WO2007032373A1 - 腫瘍発生リスクの解析方法 - Google Patents

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WO2007032373A1
WO2007032373A1 PCT/JP2006/318130 JP2006318130W WO2007032373A1 WO 2007032373 A1 WO2007032373 A1 WO 2007032373A1 JP 2006318130 W JP2006318130 W JP 2006318130W WO 2007032373 A1 WO2007032373 A1 WO 2007032373A1
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gene
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risk
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promoting
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PCT/JP2006/318130
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Inventor
Hideki Ishikawa
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Falco Biosystems Ltd.
Matsuura, Nariaki
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Publication date
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
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    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity

Definitions

  • the present invention relates to a technique for measuring the expression level of a gene in a test tissue collected from a non-tumor part and analyzing the risk of tumor development.
  • the inspection takes about 30 minutes, and if you include rest after that, it will be restrained for at least one day. Inspection costs also cost tens of thousands of yen. In this way, the inspection requires a considerable burden on the subject and cannot be performed unnecessarily. However, since few appropriate risk assessments have been found, it is currently recommended that people with a history of colorectal polyps be tested about once a year or two years. In addition, there is still a shortage of skilled physicians that need to be performed by skilled physicians.
  • the conventional method requires skill for an inspection that places a heavy burden on the subject. For this reason, an indicator that can appropriately determine the inspection interval is extremely waiting.
  • the present invention makes it possible to grasp the risk of tumor development with high accuracy using biological indicators, and to efficiently and appropriately carry out tests for early detection of tumors, or prevention or treatment of tumors.
  • the main problem is to obtain the analysis means to perform.
  • the present inventor examined the expression level of a specific gene, and combined evaluation of tumor development risk using them as an index.
  • the present inventors have found that the risk of tumor development can be analyzed with high accuracy and efficiency, and have made extensive studies to complete the present invention.
  • the present invention relates to the following items.
  • Item 1 (a) a cell proliferation promoting gene group, a cell proliferation inhibiting gene group, an apoptosis promoting gene group, an apoptosis inhibiting gene group, a cell differentiation promoting gene group in a test tissue collected from a non-tumor part of a specimen, and A step of measuring the expression level of two or more indicator genes selected from the group of cell differentiation suppressing genes,
  • step (d) a step of evaluating the tumor occurrence index of each index gene obtained in step (c) by comparing with a preset reference value; and (e) Step comprising the step of combining two or more evaluations of each indicator gene obtained in step (d), wherein the cell proliferation promoting gene group includes PCNA (proliferating cell nuclear antigen) gene, CyclinDl gene, cdk2 (cyclin dependent kinase- 2) A group of islets containing the gene, farnesyl transferase gene, Ki67 gene, and EGF receptor (epidermal growth factor receptor) gene.
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • CyclinDl gene CyclinDl gene
  • cdk2 cyclin dependent kinase- 2
  • the cell growth inhibitory gene group is a gene group including TGF ⁇ (transforming growth factor ⁇ ) gene, ⁇ 21 gene, and ⁇ 4 gene,
  • the apoptosis-promoting gene group includes a Bax gene, a caspase gene, and a Fas gene;
  • a group comprising the Bd-2 gene, the IAP gene, and the survivin gene
  • the cell differentiation promoting gene group includes a mucin gene, a Cdx-1 gene, an intestinal alkaline phosphatase gene, and a CD10 gene; and
  • a method for analyzing a risk of developing a tumor wherein the group of suppressor genes includes a Cdx-2 gene.
  • an occurrence risk increase factor occurs when the tumor occurrence index is higher than the reference value, and a case where it is lower than the reference value Evaluated as a risk reduction factor,
  • the indicator gene is a cell growth promoting gene, a cell differentiation inhibitor gene, or an apoptosis suppressor gene, if the tumor occurrence index is greater than or equal to the reference value, the risk factor is increased, and if it is less than the reference value, the risk factor is decreased And
  • the indicator gene is a cell growth inhibitory gene, a cell differentiation promoting gene, or an apoptosis promoting gene, if the tumor occurrence index is less than the reference value, the risk is increased, and if it is greater than the reference value, the risk is decreased And
  • Step (d) is as follows:
  • step (d-2) For each index gene, the tumor incidence index in step (c) is compared with the reference value in step (d-1), and the one with a high expression level is scored as a high score, (d-3a)
  • the indicator gene is a cell growth promoting gene, a cell differentiation suppressing gene, or an apoptosis inhibitory gene
  • the score of (d-2) is evaluated as an addition factor
  • Item 2 The evaluation method according to Item 1.
  • step (d-2) For each index gene, the tumor incidence index in step (c) is compared with the reference value in step (d-1), and the one with a high expression level is scored as a high score,
  • (d-3b) When the indicator gene is a cell growth inhibitory gene, a cell differentiation promoting gene, or an apoptosis promoting gene, the score of (d-2) is evaluated as an arch I factor,
  • Item 1 comprising the step of scoring a combination of two or more evaluations of each indicator gene by adding the evaluation obtained in step (d-3a) and subtracting the evaluation obtained in (d-3b) The method described in 1.
  • Item 4 The method according to any one of Items 1 to 3, which is a method for analyzing the risk of tumor development in the large intestine, wherein the non-tumor part of the specimen is normal large intestinal mucosa.
  • the step (a) comprises cell proliferation in a test tissue collected from normal large intestine mucosa.
  • the process of measuring the expression level of two or more indicator genes selected from a promoter gene group, a cell growth inhibitory gene group, an apoptosis promoter gene group, an apoptosis suppressor gene group, a cell differentiation promoter gene group, and a cell differentiation suppressor gene group Item 4.
  • the method for analyzing colorectal tumor development risk according to any one of Items 1 to 3.
  • Item 5 The method according to any one of Items 1 to 4, which is a GADPH (glyceralde-hydo-3-phosphate dehydrogenase) gene.
  • GADPH glycosyl-hydo-3-phosphate dehydrogenase
  • the method according to any one of Items 1 to 4 which is a step (b) a step of measuring the expression level of a GADPH gene in the same tissue.
  • Item 6 The method according to any one of Items 1 to 5, wherein the indicator gene is two or more indicator genes selected from a cell growth promoting gene group and an apoptosis promoting gene group.
  • the step (a) is a step of measuring the expression level of two or more indicator genes selected from the cell growth promoting gene group and the apoptosis promoting gene group in the test tissue collected from the non-tumor part of the specimen.
  • Item 6. The method according to any one of Items 1 to 5.
  • An example of a preferred embodiment is that in step (a) in a test tissue collected from a non-tumor part of a specimen.
  • Item 6 The method according to any one of Items 1 to 5, which is a step of measuring the expression level of an indicator gene having two or more genes selected from a cell growth promoting gene group and one or more apoptosis promoting genes.
  • Item 7 The method according to any one of Items 1 to 6, wherein the cell growth promoting gene group is a group consisting of a PCNA gene and a CyclinDl gene.
  • Item 8 The method according to any one of Items 1 to 7, which is a group of apoptosis promoting gene group force Bax gene force.
  • step (a) the expression level of two or more indicator genes selected from a cell proliferation promoting gene group and an apoptosis promoting gene group in a test tissue collected from a non-tumor part of a specimen is expressed.
  • Item 8 The method according to any one of Items 1 to 7, which is a measurement step, wherein the cell proliferation promoting gene group is a group having a PCNA gene and a CyclinDl gene force, and the apoptosis promoting gene group is a group having a Bax gene force.
  • step (a) force two or more index residues selected from the group consisting of PCNA gene, CyclinDl gene and Bax gene in the test tissue collected from the non-tumor part of the specimen Item 8.
  • a tumor refers to a neoplasm such as an adenoma that is a cancer and a precancerous lesion. [0028] 1. Subject
  • the tumor risk analysis method of the present invention is performed using a test tissue collected from a non-tumor part of a specimen.
  • a non-tumor part is a part that is not a tumor, that is, a part that is not cancer or an adenoma.
  • the non-tumor part is preferably a tissue that looks macroscopically normal.
  • the type of tissue to be examined is not particularly limited as long as the expression level of the gene can be measured, and includes all cells and tissues serving as a carcinogenic matrix. Specifically, mucosal cells are mentioned.
  • the type of tissue to be examined can be appropriately set according to the type of tumor, cancer or adenoma to be analyzed.
  • the test tissue in the case of a method for analyzing the risk of tumor development in the large intestine, can be cells collected from normal large intestine mucosa.
  • Collection of a test tissue can be appropriately performed according to a known method used as a biopsy.
  • the gene used as an index is a gene that is considered to be associated with cell proliferation, apoptosis, and Z or cell differentiation.
  • the indicator gene is a cell growth promoting gene group, a cell growth suppressing gene group, an apoptosis promoting gene group, an apoptosis suppressing gene group, a cell differentiation promoting gene group, And Z or a gene belonging to the cell differentiation suppressing gene group.
  • a group means a unit of a group of one or more genes.
  • Cell proliferation promoting genes include PCNA (proliferating cell nuclear antigen) gene, CyclinDl gene, cdk2 (cyclin dependent kinase-2; cyclin dependent kinase-2). These include the gene 2) gene, the farnesyl transferase gene, the Ki67 gene, and the EGF receptor (epidermal growth factor receptor) gene.
  • the cell growth promoting gene group is a group that is appropriately selected from known genes having a function of promoting cell growth.
  • the CyclinDl gene is a gene that is related to the control of the cell cycle and whose expression is induced by a proliferation signal.
  • the PCNA gene was discovered as a gene that encodes an antigen found in the nucleus of proliferating cells, and is involved in DNA replication and cell cycle progression.
  • the cell growth promoting gene is a PCNA gene or Cyclin.
  • the cytostatic genes, TGF ⁇ (transforming growth factor ⁇ ;.
  • Transformants timing growth factor gene, [rho 21 gene, and ⁇ 4 gene and the like include cell growth suppression genes may promote cell proliferation This group is set by appropriately selecting from known genes having the function of
  • the apoptosis promoting gene group includes Bax gene, caspase gene, Fas gene and the like.
  • the apoptosis-promoting gene group is a group that is appropriately selected and set from known genes having a function of promoting apoptosis.
  • the Bax gene is a gene that promotes apoptosis and inhibits the anti-apoptotic activity of Be ⁇ 2.
  • the apoptosis-inhibiting gene group includes Be ⁇ 2 gene, IAP gene, survivin gene and the like.
  • the apoptosis-suppressing gene group is a group that is set by appropriately selecting a known gene force having a function of suppressing apoptosis.
  • the Bd-2 gene is a gene having an apoptosis inhibitory activity.
  • Cell differentiation promoting genes include mucin gene, Cdx-1 gene, intestinal alkaline phosphate Intestinal alkaline phosphatase gene, CD10 gene and the like are included.
  • the cell differentiation promoting gene group is a group set by appropriately selecting from known genes having a function of promoting cell differentiation.
  • the cell differentiation suppressing gene group includes Cdx-2 gene and the like.
  • the cell differentiation suppressing gene group is a group set by appropriately selecting from known genes having a function of promoting cell differentiation.
  • the term “usukiping gene” refers to a gene that encodes a protein necessary for the general function of a cell, and a constant amount is always constitutively expressed in any cell.
  • the type of housekeeping gene can be set as appropriate.
  • GAPDH glycosylaldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • ⁇ -phosphotin ⁇ 2-microglobulin
  • HPRT 1 hyperxanthine phosphonbosyltransferase 1
  • RT-PCR real-time PCR method
  • the expression level of a gene can be measured by a method of detecting a transcript of a gene in a test tissue, a method of detecting the translation product, or the like.
  • the method for detecting transcripts is to measure the expression level of the gene by detecting mRNA, which is a transcript of the gene.
  • mRNA which is a transcript of the gene.
  • RT-PCR Northern blot analysis
  • RT-PCR Northern blot analysis
  • the method for detecting a translation is to measure the expression level of the gene by detecting a protein that is a translation of the gene. For example, Western plot analysis using a specific antibody against the protein, immunization It can be performed by immunoassay such as histochemical staining.
  • Tumor development index is a measure of the expression level of the indicator gene, It is obtained by correcting with the current measured value.
  • the tumor occurrence index of each gene is P
  • the number of CR cycles can be expressed as ACt by subtracting Ct of the indicator gene from Ct of the housekeeping gene using threshold cycle (Ct).
  • ACt can be expressed by the following equation.
  • ACt Ct of housekeeping gene Ct of indicator gene
  • the tumor incidence index obtained for each indicator gene can be used as an appropriate factor for assessing the risk of tumor development by comparing it with a reference value established in relation to the presence or absence of tumor development.
  • the reference value used in the present invention can be appropriately set based on whether or not a tumor has occurred and the amount of gene expression.
  • the reference value is a risk factor based on whether the expression level of the indicator gene is high or low, and the presence or absence of tumor occurrence as a result (endpoint). Can be calculated by examining the above.
  • the risk factor (+) when the expression level of the indicator gene is high, the risk factor (+) is low when the expression level is low, and the risk occurrence (+) As a result (1) that no tumor occurs, the value that gives the maximum sum of sensitivity and specificity of the expression level can be used as the reference value for the target gene.
  • the sensitivity means a ratio at which a factor showing a high tumor occurrence value by the expression level correctly determines the presence of a tumor.
  • the specificity means the rate at which a factor that shows a low tumor incidence depending on the expression level correctly determines the absence of tumor development.
  • the reference value can be set in several stages depending on the degree of tumor occurrence.
  • the relationship between tumor index and each index gene can be evaluated.
  • the comparison method and the evaluation method can be appropriately set according to a reference value setting method or the like.
  • the risk factor (+) is the risk factor (1)
  • the case of tumor occurrence is the result (+)
  • no tumor is the result (1).
  • the value that maximizes the sum of the specificities is calculated as the reference value for each indicator gene.
  • the index gene is a cell growth promoting gene, a cell differentiation suppressing gene, or an apoptosis suppressing gene
  • the tumor risk index is higher than the reference value, and the risk of raising the risk is less than the reference value. The case is evaluated as a risk reduction factor.
  • the indicator gene is a cell growth inhibitory gene, a cell differentiation promoting gene, or an apoptosis promoting gene
  • the tumor occurrence index is less than the reference value
  • an occurrence risk increasing factor when it is above the reference value, the occurrence risk is reduced. Evaluate as a factor.
  • CyclinDl gene when the reference value is 2.51, if Ct is less than -2.51, it is evaluated as a risk reduction factor, and if it is 2.51 or more, it is evaluated as a risk increase factor. .
  • the reference value is 2.30
  • the ACt is less than -2.30, it is evaluated as an occurrence risk increasing factor, and if it is 2.30 or more, it is evaluated as an occurrence risk decreasing factor.
  • the risk of cancer development can be analyzed by combining two or more evaluations regarding the increase or decrease in the occurrence risk obtained for each indicator gene. For example, the cause of decline with many rising factors It can be analyzed that the fewer children! /, The higher the risk of tumor development. On the other hand, it can be analyzed that the risk of tumor development tends to be lower as the increase factor is smaller and the decrease factor is lower.
  • the indicator gene is a cell growth promoting gene, cell differentiation inhibiting gene, or apoptosis inhibiting gene
  • the number added is added, and the indicator gene is a cell proliferation inhibiting gene, cell differentiation promoting gene, apoptosis
  • the score is subtracted from the number assigned. This score can be used to analyze the risk of developing cancer. For example, it can be analyzed that the higher the score, the higher the risk of tumor development. Conversely, the lower the score, the lower the risk of tumor development.
  • the risk of tumor development is analyzed by combining two or more evaluations of each indicator gene obtained in the above manner.
  • the evaluation of the indicator gene is divided into two groups, an increase factor and a decrease factor, and analysis is performed by combining them.
  • the evaluation of the indicator gene is evaluated by scores, the scores are combined and scored, and the degree of occurrence risk is analyzed with the obtained scores.
  • the combination may be a combination of evaluations of two or more indicator genes selected with the same group power.
  • One group power selected One or more indicator genes selected with another group power Evaluation of one or more indicator genes selected A combination of these may be used.
  • the cell growth promoting gene group power may be a combination of evaluations using two or more indicator genes selected from the cell growth promoting gene group. A combination of evaluation by one or more selected indicator genes may be used.
  • the evaluation may be a combination of evaluation using the CyclinDl gene and evaluation of the PCNA gene, or may be a combination of evaluation using the PCNA gene and evaluation using the Bax gene. Further, it may be a combination of evaluations using CyclinDl gene, PCNA gene, and Bax gene.
  • the combination preferably includes evaluation with two or more indicator genes selected from the same group.
  • the evaluation of two or more genes selected from a cell growth promoting gene group is combined with the evaluation of one or more genes selected from another group, for example, an apoptosis promoting gene group, to evaluate the risk of tumor development. I prefer that.
  • analysis of the risk of tumor development including a combination of evaluations of two or more indicator genes selected from the same group power can be performed, for example, as follows.
  • proliferation sputum indicates that the tumor growth index of the cell growth promoting gene is less than the reference value (development risk reducing factor).
  • Growth ⁇ indicates that the tumor growth index of the cell growth promoting gene is higher than the reference value (risk increase factor)
  • Apoptosis * indicates that the tumor development index of the apoptosis promoting gene is a reference value or more (development risk reduction factor).
  • Apoptosis I indicates that the tumor development index of the proapoptotic gene is less than the reference value (risk increase factor).
  • the evaluation of a tumor development risk can be performed by appropriately adding evaluation on genes other than the above-mentioned target genes.
  • analysis can be performed including environmental factors and other factors such as the age, sex, or medical history of the subject as long as the effects of the present invention are achieved.
  • the method of the present invention can be used to set an appropriate examination interval and examination method for early detection of a tumor or cancer.
  • guidance for cancer prevention can be provided, and measures and treatment policies can be established at an early stage.
  • the test interval is shortened for those who have a high risk, and the test interval is long for those who have a low risk of development.
  • An inspection interval can be set. Furthermore, when the risk of occurrence is high, it is possible to actively prevent carcinogenesis by changing lifestyle habits and taking a carcinogenic agent, etc., as well as shortening the test interval.
  • Carcinogenesis prevention should be performed on a person with a high risk of occurrence, because it would be efficient and ethically desirable, but it would be possible to practice effective prevention on appropriate subjects. , Inspection target It can also be used for setting the user.
  • the method of the present invention can also be used for the development of an efficient carcinogenesis prevention method and the practice of carcinogenesis prevention.
  • the method of the present invention can also be used for confirming whether or not the risk of carcinogenesis has decreased due to lifestyle changes or internal use of a carcinogenic substance.
  • the tumor risk analysis method of the present invention can be applied to solid cancers such as esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, knee cancer, prostate cancer, lung cancer, laryngeal pharyngeal cancer, and breast cancer that are not limited to colorectal cancer. It can also be applied to blood tumors such as leukemia.
  • the analysis method of the present invention can be suitably used as an analysis method for the risk of developing colorectal cancer.
  • the present invention provides a method that can appropriately evaluate the risk of tumor development, particularly the risk of colorectal tumor development, with high accuracy.
  • the present invention makes it possible to analyze the risk of tumor development with high accuracy by combining two or more indices.
  • the present invention it is possible to confirm whether or not the ability to reduce the risk of carcinogenesis has been reduced by changing lifestyle habits or taking a carcinogenesis-preventing substance. It can also be used for effective practice of carcinogenesis prevention and treatment.
  • the present invention provides a means capable of appropriately grasping the risk of tumor development with high accuracy, and can greatly contribute to the prevention or early treatment of cancer and the reduction of the morbidity rate. is there.
  • FIG. 1 A drawing showing an ROC curve based on a measured value of Cyclin Dl gene expression level.
  • FIG. 2 is a drawing showing an ROC curve based on a measured value of PCNA gene expression level.
  • FIG. 3 is an ROC curve based on a measured value of Bax gene expression level.
  • FIG. 4 is an ROC curve based on a combination of measured values of expression levels of Cyclin Dl gene, PCNA gene and Bax gene.
  • FIG. 5 shows the correlation between CyclinDl gene and PCNA gene.
  • FIG. 6 shows the correlation between PCNA gene and Bax gene.
  • FIG. 7 shows the correlation between CyclinDl gene and Bax gene.
  • FIG. 8 is a drawing showing the results of examining the relationship with tumor development by combining evaluation of CyclinDl gene, PCNA gene and Bax gene. In other words, it is a drawing showing the relative risk of combining the evaluation of the CyclinDl gene, the PCNA gene, and the Bax gene with respect to the occurrence of a moderate or higher grade adenoma.
  • the subjects were 170 males and 42 females, 212 in total (average age 55.0 ⁇ 0.4 years; 40-66 years).
  • CyclinDl residue, P NA (proliferating cell nuclear antigen) residue, and Bax residue fc + were measured.
  • GPDH glyceralde-hydo-3-phosphate dehydregenase
  • RNA extracted from colonic mucosal cells collected by this method was synthesized, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) was synthesized by reverse transcription, and mRNA was quantified by real-time PCR.
  • RNA by centrifugation at lOOOOrpm 4 ° C for 5 minutes. did.
  • Prepare a total RNA amount of 1.5 ⁇ g wash the RNA with 80% ethanol, dry it, dissolve in 12.5 ⁇ 1 DEPC (diethylpyrocarbonate) -treated water, and heat at 95 ° C for 2 minutes. Then, after cooling with ice to destroy the higher order structure of RNA, a mixture containing 10.51 reverse transcription enzyme was added and incubated at 42 ° C for 60 minutes.
  • DEPC diethylpyrocarbonate
  • This mixture consists of 4.5 1 5 X buffer (containing 0.1 M DTT), 1 ⁇ 1 oligo dT (Amarham, Hokkaidou, Japan), 3 ⁇ 1 2.5 M dNTP mixture (TAKARA, Shiga, Japan), 1 ⁇ l of Rnasin (Promega, WI, USA), 1 ⁇ l of A MV Reverse Transcriptase (Promega. WI, USA).
  • HCT-116 is a colorectal cancer cell line. 10% CO was cultured in a 25 cm 2 flask (IWAKI, Funabasi, Japan).
  • RNA was extracted from these HCT-116 cells in the same manner as described above to synthesize cDNA.
  • the cDNA obtained from HCT-116 was used as a standard for real-time PCR.
  • PCR reaction solution was mixed with 2 X QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Tokyo, Japa ⁇ 12.5 ⁇ 1, each primer 0.25 ⁇ 1 each, sample cDNA 1.5 ⁇ 1, and Rnase-removed water 10.5 ⁇ 1.
  • the total volume was 25 ⁇ 1.
  • Real-time PCR was performed using the 5700 Sequence Detection System with the following protocol:
  • GAPDH glyceralde-hydo-3-phosphate dehydregenase
  • the evaluation method of the real-time PCR method detects fluorescence of SYBR Green when the amplification product reaches a certain amount in the PCR reaction.
  • the number of PCR cycles when this fluorescence rises is called the threshold cycle (Ct), and this number was evaluated.
  • the obtained ACt value was used as a tumor occurrence index of each index gene.
  • NCBI forces and others searched for the base sequence of mRNA of each indicator gene, and designed primers based on that base sequence. Using this primer and cDNA obtained from HCT-116, PCR was performed to confirm that a specific band was detected, and then a dilution test was performed using HCT-116 cDNA. It was confirmed whether or not fluorescence could be detected, and actual samples were measured.
  • the data was statistically analyzed using StatView, and the test method was Mann-Whitney U test for significant difference test.
  • Cyclin D1 gene, PCNA gene, and Bax gene are expressed in a large amount of indicator gene, the risk factor (+) is low! Using the presence or absence of occurrence as an endpoint, the sensitivity and specificity were determined, and an ROC curve was drawn.
  • Figures 1 to 3 show the ROC curves.
  • Fig. 1 shows the ROC curve of the Cyclin D1 gene
  • Fig. 2 shows the ROC curve of the PCNA gene
  • Fig. 3 shows the ROC curve of the Bax gene.
  • index gene the value that maximizes the sum of sensitivity and specificity was determined as a reference value for the index gene.
  • the reference values were the same (; 101 gene 2.5-1.51, PCNA gene 1.27, Bax gene 2.30.
  • the value that maximizes the sum of sensitivity and specificity was determined as the reference value.
  • the reference value was -0.26.
  • FIG. 6 shows a drawing in which the correlation between the PCNA gene and the Bax gene was examined.
  • FIG. 7 shows a drawing in which the correlation between the CyclinDl gene and the Bax gene was examined.
  • CyclinDl gene which is the same cell growth promoting gene group, and PC
  • ⁇ is low when the PCNA gene tumor incidence index is less than the standard value (factor of risk reduction), and high is the PCNA gene tumor incidence index is above the standard value. Case evaluation (increased risk of occurrence) is shown.
  • RR indicates the relative risk (relative ratio).

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Abstract

検体の非腫瘍部から採取した被検組織における細胞増殖促進遺伝子群、細胞増殖抑制遺伝子群、アポトーシス促進遺伝子群、アポトーシス抑制遺伝子群、細胞分化促進遺伝子群、及び、細胞分化抑制遺伝子群から選ばれる２以上の指標遺伝子の発現量を測定する工程（ａ）；同組織におけるハウスキーピング遺伝子の発現量を測定する工程（ｂ）；工程（ａ）で得られる各指標遺伝子の発現量の測定値を、工程（ｂ）で得られるハウスキーピング遺伝子の発現量の測定値で補正した値を、各指標遺伝子に関する腫瘍発生指標とする工程（ｃ）；工程（ｃ）で得られる各指標遺伝子の腫瘍発生指標を、予め設定される基準値と比較して評価する工程（ｄ）；及び工程（ｄ）で得られる各指標遺伝子の評価を２以上組み合わせる工程（ｅ）を有する腫瘍発生リスクの解析方法。

Description

明 細 書
腫瘍発生リスクの解析方法
技術分野
[0001] 本発明は、非腫瘍部から採取された被検組織における遺伝子の発現量を測定し、 腫瘍の発生リスクを解析する技術に関する。
背景技術
[0002] 癌による死亡率は、近年、高い値で推移を続けており、特に大腸癌の死亡率は高 い。そのため、癌の早期発見、又は癌の予防のための研究が積極的に行われてきて いる。
[0003] 多くの癌は高発癌状態を経て早期癌力 進行癌になると考えられており、癌の検診 は、治療可能な早期癌を見つけることを目的としている。早期癌を見つけるためには 、頻回な検査を行うことになるが、癌を早期に発見するための検査は苦痛や危険を 伴うことも多ぐまた、多大なコストや時間も必要である。例えば、大腸癌は、早期発見 、早期治療によりほぼ完治が期待できる癌であるが、その検査である大腸内視鏡検 查はきわめて負担の大きな検査である。具体的には検査の前日より強力な下剤を大 量に服用し、大腸の内容物をすベて除去してから、肛門から屈曲の強い大腸を盲腸 まで検査具を挿入する必要がある。検査の時間も 30分程度を要し、その後の安静な ども含めると少なくとも 1日以上が拘束される。検査費用も数万円かかる。このように、 検査は、対象者がかなりの負担を要し、むやみに行うことはできない。しかし、適切な リスク評価がほとんど見出されていないため、現状では大腸ポリープの既往を持つ人 は 1年から 2年に 1回程度の検査が勧められている。また、検査は熟練した医師が行 う必要がある力 熟練医はいまだとても不足している。
[0004] このように従来の方法では対象者の負担が大きぐ検査に熟練を要していた。この ため、検査間隔を適切に判断できる指標がきわめて待たれて 、る。
[0005] また、特に大腸癌の罹患率は急激に増力!]しているが、罹患率の増加は早期発見、 早期治療では抑制できず、発癌を予防することが重要である。内視鏡検査にて異常 を認めた場合、生検が行われ、癌や前癌病変の存在の確認は可能である力 将来 の発癌率を知ることはできない。また、発癌予防はリスクの高い人に行うことが、効率 的にも、倫理的にも望ましいが、リスクの適切な指標はこれまでほとんど見つ力つてい ない。
[0006] 更に、発癌の予防や治療において、生活習慣変容や発癌予防物質の内服などに より発癌の発生リスクが下がった力否かを確認する指標があれば、効果的な発癌予 防法の開発や、効率のよい発癌予防の実践が可能となる。しかし、いまだ、そのよう な指標はほとんど見つ力つて ヽな 、。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、生物学的指標を利用して、腫瘍発生リスクを高い精度で把握し、腫瘍の 早期発見のための検査、或いは腫瘍の予防又は治療を、効率よく適切に実施可能と する解析手段を得ることを主な課題とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者は、上記課題を達成することを主な目的として鋭意検討を重ねた結果、 特定の遺伝子の発現量を調べ、それらを指標として腫瘍の発生リスクの評価を組み 合わせることにより、腫瘍の発生リスクを高い精度でかつ効率良く解析し得ることを見 出し、更に鋭意検討を重ねて、本発明を完成するに至った。
[0009] 即ち、本発明は下記の事項に関する。
[0010] 項 1： (a)検体の非腫瘍部から採取した被検組織における細胞増殖促進遺伝子群 、細胞増殖抑制遺伝子群、アポトーシス促進遺伝子群、アポトーシス抑制遺伝子群、 細胞分化促進遺伝子群、及び、細胞分化抑制遺伝子群から選ばれる 2以上の指標 遺伝子の発現量を測定する工程、
(b)前記被検組織におけるハウスキーピング遺伝子の発現量を測定する工程、
(c)工程 (a)で得られる各指標遺伝子の発現量の測定値を、工程 (b)で得られるハ ウスキーピング遺伝子の発現量の測定値で補正した値を、各指標遺伝子に関する腫 瘍発生指標とする工程、
(d)工程 (c)で得られる各指標遺伝子の腫瘍発生指標を、予め設定される基準値と 比較して評価する工程、及び、 (e)工程 (d)で得られる各指標遺伝子の評価を 2以上組み合わせる工程を有し、 前記細胞増殖促進遺伝子群が、 PCNA (proliferating cell nuclear antigen)遺伝子、 CyclinDl遺伝子、 cdk2(cyclin dependent kinase- 2)遺伝子、フアルネシルトランスフエ ラーゼ (farnesyl transferase)遺伝子、 Ki67遺伝子、及び、 EGFレセプター (epidermal growth factor receptor)遺伝子を む遺 is子群であり、
前記細胞増殖抑制遺伝子群が、 TGF β (transforming growth factor β )遺伝子、 ρ2 1遺伝子、及び ΙΝΚ4遺伝子を含む遺伝子群であり、
前記アポトーシス促進遺伝子群が、 Bax遺伝子、カスパーゼ（caspase)遺伝子、及 び Fas遺伝子を含む群であり、
前記アポトーシス抑制遺伝子群力 Bd-2遺伝子、 IAP遺伝子、及びサバイビン (sur vivin)遺伝子を含む群であり
前記細胞分化促進遺伝子群が、ムチン遺伝子、 Cdx-1遺伝子、腸型アルカリフォス ファターゼ（intestinal alkaline phosphatase)遺伝子、及び CD10遺伝子を含む群、及 び、
前記分ィ匕抑制遺伝子群が、 Cdx-2遺伝子を含む群である腫瘍発生リスクの解析方 法。
項 2 :工程 (d)が、下記
(d— 1)指標遺伝子の発現量が多!ヽ場合を危険因子（ + )発現量が少な!/ヽ場合を 危険因子（一）とし、腫瘍発生有を結果（+ )発生無を結果（一）として、発現量の感度 と特異度の和が最も大きくなる値を、該遺伝子に関する基準値とし、
(d— 2)各指標遺伝子に関して、工程 (c)における該遺伝子の腫瘍発生指標とェ 程 (d— 1)における該遺伝子の基準値とを比較し、
(d— 3a)指標遺伝子が細胞増殖促進遺伝子、細胞分化抑制遺伝子、又はアポト 一シス抑制遺伝子である場合、腫瘍発生指標が基準値以上の場合を発生リスク上昇 因子、基準値未満の場合を発生リスク低下因子と評価し、
(d— 3b)指標遺伝子が細胞増殖抑制遺伝子、細胞分化促進遺伝子、又はアポト 一シス促進遺伝子の場合、腫瘍発生指標が基準値未満の場合を発生リスク上昇因 子、基準値以上の場合を発生リスク低下因子と評価する工程 である項 1記載の方法。
[0012] 換言すると、
(a)検体の非腫瘍部から採取した被検組織における細胞増殖促進遺伝子群、細胞 増殖抑制遺伝子群、アポトーシス促進遺伝子群、アポトーシス抑制遺伝子群、細胞 分化促進遺伝子群、及び、細胞分化抑制遺伝子群から選ばれる 2以上の指標遺伝 子の発現量を測定する工程、
(b)前記被検組織におけるハウスキーピング遺伝子の発現量を測定する工程、
(c)工程 (a)で得られる各指標遺伝子の発現量の測定値を、工程 (b)で得られるハ ウスキーピング遺伝子の発現量の測定値で補正した値を、各指標遺伝子に関する腫 瘍発生指標とする工程、
(d— 1)指標遺伝子の発現量が多!ヽ場合を危険因子（ + )発現量が少な!/ヽ場合を 危険因子（一）とし、腫瘍発生有を結果（+ )腫瘍発生無を結果（―）として、発現量の 感度と特異度の和が最も大きくなる値を、該指標遺伝子に関する基準値とし、
(d— 2)各指標遺伝子に関して、工程 (c)における該遺伝子の腫瘍発生指標とェ 程 (d— 1)における該遺伝子の基準値とを比較し、
(d— 3a)指標遺伝子が細胞増殖促進遺伝子、細胞分化抑制遺伝子、アポトーシス 抑制遺伝子である場合、腫瘍発生指標が基準値以上の場合を発生リスク上昇因子、 基準値未満の場合を発生リスク低下因子と評価し、
(d— 3b)指標遺伝子が細胞増殖抑制遺伝子、細胞分化促進遺伝子、アポトーシス 促進遺伝子の場合、腫瘍発生指標が基準値未満の場合を発生リスク上昇因子、基 準値以上の場合を発生リスク低下因子と評価し、
(e)工程 (d— 3a)及び (d— 3b)で得られる各指標遺伝子の評価を 2以上組み合わ せる工程を有する、項 1に記載の方法。
[0013] 項 3 :工程 (d)が、下記
(d— 1)指標遺伝子の発現量の多少により数段階に分けて複数の基準値を設定し
(d— 2)各指標遺伝子に関し、工程 (c)における腫瘍発生指標を工程 (d—1)にお ける基準値と比較して発現量の多いものを高得点として点数を付し、 (d— 3a)指標遺伝子が細胞増殖促進遺伝子、細胞分化抑制遺伝子、又はアポト 一シス抑制遺伝子である場合、 (d- 2)の点数は加算因子と評価し、
(d— 3b)指標遺伝子が細胞増殖抑制遺伝子、細胞分化促進遺伝子、又はアポト 一シス促進遺伝子の場合、 (d- 2)の点数は弓 I算因子と評価する工程、
である項 1に記載の評価方法。
[0014] 換言すると、
(a)検体の非腫瘍部から採取した被検組織における細胞増殖促進遺伝子群、細胞 増殖抑制遺伝子群、アポトーシス促進遺伝子群、アポトーシス抑制遺伝子群、細胞 分化促進遺伝子群、及び、細胞分化抑制遺伝子群から選ばれる 2以上の指標遺伝 子の発現量を測定する工程、
(b)前記被検組織におけるハウスキーピング遺伝子の発現量を測定する工程、
(c)工程 (a)で得られる各指標遺伝子の発現量の測定値を、工程 (b)で得られるハ ウスキーピング遺伝子の発現量の測定値で補正した値を、各指標遺伝子に関する腫 瘍発生指標とする工程、
(d— 1)指標遺伝子の発現量の多少により数段階に分けて複数の基準値を設定し
(d— 2)各指標遺伝子に関し、工程 (c)における腫瘍発生指標を工程 (d—1)にお ける基準値と比較して発現量の多いものを高得点として点数を付し、
(d— 3a)指標遺伝子が細胞増殖促進遺伝子、細胞分化抑制遺伝子、又はアポト 一シス抑制遺伝子である場合、 (d- 2)の点数は加算因子と評価し、
(d— 3b)指標遺伝子が細胞増殖抑制遺伝子、細胞分化促進遺伝子、又はアポト 一シス促進遺伝子の場合、 (d- 2)の点数は弓 I算因子と評価し、
(e)工程 (d— 3a)で得られる評価を加算及び (d— 3b)で得られる評価を減算するこ とにより、各指標遺伝子の評価を 2以上組み合わせてスコア化する工程を有する項 1 に記載の方法。
[0015] 項 4 :検体の非腫瘍部が正常大腸粘膜であり、大腸における腫瘍発生リスクの解析 方法である項 1〜3のいずれかに記載の方法。
[0016] 換言すると、工程 (a)が、正常大腸粘膜から採取した被検組織における細胞増殖 促進遺伝子群、細胞増殖抑制遺伝子群、アポトーシス促進遺伝子群、アポトーシス 抑制遺伝子群、細胞分化促進遺伝子群、及び、細胞分化抑制遺伝子群から選ばれ る 2以上の指標遺伝子の発現量を測定する工程である、項 1〜3のいずれかに記載 の大腸腫瘍発生リスクの解析方法。
[0017] 項 5：ハウスキーピング遺伝子力 GADPH (glyceralde-hydo- 3- phosphate dehydrog enase)遺伝子である項 1〜4の!、ずれかに記載の方法。
[0018] 換言すると、工程 (b)力 同組織における GADPH遺伝子の発現量を測定する工程 である項 1〜4のいずれかに記載の方法。
[0019] 項 6：指標遺伝子が、細胞増殖促進遺伝子群及びアポトーシス促進遺伝子群から 選ばれる 2以上の指標遺伝子である項 1〜5のいずれかに記載の方法。
[0020] 換言すると、工程 (a)が、検体の非腫瘍部から採取した被検組織における細胞増 殖促進遺伝子群及びアポトーシス促進遺伝子群から選ばれる 2以上の指標遺伝子 の発現量を測定する工程である項 1〜5のいずれかに記載の方法。
[0021] 好ま ヽ態様の例は、工程 (a)が、検体の非腫瘍部から採取した被検組織における
、細胞増殖促進遺伝子群から選ばれる 2以上の遺伝子及びアポトーシス促進遺伝子 群力 選ばれる 1以上の遺伝子力 なる指標遺伝子の発現量を測定する工程である 項 1〜5のいずれかに記載の方法。
[0022] 項 7：細胞増殖促進遺伝子群が PCNA遺伝子及び CyclinDl遺伝子力 なる群であ る項 1〜6のいずれかに記載の方法。
[0023] 項 8：アポトーシス促進遺伝子群力 Bax遺伝子力 なる群である項 1〜7の!、ずれ かに記載の方法。
[0024] 好ま ヽ態様の例は、工程 (a)が、検体の非腫瘍部から採取した被検組織における 細胞増殖促進遺伝子群及びアポトーシス促進遺伝子群から選ばれる 2以上の指標 遺伝子の発現量を測定する工程であり、細胞増殖促進遺伝子群が PCNA遺伝子及 び CyclinDl遺伝子力 なる群であり、アポトーシス促進遺伝子群が Bax遺伝子力もな る群である項 1〜7のいずれかに記載の方法。
[0025] 換言すると、工程 (a)力 検体の非腫瘍部から採取した被検組織におけるから PCN A遺伝子、 CyclinDl遺伝子及び Bax遺伝子からなる群から選ばれる 2以上の指標遺 伝子の発現量を測定する工程である項 1〜7のいずれかに記載の方法。
[0026] 以下、本発明について、更に詳細に説明する。
[0027] 尚、本明細書において、腫瘍とは、癌及び前癌病変である腺腫等の新生物を指す [0028] 1.対象
本発明の腫瘍発生リスクの解析方法は、検体の非腫瘍部から採取した被検組織を 用いて行われる。
[0029] 非腫瘍部とは、腫瘍でな!ヽ部分、すなわち、癌又は腺腫でな ヽ部分を!ヽぅ。
[0030] 非腫瘍部は、好ましくは、肉眼的に正常に見える組織である。
[0031] 被検組織は、遺伝子の発現量が測定し得るものであれば、その種類は特に限定さ れず、発癌母地となるすべての細胞や組織が含まれる。具体的には、粘膜細胞が挙 げられる。
[0032] 被検組織の種類は、解析対象となる腫瘍、癌や腺腫の種類に応じて適宜設定する ことができる。
[0033] 例えば、大腸における腫瘍の発生リスクの解析方法とする場合には、被検組織は、 正常大腸粘膜から採取した細胞とすることができる。
[0034] 被検組織の採取は、生検として用いられている公知の方法に従って、適宜行うこと ができる。
[0035] 2.指 遣伝子
本発明において、指標に用いる遺伝子は、細胞増殖、アポトーシス及び Z又は細 胞分化との関連が考えられる遺伝子である。
[0036] 換言すると、本発明にお!/ヽて、指標遺伝子とは、細胞増殖促進遺伝子群、細胞増 殖抑制遺伝子群、アポトーシス促進遺伝子群、アポトーシス抑制遺伝子群、細胞分 化促進遺伝子群、及び Z又は細胞分化抑制遺伝子群に属する遺伝子である。
[0037] 尚、本明細書において、群とは、 1又は複数の遺伝子の集まりの単位を意味する。
[0038] 2- 1.細朐増殖促進 制遣伝 群
細胞増殖促進遺伝子群には、 PCNA(proliferating cell nuclear antigen;増殖細胞核 抗原)遺伝子、 CyclinDl遺伝子、 cdk2 (cyclin dependent kinase- 2;サイクリン依存性キ ナーゼ 2)遺伝子、フアルネシルトランスフェラーゼ（farnesyl transferase)遺伝子、 Ki67 遺伝子、及び EGFレセプター (epidermal growth factor receptor;上皮増殖因子受容 体)遺伝子等が含まれる。
[0039] 細胞増殖促進遺伝子群は、細胞増殖を促進させる機能を有する公知の遺伝子か ら適宜選択して設定される群である。
[0040] 例えば、 CyclinDl遺伝子は、細胞周期の制御に関連し増殖シグナルにより発現が 誘導される遺伝子である。また、 PCNA遺伝子は、増殖細胞の核に見られる抗原をコ ードする遺伝子として発見され、 DNAの複製や細胞周期の進行に関与する遺伝子で ある。
[0041] 好ま ヽ態様の一つにお 、て、細胞増殖促進遺伝子は、 PCNA遺伝子及び Cyclin
D1遺伝子力 なる群である。
[0042] 細胞増殖抑制遺伝子群には、 TGF β (transforming growth factor β；トランスフォー ミング増殖因子 遺伝子、 Ρ21遺伝子、及び ΙΝΚ4遺伝子等が含まれる。細胞増殖抑 制遺伝子群は、細胞増殖を促進させる機能を有する公知の遺伝子から適宜選択し て設定される群である。
[0043] 2- 2.アポトーシス 谁 制遣伝子群
アポトーシス促進遺伝子群には、 Bax遺伝子、カスパーゼ（caspase)遺伝子及び Fas 遺伝子等が含まれる。
[0044] アポトーシス促進遺伝子群は、アポトーシスを促進させる機能を有する公知の遺伝 子カゝら適宜選択して設定される群である。例えば、 Bax遺伝子はアポトーシスを促進 するとともに、 Be卜 2のアポトーシス抑制活性を阻害する遺伝子である。
[0045] アポトーシス抑制遺伝子群には、 Be卜 2遺伝子、 IAP遺伝子、サバイビン（survivin) 遺伝子等が含まれる。
[0046] アポトーシス抑制遺伝子群は、アポトーシスを抑制させる機能を有する公知の遺伝 子力も適宜選択して設定される群である。例えば、 Bd-2遺伝子は、アポトーシス抑制 活性を有する遺伝子である。
[0047] 2- 3.細朐分化促進 制遣伝 群
細胞分化促進遺伝子群には、ムチン遺伝子、 Cdx-1遺伝子、腸型アルカリフォスフ ァターゼ（intestinal alkaline phosphatase)遺伝子、 CD10遺伝子等が含まれる。
[0048] 細胞分化促進遺伝子群は、細胞分化を促進させる機能を有する公知の遺伝子か ら適宜選択して設定される群である。
[0049] 細胞分化抑制遺伝子群には、 Cdx-2遺伝子等が含まれる。
[0050] 細胞分化抑制遺伝子群は、細胞分化を促進させる機能を有する公知の遺伝子か ら適宜選択して設定される群である。
[0051] 3.ハウスキーピング遣伝子
ノ、ウスキーピング遺伝子とは、細胞の一般的な機能に必要なタンパク質をコードし、 どの細胞でも一定量が常に構成的に発現される遺伝子を意味する。
[0052] ハウスキーピング遺伝子の種類は適宜設定し得る力 例えば、 GAPDH (glyceraldeh yde- 3- phosphate dehydrogenase) , β -了クチン、 β 2-マイクログロブリン、 HPRT 1 (h ypoxanthine phosphonbosyltransferase 1)など; 0 けられる。
[0053] 4.遣伝早の 量の沏 I定方法
指標遺伝子及びハウスキーピング遺伝子の発現量の測定のための方法、手法等も 何等限定なぐリアルタイム PCR法 (RT— PCR)を初めとして、公知の各種方法をいず れち採用することができる。
[0054] より具体的には、遺伝子の発現量の測定は、被検組織における遺伝子の転写物を 検出する方法、同翻訳物を検出する方法等により行うことができる。
[0055] 転写物を検出する方法は、遺伝子の転写物である mRNAを検出することにより同遺 伝子の発現量を測定するものであり、例えば、 RT— PCRやノーザンブロット解析、 RT
-LAMP法、 in situハイブリダィゼーシヨン法、その他の各種方法を用いることができる
[0056] 翻訳物を検出する方法は、遺伝子の翻訳物であるタンパク質を検出することにより 同遺伝子の発現量を測定するものであり、例えば、タンパク質に対する特異抗体を採 用するウェスタンプロット解析、免疫組織化学染色等の免疫学的測定法等により行い 得る。
[0057] 5. 11重瘍発牛.指標
腫瘍発生指標は、指標遺伝子の発現量の測定値を、ハウスキーピング遺伝子の発 現量の測定値で補正することにより得られる。
[0058] 例えば、遺伝子の発現量を PCRで測定する場合、各遺伝子の腫瘍発生指標は、 P
CRサイクル数 threshold cycle (Ct)を用いて、ハウスキーピング遺伝子の Ctから、指標 遺伝子の Ctを差し引き、 ACtとして、表すことができる。
[0059] 換言すると、 ACtは、下記式により表することができる。
[0060] ACt=ハウスキーピング遺伝子の Ct 指標遺伝子の Ct
各指標遺伝子に関して得られる腫瘍発生指標は、腫瘍発生の有無に関連して予 め設定された基準値と比較することにより、腫瘍発生リスクを評価するための適切な 因子として用い得る。
[0061] 6.評価
6- 1. ィ直の
本発明で用いる基準値は、腫瘍発生の有無と、遺伝子の発現量を因子として、適 宜設定し得る。
[0062] 例えば、好ま 、態様の一つにお 、て、基準値は、指標遺伝子の発現量の高低を 危険因子とし、また、腫瘍の発生の有無を結果 (エンドポイント）として、それらの関係 を調べることにより、算出することができる。
[0063] 具体的に、好ましい態様の一つにおいては、指標遺伝子の発現量が多い場合を危 険因子（+ )発現量が少ない場合を危険因子（一）とし、腫瘍発生有を結果（+ )、腫 瘍発生無を結果（一）として、発現量の感度と特異度の和が最も大きくなる値を、該指 標遺伝子に関する基準値とすることが挙げられる。
[0064] ここで、感度とは、発現量により腫瘍発生高値を示す因子が、腫瘍発生ありを正しく 判定する割合を意味する。
[0065] 特異度とは、発現量により腫瘍発生低値を示す因子が、腫瘍発生なしを正しく判定 する割合を意味する。
[0066] このようにして求められる場合の基準値は、ハウスキーピング遺伝子の種類によつ て適宜設定し得る。
[0067] また好ましい態様の一つにおいて、基準値は、腫瘍発生程度により数段階に分け て設定することができる。 [0068] 6- 2.腈瘍発牛.指標 某準値の比較、及び各指標遺伝子についての腈瘍発牛.に する ¾平
上記で求めた腫瘍発生指標と、基準値とを比較することにより、各指標遺伝子に関 する腫瘍発生との関係を評価することができる。
[0069] 比較方法及び評価方法は、基準値の設定方法等に応じて適宜設定し得る。
[0070] 具体的には、以下の態様が考えられる。
[0071] (態様 1)
指標遺伝子の発現量が多 ヽ場合を危険因子（ + )少な ヽ場合を危険因子（一）とし 、腫瘍発生有を結果（+ )、腫瘍発生無を結果（一）として、発現量の感度と特異度の 和が最も大きくなる値を各指標遺伝子に関する基準値として算出する。
[0072] 次いで、得られる基準値と前述の方法で求められる腫瘍発生指標とを、指標遺伝 子ごとに、比較する。
[0073] 比較に際し、指標遺伝子が細胞増殖促進遺伝子、細胞分化抑制遺伝子、又はァ ポトーシス抑制遺伝子である場合には、腫瘍発生指標が基準値以上の場合を発生リ スク上昇因子、基準値未満の場合を発生リスク低下因子と評価する。
[0074] また、指標遺伝子が細胞増殖抑制遺伝子、細胞分化促進遺伝子、又はアポトーシ ス促進遺伝子の場合、腫瘍発生指標が基準値未満の場合を発生リスク上昇因子、 基準値以上の場合を発生リスク低下因子と評価する。
[0075] より具体的に、例えば、 CyclinDl遺伝子については、基準値が 2.51となる場合、 △Ctがー 2.51未満であれば発生リスク低下因子、 2.51以上であれば発生リスク上 昇因子と評価する。
[0076] また、例えば、 PCNA遺伝子について、基準値が 1.27となる場合、 ACtがー 1.27 未満であれば発生リスク低下因子、 1.27以上であれば発生リスク上昇因子と評価 する。
[0077] Bax遺伝子については、基準値が 2.30である場合、 ACtがー 2.30未満であれば 発生リスク上昇因子、 2.30以上であれば発生リスク低下因子と評価する。
[0078] 各指標遺伝子について得られる発生リスクの上昇 '低下に関する評価を 2以上組み 合わせて、癌の発生リスクを解析することができる。例えば、上昇因子が多ぐ低下因 子が少な!/、ほど腫瘍発生リスクが高 、傾向にあると解析することができる。反対に低 下因子が少なぐ上昇因子が多いほど、腫瘍発生リスクが低い傾向にあると解析する ことができる。
[0079] (態様 2)
指標遺伝子の発現量の程度と腫瘍発生程度の関係より複数の群に分け、最も低発 現である場合を 1とし、発現量が増加する群になるにつれ、 2、 3、 4と順次番号を付け る。
[0080] 比較に際し、指標遺伝子が細胞増殖促進遺伝子、細胞分化抑制遺伝子、又はァ ポトーシス抑制遺伝子である場合には、付した番号を加算、指標遺伝子が細胞増殖 抑制遺伝子、細胞分化促進遺伝子、アポトーシス促進遺伝子の場合には、付した番 号を引算してスコアとする。このスコアを用いて癌の発生リスクを解析することができる 。例えば、スコアが高いほど、腫瘍発生リスクが高い傾向にあると解析することができ る。反対にスコアが低いほど、腫瘍発生リスクが低い傾向にあると解析することができ る。
[0081] 7. 2以卜.の評価の組み合わせ
本発明にお 、ては、上記の要領で得られる各指標遺伝子の評価を 2以上組み合わ せて、腫瘍の発生リスクを解析する。
[0082] 例えば、指標遺伝子の評価を上昇因子と低下因子の 2群に分けて、それらを組み 合わせて解析を行う。また、例えば、指標遺伝子の評価を点数により評価した場合に は、それらの点数を組み合わせてスコア化し、得られるスコアで、発生リスクの程度を 解析する。
[0083] 2以上の評価を組み合わせることにより、腫瘍の発生リスクに対する解析の精度が 顕著に高くなる。
[0084] 組み合わせは、同じ群力 選ばれる 2以上の指標遺伝子に関する評価の組み合わ せであってもよぐ一群力 選ばれる 1以上の指標遺伝子と他の一群力 選ばれる 1 以上の指標遺伝子の評価の組み合わせであってもよい。
[0085] 具体的に、細胞増殖促進遺伝子群から選ばれる 2以上の指標遺伝子による評価の 組み合わせであってもよぐ細胞増殖促進遺伝子群力 選ばれる 1以上の指標遺伝 子とアポトーシス促進遺伝子群力 選ばれる 1以上の指標遺伝子による評価の組み 合わせであってもよい。
[0086] より具体的には、 CyclinDl遺伝子による評価と PCNA遺伝子の評価の組み合わせ であってもよぐ PCNA遺伝子による評価と Bax遺伝子による評価の組み合わせであつ てもよい。また、 CyclinDl遺伝子、 PCNA遺伝子、及び Bax遺伝子による評価の組み 合わせであってもよい。
[0087] 特に、該組み合わせは、同じ群から選ばれる 2以上の指標遺伝子による評価を含 んでいることが好ましい。例えば、細胞増殖促進遺伝子群から選ばれる 2以上の遺伝 子の評価に、他の群、例えば、アポトーシス促進遺伝子群から選ばれる 1以上の遺伝 子の評価を組み合わせて、腫瘍の発生リスク評価を行うことが好まし 、。
[0088] 同じ群に属する遺伝子の評価を 2以上含む組み合わせによる解析を行うことによつ て、腫瘍発生リスクの解析精度を顕著に高めることができる。
[0089] 指標遺伝子の組み合わせによる、腫瘍の発生リスクの解析は、例えば、以下のよう に行うことができる。
[0090] (解析例 1)
増殖丄 ·アポトーシス† · ·効果的な予防処置をした状態
増殖レアポトーシスレ '粘膜が落ち着いている状態
増殖† ·アポトーシス† · ·粘膜増殖亢進状態 (たとえば炎症など）
増殖 ΐ 'アポトーシス I · '最も発癌の危険性が高い状態
また、同じ群力 選ばれる 2以上の指標遺伝子の評価の組み合わせを含む、腫瘍 の発生リスクの解析は、例えば、以下のように行うことができる。
[0091] (解析例 2)
増殖 ·増殖 ·アポトーシス† · ·効果的な予防処置をした状態
増殖 ΐ ·増殖丄 'アポトーシス† · · (中間的な状態）
増殖丄 ·増殖 ΐ 'アポトーシス† · · (中間的な状態）
増殖レ増殖丄 'アポトーシス丄 · ·細胞動態が落ち着いている状態
増殖 ΐ ·増殖丄 'アポトーシス I · · (中間的な状態）
増殖丄 '増殖 ΐ 'アポトーシス I · · (中間的な状態） 増殖† ·増殖† 'アポトーシス† ·，粘膜細胞増殖亢進状態
増殖† ·増殖† 'アポトーシス I · '最も発癌の危険が高い状態
尚、解析例 1、 2において、増殖丄は、細胞増殖促進遺伝子の腫瘍発生指標が基 準値未満の場合 (発生リスク低下因子)であることを示す。増殖 ΐは、細胞増殖促進 遺伝子の腫瘍発生指標が基準値以上の場合 (発生リスク上昇因子)であることを示す
[0092] また、アポトーシス†は、アポトーシス促進遺伝子の腫瘍発生指標が基準値以上の 場合 (発生リスク低下因子)であることを示す。アポトーシス Iは、アポトーシス促進遺 伝子の腫瘍発生指標が基準値未満の場合 (発生リスク上昇因子)であることを示す。
[0093] このように、遺伝子の発現量に基づく評価を組み合わせることにより、高い精度で腫 瘍発生リスクの解析を行うことが可能となる。
[0094] 本発明の解析方法においては、本発明の効果を奏する範囲内であれば、上記指 標遺伝子以外の他の遺伝子に関する評価を適宜加えて、腫瘍発生リスクの解析を行 うこともできる。更に、本発明の効果を奏する範囲内であれば、環境因子や、対象者 の年齢、性別又は病歴等の他の要因を含めて、解析を行うこともできる。
[0095] 8. fl重瘍 牛リスク解析妝びにその禾 II用
本発明の方法は、腫瘍又は癌の早期発見のための適切な検査間隔、検査方法の 設定に利用することが可能である。また得られる解析結果に基づき、癌予防のための 指導を行ったり、早い段階で対策や治療方針を固めたりすることができる。
[0096] 例えば、本発明により得られる腫瘍の発生リスクの解析結果に応じて、発生リスクの 高い人では検査間隔を短ぐ発生リスクの低い人では検査間隔を長くして、対象者に 適した検査間隔を設定することができる。更に、発生リスクが高い場合には、検査間 隔を短くするだけではなぐ生活習慣変容や発癌予防剤の内服などにより積極的な 発癌予防を行うことができる。
[0097] また、発生リスクが低い場合には、癌に対する不安を軽減させることができ、対象者 への有用な情報の提供手段としても利用できる。
[0098] また、発癌予防は、発生リスクの高い人に行うことが、効率的にも、倫理的にも望ま しいが、適切な対象者に効率的な予防を実践することが可能になるため、検査対象 者の設定にも利用可能である。
[0099] 更に、本発明の方法を、効率的な発癌予防法の開発や、発癌予防の実践に利用 することも可能である。例えば、本発明の方法を、生活習慣変容や発癌予防物質の 内服などにより発癌の発生リスクが下がった力否かの確認に利用することもできる。
[0100] 本発明の腫瘍発生リスクの解析方法は、大腸癌だけでなぐ食道癌、胃癌、肝癌、 膝癌、前立腺癌、肺癌、喉頭咽頭癌、乳癌などの固形癌で応用可能である。また、 白血病などの血液腫瘍にも適用し得る。
具体的には、大腸癌、胃癌、肝癌などの細胞採取が容易な臓器での発生リスクの解 析方法として好適に利用し得る。
[0101] 特に、本発明の解析方法は、大腸癌の発生リスクの解析方法として、好適に利用し 得る。
発明の効果
[0102] 本発明により、腫瘍の発生リスク、特に大腸腫瘍の発生リスクを、高い精度で適切に 評価し得る方法が提供される。
[0103] 本発明は、 2つ以上の指標を組み合わせることにより、腫瘍の発生リスクを高い精度 で解析することを可能にして 、る。
[0104] 特に、本発明においては、同様の機能を示す指標、例えば同じ細胞増殖促進に関 する指標であっても、それらを組み合わせることにより、腫瘍発生リスクの解析精度が
、顕著に高められることが明ら力となった。
[0105] 更に、本発明においては、指標を評価付けして組み合わせることによって、より解析 精度が高められることも明らかとなった。
[0106] 本発明により、腫瘍発生リスクの適切な把握が可能となることで、従来、頻繁に行う ことを要していた早期癌発見のための検査を、適切な間隔で、適切な対象者に実施 することが可能となる。具体的に、発生リスクの高い人では検査の間隔を短ぐリスク の低い人では間隔を長くすることにより、効率のよい検査の実施が可能となる。
[0107] これにより、検査対象者の苦痛や危険を軽減することができ、検査のための多大な コストや時間を低減することもできる。
[0108] 更に、リスクの程度が分力ることにより、リスクが低い場合には、癌の心配を軽減させ ることができる。また、リスクが高い場合には、検査間隔を短くするだけではなぐ生活 習慣変容や発癌予防剤の内服などにより積極的な発癌予防を行うことも可能となる。
[0109] また、発癌予防は、発生リスクの高い人に行うことが、効率的にも、倫理的にも望ま しいが、発生リスクが把握されることで、適当な対象者に効率的な発癌予防を実践す ることが可能になる。
[0110] 更に、従来の方法では、検査に詳細な検討を要していたが、本発明によれば、精 度の高い解析結果を、容易に得ることが可能となる。
[0111] さらに、本発明を用いれば、生活習慣変容や発癌予防物質の内服などによって発 癌の発生リスクが下がった力否かを確認することもでき、発癌予防方法の効率的な開 発や、発癌予防や治療の効果的な実践に役立てることもできる。
[0112] このように本発明は、腫瘍発生リスクを高い精度で適切に把握し得る手段を提供す るものであり、癌の予防又は早期治療、並びに罹患率の低下に大きく貢献し得るもの である。
図面の簡単な説明
[0113] [図 l]Cyclin Dl遺伝子発現量の測定値に基づく ROC曲線を示す図面である。
[図 2]PCNA遺伝子発現量の測定値に基づく ROC曲線を示す図面である。
[図 3]Bax遺伝子発現量の測定値に基づく ROC曲線である。
[図 4]Cyclin Dl遺伝子、 PCNA遺伝子及び Bax遺伝子の発現量の測定値を組み合わ せた値に基づく ROC曲線である。
[図 5]CyclinDl遺伝子と PCNA遺伝子の相関を調べた図面である。
[図 6]PCNA遺伝子と Bax遺伝子との相関を調べた図面である。
[図 7]CyclinDl遺伝子と Bax遺伝子との相関を調べた図面である。
[図 8]CyclinDl遺伝子、 PCNA遺伝子及び Bax遺伝子の評価を組み合わせ、腫瘍発 生との関連を調べた結果を示す図面である。換言すると、中等度異型以上の腺腫の 発生の有無に関する、 CyclinDl遺伝子、 PCNA遺伝子及び Bax遺伝子の評価の組合 せによる相対危険度を示す図面である。
発明を実施するための最良の形態
[0114] 以下、本発明をより具体的に説明するために実施例を示す力 本発明は実施例に 限定されることはない。
実施例 1
[0115] 1.針象
大阪府立成人病センターにて 1993年から 1997年までに、内視鏡的に大腸腫瘍の摘 出を受け、大腸癌予防臨床試験に参加した患者の一部を用いて行った。
[0116] 臨床試験参加者は、臨床試験参加時 40歳から 69歳、全大腸が観察されていること 、組織学的に診断された大腸腺腫 (腺腫及び Z又は早期がん)を 2個以上持ち、それ らをすべて切除されていること、腸管切除（虫垂切除は除く）の既往歴がないこと、現 在がんを持って 、な 、こと、これらすベての条件を満たす患者であった。
[0117] 更にこれらの臨床試験に参加した者の内、 4年目の内視鏡検査の時に、 S状結腸粘 膜の採取についての研究の説明を受けて同意を得た者を今回の検討の対象とした。
[0118] 対象者は、男性 170名、女性 42人、計 212名（平均年齢 55.0 ±0.4歳; 40-66歳）であ つた o
[0119] 2.材料
(a)被舰織
試験終了時である 4年目の大腸内視鏡術施行時に採取された正常大腸粘膜細胞 を材料とした。生検部位は S状結腸 (肛門縁より 20cm口側)で、内視鏡的に病変を認 めない部位より採取し、万一、腫瘍性病変があった場合は、腫瘍性病変より 5cm以上 離れた部位で生検を行った。大腸粘膜は採取されて、直ちに液体窒素にて凍結した のち 80°Cで保存した。
[0120] (b)指標遺伝子
CyclinDl遺 ナ、 Pし NA(proliferating cell nuclear antigen)遺 ナ、及び Bax遺 fc+ を測定対象とした。
[0121] (c)ハウスキーピング遺伝子
ノヽウスキーピング遺伝子は glyceralde-hydo- 3- phosphate dehydregenase (GAPDH) 遺伝子を用いた。
[0122] 3.方法
各遺伝子の発現量の測定は、 mRNA発現のリアルタイム PCR法にて行った。上記方 法にて採取した結腸粘膜細胞カゝら RNAを抽出し、逆転写反応により cDNA (complem entary deoxyribonucleic acid)を合成した後、リアルタイム PCR法により mRNAの定量を 行った。
[0123] (a) RNA柚出と cDNA合成
サンプルに 350 μ 1の TRIzol Reagent (GIBCO BRL,Rockville,U.S.A)をカ卩え、組織を すりつぶし 100 1のクロ口ホルムをカ卩えた後、 lOOOOrpm 4°Cで 5分遠心することにより RNAを抽出した。全 RNA量を 1.5 μ gになるように調製した後 80%エタノールで RNAを 洗浄して乾燥させたものに、 12.5 μ 1の DEPC(diethylpyrocarbonate)処理水で溶解し、 95°Cで 2分間加熱した後に氷冷して RNAの高次構造を壊した後、 10.5 1の逆転写酵 素入りの混合液を添カ卩し、 42°Cで 60分インキュベートした。この混合液は、 4.5 1の 5 X buffer (0.1M DTTを含む）、 1 μ 1の oligo dT(Amarham,Hokkaidou,Japan)、 3 μ 1の 2.5 M dNTP混合液 (TAKARA,Shiga,Japan)、 1 μ 1の Rnasin (Promega,WI,USA)、 1 μ 1の A MV Reverse Transcriptase (Promega.WI ,USA)を含む。
[0124] cDNAを合成した後、 65°C10分間インキュベーションして酵素を完全に失活させた。
[0125] (b)細朐谘着
大腸がん細胞株である HCT- 116は、 DMEM(Nihonseiyaku,Tokyo,Japan) + 10%FB S(fetal bovine serum,Hyclone,Logan,U.S.A)+ペニシリン-ストレプトマイシン（GIBCO B RL,Rockville,U.S.A)を、 25cm2フラスコ (IWAKI,Funabasi,Japan)で 10%CO培養した。
2 この HCT-116細胞より、上記と同様の方法で RNAを抽出し cDNAを合成した。この HC T-116より得られた cDNAを、リアルタイム PCRのスタンダードとした。
(c)リアルタイム PCR (定量 PCR)法
PCR反応液は、 2 X QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen,Tokyo,Japa ^を12.5 μ 1、各種プライマー各 0.25 μ 1ずつ、サンプル cDNAを 1.5 μ 1、 Rnase除去水 を 10.5 μ 1混和し、全量 25 μ 1とした。リアルタイム PCRは、 ΑΒΙ 5700 Sequence Detectio n Systemを用いて、以下のプロトコ一ノレで PCRを行った；
50°C2分、 95°C15分、その後 50サイクルを、 95°C15秒、 60°C45秒、 72°C15秒。
[0126] 内部コントロールとして glyceralde-hydo- 3- phosphate dehydregenase (GAPDH)を用 いた。尚、標準曲線は、 GAPDHと測定したい遺伝子のプレートごとに HCT-116より抽 出した cDNAを希釈したものを測定し、相関係数をみて確認した。希釈系列は、 lOOng 、 33ng、 10ng、 3.3ng、 lngとし 7こ。
[0127] リアルタイム PCR法の評価方法は、 PCR反応に伴い増幅産物が一定量に達すると、 SYBR Greenの蛍光が検出される。この蛍光の立ちあがった時の PCRサイクル数を thr eshold cycle (Ct)といい、この数値で評価を行った。
[0128] 以下の式で、各指標遺伝子について、 ACtを計算した：
△Ct = (GAPDHの Ct値) - (指標遺伝子の Ct値）
得られた ACt値を、各指標遺伝子の腫瘍発生指標とした。
0129] (d) \^
指標遺伝子の測定系確立のため、 NCBI力ら、各指標遺伝子の mRNAの塩基配列 を検索し、その塩基配列をもとにプライマーを設計した。このプライマーと HCT-116よ り得られた cDNAを用いて PCRを行い、特異バンドが検出されることを確認し、その後 HCT-116の cDNAを用いて希釈試験を行い、リアルタイム PCRで濃度依存的に蛍光 を検出できるかを確認し、実際のサンプルの測定を行った。
[0130] (e)統脑析
データは、 StatViewを用いて統計解析を行い、検定方法は Mann-Whitneyの U検定 を用いて有意差検定を行った。
[0131] 4. fl重瘍発牛 旨 値の比較による各指 遣伝子に づく脯瘍発牛評価、 びに み わせの 射
(a)某準値の 出
Cyclin D1遺伝子、 PCNA遺伝子、 Bax遺伝子の各指標遺伝子について、指標遺伝 子の発現量が多 、場合を危険因子（ + )少な!、場合を危険因子（一）とし、中等度異 型以上の腺腫発生の有無をエンドポイントとして、感度、特異度を求め、 ROC曲線を 作図した。
[0132] 各 ROC曲線を図 1〜3に示す。図 1は、 Cyclin D1遺伝子の ROC曲線、図 2は PCNA 遺伝子の ROC曲線、図 3は Bax遺伝子の ROC曲線である。
[0133] また、各指標遺伝子について、感度と特異度の和が最も大きくなる値を、該指標遺 伝子に関する基準値として求めた。 [0134] 基準値は、じ (；1 01遺伝子にっぃてー2.51、 PCNA遺伝子について 1.27、 Bax遺 伝子について 2.30となった。
[0135] また、 Cyclin D1遺伝子の発現量測定値に PCNA遺伝子の発現量測定値を加え、 B axの発現量測定値を引 、た組み合わせ値にっ 、ても ROC曲線を作図した。組み合 わせ値による ROC曲線を図 4に示す。
[0136] また、組み合わせ値の場合についても、感度と特異度の和が最も大きくなる値を、 基準値として求めた。基準値は、—0.26となった。
[0137] 図 1〜4の ROC曲線の比較により示されるように、組み合わせによる感度、特異度は
、指標遺伝子を単独で検討した場合に比して、明らかに改善していた。
[0138] (b) 遣伝子のネ目閗
各指標遺伝子の ACtの分布により、相関を調べた結果を図 5〜図 7に示す。図 5は
、 CyclinDl遺伝子と PCNA遺伝子の相関を調べた図面を示す。図 6は、 PCNA遺伝子 と Bax遺伝子との相関を調べた図面を示す。図 7は、 CyclinDl遺伝子と Bax遺伝子と の相関を調べた図面を示す。
[0139] 図 5、図 6及び図 7の結果において、指標遺伝子の相関は認められなかった。
[0140] 特に図 5に示されるように、同じ細胞増殖促進遺伝子群である CyclinDl遺伝子と PC
NA遺伝子にお ヽても相関が認められな 、ことが明らカとなった。
[0141] (c) fl重瘍発 旨 の による 討
各指標遺伝子につ!、て、上記 3で得られる腫瘍発生指標と上記 4 (a)で得られる基 準値を比較し、腫瘍発生との関連を調べた。また各指標遺伝子の ACtを組み合わせ た場合についても、上記 4 (a)で得られる基準値と比較し、同様の検討を行った。結 果を表 1に示す。尚、表 1における RRは相対危険度 (relative ratio)を示す。
[0142] [表 1] 中等度異型以上の腺腫
発生なし 発生あり RR (95%信頼区間）
Cyc l in Dl発現量
-2. 51未満 70 43 1
-2. 51以上 42 45 1. 36 (0. 9996-1. 85)
PCNA発現量
-1. 27未満 59 35 1
-1. 27以上 54 53 1. 33 (0. 96-1. 84)
Bax発現量
-2. 30以上 46 24 1
-2. 30未満 54 55 1. 47 (1. 01-2. 14) 組み合わせ
- 0. 26未満 63 35 1
-0. 26以上 36 44 1. 54 (1. 11-2. 15)
[0143] 表 1に示されるように、指標を組み合わせて解析を行うことにより、 RRが改善した。
[0144] (d) 2群の組み合わせによる検討
各指標遺伝子について、発生リスク上昇又は低下による評価を行い、それらを組み 合わせて腫瘍発生との関連を調べた。結果を表 2及び図 8に示す。
[0145] 表 2の CYDの欄において、低は、 Cyclin Dl遺伝子の腫瘍発生指標が基準値未満 の場合の評価 (発生リスク低下因子)を、高は、 Cyclin Dl遺伝子の腫瘍発生指標が 基準値以上の場合の評価 (発生リスク上昇因子)を示す。
[0146] PCNAの欄にぉ 、て、低は、 PCNA遺伝子の腫瘍発生指標が基準値未満の場合の 評価 (発生リスク低下因子)を、高は、 PCNA遺伝子の腫瘍発生指標が基準値以上の 場合の評価 (発生リスク上昇因子)を示す。
[0147] Baxの欄において、高は、 Bax遺伝子の腫瘍発生指標が基準値以上の場合の評価
(発生リスク低下因子)を、低は、 Bax遺伝子の腫瘍発生指標が基準値未満の場合の 評価 (発生リスク上昇因子)を示す。
[0148] また、 RRは相対危険度（relative ratio)を示す。
[0149] [表 2] 中等度異型以上の腺腫
低低低 ¾窩高 ¾： S一〈 発生なし 発生あり RR (95%信頼区間)
13 2 0. 47 (0. 12-1 . 88)
^低低高低高低高高： 25 10 1
A 12 6 1. 17 (0. 50- -2. 70)
13 10 1. 52 (0. 75- -3. 07)
≤低低低高高高低圖 1 2 14 1. 88 (1. 00- -3. 55)
1 6 20 1. 94 (1. 07- -3. 54)
7 6 1. 62 (0. 74- -3. 54)
1 1 1 3. 21 (1. 85- -5. 57)
[0150] 表 2及び図 8に示されるように、細胞増殖促進遺伝子とアポトーシス促進遺伝子を 指標遺伝子として全ての指標遺伝子の発現量が低ぐ粘膜の細胞動態が落ち着い ている状況を 1としたとき、アポトーシス促進遺伝子が亢進すると RRが 0.47に減少し、 細胞増殖促進遺伝子が亢進すると RRが 3.21に増加していることがわ力つた。
[0151] 腿
1)上記の検討結果から、 2つ以上の指標を組み合わせることで、解析精度が顕著 に向上することがわ力 た。特に、同じ群に属する 2つの指標を含む解析により、高 い精度が得られることがわ力つた。細胞増殖を示す 2つの指標にはほとんど相関はな ぐそれらに影響を与える因子も別であると考えられる。
[0152] 2)表 2に示されるように、全ての指標遺伝子の発現量が低ぐ細胞動態が落ち着い ている状況を 1としたとき、アポトーシス促進遺伝子が亢進すると腫瘍発生リスクが 0.4 7に減少し、細胞増殖促進遺伝子が亢進すると腫瘍発生リスクが 3.21に増加すること がわかった。これだけ大きな差を見出す検査法は、従来になぐ本発明の解析方法 の有用性が確認できた。
[0153] 3)表 1のように、測定値を単純に加算、引算して組み合わせた値を用いた解析によ り、 RRは確かに改善するが、表 2のように、各指標を理論的に群分けして組み合わせ た解析により、 RRが更に改善することが明ら力となった。

Claims

請求の範囲
[1] (a)検体の非腫瘍部から採取した被検組織における細胞増殖促進遺伝子群、細胞 増殖抑制遺伝子群、アポトーシス促進遺伝子群、アポトーシス抑制遺伝子群、細胞 分化促進遺伝子群、及び、細胞分化抑制遺伝子群から選ばれる 2以上の指標遺伝 子の発現量を測定する工程、
(b)前記被検組織におけるハウスキーピング遺伝子の発現量を測定する工程、
(c)工程 (a)で得られる各指標遺伝子の発現量の測定値を、工程 (b)で得られるハ ウスキーピング遺伝子の発現量の測定値で補正した値を、各指標遺伝子に関する腫 瘍発生指標とする工程、
(d)工程 (c)で得られる各指標遺伝子の腫瘍発生指標を、予め設定される基準値と 比較して評価する工程、及び、
(e)工程 (d)で得られる各指標遺伝子の評価を 2以上組み合わせる工程を有し、 前記細胞増殖促進遺伝子群が、 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)遺伝子、
CyclinDl遺伝子、 cdk2(cyclin dependent kinase- 2)遺伝子、フアルネシルトランスフエ フ' ~~ゼ (farnesyl transferase)遺 、 Ki67遺 is十、及び EGFレセプタ ~~ (epidermal gr owth factor receptor)遺伝子を含む遺伝子群であり、
前記細胞増殖抑制遺伝子群が、 TGF β (transforming growth factor β )遺伝子、 ρ2 1遺伝子、及び ΙΝΚ4遺伝子を含む遺伝子群であり、
前記アポトーシス促進遺伝子群が、 Bax遺伝子、カスパーゼ（caspase)遺伝子、及 び Fas遺伝子を含む群であり、
前記アポトーシス抑制遺伝子群が、 Bd-2遺伝子、 IAP遺伝子、及びサバイビン (sur vivin)遺伝子を含む群であり
前記細胞分化促進遺伝子群が、ムチン遺伝子、 Cdx-1遺伝子、腸型アルカリフォス ファターゼ（intestinal alkaline phosphatase)遺伝子、及び CD10遺伝子を含む群であ り、並びに
前記分化抑制遺伝子群が、 Cdx-2遺伝子を含む群である
腫瘍発生リスクの解析方法。
[2] 工程 (d)が、下記 (d— 1)指標遺伝子の発現量が多!ヽ場合を危険因子（ + )発現量が少な!/ヽ場合を 危険因子（一）とし、腫瘍発生有を結果（+ )腫瘍発生無を結果（―）として、発現量の 感度と特異度の和が最も大きくなる値を、該遺伝子に関する基準値とし、
(d— 2)各指標遺伝子に関して、工程 (c)における該遺伝子の腫瘍発生指標とェ 程 (d— 1)における該遺伝子の基準値とを比較し、
(d— 3a)指標遺伝子が細胞増殖促進遺伝子、細胞分化抑制遺伝子、又はアポト 一シス抑制遺伝子である場合、腫瘍発生指標が基準値以上の場合を発生リスク上昇 因子、基準値未満の場合を発生リスク低下因子と評価し、
(d— 3b)指標遺伝子が細胞増殖抑制遺伝子、細胞分化促進遺伝子、又はアポト 一シス促進遺伝子の場合、腫瘍発生指標が基準値未満の場合を発生リスク上昇因 子、基準値以上の場合を発生リスク低下因子と評価する工程
である請求項 1記載の方法。
[3] 工程 (d)が、下記
(d— 1)指標遺伝子の発現量の多少により数段階に分けて複数の基準値を設定し
(d— 2)各指標遺伝子に関し、工程 (c)における腫瘍発生指標を工程 (d—1)にお ける基準値と比較して発現量の多いものを高得点として点数を付し、
(d— 3a)指標遺伝子が細胞増殖促進遺伝子、細胞分化抑制遺伝子、又はアポト 一シス抑制遺伝子である場合、 (d- 2)の点数は加算因子と評価し、
(d— 3b)指標遺伝子が細胞増殖抑制遺伝子、細胞分化促進遺伝子、又はアポト 一シス促進遺伝子の場合、 (d- 2)の点数は弓 I算因子と評価する工程
である請求項 1に記載の評価方法。
[4] 検体の非腫瘍部が正常大腸粘膜であり、大腸における腫瘍発生リスクの解析方法で ある請求項 1に記載の方法。
[5] ノヽウスキーピング遺伝子力 GADPH (glyceralde—hydo— 3— phosphate dehydrogenase) 遺伝子である請求項 1に記載の方法。
[6] 指標遺伝子が、細胞増殖促進遺伝子群及びアポトーシス促進遺伝子群から選ばれ る 2以上の指標遺伝子である請求項 1に記載の方法。 細胞増殖促進遺伝子群が PCNA遺伝子及び CyclinDl遺伝子力もなる群である請求 項 1に記載の方法。
アポトーシス促進遺伝子群が、 Bax遺伝子力もなる群である請求項 1に記載の方法。
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