ES2860679T3 - Diagnóstico de una patología hepática mediante evaluación de la glicosilación de proteínas - Google Patents

Abstract

Un método para evaluar el estado patológico de un hígado en un sujeto con sospecha de tener una patología hepática que comprende: poner en contacto una proteína en o de un fluido biológico de dicho sujeto con una lectina de unión a fucosa, en donde dicha proteína es IgG, permitir que dicha lectina se una a dicha proteína, detectar cuantificablemente dicha lectina unida en o del fluido biológico para obtener un valor detectado de lectina unida; y comparar el valor detectado de lectina unida con un valor de referencia para la lectina unida en dicha proteína en o de un fluido biológico comparable de sujetos sin dicha patología hepática, donde dicho valor detectado de lectina unida con respecto al valor de referencia es indicativo de la presencia o ausencia de dicha patología hepática, en donde un valor detectado de lectina unida que muestra una desviación significativa de dicho valor de referencia es indicativo de la presencia de dicha patología hepática, o comparar el valor detectado de lectina unida con un valor de referencia para lectina unida en dicha proteína en o de un fluido biológico comparable de sujetos en los que se sabe que está presente dicha patología hepática, donde dicho valor detectado de lectina unida con respecto al valor de referencia es indicativo de la presencia o ausencia de dicha patología hepática, en donde un valor detectado de lectina unida que muestra una desviación significativa de dicho valor de referencia es indicativo de la ausencia de dicha patología hepática, y en donde la patología hepática se selecciona de cirrosis, carcinoma hepatocelular y fibrosis.

Description

DESCRIPCIÓN

Diagnóstico de una patología hepática mediante evaluación de la glicosilación de proteínas

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Apoyo del gobierno

La investigación que condujo a las invenciones descritas se financió, en parte, con fondos del NCI bajo las concesiones R33CA94340 y UOl CA84951. En consecuencia, el gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos sobre las invenciones descritas en la presente descripción.

Campo de la invención

La invención se refiere en general al campo de los inmunodiagnósticos. Más específicamente, la invención se refiere a métodos y kits para el diagnóstico rápido y preciso de enfermedades hepáticas tales como carcinoma hepatocelular, hepatitis y cirrosis a través de la detección de glicoproteínas fucosiladas específicas identificadas como que se asocian con patologías hepáticas.

Antecedentes de la invención

A lo largo de la descripción se citan diversas publicaciones, incluidas patentes, solicitudes publicadas, artículos técnicos y artículos académicos.

El hígado es la glándula más grande del cuerpo y desempeña un papel vital en, entre otras cosas, la digestión, el metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas, el almacenamiento de vitaminas, minerales y carbohidratos, la producción de factores de coagulación sanguínea, la destrucción de bacterias en la sangre y la desintoxicación del cuerpo de sustancias endógenas y exógenas. Dado el amplio espectro de funciones hepáticas, las enfermedades y patologías del hígado pueden tener efectos sistémicos de gran alcance en el cuerpo.

Una patología hepática común es el carcinoma hepatocelular (HCC). El HCC ocupa el quinto lugar entre los cánceres más comunes del mundo y es la tercera causa principal de muerte por cáncer (El-Serag H y otros, (2001) Hepatology 33:62-5; y, Block T y otros, (2003) Oncogene 22:5093-107). La etiología principal de1HCC es la infección viral, en particular, la infección con el virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la hepatitis C (VHC) (Brechot C (1996) Baillieres Clin. Gastroenterol. 10:335-73). El HCC puede conducir a cirrosis hepática. Además, la cirrosis es un factor de riesgo de HCC (llceda K. y otros, (1993) Hepatology 18:47-53).

La cirrosis hepática se caracteriza, entre otras cosas, por fibrosis extensa, necrosis de hepatocitos, colapso de la red de reticulina de soporte y depósito extenso de tejido conectivo. Existen múltiples etiologías para la cirrosis hepática, incluidas hepatitis viral, abuso de alcohol, genética (por ejemplo, Enfermedad de Wilson), trombosis venosa en el síndrome de Budd-Chiari y autoinmunidad (por ejemplo, Cirrosis biliar primaria). La cirrosis del hígado es irreversible y, si no se controla, puede conducir a insuficiencia hepática. De hecho, la cirrosis hepática es una de las principales causas de muerte entre los adultos en los Estados Unidos y en todo el mundo.

Es importante que las enfermedades hepáticas tal como el HCC se detecten temprano para proporcionar al paciente la gama completa de opciones terapéuticas y, en última instancia, mejorar el pronóstico del paciente (Hoofnagle, JH y otros, (1997) N. Engl. J. Med. 336:347-56). Además, es igualmente importante que las afecciones que predisponen al HCC y otras enfermedades hepáticas, por ejemplo, la cirrosis y la infección por VHB y VHC, se detecten temprano para un tratamiento eficaz y para la prevención de la aparición de HCC. Desafortunadamente, muchas enfermedades hepáticas, incluida la infección por VHB y VHC, pueden ser asintomáticas durante muchos años. En general, las enfermedades hepáticas se diagnostican y monitorizan mediante pruebas serológicas y pruebas de función hepática, así como también mediante el examen físico del paciente. Además, como existe una aparente correlación entre la expresión elevada de alfa-fetoproteína (AFP) y la presencia de HCC, el tamizaje para AFP se lleva a cabo frecuentemente de forma habitual en casos de sospecha de enfermedad hepática (Buamah PK. y otros, (1984) Clin. Chim. Acta 139:313-6). También se describe como marcadores para el diagnóstico de1HCC la combinación de AFP con alfa-1-antitripsina o transferrina (Naitoh A. y otros, (1999) J. Gastroenterology and Hepatology 14:436-445). Sin embargo, la AFP tiene varios inconvenientes principales en la medida en que puede expresarse en ausencia de enfermedad, lo que conduce a diagnósticos falsos positivos, y no se encuentra elevada hasta en el 50 % de los casos de cáncer de hígado, lo que conduce a diagnósticos falsos negativos (Nguyen MH y otros, (2002) Hepatology 36:410-7). Además, el valor predictivo de AFP disminuye sustancialmente con respecto a su capacidad para identificar HCC en etapa temprana (Oka H y otros, (1994) Hepatology 19:61-7; Pateron D y otros, (1994) J. Hepatol. 20:65-72; y Zoli M y otros, (1996) Cancer 78:977-83). GP73 también se ha descrito como un biomarcador para el diagnóstico de HCC (Block TM. y otros, (2005) PNAS 102(3):779-784). El documento WO 03/087833 describe diversos carbohidratos como marcadores para la detección de cirrosis.

Por lo tanto, se necesitan medios más rápidos, precisos y fiables para el diagnóstico de enfermedades hepáticas que sean mínimamente invasivos para el paciente y que puedan administrarse fácilmente y económicamente a todos los pacientes con sospecha de tener una enfermedad hepática. Además, existe una necesidad de pruebas de diagnóstico que puedan detectar la presencia de la enfermedad en sus etapas incipientes o tempranas para facilitar un tratamiento profiláctico eficaz del paciente.

Resumen de la invención

La presente invención presenta métodos para diagnosticar patologías del hígado o del sistema biliar de acuerdo con las reivindicaciones. En general, los métodos comprenden obtener una muestra de prueba tal como un fluido biológico de un sujeto con sospechosa de tener una patología del hígado o del sistema biliar, poner en contacto una proteína del fluido biológico con una lectina de unión a fucosa, en donde dicha proteína es IgG, permitir que dicha lectina se una a dicha proteína, detectar cuantificablemente la lectina unida en la muestra para obtener un valor de lectina unida, y después comparar el valor detectado de lectina unida con valores de referencia para la unión de lectina de tales proteínas. Los valores de referencia se establecen a partir de sujetos sin patología hepática o del sistema biliar y de sujetos con patologías hepáticas conocidas. Pueden compararse ya sea uno o ambos valores de referencia con los niveles de valores detectados de lectina unida, y la comparación revelará la presencia o ausencia de la patología del hígado o del sistema biliar. El valor detectado de lectina unida, en relación con el valor de referencia, es indicativo de la presencia o ausencia de la patología hepática. Un valor detectado de lectina que muestra una desviación significativa del valor de referencia es indicativo de la presencia de patología hepática cuando el valor de referencia es de un paciente sano. Un valor detectado de lectina que muestra una desviación significativa de un valor de referencia obtenido de un paciente con patología hepática es indicativo de la ausencia de patología hepática.

Los métodos inventivos pueden aplicarse para detectar cualquier patología hepática seleccionada de carcinoma hepatocelular, cirrosis, fibrosis o combinaciones de estos. Los ejemplos de proteínas que se han identificado incluyen hemopexina, HBsAg, partícula viral de hepatitis B, alfa-1-antiquimotripsina, alfa-1-antiquimotripsina His-Proless, ceruloplasmina, alfa-2-macroglobulina, alfa-2-HS-glicoproteína, haptoglobina, precursor de la cadena gamma del fibrinógeno, inmunoglobulina (incluidas IgG, IgA, IgM, IgD, IgE y similares), APO-D, cininógeno, glicoproteína rica en histidina, precursor del factor 1 del complemento, cadena pesada del factor I del complemento, cadena ligera del factor I del complemento, C1s del complemento, precursor del factor B del complemento, fragmento Ba del factor B del complemento, fragmento Bb del factor B del complemento, precursor de C3 del complemento, cadena beta de C3 del complemento, cadena alfa de C3 del complemento, anafilatoxina C3a, cadena alfa de C3b del complemento, fragmento de C3c del complemento, fragmento de C3dg del complemento, fragmento de C3g del complemento, fragmento de C3 del complemento, fragmento de C3f del complemento, C5 del complemento, cadena beta de C5 del complemento, cadena alfa de C5 del complemento, anafilatoxina C5a, cadena alfa de C5 del complemento, C7 del complemento, alfa-1-B glicoproteína, B-2-glicoproteína, proteína de unión a vitamina D, cadena pesada H2 del inhibidor de inter-alfa-tripsina, alfa-1B-glicoproteína, precursor de angiotensinógeno, angiotensina-1, angiotensina-2, angiotensina-3, proteína GARP, beta-2-glicoproteína, clusterina (Apo J), glicoproteína precursora integrina alfa-8, cadena pesada de integrina alfa-8, cadena ligera de integrina alfa-8, partícula viral de hepatitis C y precursor de la proteína 32 que contiene repeticiones ricas en leucina.

La detección puede realizarse mediante cualquier ensayo adecuado en la técnica. El reactivo de detección puede marcar directamente los restos glicosilo, por ejemplo, a través de productos químicos o colorantes específicos de carbohidratos, o a través de lectinas marcadas, proteínas marcadas de unión a carbohidratos o anticuerpos marcados. El reactivo de detección puede ser un reactivo secundario, por ejemplo, al capturar primero el analito diana y después poner en contacto el complejo reactivo de captura-diana con un reactivo secundario marcado. La invención también presenta nuevos métodos para detectar proteínas glicosiladas en una muestra. Tales métodos comprenden poner en contacto una muestra con una lectina y detectar el complejo de lectina-proteína glicosilada. Las proteínas glicosiladas pueden ser proteínas fucosiladas. La lectina puede acoplarse directamente a un resto detectable, o la detección puede realizarse a través de un reactivo secundario que se une específicamente a la lectina, tal como un anticuerpo anti-lectina. Los métodos pueden comprender primero poner en contacto la muestra con un anticuerpo para capturar proteínas glicosiladas diana en la muestra, por ejemplo, un anticuerpo específico para las glicoproteínas ejemplificadas en la presente descripción.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un ejemplo de glicoformas. Normalmente, las células hepáticas producen glicoproteínas que contienen la estructura de carbohidratos mostrada en el panel A. Esto se denomina un glicano biantenario (A2G2). En el HCC, las células hepáticas unen un residuo de fucosa a la cadena de glicano, lo que da como resultado una glicoproteína fucosilada (glicoforma, denominada con el prefijo Fe). El examen de todas las proteínas que tienen una cadena de carbohidratos específica se denomina glicoproteómica dirigida. Las abreviaturas en la figura son las siguientes: N-acetilglucosamina (GlcNAc); manosa (Man); galactosa; (Gal); ácido siálico (NeuNAc); Fucosa (Fuc). La Figura 2 muestra el nivel del glicano FcA2G2 en las personas en función del tiempo. (A) El nivel de la estructura FcA2G2 en un paciente ya sea antes (panel superior) o después (panel inferior) del diagnóstico del cáncer. Como muestra esta figura, el nivel de la estructura FcA2G2 aumenta desde el 7,23 % de la fracción total de glicanos hasta más del 13 % de la fracción total de glicanos después del diagnóstico del cáncer. (B) Niveles de la estructura FcA2G2 en 8 individuos ya sea antes o después del diagnóstico de cáncer. En el gráfico, el eje Y es el porcentaje de la estructura FcA2G2 en cada individuo como una función del glicano total liberado. El eje X es el número de muestra.

La Figura 3 muestra el diseño de ELISA de lectina utilizado para Fc-AFP y Fc-Cininógeno. Se usó un anticuerpo oxidado con peryodato como el anticuerpo de captura y el nivel de proteína fucosilada se determinó a través de una lectina conjugada con fosfatasa alcalina (LcH) con el uso de un sustrato colorimétrico (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitroazul tetrazolio (BCIP/NBT)). La Figura 4 muestra un análisis de lectina de inmunoglobulinas humanas en pacientes con diversos grados de enfermedad hepática. Los ELISA de lectina se realizaron como se describe en la figura 3 y los ejemplos, excepto que se usó la lectina AAL (lectina de Aleuria aurantia). En el ensayo se usaron 5 Ill de suero humano. Esta figura muestra un aumento en el nivel de inmunoglobulina fucosilada con aumento de la fibrosis. Las diferencias entre el grupo cirrótico y los grupos sanos en etapa 1 y 2 son estadísticamente significativas con una p<0,001 según se determinó por la prueba t de Student.

Descripción detallada de modalidades ilustrativas

Se usan varios términos relacionados con los métodos y otros aspectos de la presente invención a lo largo de la descripción y las reivindicaciones. A tales términos se les debe dar su significado habitual en la técnica a menos que se indique lo contrario. Otros términos definidos específicamente deben interpretarse de manera coherente con la definición proporcionada en la presente descripción.

Definiciones:

Las siguientes abreviaturas pueden usarse en la descripción y ejemplos: VHA, virus de la hepatitis A; VHB, virus de la hepatitis B; VHC, virus de la hepatitis C, VHD, virus de la hepatitis D; VHE, virus de la hepatitis E; VHF, virus de la hepatitis F; VHG, virus de la hepatitis G; AFP, alfa-fetoproteína; HCC, carcinoma hepatocelular; HPLC, cromatografía líquida de alta resolución; Fe, fucosilado.

Como se usa en esta descripción y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una combinación de dos o más células y similares.

"Patología" significa cualquier afección que sea una desviación del estado normal o sano.

El término "sistema biliar" se refiere a los órganos y al sistema de conductos que crean, transportan, almacenan y liberan bilis en el intestino delgado. El término abarca el hígado, la vesícula biliar y los conductos biliares: el conducto cístico, conducto hepático, conducto hepático común, conducto biliar común y conducto pancreático. Abundan las enfermedades y patologías del hígado o del sistema biliar. Los ejemplos no limitantes de enfermedades hepáticas o biliares incluyen síndrome de Alagille, enfermedad hepática alcohólica, deficiencia de alfa-1-antitirpsina, hepatitis autoinmunitaria, síndrome de Budd-Chiari, atresia biliar, enfermedad de Byler, enfermedad de Caroli, colangiocarcinoma, síndrome de Crigler-Najjar, hepatitis inducida por fármacos o alcohol, síndrome de Dubin-Johnson, hígado graso/esteatosis, síndrome de Gilbert, hemangioma, hemocromatosis, virus de la hepatitis A, B, C, D, E y G, carcinoma hepatocelular, hiperbilirrubinemia, cirrosis biliar primaria, protoporfiria, síndrome de Rotor, colangitis esclerosante y enfermedad de Wilson.

Una patología hepática común es la cirrosis. La cirrosis del hígado se caracteriza, entre otras cosas, por la formación generalizada de nódulos en el hígado, fibrosis extensa, necrosis de hepatocitos, colapso de la red de reticulina de soporte, depósito extenso de tejido conectivo, flujo sanguíneo disminuido a través del hígado, secreción disminuida de bilirrubina, ictericia y la alteración de las funciones bioquímicas hepáticas normales. Existen múltiples etiologías para la cirrosis hepática. Las causas más comunes incluyen daño al hígado por ingestión de alcohol, fármacos o toxinas, especialmente como en el caso de la enfermedad hepática alcohólica. La cirrosis también puede ser inducida por virus, por ejemplo, por diferentes cepas del virus de la hepatitis, hereditarias (por ejemplo, enfermedad de Wilson y hemocromatosis), inducida por enfermedad crónica o alteración de los conductos biliares, por infecciones parasitarias (por ejemplo, esquistosomiasis), por absorción excesiva de hierro, por autoinmunidad (por ejemplo, cirrosis biliar primaria) o por inflamación del hígado resultante de la enfermedad del hígado graso, entre otras.

"Hepatitis" se refiere a cualquier inflamación clínicamente significativa del hígado o del sistema biliar, independientemente de la etiología. "Hepatitis aguda" se refiere a cualquier inflamación hepática de corta duración (menos de seis meses) o en etapa inicial, tales como las etapas iniciales de la infección por el virus de la hepatitis. "Hepatitis crónica" se refiere a cualquier inflamación del hígado que persiste seis meses o más. "Hepatitis infecciosa" se refiere a cualquier inflamación del hígado que puede transmitirse a otros. Típicamente, la hepatitis infecciosa es provocada por un microorganismo tal como un virus (por ejemplo, VHA, VHB, VHC, VHD, VHE, VHF, VHG, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus del herpes simple (VHS) y virus de la varicela-zoster, etc.), bacterias, protozoos o levaduras. "Hepatitis no infecciosa" se refiere a cualquier inflamación del hígado que no puede transmitirse a otros, tales como hepatitis alcohólica, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis inducida por tóxicos/fármacos y hepatitis granulomatosa, y similares.

"Etiología" significa la causa u origen de una enfermedad, trastorno o patología.

"Anticuerpos" como se usa en la presente descripción incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla y humanizados, así como también fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab') z y Fv), incluidos los productos de un Fab u otra biblioteca de expresión de inmunoglobulinas. Con respecto a los anticuerpos, el término "inmunológicamente específico" o "específico" se refiere a anticuerpos que se unen a uno o más epítopos de una proteína de interés, pero que no reconocen sustancialmente ni se unen a otras moléculas en una muestra que contiene una población mixta de moléculas biológicas antigénicas. Los ensayos de tamizaje para determinar la especificidad de unión de un anticuerpo son bien conocidos y se ponen en práctica de forma rutinaria en la técnica. Para un análisis completo de tales ensayos, ver Harlow y otros, (Eds.), ANTIBODIES A LABORATORY MANUAL; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), Capítulo 6.

"Polipéptido" se refiere a cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isósteros peptídicos. "Polipéptido" se refiere tanto a cadenas cortas, comúnmente denominadas péptidos, oligopéptidos u oligómeros, como a cadenas más largas, generalmente denominadas proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los "polipéptidos" incluyen secuencias de aminoácidos modificadas ya sea por procesos naturales, tal como procesamiento postraduccional, o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Tales modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como también en una voluminosa bibliografía de investigación. Las modificaciones pueden producirse en cualquier lugar de un polipéptido, incluida la cadena principal del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo terminal. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en grados variables en varios sitios de un polipéptido dado. Además, un polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados como resultado de la ubiquitinación y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos postraduccionales naturales o pueden prepararse mediante métodos sintéticos.

"Modificación postraduccional" se refiere a cualquier modificación química de un polipéptido después de que se produce. Comúnmente, una modificación postraduccional implica unir al menos un resto a la cadena polipeptídica, sin embargo, la modificación postraduccional puede ser la escisión de la cadena polipeptídica, el procesamiento proteolítico, la formación de enlaces disulfuro y similares. Los ejemplos no limitantes de modificaciones postraduccionales incluyen glicosilación, fosforilación, acilación, acetilación, metilación, sulfonación, prenilación, isoprenilación, ubiquitinación, biotinilación, formilación, citrulinación, miristolación, ribosilación, sumoilación, gamma carboxilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, oxidación, procesamiento proteolítico, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos mediada por ARN de transferencia a proteínas tales como arginilación, y similares. Ver, por ejemplo, Proteins - Structure and Molecular Properties, 2a Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nueva York, 1993 y Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, págs. 1-12 en Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, 1983; Seifter y otros, (1990) Analysis for Protein Modifications and Nonprotein Cofactors, Methods Enzymol. 182:626-46 y Rattan y otros, (1992) Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. NY Acad. Sci. 663:48-62.

Como se usa en la presente descripción, "glicosilación" se refiere a la unión química de al menos un resto de sacárido a una molécula tal como un polipéptido. La glicosilación puede ser por enlace a n por enlace a o.

"Fucosilación" se refiere a la unión química de al menos un resto de fucosa a una molécula tal como una proteína. Un polipéptido "fucosilado" es un polipéptido con al menos un resto de fucosa unido.

"Glicosilación del núcleo" se refiere a la adición de restos de glicosilo al núcleo N-acetilglucosamina. "Fucosilación del núcleo" se refiere a la adición de un residuo de fucosa al núcleo N-acetilglucosamina. Todas las estructuras de glicanos unidas a N tienen una estructura común, denominada núcleo, que contiene tres residuos de manosa y dos de N-acetilglucosamina.

Una "glicoforma" se refiere a un grupo de proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos idéntica pero que tienen diferentes restos de carbohidratos.

Se ha descubierto de acuerdo con la presente invención que existe una correlación con la incidencia de enfermedad hepática tal como carcinoma hepatocelular y cirrosis y un aumento en el nivel de fucosilación del núcleo. El análisis del proteoma sérico de pacientes con enfermedad hepática reveló más de cincuenta glicoproteínas que demuestran un aumento de la fucosilación en relación con los controles sanos, lo que revela que el aumento de la fucosilación de las proteínas es indicativo del estado de la enfermedad hepática. En consecuencia, en un aspecto, la invención presenta métodos de acuerdo con las reivindicaciones para diagnosticar una patología del hígado o del sistema biliar en un paciente con sospecha de tener una patología hepática o del sistema biliar. Tales métodos comprenden obtener una muestra de prueba de un paciente con sospecha de tener una patología del hígado, poner en contacto una proteína en o de un fluido biológico de dicho sujeto con una lectina de unión a fucosa, en donde dicha proteína es IgG, permitir que dicha lectina se una a dicha proteína y detectar cuantificablemente la lectina unida en la muestra de ensayo para obtener un valor detectado de lectina unida, en donde los niveles modulados de la lectina unida con respecto a los valores de referencia para la unión de lectina indican la presencia o ausencia de una patología del hígado.

Puede obtenerse una muestra de prueba de cualquier lugar en un paciente en el que es probable que se encuentren proteínas modificadas postraduccionalmente indicativas de una afección del hígado. Por ejemplo, puede obtenerse una muestra de prueba a partir de fluidos biológicos tales como lágrimas, saliva, mucosidad, sangre total, suero, plasma, orina, bilis y similares. También podría obtenerse una muestra de prueba a partir de células o tejidos específicos, o de cualquier secreción o exudado. Por ejemplo, una biopsia de células o tejidos del hígado o del sistema biliar puede servir como muestra de prueba. Preferentemente, la muestra de prueba se obtiene de sangre periférica.

En una modalidad preferida, la detección de la modificación postraduccional puede llevarse a cabo al detectar un complejo polipéptido-resto. En otra modalidad preferida, la detección de la modificación postraduccional puede llevarse a cabo al separar el polipéptido y el resto, y al detectar el resto.

La detección del complejo polipéptido-resto puede llevarse a cabo con el uso de un reactivo que reconoce específicamente el resto, la clase particular de resto o el resto como un complejo con el polipéptido. Los reactivos de detección adecuados resultarán evidentes para los expertos en la técnica, cuyos ejemplos no limitantes se describen más adelante. El reactivo puede comprender múltiples moléculas donde cada una tiene especificidad para un resto diana diferente, lo que da como resultado múltiples interacciones reactivo-diana.

Pueden usarse anticuerpos como el reactivo. En la presente invención puede usarse cualquier anticuerpo que se une específicamente al resto diana de interés. Pueden usarse anticuerpos monoclonales y/o policlonales, de cualquier fuente producida, al igual que anticuerpos recombinantes tales como anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos presentados en fagos, así como también anticuerpos quiméricos y humanizados. También pueden usarse fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno tales como el Fab o Fv.

En algunas modalidades, los anticuerpos reconocen específicamente glicoproteínas. Preferentemente, los anticuerpos reconocen específicamente restos de carbohidratos, incluidos mono y polisacáridos. Con mayor preferencia, los anticuerpos reconocen específicamente restos de fucosa. Se han descrito anticuerpos que pueden reconocer específicamente la fucosa. Ver, por ejemplo, Roy SS y otros, (2002) Ann. Bot. 89:293-9; y Srilcfishna G y otros, (1998) Glycobiology 8:799-811. Como alternativa, también pueden generarse anticuerpos contra varios restos, incluida fucosa, y usarlos en la invención. Los métodos para generar y purificar anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Además, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante varias técnicas que se conocen en la técnica, incluida la técnica desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497.

También pueden usarse como el reactivo en la presente invención otras proteínas que tienen dominios de reconocimiento de carbohidratos. Se han descrito proteínas que tienen dominios de reconocimiento de carbohidratos, ver, por ejemplo, Bouyain S y otros, (2002) J. Bioi. Chem. 277:22566-72 (proteína CG2958 de Drosophila melanogaster que reconoce la fucosa).

En modalidades particularmente preferidas, se usan lectinas como el reactivo. Las lectinas pueden obtenerse de cualquier organismo, incluidas plantas, animales, levaduras, bacterias, protozoos y similares. Las lectinas purificadas están disponibles comercialmente, ver, por ejemplo, el catálogo Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Las lectinas también pueden aislarse de su fuente de origen natural, o expresarse y purificarse de forma recombinante, por medios que son bien conocidos por los expertos en la técnica. La lectina puede, pero no necesita ser específica para un resto de carbohidrato particular. Se han descrito lectinas específicas de fucosa. Ver, por ejemplo, Mansour MH y otros, (2005) Immunobiology. 210:335-48; Amano K y otros, (2003) Biosci. Biotechnol. Biochem. 67:2277-9; Loris R y otros, (2003) J. Mol. Biol. 331:861-70; e, Ishida H y otros, (2002) Biosci. Biotechnol. Biochem. 66:1002-8. Se contempla que las lectinas identificadas en el futuro sean adecuadas para su uso en la presente invención.

Las proteínas con dominios similares a lectina también son adecuadas para su uso en la presente invención. Se conocen en la técnica proteínas con dominios similares a lectina. Ver, por ejemplo, Drickamer K (1999) Curr. Opin. Struct. Bioi. 9:585-90.

También pueden usarse alternativas a las lectinas basadas en ácidos nucleicos. Tales reactivos, denominados aptámeros, aprovechan la enorme flexibilidad conformacional de los ácidos nucleicos monocatenarios. A partir de grandes grupos de ácidos nucleicos cortos aleatorizados, se han aislado mediante selección iterativa moléculas individuales con altas afinidades por numerosos ligandos que no son de ácido nucleico. Las ventajas de los reactivos "lectámeros" de unión a glicanos son que es poco probable que los ADN lixiviados confundan o interfieran con los análisis posteriores. Los lectámeros pueden funcionar en condiciones de unión uniformes (pH, fuerza iónica). Los ácidos nucleicos sintéticos pueden prepararse en diversas formas derivatizadas (por ejemplo, biotiniladas por los extremos). Los glicanos diana no están limitados por las especificidades de lectina existentes, lo que amplía sustancialmente las capacidades analíticas y de fraccionamiento existentes.

Cualquier polipéptido sobre el que se modulan las modificaciones postraduccionales tras el inicio o la progresión de una patología del hígado puede usarse en los ensayos de diagnóstico de la invención. Los ejemplos no limitantes de tales polipéptidos que se han caracterizado hasta ahora incluyen GP-73, hemopexina, HBsAg, partícula viral de hepatitis B, alfa-glicoproteína ácida, alfa-1-antiquimotripsina, alfa-1-antiquimotripsina His-Pro-less, alfa-1-antitripsina, serotransferrina, ceruloplasmina, alfa-2-macroglobulina, alfa-2-HS-glicoproteína, alfa-fetoproteína, haptoglobina, precursor de la cadena gamma del fibrinógeno, inmunoglobulina (incluidas IgG, IgA, IgM, IgD, IgE y similares), APO-D, cininógeno, glicoproteína rica en histidina, precursor del factor 1 del complemento, cadena pesada del factor I del complemento, cadena ligera del factor I del complemento, Cls del complemento, precursor del factor B del complemento, fragmento Ba del factor B del complemento, fragmento Bb del factor B del complemento, precursor C3 del complemento, cadena beta de C3 del complemento, cadena alfa de C3 del complemento, anafilatoxina C3a, cadena alfa de C3b del complemento, fragmento de C3c del complemento, fragmento de C3dg del complemento, fragmento de C3g del complemento, fragmento de C3d del complemento, fragmento de C3f del complemento, CS del complemento, cadena beta de CS del complemento, cadena alfa de CS del complemento, anafilatoxina CSa, cadena alfa de CS del complemento, C7 del complemento, alfa-1-B glicoproteína, B-2-glicoproteína, proteína de unión a vitamina D, cadena pesada H2 del inhibidor de inter-alfa-tripsina, alfa-1B-glicoproteína, precursor de angiotensinógeno, angiotensina-I, angiotensina-2, angiotensina-3, proteína GARP, beta-2-glicoproteína, clusterina (Apo J), glicoproteína precursora integrina alfa-8, cadena pesada de integrina alfa-8, cadena ligera de integrina alfa-8, partícula viral de hepatitis C, elf-5, cininógeno, homólogo de HSP33, lisil endopeptidasa y precursor de la proteína 32 que contiene repeticiones ricas en leucina. Se contempla que en los métodos de la invención puedan usarse proteínas adicionales modificadas postraduccionalmente que estén correlacionadas con una patología hepática.

El reactivo puede marcarse directamente con un resto detectable. Como alternativa, se usa un reactivo secundario que reconoce específicamente el reactivo primario, que se marca con un resto detectable. El reactivo secundario puede ser cualquier molécula y preferentemente es un anticuerpo. El reactivo secundario se marca con un resto detectable. Los restos detectables contemplados para su uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, radioisótopos, colorantes fluorescentes tales como fluoresceína, ficoeritrina, Cy-3, Cy5, aloficocianina, DAPI, rojo Texas, rodamina, verde Oregón, amarillo lucifer y similares, proteína fluorescente verde, proteína fluorescente roja, proteína fluorescente cian, proteína fluorescente amarilla, proteína fluorescente naranja de Cerianthus, fosfatasa alcalina, P-lactamasa, cloranfenicol acetiltransferasa, adenosina desaminasa, aminoglicósido fosfotransferasa (neor, G418) dihidrofolato reductasa, higromicina-B-fosfotransferasa, timidina cinasa, lacZ (que codifica a-galactosidasa) y xantina guanina fosforribosiltransferasa, Beta-glucuronidasa, fosfatasa alcalina placentaria, fosfatasa alcalina embrionaria secretada o luciferasa de luciérnaga o bacteriana. Las etiquetas enzimáticas se usan con su sustrato afín. Al igual que con otros procedimientos estándar asociados con la práctica de la invención, los expertos en la técnica conocerán los marcadores adicionales que pueden usarse. En algunas modalidades, el reactivo o reactivo secundario se acopla a biotina y se pone en contacto con avidina o estreptavidina que tiene una etiqueta de resto detectable.

En algunas modalidades, el resto unido al polipéptido mediante modificación postraduccional puede marcarse y detectarse directamente, obviando de este modo la necesidad de un reactivo marcado que reconozca específicamente un resto particular, así como también cualquier necesidad de un reactivo secundario marcado. En algunas modalidades, el resto unido al polipéptido mediante modificación postraduccional puede separarse del polipéptido y marcarse y detectarse directamente. Por ejemplo, y no a modo de limitación, los carbohidratos y los restos de carbohidratos pueden marcarse directamente con el uso de diversos métodos que se conocen en la técnica. Los kits de marcaje de carbohidratos y restos de carbohidratos están disponibles comercialmente. Los carbohidratos y restos de carbohidratos también pueden biotinilarse y marcarse con restos detectables conjugados a avidina o estreptavidina, tales como los descritos en la presente descripción. Los ejemplos no limitantes de reactivos que pueden marcar directamente oligosacáridos incluyen 2-aminobenzamida y ácido 2-aminobenzoico.

Los restos unidos postraduccionalmente pueden separarse de un polipéptido por cualquier medio adecuado en la técnica, incluido químicamente, por ejemplo, mediante el tratamiento con hidrazina o ácidos tales como ácido fluorhídrico o ácido trifluorometanosulfónico, enzimáticamente, por ejemplo, mediante el tratamiento con N-glicosidasa tal como PNGasa F, 0-glicosidasa, endoglicosidasas o exoglicosidasas, o por medios físicos. Los kits disponibles comercialmente están disponibles para eliminar modificaciones postraduccionales, incluida la desglicosilación. Las bases químicas tal como la hidrazina o los reactivos químicos que conducen a reacciones de eliminación beta también pueden usarse en las reacciones de desglicosilación. Los expertos en la técnica apreciarán otras técnicas y reactivos, y se contempla que estén dentro del alcance de la presente invención.

En algunas modalidades, los restos separados se purifican antes del mareaje o detección de tb. Pueden usarse técnicas de extracción en fase sólida o líquida, que se conocen en la técnica, para purificar los restos separados para análisis adicionales.

Los valores de referencia pueden ser los establecidos para una patología hepática particular, o los establecidos para sujetos sanos, o ambos. Además, la presente invención contempla que el tamizaje de muestras de prueba con el uso de los métodos de la invención revelará proteínas modificadas postraduccionalmente adicionales y el tipo y nivel particular de modificación postraduccional de dichas proteínas, que se correlacionan con el estado de enfermedad o el estado sano. Con el uso de esta información, estas proteínas identificadas pueden servir como valores de referencia adicionales con los que pueden compararse las muestras de prueba.

Puede usarse una variedad de formatos de ensayo para llevar a cabo los métodos de la invención y para detectar cuantitativamente modificaciones postraduccionales de proteínas. Los inmunoensayos son un ensayo preferido e incluyen, pero no se limitan a, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos de competencia, transferencia Western, ensayos de aglomeración de perlas, inmunoensayos de flujo lateral, tiras reactivas inmunocromatográficas, tiras de diagnóstico, inmunoensayos de formato migratorio y similares. Los expertos en la técnica conocerán otros inmunoensayos adecuados. También puede usarse microscopía. En algunas modalidades, la cromatografía es el ensayo preferido. Se prefiere particularmente la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). En algunas modalidades, la espectroscopia de masas es el ensayo preferido. En algunas modalidades, como el ensayo se usa electroforesis en gel acoplada con densitometría.

El formato general de los ensayos implica poner en contacto el reactivo con una muestra de prueba que contiene los analitos de interés, a saber, las proteínas modificadas postraduccionalmente, que pueden distinguirse de otros componentes encontrados en la muestra. Después de la interacción del analito con el reactivo, el sistema puede lavarse y después detectarse directamente o detectarse por medio de un reactivo secundario como se ejemplifica en la presente descripción.

En algunas modalidades preferidas, el reactivo se inmoviliza sobre un soporte sólido. En otras modalidades preferidas, la muestra de prueba, o las moléculas separadas o purificadas de la muestra de prueba, tales como polipéptidos modificados postraduccionalmente, se inmovilizan sobre un soporte sólido. Las técnicas para la purificación de biomoléculas a partir de muestras tales como células, tejidos o fluidos biológicos son bien conocidas en la técnica. La técnica elegida puede variar con el tejido o la muestra que se examina, pero está dentro de experiencia en la técnica hacer coincidir el procedimiento de purificación apropiado con la fuente de la muestra de prueba.

Los ejemplos de soportes sólidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, vidrio, plástico, metal, látex, caucho, cerámica, polímeros tales como polipropileno, difluoruro de polivinilideno, polietileno, poliestireno y poliacrilamida, dextrano, celulosa, nitrocelulosa, pvdf, nailon, amilasa y similares. Un soporte sólido puede ser plano, cóncavo o convexo, esférico, cilíndrico y similares, y puede ser partículas, perlas, membranas, hebras, precipitados, geles, láminas, recipientes, pocillos, capilares, películas, placas, portaobjetos y similares. El soporte sólido puede ser magnético o una columna.

Como las diversas modificaciones postraduccionales asociadas con la presencia de una patología hepática identificadas hasta la fecha pueden estar presentes en niveles detectables en sujetos normales (aquellos sin una patología hepática), puede ser necesario medir cuantitativamente los niveles de cada marcador que se analiza en el ensayo de diagnóstico. En tales casos, la modulación de los niveles de las modificaciones en relación con los estándares/controles será indicativa de la presencia de una patología hepática. Los niveles de expresión normales de las diversas modificaciones pueden determinarse empíricamente de acuerdo cualquiera de las diversas técnicas que se conocen en la técnica. Los niveles de expresión normales pueden servir como un patrón frente al cual pueden compararse los niveles de expresión en pacientes con sospecha de una patología hepática. Una desviación significativa (positiva o negativa) sobre los niveles de expresión normales esperados de modificaciones asociadas a la patología hepática es indicativa de la presencia de una patología hepática en el paciente. De manera similar, los niveles de expresión observados en pacientes con patología hepática confirmada también pueden servir como un estándar contra el cual pueden compararse los niveles de expresión en pacientes con sospecha de patología hepática. Niveles de expresión similares de los marcadores asociados a patología hepática entre el paciente conocido y el paciente con sospecha son indicativos de la presencia de una patología en el paciente. En tales casos, se espera que el nivel de expresión de las modificaciones en las muestras tanto conocidas como sospechosas se desvíe significativamente del nivel de expresión presente en sujetos sanos.

Los presentes métodos tienen aplicabilidad para diagnosticar una patología hepática en cualquier animal. Preferentemente, los métodos se utilizan en mamíferos tales como perros, gatos, caballos, vacas, cerdos, conejos, burros, ovejas, ratones y ratas. Con la máxima preferencia, los métodos se utilizan en seres humanos.

También se presentan en la presente invención dispositivos para diagnosticar una patología del hígado o del sistema biliar en un paciente con sospecha de tener una patología del hígado. Los dispositivos comprenden un reactivo específico para un resto unido postraduccionalmente asociado con la presencia de una patología hepática, que preferentemente está acoplado a un soporte sólido. Los dispositivos pueden usarse en cualquier ensayo, en particular los descritos y ejemplificados en la presente descripción, en donde el ensayo puede detectar cuantificablemente la presencia del resto asociado con una patología hepática, y en donde los niveles modulados de la expresión del resto en relación con un estándar indican la presencia de una patología del hígado.

Los reactivos para su uso en los dispositivos pueden comprender una sola molécula que puede formar un complejo con una única diana, o múltiples dianas, por ejemplo, una proteína de fusión multimérica con múltiples sitios de unión para diferentes dianas. El reactivo puede comprender múltiples moléculas donde cada una tiene especificidad para una diana diferente. En modalidades preferidas, el reactivo está compuesto por proteínas. En algunas modalidades preferidas, el reactivo es de anticuerpos y puede usarse cualquier anticuerpo que se une específicamente al marcador diana de interés en los dispositivos. En algunas modalidades preferidas, el reactivo está compuesto por dominios de reconocimiento de carbohidratos. En modalidades muy preferidas, el reactivo está compuesto por lectinas o proteínas con dominios de lectina, como se ejemplifica en la presente descripción.

El soporte sólido al que se acopla el reactivo puede ser cualquier soporte sólido descrito en la presente descripción. El reactivo puede inmovilizarse sobre el soporte sólido por cualquier medio adecuado en la técnica, tal como adsorción, interacciones no covalentes tales como interacciones hidrófobas, interacciones hidrófilas, interacciones de van der Waals, enlaces de hidrógeno e interacciones iónicas, interacciones electrostáticas, enlaces covalentes o con el uso de un agente de acoplamiento. Los agentes de acoplamiento incluyen glutaraldehído, formaldehído, diisocianato de hexametileno, diisotiocianato de hexametileno, N,N'-polimetilen bisiodoacetamida, N,N'-etilen bismaleimida, succinato de etilenglicol bisuccinimidilo, bisdiazobencidina, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida, 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidilo (SPDP), 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de N-succinimidilo (SMCC), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de N-sulfosuccinimidilo, (4-yodoacetil)-aminobenzoato de N-succinimidilo, 4-(1-maleimidofenil)butirato de N-succinimidilo, N-(épsilon-maleimidocaproiloxi)succinimida (EMCS), iminotiolano, anhídrido S-acetilpropilmercaptosuccínico, metil-3-(4'-ditiopiridil)propionimidato, metil-4-mercaptobutirlimidato, metil-3-mercaptopropionimidato, N-succinimidil-8-acetilmercaptoacetato, avidina, estreptavidina, biotina, proteína A de Staphylococcous aureus y similares.

Los sitios en el soporte sólido no acoplados con el reactivo de captura pueden bloquearse para evitar la unión no específica de moléculas marcadoras al soporte sólido. Los reactivos y procedimientos de bloqueo son bien conocidos en la técnica.

También se presentan de acuerdo con la presente invención kits para diagnosticar patología del hígado o del sistema biliar. En una modalidad, los kits incluyen un reactivo que interactúa específicamente con restos de glicosilo e instrucciones para usar el kit en un método para diagnosticar patología del hígado. El reactivo puede ser una molécula que marque directamente oligosacáridos tal como 2-aminobenzamida, o puede ser una molécula que esté acoplada a un resto detectable como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, los kits comprenden además un reactivo secundario que reconoce específicamente el reactivo primario, que está marcado con un resto detectable. Los kits también pueden incluir controles positivos y negativos.

En modalidades preferidas, el reactivo está compuesto por anticuerpos, y puede usarse cualquier anticuerpo que se une específicamente al resto de glicosilo de interés en los dispositivos. En modalidades más preferidas, el reactivo está compuesto por proteínas que pueden interactuar específicamente con carbohidratos. En modalidades aún más preferidas, el reactivo está compuesto de lectinas. El resto de glicosilo preferido es fucosa.

En algunas modalidades, los kits incluyen además un soporte sólido para inmovilizar el reactivo o el analito de la muestra de prueba aislada del paciente. El soporte sólido puede ser cualquier soporte sólido descrito en la presente descripción. El kit puede incluir además agentes de acoplamiento para facilitar la inmovilización del reactivo o analito al soporte sólido. En algunas modalidades, el reactivo se proporciona acoplado previamente al soporte sólido.

Los kits pueden contener materiales suficientes para un ensayo o pueden contener materiales suficientes para múltiples ensayos.

También se presentan de acuerdo con la presente invención métodos para detectar proteínas glicosiladas en una muestra. Tales métodos comprenden poner en contacto la muestra con una lectina para formar un complejo entre proteínas glicosiladas en la muestra y la lectina, y después detectar el complejo proteína glicosilada-lectina. En algunas modalidades, los métodos comprenden poner en contacto la muestra con un anticuerpo para capturar proteínas glicosiladas en la muestra. El anticuerpo puede ser específico para una proteína particular, para un resto de glicosilo particular o para un complejo proteína-resto de glicosilo particular. El anticuerpo puede acoplarse a un soporte sólido. A continuación, la muestra puede lavarse y aplicarse la lectina a la muestra lavada. La lectina puede acoplarse a un resto detectable y detectarse directamente, o la lectina puede ponerse en contacto con un reactivo secundario acoplado a un resto detectable, por ejemplo, un anticuerpo anti-lectina, y después detectarse.

Como se apreciará, aspectos de la presente invención encuentran gran utilidad en la evaluación de la presencia o ausencia de patologías hepáticas en humanos. Los expertos en la técnica también verán que la presente invención puede aplicarse a animales, tanto con fines de pronóstico o diagnóstico, para el control de la eficacia terapéutica o de otra manera de maneras análogas a los métodos útiles en seres humanos. Sin embargo, además, pueden usarse aspectos de la presente invención para monitorizar el progreso de los estudios en animales en un entorno de investigación. Por lo tanto, la evaluación de la glicosilación en proteínas circulantes u otras proteínas en ratones, ratas, perros y otros animales puede informar a las personas que realizan investigaciones que implican tales animales del estado patológico del hígado de tales animales. De esta manera, por ejemplo, puede evaluarse la toxicidad de productos farmacéuticos, aditivos, adyuvantes, productos químicos industriales o agrícolas propuestos o existentes o cualquiera de una amplia variedad de productos químicos, especies bioquímicas, contaminantes ambientales o industriales u otros materiales.

Se verá que tal evaluación de la toxicidad es útil, por ejemplo, en ensayos farmacológicos preliminares para presentaciones reglamentarias. Además, la toxicidad de una gran cantidad de especies puede evaluarse de forma directa y conveniente. Además, es bien sabido que muchos productos farmacéuticos existentes, incluidas las estatinas, agentes antineoplásicos y otros, tienen una toxicidad hepática significativa. La toxicidad también es motivo de preocupación cuando se abusa de o se dosifican en exceso fármacos. La presente invención permite la monitorización de tal toxicidad en estas circunstancias para fármacos antes o después de su aprobación o, de hecho, para fármacos ilegales.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para describir la invención con más detalle. Están destinados a ilustrar, no a limitar la invención.

Ejemplo 1

Procedimientos experimentales generales

Análisis de glicanos. El suero se obtuvo de pacientes diagnosticados clínicamente con infección por VHB crónico, y de pacientes diagnosticados clínicamente con HCC, pacientes diagnosticados clínicamente con cirrosis hepática y de sujetos de control sin evidencia de alguna enfermedad hepática. Las muestras de suero se almacenaron a -80 °C hasta su análisis.

Se desnaturalizaron alícuotas de proteína (1 mg/ml) con SDS al 1 %, mercaptoetanol 50 mM durante 10 min a 100 °C. La solución se enfrió y se complementó con NP-40 hasta una concentración de 5,75 %. Se añadió PNGasa F (ProZyme, San Leandro, C^a ) hasta una concentración final de 1 mU(IUB)I, tL, y se añadió a la mezcla un cóctel de inhibidores de proteasa. Después, la solución se incubó durante 24 horas a 37 °C. Los oligosacáridos separados de las proteínas en la muestra se recuperaron y purificaron mediante extracción en fase sólida con el uso de una matriz de grafito porosa (LudgerClean H, Ludger Limited, Oxford, Reino Unido). Los oligosacáridos libres se marcaron con 2-aminobenzamida y se purificaron con el uso de kits disponibles comercialmente (Ludger Limited UK).

Los glicanos marcados con fluorescencia se analizaron posteriormente mediante HPLC con el uso de una columna de fase normal (columna TSK amida 80). La fase móvil consistió en el Solvente A (formiato de amonio 50 mM, pH 4,4) y el Solvente B (acetonitrilo) y el gradiente usado fue el siguiente: gradiente lineal de Solvente A al 20-58 % a 0,4 mL/minuto durante 152 min, seguido de un gradiente lineal de Solvente A al 58-100 % durante los siguientes 3 min. La tasa de flujo se aumentó a 1,0 mL/minuto y la columna se lavó en Solvente A al 100 % durante 5 min. Después de la etapa de lavado, la columna se equilibró en Solvente A al 20 % durante 22 min en preparación para la siguiente corrida de la muestra. El análisis de HPLC se realizó con el uso del sistema de HPLC Waters Alliance, complementado con un detector de fluorescencia de Waters, y se cuantificó con el uso del Millennium Chromatography Manager (Waters Corporation, Milford, MA). Las estructuras de glicanos se identificaron mediante comparación con estándares conocidos y mediante digestión secuencial con exoglicosidasa.

Extracción y análisis de lectina. Las inmunoglobulinas se eliminaron de las muestras (medio y suero) con el uso de una columna de Proteína A/G (Pierce, Rockford, IL) antes de la extracción de lectina. Las muestras se complementaron con una solución de unión a lectina, llevando la concentración final de la muestra a solución salina tamponada con Tris 20 mM (TBS), cloruro de calcio 1 mM, cloruro de magnesio 1 mM y cloruro de manganeso 1 mM (pH 7,0). Las muestras se incubaron durante 16 horas a 4 °C con una serie de lectinas que reconocen fucosa unida a agarosa. Estas lectinas consistían en Lens culinaris (LCH), Pisumsativum sativum (PSA) y Vicia faba (VFA) y reconocen manosas ramificadas con el determinante alfa fucosa (todas adquiridas de los laboratorios BY, San Mateo, CA). La incubación se realizó en un tubo de microcentrífuga antes de la transferencia a una columna Costar 0.45J.! M Spin-X (Corning, Acton, MA). La columna de lectina se lavó minuciosamente con solución de unión a lectina antes de eluir la fracción unida con el uso de los monosacáridos inhibidores apropiados (metil-a-D-glucopiranósido 200 mM, a-metil-D-manopiranósido 200 mM). A las fracciones unidas y no unidas se les intercambió el tampón en TBS con el uso de dispositivos Millipore YM-3 Centricon y se sometieron a análisis de glicanos o 2DE. Los niveles de proteína se controlaron durante todas las extracciones.

Electroforesis en gel bidimensional. Las muestras se diluyeron en tampón (urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS al 4 %, DTT 65 mM, TBP 5 mM y anfolitos al 0,4 %), se agitaron en vórtex periódicamente durante 1 hora y se aplicaron a una tira de IPG 18 em pH3-10NL (Amersham, Piscataway, NJ). La rehidratación del gel se llevó a cabo durante 14 horas a 50 V y se sometió a electroenfoque con el uso del aparato de IEF Protean (BioRadLaboratories Headquarters, Hercules, CA). Después del electroenfoque, las tiras de gel se redujeron en urea 6 M, SDS al 2 %, DTT al 1,5 %, glicerol al 30 % y Tris 50 mM pH 6,8 durante 10 min y se alcalinizaron en urea 6 M, SDS al 2 %, yodoacetamida al 3 %, glicerol al 30 % y Tris 50 mM pH 6,8. La segunda dimensión se resolvió con un gel de gradiente de acrilamida al 8-18 %-PDA al 0,8 % en una celda Protean Ilxi (Bio-Rad) con las condiciones de corrida establecidas a 20 mNgel durante 20 min y 40 mNgel durante 4 h con geles enfriados a 14 °C. Los geles se fijaron (EtOH al 30 %/ácido fosfórico al 5 %) y se tiñeron con una tinción coloidal con azul brillante de Coomassie. Para todas las muestras, los geles se corrieron por cuadruplicado y solo se consideraron significativas las diferencias que fueron consistentes en todos los geles.

Obtención de imágenes del gel y análisis. Se obtuvieron imágenes digitales de los geles con el uso de una cámara CCD enfriada de 16 bits (FluorChem 8000, Alpha Innotech, San Leandro, CA). Los archivos TIFF de las imágenes de gel se analizaron con el uso del paquete de software de obtención de imágenes de gel NonLinear Dynamics Progenesis Workstation (Nonlinear USA Inc., Durham, NC). Las características polipeptídicas en cada imagen de gel se delinearon y después el software determinó la intensidad total de píxeles dentro de cada característica (la intensidad integrada). Las características polipeptídicas se normalizaron con el uso de la intensidad integrada de cada característica y expresándolas como un porcentaje de la suma de intensidades integradas de todo el gel. Espectrometría de masas. Análisis MALDI. Se escindieron las manchas de proteína de los geles teñidos con azul de Coomassie coloidal, se destiñeron y se digirieron con tripsina. Los péptidos recuperados se concentraron y desalaron con el uso de Zip Tip C18 (Millipore, Bedford, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se prepararon para espectrometría de masas MALDI-TOF al mezclar 0,5 IlL de la mezcla de péptidos con 0,511L de 10 mg/mL de ácido alfa-ciano 4-hidroxicinámico, ácido fórmico al 1 % en acetonitrilo al 50 % y al permitir que la gota se seque en la placa MALDI. Los mapas de masas de péptidos se obtuvieron con el uso de un espectrómetro Voyager-DE ProMass (PE Biosystems, Foster City, CA) operado en modo reflectrón de iones positivos. Las proteínas se identificaron a partir de los mapas de masas de péptidos con el uso de la base de datos en línea MASCOT www.matrixscience.com para buscar la base de datos de proteínas no redundantes.

Análisis LC MS/MS. La identificación de péptidos se realizó en un espectrómetro de masas con trampa de iones ThermoFinnigan LCQ (ThennoElectron Corporation, CA) equipado con HPLC microcapilar en línea (Eldex, Napa, CA) y una fuente de ionización de micropulverización que se construyó internamente. ¡La micropulverización consiste en una columna microcapilar, picotip 360 X 75! liD, con una punta integrada de 15! liD (New objective, Woburn MA) autoempaquetada con resina Reliasil C18 (Column Engineering, Ontario, CA) hasta una longitud de 10 em. Se cargó una alícuota de la muestra mediante una bomba de presión en una trampa de muestras capilar (Upchurch, WA) autoempaquetada con C18, después se colocó justo corriente arriba de la columna microcapilar. La HPLC se programa para producir un gradiente de 3 h (B al 5 %-65 %) a 30 !1Limin. Antes de la trampa, se usa la división pasiva del flujo para reducir el flujo a 500 nl/ minuto. El tampón A consiste en acetonitrilo al 5 % ácido acético al 1 %; el tampón B consiste en acetonitrilo al 90 % ácido acético al 1 %. El LCQ se programó para realizar un escaneo completo de 450 a 2000 m/z, seguido de 3 escaneos de MS/MS dependientes de datos configurados para seleccionar las especies de iones más abundantes a partir del escaneo completo.

Análisis e interpretación de los datos. Los datos de espectrometría de masas (espectros) se buscaron en la base de datos humana no redundante con el uso de SeQuest (Thermo Electron Corporation). A continuación, se verificaron manualmente los péptidos que puntuaron por encima del valor umbral de 1,5 XCorr (individual)/ 2,0 XCorr (doble)/ 2,5 XCorr (triple). En todos los casos, los péptidos unidos deben contener la secuencia de glicosilación ligada a N, N-X-S/T que se ha convertido en D-X-S/T por la acción de la enzima PNGasa F. Esto da como resultado una diferencia de masa de 0,9840 Da en comparación con la secuencia glicosilada.

Inmunotransferencia. Se resolvieron volúmenes iguales de suero de pacientes ya sea de suero total (0,5! 1Lilane), no unido a lectina (no unido) o unido a lectina (unido) mediante SDS-PAGE en geles en gradiente de poliacrilamida al 4-20 %. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF mediante inmunotransferencia. Las membranas se bloquearon mediante la incubación con un tampón de bloqueo de TBS IX (Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, cloruro de sodio 150 mM) y leche seca descremada al 5 % y Tween 20 al 0,1 % durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, las transferencias se incubaron durante la noche con el anticuerpo deseado y se desarrolló la señal con el uso de un sistema de detección quimioluminiscente ("ECL Plus", Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL). Las transferencias se visualizaron con el uso de una cámara CCD Alpha Innotech FluorChem con software de densitometría de puntos AlphaEase (Alpha Innotech Corp., San Leandro, CA).

Ejemplo 2

La fucosilación del núcleo aumenta en el carcinoma hepatocelular

Se desarrolló una metodología glicoproteómica dirigida que permite la identificación de biomarcadores glicoproteicos en suero. La metodología identifica primero los cambios en la glicosilación ligada a N que se producen con la enfermedad. Estos cambios actúan como una etiqueta para que puedan extraerse proteínas específicas que contienen esa estructura de glicano. Los experimentos iniciales en un modelo animal revelaron una proteína, GP73, que es más sensible para detectar HCC que los marcadores usados actualmente tal como AFP. En el modelo animal de HCC, el cambio en la glicosilación fue un aumento en la fucosilación del núcleo (Block y otros, 2005). Este cambio también se observó en personas que desarrollaron HCC. En la figura 2 se muestra un ejemplo del aumento de la fucosilación. Este conjunto de muestras consistió en 16 muestras de 8 pacientes en dos puntos de tiempo: antes del desarrollo del cáncer y después del diagnóstico de cáncer. En este caso, todos los pacientes clasificados como antes se diagnosticaron clínicamente con cirrosis. Las muestras clasificadas como después se diagnosticaron clínicamente con CHC mediante ecografía y biopsia. Como muestra esta figura, los pacientes antes del diagnóstico de HCC tienen niveles mucho más bajos del glicano biantenario fucosilado del núcleo (FcA2G2) en comparación con después del diagnóstico de HCC. Por ejemplo, el paciente 121 tenía un 7,23 % del glicano FcA2G2 antes del diagnóstico de HCC y un 13,2 % después del diagnóstico de HCC. Como se ve en la figura 2B, esta tendencia ascendente fue cierta para todos los pacientes examinados. Estos resultados destacan el hecho de que niveles elevados de fucosilación del núcleo a través de enlaces a-1,6 están asociados con el desarrollo de HCC. Esto es cierto en muestras que fueron positivas para AFP (>20 ng/ML) o negativas para AFP. Es decir, como se muestra en la figura 2B, los pacientes 965, 370, 842, 999 y 978 eran todos negativos para AFP, pero tenían niveles aumentados del glicano FcA2G2. Para todos los pacientes examinados hasta ahora, los que son normales, tienen hepatitis activa o cirrosis y tienen un promedio de 8,44 % /- 0,75 (n=19) del glicano fucosilado del núcleo, mientras que los pacientes diagnosticados con HCC tenían un promedio de 12,5 % /- 1,83 (n=17) del glicano fucosilado del núcleo. Esta diferencia fue estadísticamente diferente con un valor de p de 0,001.

Ejemplo 3

Identificación de glicoproteínas fucosiladas en carcinoma hepatocelular

Como el nivel de fucosilación aumentó en pacientes con HCC, era imperativo determinar aquellas proteínas que habían aumentado la fucosilación. Por lo tanto, las glicoproteínas fucosiladas asociadas con sueros de individuos normales agrupados o de individuos positivos a HCC agrupados se extrajeron con el uso de lectinas y el proteoma se analizó ya sea mediante electroforesis en gel bidimensional (2DE) o mediante una metodología simple basada en LC MS/MS. Con el uso de estas metodologías se observó que las glicoproteínas tales como la glicoproteína fucosilada (Fe) a-1-ácida, Fc-ceruloplasmina, Fc-a-2-macroglobulina, Fc-hemopexina, Fc-Apo-D, Fc-HBsAg y Fe-Cininógeno aumentaron en pacientes con HCC, mientras que los niveles de Fc-haptoglobina disminuyeron en esos pacientes (Tabla 1). Curiosamente, también se encontraron varias moléculas de inmunoglobulina (IgG, IgA e IgM) en el proteoma fucosilado de aquellos pacientes con cáncer. Sin embargo, un análisis adicional ha demostrado que estas proteínas se fucosilan principalmente en la cirrosis y no solo en el cáncer (Figura 4).

Tabla 1. Proteínas identificadas como alteradas en acientes con HCC.

Fc-Serotransferrina

Fc-Ceruloplasmina

Fc-alfa-2-macroglobulina

Fc-alfa-2-HS-glucoproteína (Fetuina A)

Fc-Haptoglobina

Fe-Precursor de la cadena gamma de fibrinógeno

Fc-IgG

Fc-IgA

Fc-APO-D

Fc-IgM

Fc-Cininógeno

Fe-Glicoproteína rica en histidina

Fc-Precursor del factor 1 del complemento (incluidos Fc-Cadena pesada del factor I del complemento

Fc-Cadena ligera del factor I del complemento)____________________________________________________ Fc-Componente C1s del Complemento

Fc-Precursor del factor B del complemento (incluidos fragmento Ba del factor B del complemento y Fefragmento Bb del factor B del complemento)

Fc-Precursor de C3 del complemento (incluidos Fc-Cadena beta de C3 del complemento

Fc-Cadena alfa de C3 del complemento

Fc-Anafilatoxina C3a

Fc-Cadena alfa de C3b

del complemento

Fc-Fragmento de C3c del complemento

Fc-Fragmento de C3dg del complemento

Fc-Fragmento de C3g del complemento__________________________________________________________ Fc-Fragmento de C3d del complemento y Fc-Fragmento C3f del complemento)__________________________ Fc-C5 del complemento (incluidos Fc-Cadena beta de C5 del complemento_____________________________ Fc-Cadena alfa de C5 del complemento__________________________________________________________ Fc-Anafilatoxina C5a_________________________________________________________________________ Fc-Cadena alfa de C5 del complemento)_________________________________________________________ Fc-C7 del Complemento______________________________________________________________________ Fc-alfa-1-B glicoproteína______________________________________________________________________ Fc-B-2-glucoproteína (apo H)__________________________________________________________________ Fe-Proteína de unión a vitamina D______________________________________________________________ Fe-Cadena pesada H2 del inhibidor de inter-alfa-tripsina_____________________________________________ Alfa-I B-glicoproteína_________________________________________________________________________ Fc-Precursor de angiotensinógeno______________________________________________________________ Fc-Angiotensina-I___________________________________________________________________________ Fc-Angiotensina-2___________________________________________________________________________ Fc-Angiotensina -3__________________________________________________________________________ Fc-Proteína GARP__________________________________________________________________________ Fc-beta-2-glicoproteína_______________________________________________________________________ Fc-Clusterina (Apo J)________________________________________________________________________ Glicoproteína precursora integrina alfa-8 (incluidos Fc-Cadena pesada de integrina alfa-8 y Fe-Cadena ligera de integrina alfa-8______________________________________________________________________________ Fc-Partícula viral de hepatitis C________________________________________________________________ Fc-Precursor de la proteína 32 que contiene repeticiones ricas en leucina._______________________________

Ejemplo 4

Los niveles de Fc-GP73 y Fc-Hemopexina aumentan en pacientes con carcinoma hepatocelular inducido por hepatitis B

El nivel de Fc-GP73 y Fc-hemopexina se examinó en una pequeña cohorte ciega de pacientes (del colaborador, el Dr. Chau-Ting Yeh, director, Laboratorio central digestivo y equipo de investigación de hepatoma, Unidad de investigación hepática, Chang Gung Memorial Hasp, Taiwán) que contenía un total de 80 pacientes con diversos grados de enfermedad hepática (Tabla 2). El análisis de estas muestras se realizó para el nivel total de GP73, para el nivel de GP-73 fucosilado (Fc-GP73) y para el nivel de hemopexina fucosilada (Fc-hemopexina). La GP73 total se analizó mediante inmunotransferencia con el uso de suero completo. Las especies fucosiladas se analizaron mediante extracción de lectina de 5) ll de suero (LCH) seguido de inmunotransferencia de la fracción fucosilada y formación de imágenes con el uso de una cámara Alpha Innotech FluorChem CCD con software de densitometría de puntos AlphaEase. La sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivos para estos tres marcadores se presentan en la Tabla 3. Como muestra esta figura, con el uso de un valor de corte 5 veces mayor que el suero sano comprado (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), la GP73 total tenía una sensibilidad del 65 % y una especificidad del 90 %, que era muy similar a nuestro estudio ciego más amplio con el uso de este marcador (Marrero y otros, (2005) J. Hepatol. 43:1007-12); 69 % de sensibilidad y 86 % de especificidad). Aún más prometedoras que la GP73 total fueron Fc-GP73 y Fc-hemopexina. Fc-GP73 tenía una sensibilidad del 90 % y una especificidad del 100 % (con el uso de un valor de corte 100 veces mayor que el suero sano comprado (Sigma Chemical Co), mientras que la Fchemopexina tenía una sensibilidad del 95 % y una especificidad del 100 % (con el uso de un valor de corte 20 veces mayor que el suero sano comprado (Sigma Chemical Co.).

Tabla 2. Muestras utilizadas para comparar el valor predictivo de los marcadores en la enfermedad hepática

Tabla 3. Sensibilidad, especificidad y valor predictivo positivo de GP73 total, Fc-GP73 y Fc-hemopexina en los acientes mostrados en la Tabla 2

Ejemplo 5

ELISA de lectina para Fc-AFP y Fc-Cininógeno

El análisis de GP73 fucosilado y hemopexina fucosilada en la Tabla 3 se realizó mediante inmunotransferencia del proteoma fucosilado. Esto requirió la eliminación de inmunoglobulina y la extracción de lectina de cada muestra. Como esto es bastante laborioso, se desarrolló un ELISA de lectina que permita un rendimiento mucho mayor (ver la figura 3). Los experimentos iniciales se centraron en el desarrollo de un ELISA de lectina para Fc-AFP. Se sabe que la AFP está fucosilada y varios informes en la bibliografía estaban disponibles para permitir la comparación (Naitoh y otros, (1999) J. Gastroenterol. Hepatol. 14:436-45). Para el desarrollo del ensayo, se utilizó un conjunto de muestras seleccionadas de 60 pacientes como se describió anteriormente (Marrero y otros, (2005) J. Hepatol. 43:1007-12). 20 pacientes estaban infectados con el VHC, pero de cualquier otra manera se consideraban sanos, 20 pacientes estaban infectados con el VHC y se les diagnosticó cirrosis y 20 pacientes estaban infectados con el VHC y se les diagnosticó HCC. Las muestras en este conjunto se eligieron para incluir a muchos individuos AFP+. Además, se utilizó suero humano (Sigma Chemical Co.) como control con el que se compararon todos los demás grupos de pacientes. Brevemente, se diluyen 50 f!1 de suero humano en 150 f!1 de tampón de unión a lectina (Tris 20 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM y cloruro de MoC12 1 mM, pH 7,0) y se añaden directamente a los tubos de bloqueo heterofílico antes de la adición a las placas durante 2 horas a 37 °C. Posteriormente, las placas se lavaron 10 veces con Tween 20 al 2 % en tampón de unión a lectina antes de añadir la lectina. Se detectaron glicoformas fucosiladas con una lectina de Lens Culinaris o Aleuria aurantia marcada con biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA). La lectina se detectó con el uso de un sistema de estreptavidina marcada con fluoresceína y, posteriormente, las muestras se midieron en el lector de placas de fluorescencia Cytofluor 4000 (MTX Lab Systems, Inc. Vienna, VA) a la longitud de onda apropiada. La intensidad fluorescente relativa de cada muestra se comparó con la observada en el suero normal adquirido. La Tabla 4 muestra los resultados del análisis con Fc-AFP. En este conjunto de muestras, con el uso de un valor de corte 5 veces mayor que el suero sano comprado (Sigma Chemical Co.), Fc-AFP tenía una sensibilidad del 70 %, una especificidad del 90 % y un valor predictivo positivo (VPP) del 91 %. Esto es consistente con lo que se ha informado con Fc-AFP (Naitoh y otros, (1999) J. Gastroenterol. Hepatol. 14:436-45). En este mismo conjunto de muestras, la AFP total tenía una sensibilidad del 70 %, una especificidad del 70 % y un VPP del 77 % (con el uso de un valor de corte de 20 ng/ml). Con el uso del mismo conjunto de muestras, se analizó el Fccininógeno con el uso de la misma metodología que para AFP. En el análisis proteómico se identificó que el Fc-Cininógeno estaba presente en las muestras de cáncer y se utilizó inicialmente ya que el anticuerpo estaba fácilmente disponible. Como muestra la Tabla 4, el Fc-cininógeno tenía una sensibilidad del 80 %, una especificidad del 95 % y un VPP del 95 % (con el uso de un valor de corte 3 veces mayor que el suero sano comprado (Sigma Chemical Co).

Tabla 4. Sensibilidad, especificidad y VPP para AFP total, AFP fucosilada y cininógeno fucosilado según se

Ejemplo 6

Las inmunoglobulinas humanas se fucosilan con el desarrollo de cirrosis

Como se muestra en la Tabla 1, se han identificado más de 50 glicoproteínas que han alterado la glicosilación como una función de una enfermedad hepática. Aunque el aumento de muchas de estas glicoproteínas fucosiladas se correlaciona con el desarrollo de carcinoma hepatocelular (HCC), se encontró que algunas de estas glicoproteínas también se alteran con otras enfermedades hepáticas. Por ejemplo, se observó que las inmunoglobulinas humanas se hiperfucosilan con el desarrollo de cirrosis hepática. Dado que se determinó que la IgG era la principal fuente de proteína fucosilada en el suero de las personas con cirrosis, en el pequeño conjunto inicial de muestras, se razonó que el nivel de IgG fucosilada podría correlacionarse con un diagnóstico de cirrosis. Además, basándose en los resultados mostrados en la Figura 3 y la Tabla 4, parecía que podría desarrollarse un ensayo basado en lectina simple para detectar IgG fucosilada.

Brevemente, se detectó IgG fucosilada al incubar 5 111 de suero con pocillos recubiertos con IgG antihumana de ratón oxidada con peryodato durante 2 horas. Posteriormente se detectó la IgG humana fucosilada mediante incubación con lectina de Aleuria aurantia biotinilada (AAL). La lectina unida se detectó con el uso de ESTREPTAVIDINA conjugada con RDye™ 800 y la intensidad de la señal se midió con el uso del sistema de obtención de imágenes de infrarrojo Odyssey® (LI-COR Biotechnology, Lincoln, Nebraska). En todos los casos, la intensidad de la muestra se comparó con el suero humano adquirido comercialmente (Sigma Chemical Co.).

Con el uso de este ensayo, se determinó la cantidad relativa de IgG fucosilada en más de 200 muestras de suero de pacientes normales o con diversos grados de enfermedad hepática. Además, se examinaron pacientes con enfermedades no hepáticas. Es importante señalar que el operador del ensayo de detección de IgG fucosilada no era consciente del diagnóstico asociado con la muestra de suero en el momento de la prueba. Los resultados se muestran en la Figura 4.

Los resultados se expresan como un aumento en veces con respecto a sigma. La señal detectada en las muestras de los 70 sujetos sanos (sin evidencia de VHB, VHC o enfermedad hepática) fue consistentemente baja, menos del doble de la observada en suero comprado comercialmente. En contraste, todos los pacientes con cirrosis tenían valores superiores a 2 veces por encima del suero comprado comercialmente. El nivel medio de aumento estaba 13 veces por encima del suero adquirido comercialmente. Los pacientes infectados por VHC con diversos niveles de fibrosis también tenían niveles elevados de IgG fucosilada. Curiosamente, el nivel de IgG fucosilada varió en estos pacientes en función del nivel de fibrosis. Los pacientes con fibrosis en etapa 0-2 tenían un aumento medio de 3 veces en la IgG fucosilada, mientras que los pacientes con fibrosis en etapa 4 o mayor tenían un aumento medio de 13 veces en la IgG fucosilada. Con el uso de un valor de corte de 5 veces por encima del suero humano adquirido comercialmente, este ensayo tuvo una sensibilidad del 92 %, una especificidad del 96 % en la diferenciación de la fibrosis en etapa 1-2 de la fibrosis/cirrosis en etapa 3-6. El valor predictivo positivo fue del 92 % y el valor predictivo negativo fue del 96 %.

La presente invención no se limita a las modalidades descritas y ejemplificadas anteriormente, sino que es susceptible de variación y modificación dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método para evaluar el estado patológico de un hígado en un sujeto con sospecha de tener una patología hepática que comprende:

poner en contacto una proteína en o de un fluido biológico de dicho sujeto con una lectina de unión a fucosa, en donde dicha proteína es IgG, permitir que dicha lectina se una a dicha proteína, detectar cuantificablemente dicha lectina unida en o del fluido biológico para obtener un valor detectado de lectina unida; y comparar el valor detectado de lectina unida con un valor de referencia para la lectina unida en dicha proteína en o de un fluido biológico comparable de sujetos sin dicha patología hepática, donde dicho valor detectado de lectina unida con respecto al valor de referencia es indicativo de la presencia o ausencia de dicha patología hepática, en donde un valor detectado de lectina unida que muestra una desviación significativa de dicho valor de referencia es indicativo de la presencia de dicha patología hepática, o comparar el valor detectado de lectina unida con un valor de referencia para lectina unida en dicha proteína en o de un fluido biológico comparable de sujetos en los que se sabe que está presente dicha patología hepática, donde dicho valor detectado de lectina unida con respecto al valor de referencia es indicativo de la presencia o ausencia de dicha patología hepática, en donde un valor detectado de lectina unida que muestra una desviación significativa de dicho valor de referencia es indicativo de la ausencia de dicha patología hepática, y en donde la patología hepática se selecciona de cirrosis, carcinoma hepatocelular y fibrosis.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha patología hepática es cirrosis.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha patología hepática es fibrosis.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha patología hepática es carcinoma hepatocelular.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el fluido biológico es sangre total, suero, orina, saliva, lágrimas o mucosidad.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además separar dicha proteína del fluido biológico antes de detectar cuantificablemente la unión de lectina.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha proteína se separa del fluido biológico con lectinas, anticuerpos o polipéptidos mediante dominios de reconocimiento de carbohidratos.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la lectina se acopla a un resto detectable.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende comparar el valor detectado de lectina unida con un valor de referencia para la lectina unida en dicha proteína en o de un fluido biológico comparable de sujetos sin fibrosis, y clasificar la gravedad de la fibrosis en dicho sujeto como una de sin fibrosis, fibrosis limitada o fibrosis grave, con base en los resultados de dicha comparación.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 9 en donde la gravedad de la fibrosis en dicho sujeto se clasifica como limitada cuando el valor detectado del reactivo unido es de aproximadamente tres a aproximadamente cinco veces mayor que dicho valor de referencia para la unión del reactivo.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 9 en donde la gravedad de la fibrosis en dicho sujeto se clasifica como grave cuando el valor detectado del reactivo unido es de aproximadamente seis a aproximadamente 13 veces mayor que dicho valor de referencia para la unión del reactivo.