CN101495870B - 作为肺癌标记物的nnmt的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肺癌的评价。其公开了蛋白质NNMT在肺癌评价中的应用。本发明也涉及用于通过体外检测源自患者的液体样品中的NNMT评价肺癌的方法。NNMT的检测可，如被用于肺癌患者的早期检测或随访。

Description

作为肺癌标记物的NNMT的应用
本发明涉及与肺有关的癌症或肺癌(＝LC)的评价并且尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)的评价的辅助方法。本文公开了作为LC，尤其是NSCLC的标记物的蛋白质烟酰胺N-甲基转移酶(＝NNMT)的用途。再有，本文特别涉及通过检测源自患者的液体样品中的NNMT评价肺癌的方法。NNMT的检测可例如用于肺癌的早期探测或用于经受手术的患者的监测。
尽管在探测和治疗方面取得进展，癌症仍然是主要的公共卫生挑战性问题。在多种类型的癌症中，LC是西方世界常常发生的癌症并且是癌症相关死亡率的最常死因一。这大部分是由于用于疾病的早期探测的诊断空白(diagnostic gap)。LC在其早期很大程度上是无症状的。所有肺癌中的大多数在晚期被探测到，此时该疾病已经变得不宜手术治愈。
大多数LC肿瘤可分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。SCLC占所有肺癌病例的约20-25％。SCLC是具侵袭性的神经内分泌型LC，并且即使被早期探测到预后也很差。SCLC是罕见的易于通过切除术根治的疾病。由于该疾病的发展迅速，通常仅用两期，即局限型(limited disease)和扩散型疾病(extensive disease)对SCLC进行分类，而不是更复杂的TNM分期系统(见下文)。约75-80％的LC病例被类分为包括鳞状细胞癌(癌＝CA)、腺-CA(包括腺泡CA、乳头状CA、支气管肿瘤、实体瘤和混合的亚型的亚类)和大细胞癌(包括巨大细胞肿瘤、清亮细胞CA、腺鳞状CA和未分化CA的亚类)的NSCLC类别中。
如果在晚期探测到NSCLC，预后也很差。癌症的分期是根据扩散、侵袭性和严重性对该疾病的分类。将癌症患者分组以便对预后和疗法的选择进行概括。
现今，TNM系统是最广泛应用的基于癌症的解剖学范畴的分类系统。其代表国际上可接受的、统一的分期系统。有三个基本变化：T(原发肿瘤的范围)、N(局部淋巴结的状况)和M(存在或缺乏远程转移)。TNM标准由UICC(国际抗癌联合会(International Union AgainstCancer))在：恶性肿瘤的TNM分类(TNM Classification of MalignantTumours)，第五版，Sobin，L.H.和Wittekind，Ch.(编辑)，Wiley-Liss(1997)，第1803-1804页)上公布。
原发性肿瘤的外科切除术是广泛可接受的用于早期NSCLC的治疗选择。随着NSCLC的进展，特别是从IIIa期(T3N1M0、T1N2M0、T2N2M0、T3N2M0)转变至IIIb期(T4N0M0、T4N1M0、T4N2M0)，内科医师的重要的应急办法显著下降。然而，如果在更早期(Ia-IIIa；优选最早至T3N1M0期)探测癌症，则五年生存率在35％和80％之间不等。在Ia期((T1N0M0)；肿瘤尺寸小，未转移)探测，明显具有五年生存率最高至80％的最好预后。
即使有的话，也几乎很少使用外科干预NSCLC的IIIb-IV期。IV期相应于远程转移，即疾病的蔓延远离肺和局部淋巴结。较晚期(III-IV)的五年生存率降至小于1％和15％之间。
特别重要的是，NSCLC的早期诊断使预后转变得更好。早在Ia(T1N0M0)、Ib(T2N0M0)、IIa(T1N1M0)、IIb，(T3N0M0)和IIIa(T3N1M0)期诊断的患者，如果治疗得当，诊断后具有最高至80％的5年生存机会。对于被诊断的患者而言，一旦已经存在远程转移，则不得不与小于1％的5年生存率作比较。
在本发明看来，LC的早期评价指在肿瘤T1N0M0期或T1-3N0-1M0期进行评价。
优选的是，在T1-3N0-1M0(＝T1-3N0-1M0)期评价LC。
大多数肺癌在它们变得有症状时被探测到。现行的探测方法包括胸部x-光透视、螺旋计算机X线断层摄影术、痰液细胞学检查和支气管镜检。然而，有关将这些方法用于群体筛查的适宜性存在争论。
许多用于肺癌的血清肿瘤标记物在临床应用。细胞角蛋白(Cytoceratin)19(CYFRA 21-1)的可溶性的30kDa片段、癌胚胎发生抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和鳞状细胞癌抗原(SCC)是最突出的LC标记物。然而，它们中没有一个满足筛查工具所需要的灵敏度和特异性的标准(Thomas，L.，Labor und Diagnose，TH BooksVerlagsgesellschaft，Frankfurt/Main，Germany(2000))。
为了具有临床用途，作为单一标记物的新的诊断标记物应该与本领域已知的其它标记物具有可比性或更好。或者，即使单独使用或者与一种或多种其它标记物组合，新的标记物分别应该导致诊断的灵敏度和/或特异性有所提高。试验的诊断灵敏度和/或特异性最好由将在以下详细描述的其受试者工作特征评价。
全血、血清或血浆是临床常规中最广泛使用的样品源。在可靠的癌症探测或提供早期预测信息中应该有所帮助的早期LC肿瘤标记物的鉴别，可导致产生在该疾病的诊断和处理中应该大有帮助的方法。因此，临床上存在急需的是改善LC的体外评价。特别重要的是改进LC的早期诊断，因为对于早期诊断的患者而言，其对于生存机会的要求比那些在疾病的进展阶段诊断的患者更高。
生化标记物在肺癌中的临床应用最近已有评述(Duffy，M.J.，Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.38(2001)225-262)。
CYFRA 21-1普遍被认为是目前已知最好的用于肺癌的肿瘤标记物。尽管不具器官特异性，其主要在肺组织中被发现。在对于其它良性肺部疾病的特异性为95％时，CYFRA 21-1对于肺癌的灵敏度经描述为46-61％。升高的CYFRA 21-1的血清水平也与显著的良性肝病、肾功能不全和侵袭性膀胱癌相关。CYFRA 21-1试验被推荐用于术后治疗监测。
CEA属于通常在胚胎发生过程中产生的癌胚抗原的组别。CEA不具器官特异性，其主要用于结肠直肠癌的监测。除了恶性肿瘤外，几种良性疾病，诸如硬化、支气管炎、胰腺炎和自身免疫疾病也与升高的CEA血清水平相关。在对于良性肺部疾病的特异性为95％时，其对于肺癌的灵敏度报告为29-44％。CEA的优选的应用是肺癌的治疗监测。
NSE是用于SCLC的肿瘤标记物。一般地，升高的NSE血清水平被发现与神经外胚层和神经内分泌肿瘤相关。升高的血清水平也在良性肺部疾病和脑部疾病，诸如脑膜炎或脑部其它炎症性疾病以及头部创伤的患者中发现。当对于SCLC的灵敏度为95％时，报告的特异性是60-87％，对于NSCLC，NSE试验的表现差(7-25％)。NSE被推荐用于SCLC的治疗监测。
最初在子宫颈鳞状细胞CA中鉴定SCC。对于LC而言SCC的灵敏度通常低(18-27％)。因此，SCC试验被认为不适宜筛查。然而，由于对于鳞状细胞CA有比较高的灵敏度，SCC的优选应用是治疗监测，尽管CYFRA 21-1通常表现更好。
至于标记物的分布和针对改善的肺癌诊断，公开了一种方法(Schneider，J.等，Int.J.Clin.Oncol.7(2002)145-151)，该方法采用基于模糊逻辑学的分类运算法则，将CYFRA 21-1、NSE和为一般的炎症标记物的C-反应性蛋白质(CRP)的血清水平合并。作者报告特异性为95％时的灵敏度为92％。
本发明的任务是研究生化标记物是否可被鉴别，可被用于评价LC。
令人惊奇的是，已经发现，使用标记物NNMT可至少部分地克服目前现有技术已知的标记物的某些问题。
本发明涉及用于体外评价肺癌的方法，该方法包括检测样品中的NNMT浓度，并且将该测定的浓度用在肺癌评价中。令人惊奇的是，可以确定的是，升高的样品中的NNMT水平，例如预示在患者中存在肺癌。
本发明也涉及通过生化标记物体外评价LC的方法，该方法包括检测样品中的NNMT和LC的一种或多种其它标记物的浓度，并且将该测定的浓度用在LC评价中。优选的是，LC的一种或多种其它标记物选自CYFRA 21-1、CEA、NSE和SCC。
在优选的实施方案中，本发明也涉及将包含至少NNMT和CYFRA 21-1的标记板(marker panel)用在LC的评价中。
本发明也涉及将包含至少NNMT和CEA的标记板用在LC的评价中。
本发明也涉及将包含至少NNMT和SCC的标记板用在LC的评价中。
在优选的实施方案中，本发明涉及用于体外评价肺癌的方法，该方法包括检测样品中的a)NNMT的浓度，b)任选一种或多种其它肺癌标记物的浓度，和c)将步骤(a)和任选的步骤(b)中测定的浓度用于肺癌的评价中。
NNMT(烟酰胺N-甲基转移酶，EC 2.1.1.1)催化烟酰胺和其它吡啶的N-甲基化。蛋白质NNMT(Swiss-PROT：P40261)的特征是在已给出的序列表中为SEQ ID NO：1。NNMT的表观分子量为29.6kDa和等电点为5.56。
NNMT活性对于许多药物和异种生物化合物的生物转化是重要的。已有报道，该蛋白质主要在肝中表达并且定位于细胞质中。NNMT自人肝的cDNA克隆并且含编码264-个氨基酸蛋白质的792-个核苷开放读码框，其经计算的分子量为29.6kDa(Aksoy，S.等，J.Biol.Chem.269(1994)14835-14840)。文献中有关该酶在人癌症中的潜在作用知之甚少。在一篇论文中，据报道，升高的肝NNMT酶活性作为小鼠中癌症恶病质的标记物(Okamura，A.等，Jpn.J.Cancer Res.89(1998)649-656)。在近期的报道中，NNMT基因响应射线的向下调节作用在在射线敏感细胞系中得到证实(Kassem，H.，等，Iht.J.Cancer 101(2002)454-460)。在US 2006/0024692中，发现NNMT m-RNA-水平在非小细胞肺癌细胞中比在非-癌症组织中低。WO 02/082076描述了NNMT蛋白质作为肾癌亚型的标记物。
如在本文中使用的，以下每一个术语均有与其所在下文段节相关联的含义。
本文中使用的冠词“一”和“一个”指一个或多于一个(即指至少一个)的文章的语法上的宾语。例如，“标记物”指一个标记物或多于一个标记物。
如在本文中使用的，术语“标记物”或“生化标记物”指将要在患者样品的分析中用作靶标的分子。这样的分子靶标的实例为蛋白质或多肽本身以及针对如存在于样品中的此类靶标的抗体。表达“一个或多个”指1至20个，优选1至10个，优选l至5个，更优选3或4个。
在本发明中用作标记物的蛋白质或多肽期望包括所述蛋白质的天然存在的变量以及所述蛋白质或所述变量的天然存在的片段或复合物，尤其分别是可免疫探测的片段或复合物。
如对于专业技术人员而言明白的是，本发明应该不被解释为限制SEQ ID NO：1的全长蛋白质NNMT的检测。在实施本发明时，NNMT的生理片段可也被检测到并且用作肺癌的标记物。可免疫探测的片段优选包含至少6、7、8、10、12、15或20个所述标记物多肽的邻近的氨基酸。本领域专业技术人员应该认识到，由细胞释放的或存在于细胞基质中的蛋白质可例如在炎症期间被破坏，并且可变得被降解或裂解为这样的片段。如专业技术人员应该认识的，NNMT或其片段也可作为复合物的部分存在。这样的复合物也可用作本发明意义上的标记物。另外，或作为选择，NNMT多肽可带有翻译后修饰，优选糖基化、酰基化和/或磷酸化作用，并且这样的经过修饰的NNMT也可作为LC的标记物。
术语“评价肺癌”用于指明，依据本发明的方法将(单独或与其它标记物或变量，如由UICC设立的标准(见上面)一起)如，辅助医师建立或确定LC的缺乏或存在或在预后中辅助医师，探测康复(手术后的患者随访)和/或治疗监测，尤其是化疗监测。
如在本文中使用的术语“样品”，指用于体外评价的目的而获得的生物样品。在本发明的方法中，样品或患者样品优选可包括任何体液。优选样品分别为全血、血清、血浆、支气管灌洗液或痰液，而血浆或血清最优选。
令人惊奇的是，本发明的发明人已经能够在源于LC的患者的具显著意义百分比的样品中探测标记物NNMT。甚至更令人惊奇的是，他们已经能够证实，在得自患者的这样的液体样品中NNMT的存在可用于肺癌评价中。
在优选的实施方案中，本发明涉及通过检测样品的NNMT浓度评价LC和使用测定的浓度评价LC的方法。
如专业的技术人员认识到的，任何这样的检测都在体外进行。过后丢弃患者样品。患者样品单独用于本发明的体外诊断方法并且患者样品的材料并不转移进入患者身体中去。作为特色地，样品为液体样品，如全血、血清或血浆。
如专业的技术人员从描述的实施例中认识到的，通过在免疫分析中检测已经鉴别NNMT为用于LC的诊断的标记物，可使用备选的途径实现与本发明的成就相比拟的结果。可通过任何适当的方法探测标记物蛋白质NNMT并将其用作LC的标记物。这样的优选的适当方法包括通过免疫分析程序探测NNMT、通过任何其它形式的结合试验、通过检测其酶的活性、通过液相色谱，尤其是高效液相色谱、通过电泳，尤其是与蛋白质印迹结合的SDS-PAGE以及通过质谱进行。
用于诊断的理想的方案应该是其中单个事件或过程应该引起各自的疾病的情形，如在感染性疾病中。在所有的其它病例中，正确的诊断可以是非常困难的，特别是当疾病的病因学没有完全被了解为LC的病例时。如专业的技术人员认识到的，没有生化标记物，例如在LC领域，对于给定的疾病被100％地特异性同时具100％的灵敏性地诊断。更合适地，生化标记物如，CYFRA 21-1、CEA、NSE、SCC或如在本文所显示的NNMT可用于用某些可能的和预兆性的值评价疾病的存在或缺乏。因此，在常规临床诊断中，通常多种临床症状和生物标记物在潜在的疾病的诊断、治疗和处理中被一同考虑。
生化标记物可或者被个别测定，或者在本发明的优选的实施方案中，它们可同时采用基于阵列技术的芯片或磁珠检测。然后或者使用对于每一标记物的个别的临界值(cut-off)对生物标记物的浓度进行独立解释，或者将它们合并用于解释。
在进一步的优选的实施方案中，在以下方法中实施依据本发明的LC的评价，所述方法包括检测样品中的a)NNMT的浓度，b)一种或多种其它肺癌标记物的浓度和c)将在步骤(a)和步骤(b)中测定的浓度用于肺癌评价中。如为专业技术人员明白的，可备选地自等份样品或自不同等份的样品实施NNMT的检测和一种或多种其它肺癌标记物的检测。
依据在实施例部分显示的数据，在实施的单因素分析和在多因素分析中的标记物NNMT，对于LC均具有(特异性为约95％)显著的差不多为50％的灵敏度，并且在这一方面发现是可比较的甚或在比较时高于所研究的其它LC标记物。在LC的评价中，标记物NNMT在以下一个或多个方面将是有优势的：筛查；诊断辅助；预后；治疗监测，诸如化疗、放疗法和免疫疗法的监测。
筛查：
筛查被定义为测试在没有由于LC的症状而就诊的人中的系统性应用以确定有罹患LC的足够的风险的个体，从进一步研究或直接的预防行动中得到益处。
如在实施例部分所给出的数据证实，NNMT单独将不足以例如对LC的风险人群的一般性筛查。最可能的是，在循环中没有单一的生化标记物将在任何时候符合为筛查的目的所需的灵敏度和特异性标准。宁愿不得不期望，在LC筛查中将不得不使用标记板。本发明中确定的数据指出，标记物NNMT将形成适宜筛查目的的标记板的整体部分。因此，本发明涉及作为用于LC筛查目的的LC标记板的一个标记物的NNMT的应用。NNMT的升高的水平指示LC的存在。本文数据还指出，标记物的某些组合在LC的筛查中将是有优势的。因此，本发明还涉及包含NNMT和CYFRA 21-1的标记板，或包含NNMT和CEA的标记板，或包含NNMT和NSE的标记板，或包含NNMT和SCC的标记板，或包含NNMT和两个选自CYFRA 21-1、CEA、NSE和SCC的标记物的标记板于LC筛查目的中的应用。
诊断辅助：
标记物可或者辅助特定器官的良性与恶性疾病的鉴别诊断，或者帮助区别肿瘤的不同组织类型。如由Molina，R.等，Tumor Biol.24(2003)209-218报告的，CEA、CA 125、CYFRA 21-1、SSC和NSE被用作血清标记物以辅助LC的组织学诊断。该研究的结果还指出，在所测试的标记物中，CYFRA 21-1是肺癌中最敏感的标记物，但与组织学无关。
依据本发明的资料，由于作为单一标记物的NNMT可优于其它LC标记物如CEA或NSE，必须期望NNMT将被用作诊断辅助，特别在通过建立手术前的基线值中。因而，本发明也涉及使用NNMT建立LC手术前的基线值。
预后：
预后指标可被定义为癌症患者及其肿瘤的预测疾病转归的临床、病理学或生化特征。它们的主要应用是帮助合理计划患者干预，即避免对具发展性疾病的治疗不足和对惰性不再发展的疾病的过度治疗。Molina R.等，Tumor Biol.(2003)24：209-218评价了CEA、CA 125、CYFRA 21-1、SSC和NSE在NSCLC中的预后值。如评价了患者的全部生存状况，籍此标记物NSE、CEA和LDH(乳酸脱氢酶)的异常的血清水平似乎表示生存期更短。
由于NNMT单用对区分LC患者与健康对照者已有显著贡献，必须期望它将在评价罹患LC的患者的预后中起辅助作用。手术前的NNMT水平最有可能与LC的一种或多种其它标记物和/或TNM分期系统联合使用。在优选的实施方案中，NNMT被用于LC患者的预后。
化疗监测：
Merle，P.等，Int.J.of Biological Markers 19(2004)310-315已经评价用诱导性化疗治疗的局部晚期NSCLC患者中的CYFRA 21-1血清水平变化。他们推断，CYFRA 21-1血清水平的早期监测可以是用于III期NSCLC患者中的肿瘤应答和生存的有用的预测工具。另外，报告描述了CEA在LC患者的治疗监测中的应用(Fukasawa，T.等，Gan toKagaku Ryoho.Cancer & Chemotherapy 13(1986)1862-1867(用日文写的)；Zhang，H.等，Shandong Yike Daxue Xuebao 39(2001)537-538，541(用中文写的))。这些中的大多数是回顾性的、非随机的和包括少数的患者。如在用CYFRA 21-1研究的病例中那样，CEA研究提示：a)具有CEA水平降低的患者，当其在接受化疗时，与那些CEA水平未能下降的患者相比，通常具有比较好的转归。和(b)对于几乎所有患者而言，CEA水平的升高与疾病的进展相关。
由于在实施例部分所显示的资料，必须期望NNMT应该至少为与CYFRA 21-1或CEA同样好的用于化疗监测的标记物。因此本发明也涉及NNMT在监测进行化疗的LC患者中的应用。
随访：
大部分的经历外科切除术的LC患者，其目标是完全去除癌症组织、后期发展的复发或转移性疾病(Wagner，H.，Chest 117(2000)110-116；Buccheri，G.等，Ann.Thorac.Surg.75(2003)973-980)。这些复发的大多数发生在手术后的最初2-3年内。因为复发/转移性疾病总是致命的，相当多的研究集中在早期并且由此潜在可治疗阶段的LC鉴别。
因此，许多LC患者经历手术后监测程序，其常常包括用CEA的常规监测。外科切除术后使用CEA的连续监测一年已经显示，用灵敏度约29％的方法探测早期手术后的复发/转移性疾病，其特异性为约97％，即使是在缺乏可疑的症状或体征的情况下(Buccheri，G.等，Ann.Thorac.Surg.75(2003)973-980)。因而，手术后对LC患者的随访是适宜的生化标记物应用中的一个最重要的领域。由于NNMT在被研究的LC患者中的高灵敏度，期望NNMT单独或与一种或多种其它标记物联合将在随访LC患者，尤其是手术后的LC患者中大有帮助。包含NNMT和LC的一种或多种其它标记物的标记板在随访LC患者中的应用代表本发明更优选的实施方案。
在优选的实施方案中本发明涉及NNMT分别在LC的诊断领域或在LC的评价中的应用。
还在更优选的实施方案中，本发明涉及NNMT作为用于肺癌的标记物分子在与用于肺癌的一种或多种标记物分子联合在从得自患者液体样品中评价肺癌中的应用。
因而，本发明优选的实施方案是NNMT作为用于肺癌的标记物分子在与用于肺癌的一种或多种标记物分子联合在从得自患者液体样品中评价肺癌中的应用。优选可与NNMT的检测组合的经选择的其它LC标记物是CYFRA 21-1、CEA、NSE和SCC。仍然更优选的是，用于LC的评价的标记板包含NNMT和至少一种选自CYFRA21-1和CEA的其它标记物分子。
如专业技术人员将会认识到的，有许多方法应用两个或更多个标记物的检测，以改善研究中的诊断问题。在十分简单，但虽然如此经常是有效的手段中，如果样品对于至少一个被研究的标记物是阳性的，则假定阳性结果。这可能是例如当诊断感染性疾病如AIDS时的情形。
然而，经常地，评价标记物的组合。优选地，对于标记板的标记物，如，对于CYFRA和CEA的检测值是算术上合并，并且该合并值与潜在的诊断问题相关。可通过本领域数学方法的任何适宜的规定合并标记物值。用于将标记物组合与疾病关联的熟悉的数学方法使用方法，如判别分析(DA)(即线性-、二次方程式-、调整的-DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数的方法(即k-最近邻域分类器(k-Nearest-Neighbor Classifiers))、PLS(偏最小二乘(Partial LeastSquares))、基于树状(tree-Based)的方法(即逻辑回归(Logic Regression)、CART、随机Forest方法、Boosting/Bagging方法)、广义线性模型(Generalized Linear Models)(即Logistic回归)、基于主要成分的(Principal Components based)方法(即SIMCA)、广义相加模型(Generalized Additive Models)、基于模糊逻辑的(Fuzzy Logic based)方法、基于神经网络和遗传算法的(Neural Networks and GeneticAlgorithms based)方法。专业技术人员在选择适宜的评价本发明标记物组合的方法时将不存在问题。优选地，使本发明的标记物组合，如，与缺乏或存在LC相关的所使用的方法选自DA(即线性-、二次方程式-、调整的判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数的方法(即k-最近邻域分类器)、PLS(偏最小二乘)、基于树状的方法(即逻辑回归、CART、随机Forest方法、助推法(Boosting)方法)或广义线性模型(即逻辑回归)。有关这些统计方法的详细资料在以下参考资料中发现：Ruczinski，I.等，计算和绘图统计学杂志(J.of Computational andGraphical Statistics)12(2003)475-511；Friedman，J.H.，美国统计学学会杂志(J.of the American Statistical Association)84(1989)165-175；Hastie，T.等，统计学知识原理(The Elements of Statistical Learning)，Springer统计学系列丛书(Springer Series in Statistics)(2001)；Breiman，L.等，分类和回归树(Classification and Regression Trees)，Wadsworth国际集团，贝尔蒙(Belmont)，加利福尼亚(1984)；Breiman，L.，随机Forests，机械学习(Random Forests，Machine Learning)，45(2001)5-32；Pepe，M.S.，用于分类和预测的医学试验的统计评估(The StatisticalEvaluation of Medical Tests for Classification and Prediction)，牛津统计科学系列丛书(Oxford Statistical Science Series)，28(2003)；和Duda，R.O.等，模式分类(Pattern Classification)，Wiley Interscience，第2版(2001)。
本发明的优选的实施方案是，使用对于潜在的生物标记物组合的最优化多变量的临界值并区别状态A与状态B，如，区别疾病与健康。在该类分析中，标记物不再独立存在而形成标记板。可确定的是，将NNMT的检测分别与CYFRA 21-1或CEA的检测联合，与健康对照者比较，显著改善对于LC的诊断的准确性。
诊断方法的准确性被其受试者工作特征(ROC)最优描述(特别参见Zweig，M.H.和Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC图是所有灵敏度/特异性对的绘图，所述灵敏度/特异性对是由对所观察数据的整个范围连续地改变其决定阈值所得到的。
实验室试验的临床表现取决于其诊断的准确性或将患者准确地类分为临床有关的亚组的能力。诊断的准确性检测试验的准确地区别被研究的患者的两种不同病症的能力。这样的情况是例如健康和疾病或良性对恶性疾病。
在各种情况下，ROC图通过以灵敏度对1-特异性作图描述两个分布之间的交迭，用于决定阈的全部范围。在y-轴上是灵敏度或真阳性部分[被定义为(真阳性试验结果的数量)/(真阳性的数量+假阴性试验结果的数量)]。此也被称为疾病或病症存在下的阳性。从受侵袭的亚组单独计算。在x-轴上是假阳性部分或1-特异性[被定义为(假阳性结果的数量)/(真阴性的数量+假阳性结果的数量)]。其为特异性的指数并且完全从未受侵袭亚组计算。因为真阳性和假阳性部分完全分开计算，通过使用来自两个不同亚组的试验结果，ROC图独立于样本中的疾病的发病率。ROC图上的每一点表示相应于具体决定阈的灵敏度/1-特异性对。具有完美区别的试验(在两个结果的分布中没有交迭)具有遍及左上角的ROC图，在那里真阳性部分是1.0或100％(准确的灵敏度)和假阳性部分是0(准确的特异性)。没有区别的试验的理论图(两组有同样的结果分布)是从左下角至右上角的45°斜线。大多数图落在此两极之间。(如果ROC图完全落在45°斜线之下，易于矫正，通过将用于“阳性”的标准倒转，从“大于”至“小于”或反之亦然)。在质量上，图越靠近左上角，试验的整体精确度越高。
定量实验室试验的诊断准确性的一个便利目标是，用单个数字表达其表现。这样的完全参数，如，是所谓的“总误差”或作为选择地“曲线下面积＝AUC”。最常见的全面测量是ROC图下的面积。按惯例，该面积总是≥0.5(如果不是，任何人可倒转此决定规则以使其符合)。值的范围在1.0(两个组的试验值全然分开)和0.5(两组试验值之间没有明显的分布差异)之间。面积不仅取决于图的具体部分，诸如最靠近斜线的点或在90％特异性时的灵敏度，但在全图上。此为定量的、描述性的表达，即该ROC图是最接近完美的一个(面积＝1.0)。
将NNMT的检测与其它标记物如CYFRA 21-1或CEA的检测联合，或与至今仍待发现的LC的其它标记物的检测联合，NNMT导致并且将会导致对LC的评价的进一步改善。
两个标记物NNMT和CYFRA 21-1的组合显著性地改善对LC的诊断的准确性。两个标记物NNMT和CEA的组合也显著性地改善对LC的诊断的准确性。
在优选的实施方案中，本发明涉及用于改善对LC相对于健康对照者的诊断准确性的方法，该方法通过检测样品中至少NNMT分别和CYFRA 21-1、CEA、NSE或SCC的浓度，和使测定的浓度与LC的存在或缺乏相关，与基于被单独研究的任何单个标记物的分类比较，该改善导致更多的患者被正确地类分为罹患LC与健康对照者。
在依据本发明的优选的方法中，分别测定至少生物标记物NNMT和CYFRA 21-1的浓度，以及该标记物组合用于LC的评价。
在依据本发明的更优选的方法中，分别测定至少生物标记物NNMT和CEA的浓度，以及该标记物组合用于LC的评价。
在依据本发明的又一个更优选的方法中，分别测定至少生物标记物NNMT、CYFRA 21-1和CEA的浓度，以及该标记物组合用于LC的评价。
在依据本发明的又一个更优选的方法中，分别测定至少生物标记物NNMT、CYFRA 21-1和SCC的浓度，以及该标记物组合用于LC的评价。
提供以下实施例以帮助理解本发明，在随附的权利要求书中列出其真实的范畴。应该理解，可在不背离本发明的精神下对列出的方法进行修饰。
实施例1
对肺癌标记物蛋白质NNMT的抗体的产生
为了通过免疫探测分析，如蛋白质印迹和ELISA，进一步将抗体应用在血清和血浆以及血液水平的NNMT的检测中，产生对肺癌标记物蛋白质NNMT的多克隆抗体。
在大肠杆菌(E.coli)中表达重组蛋白质
为了产生对NNMT的抗体，实施蛋白质的重组表达获得免疫原。应用RTS 100表达系统和在E.coli中表达的组合进行表达。在第一步中，使用“ProteoExpert RTS E.coli HY”系统分析DNA序列和得到推荐高产率的cDNA沉默突变变量以及各自的PCR-引物序列。此为基于网络的商业服务(www.proteoexpert.com)。使用推荐的引物对，“RTS100 E.coli线性模板发生装置(Linear Template Generation Set，His-tag)”(Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德国，目录号3186237)系统，自cDNA产生线性PCR模板并且为了核苷的体外转录和表达，使用编码NNMT蛋白质的序列。对于蛋白质印迹(Western blot)探测和随后的纯化，表达的蛋白质含有His-标记物(His-tag)。确定最佳表达变量。依据制造商的说明书实施从PCR至表达和探测的所有步骤。依据制造商的说明书，将各自的包含所有必需的T7调节区域的PCR产物(启动子、核醣体的结合位点和T7终止子)克隆进pBAD
Figure G2007800285540D00151
载体(Invitrogen，卡尔斯鲁厄，德国，目录号K 4300/01)。为了表达，使用T7调节序列，将构造物转化为E.coli BL 21(DE 3)(Studier，F.W.等，Methods Enzymol.185(1990)60-89并将转化的细菌在11批次中培养用于蛋白质表达。
按照标准程序在镍-螯合物柱上纯化His-NNMT融合蛋白。简要地说，经离心使含有表达用于His-NNMT融合蛋白的载体的11细菌培养液沉淀。将细胞沉淀再悬浮于含磷酸盐(pH8.0)、7M氯化胍鎓、咪唑和巯基丙三醇的细胞裂解缓冲液中，随后使用Ultra-
Figure G2007800285540D00161
匀浆。通过高速离心使不可溶性物质沉淀并将上清液施用于镍-螯合物层析柱上。用几个床体积的细胞裂解缓冲液，随后用含磷酸盐(pH8.0)和尿素的缓冲液洗涤柱。最后，用含SDS的磷酸盐缓冲液在酸性条件下洗脱结合的抗原。
多克隆抗体的产生
a)免疫
为了免疫，制备1∶1比例的蛋白质溶液(100μg/ml蛋白质NNMT)的新鲜乳液和完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant)。用1ml乳液在第1、7、14和30、60和90天免疫每一只兔。抽取血液和将得到的抗-NNMT血清用于在实施例3和4中描述的下一步实验中。
b)通过用己酸和硫酸铵连续沉淀从兔血清纯化IgG(免疫球蛋白G)
用4体积的乙酸盐缓冲液(60mM，pH4.0)稀释1体积的兔血清。用2M Tris-碱调节pH至4.5。于剧烈搅拌下逐滴加入辛酸(25μl/ml的稀释样品)。30min后将样品离心(13000xg，30min，4℃)，弃去沉淀物和收集上清液。通过加2M Tris-碱调节上清液的pH至7.5并且过滤(0.2μm)。
通过于剧烈搅拌下逐滴加入4M硫酸铵溶液至终浓度为2M，使上清液中的免疫球蛋白沉淀。通过离心(8000xg，15min，4℃)收集沉淀的免疫球蛋白。
弃去上清液。将沉淀物溶解于10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl中并彻底透析。将透析液离心(13000xg，15min，4℃)并过滤(0.2μm)。
多克隆兔IgG的生物素化
将多克隆兔IgG溶于10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl中制成10mg/ml。向每ml IgG溶液中加入50μl生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(3.6mg/ml于DMSO中)。室温下30min后，样品于Superdex 200上经层析(10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl)。收集含生物素化的IgG部分。依据同样的规程使单克隆抗体生物素化。
多克隆兔IgG的地高辛配基化(digoxygenylation)
将多克隆兔IgG溶于10mM NaH2PO4/NaOH、30mM NaCl，pH7.5中制成10mg/ml。向每ml IgG溶液中加入50μl地高辛配基-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche Diagnostics，曼海姆，德国，目录号1 333 054)(3.8mg/ml于DMSO中)。室温下30min后，样品于
Figure G2007800285540D00171
200上经层析(10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl)。收集含地高辛配基化的IgG部分。依据同样的规程使单克隆抗体标记地高辛配基。
实施例2
用于人血清和血浆样品中NNMT的检测的ELISA。
为了探测人血清或血浆中的NNMT，开发了夹心ELISA。为了捕获和探测抗原，将抗-NNMT多克隆抗体(见实施例2)的等分试样分别与生物素和地高辛配基轭合。
将链亲合素包被的96-孔微滴定板，用在10mM磷酸盐，pH7.4，1％BSA、0.9％NaCl和0.1％土温20中，10μg/ml下的100μl生物素化的抗-NNMT多克隆抗体孵育60min。孵育后，用0.9％NaCl、0.1％土温20洗涤板三次。然后用或者作为标准抗原的系列稀释的重组蛋白质(见实施例2)或者得自患者的修饰的血浆样品孵育孔2h。结合NNMT后，用0.9％NaCl、0.1％土温20洗涤板三次。为了特异性地探测结合的NNMT，用在10mM磷酸盐，pH7.4，1％BSA、0.9％NaCl和0.1％土温20中，10μg/ml下的100μl的地高辛配基化的抗-NNMT多克隆抗体孵育孔60min。此后，洗涤板三次去除未结合的抗体。在下一步中，用在10mM磷酸盐，pH7.4，1％BSA、0.9％NaCl和0.1％土温20中，20mU/ml的抗-地高辛配基-POD共轭体(Roche DiagnosticsGmbH，曼海姆，德国，目录号1633716)孵育孔60min。随后用同样的缓冲液洗涤板三次。为了探测抗原-抗体复合物，用100μl ABTS溶液(Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德国，目录号11685767)孵育孔，并于30-60min后用ELISA读板器在405nm处检测OD。
实施例3
研究I：研究人群
在第一项研究中，采用源自示于表1的按照UICC分类法的56个经充分特征鉴定的LC患者的样本。这组患者集中在NSCLC(50个样本)，因为该型的LC具有比SC型好的预后，并且因而其早期探测特别重要。
表1
研究I：LC样本和相应的UICC分类
依据UICC的分期     样本的数量
UICCI     7
UICCII     17
UICCIII     14
UICCIV     14
没有分期     4
LC样本的总数量     56
其中NSCLC样本的数量     50
其中SCLC样本的数量     6
对比从121个没有任何已知恶性肺病的明显健康的个体(＝对照组)中获得的对照样本，评价表1的LC样本。
实施例4
研究I：单一标记物的灵敏度
在对于待测的每一单个标记物，在共同的95％的特异性水平上，计算每一标记物的灵敏度。表2以百分比给出每一个最有前途的LC标记物的灵敏度。
表2
研究I：单一标记物的灵敏度
标记物 NNMT CEA NSE  CYFRA21-1
    于95％特异性的灵敏度(％) 50.0   42.9   12.5  69.6
如易于从表2中明白的，已经发现标记物NNMT对于LC具有第二高的灵敏度，在所有被研究的标记物中仅次于CYFRA 21-1。标记物CEA似乎具有显著比较低的灵敏度，而NSE似乎表现相当差。
实施例5
研究I：标记物组合
如果各自的组合的标记物中至少一个超过某一阈值，则将该个体分类为患有LC。这些临界值被定义为，诸如在对照组上得到95％的特异性。
表3表示相对于健康对照者，诊断为LC患者的分类结果。
表3
研究I：相对健康对照者，诊断为LC的一批患者的分类结果
  标记物数   标记物或标记板   临界值   灵敏度(％)
  1   Cyfra 21-1   1.7ng/ml   69.6
  1   NNMT   884pg/ml   50.0
  1   CEA   5.5ng/ml   42.9
  1   NSE   17.7ng/ml   12.5
2   Cyfra 21-1，CEA   1.9ng/ml5.8ng/ml   73.0
2   Cyfra 21-1NNMT   1.9ng/ml970pg/ml   77.0
2   NNMT，CEA   1100pg/ml6ng/ml   66.0
2   NNMTNSE   884pg/ml26ng/ml   50.0
3   NNMTCyfra 21-1CEA   970pg/ml1.9ng/ml6ng/ml   77.0
标记物NNMT和Cyfra 21-1的组合在该分析中得到在95％特异性水平时最高的灵敏度。评价与NNMT组合的多种其它标记物。如在表3中所示的，与NNMT组合的CEA也导致在灵敏度上的显著改善。
实施例6
研究II：研究人群
第二项研究总体而言独立于第一项研究，集中在主要类型的NSCLC，腺癌和鳞状细胞癌。表4a描述癌症组的类型和分期分布。
表4a
研究II：LC样本的类型和分期
Figure G2007800285540D00211
如在表4b所描述的，在该项研究中的对照组被定义为对吸烟者和非吸烟者的某些样本更具特异性。对每个患者实施肺功能试验(肺活量测定法，Miller，M.R.，等，Eur.Respir.J.26(2005)319-338)。只有如果供体的肺功能试验的结果在正常范围内，样本才被纳入对照组中。
表4b
研究II：对照组的组成
依据UICC的分期     样本数
吸烟者     30
已戒烟者     6
非吸烟者     24
实施例7
研究II：单一标记物的灵敏度
如前基于表4b中描述的样本，计算每一标记物的灵敏度。在对于每一个体受试标记物的共同的95％特异性水平上，得出灵敏度(以百分比表示)。表5分别描述腺癌和鳞状细胞癌的灵敏度，以及每一标记物的总的灵敏度。
表5
研究II：单一标记物于95％特异性时的灵敏度(％)
标记物 NNMT CEA NSE     CYFRA21-1
    腺癌     80     43     37     63
    鳞状细胞癌     87     17     30     80
    全部肺癌     83     30     33     72
清楚地，在这种情况下，NNMT有两个理由优于Cyfra 21-1：首先NNMT的总灵敏度显著更好。第二也是非常重要的，Cyfra 21-1适应腺癌的功效比鳞状细胞癌低，而NNMT对此两种类型癌症的表现相似。
实施例8
研究II：标记物组合
研究II中标记物组合的结果示于表6中。组合的类型与在上文研究I中描述的相同。
表6
研究II：标记物组合在肺癌的两个主要亚型上的表现。在95％特异性时给出的灵敏度
Figure G2007800285540D00231
Figure G2007800285540D00241
与单用标记物时得到的灵敏度相比，将任何两个受试标记物组合导致标记物组合的灵敏度的显著改善(为了阐明，见标记物组号#7对#1和#2)。通过加入第三个标记物得到某些利益(参考，组号#8对#10)。然而，所有四个标记物的组合(组号#14)得到不比最好的三重组合(组号#10)更高的灵敏度表现。
包含NNMT的二重组合和三重组合总是比相应的由任何其它标记物替代NNMT的标记物好。
概要地说，证实NNMT单用在探测两个主要类型的NSC肺癌中具有好的灵敏度。使用NNMT分别与Cyfra 21-1和/或CEA组合得到给人非常深刻印象的结果。使用包含所有三个标记物的组合，将93％的癌症样本和95％的对照样本正确分类。

Claims (9)

1.烟酰胺N-甲基转移酶(NNMT)的抗体在制备在用于体外评价肺癌的方法中使用的试剂盒中的应用，该方法包括检测样品中的
a)烟酰胺N-甲基转移酶(NNMT)的蛋白浓度，
b)任选一种或多种其它肺癌标记物的蛋白浓度，和
c)将在步骤(a)和任选的步骤(b)中测定的浓度用在肺癌的评价中，其中NNMT的增加为肺癌的指征。
2.依据权利要求1的应用，其中所述一种或多种其它标记物选自CYFRA21-1、CEA、NSE和SCC。
3.依据权利要求2的应用，其中所述标记物是CYFRA21-1。
4.依据权利要求2的应用，其中所述标记物是CEA。
5.依据权利要求2的应用，其中所述标记物是SCC。
6.NNMT的抗体在制备用于肺癌的评价的试剂盒中的应用。
7.包括NNMT和一种或多种适于肺癌的其它标记物的标记板在制备用于肺癌的评价的试剂盒中的应用。
8.依据权利要求7的应用，其中所述一种或多种其它标记物选自CYFRA21-1、CEA、NSE和SCC。
9.依据权利要求8的应用，其中所述标记板至少包含NNMT和CYFRA21-1。
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