CN114502189A - 以屏障功能障碍为特征的疾病中的黏蛋白同种型 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及黏蛋白同种型领域，尤其是用于诊断、监测、预防和/或治疗以屏障功能障碍为特征的疾病，所述疾病例如但不限于胃肠道病症(例如炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、癌症、胃肠道感染、肥胖、非酒精性脂肪肝(NAFLD))、神经退行性病症、呼吸道感染……。在特定实施方案中，所述黏蛋白同种型选自包括MUC1同种型和MUC13同种型的列表。

Description

以屏障功能障碍为特征的疾病中的黏蛋白同种型
发明领域
本发明涉及黏蛋白同种型领域，尤其是用于诊断、监测、预防和/或治疗以屏障功能障碍为特征的疾病，所述疾病例如但不限于胃肠道病症(例如炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、癌症、胃肠道感染、肥胖、非酒精性脂肪肝(NAFLD))、神经退行性病症、呼吸道感染……。在特定实施方案中，所述黏蛋白同种型选自包括MUC1同种型和MUC13同种型的列表。
发明背景
人体的所有上皮组织都被黏液层覆盖，黏液层由分泌的和膜结合的黏蛋白组成，黏蛋白是一个大分子量糖蛋白家族。跨膜黏蛋白除了通过形成物理屏障为下层上皮提供保护功能外，还参与细胞内信号转导。黏蛋白包含多个编码不同功能域的外显子区域。更具体地说，它们拥有大的细胞外结构域(ECD)，由数量可变的串联重复序列(VNTR)区域组成，该串联重复序列(VNTR)区域富含脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸(即PTS结构域)并具有高度糖基化。此外，跨膜黏蛋白还包含细胞外表皮生长因子(EGF)样结构域、跨膜区(TMD)和包含多个磷酸化位点的较短胞质尾(CT)。ECD与TMD的结合由海胆精子蛋白、肠激酶和聚集素(SEA)结构域介导，该结构域存在于除MUC4外的所有跨膜黏蛋白中。该SEA结构域在内质网中被自身蛋白酶裂解，导致α链(ECD)和β链(TMD和CT)的非共价结合。
在慢性炎症和癌症期间，已观察到跨膜黏蛋白的异常表达。特别令人感兴趣的是MUC1和MUC13。这些跨膜黏蛋白在炎性肠病(IBD)患者的发炎结肠黏膜以及胃癌和结直肠癌患者的肿瘤组织中上调。此外，新证据表明，它们在炎症时的异常表达与黏膜上皮屏障完整性的丧失有关。
由于其多态性，黏蛋白基因中存在的遗传差异(即单核苷酸多态性(SNP))可因选择性剪接而导致不同的mRNA同种型或剪接变体。虽然大多数同种型编码相似的生物功能，但其他同种型有可能改变蛋白质功能，导致疾病进展。尽管仍知之甚少，但黏蛋白同种型的差异表达可能与涉及屏障完整性丧失的炎性疾病和癌症的病理生理学有关。
炎性肠病(IBD)，包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)，仍然是具有高发病率负担的疾病实体，其特征是肠道永久慢性复发性炎症。目前，IBD还没有治愈的治疗方法，这就是为什么患者需要终生服用药物，并且经常需要手术。治疗主要集中在免疫抑制，并且仍然有相当数量的患者没有应答或获得完全缓解。
IBD的病因和发病机制被认为与遗传易感性人群中对肠道复杂微生物菌群的不适当免疫应答有关。肠黏膜屏障将管腔内容物与宿主组织分开，并在微生物菌群与黏膜免疫系统之间的通讯中发挥关键作用。新证据表明，屏障完整性的丧失，也称为“肠道渗漏”，是IBD病理生理学的重要因素。肠黏膜屏障包括厚厚的黏液层、单层上皮细胞和固有层，固有层承载先天性和适应性免疫细胞。如图1所示，该屏障的完整性以多种方式保持。分泌的黏蛋白(如MUC2)和跨膜黏蛋白(如MUC1、MUC4、MUC13)代表了黏液屏障的主要组分，并且以富含脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的结构域为特征，这些结构域高度糖基化(即PTS结构域)。除了具有保护功能外，跨膜黏蛋白还具有细胞外EGF样结构域和细胞内磷酸化位点，使其能够也参与细胞内信号转导。通过这种方式，它们可以通过影响上皮细胞增殖、存活、分化和细胞间相互作用来调节肠道炎症。下面的肠上皮通过分泌和表达黏蛋白和抗菌肽以及通过承载抗原呈递细胞在先天免疫中发挥积极作用。在这个水平上，肠上皮细胞(IEC)、免疫细胞、微生物组和环境抗原之间发生了密切的通讯，形成了对耐受或激活的免疫应答。IEC相互机械连结，并不断更新，以保持适当的屏障功能。这种联系是通过三种类型的细胞间连接实现的，从顶端到基底方向列出如下：紧密连接、黏附连接和桥粒。虽然黏附连接和桥粒通过向上皮提供机械强度来维持细胞间黏附是重要的，而紧密连接调节细胞旁通透性并封闭肠屏障。紧密连接主要由claudin(CLDN)、occludin(OCLN)和连接黏附分子(JAM)组成。除了连接邻近细胞外，它们还与外周细胞内膜蛋白相关，如紧密连接(zonula occludens，ZO)蛋白，这些蛋白将它们锚定在肌动蛋白细胞骨架上。此外，紧密连接还参与调节细胞极性，这是由三个进化保守复合物的相互作用建立的：缺陷分配(PAR；PAR3–PAR6–aPKC)、Crumbs(CRB3–PALS1–PATJ)和Scribble(SCRIB–DLG–LGL)复合物(图1)。Crumbs复合物定义顶端膜，而PAR和Scribble复合物负责建立细胞和基底膜之间的顶端侧向连接。因此，这些极性复合体是互补的，共同作用以启动和维持顶端-基底极性。
到目前为止，IBD中肠黏膜屏障功能改变的潜在机制，尤其是黏蛋白的作用，仍在很大程度上未得到探索。Moehle等人，2006年描述了CD患者结肠中MUC2 mRNA的下调和UC患者中升高的结肠MUC13 mRNA水平。另一项研究(Sheng等人，2011)也证实了后一项发现，而Vancamelbeke及其同事显示，与对照相比，IBD患者回肠和结肠中MUC1和MUC4 mRNA的稳定上调(Vancamelbeke等人，2017)。炎症发生后，MUC1和MUC13在调节黏膜上皮信号传导方面具有不同的作用，其中MUC1具有抗炎作用而MUC13具有促炎症作用(Linden等人，2008；Sheng等人，2012)。最初，炎症期间升高的MUC13抑制上皮细胞凋亡，并且其表达受损可能降低保护水平(Sheng等人，2011)。同样，MUC1保护胃肠道上皮细胞免受感染诱导的凋亡，并提高损伤后伤口愈合率。还应注意，跨膜黏蛋白的不当过度表达可通过调节顶端-基底细胞极性和细胞间相互作用影响屏障完整性，导致紧密连接功能障碍，并因此可能导致局部炎症进展为更严重的疾病，包括IBD。
因此，为了加强我们对跨膜黏蛋白在IBD肠黏膜屏障功能障碍中的新角色的理解，我们进行了体内研究，用两种互补的小鼠模型描述结肠炎过程中影响完整性的屏障成分的变化。
发明内容
在第一方面中，本发明提供一种用于诊断、监测、预防和/或治疗以屏障功能障碍为特征的疾病的黏蛋白同种型，其中黏蛋白同种型选自包括MUC1同种型和MUC13同种型的列表。
在特定实施方案中，所述黏蛋白同种型为跨膜黏蛋白。
在另一特定实施方案中，本发明提供本文定义的黏蛋白同种型，用作诊断和疾病监控或监测的生物标志物。
在另一特定实施方案中，本发明提供本文定义的黏蛋白同种型，用作新的治疗靶点。特别地，可通过单克隆抗体、小分子或反义技术特异性地靶向所述黏蛋白同种型。
在本发明的特定实施方案中，所述以屏障功能障碍为特征的疾病是胃肠道病症，例如选自包括以下的列表：炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、癌症、胃肠道感染、肥胖、非酒精性脂肪肝(NAFLD)；神经退行性病症；或者是呼吸道感染。
在本发明的另一特定实施方案中，所述癌症可选自包括以下的列表：食管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌和前列腺癌。
在本发明的另一实施方案中，所述胃肠道感染可选自包括以下的列表：幽门螺杆菌(Helicobacter)感染、弯曲杆菌(Campylobacter)感染、艰难梭菌(Clostridioidesdifficile)感染和沙门氏菌(Salmonella)感染。
在本发明的又一实施方案中，所述神经退行性病症可选自包括以下的列表：帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症(MS)和孤独症。
在本发明的另一实施方案中，所述炎性肠病可选自包括以下的列表：克罗恩病和溃疡性结肠炎。
在又一实施方案中，所述呼吸道感染可选自包括以下的列表：呼吸道合胞病毒感染、流感病毒感染、鼻病毒感染、偏肺病毒感染、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)病毒感染和冠状病毒感染。例如，所述冠状病毒感染是SARS-CoV-2感染。
附图说明
现在具体参考附图，突显所示的细节仅作为示例并用于说明性讨论本发明的不同实施方案的目的。它们是为了提供被认为是本发明的原理和概念方面的最有用和最容易的描述而呈现的。就这点而言，没有试图比基本理解本发明所必需的更详细地展示本发明的结构细节。使用附图所作的描述使得本领域技术人员清楚地知道如何在实践中体现本发明的几种形式。
图1.肠黏膜屏障的示意图。肠道屏障包括厚厚的黏液层、单层上皮细胞和内层固有层，固有层承载先天性和适应性免疫细胞。分泌的黏蛋白和跨膜黏蛋白(MUC)是黏液屏障的主要组成部分。除了具有保护功能外，跨膜黏蛋白还参与细胞内信号转导。下面的上皮细胞通过分泌和表达黏蛋白和抗菌肽以及通过承载抗原呈递细胞在先天免疫中发挥积极作用。肠上皮细胞通过细胞间连接紧密相连：即紧密连接(claudin(CLDN)、occludin(OCLN)和连接黏附分子(JAM))和黏附连接(E-钙黏着蛋白和β-连环蛋白)。PAR、Crumbs和Scribble极性复合物调节上皮细胞中膜蛋白的极化表达。
图2.过继性T细胞转移模型中肠道炎症的分析。(A)过继性T细胞转移模型的示意图概述和时间线。(B)T细胞转移后体重的相对变化。(C)通过评估体重减轻、毛发竖起、活动度和粪便稠度来每周确定临床疾病评分。(D)通过内窥镜检查并根据血管模式形态、肠壁半透明性、纤维蛋白附着和是否存在稀便每两周对结肠炎的严重程度进行评分。(E)结肠重量/长度比。(F)处死时，纵向打开结肠，目测是否存在溃疡、充血、肠壁增厚和水肿。(G)对H&E染色的结肠切片进行盲法评估，重点关注隐窝破坏、上皮糜烂、杯状细胞损失和免疫细胞浸润。(H)通过测量MPO活性评估结肠中的中性粒细胞浸润。对照和结肠炎小鼠之间的显著差异表示为*p<0.05、**<0.01、***p<0.001(单向AVOVA，Tukey多重比较事后检验)。
图3.DSS诱导的结肠炎模型中的肠道炎症分析。(A)DSS诱导的结肠炎模型的示意图概述和时间表。(B)每日评估体重，并以初始体重的百分比表示。(C)每日测定疾病活动指数(DAI)，即体重减轻、直肠出血程度和大便稠度变化的累积得分。水平条表示DSS施用的周期。(D)直肠出血评分。(E)结肠重量/长度比。(F)处死时，纵向打开结肠，检查是否存在溃疡、充血、肠壁增厚和水肿。(G)微观结肠炎症评分，基于隐窝丢失、上皮糜烂、杯状细胞丢失、免疫细胞浸润和结肠增生。(H)结肠MPO活性以评估结肠的中性粒细胞浸润。N＝8-14只小鼠/组(对照、DSS第1周期、DSS第2周期、DSS第3周期)。对照和结肠炎小鼠之间的显著差异表示为*p<0.05、**<0.01、***p<0.001(单向ANOVA，Tukey多重比较事后检验)。
图4.T细胞转移和DSS诱导的结肠炎模型中结肠细胞因子的表达。对照和T细胞转移或DSS诱导的结肠炎小鼠结肠中促炎和抗炎细胞因子的蛋白表达。显示的结果针对TNF-α(A&F)、IL-1β(B&G)、IL-6(C&H)、IL-10(D&I)和IL-22(E&J)。对照和结肠炎小鼠之间的显著差异表示为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(对于T细胞转移模型，N＝5-10只小鼠/组(第0周(对照)，第1、2、4和6周)；对于DSS模型，N＝6-13只小鼠/组(对照、DSS第1周期、DSS第2周期、DSS第3周期)；单向ANOVA或Kruskal-Wallis、Tukey和Dunn多重比较事后检验)。
图5.分析T细胞转移和DSS诱导的结肠炎模型中的肠道通透性。对照小鼠与结肠炎动物相比的相对胃肠道通透性：(A)T细胞转移模型(N＝7-10只小鼠/组(第0周(对照)，第1、2、4和6周)；(B)DSS模型(N＝8-13只小鼠/组(对照、DSS第1周期、DSS第2周期、DSS第3周期))。对照和结肠炎小鼠之间的显著差异表示为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(Kruskal-Wallis检验、Dunn事后多重比较检验)。
图6.过继性T细胞转移模型中的结肠黏蛋白表达。(A-D)对照和T细胞转移诱导的结肠炎小鼠结肠中Muc1、Muc2、Muc4和Muc13(N＝7-10只小鼠/组(第0(对照)、1、2、4和6周))的mRNA表达。对照和结肠炎小鼠之间的显著差异表示为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(单向ANOVA，Tukey事后多重比较检验)。
图7.DSS诱导的结肠炎模型中的结肠黏蛋白表达。(A-D)对照和DSS诱导的结肠炎小鼠结肠中Muc1、Muc2、Muc4和Muc13(N＝10-13小鼠/组(对照、DSS第1周期、DSS第2周期、DSS第3周期))的mRNA表达。对照和结肠炎小鼠之间的显著差异表示为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(单向ANOVA，Tukey事后多重比较检验)。
图8.过继性T细胞转移模型中的结肠细胞间连接表达。对照和T细胞转移诱导的结肠炎小鼠结肠中几种Claudin(Cldn)、紧密连接(Zo/Tjp)、连接黏附分子(Jam)、Occludin(Ocln)、E-钙黏着蛋白(Cdh1)和肌球蛋白轻链激酶(Mylk)的mRNA表达。健康对照和结肠炎小鼠之间的显著差异表示为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(N＝10-13只小鼠/组(第0周(对照)、第1、2、4和6周)表示；单向ANOVA或Kruskal-Wallis、Tukey和Dunn多重比较事后检验)。
图9.DSS模型中的结肠细胞间连接表达。对照和DSS诱导的结肠炎小鼠结肠中几种Claudin(Cldn)、紧密连接(Zo/Tjp)、连接黏附分子(Jam)、Occludin(Ocln)、E-钙黏着蛋白(Cdh1)和肌球蛋白轻链激酶(Mylk)的mRNA表达。对照和结肠炎小鼠之间的显著差异表示为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(N＝10-13只小鼠/组(对照、DSS第1周期、DSS第2周期、DSS第3周期)；单向ANOVA或Kruskal-Wallis、Tukey和Dunn多重比较事后检验)。
图10.结肠炎过程中细胞极性蛋白的结肠表达。在T细胞转移(N＝7-10只小鼠/组(第0(对照)、1、2、4和6周))和DSS诱导的结肠炎模型(N＝10-13只小鼠/组(对照、DSS第1周期、DSS第2周期、DSS第3周期))中的(A)Par3、Par6、aPkcλ和
Figure GDA0003562081490000071
(PAR复合物)(B)Crb3、Pals1和Patj(Crumbs复合物)以及(C)Scrib、Dlg1和Llgl1(Scribble复合物)的mRNA表达。对照和结肠炎小鼠之间的显著差异表示为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(单向ANOVA，Tukeys事后多重比较检验)。
图11.以Muc1、Muc2、Muc4和Muc13的mRNA表达值作为预测因子的判别分析。对T细胞转移和DSS模型进行判别分析，以预测健康对照和结肠炎组(第0、1、2、4、6周；DSS第1周期、DSS第2周期、DSS第3周期)。每个函数的主要预测变量在结构矩阵中说明。(A)对于T细胞转移模型，不同的实验组主要通过Muc1(函数1)和Muc13(函数2)进行区分。在57.8％的病例中，个体小鼠被正确注释到其各自的组中。(B)对于DSS结肠炎模型，不同的实验组主要通过Muc2(函数1)、然后是Muc1和Muc13(函数2)进行区分。在69.6％的病例中，个体小鼠被正确注释到其各自的组中。
图12.T细胞转移模型和DSS结肠炎模型的相关数据散点图。
T细胞转移模型：(A)肠道通透性与IL-1β蛋白和Muc1 mRNA表达水平的相关性。(C)Muc1表达与IL-1β和IL-6蛋白表达的相关性。(E)Muc1 mRNA表达与细胞间连接Cldn1和Ocln表达水平的相关性。(G)Muc1 mRNA表达与细胞极性复合物亚基Par3和aPKCζ表达水平的相关性。
DSS结肠炎模型：(B)肠道通透性与TNF-α蛋白和Muc13 mRNA表达水平的相关性。(D)Muc13 mRNA表达与TNF-α蛋白表达的相关性。(F)Muc13mRNA表达与细胞间连接Cldn1、Jam2和Tjp2表达水平的相关性。(H)Muc13mRNA表达与细胞极性复合物亚基aPKCζ、Crb3和Scrib表达水平的相关性。相关性是根据多元线性回归分析的结果选择的。显示了回归模型的相应调整R2值和p值。
图13.以细胞因子、紧密连接和极性复合物的表达水平作为预测因子的判别分析。根据T细胞转移(A-C)和DSS(D-F)结肠炎模型中细胞因子(蛋白质)、紧密连接(mRNA)和细胞极性蛋白(mRNA)的表达，进行判别分析以预测健康对照和结肠炎组(T细胞转移/DSS施用周期后周数)。图例中说明了每个函数的主要预测变量(未显示集中组内相关性)。总的来说，T细胞转移后1周和DSS第1周期后处死的小鼠与对照小鼠和其他实验组明显不同。(A)72.4％的病例根据细胞因子表达进行了正确分类，并主要由IL-1β(函数1)、TNF-α和IL-6(函数2)的表达决定。(B)72.1％的病例根据紧密连接表达正确分类，并主要由Ocln(函数1)和Cldn2、Cldn1、Tjp2、Jam2和Jam2(函数2)的表达决定。(C)84.1％的病例根据细胞极性蛋白的表达正确分类，并主要由Par3(函数1)和Dlg、Patj、Scrib、Llgl1和Pals1(函数2)的表达决定。(D)37.3％的病例根据细胞因子表达进行了正确分类，并主要由IL-1β、IL-10(函数1)和TNF-α(函数2)的表达决定。在此分析中，缺失值被转换为平均值，这可能解释了错误的预测。(E)76.5％的病例根据紧密连接表达正确分类，并主要由Jam2、Cldn2、Jam3、Cldn15、Cldn5、Tjp1和Cldn1(函数1)以及Tjp3、Ocln和Jam1(函数2)的表达确定。(F)64.7％的病例根据细胞极性亚基的表达正确分类，并主要由Par3(函数1)的表达决定。
图14：IBD患者(a)非发炎的和(b)发炎的结肠组织中MUC1的替代mRNA转录本。上图显示了Sashimi图，用于总结选择性mRNA转录本中的剪接连接。以蓝色突出显示的基因结构说明了MUC1的整体外显子结构以及相应的外显子数量和编码结构域(CT＝胞质尾部；TMD＝跨膜结构域；ECD＝胞外结构域；EGF＝表皮生长因子；SEA＝海胆精子蛋白、肠激酶和聚集素；VNTR＝可变数量的串联重复；SP＝信号肽)。在非发炎的和发炎的肠组织中都能发现彩色转录本。灰色mRNA转录本突出显示仅在一种情况下(即发炎的或非发炎的)发现的转录本。在右图上，可以找到同种型标识号，其详细信息如表5所示(n＝3个成对样品)。
图15：IBD患者(a)非发炎的和(b)发炎的结肠组织中MUC13的选择性mRNA转录本。上图显示了Sashimi图，用于总结选择性mRNA转录本中的剪接连接。以蓝色突出显示的基因结构说明了MUC13的整体外显子结构以及相应的外显子编号和编码结构域(CT＝胞质尾部；TMD＝跨膜结构域；ECD＝胞外结构域；EGF＝表皮生长因子；SEA＝海胆精子蛋白、肠激酶和聚集素；VNTR＝可变数量的串联重复序列；SP＝信号肽)。在非发炎的和发炎的肠组织中都能发现彩色转录本。灰色mRNA转录本突出显示仅在一种情况下(即发炎的或非发炎的)发现的转录本。在右图上，可以找到同种型标识号，其详细信息如表5所示(n＝3个成对样品)。
图16：以0.1MOI感染SARS-CoV-2进行48h的ctrl和MUC13 siRNA转染的肠道(LS513和Caco2)和肺(Calu3)上皮细胞的上清液中检测SARS-CoV-2E的RT-qPCR结果。显示循环阈值。细胞系内ctrl和MUC13 siRNA转染细胞之间的显著差异表示为###p<0.001，并且不同转染细胞系之间的显著差异表示为***p<0.001。(单向ANOVA，Tukey事后多重比较检验，N＝6)。误差条表示SEM。
图17：在以0.1MOI感染SARS-CoV-2进行24h和48h的肠(LS513和Caco2)和肺(Calu3)上皮细胞中ACE2和TMPRSS2的相对mRNA表达。包括用病毒生长培养基处理的细胞作为对照。SARS-CoV-2感染的细胞和未感染的细胞之间的显著差异表示为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(单向ANOVA，Tukey事后多重比较检验，N＝6)。误差条表示SEM。
图18：以0.1MOI感染SARS-CoV-2进行24h和48h的肠(LS513和Caco2)和肺(Calu3)上皮细胞中跨膜黏蛋白(MUC1、MUC4和MUC13)的相对mRNA表达。包括用病毒生长培养基处理的细胞作为对照。SARS-CoV-2感染的细胞和未感染的细胞之间的显著差异表示为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(单向ANOVA，Tukey事后多重比较检验，N＝6)。误差条表示SEM。
图19：以0.1MOI感染SARS-CoV-2进行24h和48h的肠(LS513和Caco2)和肺(Calu3)上皮细胞中分泌黏蛋白(MUC2、MUC5AC、MUC5B和MUC6)的相对mRNA表达。包括用病毒生长培养基处理的细胞作为对照。SARS-CoV-2感染的细胞和未感染的细胞之间的显著差异表示为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(单向ANOVA，Tukey事后多重比较检验，N＝6)。误差条表示SEM。
图20：以0.1MOI感染SARS-CoV-2进行48h的ctrl siRNA和MUC13-siRNA转染的肠(LS513和Caco-2)和肺(Calu3)上皮细胞中MUC13和ACE2的相对mRNA表达。包括用病毒生长培养基处理的转染细胞作为对照。SARS-CoV-2感染的细胞和未感染的细胞之间的显著差异表示为#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。感染或未感染SARS-CoV-2的ctrl-siRNA和MUC13-siRNA转染细胞之间的显著差异表示为***p<0.001。单向ANOVA，Tukey事后多重比较检验，N＝6。误差条表示SEM。
图21：以0.1MOI感染SARS-CoV-2进行24h和48h的肠(LS513和Caco2)和肺(Calu3)上皮细胞中连接蛋白(CLDN1、CLDN2、CLDN3、CLDN4、CLDN7、CLDN12、CLDN15、CLDN18、OCLN、ZO-1和ZO-2以及CHD1(E-钙黏着蛋白))的相对mRNA表达。包括用病毒生长培养基处理的细胞作为对照。SARS-CoV-2感染的细胞和未感染的细胞之间的显著差异表示为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001(单向ANOVA，Tukey事后多重比较检验，N＝6)。误差条表示SEM。
发明详述
如上所述，在第一方面中，本发明提供一种用于诊断、监测、预防和/或治疗以屏障功能障碍为特征的疾病的黏蛋白同种型，其中黏蛋白同种型选自包括MUC1同种型和MUC13同种型的列表。
成熟黏蛋白由两个不同区域构成：氨基和羧基末端区域，它们轻度糖基化，但富含半胱氨酸，参与黏蛋白单体内部和之间建立二硫键；以及大的中心区域，由10到80个残基序列的多个串联重复形成，富含丝氨酸和苏氨酸。该区域被数百个O-连接低聚糖饱和。
在本发明的上下文中，术语“黏蛋白同种型”意指一组类似的mRNA分子或其编码蛋白质的成员，其来源于单个黏蛋白基因并且是遗传差异的结果。这些同种型可能由选择性剪接、可变启动子使用或基因的其他转录后修饰形成。通过RNA剪接机制，mRNA能够选择基因的不同蛋白质编码区段(外显子)，或甚至从RNA中选择外显子的不同部分，以形成不同的mRNA序列，即同种型。每个独特的序列产生一种特定形式的蛋白质。黏蛋白基因的遗传差异可导致从同一黏蛋白基因位点的基因座产生不同的mRNA同种型(即通过选择性剪接产生的剪接变体)。虽然大多数同种型编码相似的生物功能，但其他同种型有可能改变蛋白质功能，导致进展成疾病。因此，本发明具体涉及在各种病症中鉴别和/或使用这种黏蛋白同种型。本发明特别提供下文示例部分中定义的黏蛋白同种型，具体而言，表5、6、S2和S3中提及的黏蛋白同种型；以及图14和图15中提及的黏蛋白同种型。本发明还提供了本申请中详述的此类黏蛋白同种型的用途。
根据本发明的术语“同种型”包括基因的转录变体(其为mRNA分子)以及相应的多肽变体(其为多肽)。例如，这种转录变体来自选择性剪接或移码的转录起始。基于不同的转录变体，产生不同的多肽。不同的转录变体可能有不同的翻译起始位点。本领域技术人员将理解，只要同种型与作为mRNA的转录变体相关，就可以通过用于定量mRNA的适当技术来测量同种型的量。这些技术的例子包括基于聚合酶链反应的方法、基于原位杂交的方法、基于微阵列的技术和全转录组长读测序。此外，本领域技术人员将理解，只要同种型与多肽相关，就可以通过用于量化多肽的适当技术来测量同种型的量。此类多肽定量技术的示例包括基于ELISA(酶联免疫吸附测定)、基于凝胶、基于印迹、基于质谱和基于流式细胞术的方法。
在特定实施方案中，所述黏蛋白同种型是跨膜黏蛋白，其是横跨整个细胞膜的一种完整膜蛋白。这些黏蛋白形成一个通道，允许/阻止特定物质通过膜运输。
本申请中重点关注的特定的一组疾病是，它们以屏障功能障碍为特征。术语屏障功能障碍是指受试者内部屏障自然功能的部分或完全破坏。此类屏障可例如包括脑屏障、胃肠黏膜屏障、呼吸黏膜屏障、生殖黏膜屏障和尿黏膜屏障。
胃肠黏膜屏障将管腔内容物与宿主组织分开，并在微生物菌群与黏膜免疫系统之间的通讯中起着关键作用。新证据表明，屏障完整性的丧失，也被称为“肠道渗漏”，是胃肠道病症(包括IBD(炎性肠病))的病理生理学的重要促成因素。
血脑屏障是内皮细胞的高度选择性半透性边界，防止循环血液中的溶质非选择性地进入中枢神经系统的细胞外液。血脑屏障限制病原体的通过、血液中溶质和大分子或亲水分子进入脑脊液的扩散，同时允许疏水分子(如O2、CO2、激素……)和小极性分子的扩散。因此，功能不正常的血脑屏障可能与神经系统疾病、特别是神经退行性病症有关。不仅血脑屏障可能在神经系统疾病中起作用，其他脑屏障，如血脑脊液屏障，也可能与神经系统疾病有关。
呼吸黏膜屏障的主要功能是在环境和生物体内部之间形成物理屏障。它是针对病原体和过敏原等持续吸入物质的第一道屏障。增加的黏液产生通常与呼吸道感染或呼吸道疾病(例如COPD(慢性阻塞性肺疾病))有关。此外，发现严重疾病COVID-19患者(即具有SARS-CoV-2感染)有严重的护理需要，可能会特别是在肺细支气管和肺泡中产生黏液过度生成，这是妨碍ICU停留和恢复的观察现象。因此，本发明可对呼吸道感染，尤其是诸如SARS-CoV-2感染的冠状病毒感染的诊断、监测、预防和/或治疗具有重大影响。
因此，在本发明的特定实施方案中，所述以屏障功能障碍为特征的疾病可以是胃肠道病症；神经退行性病症；癌症或呼吸道感染。
在特定实施方案中，所述胃肠道病症可选自包括以下的列表：炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、癌症、胃肠道感染、肥胖、非酒精性脂肪肝(NAFLD)。在本发明的另一实施方案中，所述炎性肠病可选自包括以下的列表：克罗恩病和溃疡性结肠炎。
在本发明的另一特定实施方案中，所述癌症可选自包括以下的列表：食管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌和前列腺癌。
在本发明的另一实施方案中，所述胃肠道感染可选自包括以下的列表：幽门螺杆菌感染、弯曲杆菌感染、艰难梭菌感染和沙门氏菌感染。
在本发明的又一实施方案中，所述神经退行性病症可选自包括以下的列表：帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症(MS)和孤独症。
在又一实施方案中，所述呼吸道感染可选自包括以下的列表：呼吸道合胞病毒感染、流感病毒感染、鼻病毒感染、偏肺病毒感染、铜绿假单胞菌病毒感染和冠状病毒感染。所述冠状病毒感染例如是SARS-CoV-2感染。
如本文所使用的，术语“处理”、“治疗中”、“治疗”等指获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的副作用而言，效果可以是治疗性的。本文所用的“治疗”包括对哺乳动物、特别是人类的疾病或状况的任何治疗，并且包括：(a)防止该疾病发生在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者身上；(b)抑制疾病，即阻止其发展；和(c)缓解疾病，即导致疾病消退。
本文所述试剂的“治疗有效量”是足以在治疗病症中提供治疗益处或者延迟或最小化与病况相关的一个或多个症状的量。试剂的治疗有效量是指单独或与其他疗法组合的治疗试剂的量，其在该病况的治疗中提供治疗益处。术语“治疗有效量”可包括改善整体疗法、减少或避免病况的症状、体征或原因和/或增强另一治疗剂的治疗功效的量。
疾病的预防可能涉及对疾病的完全保护，例如在预防病原体感染的情况下，或者可能涉及预防疾病进展。例如，预防疾病可能并不意味着在任何水平上完全消除与疾病相关的任何影响，而是意味着预防疾病症状至临床显著或可检测的水平。预防疾病也可能意味着防止疾病进展到疾病的后期。
术语“患者”通常与术语“受试者”同义，并且包括所有哺乳动物，包括人类。患者的例子包括人类、牲畜(如牛、山羊、绵羊、猪和兔)以及伴侣动物(如狗、猫、兔和马)。优选地，患者是人类。
本文使用的术语“诊断”是指评估受试者是否患有本文所公开的疾病。如本领域技术人员将理解的那样，这种评估通常并不打算对所有(即100％)待鉴别的受试者都是正确的。然而，该术语要求能够鉴别出统计上显著部分的受试者。在一些实施方案中，术语诊断还指筛查。在一些实施方案中，疾病筛查可导致特定病例中的较早期诊断，并且诊断正确的疾病同种型可导致适当的治疗。
在另一特定实施方案中，本发明提供本文定义的黏蛋白同种型，用作诊断和疾病监控或监测的生物标志物。
通过使用本发明的方法监测个体的MUC同种型状态的进展和变化，临床医生或从业者能够做出与对任何一个个体采用的治疗方法有关的知情决定。例如，在某些实施方案中，可以确定具有特定黏蛋白同种型的患者可能对特定治疗有反应或没有反应。因此，通过使用本发明的方法监测黏蛋白同种型载体对各种治疗方法的应答，还可以定制组合两种或更多种治疗的方法，每种治疗靶向个体中不同的同种型亚群。
在另一特定实施方案中，本发明提供本文定义的黏蛋白同种型，用作新的治疗靶标。特别地，可通过单克隆抗体、小分子或反义技术特异性地靶向所述黏蛋白同种型。
实施例
材料和方法
动物
从Charles River(法国)购买了8至9周龄的雌性免疫受损SCID(C.B-17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl)和BALB/C小鼠(T细胞转移模型)以及7至8周龄的雄性C57BL/6J小鼠(DSS模型)。所有动物都被安置在传统的动物设施中，可以随意获得食物和水，光照周期为12小时。到达动物设施后，在实验开始之前，让小鼠适应环境7天。
结肠炎模型及实验设计
结肠炎的小鼠模型是理解IBD发病机制的主要工具，但每个单独的模型都有其局限性，因为它不能完全概括这种人类疾病的复杂性。其中，过继性T细胞转移模型主要用于研究T细胞介导的肠道炎症的免疫机制，较少用于研究屏障完整性。相比之下，葡聚糖硫酸钠(DSS)模型被描述为检查与肠道炎症和屏障功能障碍的发展有关的先天免疫机制的有用模型。更具体地，DSS对结肠上皮有毒，并且口服该化合物会导致上皮细胞损伤和先天性免疫应答，这改变黏膜屏障完整性。由于每个结肠炎模型都为IBD的某个方面提供了有价值的见解，因此，使用不同病理起始的多个模型将更广泛地了解这些疾病的病理生理学，包括屏障功能障碍。
T细胞转移模型：如前所述，通过过继转移从BALB/c供体小鼠脾脏分离的CD4+CD25-CD62L+T细胞，在SCID小鼠中诱导结肠炎(图2A)。为了监测疾病进展，每周对动物称重，并根据以下临床疾病参数对动物进行临床评分：体重减轻、毛发竖起、粪便稠度和活动度。根据疾病严重程度，每个参数从0到2进行分级(0＝不存在，1＝中等，2＝严重；对于体重减轻，0＝体重增加，1＝稳定，2＝体重减轻)。因此，累积分数在0到8之间。此外，在固定时间点(第0、2、4和6周)，使用外径为3.0mm的灵活Olympus URF P5型输尿管镜(Olympus EuropeGmbH)，通过结肠镜连续监测个体小鼠的肠道炎症。简单地说，用氯胺酮(60mg/kg，Ketalar，辉瑞)和甲苯噻嗪(6.67mg/kg，Rompun，拜耳)的混合物(腹腔内(i.p.))对小鼠进行镇静，并将其置于俯卧位。肛门括约肌用凝胶润滑(RMS内窥镜)，以便于插入内窥镜。随后，将内镜小心地通过肛门尽可能远地插入镇静小鼠的结肠中。在内镜退出期间，对以下参数进行评分：血管模式形态、肠壁半透明性、纤维蛋白附着和是否存在稀便(每个范围为0到3)，累积最小值为0(无炎症)，最大值为12(严重炎症)。
DSS诱导的结肠炎模型：通过将2％DSS(36-50kDa)加入高压灭菌饮用水中进行7天随意饮用，诱导急性结肠炎。这一循环再重复两次，中间恢复期为正常饮用水7天，以诱发更多慢性形式的结肠炎。对照小鼠仅接受高压灭菌饮用水(图3A)。每天检查水位，每隔一天更换一次。每天，通过分析体重减轻计算个体疾病活动指数(DAI)(0＝<1％，1＝1-5％，2＝5-10％，3＝10-20％，4＝>20％)，粪便稠度(0＝正常，1＝半固体，2＝稀便，4＝腹泻)和直肠出血(0＝无出血，2＝可见血，4＝大出血)，以获得这些参数的累积分数，范围为0(健康)到12(严重结肠炎)。
在移植后1、2、4和6周以及每次DSS处理结束时(图2A和3A)，每组10-14只动物(对照、T细胞移植和DSS)在麻醉下放血处死(90mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪；i.p.)。收集的血液离心以获得血清供进一步分析。随后，切除结肠，清除粪便，测定结肠的重量和长度，并以重量/长度比(mg/cm)表示。然后根据以下参数对宏观炎症进行评分：溃疡、充血、肠壁增厚和黏膜水肿的存在。对于T细胞转移模型，根据严重程度，每个参数的得分从0到3，导致最大累积得分为12，如Heylen等人,2013年所述。对于DSS模型，使用了Wallace等人，1992年的宏观评分系统，得到0到5的分数。此后，从结肠(远端)采集不同的样品并立即处理，或储存在“RNA later”中，快速冷冻或包埋在石蜡或冷冻保护剂中，直至进一步分析(见下文)。
髓过氧化物酶(MPO)活性测定
在结肠组织中测量髓过氧化物酶(MPO)活性，作为中性粒细胞浸润的参数(Heylen等人，2013年)。简单地说，将结肠样品浸入含有0.5％十六烷基三甲基溴化铵(0.02mL/mg组织)的磷酸钾(pH 6.0)中。此后，样品均化，进行两次冻融循环，然后在4℃以15000rpm离心15分钟。然后将一等份(0.1mL)的上清液添加到2.9mL的邻二甲苯胺溶液中(即16.7mg邻二甲苯胺二盐酸盐在1mL甲醇中，98mL的pH值为6.0的50mM磷酸钾缓冲液和1mL的0.005％H2O2溶液)。随后立即，使用Spectronic Genesys 5分光光度计(Milton Roy)在460nm处60秒读取样品吸光度的变化。一个单位的MPO活性等于在25℃每分钟能将1mmol H2O2转化为H2O的酶量。
RNA提取及RT-qPCR检测基因表达
根据制造商的说明，使用
Figure GDA0003562081490000161
RNA plus试剂盒(Macherey-Nagel)提取储存在“RNA later”中的结肠组织总RNA。使用
Figure GDA0003562081490000162
ND-1000UV-Vis分光光度计(Thermo Fisher Scientific)评估RNA的浓度和质量。随后，使用SensiFastTMcDNA合成试剂盒(Bioline)通过反转录将1μg RNA转化为cDNA。然后在QuantStudio 3实时PCR仪器(Thermo Fisher Scientific)上使用GoTaq qPCR主混合物(Promega)通过SYBR Green RT-qPCR测定相对基因表达。引物序列如补充表1所示。
Figure GDA0003562081490000163
Figure GDA0003562081490000171
Figure GDA0003562081490000181
所有RT-qPCR反应重复进行，包括：初始DNA聚合酶激活步骤在95℃下进行2分钟，然后40个循环：变性在95℃进行15秒，以及退火/延伸在60℃进行1分钟。使用qbase+软件(Biogozelle)进行分析和质量控制。将靶基因的相对表达标准化至管家基因Actb和Rpl4的表达。
肠道通透性的量化
为了评估体内肠道通透性，按照Gupta等人2014年的描述进行了FITC葡聚糖肠道通透性测定。简言之，在安乐死前4小时，用FITC葡聚糖(44mg/100g体重(T细胞转移)、60mg/100g体重(DSS模型)、4kDa、Sigma)对小鼠进行胃内接种。安乐死后，通过心脏穿刺采集血液，并将其转移到SSTII高级采血管(SSTII Advance Blood Collection Tubes，BDVacutainer)中。离心(10000rpm，5分钟)后，收集血清并用PBS均匀稀释。随后，将100μl的等分试样以双倍添加到96孔微孔板中，并在激发波长为480nm和发射波长为530nm的条件下，通过荧光分光光度计(Fluoroskan微孔板荧光计，Thermo Fisher Scientific)测量FITC的浓度。使用系列稀释的FITC葡聚糖溶液的标准曲线计算每孔的确切FITC葡聚糖浓度。
细胞因子测量
为了在蛋白质水平上确定结肠炎症介质，采用了两种不同的方法。首先，用PBS冲洗新鲜结肠段，吸干并称重。随后，将样品储存在冰上，直到在Tris-EDTA缓冲液(即含有10mM Tris、1mM EDTA、0.5％v/v吐温-20和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)的PBS)中以每毫升缓冲液100mg组织的比率进一步处理。然后对样品进行均质、离心(11000rpm、10min、4℃)，并将上清液储存在-80℃下，直至进一步分析。根据制造商的说明，使用细胞计数珠阵列(CBA)(BD Biosciences)针对肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-1β和IL-6定量结肠细胞因子水平。在BD Accuri C6流式细胞仪上进行荧光检测，并使用FCAP阵列软件进行数据分析。其次，使用珠子将快速冷冻的结肠组织均质化，并在冰冷的补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合片(罗氏)的NP-40缓冲液(即20mM Tris-HCl(pH 8)、137mM NaCl、10％甘油、1％nonidet-40、2mM EDTA)中提取总蛋白。离心(14.000rpm，10分钟，4℃)以去除细胞碎片后，使用Pierce BCA蛋白质分析试剂盒(Thermo FisherScientific)测定蛋白质浓度。然后进行酶联免疫吸附试验(ELISA)以在蛋白质水平上定量结肠细胞因子表达。为此，根据制造商的说明，使用小鼠未包被的ELISA试剂盒(Invitrogen)测量IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和IL-22的蛋白质浓度。通过对试剂盒中的最高标准品进行2倍的连续稀释，形成标准曲线。对于每个样品，通过ELISA对100μl的2.5μg/ml蛋白质溶液进行分析，一式两份。
组织病理学和免疫组织化学
为了在微观水平评估炎症，全层结肠段在4％甲醛中固定24小时，然后包埋在石蜡中。对横截面切片(5μm厚)进行脱蜡和再水化。然后根据标准化方案，用苏木精Gill IIIProsan(默克)和伊红黄(VWR)对切片进行染色。根据炎症浸润程度(0-3)、杯状细胞的存在(0-1)、隐窝结构(0-3)、黏膜糜烂和/或溃疡(0-2)、隐窝脓肿的存在(0-1)和受影响的层数(0-3)对炎症进行评分，得出0-13的累积分数(Moreels等人，2004)。进行高碘酸希夫(PAS)染色以检测石蜡包埋结肠切片中的黏蛋白糖蛋白。简言之，在0.5％高碘酸溶液中进行初始氧化步骤5分钟后，将再水合的5μm厚结肠切片放置在希夫试剂中15分钟。然后，用自来水清洗结肠切片，用苏木精复染，并通过光学显微镜(Olympus BX43)进行分析。
使用以下一级抗体在石蜡包埋的结肠组织上也应用几种免疫组化黏蛋白染色：多克隆兔Muc1(Abcam(ab15481)，1/1000)，Muc2(Novus Biologicals(NBP1-31231)，1/3000)，Muc4(Novus Biologicals(NBP1-52193SS)，1/3000)和内部Muc13(1/2000)抗体。简而言之，在EDTA(pH 8)(MUC1和MUC13)或柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH 6)(MUC2和MUC4)中进行热诱导抗原修复(heat-induced antigen retrieval)。随后，通过载玻片用在甲醇中的3％H2O2温育(5分钟)，阻断内源性过氧化物酶活性。在4℃进行一级抗体培养过夜。随后，通过在室温下将结肠切片与山羊抗兔生物素化二级抗体(MUC13的EnVision检测系统)温育60分钟，然后与HRP-抗生物素复合物温育，观察黏蛋白。最后，通过与氨基乙基咔唑(AEC)短时间温育来显示靶标抗原，然后用苏木精对切片进行复染。使用含有0.1％Triton X-100(pH 7.6)的Tris缓冲盐水进行洗涤步骤。染色通过光学显微镜(Olympus BX43)进行分析。
为了显示结肠中的紧密连接，将新鲜结肠组织横向放置并浸入Richard-AllanScientificTMNeg-50TM冷冻切片介质(Thermo Fisher Scientific)中并快速冷冻，然后将6μm冷冻切片安装在SuperFrost载玻片(Thermo Fisher Scientific)上。在丙酮中短暂固定5分钟后，干燥切片，并用补充有1％白蛋白的Tris缓冲盐水冲洗。然后将切片与以下一级抗体一起温育过夜：ZO-1(Invitrogen(61-7300)，1/1000)和CLDN1(abcam(ab15098)，1/2000)。第二天，使用山羊抗兔Alexa Fluor 594二级抗体(Invitrogen，1/800)进行二级抗体温育60分钟。在蒸馏水中冲洗后，使用含有DAPI的Vectashield固定介质(VectorLaboratories)对结肠切片进行复染并防止褪色。使用补充有0.1％Triton X-100的Tris缓冲盐水执行洗涤步骤。为了显示，使用配备有尼康DS-Qi2摄像机的尼康Eclipse Ti倒置荧光显微镜。所有切片均盲取，以获得具有代表性的图像。
统计
使用GraphPad Prism 8.00软件(许可证DFG170003)进行统计分析，以确定特定模型(T细胞转移或DSS)中对照和不同结肠炎组之间的显著差异。除非另有说明，数据通过单向方差分析(ANOVA)和非参数Kruskal-Wallis检验进行分析，并以平均值±平均值标准误差(SEM)或箱线图(最小值到最大值)表示。显著性水平在图中表示为*p<0.05、***<0.01、***p<0.001，并使用Tukey-Kramer和Dunn事后多重比较检验对多重测试进行校正。
根据一组预测变量(即细胞因子、黏蛋白或其他屏障介质的表达)，进行判别函数分析，以确定结肠炎小鼠是否能够与对照动物区分开来。结果以散点图表示，显示了两个主要判别函数(即函数1和函数2)，相应的主要预测变量汇总在表中。此外，还进行了多元线性回归分析，以研究(1)屏障完整性变化与黏蛋白、细胞因子和屏障介质表达之间的相关性；(2)在黏蛋白、细胞因子和屏障介质的表达之间的相关性。散点图显示了不同实验组之间的区别以及回归模型的相应p值。p值低于0.05被认为具有统计学意义。这些分析使用IBMSPSS Statistics 24软件进行。
结果
结肠炎随时间演变的宏观和微观观察
在T细胞转移模型中，SCID小鼠在过继转移幼稚T细胞一周后开始出现结肠炎的临床症状。与转移前的初始体重相比，转移后1周体重下降，并且这种下降逐渐持续到第6周(图2B)。从第1周到第4周，随着时间的推移，临床疾病评分逐渐增加，但随后又停滞不前(图2C)。每2周进行一次结肠镜检查，以监测肠壁结肠炎的体征，与对照小鼠相比，转移后第2、4和6周的炎症评分显示时间依赖性增加(图1D)。处死后，在宏观和微观水平上对结肠黏膜损伤进行评分。在移植后2、4和6周处死的小鼠显示宏观炎症逐渐增加(图2F)。结肠炎症的另一个宏观标志物结肠重量/长度比也出现了这种现象，结肠重量/长度比是结肠水肿的量化指标(图2E)。相反，在移植后第1周，在H&E染色的结肠炎小鼠结肠段上，中性粒细胞和淋巴细胞的浸润已经可见(图2G)。随着疾病进展到第2、4和6周，免疫细胞的黏膜和黏膜下浸润逐渐增加，并与结肠厚度显著增加相关(图2G)。此外，由黏膜中性粒细胞浸润引起的MPO活性从转移后2周开始增加，随着时间的推移逐渐增加至第4周和第6周(图2H)。
在DSS结肠炎模型中，在第一个周期DSS施用5天后，接受DSS处理的小鼠开始体重减轻。当在第8天重新引入正常饮用水时，体重进一步下降，在实验方案的第11天体重下降最大(图3B)。结肠炎小鼠在第二个DSS周期结束时(第21天)开始恢复体重，直到实验结束时达到初始体重。健康对照小鼠体重随时间增加(图3B)。由于DSS施用，在DSS施用7天后，每个DSS组的小鼠在粪便稠度和直肠出血方面表现出最大的变化，这些变化在恢复期减少并完全消失(图3)。上述用于评估该模型中临床疾病的参数(体重、粪便稠度和直肠出血)组合在DAI评分中，如图3D所示。在整个实验过程中，对照小鼠未显示任何疾病体征，而在DSS第1周期后，施用2％DSS持续7天稳定诱发轻度急性结肠炎。然而，随后的两个DSS周期导致慢性结肠炎的发展，个体间差异性增加。
为了评估DSS诱导的结肠炎对结肠宏观和微观炎症参数的影响，在每个DSS施用周期后处死一组小鼠(分别为DSS第1周期、DSS第2周期和DSS第3周期，图3A)。与对照相比，所有三组(第1、2和3周期)的结肠重量/长度比均增加。所有DSS周期中的宏观炎症评分均增加(图3F)，DSS第1周期后大量出现充血和溃疡，而DSS第2和3周期后结肠增厚。根据H&E染色结肠切片评分，所有DSS组均存在微观炎症(图3G)，并显示急性DSS处理小鼠结肠中隐窝丢失、上皮糜烂和明显的中性粒细胞浸润(数据未显示)。在DSS第2和3周期结束时，与急性期相比，结肠切片显示上皮再生，但增生显著。黏膜下层和黏膜中也可观察到中性粒细胞和淋巴细胞浸润(数据未显示)。此外，一些小鼠甚至在结肠出现大量局部溃疡。在分子水平上，在DSS诱导的结肠炎进展过程中，MPO活性增加(图3H)，这证实了由于DSS施用，中性粒细胞渗入结肠。有趣的是，与仅接受一次DSS处理的小鼠相比，接受3个DSS周期处理的小鼠显示显著更低的结肠MPO活性。
结肠炎症标志物
在两种结肠炎模型中，如图4所示，对几种炎症标志物的结肠蛋白水平进行了量化。在转移后的所有时间点和DSS施用的每个周期后，IL-1β和TNF-α的表达增加，而IL-10的表达减少(图4A-B，D，F-G，I)。有趣的是，IL-22蛋白水平仅在移植后1周和6周以及DSS第1和3周期结束时增加(图4E，J)。相反，IL-6的表达仅在结肠炎的更慢性阶段增加，即在转移后第6周(图4C)和DSS施用第二个周期后(图4H)。
结肠炎进展期间的黏膜屏障功能
由于肠道屏障完整性的丧失被认为是IBD病理生理学的一个主要标志18，因此在两种模型中研究了结肠炎进展期间屏障通透性的变化。FITC葡聚糖肠道通透性测定的结果表明，两种模型中肠黏膜屏障的完整性均受到影响(图5)。更具体地说，在结肠炎进展期间，T细胞转移模型的肠道通透性逐渐增加，在第6周趋于稳定，但与对照组小鼠相比，肠道通透性仍然增加(图5A)。在DSS模型中，肠通透性在DSS施用的第一个周期后表现出强烈的增加，之后在结肠炎的慢性阶段下降，在第二个DSS周期后仅显著增加，但在第三个周期后没有显著增加(图5B)。
为了进一步证实结肠炎时肠黏膜屏障功能障碍，我们测量了构成和调节黏膜屏障的几种成分的表达。
我们首先研究了黏蛋白的表达，因为黏蛋白是黏液层的主要组成部分，是管腔病原体和毒素遇到的第一道屏障。Muc2(即大肠的主要分泌黏蛋白)mRNA表达在转移后1周增加(图6A)，而在DSS诱导的结肠炎的慢性阶段上调(图7A)。Muc1是一种在健康肠道中仅以低水平表达的跨膜黏蛋白，Muc1mRNA表达在转移后2、4和6周(图6B)以及DSS施用的所有周期后上调(图7B)。在健康肠道中正常表达的跨膜Muc13黏蛋白在两种模型的RNA水平上均表现出异常表达模式，在T细胞转移和DSS第2周期后1周和2周表达增加(图6D和7D)。相反，在两种模型任一的实验性结肠炎期间，另一种膜结合黏蛋白Muc4的mRNA表达均未发生显著改变(图6C和7C)。黏蛋白mRNA表达的变化通过免疫组化染色在蛋白质水平得到证实(数据未显示)。在DSS模型中，我们观察到结肠炎进展期间Muc2染色强度增加，而在T细胞转移模型中，与对照动物相比，总体Muc2染色强度没有改变。在对照动物中，Muc1主要出现在绒毛内衬上皮细胞的顶端上，而在两种结肠炎模型中，结肠炎诱导与细胞质和隐窝中Muc1染色强度增加有关。Muc13强度主要在DSS施用的前两个周期后增加和在T细胞转移模型中从转移后第2周增加。关于其细胞定位，Muc13在肠上皮细胞中表现出强烈的顶端染色强度，在结肠炎期间在细胞质中变得明显。与对照动物相比，Muc4在结肠炎进展期间未观察到明显变化。
就RNA水平上连接成分的表达模式而言，在两种模型中都观察到了一些有趣的变化(图8和图9)。Zo1(Tjp1)、Tjp2、Jam2、Jam3和肌球蛋白轻链激酶(Mylk)的mRNA表达水平在移植后第1周和DSS施用的第一个周期后显著增加(图8和图9)。在两种模型中，在实验性结肠炎的更慢性阶段，E-钙黏着蛋白(Cdh1)和Ocln mRNA表达水平显著降低(图8和图9)。细胞旁通透性的主要调节因子Cldn1的mRNA水平在第一DSS周期后升高，而在T细胞转移模型中，其在整个结肠炎进展过程中降低(图8和图9)。相反，Cldn2mRNA表达在转移后1周增加，但在每个DSS周期结束时其表达下降(图8和图9)。此外，Cldn5和Cldn7表现出模型特异性应答。更具体地说，Cldn7和Cldn5 mRNA的表达分别在T细胞转移和DSS模型的结肠炎初期上调(图8和图9)。此外，Tjp3 mRNA表达仅在DSS诱导的结肠炎模型中的整个结肠炎进展过程中降低，而Cldn15 mRNA表达在DSS诱导的结肠炎急性期显著降低并在慢性期显著增加(图9)。Cldn3和Jam1的表达在每种模型的整个结肠炎进展过程中均未发生改变(图8和图9)。还进行ZO-1和CLDN1的免疫组化染色，用于分析蛋白质水平上细胞间连接的改变。这些结果表明，CLDN1主要表现为在两种模型的结肠炎过程中染色强度增加，突出了这种紧密连接蛋白的功能障碍，而ZO-1在视觉上未观察到明显的改变(数据未显示)。
除了适当表达细胞间连接外，组织良好的顶端至基底细胞极性对于形成功能性的紧密的肠上皮细胞单层是必不可少的。基因表达分析表明，在两种我们的实验性结肠炎小鼠模型中，不同极性复合物的亚基都受到影响(图10)。紧密连接定位的两个主要协调者Par3和aPkcλ的表达在所有DSS周期和转移后的时间点下调(图10A)。另一方面，
Figure GDA0003562081490000241
mRNA表达仅在T细胞转移模型中降低，而Par6 mRNA表达仅在DSS诱导的结肠炎急性期升高(图10A)。关于如图10B所示的Crumbs极性复合物的亚基，Patj mRNA表达在所有DSS周期中均呈下降趋势，而其表达在转移后第1周上调。此外，Pals1(Mpp5)的mRNA表达在T细胞转移模型的第一个时间点上调(图10B)。在每种结肠炎模型中均未观察到Crb3表达的显著变化(图10B)。有趣的是，被称为PAR复合体的负调控子的Scrib表达在转移后1周和第一DSS周期之后增加(图10C)。尽管在T细胞转移模型中Dlg1和Llgl1的表达在转移后1周和2周分别发生改变，但在DSS结肠炎模型中未观察到这些亚基的表达变化(图10C)。上述结果突显了在急性期和慢性期，结肠炎诱导导致上皮细胞极性受到干扰。炎症时与屏障完整性丧失相关的异常黏蛋白表达
有人认为，跨膜黏蛋白在许多癌症类型中的过度表达可通过介导连接和细胞极性功能障碍而导致上皮屏障完整性的丧失。为了阐明异常表达的跨膜黏蛋白作为炎症诱导的结肠炎中肠黏膜屏障破坏的潜在介质的参与，黏蛋白mRNA表达数据用于对两种模型进行判别分析，并将肠道通透性变化与结肠炎症联系起来(图11和图12)。在T细胞转移模型中，Muc1和Muc13表达是判别小鼠是通过过继转移T细胞发展结肠炎还是对照的最佳因素(图11A)。在DSS结肠炎模型中，发现Muc2表达是确定接受DSS处理的小鼠的主要决定因素，其次是Muc1和Muc13的表达(图11B)。有趣的是，在T细胞转移模型中，Muc1表达增加与肠道通透性增加显著相关(基于血清中的FITC葡聚糖水平)(图12A)，而在DSS模型中，异常Muc13表达与肠道通透性增加显著正相关(图12B)。此外，在T细胞转移性结肠炎中，IL-1β与通透性增加和异常Muc1表达相关(图12A和C)，而在DSS诱导的结肠炎中，TNF-α与肠道通透性和Muc13表达增加呈正相关(图12B和D)。此外，DSS模型中Muc13的表达水平也与Muc1(p＝0.013)和Muc2(p＝0.026)表达相关(数据未显示)。
在两种结肠炎模型中，几种连接蛋白和极性蛋白的表达改变彼此显著相关(数据未显示)，进一步表明相互依赖性及其参与调节屏障完整性。此外，它们的表达水平也可用于判别结肠炎小鼠和对照(图13)。此外，T细胞转移模型中异常Muc1、Cldn1、Ocln、Par3和aPKCζ表达之间的显著相关性(图12E和G)以及DSS模型中异常Muc13、Cldn1、Jam2、Tjp2、aPKCζ、Crb3和Scrib表达之间的显著相关性(图12F和H)进一步表明Muc1和Muc13在肠黏膜屏障功能障碍中的潜在作用。
4.讨论
肠黏膜屏障在肠道健康和功能中起着关键作用。它不仅是管腔内微生物组、毒素和食物抗原与宿主内部组织之间的物理屏障，也是调节炎症应答的动态屏障。屏障完整性的丧失通常被认为是IBD病理生理学的一个主要标志。然而，肠道屏障功能障碍是否是肠道炎症的主要原因，或者反而是肠道炎症的后果尚未完全阐明。在本研究中，我们使用T细胞转移和DSS小鼠模型研究了结肠炎过程中的肠道屏障完整性和炎症。这两种模型有不同的结肠炎发病机制，都是标准的IBD模型。在这两种模型中，肠通透性增加与先天性炎症应答相关，其特征是促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的表达增加和抗炎细胞因子IL-10的表达减少，在移植后1周和首次DSS施用后已经出现，并在发病过程中得以维持。IBD患者中TNF-α和IL-1β的过度产生已有记载，这些由T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞产生的有害细胞因子可能影响肠道内稳态，导致炎症进一步加重。在我们的研究中，IL-6的表达增加仅出现在结肠炎进展的后期。这种促炎细胞因子已被证明是Th17细胞分化的重要介质，进一步促进IBD的肠道炎症并调节肠上皮细胞。此外，IL-22在结肠炎诱导开始时，甚至在转移后第6周和最后一个DSS周期后表达增加。这种细胞因子通常能够促进肠黏膜愈合，但如果不加以控制，则可能导致肠道炎症。基于上述发现，我们无法明确证实屏障完整性的丧失是否先于肠道炎症，正如几项研究所建议的那样，这表明IBD患者的一级亲属在肠道炎症发生之前肠道通透性增加。然而，对我们这两种模型中连接蛋白和极性复合物的表达分析表明，大多数变化已经发生在结肠炎发展的初期。这表明屏障完整性的丧失不仅是先天性炎症反应的结果，而且可能是IBD病理生理学的主要因素。
IBD炎症时黏膜屏障功能障碍的关键介质仍有待进一步阐明。在肠屏障研究中经常被忽视的是黏蛋白。这些高度糖基化的蛋白质构成屏障的第一部分，即黏液层，它比实际的上皮细胞层厚四倍，在限制宿主和管腔内容物之间的接触方面起着重要作用。MUC2是分泌黏液层的主要组分，是肠道内抵抗入侵病原体和毒素的第一道防线。在IBD中，这种分泌黏蛋白对于结肠保护至关重要，因为已经证明Muc2-/-小鼠会自发地发展结肠炎。因此，在DSS模型中，结肠炎过程中Muc2表达的逐渐增加可归因于宿主防御，以克服DSS对结肠上皮的毒性作用。此外，这种黏蛋白在IBD患者的肠黏膜中被下调。
由于跨膜黏蛋白在IBD中越来越多地表达，并且考虑到它们在细胞间黏附和细胞分化的信号传导通路中的作用，它们是参与屏障功能调节的极好候选物。在我们的研究中，跨膜Muc1和Muc13黏蛋白的表达在在两种模型中的结肠炎进展期间增加，而Muc4在发炎的结肠中表现出不同的表达模式。在IBD患者中也有MUC4可变表达的报道，MUC4表达增加主要见于患有肿瘤病况的UC患者。已显示IBD患者发炎黏膜中MUC1和MUC13的表达改变，促炎细胞因子诱导的这种不适当的过度表达可能导致黏膜上皮细胞炎症信号传导的异常调节，进而导致病理性炎症。此外，对基因敲除动物的急性DSS研究表明：与野生型动物相比，Muc1-/-小鼠对炎症诱导的结肠炎具有抵抗力，而Muc13-/-小鼠发展更多的炎症。在我们的DSS模型中，Muc13的表达在DSS诱导的结肠炎的急性期和慢性期都发生了改变。在结肠炎的更慢性阶段中的这种表达增加也在T细胞转移模型中得到证实。与MUC1不同，MUC13由肠上皮高度表达，最初起到抗细胞毒性药物的保护作用。此外，Sheng及其同事(Sheng等人，2012年)证明，MUC13在肠上皮中具有促炎活性，调节由TNF-α诱导的炎症反应。此外，在我们的DSS模型中，TNF-α表达的增加与Muc13表达的改变显著相关，进一步表明这种黏蛋白的表达在炎症时受TNF-α调节，因此，这种黏蛋白在慢性结肠炎中的作用应进一步研究。此外，我们能够根据Muc1和Muc13的表达正确地将单个小鼠注释到其实验组(即对照组或结肠炎的不同时间点)(图11)。有趣的是，在两种结肠炎模型中可以区分出三个主要簇。特别是，在结肠炎初期(DSS施用1个周期后和T细胞转移1周后)处死的小鼠与对照小鼠和其他实验组分开。在稍后的时间点处死的小鼠可以清楚地与对照小鼠区分开来，但联系更为密切。这些结果进一步表明了Muc1和Muc13在结肠炎过程中的重要性。
据我们所知，IBD中跨膜黏蛋白的表达增加与屏障功能障碍之间的明确关联，迄今为止尚未有报道。在此，我们发现，在结肠炎进展过程中，Muc1和Muc13表达增加与体内肠道屏障通透性增加之间存在正相关关系，这些黏蛋白的表达与屏障介质(包括连接蛋白和极性蛋白)的表达改变之间的强相关性进一步证实了这一点。还观察到两种黏蛋白的模型特异性反应，这可以通过结肠炎诱导的不同机制来解释。虽然T细胞转移模型中的结肠炎是通过破坏系统性T细胞内环境平衡而诱发的，但DSS对肠上皮具有毒性，导致管腔细菌和抗原穿透肠屏障，导致强烈的先天性炎症应答。由于MUC13在健康肠上皮高度表达，其调节肠屏障完整性的作用可能与来自外部环境的直接威胁有关。另一方面，MUC1在健康肠道中低水平表达，因此其参与屏障功能障碍可能依赖于炎症刺激下T淋巴细胞的浸润。另一种可能性是细胞因子分泌的细微差异可能导致两种模型中黏蛋白表达的特异性变化。虽然两种模型中相似的细胞因子谱与疾病活性相关，但在T细胞转移模型中，IL-1β与Muc1表达增加和体内肠道通透性增加相关，而在DSS诱导的结肠炎模型中，TNF-α与Muc13表达增加和体内肠道通透性增加相关。然而，基于上述发现，我们可以得出结论，异常表达的Muc1和Muc13可能在结肠炎过程中起调节肠屏障功能障碍的作用。
跨膜黏蛋白的过度表达可导致整个细胞膜的重新定位，导致相邻细胞的细胞接触的物理障碍6。在我们的对照动物中，Muc1和Muc13在上皮膜的顶端表达，而在结肠炎进展期间，它们在整个细胞中普遍可见。跨膜黏蛋白可以通过多种方式影响细胞间的相互作用，从而影响屏障功能性。首先，通过细胞外EGF样结构域和细胞内磷酸化位点，它们可以与受体酪氨酸激酶如ERBB2相互作用。然后，这种膜结合受体的激活可以导致PAR极性复合物的破坏和随后的紧密连接功能障碍，通过与PAR6和APKC缔合并阻断与PAR3的相互作用而导致。在我们的结肠炎模型中，发现增加的MUC1表达和降低的PAR3表达之间的相关性，表明MUC1介导的屏障完整性丧失可能是由于ERBB2的螯合和随后的PAR复合物的解离引起的。MUC1以及MUC4和MUC13与ERBB2的相互作用已在许多癌症类型中被描述，ERBB2在IBD的屏障功能性中的作用仍有待进一步研究。其次，跨膜黏蛋白的细胞质结构域可以通过与crumbs和scribble极性基因启动子上的转录因子相互作用，运输到细胞核并抑制crumbs和scribble极性基因的转录。通过这种方式，细胞极性的丧失和紧密连接功能障碍也会被诱导。在此，我们发现DSS模型中Muc13、Crb3和Scrib的表达水平之间存在相关性，突显这些黏蛋白也可能根据上述机制发挥作用。此外，还描述了MUC1可在细胞内与β-连环蛋白相互作用，从而导致E-钙黏着蛋白/β-连环蛋白复合物的破坏，并最终导致黏附连接稳定性的丧失。然而，在我们的结肠炎模型中，Muc1和Muc13表达增加与Cdh1(E-钙黏着蛋白)表达改变无关。
综上所述，我们的研究结果清楚地表明，在结肠炎过程中，异常Muc1和Muc13表达与肠黏膜屏障功能障碍有关。观察到模型特异性应答，表明黏蛋白表达的复杂转录调节是宿主炎症应答、微生物组以及疾病类型和病程共同作用的结果。然而，这些黏蛋白影响屏障完整性的确切机制以及证明它们在IBD屏障完整性中的功能作用还需要进一步研究。
IBD的大多数可用疗法都是针对炎症应答的。由于这些疾病的临床异质性，生物制剂的有效性和安全性受到限制，仍然有相当数量的患者没有应答或获得完全缓解。靶向屏障，特别是MUC1和MUC13，也可能具有治疗潜力。这些跨膜黏蛋白已经显示出其在不同癌症类型(包括结肠癌)的抗体治疗中的潜力，使其成为医学上有价值的治疗靶点。此外，黏蛋白具有高度多态性，并且据报道影响黏蛋白表达的基因多态性会影响对疾病的易感性。黏蛋白基因的遗传差异可导致从同一黏蛋白基因的基因座产生不同的mRNA同种型(即通过选择性剪接产生的剪接变体)。虽然大多数同种型编码相似的生物学功能，但其他同种型有可能改变蛋白质功能，导致向疾病的进展16。到目前为止，只有MUC13-R502S多态性与UC相关，MUC1-rs3180018与CD相关，但与IBD相关的MUC1和MUC13同种型仍然未知。因此，抑制炎症诱导的MUC1和MUC13同种型以恢复肠屏障的完整性可以获得更大的疗效，且副作用更少。
总之，这里突显异常表达的Muc1和Muc13可能通过影响紧密连接和细胞极性蛋白而参与炎症时的肠黏膜屏障功能障碍，并且它们可以作为新治疗干预的可能靶点。
实施例2：靶向PacBio同种型测序以分析IBD患者结肠活检中MUC1和MUC13的同种型表达
1.背景
在这里，我们分析了来自活动性IBD患者的发炎和非发炎的结肠组织中MUC1和MUC13同种型的表达，以提高我们对慢性炎症期间黏蛋白信号传导的理解。
2.方法
2.1.IBD患者和临床标本
由于临床原因(即出现急性炎症)而接受内窥镜检查的IBD患者通过比利时安特卫普大学医院(UZA)的门诊招募。收集3例活动性疾病患者(1例克罗恩病，2例溃疡性结肠炎)的结肠活检组织，并在“RNA later”中在-80℃下储存，直到进一步使用。所有患者之前均根据肠道适应症、血液和粪便检查、放射检查、内窥镜检查和组织学诊断为IBD。疾病活动性主要基于活动性症状的存在以及结肠的内镜和微观评估。内窥镜检查前，获得每位患者的知情同意。这项研究得到了UZA伦理委员会的批准(比利时注册号B300201733423)。
2.2.RNA的分离与质量控制
根据制造商的说明，使用
Figure GDA0003562081490000291
RNA plus试剂盒(Macherey-Nagel)从储存在“RNA later”中的人类结肠组织中提取总RNA。使用
Figure GDA0003562081490000292
ND-1000UV-Vis分光光度计(Thermo Fisher Scientific)和Qubit荧光计(Qubit Broad Range RNA试剂盒，Thermo Fisher Scientific)评估RNA的浓度和纯度。使用Agilent 2100片段分析仪(Agilent)通过毛细管电泳对RNA进行质量控制。
2.3.cDNA文库的制备与复用
最初，每个样品使用1600–2000ng的输入RNA。每个样品的反应首先用条形码寡dT核苷酸标记，用于表1所示的复用目的。随后，根据制造商的说明，使用SMARTer PCR cDNA合成试剂盒(Takara Bio)进行第一链cDNA合成。然后在洗脱缓冲液(PacBio)中将反应稀释1:10，并使用每个样品16个反应进行大规模扩增。50μL的每个反应由10μL稀释的cDNA样品、10μL 5X PrimeSTAR GXL缓冲液(Takara Bio)、4μL dNTP混合物(每种2.5mM)、1μL5'PCR引物IIA(12μM)、1μL PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(1.25U/μL，Takara Bio)和24μL无核酸酶水组成。然后，使用以下程序将样品在热循环机中温育：初始变性步骤在98℃进行30秒，然后14个循环的扩增：在98℃进行10秒、在65℃进行15秒和在68℃进行10分钟，以及最后延伸步骤在68℃进行5分钟。从这些PCR产物中，使用AMPure磁性纯化珠纯化两个级分。在两个级分等摩尔合并后，最终合并样品并使用Qubit荧光计(Qubit dsDNA HS试剂盒，ThermoFisher)和Agilent 2100生物分析仪评估DNA浓度和片段长度。
表1.用于多路复用的条形码引物。
Figure GDA0003562081490000301
根据IUPAC核苷酸代码，N表示任何碱基(A、G、T或C)，V表示A、C或G。
2.4.使用SeqCap EZ探针的cDNA捕获
最初，向1.5μg cDNA中添加1μL SMARTer PCR寡核苷酸(1000μM)和1μL PolyT阻断剂(1000μM)，然后在DNA真空浓缩器中干燥1小时。然后将cDNA与预先设计的SeqCap EZ探针(靶向几个黏蛋白编码区，表2和表3)在47℃杂交16小时。根据制造商的说明，使用Dynabeads M-270(Thermo Fisher Scientific)纯化捕获的cDNA，并通过制备含有20μl10X LAPCR缓冲液、16μl2.5mM dNTP、8.3SMARTer PCR寡核苷酸(每个12μM)、1.2μl TakaraLA Taq DNA聚合酶、50μl cDNA补充无核酸酶水至终体积为200μl的混合物进行扩增。对于实际的PCR，在热循环器上运行以下程序：初始变性步骤在95℃进行2分钟，然后11个循环的扩增：在95℃进行20秒和在68℃进行10分钟，以及最后延伸步骤在72℃进行10分钟。使用AMPure纯化珠对扩增的捕获的cDNA进行最终纯化。使用Qubit荧光计(Qubit dsDNA HS试剂盒，ThermoFisher)和Agilent 2100生物分析仪评估DNA浓度和片段长度，用于随后SMRTbell文库构建。
表2.用SeqCap EZ探针靶向的基因组区域。
黏蛋白 染色体 染色体定位(GRCh38/hg38基因组注释)
MUC1 Chr 1 155,185,324–155,193,416
MUC2 Chr11 1,074,375–1,111,008
MUC3–MUC12–MUC17 Chr7 100,944,420–101,074,859
MUC4 Chr3 195,746,558–195,826,889
MUC5AC–MUC5B Chr11 1,146,953–1,272,672
MUC6 Chr11 1,012,323–1,037,218
MUC13 Chr3 124,905,442–124,940,751
MUC15 Chr11 26,558,532–26,572,763
MUC16 Chr19 8,848,344–9,001,342
MUC20 Chr3 195,720,384–195,738,123
表3.靶向黏蛋白区域的SeqCap EZ探针覆盖率。
探针覆盖率 估计覆盖率
覆盖的靶标碱基 493.161(78.7％) 561.699(89.7％)
非覆盖的靶标碱基 133.225(21.3％) 64.687(10.3％)
2.5.PacBio Sequel系统上SMRTbell文库的构建和测序
使用SMRTbell模板制备试剂盒(PacBio)，5μg捕获的cDNA用于SMRTbell文库构建。根据制造商的说明，以下步骤按时间顺序进行：DNA损伤修复、末端修复、平端衔接子的连接、Exo III和Exo VII处理。使用AMPure纯化珠进行一个中间和两个最终纯化步骤。使用Qubit荧光计(Qubit dsDNA HS试剂盒，ThermoFisher)和Agilent 2100生物分析仪评估DNA浓度和片段长度，用于随后SMRTbell文库构建。按照SMRTlink上的说明，使用Sequel结合试剂盒(PacBio)和Sequel测序试剂盒(PacBio)稀释DNA和内部对照复合物，退火测序引物，并将测序聚合酶与SMRTbell模板结合。最后，将样品加载到1M v3 SMRT cell上。
2.6.数据分析
高精度(>99％)精炼环化共有测序(circular consensus sequencing，ccs)读取被用作使用命令行界面进行数据处理的初始输入。lima工具v1.10.0用于解复用和引物去除。随后，isoseq3 v3.2.2包用于进一步读取处理，以生成高质量的mRNA转录本。首先，精炼工具用于修剪聚(A)尾，并且识别和去除多联体。然后根据情况(即3个来自非发炎组织的样品、3个来自发炎组织的样品或所有样品)将单个样品的数据汇集在一起，并进行平行分析。采用isoseq3聚类算法用于转录本聚类。Minimap2用于将处理后的读数与人类参考基因组(GRCh38)比对。映射后，使用来自cDNA_Cupcake GitHub存储库的ToFU转录本折叠冗余同种型(最小比对覆盖率和最小比对同一性设置为0.95)，识别相关计数信息，并过滤掉5'降解同种型。最后，使用SQANTI2工具对MUC1和MUC13 mRNA同种型进行广泛表征。然后通过整合基因组学查看器(IGV)2.8.0版中的可视化以及通过Excel中的分类和连接文件分析，进一步检查最终的同种型。
3.结果
3.1.患者和样品特征
从3名患有已知的和活动性IBD的患者的结肠收集样品，其中2人被诊断为溃疡性结肠炎，1人被诊断为克罗恩病。所有患者的诊断和用药年份都不同。在内窥镜检查期间，从结肠的宏观发炎区域和相邻的宏观非发炎区域收集样品。关于患者特征以及结肠活检位置的详细概述见表4。
表4.收集活检的患者特征和原发疾病部位总结。
Figure GDA0003562081490000321
3.2.测序运行的一般特征
所有样品的测序最初产生103699个ccs读数。测序产率和读取质量很高，在所有样品中都具有可比性。平均读取长度为2082bp。由于不希望的条形码引物组合，在引物去除和解复用过程中，有24592(24％)个读数丢失。聚类后，55312个读数与6617个不同的转录本相对应。由于对IGV中靶向黏蛋白区域的目视分析显示，只有MUC1和MUC13的完整基因组区域的完全且密集覆盖，因此进一步的分析仅限于这两种黏蛋白糖蛋白。
3.3.MUC1同种型
靶向PacBio同种型测序揭示了IBD患者结肠组织中已知和新的MUC1同种型的鉴定，这些同种型都被发现是编码转录本(图14和表5)。特别是，在非发炎和发炎结肠组织中发现了7种选择性mRNA转录本(＝同种型)，其中1种(PB.136.39)与已知的同种型(ENST0000462317.5)匹配，6种未在其他地方描述。有趣的是，与非发炎组织相比，从这些选择性转录本中，基于发炎组织中的读取计数，3个表达增加(PB.136.1，PB.136.25，PB.136.28)。此外，还发现了另外两种仅在非发炎结肠组织中报告的新同种型，而在发炎结肠组织中，发现了1种已知的同种型(PB.136.19；ENST0000368390.7)和11种新的选择性转录本。有趣的是，2种新发现的同种型在发炎组织中显示出显性表达(PB.136.2，PB.136.15)。关于选择性转录本的整体外显子结构，未发现包含外显子3至5(VNTR)的转录本。在非发炎和发炎结肠组织中，外显子2(VNTR)和外显子6(SEA结构域)最容易发生选择性剪接(图14和表5)。发现的所有新的选择性转录本都是由于内含子区域的部分保留(表5)。剪接连接的详细概述见补充表S2。
这些数量有限的样品的结果清楚地表明，结肠中形成了MUC1的不同选择性转录本，并且炎症刺激选择性剪接并增加特定转录本的表达。这是第一项突显MUC1同种型在IBD中潜在重要性的研究。只有在癌症研究中，才有几篇研究MUC1剪接变异体的致病意义的论文。更具体地说，已经证明不同的MUC1同种型可能相互作用，以形成配体-受体复合物，与其他宿主受体缔合或影响介导炎症信号传导通路的细胞因子表达(Zaretsky等人，2006)。MUC1同种型的选择性剪接也显示出癌症类型依赖性，并能够区分癌症样品和良性样品(Obermair等人，2002年)。例如，在乳腺癌中，有人描述更短MUC1同种型在肿瘤组织中特异表达，但在邻近的健康组织中不表达(Zrihan-Licht等人，1994)，而雌激素治疗诱导了另一种变体的表达(Zartesky等人，2006)。所有这些都突显了选择性剪接的有趣复杂性和生物学作用。
表5：IBD患者结肠活检中MUC1 mRNA同种型特征的详细概述
Figure GDA0003562081490000341
Figure GDA0003562081490000351
3.4.MUC13同种型
在IBD患者的结肠组织中发现了21种选择性MUC13 mRNA转录本(图15和表6)。其中17个转录本被鉴定为编码同种型，4个为非编码剪接变体。这种长的未翻译的黏蛋白同种型的功能可能类似于长的非编码RNA，并可以作为组装参与细胞过程调节的多聚体蛋白复合物的支架。重要的是，已知的全长同种型(ENST0000616727.4)在两种情况下都存在，但在发炎结肠组织中高度上调(表6)。在这两种情况下，发现了3种以前没有报道过的额外同种型。其他同种型表现出条件特异性表达模式。更具体地说，在非发炎组织中独特地发现了4种mRNA同种型，而仅在发炎结肠组织中报告了13种mRNA同种型。关于MUC13同种型，已经确定了几种选择性剪接机制。在发炎结肠的两个选择性转录本中观察到外显子跳跃(即PB.1087.32中的外显子9(EGF样)和10(TMD)；PB.1087.20中的外显子9(EGF样)、10(TMD)和11(CT))。发现一些单-外显子转录本是由编码ECD的基因组区域的内含子保留引起的(即PB.1087.50、PB.1087.53、PB.1087.58、PB.1087.61)。其他同种型是通过使用已知和新剪接位点(主要在MUC13的ECD编码区)进行更细微的重组而产生的(图15和表6)。所有剪接连接的详细概述可见于补充表S3。
据我们所知，炎症和癌症过程中MUC13同种型表达的异质性以前还没有被充分详细研究过。在这里，有证据表明，MUC13在IBD患者的非发炎和发炎结肠组织中选择性剪接。
表6：IBD患者结肠活检中MUC13 mRNA同种型特征的详细概述
Figure GDA0003562081490000352
Figure GDA0003562081490000361
Figure GDA0003562081490000371
4.结语
基于从有限数量的样品中收集的PacBio同种型测序数据，我们能够在IBD患者的非发炎和发炎结肠组织中鉴别已知的和新的MUC1和MUC13 mRNA同种型。炎症时，MUC1和MUC13黏蛋白基因的选择性剪接明显增加。尽管在发炎组织和非发炎组织中都发现了一些同种型，但其他几种同种型被认为是炎症的唯一原因。
总之，IBD患者炎症时黏蛋白同种型表达发生改变，突显了其在疾病监控或治疗中的潜力。此外，这些新的见解可以推广到涉及功能失调黏膜上皮屏障的其他炎性疾病和癌症。因此，尚未探索的黏蛋白同种型为理解其生物学意义、作为生物标志物的实用性和病理学特异性靶向性提供了独特的机会。
补充表S2：MUC1选择性mRNA转录本的剪接连接的详细概述
Figure GDA0003562081490000372
Figure GDA0003562081490000381
Figure GDA0003562081490000391
Figure GDA0003562081490000401
Figure GDA0003562081490000411
补充表S3:MUC13选择性mRNA转录本的剪接连接的详细概述
Figure GDA0003562081490000412
Figure GDA0003562081490000421
Figure GDA0003562081490000431
Figure GDA0003562081490000441
Figure GDA0003562081490000451
实施例3：SARS-CoV-2感染期间呼吸道和肠上皮紧密连接功能障碍相关的异常黏蛋白表达
发明背景
2020年3月11日，世界卫生组织宣布COVID-19是流行病。报道的成年人常见的症状是发烧、干咳、疲劳和呼吸短促。尽管大部分COVID-19患者(约80％)保持无症状或有轻度至不太严重的呼吸适应症，有一些(约15-20％)住院，其中少数患者发展为急性致死性呼吸窘迫综合征(ARDS)。这会导致黏液渗出、肺水肿、缺氧和肺衰竭，并伴有以Th17免疫谱为特征的细胞因子风暴。除了老年人或患有慢性基础疾病的人之外，也有年轻健康个体死于COVID-19。
SARS-CoV-2是一种正义单链RNA病毒，有4种结构蛋白，称为S(尖峰蛋白)、E(包膜蛋白)、M(膜蛋白)和N(核衣壳)蛋白。N蛋白拥有RNA基因组，并且S、E和M蛋白形成病毒包膜。冠状病毒的S蛋白调节病毒进入靶细胞，即纤毛上皮细胞。进入取决于亚基S1与细胞受体的结合，这有助于病毒附着到靶细胞表面。进入还需要通过细胞蛋白酶的S蛋白启动，该蛋白酶在S蛋白的S1/S2位点切割S蛋白，允许病毒和细胞膜的融合，这一过程由S2亚基驱动。与SARS-CoV相似，血管紧张素转换酶2(ACE2)是SARS-CoV-2的进入受体，并且细胞丝氨酸蛋白酶TMPRSS2对启动S蛋白至关重要。ACE2和TMPRSS2表达不仅限于呼吸道并且因此SARS-COV-2的肺外传播不应忽视。确实，COVID-19阳性患者(包括门诊和住院)的子集(约30％至35％)表现为胃肠道症状，包括腹泻、腹痛、食欲不振和恶心，并且与呼吸症状患者相比，与更惰性形式的COVID-19相关。甚至从患者粪便中成功分离出了活SARS-CoV-2。这表明肠上皮也易受感染，最近的研究甚至提供了额外的丝氨酸蛋白酶TMPRSS4启动SARS-CoV-2S蛋白的证据。
此外，有人认为，在过去上呼吸道中适度的ACE2表达已经限制了SARS-CoV的传播性。这与目前报告的SARS-CoV-2感染病例形成了巨大对比，后者明显超过了SARS-CoV的传播性。鉴于这种增加的传播性，我们可以推测这种新冠状病毒利用额外的促进细胞附着的辅因子来确保呼吸道中ACE2+细胞的强烈感染。这可能包括与细胞聚糖结合，如其他冠状病毒所表现的。有趣的是，已报道来自严重患病COVID-19患者的细支气管和肺泡中黏液大量生成(Cug等人，2020；自身观察ICU UZA)，使ICU停留和恢复复杂化。分泌黏蛋白和跨膜黏蛋白分别是杯状细胞和纤毛细胞产生的O-连接聚糖，是覆盖上皮细胞的黏液层的主要成分。黏液和上皮构成黏膜屏障。除了具有保护功能外，跨膜黏蛋白还参与细胞内信号转导，并从而通过与紧密连接建立微妙的平衡来维持屏障完整性，在黏膜内环境稳定中发挥重要作用。跨膜黏蛋白，尤其是MUC13，可能会作为额外的宿主因子，使病毒传播更快并造成组织损伤。因此，在本研究中，我们研究了SARS-CoV-2感染期间，ACE2、TMPRSS2/TMPRSS4、黏蛋白和连接蛋白在呼吸道和肠上皮中的表达模式。此外，还研究了病毒感染时MUC13和ACE2表达之间的相互作用。
材料和方法
病毒与生物安全
SARS-CoV-2分离株2019-nCoV/Italy-INMI1可从欧洲病毒档案全球数据库(EVAg)获得，在整个研究过程中使用。SARS-CoV-2在Vero E6细胞(绿色猴肾；ATCC CRL-1586)中传代，该细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(FCS)的杜氏改良Eagle's极限必需培养基(DMEM；Gibco)中生长，然后用于细胞培养实验。通过标准TCID50测定法测定无细胞上清液中的感染性病毒滴度。所有涉及活SARS-CoV-2的实验均在比利时安特卫普热带医学研究所的生物安全三级设施中进行。
细胞培养与病毒感染
LS513(人类结直肠癌(ATCC CRL-2134TM))和Caco-2(人类结直肠癌ATCC HTB-37)细胞在补充有10％热灭活FCS、100U ml-1青霉素、100μg ml-1链霉素和2mM L-谷氨酰胺的Roswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培养基(Life Technologies)中生长。Calu3(肺腺癌ATCC HBT-55)细胞在补充有10％热灭活FCS、100U ml-1青霉素、100μg ml-1链霉素、1X MEM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠的极限必需培养基(MEM；Gibco)中生长。对于病毒感染，将所有细胞接种在6孔板中：1x 106个细胞/ml(LS513)；5x 105个细胞/毫升(Caco-2和Calu3)。在达到汇合后，细胞以0.1的感染复数(MOI)接种SARS-CoV-2在37℃(5％CO2)24小时和48小时。包括用病毒生长培养基处理过的细胞作为对照。所有实验均对于每个时间点和细胞系进展，其中包含6个技术重复。
小干扰RNA(siRNA)转染测定
在转染实验开始时，将细胞接种并生长在6孔板中(LS513:1x 106个细胞/ml；Caco-2和Calu-3:3x 105个细胞/ml)。24小时后，使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(7.5μl/孔，Invitrogen)，用靶向MUC13的75pmol沉默选择siRNA(s32232，ThermoFisherScientific)或75pmol沉默选择阴性对照siRNA(4390843，ThermoFisher Scientific)转染细胞。转染48小时后，细胞进行彻底洗涤并以0.1的MOI感染SARS-CoV-2进行48小时。包括用病毒生长培养基处理过的细胞作为对照。所有转染实验均在每个细胞系中进行，包含6个技术重复。
RNA提取和定量RT-PCR
如前所述(Corman等人，2020；Breugelmans等人，2020)，在24hpi(感染后小时数)和48hpi收获细胞和上清液，对宿主基因表达和病毒复制进行定量RT-PCR分析。简而言之，按照制造商的说明，分别使用Nucleospin RNA plus试剂盒(Macherey-Nagel)和QIAamp病毒RNA试剂盒(Qiagen)从裂解的细胞和上清液(100μl)中提取总RNA。使用Nanodrop ND-1000UV-Vis分光光度计(Thermo Fisher Scientific)评估RNA的浓度和质量。对于基因表达分析，从转染和未转染细胞中提取的1μg RNA随后使用SensiFastTM cDNA合成试剂盒(Bioline)通过反转录转化为cDNA。然后，在QuantStudio 3实时PCR仪器(Thermo FisherScientific)上使用GoTaq qPCR主混合物(Promega)，通过SYBR Green RT-qPCR测定相关基因(即ACE2、TMPRSS2、TMPRSS4、黏蛋白和紧密连接)表达。使用了以下quantitect引物测定(Qiagen)：Hs_GAPDH(QT00079247)、Hs_ACTB(QT00095431)、Hs_TMPRSS2(QT00058156)、Hs_TMPRSS4(QT00033775)、Hs_ACE2(QT00034055)、Hs_MUC1(QT00015379)、Hs_MUC2(QT01004675)、Hs_MUC4(QT00045479)、Hs_MUC5AC(QT00088991)、Hs_MUC5B(QT01322818)、Hs_MUC6(QT00237839)、Hs_MUC13(QT00002478)、Hs_CLDN1(QT00225764)、Hs_CLDN2(QT00089481)、Hs_CLDN3(QT00201376)、Hs_CLDN4(QT00241073)、Hs_CLDN7(QT00236061)、Hs_CLDN12(QT01012186)、Hs_CLDN15(QT00202048)、Hs_CLDN18(QT00039550)、Hs_CDH1(QT00080143)、Hs_OCLN(QT00081844)、Hs_ZO-1(QT00077308)、Hs_ZO-2(QT00010290)。所有RT-qPCR反应均重复进行，并包括初始DNA聚合酶激活步骤在95℃进行2分钟，然后40个循环：变性在95℃下进行15秒和退火/延伸在60℃下进行1分钟。使用qbase+软件(Biogazelle)进行分析和质量控制。靶基因的相对表达针对管家基因ACTB和GAPDH的表达标准化。为了量化转染和未转染细胞及上清液中的病毒RNA，在LightCycler 480实时PCR系统(罗氏)上使用iTaq通用探针一步试剂盒(iTaq Universal Probes One-Step kit，BioRad)。25μl反应物包含1μl RNA、12.5μl随试剂盒提供的2X反应缓冲液、0.625μl来自试剂盒的iScript逆转录酶、0.4μl正向引物(25μM)、0.4μl反向引物(25μM)、0.5μl靶向SARS-CoV-2E基因的探针(10μM)和9.575μl H2O。我们在50℃下温育反应物10分钟进行反转录，在95℃下5分钟进行变性，然后50个循环：在95℃下进行10秒和在58℃下进行30秒。使用qbase+软件进行分析，以确定循环阈值(Ct)。
统计分析
使用GraphPad Prism 8.00软件(许可证DFG170003)进行统计分析，以确定SARS-CoV-2感染和未感染细胞之间的显著差异，以及感染或未感染SARS-CoV-2的MUC13 siRNA和ctrl siRNA转染细胞之间的显著差异。数据通过方差分析(ANOVA)检验进行分析，并以平均值±平均值标准误差(SEM)表示。显著性水平显示在图表上，并使用Tukey Kramer和Dunn事后多重比较检验对多重测试进行了校正。
结果和讨论
这里测试的所有细胞系都对SARS-CoV-2感染敏感，如在48小时内的病毒复制所示(数据未显示)。与LS513相比，Caco-2和Calu3细胞的上清液中的病毒产生量显著增加(p＝0.0004；图16)。这与最近的一项研究一致，该研究描述了SARS-CoV-2在Caco-2和Calu3细胞中的强劲复制。也在微观评估了SARS-CoV-2诱导的细胞损伤。在LS513和Caco-2细胞中未观察到Vero E6细胞中典型的细胞病变效应。有趣的是，在转染的Calu3细胞中观察到大量细胞损伤(48hpi的存活率为30％；p<0.001)，但在未转染的细胞中没有。冠状病毒引起的Calu3细胞中的细胞损伤的诱导仍然存在争议。最近的一项研究描述了SARS-CoV和SARS-CoV-2感染的Calu3细胞中没有细胞死亡，而早期的研究报道SARS-CoV感染在Calu3中诱导细胞病变效应。这些差异的原因目前尚不清楚，但不能排除的是，在我们的研究中，siRNA转染使细胞更容易受到病毒细胞病变的影响。
由于SARS-CoV-2使用受体ACE2用于进入，并使用丝氨酸蛋白酶TMPRSS2和TMPRSS4用于S蛋白启动，因此对这些宿主因子的表达进行了研究。在我们的研究中，ACE2 mRNA表达在Caco-2细胞中在24hpi(p＝0.0001)和48hpi(p＝0.0008)时显著降低，并且在Calu3细胞中仅在24hpi(p＝0.0004)时显著降低(图17)。LS513中未观察到ACE2表达的变化，这可以解释与Caco-2和Calu3相比显著更低的病毒产生(图16和17)。ACE2是肾素-血管紧张素途径的重要组分，并抵消血管紧张素II的AT1激活作用。在肺部，ACE2具有抗炎作用，保护呼吸道免受损伤，而它通过调节抗菌肽(AMP)的表达和肠道微生物群的生态来维持肠道黏膜屏障的稳态。由于血管紧张素II或AT1信号传导的不平衡，SARS-CoV-2感染时这种受体的下调可能因此会加剧急性肺和肠道损伤。相反，与未感染的对照组相比，在48hpi时，TMPRSS2在所有细胞类型中的表达均显著增加(TMPRSS2:p＝0.0433(LS513)，p＝0.0057(Caco-2)，p＝0.0001(Calu3)；图17)，而TMPRSS4的上调仅在Calu3细胞中明显可见(p＝0.0152)。因此，TMPRSS2的丰度和更低程度的TMPRSS4对于促进病毒进入宿主细胞至关重要。此外，TMPRSS2也是黏膜屏障功能障碍的重要介质，并与异常黏蛋白表达有关。因此，我们还研究了SARS-CoV-2感染对黏蛋白和紧密连接表达的影响。在我们的研究中，黏蛋白表达的显著变化主要在48hpi观察到。更具体地说，在肠和肺SARS-CoV-2感染的上皮细胞两者中的跨膜MUC1、MUC13和MUC4黏蛋白均强烈上调(MUC1:p＝0.0022(LS513)；p＝(Calu3)；MUC4:p＝0.0022(LS513)；p＝0.0022(Calu3)；MUC13:p＝0.0022(LS513)；p＝0.0022(Caco-2)；p＝0.0022(Calu3)；图18)，而分泌的黏蛋白(尤其是MUC2(p＝0.058(LS513)；p＝(Caco，24hpi)；p＝(Caco-2；48hpi))、MUC5AC(p＝0.0012(LS513))和MUC6(p＝0.0022(LS513))(处于黏膜防御的前线(Linden等人，2007))，除Calu3细胞中的MUC2(p＝0.0001)和MUC5AB(p＝0.0001)表达外，其他均显著下调(图19)。由于自己的数据显示MUC13和ACE2之间存在功能性联系，我们利用siRNA转染测定法进一步研究了病毒感染时ACE2的下调是否由MUC13介导。在所有三种细胞系中，MUC13的敲除都是成功的，其中在感染期间，MUC13表达的降低为约70-80％(图5)。在ctrl siRNA转染的Caco-2和Calu-3细胞中，SARS-CoV-2感染后MUC13表达显著增加，而ACE2表达显著降低(图20)。这与野生型SARS-CoV-2感染的Caco-2和Calu3细胞的情况一致(图18)。有趣的是，MUC13的敲除降低了Caco-2和Calu3对照细胞中的ACE2表达(p＝0.0004(Caco-2)；p＝0.09(Calu3))，并且其表达在SARS-CoV-2感染后进一步下降，尽管不显著(图20)。这加强了ACE2表达由MUC13介导的证据。此外，感染后ctrl siRNA转染的LS513细胞中MUC13表达没有改变(图20)，这与野生型SARS-CoV-2感染的LS513细胞中观察到的情况相反(图18)。ACE2表达保持不变(图20)，并且注意到上清液中更低的病毒生产(图16)。这进一步突显了增加的MUC13表达介导ACE2信号传导对优化病毒生产的重要性。
此外，最近的研究表明，MUC13的不当过度表达也通过破坏细胞极性和细胞间的相互作用，导致紧密连接功能障碍，从而影响屏障的完整性。在我们的研究中，在48hpi时，注意到几个连接蛋白的基因表达显著增加(图21)，表明SARS-CoV-2改变上皮屏障完整性的能力，如关于SARS-CoV所述。大多数表达改变见于LS513和Calu3细胞，即：CLDN1(p＝0.00225LS513)；p＝0.0001(Calu3))，CLDN2(p＝0.0007(Caco-2))、CLDN3(p＝0.075(LS513)；p＝0.0001(Calu3))，CLDN4(p＝0.01(LS513)；p＝0.0001(Calu3))，CLDN7(p＝0.0085(LS513)；p＝0.0001(Calu3))，CLDN12(p＝0.031(Calu3))，CLDN15(p＝0.0139(Caco-2)；P＝0.0004(Calu3))，CDH1(P＝0.003(Caco-2)；p＝0.0013(Calu3))，OCLN(p＝0.0335(LS513)；p＝0.0004(Caco-2)；p＝0.0002(Calu3))，ZO-1(p＝0.034(Caco-2)；p＝0.0001(Calu3)和ZO-2(p＝0.0005(Caco-2))。
总之，本研究的结果进一步突显了SARS COV-2对呼吸道和肠上皮的嗜性，并证明这种新型冠状病毒通过诱导异常黏蛋白表达和紧密连接功能障碍而强烈影响感染后的黏膜屏障完整性。此外，也提出跨膜黏蛋白、尤其是MUC13在SARS-CoV-2感染中的作用。
参考文献
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序列表
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<130> UNA-037
<150> EP19187189.6
<151> 2019-07-19
<160> 66
<170> BiSSAP 1.3
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<211> 20
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tcagaaacgg gcagaaggtg 20
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<211> 20
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<220>
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ccaggcggga gatgaagata 20
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<220>
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ggctcttggg aaggcatgac a 21
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ccgtcccctc atatcggtgt a 21
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<223> Tjp1正向引物
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<223> Tjp2正向引物
<400> 57
atgggagcag tacaccgtga 20
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<213> 人工序列
<220>
<223> Tjp2反向引物
<400> 58
tgaccaccct gtcattttct tg 22
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<400> 59
ctgtggagaa cgtcacatct g 21
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<213> 人工序列
<220>
<223> dt_BC1001_PB
<220>
<221> 不确定的
<222> 73
<223> /注释="v是A或C或G"
/注释="n是任意核苷酸"
<400> 61
aagcagtggt atcaacgcag agtaccacat atcagagtgc gttttttttt tttttttttt 60
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<210> 62
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dt_BC1002_PB
<220>
<221> 不确定的
<222> 73
<223> /注释="v是A或C或G"
/注释="n是任意核苷酸"
<400> 62
aagcagtggt atcaacgcag agtacacaca cagactgtga gttttttttt tttttttttt 60
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<210> 63
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dt_BC1003_PB
<220>
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/注释="n是任意核苷酸"
<400> 63
aagcagtggt atcaacgcag agtacacaca tctcgtgaga gttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tvn 73
<210> 64
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> 不确定的
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/注释="n是任意核苷酸"
<400> 64
aagcagtggt atcaacgcag agtaccacgc acacacgcgc gttttttttt tttttttttt 60
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<211> 73
<212> DNA
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<220>
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<400> 65
aagcagtggt atcaacgcag agtaccactc gactctcgcg tttttttttt tttttttttt 60
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<211> 73
<212> DNA
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<221> 不确定的
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/注释="n是任意核苷酸"
<400> 66
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Claims (11)

1.一种用于诊断、监测、预防和/或治疗以屏障功能障碍为特征的疾病的黏蛋白同种型，其中所述黏蛋白同种型选自包括MUC1同种型和MUC13同种型的列表。
2.根据权利要求1所述的黏蛋白同种型，其中所述黏蛋白同种型为跨膜黏蛋白。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的黏蛋白同种型，其用作诊断和疾病监控或监测的生物标志物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的黏蛋白同种型，其用作新的治疗靶点。
5.根据权利要求4所述的黏蛋白同种型，其中通过单克隆抗体、小分子或反义疗法特异性靶向所述黏蛋白同种型。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的黏蛋白同种型，其中所述以屏障功能障碍为特征的疾病是胃肠道病症，例如选自包括以下的列表：炎性肠病(IBD)、肠易激综合征(IBS)、癌症、胃肠道感染、肥胖、非酒精性脂肪肝(NAFLD)；神经退行性病症；或者是呼吸道感染。
7.根据权利要求6所述的黏蛋白同种型，其中所述癌症选自包括以下的列表：食管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌和前列腺癌。
8.根据权利要求6所述的黏蛋白同种型，其中所述胃肠道感染选自包括以下的列表：幽门螺杆菌(Helicobacter)感染、弯曲杆菌(Campylobacter)感染、艰难梭菌(Clostridioides difficile)感染和沙门氏菌(Salmonella)感染。
9.根据权利要求6所述的黏蛋白同种型，其中所述神经退行性病症选自包括以下的列表：帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症(MS)和孤独症。
10.根据权利要求6所述的黏蛋白同种型，其中所述炎性肠病选自包括以下的列表：克罗恩病和溃疡性结肠炎。
11.根据权利要求6所述的黏蛋白同种型，其中所述呼吸道感染选自包括以下的列表：呼吸道合胞病毒感染、流感病毒感染、鼻病毒感染、偏肺病毒感染、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)病毒感染和冠状病毒感染；特别是SARS-CoV-2感染。
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