JP5571171B2 - 肺癌のマーカーとしてのcybp - Google Patents
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Description
LCは、IaとIIIaの間のステージで評価されるのが好ましい。
患者のモニタリングに使用される場合、本発明に係る診断方法は、腫瘍量、治療効果、及び患者の経過観察における腫瘍再発を評価するのに役立ちうる。CYBPレベルの増加は腫瘍量に直接相関する。短期間(数時間から14日)の化学療法後、CYBPの増加は、腫瘍細胞死の指標となりうる。患者の経過観察(3ヶ月から10年)において、CYBPの増加は、腫瘍再発の指標として使用することができる。
CYBPは、生理学的なカルシウム濃度で、S100ファミリーのS100A1、S100A6、S100B、S100P及びS100A12と相互作用する。それは、少なくともUBE2D1、SIAH1、CACYBP/SIP、SKP1、APC及びTBL1Xからなるいくつかの大きなE3複合体の成分である。それは、SIAH1、SIAH2及びSKP1と直接的に相互作用する。
スクリーニングは、疾患の指標、例えば肺癌の存在について、個体、例えばリスクのある個体を特定する試験の系統的適用として定義される。好ましくはスクリーニング集団は、喫煙者、元喫煙者、及びウラン曝露、水晶曝露又はアスベスト曝露労働者等、肺癌の平均的リスクよりも高いことが知られている個体からなる。好ましい一実施態様では、肺癌をスクリーニングする試料として痰が使用される。
マーカーは、特定の器官における良性対悪性疾患の鑑別診断を補助し、異なった組織学的タイプの腫瘍を区別し、又は手術前のベースラインマーカー値を確立するのに役立ちうる。
予後指標は、疾患の成績を所定の蓋然性をもって予測する癌患者及びその腫瘍の臨床的、病理学的、又は生化学的特徴として定義することができる。それらの主要な用途は、患者の管理を理性的に計画立てる、すなわち侵襲性疾患の処置不十分、及び無痛性疾患の過剰処置をそれぞれ回避するのに役立つ。Molina Rら, Tumor Biol. (2003) 24:209-218では、NSCLCにおけるCEA、CA125、CYFRA21−1、SSC及びNSEの予後値を評価した。彼らの研究では、マーカーNSE、CEA、及びLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)の異常な血清レベルが、より短い生存率を示すようであった。
Merle, Pら, Int. J. of Biological Markers (2004) 19:310-315では、術前化学療法で治療された、局所的に進行したNSCLCを患っている患者においてCYFRA21−1血清レベル変化が評価されている。彼らは、CYFRA21−1の血清レベルの早期モニタリングが、ステージIIIのNSCLC患者の腫瘍応答及び生存期間についての有用な予後ツールとなりうると結論付けている。また、報告書には、LCを患っている患者の処置のモニタリングに、CEAを使用することが記載されている(Fukasawa Tら, Cancer & Chemotherapy (1986) 13:1862-1867)。これらの研究のほとんどが、レトロスペクティブで無作為でなく、少数の患者を含むものであった。CYFRA21−1を用いた研究の場合におけるように、CEA研究では、a)化学療法を受けながらCEAレベルが減少している患者は、一般に、CEAレベルが減少していない患者よりも良好な結果を有しており、(b)ほとんど全ての患者に対して、CEAレベルの増加が疾患の進行に関連していたことが示唆された。
癌組織の完全な除去を目的として外科的切除を受けたLC患者の多くが、後に再発性又は転移性疾患を発症している(Wagner, H., Chest (2000) 117:110-118;Buccheri, Gら, Ann. Thorac. Surg. (2003) 75:973-980)。これらの再発のほとんどは、術後の最初の2−3年で生じている。再発性/転移性疾患は、あまりに遅くに検出された場合は、常に致命的であるため、多くの研究が、初期の、よって潜在的に治療可能性のある段階でのLC再発に集中している。
肺癌マーカータンパク質CYBPに対する抗体の生産
肺癌マーカータンパク質CYBPに対するポリクローナル抗体の調製を、免疫検出アッセイ、例えばウエスタンブロット法及びELISAによる、CYBPの血清及び血漿及び血中レベルの測定において抗体をさらに使用するために生産する。
CYBPに対して抗体を生産するために、大腸菌中において組換え抗原を生成させる:よって、CYBPコード化領域は、適切な順方向及び逆方向プライマーを使用し、配列番号:1に特定された227のアミノ酸をコードする全長CYBP−cDNAクローンからPCR増幅させる。
a)免疫化
免疫化のために、1:1の比のタンパク質溶液(100μg/mlタンパク質CYBP)と完全フロイトアジュバントの新鮮なエマルションを調製する。各ウサギを、1mlの該エマルションで、1、7、14、及び30、60及び90日目に免疫化する。血液を抜き出し、得られた抗CYBP血清を、以下に記載するようにして使用する。
1容量のウサギ血清を、4容量のアセテートバッファー(60mM、pH4.0)で希釈する。pHを2Mのトリス塩基で4.5に調節する。カプリル酸(25μl/mlの希釈試料)を、激しく攪拌しつつ滴下して加える。30分後、試料を遠心分離(13000×g、30分、4℃)し、ペレットを廃棄し、上清を収集する。2Mのトリス塩基の添加により、上清のpHを7.5に調節する。
ポリクローナルウサギIgGを、10mMのNaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mMのNaCl中において10mg/mlにする。IgG溶液1ml当たり、50μlのビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミド(DMSO中3.6mg/ml)を添加する。室温で30分後、試料をスーパーデックス200(10mMのNaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mMのNaCl)でクロマトグラフィー処理する。ビオチン化IgGを含む画分を収集する。
ポリクローナルウサギIgGを、10mMのNaH2PO4/NaOH、30mMのNaCl、pH7.5中において10mg/mlにする。IgG溶液1ml当たり、50μlのジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプリン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, カタログ番号1 333 054)(DMSO中3.8mg/ml)を添加する。室温で30分後、試料をスーパーデックス(登録商標)200(10mMのNaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mMのNaCl)でクロマトグラフィー処理する。ジゴキシゲニン化IgGを含む画分を収集する。
ヒト血清及び血漿試料中のCYBPの測定のためのELISA
ヒト血清又は血漿中におけるCYBPを検出するために、サンドイッチELISAを開発する。抗原を捕捉するために、抗CYBPポリクローナル抗体(実施例1を参照)をビオチンとコンジュゲートさせ、ストレプトアビジン被覆表面に固定し、抗原の検出のために、抗CYBPポリクローナル抗体をジゴキシゲニンとコンジュゲートさせる。
研究集団
60名の十分に特徴付けられたNSCLC患者(30のアデノ−CA、30の扁平細胞CA)から得られた試料を使用する。
LC試料中のCYBP、CEA及びCYFRA21−1のレベルを評価する。
結果を表1に示す:
Claims (13)
- 肺癌をインビトロで評価する方法であって、該方法は
(a)体液試料中のCYBPの濃度を測定する工程、及び
(b)工程(a)の測定結果を肺癌の評価に使用する工程を含み、
CYBPの増大した濃度の検出が肺癌の指標となる、方法。 - CYBPの増大した濃度の検出は、工程(a)の測定結果と、健常な個体群の検査から予め決定されたカットオフ値との比較により決定される、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(a)が一又は複数の他の肺癌用マーカーの濃度を測定することを更に含み、前記工程(b)が肺癌の評価に前記一又は複数の他のマーカーの測定結果を使用することを更に含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記一又は複数の他のマーカーが、CYFRA21−1、CEA、NSE、proGRP及びSCCからなる群から選択される請求項3に記載の方法。
- 前記一又は複数の他のマーカーがCYFRA21−1である請求項4に記載の方法。
- 前記一又は複数の他のマーカーがCEAである請求項4に記載の方法。
- 前記一又は複数の他のマーカーがSCCである請求項4に記載の方法。
- 肺癌のインビトロ評価におけるCYBPの使用であって、該使用は体液試料中のCYBPの濃度を測定する工程を含み、CYBPの増大した濃度の検出が肺癌の指標となる、使用。
- 肺癌のインビトロ評価におけるCYBP及び一又は複数の他の肺癌用マーカーを含むマーカーパネルの使用であって、該使用は体液試料中のCYBP及び一又は複数の他の肺癌用マーカーの濃度を測定する工程を含み、CYBPの増大した濃度の検出が肺癌の指標となる使用。
- 一又は複数の他のマーカーが、CYFRA21−1、CEA、NSE、proGRP及びSCCからなる群から選択される請求項9に記載のマーカーパネルの使用。
- 少なくともCYBP及びCYFRA21−1を含む請求項10に記載のマーカーパネルの使用。
- 体液が血漿である、請求項1から7の何れか一項に記載の方法、又は請求項8から11の何れか一項に記載の使用。
- CYBPと、CYFRA21−1、CEA、NSE、proGRP及びSCCからなる群から選択される一又は複数の他の肺癌用マーカーを特異的に測定するのに必要とされる試薬を含んでなる、請求項1から7の何れか一項に記載の方法を実施するためのキット。
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