JP5079023B2 - 肺癌用マーカーとしてのapex - Google Patents
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Description
スクリーニングとは、疾患の表示、例えば肺癌の存在について、個体、例えば危険性のある個体を同定するための試験の体系的な適用として規定される。好ましくは、スクリーニング集団は、喫煙者、過剰喫煙者、およびウラン、石英またはアスベスト曝露労働者のような肺癌の平均的な危険性が高い個体からなる。1つの好ましい態様において、肺癌のスクリーニングにおける試料として唾液が使用される。
マーカーは、特に臓器の良性疾患対悪性疾患の鑑別診断を補助するか、異なる組織学的腫瘍型の識別を補助するか、または手術前のベースラインマーカー値を確立するかのいずれかであり得る。
診断インジケータは、一定の尤度で疾患結果を予測する癌患者およびその腫瘍の臨床的、病理学的、または生化学的特徴と定義され得る。その主な使用は、患者管理の合理的な計画、すなわち、それぞれ急速進行性疾患の過少治療および無痛性疾患の過剰治療の回避を補助することである。Molina R. et al.,Tumor Biol. (2003)24:209-218では、NSCLCにおいてCEA、CA 125、CYFRA21-1、SSCおよびNSEの予後値が評価された。彼らの研究では、マーカーNSE、CEA、およびLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)の異常血清レベルは、短い生存を示すようであった。
Merle,P. et al.,Int. J. of Biological Markers (2004)19:310-315では、導入補助化学療法で治療された局所進行NSCLCを有する患者におけるCYFRA21-1血清レベルの変化が評価された。彼らは、CYFRA21-1血清レベルの早期モニタリングが病期III NSCLC患者の腫瘍応答および生存の有用な予後ツールであり得ると結論づけた。また、報告により、LCを有する患者の治療のモニタリングにおけるCEAの使用が記載された(Fukasawa T. et al.,Cancer & Chemotherapy (1986)13:1862-1867)。これらの研究のほとんどは、遡及的でランダムではなく、少数の患者を含んだ。CYFRA21-1での研究の場合のように、CEA研究は、a)化学療法を受けている間にCEAレベルが減少した患者は、一般的に、CEAレベルが減少しなかった患者よりも良好な結果を有し、(b)ほぼすべての患者で、CEAレベルの増加は疾患の進行と関連したことを示した。
癌性組織の完全な除去を目的とした外科的切除を受けるLC患者の大部分は、
後に再発性または転移性の疾患が起こる(Wagner,H.,Chest (2000)117:110-118;Buccheri,G. et al.,Ann. Thorac. Surg. (2003)75:973-980)。これらの再発のほとんどは、手術後最初の2〜3年以内に起こる。再発性/転移性疾患は、検出が遅すぎた場合は常に致死的であるため、相当な研究が、その初期ひいては潜在的に治療可能な段階でのLC再発に焦点を当てている。
肺癌のマーカーとしてのAPEXの同定
組織の供給源:
肺癌の診断マーカーとしての腫瘍特異的タンパク質を同定するため、プロテオミクス法を用いた異なる2種類の組織の解析を行なう。
0.8〜1.2gの凍結組織を小片に切断し、ミキサーボールミルの凍結粉砕瓶に移し、液体窒素によって完全に凍結させる。組織をボールミル内で粉砕し、10倍容量(w/v)の溶解バッファー(40mMクエン酸Na、5mM MgCl2、1%Genapol X-080、0.02%アジ化Na、Complete(登録商標)無EDTA[Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany、カタログ番号1 873 580])中に溶解し、続いてWheaton(登録商標)ガラスホモジナーザー(20×ルーズフィット、20×タイトフィット)でホモジナイズする。ホモジネートを遠心分離(5,000×gで10分)に供し、上清を別のバイアルに移し、再度遠心分離(20,000×gで15分)に供する。得られた上清は可溶性タンパク質を含み、さらなる解析に使用される。
可溶性タンパク質画分のタンパク質濃度を、供給元のマニュアルの使用説明書に従ってBio-Radタンパク質アッセイ(登録商標)(カタログ番号500-0006;Bio-Rad Laboratories GmbH、Muenchen、Germany)を用いて測定する。200μgのタンパク質に相当する容量に、4mlの還元バッファー(9M尿素、2mM DTT、100mM KH2PO4、NaOH pH8.2)を添加し、1時間インキュベートする。Amicon(登録商標)Ultra装置(Millipore GmbH、Schwalbach、Germany)内でこの溶液を50μlに濃縮し、アルキル化のために0.5mlの試料バッファー(9M尿素、4mMヨードアセトアミド、100mM KH2PO4、NaOH pH8.2)に移し、6時間インキュベートする。アルキル化後、Amicon(登録商標)Ultra装置内で溶液を50μlに濃縮し、0.5mlの9M尿素 10mM KH2PO4、NaOH pH8.2を添加し、溶液を50μlに再度濃縮する。この手順を2回繰返す。続いて、最終50μlを水中4μgのトリプシン(プロテオミクス等級、Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany)で990μlに希釈し、一晩消化させる。
Nano-LCシステム(Ultimate、Famos、Switchos;LC Packings、Idstein、Germany)での2次元 HPLC (MudPIT)によって、トリプシン消化物(100μl)を分離する。分離は、自己充填2次元カラム(溶融シリカ:PicoFrit 75μm、New Objective;RP:ProntoSil 120-5-C18 AQ+、Bischoff;SCX:Partisil 10、Whatman)を用いて行なう。連続増加量のNH4Ac(0〜1500mM)での段階的溶出によって11個のSCX画分を生成させる。これらを、カラムのRP部分でさらに分離し、ESI-MSイオントラップ(LCQ deca XP;Thermo Electron、Massachusetts、USA;パラメータについては表1参照)。とともにデータ依存性スキャンを用いてオンライン解析する。各試料について、3回実験を行なう。ベースアルゴリズムとしてSequestを用いて、市販されていないRoche独自のデータ管理システムで生データを処理する(パラメータ表1参照)。反復実験で同定されたペプチドおよびタンパク質の得られたリストを組み合わせた。
各患者について、腫瘍試料から同定されたタンパク質および対応するペプチドの数を、隣接正常組織の一致した結果と比較する。この手段によって、タンパク質APEXは、腫瘍組織内に特異的に存在するか、または非常に多量であり、健常対照組織では検出可能でないか、またはかろうじて検出可能であることがわかる。
肺癌マーカータンパク質APEXに対する抗体の作製
免疫検出アッセイ、例えば、ウエスタンブロッティングおよびELISAによるAPEXの血清レベルおよび血漿レベルおよび血中レベルの測定における抗体のさらなる使用のため、肺癌マーカータンパク質APEXに対するポリクローナル抗体を作製する。
APEXに対する抗体を作製するため、大腸菌において組換え抗原を作製する。したがって、German Resource Center for Genome Research (RZPD、Berlin、Germany)から入手した完全長cDNAクローンIRAT p970H075Dから、プライマー:
を用いてAPEXコード領域をPCR増幅する。
a)免疫化
免疫化のため、タンパク質溶液の新鮮エマルジョン(100μg/mlのタンパク質APEX)および完全フロイントアジュバントを1:1の比で調製する。1、7、14および30、60および90日目に各ウサギを1mlのエマルジョンで免疫化する。血液を採取し、得られた抗APEX血清を以下に記載するようにして使用する。
1容量のウサギ血清を4容量の酢酸バッファー(60mM、pH4.0)で希釈する。2M Tris-塩基でpHを4.5に調整する。カプリル酸(25μl/mlの希釈試料)を激しい攪拌下で滴下する。30分後、試料を遠心分離し(13000×g、30分、4℃)、ペレットを廃棄し、上清を回収する。2MのTris-塩基の添加により上清のpHを7.5に調整する。
ポリクローナルウサギIgGを10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl中で10mg/mlにする。IgG溶液1mlあたり50μlのビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミド(DMSO中3.6mg/ml)を添加する。室温で30分後、試料をSuperdex 200 (10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl)上でクロマトグラフィー処理する。ビオチン化IgGを含有する画分を収集する。
APEX免疫吸着体のため、製造業者のプロトコルに従って10mgの精製組換えAPEXを1mlのCNBr活性化SepharoseTM 4B (GE Healthcare、Germany カタログ番号17-04-30-01)に結合させる。このアフィニティカラムにPBS、0.05%Tween 20中100mgのポリクローナルウサギIgGを負荷した後、a)PBS、b)0.5M塩化ナトリウム、0.05%Tween 20、c)30mM塩化ナトリウムで洗浄する。結合画分を0.5Mのグリシン、150mM塩化ナトリウムで溶出し、塩酸でpH2.1調整し、1MのTris-塩基の添加によってすぐに中性pHにする。溶出液を10mg/mlに濃縮し、PBS中TSK-Gel(登録商標)G3000SWゲル濾過カラム(Sigma-Aldrich、Germany、カタログ番号815103)上でクロマトグラフィー処理する。IgGモノマーを含有する画分を収集する。
ヒト血清および血漿試料におけるAPEXの測定のためのELISA
ヒト血清または血漿におけるAPEXの検出のため、サンドイッチELISAを開発する。抗原の捕捉のため、抗APEXポリクローナル抗体(実施例2参照)を免疫吸着し、抗原の検出のために抗APEXポリクローナル抗体をビオチンと結合させる。
試験集団
表3に示すUICC分類での充分特性付けされた60名のNSCLC患者由来の試料(30腺CA、30 扁平上皮細胞CA)を使用する。
実施例2で作製したポリクローナル抗体を用いたヒト肺癌組織におけるAPEXの検出のためのウエスタンブロッティング
腫瘍試料および健常対照試料の組織溶解物を実施例1の「組織調製」に記載のようにして調製する。
T = 腫瘍組織溶解物
N = 適合対照組織溶解物
PP = 健常ドナー由来血漿プール(約60kDの範囲のバンドは、おそらく非特異的バックグラウンド反応によるものである)
rec. AG = 組換えにより産生されたAPEX (1レーンあたり10、3または1ng)
矢印は、APEXの位置を示す。
Claims (11)
- (a)組織抽出物および体液から選択される試料中のAPエンドヌクレアーゼ(APEX)の存在および/または濃度を測定する工程、ならびに
(b)工程(a)の測定結果を肺癌の評価に使用する工程、ここで、APEXの増大した存在および/または増大した濃度の検出は肺癌を示す、
を含む、肺癌をインビトロで評価するための方法。 - 工程(a)が、試料中の1種類以上の他の肺癌のマーカーの存在および/または濃度を測定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 前記1種類以上の他のマーカーが、CYFRA21-1、CEA、NSE、proGRPおよびSCCからなる群から選択される、請求項2記載の方法。
- 前記1種類以上の他のマーカーがCYFRA21-1である、請求項3記載の方法。
- 前記1種類以上の他のマーカーがCEAである、請求項3記載の方法。
- 前記1種類以上の他のマーカーがSCCである、請求項3記載の方法。
- 組織抽出物および体液から選択される試料中での肺癌のインビトロ評価におけるAPEXの使用であって、該使用においては、該試料中のAPEXの存在および/または濃度を測定する工程を含み、APEXの増大した存在および/または増大した濃度の検出が肺癌を示す、使用。
- 組織抽出物および体液から選択される試料中での肺癌のインビトロ評価におけるAPEXおよび1種類以上の他の肺癌のマーカーを含むマーカーパネルの使用であって、該使用においては、該試料中のAPEXおよび1種類以上の他の肺癌のマーカーの存在および/または濃度を測定する工程を含み、APEXの増大した存在および/または増大した濃度の検出が肺癌を示す、使用。
- 1種類以上の他のマーカーが、CYFRA21-1、CEA、NSE、およびSCCからなる群から選択される、請求項8記載のマーカーパネルの使用。
- 該マーカーパネルが少なくともAPEXおよびCYFRA21-1を含む、請求項9記載のマーカーパネルの使用。
- APEXおよび1種類以上の他の肺癌のマーカーを特異的に測定するのに必要とされる試薬を含む、請求項3記載の方法を行なうためのキット。
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