JP2004159600A - 癌の診断方法及び癌の診断用キット - Google Patents
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Abstract
【課題】広く癌一般の診断を行うことができる癌の診断方法及び癌の診断用キットを提供するとともに、癌予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができるスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供する。
【解決手段】本発明の癌の診断方法は、被験動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを指標として、前記検体における癌細胞の有無を診断することを特徴とし、本発明のスクリーニング方法は、癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベル低減効果を指標として、候補物質の癌予防・治療効果を判定することを特徴とし、本発明の癌の診断用キット及びスクリーニング用キットは、ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【選択図】 なし
【解決手段】本発明の癌の診断方法は、被験動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを指標として、前記検体における癌細胞の有無を診断することを特徴とし、本発明のスクリーニング方法は、癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベル低減効果を指標として、候補物質の癌予防・治療効果を判定することを特徴とし、本発明の癌の診断用キット及びスクリーニング用キットは、ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌の診断方法及び診断用キット、癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キット、並びに癌の予防・治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料を用いたヒトの癌の診断は、一般的に、血液中に含まれる腫瘍マーカーの測定により行われる。このような腫瘍マーカーとしては、例えば、肝癌のマーカーであるαフェトプロテイン（ＡＦＰ）、大腸癌のマーカーである癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、膵癌マーカーであるＣＡ１９−９、前立腺癌のマーカーである前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等が知られている。また、腫瘍マーカーを検出・定量する代表的な方法としては、それぞれの腫瘍マーカーに対して特異的に反応する抗体を用いた放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等が知られている。
【０００３】
しかしながら、現在使用されている腫瘍マーカーは腫瘍特異性や臓器特異性を有する一方、腫瘍マーカーの存在しない臓器も存在するため、１種類の腫瘍マーカーを単独で用いて広く癌一般の診断を行うことは難しい。
【０００４】
ムチン（ＭＵＣ）は、コアタンパク質に多数のＯ型糖鎖が結合する糖タンパク質で、管及び腺構造を有する組織の上皮細胞に発現している。ムチンファミリー（ＭＵＣファミリー）は、ヒトにおいて現在までに１７種（ＭＵＣ１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５ＡＣ、５Ｂ、６、７、８、９、１１、１２、１３、１５、１６、１７）が同定されており、これらは構造及び機能から大きく分泌型及び膜結合型の二種類に分類されている。
【０００５】
分泌型ムチンのうち、ＭＵＣ２、５ＡＣ、５Ｂ、６はゴブレット細胞等から分泌された後、粘液の主成分となり上皮表面の保護や潤滑剤として機能していると考えられている。また、比較的分子量が小さい分泌型ムチンであるＭＵＣ７、８、９はそれぞれ唾液腺、呼吸器、Ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅから分泌されることが知られている。
【０００６】
一方、膜結合型ＭＵＣファミリーは消化管、呼吸器、尿管等の上皮細胞の管空側に発現していることが知られている。ほぼ全ての管構造を有する組織の上皮細胞及び消化管上皮細胞に高発現するＭＵＣ１が膜結合型ムチンとして同定されて以来、近年さらに多くの膜結合型ムチンが同定され、上皮細胞に発現する膜結合型ムチンは大きなファミリーを形成していることが明らかになってきた。多くの糖鎖が結合しかつ高分子量である膜結合型ムチンは上皮細胞の管空側に高発現することで、有害な物質や微生物と上皮細胞との接触を防ぐと共に、他の分子との相互作用を通じ生理機能の調節等に関与していると考えられている。また、炎症性大腸炎や嚢胞性線維症等の呼吸器疾患においてムチンの発現量が変化していることからもムチンが恒常性維持に関与していると推定されている。
【０００７】
また、ムチンと癌細胞との関与に関しても報告されている。ＭＵＣ１は乳癌、大腸癌などの癌細胞において発現が亢進しているとともに、悪性度の増強との関連が示唆され、腫瘍マーカーとして注目されている。さらに、最近になり、卵巣癌の腫瘍マーカーとして用いられているＣＡ１２５の遺伝子単離の結果、その分子構造よりＭＵＣファミリーに属することが明らかになった。一方、癌化により発現が低下するものとしてはＭＵＣ２、３、１１、１２等が報告されている。以上のことより、多くのムチンが癌細胞において発現が亢進又は低下していることが知られている。従って、それらムチンの発現量を検出することである種の癌の診断に有用であると考えられている。
【０００８】
さらに、各種ＭＵＣタンパク質の発現量又は発現制御と発癌又は癌細胞の増殖との関係も報告されている。癌細胞に発現しているＭＵＣ１の細胞内領域に存在するチロシン残基がリン酸化され、Ｇｒｂ２を介してＲａｓの活性化を誘導することや（Ｐａｎｄｅｖ Ｐ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９５． ５５；４０００−４００３）、細胞接着や増殖に関与するβカテニンとも相互作用することが報告されている（Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｍ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７． ２７２；１２４９２−１２４９４， Ｌｉ ＹＱ．ら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９９８． １８；７２１６−７２２４）。また、多くの癌細胞に対して増殖因子として働いていると考えられているＥＧＦ受容体ファミリー分子とＭＵＣ１又はＭＵＣ４とが相互作用することで細胞増殖シグナルを増強することや、癌細胞の転移に関与することが報告されている（Ｐａｔｔｏｎ Ｓ．ら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １９９５． １２４１；４０７−４２３， Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＪＡ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００１． ２７６；１３０５７−１３０６４， Ｋｏｍａｔｓｕ Ｍ．ら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２０００． ８７；４８０−４８６）。
【０００９】
さらに、ＭＵＣ２等の発現の低下と発癌との関係に関して報告されている。ＭＵＣ２ノックアウトマウスにおいては、小腸上皮細胞の細胞増殖が亢進しており、実際に加齢とともに小腸に癌の発生が確認されている（Ｖｅｌｃｉｃｈ Ａ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２． ２９５；１７２６−１７２９）。したがって、ＭＵＣ２は正常な腸上皮細胞の増殖、分化等を制御することで、癌の発生を抑制していると考えられている。
【００１０】
ＭＵＣ１３は特徴的なＯ型糖鎖結合に必須である繰り返し配列をＮ末に有する膜結合型のムチン蛋白として同定された（非特許文献１）。正常組織における発現分布は大腸、小腸等の上皮細胞に高発現しており、大腸癌においてもその発現が確認されている（非特許文献１）。しかしながら、その他の癌種におけるＭＵＣ１３の発現に関しては明らかとなっていない。また、癌化及び癌の進行に伴うＭＵＣ１３の発現レベルの変化に関しても明らかとなっていない。
【００１１】
【非特許文献１】
ウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ＳＪら，ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２００１年，第２７６巻，ｐ．１８３２７−１８３３６
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、第一に、広く癌一般の診断を行うことができる癌の診断方法及び癌の診断用キットを提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、癌予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができるスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、第三に、癌を予防及び／又は治療することができる癌の予防・治療剤を提供することを目的とする。
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の癌の診断方法及び癌の診断用キット、癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キット、並びに癌の予防・治療剤を提供する。
（１）被験動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを指標として、前記検体における癌細胞の有無を診断することを特徴とする癌の診断方法。
（２）前記発現レベルを、前記検体におけるＭＵＣ１３をコードするｍＲＮＡの存在量に基づいて測定することを特徴とする前記（１）記載の診断方法。
（３）前記発現レベルを、前記検体におけるＭＵＣ１３の存在量に基づいて測定することを特徴とする前記（１）記載の診断方法。
（４）ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする癌の診断用キット。
（５）ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする癌の診断用キット。
【００１４】
（６）癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベル低減効果を指標として、候補物質の癌予防・治療効果を判定することを特徴とする癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法。
（７）ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
（８）ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
（９）ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を含有する癌の予防・治療剤。
（１０）ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はこれらを発現し得るベクターを含有する癌の予防・治療剤。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の癌の診断方法は、被験動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを指標として、前記検体における癌細胞の有無を診断する。
【００１６】
被験動物は癌に罹患し得る動物である限り特に限定されるものではなく、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等の哺乳動物が挙げられる。
【００１７】
被験動物から採取する検体は特に限定されず、例えば、診断対象となる組織又は器官の細胞、血液、血清等を利用することができる。診断対象となる組織又は器官は特に限定されるものではないが、正常時のＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが低い組織又は器官であることが好ましい。正常時のＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが高い組織又は器官（例えば、小腸、大腸、直腸）の場合には、癌化及び癌の進行に伴って生じるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルの亢進を判別し難いため、ＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを指標とした癌の診断精度が低下するおそれがあるが、正常時のＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが低い組織又は器官の場合には、癌化及び癌の進行に伴って生じるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルの亢進を判別し易いので、上記のような診断精度の低下を防止することができる。正常時のＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが低い組織又は器官としては、例えば、脳、脳下垂体、脊髄、唾液腺、胸腺、甲状腺、肺、乳房、皮膚、骨格筋、心臓、肝臓、脾臓、副腎、膵臓、胃、膀胱、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨髄、末梢単核球等が挙げられ、小腸、大腸及び直腸以外のほとんどの組織又は器官において正常時のＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルは低いと考えられる。
【００１８】
ＭＵＣ１３は、コアタンパク質に多数のＯ型糖鎖が結合する糖タンパク質であり、「ＭＵＣ１３遺伝子」とは、ＭＵＣ１３のコアタンパク質をコードする遺伝子を意味する。なお、異種動物間はもちろんのこと、同種動物間でも、多型、アイソフォーム等によってＭＵＣ１３遺伝子の塩基配列に相違が見られる場合があるが、塩基配列が相違する場合であってもＭＵＣ１３のコアタンパク質をコードする限り、ＭＵＣ１３遺伝子に含まれる。
【００１９】
「ＭＵＣ１３遺伝子の発現」には、ＭＵＣ１３遺伝子のｍＲＮＡへの転写及びタンパク質への翻訳が含まれる。したがって、検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルは、検体におけるＭＵＣ１３をコードするｍＲＮＡの存在量、あるいは、検体におけるＭＵＣ１３の存在量に基づいて測定することができる。
【００２０】
検体におけるＭＵＣ１３をコードするｍＲＮＡの存在量の測定にあたっては、公知の遺伝子解析技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法等）、遺伝子増幅技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ等）等を利用することができる。
【００２１】
ハイブリダイゼーション技術を利用する際には、ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプローブとして利用することができ、遺伝子増幅技術を利用する際には、当該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用することができる。
【００２２】
「ＭＵＣ１３をコードする核酸」にはＤＮＡ及びＲＮＡの両者が含まれ、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等が含まれる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドのいずれであってもよい。オリゴヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常１５〜１００塩基、好ましくは１７〜３５塩基である。また、ポリヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常５０〜１０００塩基、好ましくは１５０〜５００塩基である。
【００２３】
ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、ＭＵＣ１３をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし得ることが好ましい。「特異的にハイブリダイズし得る」とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得ることを意味し、「ストリンジェントな条件」とは、通常、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。
【００２４】
ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基配列は、被験動物のＭＵＣ１３遺伝子の塩基配列に基づいて設計することができる。ＭＵＣ１３遺伝子の塩基配列としては、例えば、ヒト、マウス等のＭＵＣ１３遺伝子の塩基配列が公知である。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、例えば、ＭＵＣ１３をコードする核酸のＣＤＳ領域にハイブリダイズし得るように、ＣＤＳ領域の５’末端側又は３’末端側の領域にハイブリダイズし得るように、あるいは、ＣＤＳ領域からその５’末端側又は３’末端側の領域にわたる領域にハイブリダイズし得るように設計される。プライマーの５’末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加することができる。また、プライマー及びプローブには、蛍光色素、ラジオアイソトープ等の標識を付加することができる。
【００２５】
検体におけるＭＵＣ１３をコードするｍＲＮＡの存在量の具体的測定方法について、ＲＴ−ＰＣＲを利用する場合を例にして説明する。被験動物から採取した検体から全ＲＮＡを抽出し、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＭＵＣ１３をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズし得るプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅断片を定量することによって、ＭＵＣ１３をコードするｍＲＮＡの存在量を測定することができる。この際、ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅断片生成量が初期鋳型ｃＤＮＡ量を反映するような条件（例えば、ＰＣＲ増幅断片が指数関数的に増加するＰＣＲサイクル数）で行う。
【００２６】
ＰＣＲ増幅断片の定量方法は特に限定されるものではなく、ＰＣＲ増幅断片の定量には、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いた定量方法、蛍光色素を用いた定量方法等を利用することができる。
【００２７】
ＲＩを用いた定量方法としては、例えば、（ｉ） 反応液にＲＩ標識したヌクレオチド（例えば３２Ｐ標識されたｄＣＴＰ等）を基質として加えておき、ＰＣＲ増幅断片に取り込ませてＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉ） ＲＩ標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉｉ） ＰＣＲ増幅断片を電気泳動した後、メンブランにブロッティングし、ＲＩ標識したプローブをハイブリダイズさせ、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。放射活性は、例えば、液体シンチレーションカウンター、Ｘ線フィルム、イメージングプレート等を用いて測定することができる。
【００２８】
蛍光色素を用いた定量方法としては、（ｉ） 二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ等）を用いてＰＣＲ増幅断片を染色し、励起光の照射によって発せられる蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉ） 蛍光色素で標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片を蛍光色素で標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。蛍光強度は、例えば、ＣＣＤカメラ、蛍光スキャナー、分光蛍光光度計等を用いて測定することができる。
【００２９】
検体におけるＭＵＣ１３の存在量の測定にあたっては、公知のタンパク質解析技術、例えば、ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、組織免疫染色法等を利用することができる。
【００３０】
「ＭＵＣ１３に反応し得る抗体」には、被験動物のＭＵＣ１３に反応し得る限り、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「その断片」には、被験動物のＭＵＣ１３に反応し得る限り、いかなる断片も含まれる。抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。「ＭＵＣ１３に反応し得る」には、ＭＵＣ１３のコアタンパク質に反応する場合、及びＭＵＣ１３の糖鎖に反応する場合の両者が含まれ、また、コアタンパク質又は糖鎖のいずれの部分と反応する場合も含まれる。
【００３１】
被験動物のＭＵＣ１３に反応し得る抗体を作製する際には、免疫用抗原として、被験動物のＭＵＣ１３の一部又は全部を利用することができる。具体的には、（ｉ） ＭＵＣ１３を発現している被験動物の細胞、組織又は器官の破砕物又はその精製物、（ｉｉ） 遺伝子組換え技術を用いて被験動物のＭＵＣ１３遺伝子の一部又は全部を昆虫細胞、動物細胞等の宿主に導入して発現させた組換えタンパク質、（ｉｉｉ） 被験動物のＭＵＣ１３のアミノ酸配列に従ってその一部又は全部を化学合成したペプチド等を利用することができる。
【００３２】
また、免疫用抗原としては、被験動物のＭＵＣ１３以外のタンパク質又は糖タンパク質を利用することもできる。例えば、被験動物のＭＵＣ１３のアミノ酸配列に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質又は糖タンパク質の他、欠失、置換、不可等の変異が加えられた状態で天然に存在するタンパク質又は糖タンパク質、例えば、被験動物以外の動物由来のＭＵＣ１３や、これらのＭＵＣ１３のアミノ酸配列に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質又は糖タンパク質を免疫用抗原として利用することができる。ＭＵＣ１３に導入される欠失、置換、不可等の変異の位置や個数は特に限定されるものではないが、ＭＵＣ１３の立体構造が保持される位置や個数であることが好ましい。
【００３３】
ＭＵＣ１３の取得にあたっては、既にＭＵＣ１３遺伝子が単離・同定されている場合にはそれを利用できるし、単離・同定されていない場合であっても、既に単離・同定されているＭＵＣ１３遺伝子をプローブとして、目的のｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることによって取得することができる。ＭＵＣ１３への人為的変異は、例えば、部位特異的変異誘発法等の公知の方法によって導入することができる。
【００３４】
ポリクローナル抗体の作製にあたっては、免疫用抗原を用いて、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の哺乳動物を免疫する。免疫動物は、抗体を容易に作製できることからマウスを利用することが好ましい。免疫の際には、抗体産生誘導する為に、フロイント完全アジュバント等の免疫助剤を用いてエマルジョン化した後、複数回の免疫することが好ましい。免疫助剤としては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）の他、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムゲル等を利用することができる。哺乳動物１匹当たりの抗原の投与量は、哺乳動物の種類に応じて適宜設定できるが、マウスの場合には通常５０〜５００μｇである。投与部位は、例えば、静脈内、皮下、腹腔内等である。免疫の間隔は、通常、数日から数週間間隔、好ましくは４日〜３週間間隔で、合計２〜８回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終免疫日から５〜１０日後に、ＭＵＣ１３に対する抗体力価を測定し、抗体力価が上昇した後に採血し、抗血清を得る。抗体力価の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等により行うことができる。
【００３５】
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用することができる。
【００３６】
モノクローナル抗体の作製にあたっては、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫用抗原を用いて哺乳動物を免疫し、最終免疫日から２〜５日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が一般的に利用される。
【００３７】
次いで、ハイブリドーマを得るために、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、ヒト、マウス等の哺乳動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を利用することができる。利用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００３８】
細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを所定の割合（例えば１：１〜１：１０）で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤の存在下で、又は電気パルス処理（例えばエレクトロポレーション）により融合反応を行う。
【００３９】
細胞融合処理後、選択培地を用いて培養し、目的とするハイブリドーマを選別する。次いで、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法 （ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等によってスクリーニングすることができる。
【００４０】
ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。
取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法等を利用することができる。細胞培養法においては、例えばハイブリドーマを１０〜２０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で３〜１０日間培養することにより、その培養上清からモノクローナル抗体を取得することができる。また、ハイブリドーマをマウス等の腹腔内に移植し、１０〜１４日後に腹水を採取し、当該腹水からモノクローナル抗体を取得することもできる。
【００４１】
モノクローナル抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用することができる。
【００４２】
被験動物のＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を用いて、検体におけるＭＵＣ１３の存在量を測定する際には、例えば、放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、組織免疫染色法等を利用することができる。具体的には、物理吸着や化学結合等により抗体を結合させた固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）を用いて、検体中のＭＵＣ１３を捕捉した後、捕捉されたＭＵＣ１３を、固相担体に固定化した抗体とはＭＵＣ１３に対する抗原認識部位が異なる標識化抗体（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、フロレッセンス、ウンベリフェロン等の蛍光物質等で標識した抗体）を用いて定量することができる。
【００４３】
また、検体におけるＭＵＣ１３の存在量の測定は、検体におけるＭＵＣ１３の活性を測定することによって行うこともできる。ＭＵＣ１３の活性は、ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法等の公知の方法によって測定することができる。
【００４４】
ＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルの測定値は、発現レベルが大きく変動しない遺伝子（例えば、β−アクチン遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子等のハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて補正することが好ましい。
【００４５】
本発明の癌の診断方法では、癌化及び癌の進行に伴ってＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが亢進する（すなわち、癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルは、正常細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルよりも高い）ことを利用し、被験動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを指標として、当該検体における癌細胞の有無を診断する。すなわち、被験動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが、被験動物と同種の健常動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルよりも高いとき、被験動物から採取した検体に癌細胞が存在すると診断する。
【００４６】
被験動物と健常動物との間で、ＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを比較する際には、検体として同一の組織又は器官の細胞を使用する。また、ＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを比較する際には、複数の健常動物（健常動物群）におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを定量し、その値の分布から正常範囲を設定して、被験動物におけるＭＵＣ１３の発現レベルが正常範囲以上になるか正常範囲以下になるかを判別することが好ましい。このとき、被験動物の検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが正常範囲以上であるときに、被験動物の検体に癌細胞が存在すると診断することができる。
【００４７】
本発明の癌の診断方法は、広く癌一般の診断に利用することができる。本発明の癌の診断方法によって診断可能な癌としては、例えば、肝癌、胃癌、肺癌、グリオーマ等が挙げられる。
【００４８】
本発明の癌の診断用キットは、被験動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを測定するための試薬として、被験動物のＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、被験動物のＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を含む。
【００４９】
本発明の癌の診断用キットは、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、上記抗体又はその断片を含む限り、いかなる形態であってもよく、任意の試薬、器具等を含むことができる。
【００５０】
本発明の癌の診断用キットが、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む場合には、ＰＣＲに必要な試薬（例えばＨ２Ｏ、バッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰミックス、Ｔａｑポリメラーゼ等）、ＰＣＲ増幅断片の定量に必要な試薬（例えばＲＩ、蛍光色素等）、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ等の１種類又は２種類以上を含むことができる。また、本発明の癌の診断用キットが、上記抗体又はその断片を含む場合には、上記抗体又はその断片を固定化するための固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）、抗γ−グログリン抗体（二次抗体）、抗体（二次抗体を含む）又はその断片の標識（例えば、酵素、蛍光物質等）、各種試薬（例えば、酵素基質、緩衝液、希釈液等）等の１種類又は２種類以上を含むことができる。
【００５１】
本発明の癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法は、癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベル低減効果を指標として、候補物質の癌予防・治療効果を判定する。
【００５２】
癌化及び癌の進行に伴ってＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが亢進する（すなわち、癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルは、正常細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルよりも高い）ので、癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベル低減作用を有する物質を選択することによって、癌予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００５３】
「ＭＵＣ１３遺伝子の発現レベル低減効果」には、ＭＵＣ１３遺伝子の転写・翻訳、ＭＵＣ１３の活性発現等のいずれのステップに対する効果も含まれる。
本発明のスクリーニング方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれにおいても行うことができる。
【００５４】
ｉｎ ｖｉｖｏにおいては、例えば、所定の組織又は器官に癌細胞を有するモデル動物に候補物質を投与した後、上記組織又は器官から検体を採取し、当該検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを測定し、候補物質を投与した後のＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが低減したか否かを指標として、候補物質の癌予防・治療効果を判定し、この結果に基づいて癌予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００５５】
ｉｎ ｖｉｖｏのスクリーニング方法において利用されるモデル動物としては、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等の哺乳動物が挙げられる。
【００５６】
候補物質を投与するモデル動物としては、ＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを人為的に亢進させたトランスジェニック動物を利用することもできる。このようなトランスジェニック動物は、例えば、（ｉ） ＭＵＣ１３遺伝子と卵とを混合してリン酸カルシウムで処理する方法、（ｉｉ） 位相差顕微鏡下で前核期卵の核にＭＵＣ１３遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法）、（ｉｉｉ） 胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いる方法等の公知の方法によって得ることができる。なお、トランスジェニック動物におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルの亢進には、ＭＵＣ１３遺伝子が外来遺伝子として導入されて強制発現している状態、宿主が固有に有するＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが亢進している状態、ＭＵＣ１３の分解が抑制された状態のいずれもが含まれる。
【００５７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては、例えば、癌細胞に候補物質を接触させた後、当該癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを測定し、候補物質を投与した後のＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが低減したか否かを指標として、候補物質の癌予防・治療効果を判定し、この結果に基づいて癌予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００５８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏのスクリーニング方法において利用される癌細胞としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット等由来の癌細胞株を利用することができる。
【００５９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏのスクリーニング方法においては、癌細胞の代わりに、ＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを人為的に亢進させた細胞を利用することができる。このような細胞は、ＭＵＣ１３遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、当該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。
【００６０】
本発明の癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キットは、検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを測定するための試薬として、ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、ＭＵＣ１３に反応する抗体又はその断片を含む。
【００６１】
本発明のスクリーニング用キットは、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、上記抗体又はその断片を含む限り、いかなる形態であってもよく、本発明の癌の診断用キットにおいて例示した各種試薬、器具等の他、モデル動物、細胞株、細胞培養用培地等を含むことができる。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法によってスクリーニングされた物質は、癌の予防・治療剤として有用である。また、ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片も、癌の予防・治療剤として有用である。さらに、ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はこれらを発現し得るベクターも、癌の予防・治療剤として有用である。これらの癌の予防・治療剤は、ＭＵＣ１３遺伝子の発現を抑制することにより、あるいは、ＭＵＣ１３の機能を阻害することにより、癌の予防・治療効果を発揮することができると考えられる。
【００６３】
ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を癌の予防・治療剤として利用する場合、癌の予防・治療剤は当該抗体又はその断片のみから構成してもよいが、通常は、薬学的に許容され得る賦形剤その他任意の添加剤を用いて製剤化する。製剤化する場合、製剤中の当該抗体又はその断片の含有量は適宜調節することができる。製剤化にあたっては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用することができる。
【００６４】
ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡを癌の予防・治療剤として利用する場合、例えば、アンチセンスＤＮＡを適当なプロモーター配列の下流に組み込んでアンチセンスＲＮＡ発現ベクターを作製し、このアンチセンスＲＮＡ発現ベクターを投与することができる。ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡは、ＭＵＣ１３遺伝子のアンチセンス鎖のいずれの部分であってもよい。標的細胞への発現ベクターの導入方法としては、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおける導入方法が公知である。
【００６５】
ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡを癌の予防・治療剤として利用する場合、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を標的細胞に直接導入することができる。また、アンチセンスＲＮＡ発現ベクター又はｓｉＲＮＡ発現ベクターを作製し、これらの発現ベクターを投与することができる。ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡは、ＭＵＣ１３遺伝子のアンチセンスＤＮＡを鋳型として生成されるアンチセンスＲＮＡであり、ＭＵＣ１３遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ及び当該アンチセンスＲＮＡと相補的なＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡである。標的細胞への発現ベクター、アンチセンスＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの導入方法としては、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおける導入方法が公知である。
【００６６】
癌の予防・治療剤の投与経路としては、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与等）が挙げられ、投与剤形としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、懸濁剤等が挙げられる。また、癌の予防・治療剤は、飲食品、飼料等に配合して投与することもできる。投与量及び投与回数は、目的とする作用効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、体重、性別等により異なるが、ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を利用する場合の投与量は、成人１日当たり通常１００μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１〜２０ｍｇの範囲から適宜選択でき、ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はこれらを発現し得るベクターを利用する場合の投与量は、成人１日当たり通常０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲から適宜選択でき、投与回数は、１日１回から数回の範囲から適宜選択できる。但し、投与量は種々の条件により変動するため上記範囲外となる場合もある。
【００６７】
【実施例】
大腸癌において高発現していることが知られているＭＵＣ１３について他の癌細胞における発現量を明らかにするために、各種ヒト正常組織及び癌細胞におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現量をＧｅｎｅ ｃｈｉｐを用いて解析するとともに、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて解析した。
【００６８】
〔実施例１〕ヒト正常組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現解析
ヒト正常組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現分布をＧｅｎｅ ｃｈｉｐを用い検討した。
ヒト正常組織としては各ヒト臓器由来ＲＮＡ（表１）各１０ ｎｇずつを試料とし、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｇｅｎｅ ＣｈｉｐＴＭ ＨＧ−１３３Ａ Ｔａｒｇｅｔ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用い、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社）に準じて遺伝子発現解析を行った。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、それに対するＭＵＣ１３（プローブＩＤ：２１８６８７＿ｓ＿ａｔ ＨＧ−Ｕ１３３Ａ）のｍＲＮＡ発現量を相対値で表した結果（図１）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＳＪ等の報告（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２００１ ２７６； １８３２７−１８３３６）と同様に小腸、大腸で非常に高い値を示したのみで、他の臓器では特に高い値を示さなかった。このことから、小腸、大腸以外ではＭＵＣ１３は発現していたとしてもその発現量は低いことが示唆された。
【００６９】
【表１】
【００７０】
〔実施例２〕ヒト癌細胞株におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現解析
各種ヒト癌細胞株におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて解析した。すなわち、各種ヒト癌細胞株よりＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社）を用い常法により全ＲＮＡを調製した後、さらに全ＲＮＡより逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて１本鎖 ｃＤＮＡを合成したもの、及びＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ （ＭＴＣ） Ｐａｎｅｌｓ （Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ；ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をそれぞれ鋳型ＤＮＡとして用い、ｉＣｙｃｌｅｒｉＱリアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）によりＰＣＲ反応を行い、ｍＲＮＡ発現量を定量した。各２５μＬのＰＣＲ反応液は、５００ｍＭ ＫＣｌ， １００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）， ２０ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．１％ Ｇｅｌａｔｉｎ、各１．２５ ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＴＴＰ）、１μＬの各１本鎖ｃＤＮＡ、５ ｐｍｏｌｅずつのＭＵＣ１３センスプライマー（配列番号１）、ＭＵＣ１３アンチセンスプライマー（配列番号２）、０．７５μＬのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ （１０００倍希釈溶液，宝酒造社製）、０．２５μＬのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＦＧ Ｐｌｕｔｈｅｒｏ， Ｒａｐｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １９９３ ２１： ４８５０−４８５１．）を含むように調製した後、初めに９４ ℃で３分間一次変性を行い、９４ ℃で１５秒、６３ ℃で１５秒、７２ ℃で３０秒からなるサイクルを４０回行なった。各標品中の発現量はｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ リアルタイム解析システム付属ソフトを用いて計算した。また、個々のＲＮＡ中のヒトβ−アクチン遺伝子発現量もヒトβ−アクチンに特異的なセンスプライマー（配列番号３）ならびにアンチセンスプライマー（配列番号４）を用い上記と同様に解析を行い、ＭＵＣ１３における解析結果をヒトβ−アクチンの解析結果で補正した値（ＭＵＣ１３／β−アクチン×１００）をＭＵＣ１３ ｍＲＮＡ発現量とした。
【００７１】
その結果、既に報告されている大腸癌由来の細胞株に加え、胃癌、肝癌、肺癌、グリオーマなどでＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現が高い細胞株が認められた（図２）。さらに、大腸癌と異なり、それ以外の癌種に関しては正常組織でのＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現は低いことより（図１）、これらの癌種においては癌化に伴いＭＵＣ１３の発現が亢進していることが確認された。
【００７２】
〔実施例３〕ヒト癌組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現解析
実施例１及び２の結果より、ＭＵＣ１３が大腸癌以外の癌種由来の細胞株においても発現が亢進していることが見出されたことより、実際に臨床標品においても発現が亢進しているのかを明らかにするために肝癌及び胃癌患者から摘出した癌組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現をＧｅｎｅ ｃｈｉｐを用いて解析するとともに、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。
【００７３】
（１）ヒト肝細胞癌におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現解析
（１−１）ヒト肝細胞癌からの全ＲＮＡの調製
ＭＵＣ１３ ｍＲＮＡ発現解析に用いる全ＲＮＡはＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社）を用いて常法により調製した。すなわち、肝細胞癌由来の全ＲＮＡは高分化型肝癌、中分化型肝癌及び低分化型肝癌患者からの摘出組織より肝細胞癌腫瘍部のみを選別したものより調製した。また、陰性対照として用いる全ＲＮＡは摘出組織の非癌部である肝炎部位、肝硬変部位及び正常肝からそれぞれ同様に調製した。なお、すべての臨床組織はインフォームドコンセントに基づき入手した。
【００７４】
（１−２）Ｇｅｎｅ ｃｈｉｐを用いたヒトＭＵＣ１３ ｍＲＮＡ発現解析
上記（１−１）において調製した全ＲＮＡを用い、肝細胞癌又は正常肝、非癌部におけるｍＲＮＡの発現をＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ ＨＧ−Ｕ９５Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ Ｔａｒｇｅｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いて解析した。肝細胞癌腫瘍部としては高分化型肝癌、中分化型肝癌及び低分化型肝癌組織より調製した全ＲＮＡを、また対照とする非癌部（肝炎部位、肝硬変部位）ならびに正常肝より調製した全ＲＮＡを各５μｇずつ、それぞれ３例分を混合したもの試料として用い、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社）に準じて遺伝子発現解析を行った。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、それに対する相対値として発現量を表した。
【００７５】
その結果、ＭＵＣ１３遺伝子（プローブＩＤ：６４４７２＿ａｔ＿ＨＧ−Ｕ９５Ｃ）は正常肝、非癌部、高分化型肝癌、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した中分化型肝癌においては発現が非常に少ないのに対し、Ｃ型中分化型肝癌及び低分化型肝癌において顕著な発現上昇が確認され、確かに臨床標品においてもＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現が亢進していること、並びに癌の悪性化と共に発現が亢進することが認められた（図３）。
【００７６】
（１−３）定量的ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現解析
続いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて正常肝、肝炎部位、肝硬変部位及び肝細胞癌の個々の臨床組織におけるＭＵＣ１３のｍＲＮＡ発現を比較した。すなわち、各組織より調製した全ＲＮＡより逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて合成した１本鎖 ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用い、上記と同様の条件にてｉＣｙｃｌｅｒｉＱリアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）によりＰＣＲ反応を行った。
【００７７】
解析の結果、正常肝、肝炎、肝硬変の病変部におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡ発現量は１８から１７７という値を（図４−１）、また肝癌患者からの摘出組織の非癌部においても５から２８１という値を示したのに対し、肝癌摘出組織の腫瘍部位においては最大で１２４４０と値を示し、今回解析した９例中３例で明らかに高い値を示した。さらに、同一患者由来の癌部、及び非癌部との比較においては９例中５例において１０倍以上癌部においてＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現が高いことが明らかになった（図４−２）。
【００７８】
以上の結果より、ＭＵＣ１３は正常肝細胞ではほとんど発現していないものが、癌化と共に、及び中分化〜低分化型への癌の悪性度の進行と共に発現が亢進することが明らかになり、ＭＵＣ１３は中分化及び低分化肝癌の診断マーカーとして有用であると考えられた。さらに、肝細胞の癌化、悪性化に従いその発現が亢進することより、ＭＵＣ１３が肝細胞癌の発生、悪性化において重要な働きを担っている可能性が考えられた。従って、ＭＵＣ１３は肝癌の診断に加え、肝癌細胞のターゲティング、又は肝癌治療の標的分子としても有用である可能性が示唆された。
【００７９】
（２）ヒト胃癌におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現解析
胃癌摘出組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現について上記と同様にＧｅｎｅＣｈｉｐ（ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ ＨＧ−１３３Ａ Ｔａｒｇｅｔ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）ならびに定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて解析した。
【００８０】
（２−１）ヒト胃癌からの全ＲＮＡの調製
６例の進行癌且つ分化型胃癌（腸型）、ならびに５例の未分化型胃癌（胃型）と診断された胃癌摘出組織の腫瘍部位、ならびに正常部位から上記の方法と同様に全ＲＮＡを調製した。なお、すべての臨床組織はインフォームドコンセントに基づき入手した。
【００８１】
（２−２）Ｇｅｎｅ ｃｈｉｐを用いたｍＲＮＡ発現解析
上記（２−１）において調製した全ＲＮＡを用い胃癌又は正常胃におけるｍＲＮＡの発現をＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ ＨＧ−Ｕ１３３（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いて解析した。胃癌の腫瘍部位に関しては分化型胃癌３例分より調製した全ＲＮＡを混合したもの、また対照として正常部位１例の全ＲＮＡ各５μｇずつを試料として用い、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社）に準じて遺伝子発現解析を行った。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、各遺伝子の発現量は相対値として解析した。
【００８２】
その結果、ＭＵＣ１３遺伝子（プローブＩＤ：２１８６８７＿ｓ＿ａｔ＿ＨＧ−Ｕ１３３Ａ）に関し正常部位と腫瘍部位における発現スコアを比較したところ、正常組織においては３１．９と低い値を示したのに対し、腫瘍部位では２１７．６と正常部位に比べ約７倍程度高い値を示すことが明らかになり、摘出癌組織においてもＭＵＣ１３ ｍＲＮＡ発現が亢進していることが確認された（図５）。
【００８３】
（２−３）定量的ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現解析
続いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて個々の種摘出胃癌におけるＭＵＣ１３のｍＲＮＡ発現を比較した。ＲＴ−ＰＣＲ解析には、未分化型（胃型）の各種組織型を示すもの５例、ならびにＧｅｎｅ ｃｈｉｐ解析と同様に分化型（腸型）のもの６例を用いた。すなわち、各組織より調製した全ＲＮＡを用い上記と同様の方法によりＭＵＣ１３ ｍＲＮＡ発現量を解析した結果、未分化型の充実型低分化型管状腺癌（ｐｏｒ１）の癌部において１１６、ならびに１７３という値を示した以外はいずれも８００以上の高い値を示した。特に悪性度が高いことが知られている未分化型胃癌の非充実型低分化型管状腺癌（ｐｏｒ２）において、それぞれ２，４３７ならびに１，９６０という値を示し、さらに非癌部と比較した場合には共に約４〜５倍ｍＲＮＡの発現が亢進していた。また、胃癌の多くでは癌部の周辺の組織も腸上皮化生を起こしており正常の胃と形態的に異なることが知られており、その結果今回の解析においても非癌部においても高い値を示す例が多く見られたが、全体でみても１１例中５例において非癌部に比べ癌部においてＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現が２倍以上亢進していた（図６）。従って、ＭＵＣ１３は胃の癌化、又は腸上皮化生等の形態変化に伴い発現が亢進することが強く示唆された。
【００８４】
以上の結果より、ＭＵＣ１３は胃においても正常での発現が少ないのに対し、胃癌ならびに前癌状態において発現が亢進することより、胃癌においても診断ならびに治療の標的分子として有用である可能性が示された。
【００８５】
【発明の効果】
本発明により、第一に、広く癌一般の診断を行うことができる癌の診断方法及び癌の診断用キットが提供される。また、本発明によりは、第二に、癌予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができるスクリーニング方法及びスクリーニング用キットが提供される。さらに、本発明は、第三に、癌を予防及び／又は治療することができる癌の予防・治療剤が提供される。
【００８６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】正常臓器及び血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＭＵＣ１３遺伝子発現解析結果を示す図である。
【図２】各種ヒト癌細胞株におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。
【図３】正常肝、肝炎及び肝癌の各摘出組織におけるＭＵＣ１３遺伝子発現量をＧｅｎｅ ｃｈｉｐを用いて解析した結果を示す図である。
【図４】（１）は正常肝、肝炎、肝硬変の各摘出組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す図であり、（２）は中分化型及び低分化型肝癌の各摘出組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す図である。
【図５】正常胃及び胃癌の各摘出組織におけるＭＵＣ１３遺伝子発現量をＧｅｎｅ ｃｈｉｐを用いて解析した結果を示す図である。
【図６】未分化型及び分化型胃癌の各摘出組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、癌の診断方法及び診断用キット、癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キット、並びに癌の予防・治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料を用いたヒトの癌の診断は、一般的に、血液中に含まれる腫瘍マーカーの測定により行われる。このような腫瘍マーカーとしては、例えば、肝癌のマーカーであるαフェトプロテイン（ＡＦＰ）、大腸癌のマーカーである癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、膵癌マーカーであるＣＡ１９−９、前立腺癌のマーカーである前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等が知られている。また、腫瘍マーカーを検出・定量する代表的な方法としては、それぞれの腫瘍マーカーに対して特異的に反応する抗体を用いた放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等が知られている。
【０００３】
しかしながら、現在使用されている腫瘍マーカーは腫瘍特異性や臓器特異性を有する一方、腫瘍マーカーの存在しない臓器も存在するため、１種類の腫瘍マーカーを単独で用いて広く癌一般の診断を行うことは難しい。
【０００４】
ムチン（ＭＵＣ）は、コアタンパク質に多数のＯ型糖鎖が結合する糖タンパク質で、管及び腺構造を有する組織の上皮細胞に発現している。ムチンファミリー（ＭＵＣファミリー）は、ヒトにおいて現在までに１７種（ＭＵＣ１、２、３Ａ、３Ｂ、４、５ＡＣ、５Ｂ、６、７、８、９、１１、１２、１３、１５、１６、１７）が同定されており、これらは構造及び機能から大きく分泌型及び膜結合型の二種類に分類されている。
【０００５】
分泌型ムチンのうち、ＭＵＣ２、５ＡＣ、５Ｂ、６はゴブレット細胞等から分泌された後、粘液の主成分となり上皮表面の保護や潤滑剤として機能していると考えられている。また、比較的分子量が小さい分泌型ムチンであるＭＵＣ７、８、９はそれぞれ唾液腺、呼吸器、Ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅから分泌されることが知られている。
【０００６】
一方、膜結合型ＭＵＣファミリーは消化管、呼吸器、尿管等の上皮細胞の管空側に発現していることが知られている。ほぼ全ての管構造を有する組織の上皮細胞及び消化管上皮細胞に高発現するＭＵＣ１が膜結合型ムチンとして同定されて以来、近年さらに多くの膜結合型ムチンが同定され、上皮細胞に発現する膜結合型ムチンは大きなファミリーを形成していることが明らかになってきた。多くの糖鎖が結合しかつ高分子量である膜結合型ムチンは上皮細胞の管空側に高発現することで、有害な物質や微生物と上皮細胞との接触を防ぐと共に、他の分子との相互作用を通じ生理機能の調節等に関与していると考えられている。また、炎症性大腸炎や嚢胞性線維症等の呼吸器疾患においてムチンの発現量が変化していることからもムチンが恒常性維持に関与していると推定されている。
【０００７】
また、ムチンと癌細胞との関与に関しても報告されている。ＭＵＣ１は乳癌、大腸癌などの癌細胞において発現が亢進しているとともに、悪性度の増強との関連が示唆され、腫瘍マーカーとして注目されている。さらに、最近になり、卵巣癌の腫瘍マーカーとして用いられているＣＡ１２５の遺伝子単離の結果、その分子構造よりＭＵＣファミリーに属することが明らかになった。一方、癌化により発現が低下するものとしてはＭＵＣ２、３、１１、１２等が報告されている。以上のことより、多くのムチンが癌細胞において発現が亢進又は低下していることが知られている。従って、それらムチンの発現量を検出することである種の癌の診断に有用であると考えられている。
【０００８】
さらに、各種ＭＵＣタンパク質の発現量又は発現制御と発癌又は癌細胞の増殖との関係も報告されている。癌細胞に発現しているＭＵＣ１の細胞内領域に存在するチロシン残基がリン酸化され、Ｇｒｂ２を介してＲａｓの活性化を誘導することや（Ｐａｎｄｅｖ Ｐ．ら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９５． ５５；４０００−４００３）、細胞接着や増殖に関与するβカテニンとも相互作用することが報告されている（Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｍ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９７． ２７２；１２４９２−１２４９４， Ｌｉ ＹＱ．ら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９９８． １８；７２１６−７２２４）。また、多くの癌細胞に対して増殖因子として働いていると考えられているＥＧＦ受容体ファミリー分子とＭＵＣ１又はＭＵＣ４とが相互作用することで細胞増殖シグナルを増強することや、癌細胞の転移に関与することが報告されている（Ｐａｔｔｏｎ Ｓ．ら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １９９５． １２４１；４０７−４２３， Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＪＡ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２００１． ２７６；１３０５７−１３０６４， Ｋｏｍａｔｓｕ Ｍ．ら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２０００． ８７；４８０−４８６）。
【０００９】
さらに、ＭＵＣ２等の発現の低下と発癌との関係に関して報告されている。ＭＵＣ２ノックアウトマウスにおいては、小腸上皮細胞の細胞増殖が亢進しており、実際に加齢とともに小腸に癌の発生が確認されている（Ｖｅｌｃｉｃｈ Ａ．ら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２． ２９５；１７２６−１７２９）。したがって、ＭＵＣ２は正常な腸上皮細胞の増殖、分化等を制御することで、癌の発生を抑制していると考えられている。
【００１０】
ＭＵＣ１３は特徴的なＯ型糖鎖結合に必須である繰り返し配列をＮ末に有する膜結合型のムチン蛋白として同定された（非特許文献１）。正常組織における発現分布は大腸、小腸等の上皮細胞に高発現しており、大腸癌においてもその発現が確認されている（非特許文献１）。しかしながら、その他の癌種におけるＭＵＣ１３の発現に関しては明らかとなっていない。また、癌化及び癌の進行に伴うＭＵＣ１３の発現レベルの変化に関しても明らかとなっていない。
【００１１】
【非特許文献１】
ウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ＳＪら，ジャーナル オブ バイオロジカルケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２００１年，第２７６巻，ｐ．１８３２７−１８３３６
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、第一に、広く癌一般の診断を行うことができる癌の診断方法及び癌の診断用キットを提供することを目的とする。
また、本発明は、第二に、癌予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができるスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することを目的とする。
さらに、本発明は、第三に、癌を予防及び／又は治療することができる癌の予防・治療剤を提供することを目的とする。
【００１３】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の癌の診断方法及び癌の診断用キット、癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法及びスクリーニング用キット、並びに癌の予防・治療剤を提供する。
（１）被験動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを指標として、前記検体における癌細胞の有無を診断することを特徴とする癌の診断方法。
（２）前記発現レベルを、前記検体におけるＭＵＣ１３をコードするｍＲＮＡの存在量に基づいて測定することを特徴とする前記（１）記載の診断方法。
（３）前記発現レベルを、前記検体におけるＭＵＣ１３の存在量に基づいて測定することを特徴とする前記（１）記載の診断方法。
（４）ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする癌の診断用キット。
（５）ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする癌の診断用キット。
【００１４】
（６）癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベル低減効果を指標として、候補物質の癌予防・治療効果を判定することを特徴とする癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法。
（７）ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
（８）ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
（９）ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を含有する癌の予防・治療剤。
（１０）ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はこれらを発現し得るベクターを含有する癌の予防・治療剤。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の癌の診断方法は、被験動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを指標として、前記検体における癌細胞の有無を診断する。
【００１６】
被験動物は癌に罹患し得る動物である限り特に限定されるものではなく、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等の哺乳動物が挙げられる。
【００１７】
被験動物から採取する検体は特に限定されず、例えば、診断対象となる組織又は器官の細胞、血液、血清等を利用することができる。診断対象となる組織又は器官は特に限定されるものではないが、正常時のＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが低い組織又は器官であることが好ましい。正常時のＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが高い組織又は器官（例えば、小腸、大腸、直腸）の場合には、癌化及び癌の進行に伴って生じるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルの亢進を判別し難いため、ＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを指標とした癌の診断精度が低下するおそれがあるが、正常時のＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが低い組織又は器官の場合には、癌化及び癌の進行に伴って生じるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルの亢進を判別し易いので、上記のような診断精度の低下を防止することができる。正常時のＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが低い組織又は器官としては、例えば、脳、脳下垂体、脊髄、唾液腺、胸腺、甲状腺、肺、乳房、皮膚、骨格筋、心臓、肝臓、脾臓、副腎、膵臓、胃、膀胱、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨髄、末梢単核球等が挙げられ、小腸、大腸及び直腸以外のほとんどの組織又は器官において正常時のＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルは低いと考えられる。
【００１８】
ＭＵＣ１３は、コアタンパク質に多数のＯ型糖鎖が結合する糖タンパク質であり、「ＭＵＣ１３遺伝子」とは、ＭＵＣ１３のコアタンパク質をコードする遺伝子を意味する。なお、異種動物間はもちろんのこと、同種動物間でも、多型、アイソフォーム等によってＭＵＣ１３遺伝子の塩基配列に相違が見られる場合があるが、塩基配列が相違する場合であってもＭＵＣ１３のコアタンパク質をコードする限り、ＭＵＣ１３遺伝子に含まれる。
【００１９】
「ＭＵＣ１３遺伝子の発現」には、ＭＵＣ１３遺伝子のｍＲＮＡへの転写及びタンパク質への翻訳が含まれる。したがって、検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルは、検体におけるＭＵＣ１３をコードするｍＲＮＡの存在量、あるいは、検体におけるＭＵＣ１３の存在量に基づいて測定することができる。
【００２０】
検体におけるＭＵＣ１３をコードするｍＲＮＡの存在量の測定にあたっては、公知の遺伝子解析技術、例えば、ハイブリダイゼーション技術（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法等）、遺伝子増幅技術（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ等）等を利用することができる。
【００２１】
ハイブリダイゼーション技術を利用する際には、ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプローブとして利用することができ、遺伝子増幅技術を利用する際には、当該オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをプライマーとして利用することができる。
【００２２】
「ＭＵＣ１３をコードする核酸」にはＤＮＡ及びＲＮＡの両者が含まれ、例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等が含まれる。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドのいずれであってもよい。オリゴヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常１５〜１００塩基、好ましくは１７〜３５塩基である。また、ポリヌクレオチドの塩基長は特に限定されないが、通常５０〜１０００塩基、好ましくは１５０〜５００塩基である。
【００２３】
ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、ＭＵＣ１３をコードする核酸に特異的にハイブリダイズし得ることが好ましい。「特異的にハイブリダイズし得る」とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得ることを意味し、「ストリンジェントな条件」とは、通常、４２℃、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件であり、好ましくは、６５℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの条件である。
【００２４】
ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基配列は、被験動物のＭＵＣ１３遺伝子の塩基配列に基づいて設計することができる。ＭＵＣ１３遺伝子の塩基配列としては、例えば、ヒト、マウス等のＭＵＣ１３遺伝子の塩基配列が公知である。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、例えば、ＭＵＣ１３をコードする核酸のＣＤＳ領域にハイブリダイズし得るように、ＣＤＳ領域の５’末端側又は３’末端側の領域にハイブリダイズし得るように、あるいは、ＣＤＳ領域からその５’末端側又は３’末端側の領域にわたる領域にハイブリダイズし得るように設計される。プライマーの５’末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加することができる。また、プライマー及びプローブには、蛍光色素、ラジオアイソトープ等の標識を付加することができる。
【００２５】
検体におけるＭＵＣ１３をコードするｍＲＮＡの存在量の具体的測定方法について、ＲＴ−ＰＣＲを利用する場合を例にして説明する。被験動物から採取した検体から全ＲＮＡを抽出し、抽出した全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した後、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＭＵＣ１３をコードするｃＤＮＡにハイブリダイズし得るプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅断片を定量することによって、ＭＵＣ１３をコードするｍＲＮＡの存在量を測定することができる。この際、ＰＣＲは、ＰＣＲ増幅断片生成量が初期鋳型ｃＤＮＡ量を反映するような条件（例えば、ＰＣＲ増幅断片が指数関数的に増加するＰＣＲサイクル数）で行う。
【００２６】
ＰＣＲ増幅断片の定量方法は特に限定されるものではなく、ＰＣＲ増幅断片の定量には、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）を用いた定量方法、蛍光色素を用いた定量方法等を利用することができる。
【００２７】
ＲＩを用いた定量方法としては、例えば、（ｉ） 反応液にＲＩ標識したヌクレオチド（例えば３２Ｐ標識されたｄＣＴＰ等）を基質として加えておき、ＰＣＲ増幅断片に取り込ませてＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉ） ＲＩ標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片をＲＩ標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉｉ） ＰＣＲ増幅断片を電気泳動した後、メンブランにブロッティングし、ＲＩ標識したプローブをハイブリダイズさせ、放射活性を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。放射活性は、例えば、液体シンチレーションカウンター、Ｘ線フィルム、イメージングプレート等を用いて測定することができる。
【００２８】
蛍光色素を用いた定量方法としては、（ｉ） 二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ等）を用いてＰＣＲ増幅断片を染色し、励起光の照射によって発せられる蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法、（ｉｉ） 蛍光色素で標識したプライマーを用いることによりＰＣＲ増幅断片を蛍光色素で標識し、ＰＣＲ増幅断片を電気泳動等で分離した後、蛍光強度を測定してＰＣＲ増幅断片を定量する方法等が挙げられる。蛍光強度は、例えば、ＣＣＤカメラ、蛍光スキャナー、分光蛍光光度計等を用いて測定することができる。
【００２９】
検体におけるＭＵＣ１３の存在量の測定にあたっては、公知のタンパク質解析技術、例えば、ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、組織免疫染色法等を利用することができる。
【００３０】
「ＭＵＣ１３に反応し得る抗体」には、被験動物のＭＵＣ１３に反応し得る限り、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれもが含まれ、「その断片」には、被験動物のＭＵＣ１３に反応し得る限り、いかなる断片も含まれる。抗体の断片としては、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）等が挙げられる。「ＭＵＣ１３に反応し得る」には、ＭＵＣ１３のコアタンパク質に反応する場合、及びＭＵＣ１３の糖鎖に反応する場合の両者が含まれ、また、コアタンパク質又は糖鎖のいずれの部分と反応する場合も含まれる。
【００３１】
被験動物のＭＵＣ１３に反応し得る抗体を作製する際には、免疫用抗原として、被験動物のＭＵＣ１３の一部又は全部を利用することができる。具体的には、（ｉ） ＭＵＣ１３を発現している被験動物の細胞、組織又は器官の破砕物又はその精製物、（ｉｉ） 遺伝子組換え技術を用いて被験動物のＭＵＣ１３遺伝子の一部又は全部を昆虫細胞、動物細胞等の宿主に導入して発現させた組換えタンパク質、（ｉｉｉ） 被験動物のＭＵＣ１３のアミノ酸配列に従ってその一部又は全部を化学合成したペプチド等を利用することができる。
【００３２】
また、免疫用抗原としては、被験動物のＭＵＣ１３以外のタンパク質又は糖タンパク質を利用することもできる。例えば、被験動物のＭＵＣ１３のアミノ酸配列に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質又は糖タンパク質の他、欠失、置換、不可等の変異が加えられた状態で天然に存在するタンパク質又は糖タンパク質、例えば、被験動物以外の動物由来のＭＵＣ１３や、これらのＭＵＣ１３のアミノ酸配列に対して人為的に欠失、置換、付加等の変異を導入したタンパク質又は糖タンパク質を免疫用抗原として利用することができる。ＭＵＣ１３に導入される欠失、置換、不可等の変異の位置や個数は特に限定されるものではないが、ＭＵＣ１３の立体構造が保持される位置や個数であることが好ましい。
【００３３】
ＭＵＣ１３の取得にあたっては、既にＭＵＣ１３遺伝子が単離・同定されている場合にはそれを利用できるし、単離・同定されていない場合であっても、既に単離・同定されているＭＵＣ１３遺伝子をプローブとして、目的のｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることによって取得することができる。ＭＵＣ１３への人為的変異は、例えば、部位特異的変異誘発法等の公知の方法によって導入することができる。
【００３４】
ポリクローナル抗体の作製にあたっては、免疫用抗原を用いて、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の哺乳動物を免疫する。免疫動物は、抗体を容易に作製できることからマウスを利用することが好ましい。免疫の際には、抗体産生誘導する為に、フロイント完全アジュバント等の免疫助剤を用いてエマルジョン化した後、複数回の免疫することが好ましい。免疫助剤としては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）の他、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムゲル等を利用することができる。哺乳動物１匹当たりの抗原の投与量は、哺乳動物の種類に応じて適宜設定できるが、マウスの場合には通常５０〜５００μｇである。投与部位は、例えば、静脈内、皮下、腹腔内等である。免疫の間隔は、通常、数日から数週間間隔、好ましくは４日〜３週間間隔で、合計２〜８回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終免疫日から５〜１０日後に、ＭＵＣ１３に対する抗体力価を測定し、抗体力価が上昇した後に採血し、抗血清を得る。抗体力価の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等により行うことができる。
【００３５】
抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用することができる。
【００３６】
モノクローナル抗体の作製にあたっては、ポリクローナル抗体の場合と同様に免疫用抗原を用いて哺乳動物を免疫し、最終免疫日から２〜５日後に抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞が一般的に利用される。
【００３７】
次いで、ハイブリドーマを得るために、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞としては、ヒト、マウス等の哺乳動物由来の細胞であって一般に入手可能な株化細胞を利用することができる。利用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞の具体例としては、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４等のマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００３８】
細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の動物細胞培養用培地中に、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを所定の割合（例えば１：１〜１：１０）で混合し、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤の存在下で、又は電気パルス処理（例えばエレクトロポレーション）により融合反応を行う。
【００３９】
細胞融合処理後、選択培地を用いて培養し、目的とするハイブリドーマを選別する。次いで、増殖したハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法 （ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）等によってスクリーニングすることができる。
【００４０】
ハイブリドーマのクローニングは、例えば、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等により行うことができ、最終的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得する。
取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法等を利用することができる。細胞培養法においては、例えばハイブリドーマを１０〜２０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地等の動物細胞培養培地中、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で３〜１０日間培養することにより、その培養上清からモノクローナル抗体を取得することができる。また、ハイブリドーマをマウス等の腹腔内に移植し、１０〜１４日後に腹水を採取し、当該腹水からモノクローナル抗体を取得することもできる。
【００４１】
モノクローナル抗体の精製が必要とされる場合は、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して又はこれらを組み合わせて利用することができる。
【００４２】
被験動物のＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を用いて、検体におけるＭＵＣ１３の存在量を測定する際には、例えば、放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、化学発光測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、組織免疫染色法等を利用することができる。具体的には、物理吸着や化学結合等により抗体を結合させた固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）を用いて、検体中のＭＵＣ１３を捕捉した後、捕捉されたＭＵＣ１３を、固相担体に固定化した抗体とはＭＵＣ１３に対する抗原認識部位が異なる標識化抗体（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、フロレッセンス、ウンベリフェロン等の蛍光物質等で標識した抗体）を用いて定量することができる。
【００４３】
また、検体におけるＭＵＣ１３の存在量の測定は、検体におけるＭＵＣ１３の活性を測定することによって行うこともできる。ＭＵＣ１３の活性は、ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を利用したウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法等の公知の方法によって測定することができる。
【００４４】
ＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルの測定値は、発現レベルが大きく変動しない遺伝子（例えば、β−アクチン遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子等のハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて補正することが好ましい。
【００４５】
本発明の癌の診断方法では、癌化及び癌の進行に伴ってＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが亢進する（すなわち、癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルは、正常細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルよりも高い）ことを利用し、被験動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを指標として、当該検体における癌細胞の有無を診断する。すなわち、被験動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが、被験動物と同種の健常動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルよりも高いとき、被験動物から採取した検体に癌細胞が存在すると診断する。
【００４６】
被験動物と健常動物との間で、ＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを比較する際には、検体として同一の組織又は器官の細胞を使用する。また、ＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを比較する際には、複数の健常動物（健常動物群）におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを定量し、その値の分布から正常範囲を設定して、被験動物におけるＭＵＣ１３の発現レベルが正常範囲以上になるか正常範囲以下になるかを判別することが好ましい。このとき、被験動物の検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが正常範囲以上であるときに、被験動物の検体に癌細胞が存在すると診断することができる。
【００４７】
本発明の癌の診断方法は、広く癌一般の診断に利用することができる。本発明の癌の診断方法によって診断可能な癌としては、例えば、肝癌、胃癌、肺癌、グリオーマ等が挙げられる。
【００４８】
本発明の癌の診断用キットは、被験動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを測定するための試薬として、被験動物のＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、被験動物のＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を含む。
【００４９】
本発明の癌の診断用キットは、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、上記抗体又はその断片を含む限り、いかなる形態であってもよく、任意の試薬、器具等を含むことができる。
【００５０】
本発明の癌の診断用キットが、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む場合には、ＰＣＲに必要な試薬（例えばＨ２Ｏ、バッファー、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰミックス、Ｔａｑポリメラーゼ等）、ＰＣＲ増幅断片の定量に必要な試薬（例えばＲＩ、蛍光色素等）、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ等の１種類又は２種類以上を含むことができる。また、本発明の癌の診断用キットが、上記抗体又はその断片を含む場合には、上記抗体又はその断片を固定化するための固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）、抗γ−グログリン抗体（二次抗体）、抗体（二次抗体を含む）又はその断片の標識（例えば、酵素、蛍光物質等）、各種試薬（例えば、酵素基質、緩衝液、希釈液等）等の１種類又は２種類以上を含むことができる。
【００５１】
本発明の癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法は、癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベル低減効果を指標として、候補物質の癌予防・治療効果を判定する。
【００５２】
癌化及び癌の進行に伴ってＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが亢進する（すなわち、癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルは、正常細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルよりも高い）ので、癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベル低減作用を有する物質を選択することによって、癌予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００５３】
「ＭＵＣ１３遺伝子の発現レベル低減効果」には、ＭＵＣ１３遺伝子の転写・翻訳、ＭＵＣ１３の活性発現等のいずれのステップに対する効果も含まれる。
本発明のスクリーニング方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれにおいても行うことができる。
【００５４】
ｉｎ ｖｉｖｏにおいては、例えば、所定の組織又は器官に癌細胞を有するモデル動物に候補物質を投与した後、上記組織又は器官から検体を採取し、当該検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを測定し、候補物質を投与した後のＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが低減したか否かを指標として、候補物質の癌予防・治療効果を判定し、この結果に基づいて癌予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００５５】
ｉｎ ｖｉｖｏのスクリーニング方法において利用されるモデル動物としては、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等の哺乳動物が挙げられる。
【００５６】
候補物質を投与するモデル動物としては、ＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを人為的に亢進させたトランスジェニック動物を利用することもできる。このようなトランスジェニック動物は、例えば、（ｉ） ＭＵＣ１３遺伝子と卵とを混合してリン酸カルシウムで処理する方法、（ｉｉ） 位相差顕微鏡下で前核期卵の核にＭＵＣ１３遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法）、（ｉｉｉ） 胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いる方法等の公知の方法によって得ることができる。なお、トランスジェニック動物におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルの亢進には、ＭＵＣ１３遺伝子が外来遺伝子として導入されて強制発現している状態、宿主が固有に有するＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが亢進している状態、ＭＵＣ１３の分解が抑制された状態のいずれもが含まれる。
【００５７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいては、例えば、癌細胞に候補物質を接触させた後、当該癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを測定し、候補物質を投与した後のＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルが低減したか否かを指標として、候補物質の癌予防・治療効果を判定し、この結果に基づいて癌予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００５８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏのスクリーニング方法において利用される癌細胞としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット等由来の癌細胞株を利用することができる。
【００５９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏのスクリーニング方法においては、癌細胞の代わりに、ＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを人為的に亢進させた細胞を利用することができる。このような細胞は、ＭＵＣ１３遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、当該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。
【００６０】
本発明の癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キットは、検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを測定するための試薬として、ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、ＭＵＣ１３に反応する抗体又はその断片を含む。
【００６１】
本発明のスクリーニング用キットは、上記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、あるいは、上記抗体又はその断片を含む限り、いかなる形態であってもよく、本発明の癌の診断用キットにおいて例示した各種試薬、器具等の他、モデル動物、細胞株、細胞培養用培地等を含むことができる。
【００６２】
本発明のスクリーニング方法によってスクリーニングされた物質は、癌の予防・治療剤として有用である。また、ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片も、癌の予防・治療剤として有用である。さらに、ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はこれらを発現し得るベクターも、癌の予防・治療剤として有用である。これらの癌の予防・治療剤は、ＭＵＣ１３遺伝子の発現を抑制することにより、あるいは、ＭＵＣ１３の機能を阻害することにより、癌の予防・治療効果を発揮することができると考えられる。
【００６３】
ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を癌の予防・治療剤として利用する場合、癌の予防・治療剤は当該抗体又はその断片のみから構成してもよいが、通常は、薬学的に許容され得る賦形剤その他任意の添加剤を用いて製剤化する。製剤化する場合、製剤中の当該抗体又はその断片の含有量は適宜調節することができる。製剤化にあたっては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を使用することができる。
【００６４】
ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡを癌の予防・治療剤として利用する場合、例えば、アンチセンスＤＮＡを適当なプロモーター配列の下流に組み込んでアンチセンスＲＮＡ発現ベクターを作製し、このアンチセンスＲＮＡ発現ベクターを投与することができる。ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡは、ＭＵＣ１３遺伝子のアンチセンス鎖のいずれの部分であってもよい。標的細胞への発現ベクターの導入方法としては、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおける導入方法が公知である。
【００６５】
ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡを癌の予防・治療剤として利用する場合、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を標的細胞に直接導入することができる。また、アンチセンスＲＮＡ発現ベクター又はｓｉＲＮＡ発現ベクターを作製し、これらの発現ベクターを投与することができる。ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡは、ＭＵＣ１３遺伝子のアンチセンスＤＮＡを鋳型として生成されるアンチセンスＲＮＡであり、ＭＵＣ１３遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ及び当該アンチセンスＲＮＡと相補的なＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡである。標的細胞への発現ベクター、アンチセンスＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの導入方法としては、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏにおける導入方法が公知である。
【００６６】
癌の予防・治療剤の投与経路としては、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与等）が挙げられ、投与剤形としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、懸濁剤等が挙げられる。また、癌の予防・治療剤は、飲食品、飼料等に配合して投与することもできる。投与量及び投与回数は、目的とする作用効果、投与方法、治療期間、患者の年齢、体重、性別等により異なるが、ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を利用する場合の投与量は、成人１日当たり通常１００μｇ〜１００ｍｇ、好ましくは１〜２０ｍｇの範囲から適宜選択でき、ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はこれらを発現し得るベクターを利用する場合の投与量は、成人１日当たり通常０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲から適宜選択でき、投与回数は、１日１回から数回の範囲から適宜選択できる。但し、投与量は種々の条件により変動するため上記範囲外となる場合もある。
【００６７】
【実施例】
大腸癌において高発現していることが知られているＭＵＣ１３について他の癌細胞における発現量を明らかにするために、各種ヒト正常組織及び癌細胞におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現量をＧｅｎｅ ｃｈｉｐを用いて解析するとともに、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて解析した。
【００６８】
〔実施例１〕ヒト正常組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現解析
ヒト正常組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現分布をＧｅｎｅ ｃｈｉｐを用い検討した。
ヒト正常組織としては各ヒト臓器由来ＲＮＡ（表１）各１０ ｎｇずつを試料とし、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｇｅｎｅ ＣｈｉｐＴＭ ＨＧ−１３３Ａ Ｔａｒｇｅｔ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用い、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社）に準じて遺伝子発現解析を行った。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、それに対するＭＵＣ１３（プローブＩＤ：２１８６８７＿ｓ＿ａｔ ＨＧ−Ｕ１３３Ａ）のｍＲＮＡ発現量を相対値で表した結果（図１）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＳＪ等の報告（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２００１ ２７６； １８３２７−１８３３６）と同様に小腸、大腸で非常に高い値を示したのみで、他の臓器では特に高い値を示さなかった。このことから、小腸、大腸以外ではＭＵＣ１３は発現していたとしてもその発現量は低いことが示唆された。
【００６９】
【表１】
〔実施例２〕ヒト癌細胞株におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現解析
各種ヒト癌細胞株におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現を、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて解析した。すなわち、各種ヒト癌細胞株よりＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社）を用い常法により全ＲＮＡを調製した後、さらに全ＲＮＡより逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて１本鎖 ｃＤＮＡを合成したもの、及びＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｔｉｓｓｕｅ ｃＤＮＡ （ＭＴＣ） Ｐａｎｅｌｓ （Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ；ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をそれぞれ鋳型ＤＮＡとして用い、ｉＣｙｃｌｅｒｉＱリアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）によりＰＣＲ反応を行い、ｍＲＮＡ発現量を定量した。各２５μＬのＰＣＲ反応液は、５００ｍＭ ＫＣｌ， １００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）， ２０ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．１％ Ｇｅｌａｔｉｎ、各１．２５ ｍＭ ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＴＴＰ）、１μＬの各１本鎖ｃＤＮＡ、５ ｐｍｏｌｅずつのＭＵＣ１３センスプライマー（配列番号１）、ＭＵＣ１３アンチセンスプライマー（配列番号２）、０．７５μＬのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ （１０００倍希釈溶液，宝酒造社製）、０．２５μＬのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｍｉｘ（ＦＧ Ｐｌｕｔｈｅｒｏ， Ｒａｐｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １９９３ ２１： ４８５０−４８５１．）を含むように調製した後、初めに９４ ℃で３分間一次変性を行い、９４ ℃で１５秒、６３ ℃で１５秒、７２ ℃で３０秒からなるサイクルを４０回行なった。各標品中の発現量はｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ リアルタイム解析システム付属ソフトを用いて計算した。また、個々のＲＮＡ中のヒトβ−アクチン遺伝子発現量もヒトβ−アクチンに特異的なセンスプライマー（配列番号３）ならびにアンチセンスプライマー（配列番号４）を用い上記と同様に解析を行い、ＭＵＣ１３における解析結果をヒトβ−アクチンの解析結果で補正した値（ＭＵＣ１３／β−アクチン×１００）をＭＵＣ１３ ｍＲＮＡ発現量とした。
【００７１】
その結果、既に報告されている大腸癌由来の細胞株に加え、胃癌、肝癌、肺癌、グリオーマなどでＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現が高い細胞株が認められた（図２）。さらに、大腸癌と異なり、それ以外の癌種に関しては正常組織でのＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現は低いことより（図１）、これらの癌種においては癌化に伴いＭＵＣ１３の発現が亢進していることが確認された。
【００７２】
〔実施例３〕ヒト癌組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現解析
実施例１及び２の結果より、ＭＵＣ１３が大腸癌以外の癌種由来の細胞株においても発現が亢進していることが見出されたことより、実際に臨床標品においても発現が亢進しているのかを明らかにするために肝癌及び胃癌患者から摘出した癌組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現をＧｅｎｅ ｃｈｉｐを用いて解析するとともに、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した。
【００７３】
（１）ヒト肝細胞癌におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現解析
（１−１）ヒト肝細胞癌からの全ＲＮＡの調製
ＭＵＣ１３ ｍＲＮＡ発現解析に用いる全ＲＮＡはＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社）を用いて常法により調製した。すなわち、肝細胞癌由来の全ＲＮＡは高分化型肝癌、中分化型肝癌及び低分化型肝癌患者からの摘出組織より肝細胞癌腫瘍部のみを選別したものより調製した。また、陰性対照として用いる全ＲＮＡは摘出組織の非癌部である肝炎部位、肝硬変部位及び正常肝からそれぞれ同様に調製した。なお、すべての臨床組織はインフォームドコンセントに基づき入手した。
【００７４】
（１−２）Ｇｅｎｅ ｃｈｉｐを用いたヒトＭＵＣ１３ ｍＲＮＡ発現解析
上記（１−１）において調製した全ＲＮＡを用い、肝細胞癌又は正常肝、非癌部におけるｍＲＮＡの発現をＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ ＨＧ−Ｕ９５Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ Ｔａｒｇｅｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いて解析した。肝細胞癌腫瘍部としては高分化型肝癌、中分化型肝癌及び低分化型肝癌組織より調製した全ＲＮＡを、また対照とする非癌部（肝炎部位、肝硬変部位）ならびに正常肝より調製した全ＲＮＡを各５μｇずつ、それぞれ３例分を混合したもの試料として用い、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社）に準じて遺伝子発現解析を行った。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、それに対する相対値として発現量を表した。
【００７５】
その結果、ＭＵＣ１３遺伝子（プローブＩＤ：６４４７２＿ａｔ＿ＨＧ−Ｕ９５Ｃ）は正常肝、非癌部、高分化型肝癌、Ｂ型肝炎ウイルスに感染した中分化型肝癌においては発現が非常に少ないのに対し、Ｃ型中分化型肝癌及び低分化型肝癌において顕著な発現上昇が確認され、確かに臨床標品においてもＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現が亢進していること、並びに癌の悪性化と共に発現が亢進することが認められた（図３）。
【００７６】
（１−３）定量的ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現解析
続いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて正常肝、肝炎部位、肝硬変部位及び肝細胞癌の個々の臨床組織におけるＭＵＣ１３のｍＲＮＡ発現を比較した。すなわち、各組織より調製した全ＲＮＡより逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を用いて合成した１本鎖 ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用い、上記と同様の条件にてｉＣｙｃｌｅｒｉＱリアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）によりＰＣＲ反応を行った。
【００７７】
解析の結果、正常肝、肝炎、肝硬変の病変部におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡ発現量は１８から１７７という値を（図４−１）、また肝癌患者からの摘出組織の非癌部においても５から２８１という値を示したのに対し、肝癌摘出組織の腫瘍部位においては最大で１２４４０と値を示し、今回解析した９例中３例で明らかに高い値を示した。さらに、同一患者由来の癌部、及び非癌部との比較においては９例中５例において１０倍以上癌部においてＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現が高いことが明らかになった（図４−２）。
【００７８】
以上の結果より、ＭＵＣ１３は正常肝細胞ではほとんど発現していないものが、癌化と共に、及び中分化〜低分化型への癌の悪性度の進行と共に発現が亢進することが明らかになり、ＭＵＣ１３は中分化及び低分化肝癌の診断マーカーとして有用であると考えられた。さらに、肝細胞の癌化、悪性化に従いその発現が亢進することより、ＭＵＣ１３が肝細胞癌の発生、悪性化において重要な働きを担っている可能性が考えられた。従って、ＭＵＣ１３は肝癌の診断に加え、肝癌細胞のターゲティング、又は肝癌治療の標的分子としても有用である可能性が示唆された。
【００７９】
（２）ヒト胃癌におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現解析
胃癌摘出組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現について上記と同様にＧｅｎｅＣｈｉｐ（ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ ＨＧ−１３３Ａ Ｔａｒｇｅｔ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）ならびに定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて解析した。
【００８０】
（２−１）ヒト胃癌からの全ＲＮＡの調製
６例の進行癌且つ分化型胃癌（腸型）、ならびに５例の未分化型胃癌（胃型）と診断された胃癌摘出組織の腫瘍部位、ならびに正常部位から上記の方法と同様に全ＲＮＡを調製した。なお、すべての臨床組織はインフォームドコンセントに基づき入手した。
【００８１】
（２−２）Ｇｅｎｅ ｃｈｉｐを用いたｍＲＮＡ発現解析
上記（２−１）において調製した全ＲＮＡを用い胃癌又は正常胃におけるｍＲＮＡの発現をＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ ＨＧ−Ｕ１３３（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いて解析した。胃癌の腫瘍部位に関しては分化型胃癌３例分より調製した全ＲＮＡを混合したもの、また対照として正常部位１例の全ＲＮＡ各５μｇずつを試料として用い、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社）に準じて遺伝子発現解析を行った。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、各遺伝子の発現量は相対値として解析した。
【００８２】
その結果、ＭＵＣ１３遺伝子（プローブＩＤ：２１８６８７＿ｓ＿ａｔ＿ＨＧ−Ｕ１３３Ａ）に関し正常部位と腫瘍部位における発現スコアを比較したところ、正常組織においては３１．９と低い値を示したのに対し、腫瘍部位では２１７．６と正常部位に比べ約７倍程度高い値を示すことが明らかになり、摘出癌組織においてもＭＵＣ１３ ｍＲＮＡ発現が亢進していることが確認された（図５）。
【００８３】
（２−３）定量的ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ発現解析
続いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて個々の種摘出胃癌におけるＭＵＣ１３のｍＲＮＡ発現を比較した。ＲＴ−ＰＣＲ解析には、未分化型（胃型）の各種組織型を示すもの５例、ならびにＧｅｎｅ ｃｈｉｐ解析と同様に分化型（腸型）のもの６例を用いた。すなわち、各組織より調製した全ＲＮＡを用い上記と同様の方法によりＭＵＣ１３ ｍＲＮＡ発現量を解析した結果、未分化型の充実型低分化型管状腺癌（ｐｏｒ１）の癌部において１１６、ならびに１７３という値を示した以外はいずれも８００以上の高い値を示した。特に悪性度が高いことが知られている未分化型胃癌の非充実型低分化型管状腺癌（ｐｏｒ２）において、それぞれ２，４３７ならびに１，９６０という値を示し、さらに非癌部と比較した場合には共に約４〜５倍ｍＲＮＡの発現が亢進していた。また、胃癌の多くでは癌部の周辺の組織も腸上皮化生を起こしており正常の胃と形態的に異なることが知られており、その結果今回の解析においても非癌部においても高い値を示す例が多く見られたが、全体でみても１１例中５例において非癌部に比べ癌部においてＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現が２倍以上亢進していた（図６）。従って、ＭＵＣ１３は胃の癌化、又は腸上皮化生等の形態変化に伴い発現が亢進することが強く示唆された。
【００８４】
以上の結果より、ＭＵＣ１３は胃においても正常での発現が少ないのに対し、胃癌ならびに前癌状態において発現が亢進することより、胃癌においても診断ならびに治療の標的分子として有用である可能性が示された。
【００８５】
【発明の効果】
本発明により、第一に、広く癌一般の診断を行うことができる癌の診断方法及び癌の診断用キットが提供される。また、本発明によりは、第二に、癌予防・治療効果を有する物質をスクリーニングすることができるスクリーニング方法及びスクリーニング用キットが提供される。さらに、本発明は、第三に、癌を予防及び／又は治療することができる癌の予防・治療剤が提供される。
【００８６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】正常臓器及び血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＭＵＣ１３遺伝子発現解析結果を示す図である。
【図２】各種ヒト癌細胞株におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により解析した結果を示す図である。
【図３】正常肝、肝炎及び肝癌の各摘出組織におけるＭＵＣ１３遺伝子発現量をＧｅｎｅ ｃｈｉｐを用いて解析した結果を示す図である。
【図４】（１）は正常肝、肝炎、肝硬変の各摘出組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す図であり、（２）は中分化型及び低分化型肝癌の各摘出組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す図である。
【図５】正常胃及び胃癌の各摘出組織におけるＭＵＣ１３遺伝子発現量をＧｅｎｅ ｃｈｉｐを用いて解析した結果を示す図である。
【図６】未分化型及び分化型胃癌の各摘出組織におけるＭＵＣ１３ ｍＲＮＡの発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す図である。
Claims (10)
- 被験動物から採取した検体におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベルを指標として、前記検体における癌細胞の有無を診断することを特徴とする癌の診断方法。
- 前記発現レベルを、前記検体におけるＭＵＣ１３をコードするｍＲＮＡの存在量に基づいて測定することを特徴とする請求項１記載の診断方法。
- 前記発現レベルを、前記検体におけるＭＵＣ１３の存在量に基づいて測定することを特徴とする請求項１記載の診断方法。
- ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする癌の診断用キット。
- ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする癌の診断用キット。
- 癌細胞におけるＭＵＣ１３遺伝子の発現レベル低減効果を指標として、候補物質の癌予防・治療効果を判定することを特徴とする癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング方法。
- ＭＵＣ１３をコードする核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことを特徴とする癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
- ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする癌予防・治療効果を有する物質のスクリーニング用キット。
- ＭＵＣ１３に反応し得る抗体又はその断片を含有する癌の予防・治療剤。
- ＭＵＣ１３遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はこれらを発現し得るベクターを含有する癌の予防・治療剤。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041012 |