JP4981133B2

JP4981133B2 - 肺癌用マーカーとしてのｎｎｍｔの使用

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Publication number: JP4981133B2
Application number: JP2009522154A
Authority: JP
Inventors: ロリンガー，ウォルフガング; ハグマン，マリー−ルイゼ; カール，ヨハン; コット，テレーザ; レスラー，マルクス; タッケ，ミヒァエル
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2006-08-01
Filing date: 2007-07-30
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2027-07-30
Also published as: ES2345167T3; EP2049905B1; CA2655851A1; US7785821B2; CN101495870B; EP2049905A1; CN101495870A; JP2009545731A; ATE468535T1; WO2008014951A1; US20090263841A1; HK1136873A1; DE602007006671D1

Description

本発明は、肺性の癌または肺癌(=LC)、特に非小細胞肺癌(NSCLC)の評価を補助する方法に関する。本発明は、LC、特にNSCLCのマーカーとしてのタンパク質ニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ(=NNMT)の使用を開示する。さらに、本発明は、特に試料中のNNMTを測定することによって個体由来の液体試料から肺癌を評価する方法に関する。NNMTの測定は、例えば肺癌の早期検出または手術を受ける患者のサーベイランスに使用することができる。

癌は、検出および治療の進歩にも関わらず、主要な公衆衛生課題のままである。様々な種類の癌の中でも、LCは西洋で頻度の高い癌であり、中でも癌関連致死率の最も頻度の高い原因である。これは大部分で疾患の早期検出の診断ギャップによるものである。LCは主に早期段階で無症候である。全ての肺癌の大部分は、疾患が既に手術可能でない場合の後期段階で検出される。

LC腫瘍の大部分は、小細胞肺癌(SCLC)および非小細胞肺癌(NSCLC)に分けることができる。SCLCは全ての肺癌症例の約20〜25％に当たる。SCLCはLCの攻撃性神経内分泌型であり、早期段階で検出されても非常に不良な予後を有する。SCLCはまれに切除による治療処置に影響をうけやすい。疾患が進行する速度のために、SCLCは、より複雑なTNM病期システムよりも2つの段階、即ち、限定疾患および広範疾患を用いて一般的に分類される（以下参照）。約75〜80％のLC症例は扁平上皮細胞癌（癌=CA）、アデノ-CA（腺房CA、乳頭CA、肺胞腫瘍、固形腫瘍のサブクラス、および混合型サブタイプを含む）、ならびに大細胞癌（巨大細胞腫瘍、明細胞CA、アデノ扁平上皮CA、および未分化CAのサブクラスを含む）を含むNSCLCの種類にグループ化される。

また、NSCLCは、後期段階で検出される場合、非常に不良な予後を有する。癌の病期は程度、進行および重篤度の点における疾患の分類である。これは癌患者をグループ化して、一般化が予後および治療の選択について行われ得る。

今日、TNMシステムは、癌の解剖学的程度に基づいて最も広く使用される分類システムである。これは国際的に受け入れられた統一病期分類システムを表す。3つの基本変数:T(原発腫瘍の程度)、N(局所リンパ節の状態)、およびM(遠隔転移の有無)がある。TNM基準はUICC(International Union Against Cancer)のTNM Classification of Malignant Tumours, 第5版, Sobin, L.H. and Wittekind, Ch. (編), Wiley-Liss (1997), pp. 1803-1804)に公開されている。

原発腫瘍の外科切除は早期段階NSCLCのための治療選択として広く受け入れられている。NSCLCの進行、より具体的に、段階IIIa(T3N1M0、T1N2M0、T2N2M0、T3N2M0)からIIIb(T4N0M0、T4N1M0、T4N2M0)までの移行について、医師のアプローチの有意なシフトを早める。しかし、癌がより早期の段階(Ia〜IIIa;好ましくは段階T3N1M0まで)で検出される場合、5年の生存率は35％〜80％で変化する。段階Ia((T1N0M0);小腫瘍サイズ、転移なし)での検出は、80％までの5年の生存を有する最良の予後を明白に有する。

NSCLCの段階IIIb〜IVの管理に手術が使用されるのは、あるとしてもまれである。段階IVは、遠隔転移、即ち、肺および局部リンパ節を超える疾患の拡散に相当する。後期段階(III〜IV)における5年の生存率は1％〜15％未満に落ちる。

特に重要なことは、NSCLCの早期の診断をかなり良好な予後に変えることである。段階Ia(T1N0M0)、Ib(T2N0M0)、IIa(T1N1M0)、IIb、(T3N0M0)、およびIIIa(T3N1M0)ほどの早期に診断された患者は、適切に治療された場合に、診断後に80％までの5年の生存可能性を有する。これは、遠隔転移が既に存在すると診断された患者で1％未満の5年の生存率と比較される必要がある。

本発明の意味において、LCの早期評価とは、腫瘍段階T1N0M0またはT1-3N0-1M0での評価のことをいう。

LCが段階T1-3N0-1M0(=T1-3N0-1M0)で評価されることが好ましい。

ほとんどの肺癌は、症候性になる場合に検出される。現在の検出方法としては、胸部x-線、螺旋コンピュータートモグラフィー、唾液細胞学および肺胞検査が挙げられる。しかし、マススクリーニングについてこれらの手段の適切性に関しては論争がある。

肺癌のための多くの血清腫瘍マーカーが臨床使用にある。サイトセラチン 19 (CYFRA 21-1)の可溶性30 kDa断片、胚性癌抗原(CEA)、神経特異的エノラーゼ(NSE)、および扁平上皮細胞癌抗原(SCC)が最も卓越したLCマーカーである。しかし、これらのうち、スクリーニングツールに必要な感度および特異性の基準を満たすものはない(Thomas, L., Labor und Diagnose, TH Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt/Main, Germany (2000))。

臨床で有用であるために、単一マーカーとしての新しい診断マーカーが、当該技術分野で公知の他のマーカーに匹敵すべきであるか、または良好であるべきである。つまり、新しいマーカーはそれぞれ単独でまたは1つ以上の他のマーカーと組み合わせて使用されるいずれかの場合に診断感度および／または特異性における進歩をもたらすべきである。試験の診断感度および／または特異性は、受信者動作特性によって最良に評価され、以下で詳細に記載される。

全血、血清または血漿は、臨床慣例における試料の最も広く使用される供給源である。信頼性が高い癌検出を補助するかまたは早期の予後情報を提供する早期LC腫瘍マーカーの同定によって、診断およびこの疾患の管理を大いに補助する方法をもたらすことができる。従って、LCのインビトロ評価を改善するための緊急の臨床必要性が存在する。早期に診断される患者の生存機会は疾患の進行段階で診断される患者と比較して非常に高いので、LCの早期診断を改善することが特に重要である。

肺癌における生化学マーカーの臨床有用性が、最近概説された(Duffy, M.J., Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 38 (2001) 225-262)。

現在、CYFRA 21-1は、現在知られている最良の肺癌の腫瘍マーカーであるとみなされる。これは、臓器特異的でないが、主として肺組織に見られる。肺癌のためのCYFRA 21-1の感度は46〜61％であり、他の良性肺疾患に対して95％の特異性であると示されている。また、CYFRA 21-1の血清レベルの増大は、顕著な良性肝臓疾患、腎不全および侵襲性膀胱癌と関連する。CYFRA 21-1試験が、手術後治療サーベイランスに推奨される。

CEAは、通常胚発生中に作られる胎児癌抗原のグループに属する。CEAは、臓器特異的ではなく、結腸直腸癌のモニタリングに主に使用される。悪性の他に、肝臓硬変、気管支炎、膵臓炎および自己免疫疾患などの、いくつかの良性疾患もCEA血清レベルの増大と関連する。良性肺疾患に対して95％の特異性で、肺癌の感度が29〜44％であると報告されている。CEAの好ましい使用は、肺癌の治療サーベイランスである。

NSEはSCLCの腫瘍マーカーである。一般的に、NSE血清レベルの増大は、神経外胚葉腫瘍および神経内分泌腫瘍と関連して見られる。血清レベルの増大はまた、脳の髄膜炎または他の炎症疾患および頭部への外傷損傷などの、良性肺疾患および脳疾患を有する患者で見られる。95％の特異性でSCLCの感度が60〜87％であると報告されているが、NSCLCのためのNSE試験の性能は不良である(7〜25%)。NSEは、SCLCの治療サーベイランスに推奨される。

SCCは、頚部の扁平上皮細胞CAで最初に同定された。LCについてSCCの感度は一般的に低い(18〜27％)。従って、SCC試験は、スクリーニングに適切ではないとみなされる。しかし、扁平上皮細胞CAの高い感度のために、CYFRA 21-1が一般的に良好に実施されるが、SCCの好ましい使用は治療サーベイランスである。

マーカープロファイルおよび肺癌の改善された診断を目的とすることについて、一般的な炎症マーカーであるCYFRA 21-1、NSEおよびC-反応性タンパク質(CRP)の血清レベルを組み合わせるようなファジー論理ベース分類アルゴリズムを用いた方法(Schneider, J. et al., Int. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 145-151)が、公開された。著者は95％の特異性で92％の感度を報告する。

LCの評価に使用され得る生化学マーカーを同定し得るかどうかを調べることが本発明の課題であった。

驚くべきことに、マーカーNNMTの使用は当該技術分野の水準で現在公知のマーカーのいくつかの問題を少なくとも部分的に克服できることが分かった。

本発明は、NNMTの濃度を試料中で測定する工程、肺癌の評価において測定された濃度を用いる工程を含む、インビトロで肺癌を評価する方法に関する。驚くべきことに、試料中のNNMTレベルの増大は、例えば個体における肺癌の存在を示すことが確立できた。

また、本発明は、NNMTの濃度およびLCの１つ以上の他のマーカーの濃度を試料中で測定する工程、LCの評価において測定された濃度を使用する工程を含む、生化学マーカーによってインビトロでLCを評価する方法に関する。LCの1つ以上の他のマーカーがCYFRA 21-1、CEA、NSEおよびSCCからなる群より選択されることが好ましい。

また、本発明は、好ましい態様において、LCの評価において少なくともNNMTおよびCYFRA 21-1を含むマーカーパネルの使用に関する。

また、本発明は、LCの評価において少なくともNNMTおよびCEAを含むマーカーパネルの使用に関する。

また、本発明は、LCの評価において少なくともNNMTおよびSCCを含むマーカーパネルの使用に関する。

好ましい態様において、本発明は、a)NNMTの濃度を試料中で測定する工程、b)任意に肺癌の1つ以上の他のマーカーの濃度を試料中で測定する工程、ならびにc)肺癌の評価において工程(a)および任意に工程(b)で測定された濃度を使用する工程を含む、インビトロで肺癌を評価する方法に関する。

NNMT(ニコチンアミド N-メチルトランスフェラーゼ、EC 2.1.1.1)は、ニコチンアミドおよび他のピリジンのN-メチル化を触媒する。タンパク質NNMT(Swiss-PROT: P40261)は、配列番号１に示される配列を特徴とする。NNMTは、29.6 kDaの見かけ分子量および5.56の等電点を有する。

NNMT活性は多くの薬物および生体異物化合物の生体内変化に重要である。タンパク質は肝臓で主に発現することが報告されており、細胞質に局在する。NNMTは、ヒト肝臓のcDNAからクローニングされ、264アミノ酸のタンパク質をコードする792ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含み、29.6kDaの計算分子量を有する(Aksoy, S. et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 14835-14840)。文献ではヒト癌における酵素の潜在的役割についてはほとんど知られていない。ある論文では、肝臓NNMT酵素活性の増大がマウスにおける癌悪液質のマーカーとして報告された(Okamura, A. et al., Jpn. J. Cancer Res. 89 (1998) 649-656)。最近の報告で、放射線感受性細胞株の放射線に応答するNNMT遺伝子の下方調節が示された(Kassem, H., et al., Int. J. Cancer 101 (2002) 454-460)。米国2006/0024692では、NNMTm-RNA-レベルは、非癌性組織と比較して非小細胞肺癌細胞で低いことを見出した。WO 02/082076は、腎臓癌のサブタイプのマーカーとしてのNNMTタンパク質を記載する。

本明細書で使用される場合、以下の用語のそれぞれは、本項のものと関連する意味を有する。

冠詞「a」および「an」は、1つまたは1つより多い（即ち少なくとも1つの）冠詞の文法上の目的語のことをいうために本明細書で使用される。例えば、「a marker」は一つのマーカーまたは一つより多いマーカーを意味する。

用語「マーカー」または「生化学マーカー」は、本明細書で使用する場合、患者試料の分析における標的として使用される分子のことをいう。かかる分子標的の例は、タンパク質またはポリペプチドそれ自身、および試料中に存在するような標的に対する抗体である。記載「1つ以上」は、1〜20、好ましくは1〜10、好ましくは1〜5、より好ましくは3または4を表す。

本発明でマーカーとして使用されるタンパク質またはポリペプチドは、前記タンパク質の天然バリアントおよび前記タンパク質またはバリアントの天然断片または天然複合体、特に免疫学的に検出可能な断片または複合体のそれぞれを含むことが想定される。

当業者に明らかなように、本発明は配列番号1の完全長タンパク質NNMTの測定に限定されると解釈されるべきでない。また、NNMTの生理学的断片は、本発明を実施する際に肺癌用マーカーとして測定および使用することができる。免疫学的に検出可能な断片は、好ましくは前記マーカーポリペプチドの少なくとも6、7、8、10、12、15または20個の連続アミノ酸を含む。当業者は、細胞によって放出されるかまたは細胞外マトリックスに存在するタンパク質が、例えば炎症中に損傷され、かかる断片に分解または切断され得ることを認識する。また、当業者が認めるように、NNMTまたはその断片は、複合体の一部として存在し得る。また、かかる複合体は本発明の意味においてマーカーとして使用され得る。またはもしくはあるいは、NNMTポリペプチドは、翻訳後修飾、好ましくはグリコシル化、アシル化、および／またはリン酸化を保有し得、かかる修飾されたNNMTはまたLCのマーカーとして働き得る。

用語「肺癌を評価する」は、本発明による方法（単独でまたは他のマーカーもしくは例えば、UICCに示される基準(上述参照)の変数と共に）が、例えば医師がLCの存在または非存在を確立または確認することを補助するかまたは予後、再発の検出（手術後の患者の追跡）および／または治療、特に化学療法のモニタリングにおいて医師を補助することを示すために使用される。

用語「試料」は、本明細書で使用される場合、インビトロでの評価目的で得られた生物学的試料のことをいう。本発明の方法において、試料または患者試料は好ましくは任意の体液を含み得る。好ましい試料は全血、血清、血漿、肺胞洗浄液または唾液のそれぞれであり、血漿または血清が最も好ましい。

本発明の発明者らは、驚くべきことに、LCを有する患者に由来する試料の有意な割合のマーカーNNMTを検出することができた。さらに驚くべきことに、本発明者らは個体から得られたかかる液体試料中のNNMTの存在が肺癌の評価に使用され得ることを示すことができた。

好ましい態様において、本発明は、NNMTの濃度を試料中で測定すること、およびLCの評価において測定された濃度を使用することによってLCを評価する方法に関する。

当業者が認めるように、如何なるかかる測定はインビトロで行われる。患者試料は後で廃棄される。患者試料は本発明のインビトロ診断法に単独で使用され、患者試料の物質は患者の体に戻されない。典型的に、試料は、例えば、全血、血清、または血漿の液体試料である。

当業者は記載された実施例から分かるように、NNMTは、LCの診断に有用なマーカーとしてイムノアッセイにおける測定によって同定され、代替方法が本発明の達成に匹敵する結果に達するように使用され得る。マーカータンパク質NNMTは、任意の適切な手段によって検出され得、LCのマーカーとして使用され得る。かかる好ましい適切な手段は、イムノアッセイ手順、任意の他の形態の結合アッセイ、酵素活性の測定、液体クロマトグラフィー、特に高性能液体クロマトグラフィー、電気泳動、特にウエスタンブロッティングと組み合わせたSDS-PAGEおよび質量分析によるNNMTの検出を含む。

診断の理想シナリオは、単一事象またはプロセスが例えば感染疾患のような各疾患を生じる状態である。全ての他の症例で、正しい診断は、特に疾患の病因がLCの場合と同様に十分に理解されていない場合に、非常に困難であり得る。当業者が認めるように、例えばLCの分野で所定の疾患について100％特異性および同時に100％感度を有する診断生化学マーカーはない。むしろ、例えばCYFRA 21-1、CEA、NSE、SCCの生化学マーカーまたはここに示されるようなNNMTが、疾患の存在または非存在を特定の可能性または予測値で評価するために使用され得る。従って、慣例臨床診断において、一般的に様々な臨床症状および生物学的マーカーが、基礎にある疾患の診断、治療および管理において共に考慮される。

生化学マーカーは別々に測定することができるか、または本発明の好ましい態様においてこれらはアレイ技術に基づくチップもしくはビーズを用いて同時に測定することができるかのいずれかである。次に、バイオマーカーの濃度が、各マーカーの個々のカットオフを用いて独立に解釈されるか、またはこれらが解釈のために組み合わされるかのいずれかである。

さらに好ましい態様において、本発明によるLCの評価は、a)NNMTの濃度を試料中で測定する工程、b)肺癌の1つ以上の他のマーカーの濃度を試料中で測定する工程、ならびにc)肺癌の評価において工程(a)および工程(b)で測定された濃度を使用する工程を含む方法で実施される。当業者に明らかなように、NNMTの測定および肺癌の1つ以上の他のマーカーの測定が、試料の同じアリコートまたは種々のアリコートで選択的に行うことができる。

実施例部に示されるデータによれば、マーカーNNMTは、実施される単変量解析および多変量解析の両方で、LCについてほぼ50％の顕著な感度(約95％の特異性)を有し、この面で調査される他のLCマーカーと比較して同等または優れてもいることが分かった。LCの評価において、マーカーNNMTは、以下の局面:スクリーニング;診断補助;予後;化学療法、放射線療法および免疫療法などの治療モニタリングの1つ以上において有利である。

スクリーニング：
スクリーニングは、LCの症状の判断に医学注意を払わない個体で、LCを患う個体を十分なリスクで同定し、さらなる調査または直接予防作用の利益を得るような全身性適用の試験として定義される。

実施例部に示されるデータが示すように、NNMT単独では例えばLCのリスク集団の一般的スクリーニングを可能にするようには十分でない。最も可能性が高いが、循環における単一生化学マーカーはスクリーニング目的で必要な感度および特異性基準を満たさない。むしろ、マーカーパネルがLCスクリーニングで使用される必要があることを予測しなければならない。本発明で確立されたデータは、マーカーNNMTがスクリーニング目的に適切なマーカーパネルの統合部分を形成することを示す。従って、本発明は、LCのスクリーニング目的のためのLCマーカーパネルの１つのマーカーとしてのNNMTの使用に関する。NNMTレベルの増大はLCの存在を示す。本データは、特定のマーカーの組み合わせがLCのスクリーニングで有利であることをさらに示す。従って、本発明はまた、LCのスクリーニングの目的で、NNMTおよびCYFRA 21-1を含むマーカーパネル、またはNNMTおよびCEAを含むマーカーパネル、またはNNMTおよびNSEを含むマーカーパネル、またはNNMTおよびSCCを含むマーカーパネル、またはNNMTおよびCYFRA 21-1、CEA、NSE、およびSCCからなる群より選択される２つのマーカーを含むマーカーパネルの使用に関する。

診断補助：
マーカーは特定の臓器における良性対悪性疾患の種々の診断を補助し得るか、または腫瘍の異なる組織学的種類の区別に役立ち得るかのいずれかである。Molina, R. et al., Tumor Biol. 24 (2003) 209-218によって報告されるように、CEA、CA 125、CYFRA 21-1、SSCおよびNSEが血清マーカーとしてLCの組織学的診断を補助するために使用された。また、その研究の結果は、試験されたマーカーの中で、CYFRA21-1が組織学に関連しないが肺癌における最も感度の高いマーカーであることを示す。

本発明のデータによる単一マーカーとしてのNNMTがCEAまたはNSEのような他のLCマーカーに対して優れているために、NNMTが診断補助として、特に手術前のベースライン値の確立によって使用されることを予測しなければならない。

予後：
予後指標は、癌患者および疾患結果を予見する腫瘍の臨床、病理学的、または生化学特徴として定義することができる。その主な使用は患者管理の合理的な計画を補助すること、即ち、攻撃性疾患の過小治療および無痛性疾患の過剰治療を回避することである。Molina R. et al., Tumor Biol. (2003) 24:209-218 は、NSCLCにおいてCEA、CA 125、CYFRA 21-1、SSCおよびNSEの予後値を評価し、例えば、患者の全体生存を評価して、マーカーNSE、CEA、およびLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)の異常血清レベルが、短い生存を示すように思われた。

NNMTだけでもLC患者と健常対照との区別に有意に貢献するので、LCを患う患者の予後の評価を補助することが予測されなければならない。手術前のNNMTのレベルは、LCの1つ以上の他のマーカーおよび／またはTNM病期システムと組み合わせられる可能性が高い。好ましい態様において、NNMTが、LCを有する患者の予後に使用される。

化学療法のモニタリング：
Merle, P. et al., Int. J. of Biological Markers 19 (2004) 310-315は、誘導化学療法で治療され局所的に進行したNSCLCを有する患者においてCYFRA21-1血清レベル変動を評価した。彼らはCYFRA21-1血清レベルの早期モニタリングが段階III NSCLC患者の腫瘍応答および生存のための有用な予後ツールであり得ることを結論付けた。また、報告は、LCを有する患者の治療のモニタリングにCEAを使用することを記載している(Fukasawa, T. et al., Gan to Kagaku Ryoho. Cancer & Chemotherapy 13 (1986) 1862-1867 (日本語で記載); Zhang, H. et al., Shandong Yike Daxue Xuebao 39 (2001) 537-538, 541 (中国語で記載))。これらのほとんどは遡及的にランダム化されず、小数の患者を含んだ。CYFRA 21-1を用いた研究の場合のように、CEA研究は:a)化学療法を受けておりCEAレベルの減少を有する患者はCEAレベルを減少できなかった患者よりも良好な結果を一般的に有したこと、および(b)ほとんどの全ての患者について、CEAレベルの増大が疾患進行と関連したことを示唆した。

実施例部に示されるデータにより、NNMTがCYFRA 21-1またはCEAと同様に化学療法のモニタリングのための少なくとも良好なマーカーであることが予測されるはずである。従って、本発明はまた、化学療法中のLC患者のモニタリングにおけるNNMTの使用に関する。

追跡：
癌性組織の完全な除去を目的とした外科切除を受けるLC患者の大部分は、後に再発または転移疾患を発症する(Wagner, H., Chest 117 (2000) 110-116; Buccheri, G. et al., Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980)。これらのうちほとんどの再発は手術後の最初の2〜3年で生じる。再発／転移疾患は不変的に致命的であるために、かなりの研究が早期および潜在的に治療可能な段階でのLC同定に焦点を当てている。

その結果、多くのLC患者は、CEAを用いた標準モニタリングをしばしば含む手術後サーベイランスプログラムを受ける。手術1年後のCEAを用いる連続モニタリングによって、疑いのある症状または兆候の非存在下でも、およそ29％の感度、およそ97％の特異性で早期手術後再発／転移疾患を検出することが示された(Buccheri, G. et al., Ann. Thorac. Surg. 75 (2003) 973-980)。従って、手術後のLCを有する患者の追跡は、適切な生化学マーカーの使用の最も重要な分野の1つである。調査されたLC患者におけるNNMTの高い感度のために、NNMT単独または1つ以上の他のマーカーと組み合わせたNNMTがLC患者、特に手術後のLC患者の追跡に非常に役に立つことが予測される。LC患者の追跡においてNNMTおよびLCの1つ以上の他のマーカーを含むマーカーパネルの使用は、本発明のさらなる好ましい態様を表す。

好ましい態様において、本発明は、LCの診断分野またはLCの評価のそれぞれにおけるNNMTの使用に関する。

なおさらに好ましい態様において、本発明は、個体から得られた液体試料からの肺癌の評価において、肺癌の1つ以上のマーカー分子と組み合わせた肺癌の分子マーカーとしてのNNMTの使用に関する。

従って、本発明の好ましい態様は、個体から得られた液体試料からの肺癌の評価において、肺癌の1つ以上のマーカー分子と組み合わせた肺癌のマーカー分子としてのNNMTの使用である。NNMTの測定に組み合わされ得る好ましく選択される他のLCマーカーは、CYFRA 21-1、CEA、NSE、およびSCCである。なおさらに好ましくは、LCの評価に使用されるマーカーパネルは、NNMTおよびCYFRA21-1およびCEAからなる群より選択される少なくとも1つの他のマーカー分子を含む。

当業者には認識されるように、調査中の診断問題を改善するために2つ以上のマーカーの測定値を使用する多くの方法がある。全く単純であるが、しかしながらしばしば効果的なアプローチにおいて、陽性結果が、試料が調査される少なくとも１つのマーカーで陽性である場合に仮定される。これは、例えば、AIDSなどの感染疾患を診断する場合であり得る。

しかし、しばしば、マーカーの組み合わせが評価される。好ましくは、例えばCYFRAおよびCEAの、マーカーパネルのマーカーについて測定された値が数学的に組み合わされ、組み合わされた値が、基礎にある診断問題と関連付けられる。マーカー値は、当該技術分野の数学的方法の任意の適切な状態によって組み合わされ得る。マーカー組み合わせと疾患とを関連付けるための周知の数学的方法は、識別分析(DA)(即ち、線形-、四分-、正規-DA)、カーネル法(即ち、SVM)、ノンパラメトリック法(即ち、k-最近隣接分類)、PLS(部分最小二乗)、ツリーベース法(即ち論理回帰、CART、ランダムフォレスト法、ブースティング/バッギング法)、一般化線形モデル(即ち論理回帰)、主要成分ベース法(即ち SIMCA)、一般化付加モデル、ファジー論理ベース法、ニューラルネットワークおよび遺伝アルゴリズムベース法のような方法を使用する。当業者は、本発明のマーカー組み合わせを評価するための適切な方法を選択することに問題はない。好ましくは本発明のマーカー組み合わせと例えばLCの非存在または存在とを関連付けることに使用される方法は、DA(即ち線形-、四分-、正規識別分析)、カーネル法(即ち SVM)、ノンパラメトリック法(即ち k-最近隣接分類)、PLS(部分最小二乗)、ツリーベース法(即ち論理回帰、CART、ランダムフォレスト法、ブースティング法)、または一般化線形モデル(即ち論理回帰)から選択される。これらの統計法に関する詳細は以下の文献:Ruczinski, I. et al., J. of Computational and Graphical Statistics 12 (2003) 475-511; Friedman, J. H., J. of the American Statistical Association 84 (1989) 165-175; Hastie, T. et al., The Elements of Statistical Learning, Springer Series in Statistics (2001); Breiman, L. et al., Classification and Regression Trees, Wadsworth International Group, Belmont, California (1984); Breiman, L., Random Forests, Machine Learning, 45 (2001) 5-32; Pepe, M.S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28 (2003); およびDuda, R.O. et al., Pattern Classification, Wiley Interscience, 第2版 (2001)に見られる。

生物学的マーカーの基礎となる組み合わせのための最適多変量カットオフを使用することおよび状態Aと状態B、例えば疾患と健常を識別することは本発明の好ましい態様である。この種類の分析において、マーカーはもはや独立せずにマーカーパネルを形成する。NNMTの測定値とCYFRA21-1またはCEAそれぞれの測定値の組み合わせは健常対照と比べてLCの診断精度を有意に改善することを確立し得た。

診断方法の精度は、その受信者動作特性(ROC)によって最もよく示される(特にZweig, M.H.およびCampbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577を参照のこと)。ROCグラフは、観察されたデータの全範囲にわたって判定閾値を連続的に変えることにより得られる全ての感度／特異性の組のプロットである。

実験室試験の臨床的成績は、その診断の精度または被験体を臨床的に関連する亜群へと正確に分類する能力に依存している。診断の精度は、検査を受けた被験体の２つの異なる状態を正確に区別する試験の能力を評価するものである。かかる状態は、例えば健康と疾患または良性疾患対悪性疾患である。

各場合において、ROCプロットは、判定閾値の全範囲で１−特異性に対して感度をプロットすることにより２つの分布間の重複を示す。Y軸上は感度、または真陽性の割合［（真陽性試験結果の数）／（真陽性の数＋偽陰性試験結果の数）として定義される］である。これはまた、疾患または症状の存在下において陽性と称されている。それは罹患した亜群単独から算出される。X軸上は偽陽性の割合、すなわち１−特異性［（偽陽性結果の数）／（真陰性の数＋偽陽性結果の数）として定義される］である。これは特異性の指標であり、罹患していない亜群全体から算出される。真陽性および偽陽性の割合は、２つの異なる亜群由来の試験結果を用いて全く別々に算出されるため、ROCプロットは試料中の疾患の罹患率から独立している。ROCプロット上の各点は、特定の判定閾値に対応する感度／１−特異性の組を表している。完全な区別を伴う試験は（結果の２つの分布に重複がない）、左上の角を通るROCプロットを有し、この場合、真陽性の割合は1.0または100％（完全な感度）であり、偽陽性の割合は0（完全な特異性）である。区別を伴わない試験の理論的プロット（２つの群の結果の分布が同一）は、左下の角から右上の角に向かって４５度の斜め線となる。ほとんどのプロットはこれらの両極間に含まれる。（ROCプロットが４５度の斜め線の下方に完全に含まれる場合、これは「陽性度（positivity）」についての基準を「より大きい」から「より少ない」に入れ換えることにより容易に修正される。逆も同じ）。定性的には、プロットが左上の角に近づくにしたがって、試験の全体的な精度は高くなる。

実験室試験の診断の精度を定量化するためのある都合のよい最終目標は、単独の数によりその成績を表すことである。例えば、このような全体的パラメータは、いわゆる「総エラー」または代替的に「曲線下面積＝AUC」である。最も一般的な世界的尺度はROCプロットの下の面積である。慣例により、この面積は常に≧0.5である（もしそうでなければ、そうなるように決定基準を入れ換え得る）。数値は1.0（２群の試験値の完全な分離）と0.5（２群間の試験値に明らかな分布の差が無い）の間の範囲である。該面積は、該斜め線に最も近い点または90％特異性における感度などのプロットの特定の部分だけでなく、全プロットにも依存する。これは、ROCプロットが完全なもの（面積＝1.0）にどれだけ近いかということの定量的で説明的な表現である。

NNMTと、CYFRA 21-1もしくはCEAなどの他のマーカー、またはまだ見出されていないLCの他のマーカーの測定を組み合わせると、NNMTにより、それぞれ、LCの評価のさらなる改善がもたらされるか、またはもたらされるであろう。

２つのマーカーNNMTおよびCYFRA 21-1の組み合わせは、LCの診断の精度を有意に改善する。２つのマーカーNNMTおよびCEAの組み合わせもまた、LCの診断の精度を有意に改善する。

好ましい態様において、本発明は、試料中の少なくともNNMTおよびCYFRA 21-1、CEA、NSEまたはSCCのそれぞれの濃度を測定し、測定された濃度をLCの有無と相関させることにより、健常対照に対し、LCの診断の精度を改善するための方法であって、該改善により、調べた任意の単一のマーカー単独に基づく分類と比べると、健常対照に対し、より多くの患者がLCに苦しんでいると正確に分類される方法に関する。

本発明による好ましい方法において、少なくともバイオマーカーNNMTおよびCYFRA 21-1のそれぞれの濃度が測定され、該マーカー組み合わせがLCの評価に使用される。

本発明によるさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーNNMTおよびCEAのそれぞれの濃度が測定され、該マーカー組み合わせがLCの評価に使用される。

本発明によるまたさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーNNMT、CYFRA 21-1およびCEAのそれぞれの濃度が測定され、該マーカー組み合わせがLCの評価に使用される。

本発明によるまたさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーNNMT、CYFRA 21-1およびSCCのそれぞれの濃度が測定され、該マーカー組み合わせがLCの評価に使用される。

以下の実施例は、本発明の理解を補助するために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載する。本発明の精神から逸脱せずに、示される手順において変更がなされ得ることを理解されたい。

実施例1
肺癌マーカータンパク質NNMTに対する抗体の作製
免疫検出アッセイ、例えばウエスタンブロッティングおよびELISAによる、NNMTの血清中濃度および血漿中濃度ならびに血中濃度の測定における、抗体のさらなる使用のために、肺癌のマーカーのタンパク質NNMTに対するポリクローナル抗体を作製した。

大腸菌における組み換えタンパク質の発現
NNMTに対する抗体を産生させるために、免疫原を得るために、タンパク質の組み換え発現を行なった。RTS 100発現系および大腸菌での発現の組み合わせを適用することにより発現させた。最初の段階において、「ProteoExpert RTS E.coli HY」システムを用いて、該DNA配列を分析し、高収率のcDNAサイレント突然変異体、およびそれぞれのPCRプライマー配列についての推奨を得た。これは商用ウェブベースサービス（www.proteoexpert.com）である。推奨されるプライマー対を用い、cDNAから線状PCR鋳型を産生させるための、ならびにNNMTタンパク質をコードするヌクレオチド配列のインビトロの転写および発現のための、「RTS 100大腸菌線状鋳型産生セット、His標識（RTS 100 E. coli Linear Template Generation Set, His-tag）」（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号3186237）を用いた。ウエスタンブロット検出および後の精製のために、発現されるタンパク質はHis標識を含んだ。最もよく発現する変異体を同定した。PCRから発現および検出までのすべての工程は、製造業者の使用説明書に従って行なった。すべての必要なT7調節領域（プロモーター、リボソーム結合部位、およびT7ターミネーター）を含むそれぞれのPCR産物を、製造業者の使用説明書に従い、pBAD TOPO（登録商標）ベクター（Invitrogen, Karlsruhe, Germany, カタログ番号K 4300/01）の中にクローン化させた。T7調節配列を用いる発現のために、該構築物を大腸菌BL 21 (DE 3)に形質転換させ (Studier, F.W.,ら, Methods Enzymol. 185 (1990)60〜89)、形質転換された細菌をタンパク質発現のために1lのバッチで培養した。

His-NNMT融合タンパク質の精製を、Niキレートカラムで、標準的な手順に従って行なった。手短に言えば、His-NNMT融合タンパク質の発現ベクターを含有する1lの細菌培養物を遠心分離によりペレット状にした。pH 8.0のリン酸塩、7Mグアニジニウムクロリド（guanidium chloride）、イミダゾール、およびチオグリセロールを含有する溶菌緩衝液に、細胞ペレットを再懸濁させ、その後にUltra-Turrax（登録商標）を用いてホモジナイズした。不溶性物質を高速遠心分離によりペレット状にし、上澄みをNiキレートクロマトグラフ用カラムにかけた。数カラム床体積の溶菌緩衝液でカラムを洗浄し、その後pH 8.0のリン酸塩、および尿素を含有する緩衝液で洗浄した。最後に、酸性条件下でSDSを含有するリン酸塩緩衝液を用いて、結合抗体を溶出した。

ポリクローナル抗体の作製
a）免疫化
免疫化のために、タンパク質溶液の新鮮なエマルション（100μg/mlのタンパク質NNMT）および完全フロイントアジュバントを1：1の比で調製した。各ウサギを1日目、7日目、14日目、および30日目、60日目、ならびに90日目に1 mlのエマルションで免疫した。血液を取り、生じた抗NNMT血清を、実施例3および実施例4に記載したように、さらなる実験に用いた。

b）カプリル酸および硫酸アンモニウムを用いた連続的沈殿によるウサギ血清からのIgG（免疫グロブリンG）の精製
ウサギ血清1容積を酢酸塩緩衝液（60 mM、pH 4.0）4容積で希釈した。pHを2 M Tris塩基で4.5に調節した。カプリル酸（25μl/mlの希釈した試料）を激しい攪拌のもとで滴下した。30分後、試料を遠心分離し（13,000 x g、30分、4℃）、ペレットを捨て、上澄みを収集した。2 M Tris塩基を加えることにより上澄みのpHを7.5に調節し、濾過した（0.2μm）。

上澄みの中の免疫グロブリンを、激しい攪拌のもとで、4 M硫酸アンモニウム溶液を滴下して沈殿させ最終濃度を2 Mにした。沈殿した免疫グロブリンを遠心分離（8,000 x g、15分、4℃）により収集した。

上澄みを廃棄した。ペレットを10 mM NaH₂PO₄/NaOH、pH 7.5、30 mM NaClに溶解し、完全に透析した。透析物を遠心分離し（13,000 x g、15分、4℃）、濾過した（0.2μm）。

ポリクローナルウサギIgGのビオチン化
ポリクローナルウサギIgGを10 mMNaH₂PO₄/NaOH、pH 7.5、30 mM NaClで10 mg/mlにした。IgG溶液1 mlあたり50μlのビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミド（DMSO中の3.6 mg/ml）を加えた。室温で30分放置した後に、試料をSuperdex200でクロマトグラフィーによって分離した（10 mM NaH₂PO₄/NaOH、pH 7.5、30 mM NaCl）。ビオチン化IgGを含有する画分を収集した。モノクローナル抗体を、同じ手順によってビオチン化した。

ポリクローナルウサギIgGのジゴキシゲニン化（Digoxygenylation）
ポリクローナルウサギIgGを10 mMNaH₂PO₄/NaOH、30 mM NaCl、pH 7.5で10 mg/mlにした。IgG溶液1 mlあたり50μlのジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, カタログ番号1 333 054）（DMSO中3.8 mg/ml）を加えた。室温で30分放置した後に、試料をSuperdex（登録商標)200でクロマトグラフィーによって分離した（10 mM NaH₂PO₄/NaOH、pH 7.5、30 mM NaCl）。ジゴキシゲニン化IgGを含有する画分を収集した。モノクローナル抗体を、同じ手順によってジゴキシゲニンで標識した。

実施例2
ヒト血清および血漿試料中のNNMTの測定のためのELISA
ヒト血清および血漿中のNNMTの検出のために、サンドイッチ型ELISAを開発した。抗原の捕捉および検出のために、抗NNMTポリクローナル抗体のアリコート（実施例2参照）をビオチンおよびジゴキシゲニンとそれぞれ結合させた。

ストレプトアビジン被覆96ウェルマイクロタイタープレートを、10 mMリン酸塩、pH 7.4、1%BSA、0.9%NaCl、および0.1%Tween 20で10μg/mlにした、100μlのビオチン化抗NNMTポリクローナル抗体とともに、60分間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを0.9%NaCl、0.1%Tween 20で3回洗浄した。次いで、標準抗原としての組み換えタンパク質の連続希釈物（実施例2参照）、または患者から得られた希釈した血漿試料のいずれかとともに、ウェルを2時間インキュベートした。NNMTの結合の後、プレートを0.9%NaCl、0.1%Tween 20で3回洗浄した。結合したNNMTの特異的検出のために、10 mMリン酸塩、pH 7.4、1%BSA、0.9%NaCl、および0.1%Tween 20で10μg/mlにした、100μlのジゴキシゲニン化抗NNMTポリクローナル抗体とともにウェルを60分間インキュベートした。その後プレートを3回洗浄し、未結合抗体を除去した。次の工程において、10 mMリン酸塩、pH 7.4、1%BSA、0.9%NaCl、および0.1%Tween 20中の20 mU/mlの抗ジゴキシゲニン-POD結合体 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号1633716)とともにウェルを60分間インキュベートした。その後プレートを同じ緩衝液で3回洗浄した。抗原抗体複合体の検出のために、100μlのABTS溶液 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, カタログ番号11685767)とともにウェルをインキュベートし、30〜60分後ELISAリーダーを用いて405 nmでODを測定した。

実施例3
試験I：試験集団
第１の試験では、表1に示すUICC分類を有する56名の充分特徴付けされたLC患者由来の試料を使用した。このコホートの焦点はNSCLC (50の試料)に対するものとし、それは、この形態のLCがSC型よりも良好な予後を有し、したがってその早期検出が特に重要であるためである。

表1のLC試料は、任意の既知の悪性肺疾患(=対照コホート)のない121名の明らかに健常な個体から得られた対照試料との比較において評価した。

実施例4
試験I：単一マーカーの感度
各マーカーの感度を、試験した個々の各マーカーについて、一般的な特異性レベル95%で計算した。表2に最も有望なLCマーカーそれぞれの感度をパーセントで示す。

表2から容易に自明なように、マーカーNNMTは、LCに対し、調べたすべてのマーカーの中で、CYFRA21-1の次に2番目に高い感度を有することがわかった。マーカーCEAは有意に低い感度を有するようであり、NSEは、かなり性能が良好でないようである。

実施例5
試験I：マーカー組み合わせ
個体は、それぞれの組み合わせのマーカーの少なくとも１つが一定の閾値を超える場合、LCを有すると分類した。これらのカットオフ値は、例えば、対照コホートに対して95%特異性をもたらすように規定した。

表3は、健常対照に対し、LCを有すると診断された患者の分類結果を示す。

この分析でのマーカーNNMTおよびCyfra 21-1の組み合わせは、95%の特異性レベルで最も高い感度をもたらした。種々の他のマーカーをNNMTと組み合わせて評価した。表3に示されるように、NNMTと組み合わせたCEAもまた、感度の有意な改善をもたらす。

実施例6
試験II：試験集団
第１のものとは完全に独立した第２の試験は、NSCLCの主な型である腺癌および扁平上皮癌に焦点をあてた。表4aは、癌コホートの型および病期の分布を示す。

この試験における対照コホートは、表4bに示されるように、喫煙者および非喫煙者由来の試料を含むようにより詳しく規定した。肺機能試験(肺活量測定、Miller，M.R.，et al.，Eur. Respir. J. 26 (2005)319-338)を、各個体について行なった。肺機能試験でのドナーの結果が正常範囲内である場合のみ、試料が対照コホートに含まれた。

実施例7
試験II：単一マーカーの感度
各マーカーの感度を、前述のように表4bに示した試料に基づいて計算した。感度(パーセントで)を、試験した個々の各マーカーについて一般的な特異性レベル95%で示す。表5は、それぞれ腺癌および扁平上皮癌の感度、ならびに各マーカーの全体の感度を示す。

明らかに、この場合、２つの理由でNNMTはCyfra 21-1よりも優れている。第１に、NNMTの全体的な感度が有意に良好である。第２に、非常に重要でもあるが、Cyfra21-1は、扁平上皮癌よりも腺癌に関して低い効率を示しているが、NNMTは両方の型の癌に同様の性能を示す。

実施例8
試験II：マーカー組み合わせ
試験IIにおけるマーカー組み合わせの結果を表6に示す。組み合わせの型は、試験Iで上記のものと同じであった。

調べたマーカーの任意の２つを組み合わせると、マーカーを個々に用いた場合に得られる感度と比べて、マーカー組み合わせの感度の有意な改善がもたらされる(例示として、マーカー組番号7対番号1および番号2を参照)。第３のマーカーを加えることによりある程度の利益が得られる(組番号8対番号10参照)。しかしながら、４つすべてのマーカーの組み合わせ(組番号14)は、最良の３つの組(組番号10)より高い性能はもたらさない。

NNMTを含む２つおよび３つの組み合わせは、NNMTが任意の他のマーカーに置き換えられた対応のものよりも常に良好である。

まとめると、NNMT単独は、NSC肺癌の2つの主な型の検出において良好な感度を示す。NNMTとCyfra 21-1および／またはCEAのそれぞれの組み合わせを使用すると、非常に印象的な結果が得られる。３つのすべてのマーカーを含む組み合わせを使用すると、癌試料の93%および対照の95%が正確に分類される。

Claims

a) 試料中のニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼ(NNMT)のタンパク質濃度を測定する工程、および
b) 工程(a)で測定された濃度を肺癌の評価に使用する工程
を含み、
ここで、NNMTの増加が肺癌を示す、
肺癌のインビトロ評価のための方法。
工程a)が、試料中の１つ以上の他の肺癌マーカーのタンパク質濃度を測定する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
前記１つ以上の他のマーカーが、CYFRA21-1、CEA、NSEおよびSCCからなる群より選択される、請求項２記載の方法。
前記１つ以上の他のマーカーがCYFRA21-1である、請求項３記載の方法。
前記１つ以上の他のマーカーがCEAである、請求項３記載の方法。
前記１つ以上の他のマーカーがSCCである、請求項３記載の方法。
肺癌の評価におけるNNMTタンパク質濃度の使用であって、該NNMTタンパク質濃度は、請求項１記載の方法に従って使用される、使用。
肺癌の評価における、NNMTタンパク質濃度および１つ以上の他の肺癌マーカーを含むマーカーパネルの使用であって、該マーカーパネルは、請求項２記載の方法に従って使用される、使用。
１つ以上の他のマーカーが、CYFRA21-1、CEA、NSEおよびSCCからなる群より選択される、請求項８記載のマーカーパネルの使用。
マーカーパネルが少なくともNNMTおよびCYFRA21-1を含む、請求項９記載のマーカーパネルの使用。