发明内容
发明要解决的技术问题
如上所述,CA15-3虽然作为乳腺癌的恶性度和进展度的指标、以及治疗效果的监测的指标是有用的,但是存在阳性率低的问题。
本发明的目的是提供对无法用CA15-3的测定方法检测的来自乳腺癌的粘蛋白1进行检测的方法。另外,通过使用该检测方法,提供乳腺癌的恶性度和进展度的标志物、以及治疗效果的监测标志物。另外,提供对无法检测出CA15-3的早期的乳腺癌患者中存在的粘蛋白1进行分析的方法。
用于解决技术问题的手段
本发明人对由乳腺癌细胞分泌的粘蛋白1进行了潜心研究,结果,令人惊讶地发现了乳腺癌患者的粘蛋白1具有作为糖链抗原的Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链(3′硫酸化核心1糖链)。本发明人使用能够识别具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的探针,发现了检出率比CA15-3的测定方法的检出率优异的分析方法。发现了通过使用本发明的分析方法,能够检测出无法用CA15-3的测定方法检测的乳腺癌患者的粘蛋白1。特别是,使用以往凝集素的ELISA,因为凝集素对糖链的亲和性低,所以大多灵敏度低。使用3′硫酸化核心1糖链结合凝集素的本发明的分析方法,灵敏度非常高,从这一点来看,本发明也是令人惊讶的。
本发明是基于上述的见解。
即,本发明涉及:
[1]一种具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析方法,其特征在于:
(A)包括:
使与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合的3′硫酸化核心1糖链结合探针与被检试样接触的工序;
使与具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1结合的3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针或与粘蛋白1结合的粘蛋白1结合探针,与被检试样接触的工序;和
检测具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1与探针的结合体的工序,
或者
(B)包括:
使与具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1结合的3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针与被检试样接触的工序;
使与具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1结合的3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针、与粘蛋白1结合的粘蛋白1结合探针或与粘蛋白1具有的糖链结合的粘蛋白1糖链结合探针,与被检试样接触的工序;和
检测具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1与探针的结合体的工序;
[2]一种具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析方法,其特征在于,包括:使与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合的3′硫酸化核心1糖链结合探针与被检试样接触的工序;
[3]如[2]所述的具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析方法,其特征在于,包括:
使与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合的3′硫酸化核心1糖链结合探针与被检试样接触的工序;和
检测具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1与探针的结合体的工序;
[4]如[1]~[3]中任一项所述的具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析方法,其特征在于:上述3′硫酸化核心1糖链结合探针是3′硫酸化核心1糖链结合凝集素或具有其糖链结合部位的凝集素片段、或者3′硫酸化核心1糖链结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段,上述3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针是3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段,上述粘蛋白1结合探针是粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、或者粘蛋白1糖链肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段,上述粘蛋白1糖链结合探针是粘蛋白1糖链结合凝集素或具有其糖链结合部位的凝集素片段、或者粘蛋白1糖链结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段;
[5]如[4]所述的具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析方法,其特征在于,上述3′硫酸化核心1糖链结合凝集素选自半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-4、半乳糖凝集素-6、半乳糖凝集素-8和半乳糖凝集素-9;
[6]如[5]所述的具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析方法,其特征在于,上述半乳糖凝集素-4为来自哺乳类、鸟类、两栖类、爬行类或鱼类的半乳糖凝集素-4;
[7]一种乳腺癌的检测或监测方法,其特征在于,利用[1]~[6]中任一项所述的分析方法,分析具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的量;
[8]一种具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析试剂盒,其特征在于,包括与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合的3′硫酸化核心1糖链结合探针;
[9]一种具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析试剂盒,其特征在于::
(A)包括:
与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合的3′硫酸化核心1糖链结合探针;和
与具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1结合的3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针或与粘蛋白1结合的粘蛋白1结合探针,
或者
(B)包括:
与具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1结合的3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针;和
与粘蛋白1结合的粘蛋白1结合探针或与粘蛋白1具有的糖链结合的粘蛋白1糖链结合探针;
[10]如[8]或[9]所述的具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析试剂盒,其特征在于:上述3′硫酸化核心1糖链结合探针是3′硫酸化核心1糖链结合凝集素或具有其糖链结合部位的凝集素片段、或者3′硫酸化核心1糖链结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段,上述3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针是3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段,上述粘蛋白1结合探针是粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、或者粘蛋白1糖链肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段,上述粘蛋白1糖链结合探针是粘蛋白1糖链结合凝集素或具有其糖链结合部位的凝集素片段、或者粘蛋白1糖链结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段;
[11]如[10]所述的具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析试剂盒,其特征在于,上述3′硫酸化核心1糖链结合凝集素选自半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-4、半乳糖凝集素-6、半乳糖凝集素-8和半乳糖凝集素-9;
[12]如[11]所述的具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析试剂盒,其特征在于,上述半乳糖凝集素-4为来自哺乳类、鸟类、两栖类、爬行类或鱼类的半乳糖凝集素-4;
[13]如[8]~[12]中任一项所述的具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析试剂盒,其特征在于,还包括具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1;
[14]一种乳腺癌的检测或监测试剂盒,其特征在于,使用[8]~[13]中任一项所述的具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析试剂盒;以及
[15]一种具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1。
此外,本说明书中的上述“分析”包括定量地或半定量地确定分析对象物质的量的“测定”和判定有无分析对象物质存在的“检测”这两者。
发明效果
根据本发明的具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析方法或分析试剂盒,能够高效率地检测乳腺癌患者的粘蛋白1。另外,根据本发明的分析方法或分析试剂盒,能够预测乳腺癌患者的复发或转移,能够作为乳腺癌的复发或转移标志物使用。
具体实施方式
[1]具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1
粘蛋白1为具有约300KDa以上的分子量的高度糖基化的I型膜糖蛋白,包含短的N末端区域、中央区域、跨膜区域和C末端的细胞质内区域。上述中央区域包含由20个氨基酸(PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA)构成的固有的重复序列(tandem repeat)。粘蛋白1的基因具有多样性,编码上述重复序列的部分的数目在约25到125之间变化。另外,粘蛋白1的基因,除了重复序列的数目以外,还存在氨基酸的缺失、插入和取代,多样性高。上述中央区域的重复序列的数目变化的区域(variable number of tandem repeats)被称为VNTR区,含有大量的O型聚糖。另一方面,在中央区域的重复序列以外的接近膜的肽部分,存在N型聚糖和O型聚糖。
本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1为新化合物,只要具有3′硫酸化核心1糖链和由20个氨基酸(PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA)构成的固有的重复序列,就没有限定。在具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1中,3′硫酸化核心1糖链大多含在具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的VNTR区的O型聚糖中。
序列号16表示包含N末端区域、中央区域、跨膜区域和C末端的细胞质内区域的粘蛋白1蛋白质的氨基酸序列的1个例子,但是由于粘蛋白1具有多样性,所以具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的氨基酸序列并不限定于由序列号16表示的氨基酸序列。上述重复序列的数目没有限定,优选为1~200,更优选为5~150,更加优选为20~130,最优选为25~125。另外,在具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的N末端区域的氨基酸序列、中央区域的重复的氨基酸序列和重复以外的氨基酸序列、跨膜区域的氨基酸序列、以及C末端的细胞质内区域的氨基酸序列中,本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1能够包含变异。例如,也可以为在由序列号16表示的氨基酸序列中,缺失、取代、和/或添加1~100个氨基酸而得到的氨基酸序列。
此外,本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1,通过进行唾液酸酶处理,和后述的与3′硫酸化核心1糖链结合的凝集素的反应性增加。可以认为该现象是因为:通过除去与粘蛋白1的糖链结合的唾液酸,在空间上被遮挡的3′硫酸化核心1糖链露出。
本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分子量也没有限定,例如为20kD~1000kD。具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1可以为与细胞膜结合的膜结合型的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1,也可以为分泌型的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1,还可以为它们的部分肽。因此,乳腺癌患者的体液能够含有膜结合型具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1、分泌型具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1、和它们的部分肽。
表达本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的细胞或组织没有限定,能够列举例如乳腺、肺、子宫或胰脏。特别是,如后述的实施例所示,在乳腺癌细胞、乳腺癌组织或来自乳腺癌的细胞株中,表达具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1。
本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1,例如是从试样中分离出的。具体而言,能够从来自含有具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的生物体的试样(例如,血清或血浆等血液、或者乳腺癌组织)、或来自乳腺癌的传代细胞、或者其培养上清等中分离。例如,能够使用硫酸铵盐析、离子交换柱色谱、疏水性柱色谱、凝胶过滤柱色谱、亲和柱色谱、透析或冷冻干燥等对上述试样进行纯化。具体而言,能够使用与3′硫酸化核心1糖链结合的抗体或与具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1结合的抗体,制作亲和柱,通过亲和色谱法进行纯化。
本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1,在后述的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析方法中,能够作为标准物质使用。另外,具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析试剂盒,能够含有具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1作为标准物质。
在本说明书中,3′硫酸化核心1糖链更具体而言是指“SO3 --3Galβ1→3GalNAcα1→Ser(Thr)”。粘蛋白1具有的包含3′硫酸化核心1糖链的糖链没有限定,能够列举:
由式(I)表示的3′硫酸化核心1糖链
SO3 --3Galβ1→3GalNAcα1→Ser(Thr) (I)
(以下,称为“3′硫酸化核心1糖链(I)”);
由式(II)表示的3′硫酸化核心1糖链
(以下,称为“3′硫酸化核心1糖链结构(II)”);和
由式(III)表示的3′硫酸化核心1糖链
(以下,称为“3′硫酸化核心1糖链结构(III)”)。
此外,在本说明书中,“核心1糖链”是指“Galβ1→3GalNAcα1→R”。
含有上述3′硫酸化核心1糖链(I)、3′硫酸化核心1糖链(II)和3′硫酸化核心1糖链(III)的粘蛋白1,在正常人的血中几乎不存在,在乳腺癌患者的血中增加。
另外,具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的糖链中的3′硫酸化核心1糖链(I)的含量根据乳腺癌患者而不同,没有特别限定,例如为0.1~99摩尔%,也可以为1~50摩尔%,还可以为5~15摩尔%。具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的糖链中的3′硫酸化核心1糖链(II)的含量也根据乳腺癌患者而不同,没有特别限定,例如为0.1~99摩尔%,也可以为1~50摩尔%,还可以为1~10摩尔%。具有硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的糖链中的3′硫酸化核心1糖链(III)的含量也根据乳腺癌患者而不同,没有特别限定,例如为0.1~99摩尔%,也可以为1~50摩尔%,还可以为5~15摩尔%。
本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1包括具有选自3′硫酸化核心1糖链(I)、3′硫酸化核心1糖链(II)和3′硫酸化核心1糖链(III)中的1种或2种以上的3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1。
本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1也可以具有3′硫酸化核心1糖链(I)、3′硫酸化核心1糖链(II)和3′硫酸化核心1糖链(III)以外的糖链,例如能够列举“Neu5Acα2,3Galβ1,3GalNAcα糖链”、“Neu5Acα2→3Galβ1→3(Neu5Acα2→6)GalNAcβ→R”和“Neu5Acα2→3Galβ1→3(Neu5Acα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→6)GalNAcβ→R”、“Neu5Acα2→8Neu5Acα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→3GalNAc→R”或“Neu5Acα2→8Neu5Acα2→3Galβ1→3GlcNAcβ→R”。
[2]具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析方法
本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析方法的第一方式的特征在于,(A)包括:使与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合的3′硫酸化核心1糖链结合探针与被检试样接触的工序(以下,有时称为接触工序(A-a));使与具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1结合的3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针或与粘蛋白1结合的粘蛋白1结合探针,与被检试样接触的工序(以下,有时称为接触工序(A-b));和检测具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1与探针的结合体的工序。
另外,本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析方法的第二方式的特征在于,(B)包括:使与具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1结合的3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针与被检试样接触的工序(以下,有时称为接触工序(B-a));使与具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1结合的3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针、与粘蛋白1结合的粘蛋白1结合探针或与粘蛋白1具有的糖链结合的粘蛋白1糖链结合探针,与被检试样接触的工序(以下,有时称为接触工序(B-b));和检测具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1与探针的结合体的工序。
此外,在上述检测工序中检测的“具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1与探针的结合体”可以是具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1与1个探针的结合体,也可以是具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1与2个以上的探针的结合体。
作为上述接触工序(A-a)中使用的3′硫酸化核心1糖链结合探针,能够使用3′硫酸化核心1糖链结合凝集素或3′硫酸化核心1糖链结合抗体。更具体而言,3′硫酸化核心1糖链结合探针能够使用3′硫酸化核心1糖链结合凝集素或具有其糖链结合部位的凝集素片段、或者3′硫酸化核心1糖链结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段。
作为上述接触工序(A-b)中使用的3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针,能够列举3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体,具体而言能够使用3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段。另外,作为粘蛋白1结合探针,能够列举粘蛋白1肽结合抗体或粘蛋白1糖链肽结合抗体。具体而言,能够使用粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、或者粘蛋白1糖链肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段。
作为上述接触工序(B-a)中使用的3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针,能够列举3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体,具体而言能够使用3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段。
作为上述接触工序(B-b)中使用的3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针,能够列举3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体,具体而言能够使用3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段。另外,作为粘蛋白1结合探针,能够列举粘蛋白1肽结合抗体或粘蛋白1糖链肽结合抗体。具体而言能够使用粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、或者粘蛋白1糖链肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段。另外,作为粘蛋白1糖链结合探针,能够列举粘蛋白1糖链结合凝集素或粘蛋白1糖链结合抗体。具体而言能够使用粘蛋白1糖链结合凝集素或具有其糖链结合部位的凝集素片段、或者粘蛋白1糖链结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段。
以下,对3′硫酸化核心1糖链结合探针、3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针、粘蛋白1结合探针和粘蛋白1糖链结合探针进行详细说明。
《3′硫酸化核心1糖链结合探针》
3′硫酸化核心1糖链结合探针是识别3′硫酸化核心1糖链的探针。即,3′硫酸化核心1糖链结合探针是仅将3′硫酸化核心1糖链作为表位识别的探针,与后述的将3′硫酸化核心1糖链和粘蛋白1的肽(氨基酸)的组合作为1个表位识别的3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽探针,识别的表位重叠,但是并不相同。另外,3′硫酸化核心1糖链结合探针只要是识别包含“SO3 --3Galβ1→3GalNAcα1→Ser(Thr)”的糖链的探针就没有限定,例如只要是识别上述3′硫酸化核心1糖链(I)、3′硫酸化核心1糖链(II)和3′硫酸化核心1糖链(III)中的任意一个以上的探针即可。
(3′硫酸化核心1糖链结合凝集素)
3′硫酸化核心1糖链结合凝集素只要是能够与3′硫酸化核心1糖链结合的凝集素,就没有限定,例如能够列举与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链具有亲和性的凝集素或与Sulfo-3Galβ1糖链具有亲和性的凝集素。即,只要是能够与3′硫酸化核心1糖链结合的凝集素,与其他糖链具有亲和性的凝集素,也包含在本发明中使用的3′硫酸化核心1糖链结合凝集素中。
作为与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链具有亲和性的凝集素,没有限定,能够列举半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-4、半乳糖凝集素-6、半乳糖凝集素-8或半乳糖凝集素-9。另外,这些半乳糖凝集素的来源也没有限定,能够使用来自各种动物的半乳糖凝集素。这些半乳糖凝集素保留有用于与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合所需要的氨基酸序列,能够与粘蛋白1的3′硫酸化核心1糖链结合,特别优选半乳糖凝集素-4。因为半乳糖凝集素-4对粘蛋白1的3′硫酸化核心1糖链的结合特异性高(非专利文献4)。
半乳糖凝集素-4的来源,只要能够与3′硫酸化核心1糖链结合,就没有限定,例如能够列举来自哺乳类(例如,人、黑猩猩、豚尾猴、普通狨猴、猪、牛、马、山羊、绵羊、狗、猫、兔、熊猫、小鼠或大鼠)、鸟类(例如,鸡)、两栖类(例如,非洲爪蟾)、爬行类(例如,安乐蜥)、鱼类(例如,鲑鱼)的半乳糖凝集素-4。如图2所示,人(序列号2)、猪(序列号4)、小鼠(序列号6)和大鼠(序列号8)等哺乳类的半乳糖凝集素-4的氨基酸序列的同源性非常高。具体而言,人与猪的同源率为80%,人与大鼠的同源率为77%,人与小鼠的同源率为76%。因此,在本发明的分析方法中,能够作为3′硫酸化核心1糖链结合探针,没有限制地使用。另外,人与非洲爪蟾(序列号10)的同源率为55%,人与鲑鱼(序列号12)的同源率为49%,在本发明的分析方法中,能够作为3′硫酸化核心1糖链结合探针使用。
另外,图2所示的小鼠的半乳糖凝集素-6(序列号14),当与半乳糖凝集素-4的氨基酸序列比较时,连接2个糖结合部位的接头部分不同,因此,与人的同源率为70%,但是2个糖结合部位的氨基酸序列的同源性高,保留有用于与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合所需要的氨基酸序列,因此,能够与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合。
作为本发明的分析方法中能够使用的能够与3′硫酸化核心1糖链结合的凝集素,具体而言,能够列举:
(1)选自由序列号2表示的氨基酸序列构成的多肽、由序列号4表示的氨基酸序列构成的多肽、由序列号6表示的氨基酸序列构成的多肽、由序列号8表示的氨基酸序列构成的多肽、由序列号10表示的氨基酸序列构成的多肽、由序列号12表示的氨基酸序列构成的多肽和由序列号14表示的氨基酸序列构成的多肽中的多肽;
(2)选自包含序列号2表示的氨基酸序列的多肽、包含序列号4表示的氨基酸序列的多肽、包含序列号6表示的氨基酸序列的多肽、包含序列号8表示的氨基酸序列的多肽、包含序列号10表示的氨基酸序列的多肽、包含序列号12表示的氨基酸序列的多肽和包含序列号14表示的氨基酸序列的多肽中的且与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合的多肽;
(3)由在选自序列号2表示的氨基酸序列、序列号4表示的氨基酸序列、序列号6表示的氨基酸序列、序列号8表示的氨基酸序列、序列号10表示的氨基酸序列、序列号12表示的氨基酸序列和序列号14表示的氨基酸序列中的氨基酸序列中,取代、缺失、和/或插入1~100个氨基酸(优选1~50个氨基酸,更优选1~20个氨基酸,更加优选1~10个氨基酸,最优选1个或数个氨基酸)而得到的氨基酸序列构成的多肽或包含该氨基酸序列的多肽,且该多肽与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合;
(4)由与选自序列号2表示的氨基酸序列、序列号4表示的氨基酸序列、序列号6表示的氨基酸序列、序列号8表示的氨基酸序列、序列号10表示的氨基酸序列、序列号12表示的氨基酸序列和序列号14表示的氨基酸序列中的氨基酸序列的同源性为50%以上的氨基酸序列(优选同源性为70%以上的氨基酸序列,更优选同源性为80%以上的氨基酸序列,最优选同源性为90%以上的氨基酸序列)构成的多肽或包含该氨基酸序列的多肽,且该多肽与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合。
另外,3′硫酸化核心1糖链结合凝集素可以是从细胞或组织中分离并纯化的,也可以是使用重组体用基因工程的方式制造的。例如,后述的实施例的半乳糖凝集素-4是利用大肠杆菌使用重组体得到的,并与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合。另外,也能够用基因工程的方式制造包含能够与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合的结构域的凝集素片段。
另外,作为3′硫酸化核心1糖链结合凝集素,能够列举双孢蘑菇凝集素(Agaricus bisporus Agglutinin:ABA)。ABA是分子量约64kDa的来自双孢蘑菇的凝集素,由143个氨基酸(分子量约16kDa)的4个亚基构成。ABA与3′硫酸化核心1糖链结合,也与“Galβ1→3GalNAcα1→Ser(Thr)”(核心1糖链)和“Siaα2→3(6)Galβ1→3GalNAcα→Ser(Thr)”结合,在本发明的分析方法中,能够作为3′硫酸化核心1糖链结合凝集素使用。
(3′硫酸化核心1糖链结合抗体)
作为3′硫酸化核心1糖链结合抗体,只要是能够与3′硫酸化核心1糖链结合的抗体,就没有限定,例如能够列举与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合的抗体、或与Sulfo-3Galβ1糖链结合的抗体。上述与3′硫酸化核心1糖链结合的抗体由于仅能够与3′硫酸化核心1糖链结合,所以能够与具有3′硫酸化核心1糖链的糖蛋白或糖脂质结合。
与3′硫酸化核心1糖链结合的抗体,除了使用3′硫酸化核心1糖链或具有3′硫酸化核心1糖链的糖蛋白作为免疫抗原以外,能够通过公知的方法制作。例如,单克隆抗体能够按照Koehler和Milstein的方法(Nature256:495-497,1975)制作。另外,多克隆抗体,例如,在兔子的皮内,将3′硫酸化核心1糖链或具有3′硫酸化核心1糖链的糖蛋白单独或者作为与BSA或KLH等结合的抗原,与完全弗氏佐剂等佐剂混合定期地免疫。在血中的抗体效价上升的时刻采血,能够直接作为抗血清使用或将抗体用公知的方法纯化使用。
《3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针》
3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针是将3′硫酸化核心1糖链和粘蛋白1的肽(氨基酸)的组合作为1个表位识别的探针。即3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针是识别由3′硫酸化核心1糖链和粘蛋白1肽的组合构成的表位的探针,与上述的识别3′硫酸化核心1糖链的3′硫酸化核心1糖链结合探针,识别的表位重叠,但是并不相同。另外,3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针只要是将包含“SO3 --3Galβ1→3GalNAcα1→Ser(Thr)”的糖链和肽的组合作为1个表位识别的探针,就没有限定,例如只要是将上述3′硫酸化核心1糖链(I)、3′硫酸化核心1糖链(II)和3′硫酸化核心1糖链(III)中的任意一个以上的糖链和肽的组合作为1个表位识别的探针即可。
(3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体)
3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体是与具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1结合、与不具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1不结合、而且仅与3′硫酸化核心1糖链不结合的抗体。即,是将3′硫酸化核心1糖链和粘蛋白1的肽的组合作为1个表位识别的抗体。作为3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体,能够列举在后述的实施例中使用的Sigma公司的1D1单克隆抗体。上述单克隆抗体是使用人乳腺癌患者胸水的粘蛋白1的部分纯化物作为免疫抗原而得到的单克隆抗体,与由粘蛋白1的3′硫酸化核心1糖链和肽的组合构成的表位结合。此外,3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体中,存在对3′硫酸化核心1糖链和粘蛋白1的肽显示强的亲和性、并且对3′硫酸化核心1糖链以外的糖链和肽的组合也显示交叉反应的抗体,这样的抗体也包括在3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体中。
另外,3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体,除了使用具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1作为免疫抗原以外,能够通过公知的方法制作。例如,单克隆抗体能够按照Koehler和Milstein的方法(Nature256:495-497,1975)制作,通过在杂交瘤的筛选中,选择产生与具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1结合、与不具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1不结合、而且仅与3′硫酸化核心1糖链不结合的单克隆抗体的杂交瘤,能够取得与具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1结合的抗体。另外,多克隆抗体,例如,在兔子的皮内,将具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1单独或者作为与BSA或KLH等结合的抗原,与完全弗氏佐剂等佐剂混合定期地免疫。在血中的抗体效价上升的时刻采血,通过用亲和柱等吸收与不具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1结合的抗体、和与3′硫酸化核心1糖链结合的抗体,能够取得与具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1结合的多克隆抗体。
《粘蛋白1结合探针》
粘蛋白1结合探针是与粘蛋白1结合的探针,但是,是与上述3′硫酸化核心1糖链结合探针或3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针识别的表位实质上不同的探针。即,粘蛋白1结合探针的表位与上述3′硫酸化核心1糖链结合探针或3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针的表位实质上不重叠。
(粘蛋白1肽结合抗体或粘蛋白1糖链肽结合抗体)
粘蛋白1结合探针具体而言为粘蛋白1肽结合抗体、或粘蛋白1糖链肽结合抗体,只要能够与不具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1和具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1结合,就没有限定,例如能够列举与不具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1和具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1结合、并且仅与3′硫酸化核心1糖链不结合的抗体。即,包括将粘蛋白1的肽作为表位识别的粘蛋白1肽结合抗体、和将粘蛋白1的糖链和肽的组合作为表位识别的粘蛋白1糖链肽结合抗体。
上述粘蛋白1肽结合抗体或粘蛋白1糖链肽结合抗体,除了使用粘蛋白1作为免疫抗原以外,能够通过公知的方法制作。例如,单克隆抗体能够按照Koehler和Milstein的方法(Nature256:495-497,1975)制作。另外,多克隆抗体,例如,在兔子的皮内,将粘蛋白1单独或者作为与BSA或KLH等结合的抗原,与完全弗氏佐剂等佐剂混合定期地免疫。在血中的抗体效价上升的时刻采血,能够直接作为抗血清使用或将抗体用公知的方法纯化使用。
另外,粘蛋白1肽结合抗体或粘蛋白1糖链肽结合抗体,以往获取了多种,大多抗粘蛋白1抗体有市售,例如也能够使用在CA15-3的检测中使用的单克隆抗体115D8或单克隆抗体DF3。
另外,在KL-6的检测中使用的单克隆抗体KL-6,作为粘蛋白1糖链肽结合抗体,能够用于本发明的分析方法。有报道KL-6抗体是识别粘蛋白1的氨基酸序列PDTRPAP和Neu5Acα2,3Galβ1,3GalNAcα糖链(唾液酸化糖链)的单克隆抗体(非专利文献5)。本发明人发现,KL-6抗体除了上述的唾液酸化糖链以外,对Neu5Acα2-3(SO3 --6)Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3GalNAc糖链、Neu5Acα2-3Galβ1-3(SO3 --6)GalNAc糖链和SO3 --6[SO3 --3Galβ1-3GalNAc]糖链也显示强的亲和性。另外,对上述3′硫酸化核心1糖链(I)和3′硫酸化核心1糖链(II)也显示亲和性。即,KL-6抗体是对3′硫酸化核心1糖链以外的糖链和粘蛋白1的肽显示强的亲和性的抗体,是对3′硫酸化核心1糖链和粘蛋白1的肽也显示亲和性的抗体。这样的抗体,在本发明的分析方法中,为方便起见包含在粘蛋白1糖链肽结合抗体中。但是,也能够作为3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体使用。
《粘蛋白1糖链结合探针》
粘蛋白1糖链结合探针是仅与粘蛋白1具有的糖链结合的探针,是仅与3′硫酸化核心1糖链以外的糖链结合的探针。即,粘蛋白1糖链结合探针的表位与上述3′硫酸化核心1糖链结合探针或3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针的表位实质上不重叠,但可以与上述粘蛋白1结合探针的表位重叠。另外,因为也能够与上述具有糖链的粘蛋白1以外的糖蛋白结合,所以不是与粘蛋白1特异性结合的探针。
(粘蛋白1糖链结合凝集素)
粘蛋白1糖链结合凝集素,只要是对粘蛋白1具有的3′硫酸化核心1糖链以外的糖链具有亲和性的凝集素,就没有限定。例如能够列举识别粘蛋白1具有的Neu5Acα2,3Galβ1,3GalNAcα糖链的凝集素。具体而言,能够列举Jacalin或双孢蘑菇凝集素(ABA),ABA也能够与3′硫酸化核心1糖链结合,因此也能够作为3′硫酸化核心1糖链结合凝集素使用,还能够作为粘蛋白1糖链结合凝集素使用。另外,作为粘蛋白1糖链结合凝集素,能够列举能够识别Neu5Acα2→3Galβ1→3(Neu5Acα2→6)GalNAcβ→R、或Neu5Acα2→3Galβ1→3(Neu5Acα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→6)GalNAcβ→R的凝集素。除此以外,还能够列举与“Neu5Acα2→8Neu5Acα2→3Gal(以下,有时称为α2,8二唾液酸糖链)结合的凝集素。
(粘蛋白1糖链结合抗体)
粘蛋白1糖链结合抗体,只要是与3′硫酸化核心1糖链以外的粘蛋白1具有的糖链结合的抗体,就没有限定。能够列举识别粘蛋白1具有的Neu5Acα2,3Galβ1,3GalNAcα糖链、Neu5Acα2→3Galβ1→3(Neu5Acα2→6)GalNAcβ→R、或Neu5Acα2→3Galβ1→3(Neu5Acα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→6)GalNAcβ→R的抗体。另外,能够列举能够与作为α2,8二唾液酸糖链的Neu5Acα2→8Neu5Acα2→3Galβ1→4GlcNAcβ1→3Galβ1→3GalNAc→R结合的S2-566单克隆抗体、和1E6单克隆抗体。
作为本发明的分析方法中使用的探针,也能够使用具有上述凝集素的糖链结合部位的凝集素片段、或具有上述抗体的抗原结合部位的抗体片段。
具有凝集素的糖链结合部位的凝集素片段,例如能够用基因工程的方式使用重组体制造具有糖链结合部位的多肽。
另外,作为具有抗体的抗原结合部位的抗体片段,例如能够列举F(ab′)2、Fab′、Fab或Fv等。这些抗体片段,例如,能够通过将抗体按照常规方法利用蛋白质分解酶(例如,胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等)进行消化,接着,按照常规方法的蛋白质的分离纯化的方法进行纯化而得到。
《夹心法》
本发明的分析方法的第一方式和第二方式没有限定,具体而言能够如以下那样进行。
本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析方法的第一方式包括上述接触工序(A-a)、接触工序(A-b)和检测工序。对于上述接触工序(A-a)和接触工序(A-b),可以先进行接触工序(A-a)和接触工序(A-b)中的任一个。因此,实施接触工序(A-a)、接触工序(A-b)和检测工序的顺序有以下2种实施方式。
(1)实施接触工序(A-a),实施接触工序(A-b),然后实施检测工序。
(2)实施接触工序(A-b),实施接触工序(A-a),然后实施检测工序。
另外,同样,本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析方法的第二方式也有以下2种实施方式。
(1)实施接触工序(B-a),实施接触工序(B-b),然后实施检测工序。
(2)实施接触工序(B-b),实施接触工序(B-a),然后实施检测工序。
例如,在利用夹心法进行本发明的分析方法的第一方式的情况下,能够列举以下2种实施方式。此外,第二方式也能够通过更换探针同样地进行。
(1)依次进行以下工序的夹心法(以下,称为夹心法(1)):使3′硫酸化核心1糖链结合探针与被检试样接触的工序(a);使3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针或粘蛋白1结合探针与被检试样接触的工序(b);和检测具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1与探针的结合体的工序。
(2)依次进行以下工序的夹心法(以下,称为夹心法(2)):使3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针或粘蛋白1结合探针与被检试样接触的工序(b);使3′硫酸化核心1糖链结合探针与被检试样接触的工序(a);和检测具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1与探针的结合体的工序。
上述夹心法例如能够如以下那样进行。
(i)一次反应工序
将捕获探针(一次探针)固定在微孔板或珠子等不溶性载体上。接着,为了防止向捕获探针或不溶性载体的非特异性的吸附,用适当的封闭剂(例如牛血清白蛋白或明胶等)进行不溶性载体的封闭。将含有具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的被检试样与一次反应液一起加入到固定有捕获探针(一次探针)的不溶性载体(微孔板或珠子)中,使捕获探针(一次探针)与具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1接触,使它们结合。然后,用适当的清洗液(例如,含有表面活性剂的磷酸缓冲液)清洗未与捕获抗体结合的抗原和杂质。
(ii)二次反应工序
在与具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1结合的探针中添加标记了辣根过氧化物酶(HRP)等酶的标记探针(2次探针),使标记探针与被捕获的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1结合。通过该反应,在不溶性载体(微孔板或珠子)上形成捕获探针-具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1-标记探针的复合体。
另外,作为2次抗体也能够使用结合了生物素的“生物素标记探针”或“非标记探针”代替标记了酶的“标记探针”。
(iii)检测工序
用清洗液清洗不溶性载体(微孔板或珠子等),添加对于标记抗体的酶的发色底物或发光底物,通过使酶与底物反应来检测信号。
另外,在不直接标记2次抗体而使用非标记探针的情况下,也能够标记与2次探针结合的抗体,检测信号。另外,在使用上述生物素标记抗体的情况下,也能够使用酶标记亲和素来检测信号。
在上述第一方式的夹心法(1)的情况下,作为捕获探针(一次探针),使用3′硫酸化核心1糖链结合凝集素或具有其糖链结合部位的凝集素片段、或者3′硫酸化核心1糖链结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、或者它们的混合物,作为标记探针(2次探针),使用3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、粘蛋白1糖链肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、或者它们的混合物。
另外,在上述第一方式的夹心法(2)的情况下,作为捕获探针(一次探针),使用3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、粘蛋白1糖链肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、或者它们的混合物,作为标记探针(2次探针),使用3′硫酸化核心1糖链结合凝集素或具有其糖链结合部位的凝集素片段、或者3′硫酸化核心1糖链结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、或者它们的混合物。
在上述第二方式的夹心法(1)的情况下,作为捕获探针(一次探针),使用3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、或者它们的混合物,作为标记探针(2次探针),使用3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、粘蛋白1糖链肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、粘蛋白1糖链结合凝集素或具有其糖链结合部位的凝集素片段、粘蛋白1糖链结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、或者它们的混合物。
另外,在上述第二方式的夹心法(2)的情况下,作为捕获探针(一次探针),使用3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、粘蛋白1糖链肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、粘蛋白1糖链结合凝集素或具有其糖链结合部位的凝集素片段、粘蛋白1糖链结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、或者它们的混合物,作为标记探针(2次探针),使用3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、或者它们的混合物。
上述夹心法能够通过酶免疫测定法、化学发光免疫测定法、电化学发光免疫测定法或放射免疫测定法进行。因此,作为标记抗体的酶,能够列举辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和荧光素酶等。另外,除了酶以外,作为标记物质,能够使用吖啶鎓衍生物等发光物质、铕等荧光物质、钌配位化合物等电化学发光物质、I125等放射性物质等。另外,能够根据标记物质适当选择底物和发光诱导物质。另外,作为本发明中的标记抗体,能够使用结合有半抗原或低分子量的肽、凝集素等能够在抗原抗体反应的信号的检测中作为检测标志物利用的物质的抗体。
本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析方法的第三方式,包括第一方式的接触工序(A-a),不包括上述接触工序(A-b)和检测工序。具体而言,能够列举使具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1与3′硫酸化核心1糖链结合探针结合,使其从3′硫酸化核心1糖链结合探针解离进行回收的方法。在使用3′硫酸化核心1糖链结合凝集素作为3′硫酸化核心1糖链结合探针的情况下,使用凝集素亲和柱,在使用3′硫酸化核心1糖链结合抗体作为3′硫酸化核心1糖链结合探针的情况下,使用抗体亲和柱。
使用上述的凝集素亲和柱或抗体亲和柱,使试样中的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1结合,然后通过进行洗脱,来回收试样中的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1。回收的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1能够通过一般的蛋白检测法(例如,凝胶电泳后的蛋白质的染色、利用UV计进行的蛋白质的检测)或粘蛋白1特异性的检测法(例如,通过抗粘蛋白1抗体的酶免疫测定法进行的检测)检测。
本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析方法的第四方式包括上述接触工序(A-a)和检测工序,不包括上述接触工序(A-b)。
具体而言,进行使与具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1结合的3′硫酸化核心1糖链结合探针与被检试样接触的工序(A-a),接着,进行检测具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1与上述3′硫酸化核心1糖链结合探针的结合体的工序。作为3′硫酸化核心1糖链结合探针,能够使用3′硫酸化核心1糖链结合凝集素或3′硫酸化核心1糖链结合抗体。
第四方式在使用3′硫酸化核心1糖链结合抗体的情况下,例如能够通过乳胶凝集免疫测定法、荧光抗体法、放射免疫测定法、免疫沉降法、免疫组织染色法或蛋白质印迹法等进行。在使用3′硫酸化核心1糖链结合凝集素的情况下,能够通过凝集素印迹法进行。
(被检试样)
作为本发明的分析方法中使用的被检试样,能够列举来自可能含有具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的生物体的试样。例如能够列举尿、血液、血清、血浆、脑脊液、唾液、细胞、组织或器官或者它们的制备物(例如活检标本,特别是乳腺癌患者的活检标本)等,优选血液、血清、血浆或乳腺的活检标本,特别优选血液、血清或血浆。在健康人的血液、血清或血浆中,几乎不存在具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1,在乳腺癌患者中,具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1被放出到血液中,因此适合作为用于检测乳腺癌的被检试样。
上述尿、血液、血清、血浆、脑脊液、唾液等液性的试样,在上述分析方法中,能够根据各种分析方法利用适当的缓冲液稀释使用。另外,细胞、组织或器官等固形的试样,能够用固形的试样的体积的2~10倍左右的适当的缓冲液溶解,将悬浊液或其上清,在上述分析方法中直接使用或进一步稀释使用。
在本说明书中,“来自可能含有具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的生物体的试样”包括含有粘蛋白1的被检试样和可能含有粘蛋白1的被检试样。其理由是因为,有时在分析中使用来自有可能患有乳腺癌或其他癌的患者的被检试样。
[3]乳腺癌的检测或监测方法
利用上述具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析方法,能够进行乳腺癌的检测或监测。
(乳腺癌的检测方法)
通过利用上述具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析方法,测定对象(患者)的试样中的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的量,并与健康人试样中的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的量进行比较,能够检测或诊断上述对象(患者)是否患有乳腺癌。
如表2和图7所示,本发明的乳腺癌的检测方法,在阶段I和阶段II的原发性乳腺癌患者中,与通过以往的CA15-3的测定得到的检出率进行比较时,显示出40%和55%的高检出率。
(乳腺癌的监测方法)
另外,通过利用上述具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析方法,测定正在进行治疗的乳腺癌患者的试样中的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的量,能够进行乳腺癌患者的监测(例如,乳腺癌的恶性度、乳腺癌的进展度、乳腺癌的转移和乳腺癌的复发的监测)。
如表1所示,在乳腺癌转移的患者中,当与通过以往的CA15-3的测定得到的阳性率进行比较时,显示出非常高的阳性率。因此,本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析方法能够作为乳腺癌的转移的预测方法或监测方法使用。
另外,如图6所示,复发或发生转移的患者的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的测定值比5年以上没有复发的患者高。因此,本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析方法能够作为乳腺癌的复发或转移的监测方法使用。
[4]具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1的分析试剂盒
本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析试剂盒,是用于上述具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析方法的试剂盒。本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析试剂盒,也能够作为乳腺癌的检测或监测用试剂盒使用。
本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析试剂盒的第一方式包括:与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合的3′硫酸化核心1糖链结合探针;和与具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1结合的3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针或与粘蛋白1结合的粘蛋白1结合探针。
本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析试剂盒的第二方式包括:与具有Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链的粘蛋白1结合的3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针;和与粘蛋白1结合的粘蛋白1结合探针或与粘蛋白1具有的糖链结合的粘蛋白1糖链结合探针。
本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析试剂盒的第三方式包括与Sulfo-3Galβ1-3GalNAc-R糖链结合的3′硫酸化核心1糖链结合探针。
作为3′硫酸化核心1糖链结合探针,能够使用3′硫酸化核心1糖链结合凝集素或具有其糖链结合部位的凝集素片段、或者3′硫酸化核心1糖链结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段。作为3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合探针,能够使用3′硫酸化核心1糖链粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段。作为粘蛋白1结合探针,能够使用粘蛋白1肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段、或者粘蛋白1糖链肽结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段。作为粘蛋白1糖链结合探针,能够使用粘蛋白1糖链结合凝集素或具有其糖链结合部位的凝集素片段、或者粘蛋白1糖链结合抗体或具有其抗原结合部位的抗体片段。
上述探针根据分析试剂盒的测定方法,可以与载体结合,也可以溶解在缓冲液中。例如,作为载体,能够列举琼脂糖(Sepharose)、纤维素、琼脂糖(agrose)、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、苯乙烯与二乙烯基苯的共聚物、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚环氧乙烷、羟丙基甲基纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯酸甲酯、聚苯乙烯和聚苯乙烯?共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸、胶原蛋白、海藻酸钙、乳胶、聚砜、二氧化硅、氧化锆、氧化铝、氧化钛、陶瓷。载体的形状也没有特别限定,能够使用颗粒状的珠子、板和凝胶等形状的载体。
另外,在上述分析方法为使用标记化抗体的免疫学方法(例如酶免疫测定法、化学发光免疫测定法、荧光抗体法、电化学发光免疫测定法或放射免疫测定法)的情况下,探针能够以用标记物质标记的标记化抗体或标记化抗体片段的形态包含。作为标记物质的具体例子,作为酶能够列举过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶或葡糖氧化酶等,作为荧光物质能够列举异硫氰酸荧光素或稀土金属螯合物等,作为放射性同位素能够列举3H、14C或125I等,另外能够列举生物素、亲和素或化学发光物质等。在酶或化学发光物质等的情况下,其本身单独并不能带来能够测定的信号,因此优选分别选择并含有对应的适当的底物等。
本发明的分析试剂盒能够含有具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1作为标准物质。作为标准物质使用的MUC1粘蛋白能够将YMB-1等乳腺癌细胞株培养上清、乳腺癌患者的胸水、腹水等体液作为原料通过常规方法进行纯化。另外,本发明的试剂盒能够包含明确记载有乳腺癌的检测或监测的使用说明书。作为用于乳腺癌的检测或监测的意思的记载可以附在分析试剂盒的容器上。
实施例
以下,通过实施例具体地说明本发明,但是这些实施例并不是对本发明的范围进行限定。
《解析例1》
在本解析例中,进行乳腺癌细胞(YMB-1)的分泌粘蛋白1中的3′硫酸化核心1糖链的解析。用β-消去反应使乳腺癌细胞(YMB-1)的分泌粘蛋白1的糖链游离,用NaB3H4进行还原标记。将得到的糖链用pH5.4的高压滤纸电泳分离。将分离的各组分通过Bio-Gel P-4柱色谱、各种凝集素柱色谱、含有唾液酸酶的外切糖苷酶消化,确定各个组分中含有的糖链结构。
其结果,作为含有3′硫酸化核心1糖链的糖链,含有由式(I)
SO3 --3Galβ1→3GalNAcα1→Ser(Thr) (I)
表示的3′硫酸化核心1糖链(I)约7摩尔%,含有由式(II)
表示的3′硫酸化核心1糖链(II)约3摩尔%,含有由式(III)
表示的3′硫酸化核心1糖链(III)约10摩尔%。
《实施例1:具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分离》
在本实施例中,从乳腺癌细胞株进行具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分离和纯化。
回收来自乳腺癌的细胞株YMB-1细胞培养液,通过离心分离将漂浮的细胞除去后,用100KDa截留分子量的膜浓缩回收。将回收的培养液加在用PBS平衡了的抗粘蛋白1抗体的亲和柱上,用该PBS缓冲液清洗后,用洗脱缓冲液(10mM KH2PO4、3M NaCl,pH2.5)洗脱,得到粘蛋白1溶液。
此外,抗粘蛋白1的亲和柱使用CNBr-Sepharose(GEhealthcare公司制造),按照制造商推荐的所附的操作方案制作。
《实施例2:半乳糖凝集素-4的制备和半乳糖凝集素-4-HRP的制备》
在本实施例中,进行与3′硫酸化核心1糖链结合的重组人半乳糖凝集素-4的制备。
首先,通过PCR从人T-84结肠上皮cDNA文库中取得编码半乳糖凝集素-4的ORF的cDNA。使用的引物为正义引物:5′-gctgtcgacATGGCCTATGTCCCCGCA-3′(序列号17)和反义引物:5′-cctaagcttTCTGGACATAGGACAAGG-3′(序列号18)。将得到的PCR片段整合入pQE-9载体的SalI位点和HindIII位点,得到G4-pQE-9载体。用G4-pQE-9载体转化大肠杆菌M15株。培养转化后的大肠杆菌,用IPTG诱导半乳糖凝集素-4的表达。将得到的大肠杆菌用溶菌酶处理,通过离心分离得到上清。使用Ni-NTA树脂、脱唾液酸胎球蛋白结合树脂,从得到的上清中纯化半乳糖凝集素-4。通过Bio-Rad Protein Assay测定纯化的半乳糖凝集素-4的浓度,在以下的实验中使用。
(半乳糖凝集素-4-HRP的制备)
用辣根过氧化物酶(HRP)标记纯化的半乳糖凝集素-4。HRP的标记使用Peroxidase Labeling Kit-NH2(同仁化学研究所),按照所附的操作方案进行,得到半乳糖凝集素-4-HRP。
《实施例3:具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的测定体系的构建》
在本实施例中,进行具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的通过夹心法的免疫学分析方法的构建。
将用50mM碳酸缓冲液(pH9.6)稀释至4μg/mL的抗粘蛋白1单克隆抗体(Sigma公司)50μL加到96well ELISA plates(96孔酶标板)(康宁公司),在4℃固定16小时。将表面用含有20%封闭试剂N102(日油株式会社)的PBS在25℃进行1.5小时封闭。用在PBS-0.1%Tween-20(PBS-T)中添加有10%Carbofree blocking solution(Vector公司)的稀释液,将作为标准物质的实施例1中得到的具有3′硫酸化核心1糖链的YMB-1粘蛋白1溶液稀释至10~6000倍,加入50μL,在25℃孵育1.5小时。用PBS-T清洗3次后,加入稀释2000倍的半乳糖凝集素-4-HRP50μL,在25℃孵育1.5小时。将各孔用PBS-T清洗4次,加入100μL的TMB底物溶液(Pierce公司),在25℃孵育15分钟后,用2N硫酸溶液停止反应后,用Plate CHAMELEON V(Hidex公司)测定450nm的吸光度。
将得到的标准直线示于图3。此外,具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的量,利用“Eitest KL-6”(卫材株式会社)测定上述YMB-1粘蛋白1溶液,以得到的单位数作为基准算出。
《实施例4:乳腺癌患者血清的测定》
对复发或转移的乳腺癌患者血清48个样本或健康人血清85个样本,进行具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的测定。
除了使用乳腺癌患者血清48个样本或健康人血清85个样本代替YMB-1粘蛋白1溶液以外,重复实施例3的操作。根据实施例3中得到的标准直线,计算各个样本的单位数。将结果示于图4。健康人血清的粘蛋白1的平均值为182±85U/mL。另一方面,乳腺癌患者血清的粘蛋白1的平均值为1082±1145U/mL。将截止值设为350U/mL时,乳腺癌患者的阳性率为92%。
《比较例1:CA15-3的测定》
在本比较例中,对实施例4中测定的乳腺癌患者血清48个样本,进行作为乳腺癌标志物的CA15-3的测定。
CA15-3的测定使用“E TEST“TOSOH”II(CA15-3)”(东曹株式会社),按照所附的操作方案进行测定。
将结果示于图4。乳腺癌患者血清48个样本的阳性率为52%。
将CA15-3的测定值和上述实施例4中测定的本发明的分析方法中的测定值作图(图5)。可知CA15-3为阴性的很多样本用本发明的分析方法能够判定为阳性。
《实施例5:乳腺癌患者的复发的预测》
在本实施例中,除了在实施例4中测定的复发或转移的乳腺癌患者48个样本和健康人血清85个样本以外,用实施例4的测定方法测定了手术后5年以上没有复发的乳腺癌患者24个样本。将结果示于图6。
手术后5年以上没有复发的乳腺癌患者的测定值明显比复发或转移的乳腺癌患者的测定值低,因此,可以认为本发明的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的分析方法为乳腺癌的复发或转移的有用的标志物。
《实施例6》
在本实施例中,按照实施例4的操作测定复发或转移的8名乳腺癌患者的血清中的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1。对于实施例4中测定的48个样本和本实施例中测定的8个样本共计56个样本,将乳腺癌的转移位置与Gal4/MUC1的阳性率的关系示于表1。
《比较例2》
在本比较例中,按照比较例1的操作测定复发或转移的8名乳腺癌患者的血清中的CA15-3。对于比较例4中测定的48个样本和本比较例中测定的8个样本共计56个样本,将乳腺癌的转移位置与CA15-3的阳性率的关系示于表1。
[表1]
具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1在复发或转移的乳腺癌患者的91%(51/56)中为阳性。另外,不论转移位置是何处都显示出高的阳性率。另一方面,CA15-3在复发或转移的乳腺癌患者的48%(27/56)中为阳性,阳性率不高。
《实施例7》
在本实施例中,测定54名原发性乳腺癌患者的血清中的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1。
除了使用54名原发性乳腺癌患者的血清以外,重复实施例4的操作。将阶段I和阶段II的原发性乳腺癌患者的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的阳性率示于表2。将截止值设为350单位时,具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的阳性率在阶段I为40%,在阶段II为55%。这些阳性率与后述的CA15-3的阳性率相比较非常高。
《比较例3》
在本比较例中,测定54名原发性乳腺癌患者的血清中的CA15-3。
除了使用54名原发性乳腺癌患者的血清以外,重复比较例1的操作。将阶段I和阶段II的原发性乳腺癌患者的CA15-3的阳性率示于表2。CA15-3的阳性率在阶段I为4%,在阶段II为10%。
[表2]
另外,将实施例7中测定的具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1的测定值与本比较例中测定的CA15-3的测定值的相关性绘制在图7中。在CA15-3为阴性的样本中,也存在很多具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1为阳性的样本。
产业上的可利用性
本发明的对具有3′硫酸化核心1糖链的粘蛋白1进行分析的方法能够用于乳腺癌的检测或监测。本发明的分析方法或分析试剂盒能够作为乳腺癌的复发或转移标志物使用。
以上,用特定的方式对本发明进行了说明,但是对于本领域技术人员来说显而易见的变形和改良也包括在本发明的范围中。