTT、100mM KH2P04、NaOH pH 8.2)，孵育1小时。这个溶液在
Figure A20088000950400204
Ultra设备(Millipore GmbH，Schwalbach，Germany)中浓缩到50μl，为了烷基化转移到0.5ml样品缓冲液(9M尿素、4mM碘乙酰胺、100mM KH2PO4、NaOH pH 8.2)中，并孵育6小时。在烷基化之后，溶液在Ultra设备中浓缩到50μl，添加0.5ml 9M尿素10mM KH2PO4、NaOH pH 8.2，溶液再次浓缩到50μl。这个操作重复两次。随后，最终的50μl用4μg胰蛋白酶(蛋白质组级别，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)在水中稀释到990μl并消化过夜。
LC-ESI-MSMS分析：
胰蛋白酶的消化(100μl)在Nano-LC系统(Ultimate，Famos，Switchos；LC Packings，Idstein，Germany)上通过二维HPLC(MudPIT)来分离。使用自身包装的二维柱(Fused silica：PicoFrit 75pm，NewObjective；RP：ProntoSil 120-5-C18 AQ+，Bischoff；SCX：Partisil 10，Whatman)进行分离。11个SCX部份通过连续地提高NH4AC的数量(0到1500mM)的洗脱步骤产生。它们进一步在柱的RP部分上分离，利用ESI-MS离子阱的数据依赖性扫描在线分析(LCQ deca XP；Thermo Electron，Massachusetts，USA；参数参见表1)。对每个样品进行三个运行。原始数据用非商业的Roche自有数据管理系统，利用Sequest作为基础算法(参数参见表1)来加工。组合来自重复运行的鉴定的肽和蛋白质的得到的列表。
蛋白质APEX通过所鉴定的序列的帮助被鉴定出，在表2中给出。
APEX作为肺癌标志物的检测：
对于每个患者，来自肿瘤样品的鉴定的蛋白质和相应的肽的数量与来自邻近正常组织的一致性结果相比较。通过这种方法，蛋白质APEX被发现特异性地存在于、或强烈富含于肿瘤组织中，并且在健康对照组织中是不可检测的或刚刚可检测的。
表1：MSMS数据获取和数据库检索参数
  MSMS-数据获取   MS排除  前体离子的350-2000Da
  重复计数  2
  重复持续时间  0.25分钟
  排除列表大小  50
  排除持续时间  5分钟
  排除质量宽度  低0.5Da，高1.5Da
  Sequest   离子数  30
  最小离子强度  10.000计数
  前体质量公差  1.5Da
  片段质量公差  1.0Da
  Xcorr  ＞1.8；2.3，2.8(z＝1；2；3)
  dCn  ＞0.1
  Sp  ＞500
  数据库  Humangp(由RocheBioinformatics组合)
蛋白质APEX在来自患有肺癌的患者的肿瘤组织中强烈地过量呈现。蛋白质APEX的以下肽序列通过肿瘤组织中的数据库检索形式LCQ-MS2-数据被鉴定出：来自APEX的以下序列利用以上描述的方法被鉴定出。
表2：ESI-MSMS鉴定的序列
  序列   自APEX的氨基酸延伸
  GAVAEDGDELRTEPEAK   7-23
  GLDWVKEEAPDILCLQETK   79-97
  KPLVLCGDLNVAHEEIDLR   202-220
  QGFGELLQAVPLADSFR   237-253
  VSYGIGDEEHDQEGR   241-255
  LDYFLLSHSLLPALCDSK   281-298
  ALGSDHCPITLYLAL   303-317/C-末端
APEX可以在来自患有肺腺癌的8位患者的5位的肿瘤组织溶胞产物样品中鉴定出。在正常的组织溶胞产物中，APEX不能被鉴定出。
实施例2
肺癌标志物蛋白质APEX的抗体的产生
产生肺癌标志物蛋白质APEX的多克隆抗体，用于在通过免疫检测分析，例如Western印迹和ELISA的APEX血清和血浆和血液水平测量中进一步使用。
在大肠杆菌(E.coli)中重组蛋白质的表达：
为了产生针对APEX的抗体，在大肠杆菌中产生重组抗原：因此，APEX编码区域从获自德国基因组研究资源中心(RZPD，Berlin，Germany)的全长cDNA克隆IRAT p970H075D利用以下引物PCR扩增：
正向引物LC38for-EcoRI：
5′ACGTACGTGA ATTCATTAAA    GAGGAGAAAT    TMCTATGAG
AGGATCGCAT  CACCATCACC   ATCACATTGA   AGGCCGTCCG
AAGCGTGGGA AAAAGG(SEQ ID NO：2/EcoRI-位点下划线，起始密码子下划线)，
反向引物LC38rev-BamHI：
5′CGTACGTGGA TCCTCATTAC AGTGCTAGGT ATAGGGTGAT AGG
(SEQ ID NO：3/BamHI-位点下划线)。
正向引物特征在于(除了EcoRI克隆和核糖体结合位点之外)编码按阅读框导入APEX多肽的N-末端MRGSHHHHHHIEGR肽延伸(SEQ ID NO：4)的寡核苷酸。EcoRI/BamHI消化的PCR片段连接到相应的pQE-30(Qiagen，Hilden，Germany)载体片段，其随后转化到大肠杆菌-XL1-blue感受态细胞中。在序列分析之后，质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，用于根据厂家的说明书在pQE载体系列的IPTG-可诱导T5启动子之下的表达。
对于MRGSHHHHHHIEGR-APEX融合蛋白的纯化，1L过夜诱导的细菌培养物通过离心来丸粒化，细胞丸粒重悬浮在含1mg/ml溶菌酶和CompleteTM EDTA-free蛋白酶抑制物片的pH 7.4的20mM磷酸钠缓冲液，500mM氯化钠中。细胞通过超声破碎来破坏，不溶性物质通过离心丸粒化，上清液施加于Ni-氨三乙酸(Ni-NTA)金属亲和层析：柱用几倍柱床体积的裂解缓冲液洗涤，随后用20mM磷酸钠缓冲液、500mM氯化钠、20mM咪唑，pH 7.4洗涤。最后，结合的抗原用在20mM磷酸钠缓冲液、500mM氯化钠、pH7.4中从20到500mM的咪唑梯度洗脱，并保存在4℃、75mM HEPES-缓冲液，pH 7.5、100mM氯化钠、1mM EDTA、6.5％蔗糖中。
多克隆抗体的产生：
a)免疫
为了免疫，制备1∶1比例的蛋白质溶液(100μg/ml蛋白质APEX)和完全弗氏佐剂的新鲜乳剂。在第1、7、14和30、60和90天用1mL乳剂免疫每只兔子。抽取血液，产生的抗APEX血清如下文描述的使用。
b)通过用辛酸和硫酸铵连续沉淀从兔血清纯化IgG(免疫球蛋白G)
一倍体积的兔血清用4倍体积的醋酸盐缓冲液(60mM，pH 4.0)稀释。pH值用2M Tris-碱调节到4.5。辛酸(25μl/ml稀释的样品)在强烈搅拌下滴加。在30分钟后，离心样品(13000×g，30分钟，4℃)，弃去丸粒，采集上清液。上清液的pH值通过添加2M Tris-碱调节到7.5。
上清液中的免疫球蛋白通过滴加4M硫酸铵溶液到2M的终浓度在强烈搅拌下沉淀。沉淀的免疫球蛋白通过离心收集(8000×g，15分钟，4℃)。
丢弃上清液。丸粒溶于10mM NaH2PO4/NaOH、pH 7.5、30mMNaCl中，并彻底地透析。透析液进行离心(13000×g，15分钟，4℃)并过滤(0.2μm)。
c)多克隆兔IgG的生物素化：
多克隆兔IgG在10mM NaH2PO4/NaOH、pH 7.5、30mM NaCl中达到10mg/ml。每ml IgG溶液添加50μl生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(DMSO中3.6mg/ml)。在室温下30分钟后，样品在Superdex 200上层析(10mM NaH2PO4/NaOH，pH 7.5，30mM NaCl)。采集含有生物素化的IgG的部分。
d)多克隆兔IgG的免疫吸附：
对于APEX免疫吸附，根据厂家的方案，10mg纯化的重组APEX与1ml CNBr活化的SepharoseTM 4B(GE Healthcare，Germany CatalogNo.17-04-30-01)偶联。这个亲和柱用PBS、0.05％Tween 20中的100mg多克隆兔IgG加载，随后用a)PBS，b)0.5M氯化钠、0.05％Tween20，c)30mM氯化钠洗涤。结合的部份用用盐酸调节到pH 2.1的0.5M甘氨酸、150mM氯化钠洗脱，立即通过添加1M Tris-碱变为中性pH值。洗脱物浓缩到10mg/ml，并在PBS中在
Figure A20088000950400241
G3000SW凝胶过滤柱(Sigma-Aldrich，Germany，catalogue No.815103)上层析。采集含有IgG单体的部分。
实施例3
用于测量人类血清和血浆样品中的APEX的ELISA
为了检测人类血清或血浆中的APEX，开发了夹心ELISA。对于抗原的捕获，抗APEX多克隆抗体(参见实施例2)被免疫吸附，并且为了抗原的检测，抗APEX多克隆抗体与生物素结合。
96孔微量滴定板与以150mM碳酸二钠、350mM碳酸氢钠中5μg/ml的100μl免疫吸附的抗APEX多克隆抗体孵育60分钟。随后，平板用PBS、0.05％Tween 20洗涤三次。然后用重组蛋白质的连续稀释物(参见实施例2)作为标准抗原或用来自患者的稀释的血浆样品与5μg/ml生物素化的抗APEX多克隆抗体一起孵育孔2小时。孵育是在10mM磷酸盐、pH 7.4、1％BSA、0.9％NaCl和0.1％Tween 20中。此后，洗涤平板三次来除去未结合的成分。在下一步中，孔与20mU/mL抗生物素-POD结合物在10mM磷酸盐、pH 7.4、1％BSA、0.9％NaCl和0.1％Tween 20中孵育60分钟。随后用相同的缓冲液洗涤平板三次。对于结合的抗原抗体复合物的检测，孔与100μl ABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany，Catalog No.11685767)孵育，在30-60分钟之后用ELISA读取器在405nm测量OD。
实施例4
研究群体
使用了来自用表3中给出的UICC分类法良好表征的60位NSCLC患者(30位腺CA，30位鳞状细胞CA)的样品。
表3：研究群体
  根据UICC的分期   样品数
  UICC I/II   24
  UICC III   17
  UICC IV   19
  明显健康的供血者   30
  表面上健康的吸烟者   30
与获自30位明显健康的个体和30位没有任何已知恶性肺部疾病的表面上健康的吸烟者(＝对照群组)相比，评估表3的LC样品中APEX的水平。
与对照样品中的APEX水平相比，表3的LC样品中APEX的水平提高了。
根据Zweig，M.H.和Campbell的上文进行ROC分析。如通过曲线下面积所测量的，区分LC组中的患者与健康个体的判别能力被发现对于LC对健康对照为92％(附图1)。
在95％的特异性下，所有LC样品的敏感性是70％，对于腺癌67％，对于鳞状细胞癌73％。
实施例5
利用实施例2中产生的多克隆抗体检测人类肺癌组织中的APEX的Western印迹
来自肿瘤样品和健康对照样品的组织溶胞产物如实施例1“组织制备”中描述的制备。
SDS-PAGE和Western印迹使用Invitrogen，Karlsruhe，Germany的试剂和设备进行。对于测试的每种组织样品，15μg的组织溶胞产物在还原
Figure A20088000950400261
(Invitrogen)SDS样品缓冲液中稀释，在95℃加热10分钟。样品在MES运行缓冲系统中在4-12％
Figure A20088000950400262
凝胶(Tris-甘氨酸)上运行。使用Invitrogen XCell
Figure A20088000950400263
Blot Module(Invitrogen)和
Figure A20088000950400264
转移缓冲系统，凝胶分离的蛋白质混合物在硝化纤维膜上印迹。膜在PBS/0.05％Tween-20中洗涤3次，用
Figure A20088000950400265
封闭缓冲液(A151.1；Carl Roth GmbH，Karlsruhe，Germany)封闭2小时。第一抗体，多克隆兔抗APEX血清(实施例2中描述的产生)在
Figure A20088000950400266
封闭缓冲液中1∶10,000稀释，与膜孵育1小时。膜在PBS/0.05％Tween-20中洗涤6次。特异性结合的第一兔抗体用POD结合的多克隆绵羊抗兔IgG抗体标记，在
Figure A20088000950400267
封闭缓冲液中稀释到10mU/ml。在孵育1小时之后，膜在PBS/0.05％Tween-20中洗涤6次。对于结合的POD结合的抗兔抗体的检测，膜与Lumi-LightPLUS Western印迹底物(Order-No.2015196，RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany)孵育，并暴露于放射自显影底片。
APEX的信号强度在从20位不同LC患者获得的20个肿瘤组织溶胞产物中的16个中提高(附图2)。表达水平＞600ng/mg。因而，如实施例1中的MALDI检出的肺癌组织中APEX的提高的丰度通过Western印迹分析被确认。
序列表
<110>F.Hoffmann-La Roche AG
<120>作为肺癌标志物的APEX
<130>39943P EP
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>318
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<222>(1)..(318)
<223>APEX
<400>1
Met Pro Lys Arg Gly Lys Lys Gly Ala Val Ala Glu Asp Gly Asp Glu
1               5                   10                  15
Leu Arg Thr Glu Pro Glu Ala Lys Lys Ser Lys Thr Ala Ala Lys Lys
            20                  25                  30
Asn Asp Lys Glu Ala Ala Gly Glu Gly Pro Ala Leu Tyr Glu Asp Pro
        35                  40                  45
Pro Asp Gln Lys Thr Ser Pro Ser Gly Lys Pro Ala Thr Leu Lys Ile
    50                  55                  60
Cys Ser Trp Asn Val Asp Gly Leu Arg Ala Trp Ile Lys Lys Lys Gly
65                  70                  75                  80
Leu Asp Trp Val Lys Glu Glu Ala Pro Asp Ile Leu Cys Leu Gln Glu
                85                 90                 95
Thr Lys Cys Ser Glu Asn Lys Leu Pro Ala Glu Leu Gln Glu Leu Pro
            100                 105                 110
Gly Leu Ser His Gln Tyr Trp Ser Ala Pro Ser Asp Lys Glu Gly Tyr
        115                 120                 125
Ser Gly Val Gly Leu Leu Ser Arg Gln Cys Pro Leu Lys Val Ser Tyr
    130                 135                 140
Gly Ile Gly Asp Glu Glu His Asp Gln Glu Gly Arg Val Ile Val Ala
145                 150                 155                 160
Glu Phe Asp Ser Phe Val Leu Val Thr Ala Tyr Val Pro Asn Ala Gly
                165                 170                 175
Arg Gly Leu Val Arg Leu Glu Tyr Arg Gln Arg Trp Asp Glu Ala Phe
            180                 185                 190
Arg Lys Phe Leu Lys Gly Leu Ala Ser Arg Lys Pro Leu Val Leu Cys
        195                 200                 205
Gly Asp Leu Asn Val Ala His Glu Glu Ile Asp Leu Arg Asn Pro Lys
    210                 215                 220
Gly Asn Lys Lys Asn Ala Gly Phe Thr Pro Gln Glu Arg Gln Gly Phe
225                 230                 235                 240
Gly Glu Leu Leu Gln Ala Val Pro Leu Ala Asp Ser Phe Arg His Leu
                245                 250                 255
Tyr Pro Asn Thr Pro Tyr Ala Tyr Thr Phe Trp Thr Tyr Met Met Asn
            260                 265                 270
Ala Arg Ser Lys Asn Val Gly Trp Arg Leu Asp Tyr Phe Leu Leu Ser
        275                 280                 285
His Ser Leu Leu Pro Ala Leu Cys Asp Ser Lys Ile Arg Ser Lys Ala
    290                 295                 300
Leu Gly Ser Asp His Cys Pro Ile Thr Leu Tyr Leu Ala Leu
305                 310                 315
<210>2
<211>96
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>正向引物LC38for-EcoRI
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(96)
<400>2
acgtacgtga attcattaaa gaggagaaat taactatgag aggatcgcat caccatcacc    60
atcacattga aggccgtccg aagcgtggga aaaagg                              96
<210>3
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>反向引物LC38rev-BamHI
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(43)
<400>3
cgtacgtgga tcctcattac agtgctaggt atagggtgat agg                   43
<210>4
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽延伸
<220>
<221>肽
<222>(1)..(14)
<400>4
Met Arg Gly Ser His His His His His His Ile Glu Gly Arg
1               5                   10

Claims (10)

1.一种体外评估肺癌的方法，包括测量样品中以下的存在和/或浓度：
(a)选自组织提取物和体液的样品中的AP核酸内切酶(APEX)，
(b)任选一种或更多种其他肺癌标志物，以及
(c)将步骤(a)和任选步骤(b)的测量结果用于肺癌的评估，其中APEX的检测是肺癌的指示。
2.根据权利要求1的方法，其中所述一种或更多种其他标志物选自CYFRA 21-1、CEA、NSE、proGRP和SCC。
3.根据权利要求2的方法，其中所述一种或更多种其他标志物是CYFRA 21-1。
4.根据权利要求2的方法，其中所述一种或更多种其他标志物是CEA。
5.根据权利要求2的方法，其中所述一种或更多种其他标志物是SCC。
6.APEX在选自组织提取物和体液的样品中体外评估肺癌中的用途，其中APEX的检测是肺癌的指示。
7.包含APEX和一种或更多种其他肺癌标志物的标志物组在选自组织提取物和体液的样品中体外评估肺癌中的用途，其中APEX的检测是肺癌的指示。
8.根据权利要求7的标志物组的用途，其中所述一种或更多种其他标志物选自CYFRA 21-1、CEA、NSE和SCC。
9.根据权利要求8的标志物组的用途，所述标志物组至少包含APEX和CYFRA 21-1。
10.一种用于进行根据权利要求2的方法的试剂盒，包括特异性地测量APEX和一种或更多种其他肺癌标志物所需的试剂。
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