JP6099109B2 - 新規肺癌マーカー（ｌｉｐｈ） - Google Patents
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Description
本願発明は、癌の診断を補助する臨床検査薬の技術分野に関する。更に、本願発明は、癌マーカー、特に肺癌検出用の肺癌マーカー、及び食道癌検出用の食道癌マーカーに関する。
人口の高齢化などにより、癌が増加しており、２０１２年に世界では癌患者は３２００万に達し、１年で１４２０万人が新たに癌であると診断されたといわれている。我が国においても癌は、年間３４万人が死亡する、死因第１位の疾患である。癌は、早期発見すれば、治療も可能な病気となってきており、癌の早期発見が重要となっている。癌の早期発見には、内視鏡検査や、ＰＥＴ、ＣＴ等の開発もされているが、大量の被験者を効率的に検査するには、癌マーカーの開発が欠かせなくなっている。
すでに、種々の癌マーカーが開発されているが、肺癌及び食道癌では、更なる癌マーカーの開発が望まれている。
肺癌は早期発見が困難でその５年生存率は２０％に満たない予後不良な疾患の一つである。しかし、Ｓｔａｇｅ ＩＡ、ＩＢの早期肺癌に限ればその５年生存率は７０％程度と大幅に上昇する。肺癌の種類（組織型）は病理学的にはその形態から小細胞性肺癌及び非小細胞性肺癌に分類され、後者はさらに扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌に分類されている。肺癌マーカーとして現在良く使用されているものには、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＥＡ、ＳＬＸ、ＳＣＣ、ＰｒｏＧＲＰ、ＮＳＥなどがある。ＣＥＡはもっとも一般的な腫瘍マーカーであり、ＳＬＸは腺癌に特異性が高い。ＣＹＦＲＡ２１−１やＳＣＣは扁平上皮癌に特異性が高いとされ、ＰｒｏＧＲＰやＮＳＥは小細胞癌に特異性が高いといわれている。
また、例えば、特許文献１には、従来からのＣＹＦＲＡ ２１−１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＳＣＣ等のマーカーと組み合わせてＮＮＭＴを用いると感度が向上することを報告している。非特許文献１には、糖鎖を利用した肺癌マーカーが報告されている。
また、食道癌は、消化器での一番の致死性の悪性腫瘍の一つであり、検査で食道癌が発見されたときには、すでに病状が相当に進行していることが多い。ステージ１で根治的治療をしても５年後生存率は、依然、４０−６０％と低いのが現状である。しかしながら、食道癌マーカーについては、診断、治療効果判定、予後評価のいずれかにでも有用であるものは残念ながら少ない現状である。扁平上皮癌では、ＳＣＣとＣＥＡが、腺癌ではＣＥＡが使われ、他に食道癌マーカーとしてはｐ５３抗体、及びＣＹＦＲＡ２１−１がある。
なお、肺癌、食道癌のバイオマーカーとして、Ｏｐａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ５が報告されている（非特許文献２）。
すでに、種々の癌マーカーが開発されているが、肺癌及び食道癌では、更なる癌マーカーの開発が望まれている。
肺癌は早期発見が困難でその５年生存率は２０％に満たない予後不良な疾患の一つである。しかし、Ｓｔａｇｅ ＩＡ、ＩＢの早期肺癌に限ればその５年生存率は７０％程度と大幅に上昇する。肺癌の種類（組織型）は病理学的にはその形態から小細胞性肺癌及び非小細胞性肺癌に分類され、後者はさらに扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌に分類されている。肺癌マーカーとして現在良く使用されているものには、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＣＥＡ、ＳＬＸ、ＳＣＣ、ＰｒｏＧＲＰ、ＮＳＥなどがある。ＣＥＡはもっとも一般的な腫瘍マーカーであり、ＳＬＸは腺癌に特異性が高い。ＣＹＦＲＡ２１−１やＳＣＣは扁平上皮癌に特異性が高いとされ、ＰｒｏＧＲＰやＮＳＥは小細胞癌に特異性が高いといわれている。
また、例えば、特許文献１には、従来からのＣＹＦＲＡ ２１−１、ＣＥＡ、ＮＳＥ、ＳＣＣ等のマーカーと組み合わせてＮＮＭＴを用いると感度が向上することを報告している。非特許文献１には、糖鎖を利用した肺癌マーカーが報告されている。
また、食道癌は、消化器での一番の致死性の悪性腫瘍の一つであり、検査で食道癌が発見されたときには、すでに病状が相当に進行していることが多い。ステージ１で根治的治療をしても５年後生存率は、依然、４０−６０％と低いのが現状である。しかしながら、食道癌マーカーについては、診断、治療効果判定、予後評価のいずれかにでも有用であるものは残念ながら少ない現状である。扁平上皮癌では、ＳＣＣとＣＥＡが、腺癌ではＣＥＡが使われ、他に食道癌マーカーとしてはｐ５３抗体、及びＣＹＦＲＡ２１−１がある。
なお、肺癌、食道癌のバイオマーカーとして、Ｏｐａ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ５が報告されている（非特許文献２）。
実験医学増刊 Ｖｏｌ．２５ Ｎｏ．１７ 「肺癌における糖鎖標的腫瘍マーカーの探索」植田幸嗣，醍醐 弥太郎，中村祐輔
Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ １０３：５７７−５８６，２０１２
ＣＥＡ等、臨床で使用されている癌マーカーは検出率が依然低く、例えば、早期肺癌の検出率は３０％程度であり、より高感度な新規マーカーが望まれている。そこで本願発明は、新規な癌マーカーを提供することを第１の課題とする。また、本願発明は、検出効率が高い癌マーカーを提供することを第２の課題とする。更に、本願発明は、新規な肺癌マーカーを提供することを第３の課題とする。また、本願発明は、検出効率が高い肺癌マーカーを提供することを第４の課題とする。また、本願発明は、肺癌の種類（組織型）を特定することができる肺癌マーカーを提供することを第５の課題とする。その上、他の肺癌マーカーと組み合わせることにより、検出効率及び／又は検出特異性を向上させることができる肺癌マーカーを提供することを第６の課題とする。
更に、本願発明は、新規な食道癌マーカーを提供することを第７の課題とする。また、本願発明は、検出効率が高い食道癌マーカーを提供することを第８の課題とする。その上、他の食道癌マーカーと組み合わせることにより、検出効率及び／又は検出特異性を向上させることができる食道癌マーカーを提供することを第９の課題とする。
本願発明者らは、ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ Ｈ）は複数の肺腺癌由来細胞株で正常肺由来上皮細胞と比較して発現が亢進し、肺癌及び食道癌において高発現している可能性が高いことを見出し、本願発明を完成させた。
さらに本願発明者らは、肺癌組織マイクロアレイを用いた免疫組織染色の結果、ＬＩＰＨは肺腫瘍組織で染色が見られたが間質組織では染色が見られず、臨床サンプルのタンパク質レベルにおいても肺腫瘍組織での発現が亢進することを明らかにした。ＬＩＰＨタンパク質の発現を肺癌の組織型別に見てみると、肺腺癌で７０％、細気管支肺胞上皮癌で７０％と高い陽性率を示した一方で、肺扁平上皮癌で３０％、大細胞癌で２０％とやや低く、小細胞癌では１０検体中１検体のみでその発現が確認され、ＬＩＰＨタンパク質が肺腺癌に特異的に発現するタンパク質であることを見出した。これらの知見に基づき、本願発明者らは、肺癌の組織型を特定するマーカーを提供する。
本願発明は、新規な、高い信頼性の肺癌マーカーを提供するという優れたものである。特にＬＩＰＨは、肺腺癌を特異的に検出できる点で優れたマーカーである。
また本願発明者らは、食道癌の組織マイクロアレイを用いた免疫組織染色の結果、ＬＩＰＨは食道癌組織で染色が見られたが間質組織では染色が見られなかった。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１３−１３６８２０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
更に、本願発明は、新規な食道癌マーカーを提供することを第７の課題とする。また、本願発明は、検出効率が高い食道癌マーカーを提供することを第８の課題とする。その上、他の食道癌マーカーと組み合わせることにより、検出効率及び／又は検出特異性を向上させることができる食道癌マーカーを提供することを第９の課題とする。
本願発明者らは、ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ Ｈ）は複数の肺腺癌由来細胞株で正常肺由来上皮細胞と比較して発現が亢進し、肺癌及び食道癌において高発現している可能性が高いことを見出し、本願発明を完成させた。
さらに本願発明者らは、肺癌組織マイクロアレイを用いた免疫組織染色の結果、ＬＩＰＨは肺腫瘍組織で染色が見られたが間質組織では染色が見られず、臨床サンプルのタンパク質レベルにおいても肺腫瘍組織での発現が亢進することを明らかにした。ＬＩＰＨタンパク質の発現を肺癌の組織型別に見てみると、肺腺癌で７０％、細気管支肺胞上皮癌で７０％と高い陽性率を示した一方で、肺扁平上皮癌で３０％、大細胞癌で２０％とやや低く、小細胞癌では１０検体中１検体のみでその発現が確認され、ＬＩＰＨタンパク質が肺腺癌に特異的に発現するタンパク質であることを見出した。これらの知見に基づき、本願発明者らは、肺癌の組織型を特定するマーカーを提供する。
本願発明は、新規な、高い信頼性の肺癌マーカーを提供するという優れたものである。特にＬＩＰＨは、肺腺癌を特異的に検出できる点で優れたマーカーである。
また本願発明者らは、食道癌の組織マイクロアレイを用いた免疫組織染色の結果、ＬＩＰＨは食道癌組織で染色が見られたが間質組織では染色が見られなかった。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１３−１３６８２０号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
図１は、肺癌マーカーの肺癌細胞株における発現を示す。
図２は、肺癌マーカーＬＩＰＨの肺癌組織における発現を示す。
図３は、ＬＩＰＨの発現を肺癌組織型別に観察した結果を示す。
図４は、健常人とがん患者におけるＬＩＰＨの血清中の検出量を示す。
図５は、ＣＥＡとの相関プロットを示す。
図６は、ＬＩＰＨの発現を食道癌組織型別に観察した結果を示す。
図２は、肺癌マーカーＬＩＰＨの肺癌組織における発現を示す。
図３は、ＬＩＰＨの発現を肺癌組織型別に観察した結果を示す。
図４は、健常人とがん患者におけるＬＩＰＨの血清中の検出量を示す。
図５は、ＣＥＡとの相関プロットを示す。
図６は、ＬＩＰＨの発現を食道癌組織型別に観察した結果を示す。
１．はじめに
本願発明者らは、癌マーカーを開発するために、肺癌で発現が有意に高いと予想される候補遺伝子をまず選抜した。その候補遺伝子の中から、複数の肺癌由来細胞株で正常肺由来上皮細胞と比較して発現量が高いものを更に選抜し、癌マーカーを完成させた。
２．癌マーカー遺伝子、肺癌マーカー遺伝子、食道癌マーカー遺伝子
本願発明者らは、癌マーカーとして、ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ Ｈ）遺伝子を同定した。
さらに、本願発明者らは、ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ Ｈ）遺伝子を肺癌マーカー及び食道癌マーカーとして同定した。
以下の実施例に示されるとおり、上記遺伝子は、複数の種類の肺癌由来細胞株で、正常肺由来細胞と比較して発現が亢進していたことが確認されている。さらに、免疫染色により、肺癌組織及び食道癌組織から上記遺伝子産物であるＬＩＰＨが検出されている。また、本マーカーは、肺癌及び食道癌への特異性に加え、肺癌切除後の予後との相関性が高く、肺癌の予後予測に使える可能性が非常に高いマーカーである。
３．癌マーカー遺伝子、肺癌マーカー遺伝子，及び／又は食道癌マーカー遺伝子の発現の確認
遺伝子発現の確認には、当該遺伝子のｍＲＮＡ又は当該遺伝子がコードする蛋白質を検出する周知の方法を用いることができる。ｍＲＮＡの存在を確認する方法としては、例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法、マイクロアレイ法などを用いることができる。蛋白質の確認方法としては、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法などの抗体を用いる方法などを用いることができる。
４．癌マーカーを用いた、癌細胞の存在を確認する方法及び癌診断を補助する方法、肺癌マーカーを用いた、肺癌細胞の存在を確認する方法及び肺癌診断を補助する方法、食道癌マーカーを用いた、食道癌細胞の存在を確認する方法及び食道癌診断を補助する方法
４−１．サンプル
癌細胞、肺癌細胞又は食道癌細胞の存在を確認する方法に使用するためのサンプル（試料）としては、任意の試料を用いることができるが、好適には被験者からの採取物、具体的には、任意の採取された体液、生検された試料を挙げることができる。特に好適には、被験者の肺疾患部又は食道疾患部の生検試料または喀痰試料を挙げることができる。
４−２．サンプル中のｍＲＮＡの検出法並びにそのための試薬及びキット
例えば、生検試料は、細胞を、例えば、界面活性剤、ホモジナイザー、又はフリーズソーイングなどの定法により、破砕し、全ＲＮＡを抽出することができる。目的のｍＲＮＡの定量には、ＬＡＭＰ法、ディファレンシャルディスプレイ法やＤＮＡアレイ（ＤＮＡチップ）を用いる方法、定量ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、コンペティティブＰＣＲ法を利用することができる。
例えば、リアルタイムＰＣＲ法では、マーカー遺伝子の増幅産物の生成をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法があげられる。前記リアルタイムモニタリング試薬としては、例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｉ、ＴａｑＭａｎプローブ等が挙げられる。
また、コンペティティブＰＣＲ法としては、例えば、細胞内の全ＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、当該ｃＤＮＡ及びＤＮＡコンペティターを同一チューブ内で反応させる方法や、さらに前記逆転写反応時にｍＲＮＡとともにＲＮＡコンペティターを加えて反応させる方法等があげられる。またコンペティターのプライマー配列以外の内部配列としては、例えば、増幅目的ｍＲＮＡの配列と相同配列でもよく、非相同な配列でもよい。
また、リアルタイムＰＣＲ法を利用する場合について、より具体的に例示すると、全抽出ＲＮＡからＯｌｉｇｏ ｄＴプライマーを用いて逆転写反応で、ｃＤＮＡを調製し、これをリアルタイムＰＣＲで計測することができる。ＲＮＡ抽出には、例えば、ＩＳＯＧＥＮ法（ニッポンジーン）を用いることができる。また、逆転写法には、例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（Ｒ） ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いることができる。リアルタイムＰＣＲには、例えば、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標） ＳＹＢＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）やＴａｑＭａｎプローブなどを用いて増幅産物を測定することができる。
また、ＬＩＰＨ遺伝子の配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列に相補的な配列の標識したプローブによるハイブリダイゼーション方法も含まれる。
なお、プライマーとしては、癌マーカー遺伝子、肺癌マーカー遺伝子及び／又は食道癌マーカー遺伝子であるＬＩＰＨ遺伝子をＰＣＲ法などの遺伝子増幅方法で増幅できるプライマーであれば、いずれのプライマーでもよい。ＬＩＰＨ遺伝子、例えば、配列番号１で示される配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列について、その配列の任意の連続する１５塩基長以上の塩基、好ましくは１６−３０塩基長、より好ましくは、１８〜２８塩基長からなるプライマーを使用することができる。具体的には、以下の表１に記載のものを用いることができる。
また、ディファレンシャルディスプレイ法やＤＮＡアレイ（ＤＮＡチップ）を用いることもできる。
更にハイブリダイゼーション法には、配列番号１で示される配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列に相補的な配列の標識したプローブを用いることができる。
プローブの標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素などを挙げることができる。放射性同位元素としては、例えば、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕などを用いることができる。蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレスカミン、ローダミンなどを用いることができる。酵素としては、例えば、標識として常用される、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。
４−２−１．
上記ｍＲＮＡ検出方法を実施するためのキットとしては、例えば、（１）ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ Ｈ）肺癌又は食道癌マーカー遺伝子をＬＡＭＰ法などの遺伝子増幅方法で増幅できるプライマー又は１組のプライマー（プライマーセット）を含むキット、（２）一例を挙げれば、表１に掲げた１組のプライマー（プライマーセット）を含むキットが挙げられる。
４−３．サンプル中のタンパク質の検出方法
本願発明では、マーカー蛋白質の検出法として、例えば、抗体を用いて検出する方法や質量分析法などマーカー蛋白質を特異的に検出できる方法であればいかなる方法を用いても良い。抗体を用いる方法では、上記ＬＩＰＨ遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体は、既に市販されているものを利用しても良いが、定法により調製してもよい。抗体を用いるマーカー蛋白質の検出法としては、免疫染色法、免疫蛍光法、各種のエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）・酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法、ウェスタンブロッティング法、ビオチン−アビジン法、免疫沈降法などを挙げることができる。
４−３−１．
例えば、上記４．３のタンパク質検出方法を実施するためのキットとしては次のようなものが挙げられる。
（１）（ｉ）酵素標識化モノクローナル抗体及び（ｉｉ）基質溶液
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施するためのキットとしては下記の試薬を含むものがある。
（２）（ｉ）モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉ）酵素標識化モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、及び（ｉｉｉ）基質溶液
ビオチン−アビジン法を実施するためのキットは下記の試薬を含むものである。
（３）（ｉ）ビオチン化モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉ）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン、及び（ｉｉｉ）基質溶液
サンドイッチＥＬＩＳＡ法及びビオチン−アビジン法を実施するためのキットは下記の試薬を含むものである。
（４）（ｉ）モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉ）ビオチン化モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉｉ）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン及び（ｉｖ）基質溶液
なお上記の基質溶液とは、抗体に標識した酵素の基質であって、酵素反応により検出可能な変化を生じる基質を含有する溶液のことである。例えば、基質溶液としては、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）で標識した場合はｐ−ニトロフェニルリン酸含有緩衝液が、ホースラディシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）で標識した場合はｏ−フェニレンジアミン含有緩衝液が、β−ガラクトシダーゼで標識した場合は、４−メチルウンベリルフェリル−β−ガラクトシドを含有する緩衝液を用いることができる。
ビオチン化抗体を用いる方法としては公知の方法を用いることができるが、好ましくはストレプトアビジンとパーオキシダーゼとのコンジュゲートをビオチンに結合させる方法を用いる。このようなパーオキシダーゼとしては、ホースラディッシュパーオキシダーゼが挙げられる。さらに、パーオキシダーゼの検出には、そのパーオキシダーゼの作用によって発色する物質を用いることが好ましい。
以下に本願発明を、実施例を用いてより具体的に説明する。但し、本願は以下の実施例により限定されるものではない。
本願発明者らは、癌マーカーを開発するために、肺癌で発現が有意に高いと予想される候補遺伝子をまず選抜した。その候補遺伝子の中から、複数の肺癌由来細胞株で正常肺由来上皮細胞と比較して発現量が高いものを更に選抜し、癌マーカーを完成させた。
２．癌マーカー遺伝子、肺癌マーカー遺伝子、食道癌マーカー遺伝子
本願発明者らは、癌マーカーとして、ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ Ｈ）遺伝子を同定した。
さらに、本願発明者らは、ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ Ｈ）遺伝子を肺癌マーカー及び食道癌マーカーとして同定した。
以下の実施例に示されるとおり、上記遺伝子は、複数の種類の肺癌由来細胞株で、正常肺由来細胞と比較して発現が亢進していたことが確認されている。さらに、免疫染色により、肺癌組織及び食道癌組織から上記遺伝子産物であるＬＩＰＨが検出されている。また、本マーカーは、肺癌及び食道癌への特異性に加え、肺癌切除後の予後との相関性が高く、肺癌の予後予測に使える可能性が非常に高いマーカーである。
３．癌マーカー遺伝子、肺癌マーカー遺伝子，及び／又は食道癌マーカー遺伝子の発現の確認
遺伝子発現の確認には、当該遺伝子のｍＲＮＡ又は当該遺伝子がコードする蛋白質を検出する周知の方法を用いることができる。ｍＲＮＡの存在を確認する方法としては、例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法、マイクロアレイ法などを用いることができる。蛋白質の確認方法としては、免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法などの抗体を用いる方法などを用いることができる。
４．癌マーカーを用いた、癌細胞の存在を確認する方法及び癌診断を補助する方法、肺癌マーカーを用いた、肺癌細胞の存在を確認する方法及び肺癌診断を補助する方法、食道癌マーカーを用いた、食道癌細胞の存在を確認する方法及び食道癌診断を補助する方法
４−１．サンプル
癌細胞、肺癌細胞又は食道癌細胞の存在を確認する方法に使用するためのサンプル（試料）としては、任意の試料を用いることができるが、好適には被験者からの採取物、具体的には、任意の採取された体液、生検された試料を挙げることができる。特に好適には、被験者の肺疾患部又は食道疾患部の生検試料または喀痰試料を挙げることができる。
４−２．サンプル中のｍＲＮＡの検出法並びにそのための試薬及びキット
例えば、生検試料は、細胞を、例えば、界面活性剤、ホモジナイザー、又はフリーズソーイングなどの定法により、破砕し、全ＲＮＡを抽出することができる。目的のｍＲＮＡの定量には、ＬＡＭＰ法、ディファレンシャルディスプレイ法やＤＮＡアレイ（ＤＮＡチップ）を用いる方法、定量ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、コンペティティブＰＣＲ法を利用することができる。
例えば、リアルタイムＰＣＲ法では、マーカー遺伝子の増幅産物の生成をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法があげられる。前記リアルタイムモニタリング試薬としては、例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ Ｉ、ＴａｑＭａｎプローブ等が挙げられる。
また、コンペティティブＰＣＲ法としては、例えば、細胞内の全ＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを調製し、当該ｃＤＮＡ及びＤＮＡコンペティターを同一チューブ内で反応させる方法や、さらに前記逆転写反応時にｍＲＮＡとともにＲＮＡコンペティターを加えて反応させる方法等があげられる。またコンペティターのプライマー配列以外の内部配列としては、例えば、増幅目的ｍＲＮＡの配列と相同配列でもよく、非相同な配列でもよい。
また、リアルタイムＰＣＲ法を利用する場合について、より具体的に例示すると、全抽出ＲＮＡからＯｌｉｇｏ ｄＴプライマーを用いて逆転写反応で、ｃＤＮＡを調製し、これをリアルタイムＰＣＲで計測することができる。ＲＮＡ抽出には、例えば、ＩＳＯＧＥＮ法（ニッポンジーン）を用いることができる。また、逆転写法には、例えば、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（Ｒ） ＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いることができる。リアルタイムＰＣＲには、例えば、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標） ＳＹＢＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）やＴａｑＭａｎプローブなどを用いて増幅産物を測定することができる。
また、ＬＩＰＨ遺伝子の配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列に相補的な配列の標識したプローブによるハイブリダイゼーション方法も含まれる。
なお、プライマーとしては、癌マーカー遺伝子、肺癌マーカー遺伝子及び／又は食道癌マーカー遺伝子であるＬＩＰＨ遺伝子をＰＣＲ法などの遺伝子増幅方法で増幅できるプライマーであれば、いずれのプライマーでもよい。ＬＩＰＨ遺伝子、例えば、配列番号１で示される配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列について、その配列の任意の連続する１５塩基長以上の塩基、好ましくは１６−３０塩基長、より好ましくは、１８〜２８塩基長からなるプライマーを使用することができる。具体的には、以下の表１に記載のものを用いることができる。
更にハイブリダイゼーション法には、配列番号１で示される配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列に相補的な配列の標識したプローブを用いることができる。
プローブの標識としては、例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素などを挙げることができる。放射性同位元素としては、例えば、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕などを用いることができる。蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレスカミン、ローダミンなどを用いることができる。酵素としては、例えば、標識として常用される、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。
４−２−１．
上記ｍＲＮＡ検出方法を実施するためのキットとしては、例えば、（１）ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ Ｈ）肺癌又は食道癌マーカー遺伝子をＬＡＭＰ法などの遺伝子増幅方法で増幅できるプライマー又は１組のプライマー（プライマーセット）を含むキット、（２）一例を挙げれば、表１に掲げた１組のプライマー（プライマーセット）を含むキットが挙げられる。
４−３．サンプル中のタンパク質の検出方法
本願発明では、マーカー蛋白質の検出法として、例えば、抗体を用いて検出する方法や質量分析法などマーカー蛋白質を特異的に検出できる方法であればいかなる方法を用いても良い。抗体を用いる方法では、上記ＬＩＰＨ遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体は、既に市販されているものを利用しても良いが、定法により調製してもよい。抗体を用いるマーカー蛋白質の検出法としては、免疫染色法、免疫蛍光法、各種のエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）・酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ法、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ法、ウェスタンブロッティング法、ビオチン−アビジン法、免疫沈降法などを挙げることができる。
４−３−１．
例えば、上記４．３のタンパク質検出方法を実施するためのキットとしては次のようなものが挙げられる。
（１）（ｉ）酵素標識化モノクローナル抗体及び（ｉｉ）基質溶液
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施するためのキットとしては下記の試薬を含むものがある。
（２）（ｉ）モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉ）酵素標識化モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、及び（ｉｉｉ）基質溶液
ビオチン−アビジン法を実施するためのキットは下記の試薬を含むものである。
（３）（ｉ）ビオチン化モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉ）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン、及び（ｉｉｉ）基質溶液
サンドイッチＥＬＩＳＡ法及びビオチン−アビジン法を実施するためのキットは下記の試薬を含むものである。
（４）（ｉ）モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉ）ビオチン化モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、（ｉｉｉ）酵素標識化アビジン又はストレプトアビジン及び（ｉｖ）基質溶液
なお上記の基質溶液とは、抗体に標識した酵素の基質であって、酵素反応により検出可能な変化を生じる基質を含有する溶液のことである。例えば、基質溶液としては、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）で標識した場合はｐ−ニトロフェニルリン酸含有緩衝液が、ホースラディシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）で標識した場合はｏ−フェニレンジアミン含有緩衝液が、β−ガラクトシダーゼで標識した場合は、４−メチルウンベリルフェリル−β−ガラクトシドを含有する緩衝液を用いることができる。
ビオチン化抗体を用いる方法としては公知の方法を用いることができるが、好ましくはストレプトアビジンとパーオキシダーゼとのコンジュゲートをビオチンに結合させる方法を用いる。このようなパーオキシダーゼとしては、ホースラディッシュパーオキシダーゼが挙げられる。さらに、パーオキシダーゼの検出には、そのパーオキシダーゼの作用によって発色する物質を用いることが好ましい。
以下に本願発明を、実施例を用いてより具体的に説明する。但し、本願は以下の実施例により限定されるものではない。
本願発明者らは、肺癌で発現が有意に高いと予想される候補遺伝子をまず選抜する予備的研究により、８種の新規肺癌マーカー候補因子を得た。これら因子の肺癌における発現を検証するため肺癌由来細胞株を用いてｑＰＣＲを行い、ｍＲＮＡレベルでの各候補因子の発現を検証した。表２記載の細胞を同表記載の培地を用いて、１６種類の肺癌由来細胞株および２種類の正常肺由来細胞を６−ｗｅｌｌプレートでコンフルエントまで培養した。次に、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）あるいはＲＮＡ ｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＲＮＡの抽出を行った。抽出した５００ｎｇの全ＲＮＡを鋳型としＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＩＩ １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。そして合成したｃＤＮＡを鋳型としＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてｑＰＣＲを行った。
ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ Ｈ）についての結果を図１に示す。正常肺由来上皮細胞（ＳＡＥＣ ：小気道上皮細胞、ＮＨＢＥ：肺胞上皮細胞）と比較し、複数の肺腺癌細胞株で２倍以上の発現が確認された。また、肺扁平上皮癌細胞株で発現が上昇していた。図中グラフの縦軸は遺伝子の発現量を内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨの発現量で除した値を、ＰＣ−３細胞の発現量との相対値で示している。
ＬＩＰＨ（ｌｉｐａｓｅ，ｍｅｍｂｅｒ Ｈ）についての結果を図１に示す。正常肺由来上皮細胞（ＳＡＥＣ ：小気道上皮細胞、ＮＨＢＥ：肺胞上皮細胞）と比較し、複数の肺腺癌細胞株で２倍以上の発現が確認された。また、肺扁平上皮癌細胞株で発現が上昇していた。図中グラフの縦軸は遺伝子の発現量を内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨの発現量で除した値を、ＰＣ−３細胞の発現量との相対値で示している。
タンパク質レベルでの発現を検証するため、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社の抗ＬＩＰＨウサギポリクローナル抗体を用いて、市販の組織マイクロアレイ（上海Ｏｕｔｄｏ社）に対する免疫染色を行った。用いた組織マイクロアレイには肺癌組織６０検体および癌検体と同一ドナー由来の周辺正常組織６０検体のホルマリン固定パラフィン包埋切片がスポットされている。肺癌のタイプは、肺扁平上皮癌、肺腺癌、肺腺扁平上皮癌、細気管支肺胞上皮癌、大細胞癌および小細胞肺癌各１０検体である。
まず、キシレン処理を１０分間、２回、１００％ＥｔＯＨ（エタノール）で１０分間処理を２回、した後、９０％ＥｔＯＨで１０分間処理し、最後に、７０％ＥｔＯＨエタノールで１０分間処理して、脱パラフィンし、親水化した。
次に、１０ｍＭクエン酸緩衝液中で１１０℃１０分間オートクレーブを行うことで抗原の賦活化を行った。０．３％Ｈ２Ｏ２／ＭｅＯＨで３０分処理して、内在性ペルオキシダーゼを失活させた。その後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いて免疫染色を行い、ＤＡＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いて発色を行った。また、免疫染色後にヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ社）で対比染色を行った。
顕微鏡（ＢＸ５０（ＯＬＹＭＰＵＳ社）、ＥＯＳ ｋｉｓｓ Ｘ６ｉで観察し、撮影した結果を図２に示す。肺腺癌組織において、腫瘍細胞の細胞質で強く発現していることが明らかとなった。
まず、キシレン処理を１０分間、２回、１００％ＥｔＯＨ（エタノール）で１０分間処理を２回、した後、９０％ＥｔＯＨで１０分間処理し、最後に、７０％ＥｔＯＨエタノールで１０分間処理して、脱パラフィンし、親水化した。
次に、１０ｍＭクエン酸緩衝液中で１１０℃１０分間オートクレーブを行うことで抗原の賦活化を行った。０．３％Ｈ２Ｏ２／ＭｅＯＨで３０分処理して、内在性ペルオキシダーゼを失活させた。その後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いて免疫染色を行い、ＤＡＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いて発色を行った。また、免疫染色後にヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ社）で対比染色を行った。
顕微鏡（ＢＸ５０（ＯＬＹＭＰＵＳ社）、ＥＯＳ ｋｉｓｓ Ｘ６ｉで観察し、撮影した結果を図２に示す。肺腺癌組織において、腫瘍細胞の細胞質で強く発現していることが明らかとなった。
実施例１及び２の結果より、ＬＩＰＨは、新規肺癌マーカー候補として有力であると判断した。そこで、以下に肺癌組織型別にＬＩＰＨが高発現している割合を検討し、その結果を示す（図３）。図中の数値は組織マイクロアレイにスポットされている１０検体中どのくらいの割合でＬＩＰＨが高発現しているかを示している。結果、肺腺癌では７０％と高い割合でその発現が確認でき、腺癌と類似した乳頭状所見を示す細気管支肺胞上皮癌（ＢＡＣ）でも同じく７０％と高い割合で発現が確認できた。一方、扁平上皮癌で３０％、大細胞癌で２０％とやや低く、小細胞肺癌では１０検体中１検体でのみその発現が確認され、非小細胞肺癌に特異的であることが示唆された。また、腫瘍細胞において、肺腺癌では細胞質、気管支上皮癌では細胞表面、扁平上皮癌では膜や核、小細胞肺癌では主に核が陽性であった。
肺癌患者血清はビジコムジャパン社から購入し、健常者血清検体は栄研社内より調達した。Ｍａｘｉｓｏａｐ（ｎｕｎｃ社）に１００μｇ／ｗｅｌｌの抗ＬＩＰＨウサギポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社）を４℃一晩インキュベートすることで固相化し、２５％ブロックエースを用いて４℃一晩ブロキングを行った。ブロッキング液を除いた後、１０％ブロックエースにより１０倍希釈した血清検体を１００μｇ／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間反応を行った。１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で３回洗浄後、１：５００に希釈した抗ＬＩＰＨマウスポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社）を加え室温で１時間反応を行った。３回洗浄後、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧを加え１時間反応を行った後、１００μｌのＯＰＤ基質を加え発色反応を行った。４９２ｎｍの吸光度を測定することでＬＩＰＨの定量を行った。標準はｃｕｓａｂｉｏ ｂｉｏｔｅｃｈ社のＨｕｍａｎ Ｌｉｐａｓｅ ｍｅｍｂｅｒ Ｈ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔに添付された標準物質を使用した。結果を図４に示す。
実施例４で用いた血清検体のＣＥＡ値を測定した。測定試薬はＥテスト「ＴＯＳＯＨ」ＩＩ ＣＥＡ免疫反応試薬（東ソー）を用い、測定装置にはＡＩＡ−８００（東ソー）を用いた。Ｘ軸に実施例４で測定した血清ＬＩＰＨ値、Ｙ軸に血清ＣＥＡ値をプロットした散布図を描画し、相関係数を求めた。結果を図５に示す。
食道癌組織におけるＬＩＰＨのタンパク質レベルでの発現を検証するため、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社の抗ＬＩＰＨウサギポリクローナル抗体を用い、市販の組織マイクロアレイ（上海Ｏｕｔｄｏ社）に対する免疫染色を行った。用いた組織マイクロアレイには食道癌組織６検体および癌検体と同一ドナー由来の周辺正常組織６検体のホルマリン固定パラフィン包埋切片がスポットされている。食道癌検体の組織型はいずれも扁平上皮癌であった。
まず、キシレン処理を１０分間、２回、１００％ＥｔＯＨ（エタノール）で１０分間処理を２回、した後、９０％ＥｔＯＨで１０分間処理し、最後に、７０％ＥｔＯＨエタノールで１０分間処理して、脱パラフィンし、親水化した。
抗原の賦活化は１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１００℃、２０分間加熱処理することで行い、内在性ペルオキシダーゼを失活させるため、０．３％過酸化水素／メタノールで３０分間スライドを処理した。染色にはタイラマイドを利用したビオチンフリー免疫染色増感システムＣＡＳＩＩ（Ｄａｋｏ社）を使用し、製造者のプロトコールに従って行った。ＤＡＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いて発色を行った後、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ社）で対比染色を行った。観察はＩＸ５９顕微鏡（オリンパス）を用い、ＥＯＳ Ｋｉｓｓ Ｘ６ｉ（Ｃａｎｏｎ）を用いて画像を取得した。
結果を図６に示す。図６より、ＬＩＰＨは、食道癌のマーカーとしても用いることができることが明らかとなった。
まず、キシレン処理を１０分間、２回、１００％ＥｔＯＨ（エタノール）で１０分間処理を２回、した後、９０％ＥｔＯＨで１０分間処理し、最後に、７０％ＥｔＯＨエタノールで１０分間処理して、脱パラフィンし、親水化した。
抗原の賦活化は１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１００℃、２０分間加熱処理することで行い、内在性ペルオキシダーゼを失活させるため、０．３％過酸化水素／メタノールで３０分間スライドを処理した。染色にはタイラマイドを利用したビオチンフリー免疫染色増感システムＣＡＳＩＩ（Ｄａｋｏ社）を使用し、製造者のプロトコールに従って行った。ＤＡＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ社）を用いて発色を行った後、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ社）で対比染色を行った。観察はＩＸ５９顕微鏡（オリンパス）を用い、ＥＯＳ Ｋｉｓｓ Ｘ６ｉ（Ｃａｎｏｎ）を用いて画像を取得した。
結果を図６に示す。図６より、ＬＩＰＨは、食道癌のマーカーとしても用いることができることが明らかとなった。
本願発明は、診断剤及び診断キット製造を製造する産業で利用することができる。より具体的には、腫瘍診断剤及び診断キットを製造業で利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
Claims (9)
- LIPH遺伝子によりコードされるポリペプチドである肺癌又は食道癌のマーカー。
- LIPHをコードするmRNAである請求項１記載の肺癌又は食道癌のマーカー。
- 配列番号１で示される配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列に相補的な配列の標識した肺癌又は食道癌検出用プローブ。
- LIPH遺伝子を検出するためのLIPH遺伝子配列中の連続する15塩基以上の塩基を含む肺癌又は食道癌検出用プライマー。
- 配列番号１で示される配列又は同配列に１から数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加された配列について、その配列の任意の連続する15塩基長以上の塩基を含む肺癌又は食道癌検出用プライマー。
- LIPHに対する抗体を含む肺癌又は食道癌検出剤。
- 抗体がモノクローナル抗体である請求項６記載の肺癌又は食道癌検出剤。
- 請求項４又は５記載の肺癌又は食道癌検出用プライマーを含む肺癌又は食道癌検出キット。
- 請求項６又は７記載の肺癌又は食道癌検出剤を含む肺癌又は食道癌検出キット。
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