JP4386660B2 - Ｈｂｖ−ｒｎａを含むｈｂｖ粒子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラミブジンなどのＢ型慢性肝炎治療薬の治療効果を判定等に有用な、Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)-RNAを含むウイルス粒子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)の感染は世界でおよそ3億人に達すると見積もられている。HBVの感染は急性および慢性の肝炎(Ｂ型肝炎)を引き起こし、さらには肝硬変、肝癌の原因となる。
HBV感染患者血清中にはHBV粒子として、Dane粒子（感染性を持つ完全HBV粒子）に加え不完全なHBV-DNAを持つ粒子およびHBsAgで形成される小型球状粒子、管状粒子が存在する。さらにプレコアタンパクを構造タンパクとして含みHBV-DNAを持たない粒子も存在する（特願2002-261666）。本願発明のHBV粒子にはこれらの粒子を全て含む。
【０００３】
Ｂ型肝炎の診断には、肝組織像に加えて、ALT、HBsAg、HBsAb、HBcAb、HBeAb、HBVポリメラーゼ、HBV-DNA量などの血清マーカーが用いられる。このうち、抗ウイルス剤の治療効果の判定には血中HBV-DNA量が重視されている。すなわち、HBV-DNA量が著しく低下もしくは測定感度以下となり、その状態が長期にわたり維持され、その他の指標も良好な場合、高い治療効果を示したと判断される。
【０００４】
HBVの遺伝子は約3,200塩基対からなる環状不完全２本鎖DNAである。このHBVの遺伝子の複製には逆転写の過程が存在する。複製過程は大別すると次の4段階に分けられる。（１）細胞の核内で内因性のDNAポリメラーゼにより完全2本鎖環状DNAとなり、これが閉環して閉環２本鎖DNA（covalently closed circular DNA: cccDNA）となる。このcccDNAは超らせん構造をとっている。（２）cccDNAを鋳型として細胞のRNAポリメラーゼIIによりmRNAが転写される。このうち最長の3.5kbのものがプレゲノム RNAとして、逆転写の鋳型となる。（３）コア粒子内でRNA依存性DNAポリメラーゼによりプライマーとしてオリゴヌクレオチドが合成され、プレゲノム RNAを鋳型として逆転写により（-）鎖DNAが合成される。（４）プレゲノム RNAの5’末端に残ったオリゴヌクレオチドをプライマーとし、（−）鎖DNAを鋳型として（＋）鎖DNAが合成される。
【０００５】
コアタンパクはプレゲノム RNAと共にヌクレオキャプシド粒子を形成するが、その内腔で上記のようなHBV-DNAが合成された後はじめて、HBsAgを含むエンベロ−プに包まれHBV粒子を形成するとされている (Gerelsaikhan, T., et al., J. Virol., 70: 4296-4274, 1996) 。したがって細胞外でHBV-RNAのみを持つウイルス粒子は存在しないと考えられてきた。
【０００６】
血清中でのHBV-RNAの存在はSuらにより示されている (Su, Q., et al., Clinical Cancer Research, 7: 2005-2015, 2001)。このHBV-RNAの存在様式は不明であるが、上記の知見に加えウイルスマーカー陰性でもHBV-RNA陽性例があることから、キャプシド内にパッケージされたウイルス粒子や小型球状粒子・管状粒子ではなく、細胞膜小胞に包まれた状態で放出されていると推測されている。また、血中HBV粒子はDNA-RNAハイブリッド分子を含むことがMillerらにより報告 (Miller, R. H., et al., Virology, 139: 53-63, 1984) されており、HBV-DNA, HBV-RNA両方を含むウイルス粒子の存在も示唆されている。
【０００７】
上記ウイルス増殖過程のいずれかを阻害することにより、ＨＢＶの遺伝子の複製を阻止し、ウイルスの増殖を抑制することができると考えられる。ここで代表的なＨＢＶの治療薬であるラミブジンについて従来技術を説明するが、本願発明のウイルス粒子はラミブジンによる治療にのみ関係するものではない。ＨＢＶの複製には逆転写の過程があるが、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）もその増殖に逆転写酵素を必要としていることから、治療薬としてRNA依存性DNAポリメラーゼのスクリーニングが行われてきた。
【０００８】
ラミブジンも、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の複製過程である逆転写を特異的に阻害することから、当初はHIV治療薬としての開発が行われたが、HBVに対しても増殖抑制効果を示すことが分かり、1992年からＢ型肝炎の治療薬としての開発が始まった。
【０００９】
ラミブジンのHBVに対する作用機構は、はっきりと解明されたわけではないが、次のように考えられている。ラミブジンはヌクレオシド（シチジン）誘導体の抗ウイルス剤で、細胞内で三リン酸誘導体にリン酸化され活性型となる。この薬剤のHBVに対する増殖抑制機序の一つは、RNA依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）阻害によりプレゲノムRNAの逆転写を阻害することである。
もう一つの機序は、ウイルスDNA鎖に取り込まれ、その伸長を止めることと考えられている。
【００１０】
このような作用機序により、HBV感染症の治療薬としてラミブジンは広く使われてきているが、血中HBV-DNA量が減少しにくい症例も存在し、その後の耐性株出現や肝炎再燃が問題となることが多い。また、HBV-DNA量が測定限界未満にまで低下した例の中からも薬剤耐性株の出現する例が少なくなく、HBV-DNA量による治療効果判定にも問題が残されている。
【００１１】
ラミブジン等の逆転写阻害効果を有する薬剤により、血中HBV-DNA量は大きく減少するが、肝臓中にはHBVウイルスがcccDNAとして存在しており、このcccDNA量はあまり減少しないと報告されている (Locarnini, S., C. Birch, J. Hepatol., 30: 536-550, 1999) 。したがって、こうした薬剤の治療効果を判定するにはHBV-DNA量のみでは充分ではなく、たとえば肝生検による組織学的検査を行う場合もある。しかしながら、肝生検は非常に苦痛を伴い患者に多大な負担を強いなければならない。
【００１２】
したがって、たとえば血液検査により肝臓中HBV量を反映するマーカーがあれば治療効果の判定に非常に有用であり、患者の負担を軽くするのみならず、より効果的な治療を可能にすることができる。
我々はこうした見地から研究を行い、従来の報告に反し、血液中にHBV-DNAを含まず、HBV-RNAを含むウイルス粒子が存在することをはじめて見出した。さらに、このウイルス粒子の測定法を開発し、この測定結果が治療効果の判定に有用なマーカーとなることを示した。
【００１３】
【非特許文献１】
Gerelsaikhan, T., et al., J. Virol., 70: 4296-4274, 1996
【非特許文献２】
Su, Q., et al., Clinical Cancer Research, 7: 2005-2015, 2001
【非特許文献３】
Miller, R. H., et al., Virology, 139: 53-63, 1984
【非特許文献４】
Locarnini, S., C. Birch, J. Hepatol., 30: 536-550, 1999
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
前述のように、薬剤による治療効果の判定には血清HBV-DNA量が重視されているが、その判定基準としては充分ではない。
従って本発明の目的は、ラミブジン等の逆転写阻害効果を有するＢ型肝炎治療薬の治療効果の判定に有用なウイルス粒子を提供することである。
このウイルス粒子を測定することにより、Ｂ型肝炎の効果的な治療に貢献できる新たな診断薬を開発することができる。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は血液等の体液中に存在する、HBV-RNAを含みHBV-DNAを含まないHBV粒子を提供する。この粒子はHBVの構造蛋白を持つという点でSuらの報告にある血清中HBV-RNAとは異なっており、また、HBV-DNAを含まないことからHBV-DNA, HBV-RNAを共に含むウイルス粒子とも異なる。
また本発明は、このHBV粒子を測定する方法を提供する。
さらに本発明は、RT-PCRを用いてHBV-RNAを定量することにより、このHBV粒子を定量する方法を提供する。
本発明により、B型肝炎の治療成績を向上させ耐性株や肝炎再燃を極力避ける効果が期待できる。
【００１６】
本発明はラミブジンに代表されるRNA依存性DNAポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤によるＢ型肝炎ウイルス（HBV）感染症の治療において、HBV-RNAを測定することにより、治療効果を判定する方法に関する。
また本発明は、HBV-DNAとHBV-RNAを同時に検出する方法であるものを含む。
さらに本発明は上記のHBV-RNAを検出するする方法、あるいは診断薬、診断キットを提供する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本願発明者らはラミブジン治療を行った患者血清中のHBV-DNAおよびHBcAgの測定を行った。その結果、ラミブジン治療により患者血清中からHBV-DNAは完全に消失するが、HBcAgが減少するけれども完全には消失しない検体があることを見出した。
【００１８】
これらの検体についてHBV-RNAの測定を行ってみると、HBV-DNAとは異なる動態を示すことがわかった。つまりラミブジン治療を行った患者検体中に、HBV-RNAとHBVの構造蛋白が存在するが、HBV-DNAは消失していることが証明された。血清などの患者検体中にはRNAを分解するRNaseが多量に存在しているため、HBV-RNAが検体中に遊離の状態で存在することはなく、HBcAgやHBsAgなどのHBV構造蛋白と不完全なウイルス粒子を形成しているものと考えられる。
【００１９】
このHBV-DNAを含まず、HBV-RNAを含みHBV構造蛋白から作られるHBV粒子は新規な物質である。またこのHBV粒子を測定することは、RNA依存性DNAポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤によるHBV感染症の治療において、薬剤の治療効果を判定するために役立つと考えられる。特にRNA依存性DNAポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤がラミブジンである場合に有用である。さらに肝癌発生の危険度を予測、または肝癌発生の危険群を選別することに有用である。
【００２０】
このウイルス粒子を測定するには検体中のHBV-RNAを測定できる方法であれば、どのような方法でも用いることが可能である。好ましくはReverse Transcription (RT)-PCRが挙げられる。またウイルス粒子を測定するにはRNAを測定するだけでなく、HBV-RNAと粒子を形成しているHBVの構造蛋白を測定してもよい。
【００２１】
【実施例】
以下の実施例は本発明を例証するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
【００２２】
実施例１ . 血清中のＨＢＶ遺伝子量の測定
（Ａ）HBVプレゲノムの精製
Dane粒子（感染力のあるHBV粒子：完全HBV粒子）中のHBV遺伝子を単離するため、HBV患者血清をハイピュアーウイルス核酸キット（ロシュ・ダイアグノスティック社）により以下の方法で精製した。ラミブジン治療を受けたHBV患者血清100μLを健常人血清100μLと混和し200μL血清サンプルとした。血清サンプルに200μLのワーキング溶液〔50μLのポリＡキャリアーRNA（4mg/mL）と2.5mLの結合緩衝液［6M Guanidine-HCl，10mM Urea，10mM Tris-HCl（pH4.4），20％ TritonX-100(v/v)]〕と50μLのProteinaseK（18mg/ml）を加えて混合し、72℃で10分間加熱した。
【００２３】
100μLのイソプロパノールとサンプルを混合し、ハイピュアーフィルターチューブに注入した。8000rpmで１分間遠心し、通過液を捨てたのち、500μLの阻害物除去緩衝液［5M Guanidine-HCl，20mM Tris-HCl（pH6.6）］を注入し、8000rpmで１分間遠心した。450μLの洗浄緩衝液［20mM NaCl，2mM Tris-HCl（pH7.5)］を加えて、8000rpmで１分間遠心し、再度450μLの洗浄緩衝液で洗浄し、13000rpmで10秒間遠心した。50μLの滅菌水をフィルターチューブに注入し、8000rpmで１分間遠心し、通過液を採取して血清中のHBV遺伝子溶液とした。
【００２４】
（Ｂ）血清中のHBV DNAの定量
血清HBV DNAの定量は、ライトサイクラー（ロシュ・ダイアグノスティック社）を用いたTaqMan PCR法により行った。
リアルタイムPCRは、10×LightCycler-FastStart DNAマスターハイブリダイゼーションプローブ（ロシュ・ダイアグノスティック社）を2μL、HBV遺伝子溶液を4μL、10μMのHBVのＳ領域に対する２つのプライマー［HBS-F:5′-ACAACATCAGGATTCCTAGGAC-3′（配列番号：１），HBS-R:5′-GGTTGGTGAGTGATTGGAGGTT-3′（配列番号：２）］を各々2μL、4μMのTaqManプローブ［HBS-P:5′FAM(6-carboxy-fluorescein)-CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTC-3′TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) （配列番号：３）］を2μL、25mM MgCl2を2μL混和し、滅菌水を加えて20μLの反応液として行った。
【００２５】
条件としては、前処理を95℃で10分間、DNA変性を95℃で５秒間、アニーリングを60℃で15秒間、DNA合成を72℃で８秒間で行い、TaqManプローブから発せられた蛍光を測定し、血清中のHBV DNA量を定量した。（表１）
【００２６】
（Ｃ）血清中のHBV遺伝子（DNA＋RNA）の定量
次に血清中のHBV遺伝子量を測定するために、逆転写酵素反応を加えた。HBV遺伝子溶液の10μLに1μLの20mM dNTP Mix（10mM dATP，10mM dGTP，10mM dCTP，10mM dTTP）と0.2μLの10μM HBS-Rプライマーを混和し、65℃で５分間加熱後、氷中で急冷した。4μLの５×逆転写緩衝液［250mM Tris-HCl（pH8.3），375mM KCl，15mM MgCl2］、0.2μLの0.1M DTT、0.6μLのRNaseインヒビター（40単位／μL）と3μLの滅菌水を混和し、42℃で２分間アニ−リング反応を行い、1μLの逆転写酵素（200単位／μL）を加えて20μLの反応液とし、42℃で50分間逆転写反応させ、逆転写酵素の不活化処理を70℃で15分間行った。
【００２７】
この反応液の4μLを上記のHBV DNA定量系に適用させることで、血清中のHBV遺伝子量、すなわち血清中のHBV DNAとRNAの合計量が測定できる。また、HBV遺伝子量からHBV DNA量を減算することにより、血清中のHBV RNA量を推計することが可能である。（表１）
【００２８】
実施例２ . HBc 抗原の測定
（Ａ）抗体固相プレートの作製
HBc抗原HBe抗原両方に反応する３種のモノクローナル抗体HB44（認識部位31-49アミノ酸）、HB61（認識部位131-140アミノ酸）およびHB114（認識部位1-81アミノ酸）をマイクロタイタープレートウェルに感作し、固相化する。PBSで洗浄後、カゼインを含む溶液でブロッキングし、この溶液を除いた後、乾燥させた。
【００２９】
（Ｂ）検体の前処理
50μLの前処理液（15％ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、３％ CHAPS、１％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド）を100μLの検体（血清、血漿など）と混合し、70℃で30分処理した。
（Ｃ）１次反応
各抗体固相ウェルに100μLの反応緩衝液（pH8.0）および前処理した検体を50μL加え、穏やかに撹拌しながら室温２時間反応させた。
【００３０】
（Ｄ）２次反応
ウェルを洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識HB50（認識部位168-176アミノ酸)モノクローナル抗体を含む溶液を100μl加え、室温1時間反応させた。
（Ｅ）基質反応
ウェルを洗浄後、CDP Star with Emerald II（Applied Biosystems）を100μL加え、室温２０分間反応後各ウェルの発光量をマイクロプレートルミノメーターで測定した。標準抗原での発行量と比較し、検体中HBc抗原の濃度を算出した（表１）。
【００３１】
実施例３ . ラミブジン治療を受けた HBV 患者血清での検討
表１に示すように、ラミブジン治療開始１ヶ月前の検体では、血中HBV DNAとRNAはほぼ同様の血中ウイルス量を示したが、１ヶ月間投与の検体では、血中HBV DNAが6.1×103 コピー/mLに対して血中HBV RNAが1.0×105コピー/mLと明らかに血中HBV RNA量が優位となっていた。さらに、８ヶ月間投与及び19ヶ月間投与の検体においては、血中HBV DNAがほとんど検出できない場合でも、血中HBV RNAが２〜７×103コピー/ml残存していた。
【００３２】
一方、コアタンパク濃度は投与前には610 pg/mlであったが、投与１ヵ月後には56 pg/mlまで低下したもののその低下率はHBV-DNAより小さく、さらに投与8, 19ヶ月では21, 20 pg/mlとほとんど低下していなかった。HBc抗原濃度の変化は(HBV-DNA + HBV-RNA)量の変化とほぼ一致していた。
これらの結果から、ラミブジン治療中の患者血清中には、HBV DNAを含む完全ウイルス粒子はほとんど存在せず、HBV RNAのみを含むHBV粒子が多量に存在していることが示唆される。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラミブジンなどのＢ型慢性肝炎治療薬の治療効果を判定等に有用な、Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)-RNAを含むウイルス粒子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)の感染は世界でおよそ3億人に達すると見積もられている。HBVの感染は急性および慢性の肝炎(Ｂ型肝炎)を引き起こし、さらには肝硬変、肝癌の原因となる。
HBV感染患者血清中にはHBV粒子として、Dane粒子（感染性を持つ完全HBV粒子）に加え不完全なHBV-DNAを持つ粒子およびHBsAgで形成される小型球状粒子、管状粒子が存在する。さらにプレコアタンパクを構造タンパクとして含みHBV-DNAを持たない粒子も存在する（特願2002-261666）。本願発明のHBV粒子にはこれらの粒子を全て含む。
【０００３】
Ｂ型肝炎の診断には、肝組織像に加えて、ALT、HBsAg、HBsAb、HBcAb、HBeAb、HBVポリメラーゼ、HBV-DNA量などの血清マーカーが用いられる。このうち、抗ウイルス剤の治療効果の判定には血中HBV-DNA量が重視されている。すなわち、HBV-DNA量が著しく低下もしくは測定感度以下となり、その状態が長期にわたり維持され、その他の指標も良好な場合、高い治療効果を示したと判断される。
【０００４】
HBVの遺伝子は約3,200塩基対からなる環状不完全２本鎖DNAである。このHBVの遺伝子の複製には逆転写の過程が存在する。複製過程は大別すると次の4段階に分けられる。（１）細胞の核内で内因性のDNAポリメラーゼにより完全2本鎖環状DNAとなり、これが閉環して閉環２本鎖DNA（covalently closed circular DNA: cccDNA）となる。このcccDNAは超らせん構造をとっている。（２）cccDNAを鋳型として細胞のRNAポリメラーゼIIによりmRNAが転写される。このうち最長の3.5kbのものがプレゲノム RNAとして、逆転写の鋳型となる。（３）コア粒子内でRNA依存性DNAポリメラーゼによりプライマーとしてオリゴヌクレオチドが合成され、プレゲノム RNAを鋳型として逆転写により（-）鎖DNAが合成される。（４）プレゲノム RNAの5’末端に残ったオリゴヌクレオチドをプライマーとし、（−）鎖DNAを鋳型として（＋）鎖DNAが合成される。
【０００５】
コアタンパクはプレゲノム RNAと共にヌクレオキャプシド粒子を形成するが、その内腔で上記のようなHBV-DNAが合成された後はじめて、HBsAgを含むエンベロ−プに包まれHBV粒子を形成するとされている (Gerelsaikhan, T., et al., J. Virol., 70: 4296-4274, 1996) 。したがって細胞外でHBV-RNAのみを持つウイルス粒子は存在しないと考えられてきた。
【０００６】
血清中でのHBV-RNAの存在はSuらにより示されている (Su, Q., et al., Clinical Cancer Research, 7: 2005-2015, 2001)。このHBV-RNAの存在様式は不明であるが、上記の知見に加えウイルスマーカー陰性でもHBV-RNA陽性例があることから、キャプシド内にパッケージされたウイルス粒子や小型球状粒子・管状粒子ではなく、細胞膜小胞に包まれた状態で放出されていると推測されている。また、血中HBV粒子はDNA-RNAハイブリッド分子を含むことがMillerらにより報告 (Miller, R. H., et al., Virology, 139: 53-63, 1984) されており、HBV-DNA, HBV-RNA両方を含むウイルス粒子の存在も示唆されている。
【０００７】
上記ウイルス増殖過程のいずれかを阻害することにより、ＨＢＶの遺伝子の複製を阻止し、ウイルスの増殖を抑制することができると考えられる。ここで代表的なＨＢＶの治療薬であるラミブジンについて従来技術を説明するが、本願発明のウイルス粒子はラミブジンによる治療にのみ関係するものではない。ＨＢＶの複製には逆転写の過程があるが、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）もその増殖に逆転写酵素を必要としていることから、治療薬としてRNA依存性DNAポリメラーゼのスクリーニングが行われてきた。
【０００８】
ラミブジンも、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の複製過程である逆転写を特異的に阻害することから、当初はHIV治療薬としての開発が行われたが、HBVに対しても増殖抑制効果を示すことが分かり、1992年からＢ型肝炎の治療薬としての開発が始まった。
【０００９】
ラミブジンのHBVに対する作用機構は、はっきりと解明されたわけではないが、次のように考えられている。ラミブジンはヌクレオシド（シチジン）誘導体の抗ウイルス剤で、細胞内で三リン酸誘導体にリン酸化され活性型となる。この薬剤のHBVに対する増殖抑制機序の一つは、RNA依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）阻害によりプレゲノムRNAの逆転写を阻害することである。
もう一つの機序は、ウイルスDNA鎖に取り込まれ、その伸長を止めることと考えられている。
【００１０】
このような作用機序により、HBV感染症の治療薬としてラミブジンは広く使われてきているが、血中HBV-DNA量が減少しにくい症例も存在し、その後の耐性株出現や肝炎再燃が問題となることが多い。また、HBV-DNA量が測定限界未満にまで低下した例の中からも薬剤耐性株の出現する例が少なくなく、HBV-DNA量による治療効果判定にも問題が残されている。
【００１１】
ラミブジン等の逆転写阻害効果を有する薬剤により、血中HBV-DNA量は大きく減少するが、肝臓中にはHBVウイルスがcccDNAとして存在しており、このcccDNA量はあまり減少しないと報告されている (Locarnini, S., C. Birch, J. Hepatol., 30: 536-550, 1999) 。したがって、こうした薬剤の治療効果を判定するにはHBV-DNA量のみでは充分ではなく、たとえば肝生検による組織学的検査を行う場合もある。しかしながら、肝生検は非常に苦痛を伴い患者に多大な負担を強いなければならない。
【００１２】
したがって、たとえば血液検査により肝臓中HBV量を反映するマーカーがあれば治療効果の判定に非常に有用であり、患者の負担を軽くするのみならず、より効果的な治療を可能にすることができる。
我々はこうした見地から研究を行い、従来の報告に反し、血液中にHBV-DNAを含まず、HBV-RNAを含むウイルス粒子が存在することをはじめて見出した。さらに、このウイルス粒子の測定法を開発し、この測定結果が治療効果の判定に有用なマーカーとなることを示した。
【００１３】
【非特許文献１】
Gerelsaikhan, T., et al., J. Virol., 70: 4296-4274, 1996
【非特許文献２】
Su, Q., et al., Clinical Cancer Research, 7: 2005-2015, 2001
【非特許文献３】
Miller, R. H., et al., Virology, 139: 53-63, 1984
【非特許文献４】
Locarnini, S., C. Birch, J. Hepatol., 30: 536-550, 1999
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
前述のように、薬剤による治療効果の判定には血清HBV-DNA量が重視されているが、その判定基準としては充分ではない。
従って本発明の目的は、ラミブジン等の逆転写阻害効果を有するＢ型肝炎治療薬の治療効果の判定に有用なウイルス粒子を提供することである。
このウイルス粒子を測定することにより、Ｂ型肝炎の効果的な治療に貢献できる新たな診断薬を開発することができる。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明は血液等の体液中に存在する、HBV-RNAを含みHBV-DNAを含まないHBV粒子を提供する。この粒子はHBVの構造蛋白を持つという点でSuらの報告にある血清中HBV-RNAとは異なっており、また、HBV-DNAを含まないことからHBV-DNA, HBV-RNAを共に含むウイルス粒子とも異なる。
また本発明は、このHBV粒子を測定する方法を提供する。
さらに本発明は、RT-PCRを用いてHBV-RNAを定量することにより、このHBV粒子を定量する方法を提供する。
本発明により、B型肝炎の治療成績を向上させ耐性株や肝炎再燃を極力避ける効果が期待できる。
【００１６】
本発明はラミブジンに代表されるRNA依存性DNAポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤によるＢ型肝炎ウイルス（HBV）感染症の治療において、HBV-RNAを測定することにより、治療効果を判定する方法に関する。
また本発明は、HBV-DNAとHBV-RNAを同時に検出する方法であるものを含む。
さらに本発明は上記のHBV-RNAを検出するする方法、あるいは診断薬、診断キットを提供する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本願発明者らはラミブジン治療を行った患者血清中のHBV-DNAおよびHBcAgの測定を行った。その結果、ラミブジン治療により患者血清中からHBV-DNAは完全に消失するが、HBcAgが減少するけれども完全には消失しない検体があることを見出した。
【００１８】
これらの検体についてHBV-RNAの測定を行ってみると、HBV-DNAとは異なる動態を示すことがわかった。つまりラミブジン治療を行った患者検体中に、HBV-RNAとHBVの構造蛋白が存在するが、HBV-DNAは消失していることが証明された。血清などの患者検体中にはRNAを分解するRNaseが多量に存在しているため、HBV-RNAが検体中に遊離の状態で存在することはなく、HBcAgやHBsAgなどのHBV構造蛋白と不完全なウイルス粒子を形成しているものと考えられる。
【００１９】
このHBV-DNAを含まず、HBV-RNAを含みHBV構造蛋白から作られるHBV粒子は新規な物質である。またこのHBV粒子を測定することは、RNA依存性DNAポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤によるHBV感染症の治療において、薬剤の治療効果を判定するために役立つと考えられる。特にRNA依存性DNAポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤がラミブジンである場合に有用である。さらに肝癌発生の危険度を予測、または肝癌発生の危険群を選別することに有用である。
【００２０】
このウイルス粒子を測定するには検体中のHBV-RNAを測定できる方法であれば、どのような方法でも用いることが可能である。好ましくはReverse Transcription (RT)-PCRが挙げられる。またウイルス粒子を測定するにはRNAを測定するだけでなく、HBV-RNAと粒子を形成しているHBVの構造蛋白を測定してもよい。
【００２１】
【実施例】
以下の実施例は本発明を例証するものであるが、これによって本発明の範囲を制限するものではない。
【００２２】
実施例１ . 血清中のＨＢＶ遺伝子量の測定
（Ａ）HBVプレゲノムの精製
Dane粒子（感染力のあるHBV粒子：完全HBV粒子）中のHBV遺伝子を単離するため、HBV患者血清をハイピュアーウイルス核酸キット（ロシュ・ダイアグノスティック社）により以下の方法で精製した。ラミブジン治療を受けたHBV患者血清100μLを健常人血清100μLと混和し200μL血清サンプルとした。血清サンプルに200μLのワーキング溶液〔50μLのポリＡキャリアーRNA（4mg/mL）と2.5mLの結合緩衝液［6M Guanidine-HCl，10mM Urea，10mM Tris-HCl（pH4.4），20％ TritonX-100(v/v)]〕と50μLのProteinaseK（18mg/ml）を加えて混合し、72℃で10分間加熱した。
【００２３】
100μLのイソプロパノールとサンプルを混合し、ハイピュアーフィルターチューブに注入した。8000rpmで１分間遠心し、通過液を捨てたのち、500μLの阻害物除去緩衝液［5M Guanidine-HCl，20mM Tris-HCl（pH6.6）］を注入し、8000rpmで１分間遠心した。450μLの洗浄緩衝液［20mM NaCl，2mM Tris-HCl（pH7.5)］を加えて、8000rpmで１分間遠心し、再度450μLの洗浄緩衝液で洗浄し、13000rpmで10秒間遠心した。50μLの滅菌水をフィルターチューブに注入し、8000rpmで１分間遠心し、通過液を採取して血清中のHBV遺伝子溶液とした。
【００２４】
（Ｂ）血清中のHBV DNAの定量
血清HBV DNAの定量は、ライトサイクラー（ロシュ・ダイアグノスティック社）を用いたTaqMan PCR法により行った。
リアルタイムPCRは、10×LightCycler-FastStart DNAマスターハイブリダイゼーションプローブ（ロシュ・ダイアグノスティック社）を2μL、HBV遺伝子溶液を4μL、10μMのHBVのＳ領域に対する２つのプライマー［HBS-F:5′-ACAACATCAGGATTCCTAGGAC-3′（配列番号：１），HBS-R:5′-GGTTGGTGAGTGATTGGAGGTT-3′（配列番号：２）］を各々2μL、4μMのTaqManプローブ［HBS-P:5′FAM(6-carboxy-fluorescein)-CAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTC-3′TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine) （配列番号：３）］を2μL、25mM MgCl2を2μL混和し、滅菌水を加えて20μLの反応液として行った。
【００２５】
条件としては、前処理を95℃で10分間、DNA変性を95℃で５秒間、アニーリングを60℃で15秒間、DNA合成を72℃で８秒間で行い、TaqManプローブから発せられた蛍光を測定し、血清中のHBV DNA量を定量した。（表１）
【００２６】
（Ｃ）血清中のHBV遺伝子（DNA＋RNA）の定量
次に血清中のHBV遺伝子量を測定するために、逆転写酵素反応を加えた。HBV遺伝子溶液の10μLに1μLの20mM dNTP Mix（10mM dATP，10mM dGTP，10mM dCTP，10mM dTTP）と0.2μLの10μM HBS-Rプライマーを混和し、65℃で５分間加熱後、氷中で急冷した。4μLの５×逆転写緩衝液［250mM Tris-HCl（pH8.3），375mM KCl，15mM MgCl2］、0.2μLの0.1M DTT、0.6μLのRNaseインヒビター（40単位／μL）と3μLの滅菌水を混和し、42℃で２分間アニ−リング反応を行い、1μLの逆転写酵素（200単位／μL）を加えて20μLの反応液とし、42℃で50分間逆転写反応させ、逆転写酵素の不活化処理を70℃で15分間行った。
【００２７】
この反応液の4μLを上記のHBV DNA定量系に適用させることで、血清中のHBV遺伝子量、すなわち血清中のHBV DNAとRNAの合計量が測定できる。また、HBV遺伝子量からHBV DNA量を減算することにより、血清中のHBV RNA量を推計することが可能である。（表１）
【００２８】
実施例２ . HBc 抗原の測定
（Ａ）抗体固相プレートの作製
HBc抗原HBe抗原両方に反応する３種のモノクローナル抗体HB44（認識部位31-49アミノ酸）、HB61（認識部位131-140アミノ酸）およびHB114（認識部位1-81アミノ酸）をマイクロタイタープレートウェルに感作し、固相化する。PBSで洗浄後、カゼインを含む溶液でブロッキングし、この溶液を除いた後、乾燥させた。
【００２９】
（Ｂ）検体の前処理
50μLの前処理液（15％ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、３％ CHAPS、１％ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド）を100μLの検体（血清、血漿など）と混合し、70℃で30分処理した。
（Ｃ）１次反応
各抗体固相ウェルに100μLの反応緩衝液（pH8.0）および前処理した検体を50μL加え、穏やかに撹拌しながら室温２時間反応させた。
【００３０】
（Ｄ）２次反応
ウェルを洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識HB50（認識部位168-176アミノ酸)モノクローナル抗体を含む溶液を100μl加え、室温1時間反応させた。
（Ｅ）基質反応
ウェルを洗浄後、CDP Star with Emerald II（Applied Biosystems）を100μL加え、室温２０分間反応後各ウェルの発光量をマイクロプレートルミノメーターで測定した。標準抗原での発行量と比較し、検体中HBc抗原の濃度を算出した（表１）。
【００３１】
実施例３ . ラミブジン治療を受けた HBV 患者血清での検討
表１に示すように、ラミブジン治療開始１ヶ月前の検体では、血中HBV DNAとRNAはほぼ同様の血中ウイルス量を示したが、１ヶ月間投与の検体では、血中HBV DNAが6.1×103 コピー/mLに対して血中HBV RNAが1.0×105コピー/mLと明らかに血中HBV RNA量が優位となっていた。さらに、８ヶ月間投与及び19ヶ月間投与の検体においては、血中HBV DNAがほとんど検出できない場合でも、血中HBV RNAが２〜７×103コピー/ml残存していた。
【００３２】
一方、コアタンパク濃度は投与前には610 pg/mlであったが、投与１ヵ月後には56 pg/mlまで低下したもののその低下率はHBV-DNAより小さく、さらに投与8, 19ヶ月では21, 20 pg/mlとほとんど低下していなかった。HBc抗原濃度の変化は(HBV-DNA + HBV-RNA)量の変化とほぼ一致していた。
これらの結果から、ラミブジン治療中の患者血清中には、HBV DNAを含む完全ウイルス粒子はほとんど存在せず、HBV RNAのみを含むHBV粒子が多量に存在していることが示唆される。
【００３３】
【表１】
【配列表】
Claims (5)
- Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)-RNAを含み、HBV-DNAを持たない体液試料中のHBV粒子。
- HBV-RNAを測定することにより、請求項１に記載の粒子を測定する方法。
- RT-PCR法により、請求項１に記載の粒子を測定する方法。
- 患者の体液中のＢ型肝炎ウイルス(HBV)-RNAを測定することによりRNA依存性DNAポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤によるHBV感染症の治療の効果を判定するための、Ｂ型肝炎ウイルス(HBV)-RNAを測定用試薬を含んでなる診断薬。
- 前記RNA依存性DNAポリメラーゼ阻害効果を有する薬剤がラミブジンである、請求項４に記載の診断薬。
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