JP2022040339A - シングルプレックス又はマルチプレックスアッセイにおいてヒトパルボウイルス核酸を検出及びa型肝炎ウイルス核酸を検出するための組成物及び方法 - Google Patents
シングルプレックス又はマルチプレックスアッセイにおいてヒトパルボウイルス核酸を検出及びa型肝炎ウイルス核酸を検出するための組成物及び方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119条に基づき、米国特許出願第61/508,597号(2011年7月15日出願)に対する優先権を主張し、この内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、ヒト感染因子を検出するための診断方法及び組成物に関するものであり、具体的には、ヒトパルボウイルス遺伝子型1、2、及び3並びに/又はA型肝炎ウイルスの核酸をインビトロで検出するための方法及び組成物に関する。
HAVは27nmのRNAウイルス(ピコルナウイルス)であり、約7.5kbのプラスセンス一本鎖RNAゲノムを含む。ウイルスは肝臓内で複製され、感染の急性段階に、胆汁中に放出され、糞便中に排泄される(例えば、1mL中にウイルスが最高108個)。潜伏期は通常、症状が現われるまでに2~6週間である。世界で、単一のHAVの血清型が見出されている。A型肝炎の診断は、症状又はその他の臨床的特徴(例えば血清アミノトランスフェラーゼ値の上昇)によって他のタイプのウイルス性肝炎と区別することはできない。典型的に、A型肝炎の診断は、抗HAV免疫グロブリン(Ig)の存在について陽性結果を示す血清学的試験によって確認される。抗HAV IgMは通常、症状発症前の5~10日間存在し、多くの患者において6ヶ月後には検出不能になるが、抗HAV
IgGは感染期間の初期に現われ、その患者の生涯にわたって検出可能なままである。HAV RNAは、感染の急性期に、多くの患者の血液中及び糞便中において、核酸試験手法(例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅)によって検出可能であり、核酸シーケンシングを用いて、コミュニティ規模の感染後にHAVの遺伝的関連性が特定されてきた(非特許文献5(Datoら、Morbidity Mortality Wkly.Rpt.,2003,52(47):1155~57)、非特許文献6(LaPorteら、Morbidity Mortality Wkly.Rpt.,2003,52(24):565~67))。しかしながら、これらの方法は通常、診断目的には使用されていない。
5~約6028に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている。一態様において、HAV特異的キャプチャープローブオリゴマーは、配列番号46~51からなる群から選択される配列を有する。一態様において、HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号178の配列に包含されている。一態様において、HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列は、配列番号58~74からなる群から選択される。一態様において、本明細書に記載されている増幅オリゴマーのいずれかから構成されるオリゴマー組み合わせは、第1又は第2 HAV増幅オリゴマーより上流のHAV標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーを更に含む。一態様において、このオリゴマー組み合わせは、不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのHAV特異的キャプチャープローブオリゴマーを更に含み、ここでこの標的ハイブリダイズ配列は、配列番号52~57からなる群から選択される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
試料中のヒトパルボウイルス標的核酸及びA型肝炎ウイルス(HAV)標的核酸のうち少なくとも1つを検出するためのオリゴマー組み合わせであって、前記オリゴマー組み合わせが、
(I)ヒトパルボウイルス核酸標的領域を増幅するための第1及び第2増幅オリゴマーであって、ここで
(a)前記第1パルボウイルス増幅オリゴマーは、配列番号181の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーは、
(i)配列番号189の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び
(ii)配列番号193の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第2標的ハイブリダイズ配列を含む、第1及び第2増幅オリゴマーと、
並びに/又は
(II)HAV核酸標的領域を増幅するための第1及び第2増幅オリゴマーであって、ここで
(a)第1 HAV増幅オリゴマーは、配列番号174の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)前記第2 HAV増幅オリゴマーは、配列番号177の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第2標的ハイブリダイズ配列を含む、第1及び第2増幅オリゴマーと、を含む、オリゴマー組み合わせ。
(項目2)
前記オリゴマー組み合わせが、(I)の前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマーを含む、項目1に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目3)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号182の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号179の配列を含む、項目2に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目4)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号183又は配列番号117の配列を含む、項目3に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目5)
(I)(a)の前記第1標的ハイブリダイズ配列が、配列番号75~80からなる群から選択される配列を有する、項目4に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目6)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号184の配列に包含される、項目2に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目7)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号81~84からなる群から選択される、項目6に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目8)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号185に包含され、かつ少なくとも配列番号180の配列を含む、項目2に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目9)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号82~84からなる群から選択される、項目8に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目10)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号187の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む、項目2~9のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目11)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号186の配列を含む、項目10に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目12)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号108~113からなる群から選択される、項目11に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目13)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号191の配列に包含される、項目2~9のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目14)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号190の配列を含む、項目13に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目15)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号118~121からなる群から選択される、項目14に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目16)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目2~15のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目17)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目16に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目18)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目17に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目19)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、配列番号88~93及び98~101からなる群から選択される配列を有する、項目18に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目20)
(III)ヒトパルボウイルス核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、ここで
(a)該第3パルボウイルス増幅オリゴマーは、配列番号181の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)第4パルボウイルス増幅オリゴマーは、
(i)配列番号189の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び
(ii)配列番号193の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(III)(a)の前記第3標的ハイブリダイズ配列は、(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(III)(b)の前記第4標的ハイブリダイズ配列は、(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーを更に含む、項目2~19のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目21)
前記第3パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第1パルボウイルス増幅オリゴマーについて項目3~9のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目20に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目22)
前記第4パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーについて項目10~19のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目20又は21に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目23)
不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのパルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーを更に含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号132~135からなる群から選択される、項目2~22のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目24)
前記パルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号128~131からなる群から選択される配列を有する、項目23に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目25)
前記第1又は第2パルボウイルス増幅オリゴマーより上流の前記パルボウイルス標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーを更に含む、項目2~24のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目26)
長さ約14~約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのパルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーを更に含み、配列番号199内のヌクレオチド位置約2921~約2966、又はヌクレオチド位置約2921~約3067に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目2~25のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目27)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号194又は195の配列内に包含される、項目26に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目28)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号137~169からなる群から選択される、項目27に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目29)
前記オリゴマー組み合わせが、(II)の前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマーを含む、項目1~22のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目30)
(II)(a)の前記第1標的ハイブリダイズ配列が、配列番号172の配列に包含される、項目29に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目31)
(II)(a)の前記第1標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号170の配列を含む、項目30に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目32)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1~6及び11からなる群から選択される、項目31に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目33)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号171の配列を含む、項目30に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目34)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1~6からなる群から選択される、項目33に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目35)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号176の配列に包含される、項目29~34のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目36)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号29~38及び45からなる群から選択される、項目35に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目37)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目29~36のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目38)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目37に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目39)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目38に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目40)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、配列番号12~21及び28からなる群から選択される配列を有する、項目39に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目41)
(IV)HAV核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、ここで
(a)前記第3 HAV増幅オリゴマーは、配列番号174の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)第4 HAV増幅オリゴマーは、配列番号177の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(IV)(a)の前記第3標的ハイブリダイズ配列は、(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(IV)(b)の前記第4標的ハイブリダイズ配列は、(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーを更に含む、項目29~40のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目42)
前記第3 HAV増幅オリゴマーが、前記第1 HAV増幅オリゴマーについて項目30~34のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目41に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目43)
前記第4 HAV増幅オリゴマーが、前記第2 HAV増幅オリゴマーについて項目35~40で示されているオリゴマーである、項目41又は42に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目44)
不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのHAV特異的キャプチャープローブオリゴマーを更に含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号52~57からなる群から選択される、項目29~43のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目45)
前記HAV特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号46~51からなる群から選択される配列を有する、項目44に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目46)
前記第1又は第2 HAV増幅オリゴマーより上流の前記HAV標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーを更に含む、項目29~45のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目47)
長さ約14~約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのHAV特異的検出プローブオリゴマーを更に含み、配列番号198内のヌクレオチド位置約5965~約6028に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目29~46のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目48)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号178の配列内に包含される、項目47に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目49)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号58~74からなる群から選択される、項目48に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目50)
項目1~49のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせを含むキット。
(項目51)
項目1~49のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせを含む反応混合物。
(項目52)
試料中のヒトパルボウイルス標的核酸及びA型肝炎ウイルス(HAV)標的核酸のうち少なくとも1つを検出するための方法であって、前記方法が、
(A)ヒトパルボウイルスとHAVのうち少なくとも1つを含むことが疑われる試料を提供する工程と、
(B)該試料を、ヒトパルボウイルス核酸標的領域及びHAV核酸標的領域のうち少なくとも1つを増幅するためのオリゴマー組み合わせに接触させる工程であって、このオリゴマー組み合わせは、
(I)パルボウイルス標的領域について、(a)配列番号181の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含む、第1パルボウイルス増幅オリゴマーと、(b)(i)配列番号189の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び(ii)配列番号193の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第2標的ハイブリダイズ配列を含む第2パルボウイルス増幅オリゴマーと、
並びに/又は
(II)HAV標的領域について、(a)配列番号174の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含む、第1 HAV増幅オリゴマーと、(b)配列番号177の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第2標的ハイブリダイズ配列を含む、第2 HAV増幅オリゴマーと、を含む、工程と、
(C)試料中に存在する任意のパルボウイルス及び/又はHAVの標的核酸が、パルボウイルス及び/又はHAV増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、インビトロ核酸増幅反応を実施する工程と、
(D)パルボウイルス及び/又はHAV増幅産物の存在又は不在を検出することにより、前記試料中のパルボウイルス及び/又はHAVの存在又は不在を示す工程と、を含む、方法。
(項目53)
前記方法が、ヒトパルボウイルス標的核酸を検出するためのものであり、前記試料が(I)の前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマーに接触する、項目52に記載の方法。
(項目54)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号182の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号117又は配列番号179の配列を含む、項目53に記載の方法。
(項目55)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号183の配列を含む、項目54に記載の方法。
(項目56)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号75~80からなる群から選択される配列を有する、項目55に記載の方法。
(項目57)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号184の配列に包含される、項目53に記載の方法。
(項目58)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号81~84からなる群から選択される、項目57に記載の方法。
(項目59)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号185の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号180の配列を含む、項目53に記載の方法。(項目60)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号82~84からなる群から選択される、項目59に記載の方法。
(項目61)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号187の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む、項目53~60のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号186の配列を含む、項目61に記載の方法。
(項目63)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号108~113からなる群から選択される、項目62に記載の方法。
(項目64)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号191の配列に包含される、項目53~60のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号190の配列を含む、項目64に記載の方法。
(項目66)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号118~121からなる群から選択される、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目53~66のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目67に記載の方法。
(項目69)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、配列番号88~93及び98~101からなる群から選択される配列を有する、項目69に記載の方法。
(項目71)
工程(B)が、前記試料を、
(III)ヒトパルボウイルス核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、ここで(a)前記第3パルボウイルス増幅オリゴマーは、配列番号181の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)前記第4パルボウイルス増幅オリゴマーは、(i)配列番号189の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び(ii)配列番号193の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(III)(a)の該第3標的ハイブリダイズ配列は、(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(III)(b)の第4標的ハイブリダイズ配列は、(I)(b)の第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーとを接触させる工程を更に含む、項目53~70のいずれか一項に記載の方法。
(項目72)
前記第3パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第1パルボウイルス増幅オリゴマーについて項目54~60のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目71に記載の方法。
(項目73)
前記第4パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーについて項目61~70のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目71又は72に記載の方法。
(項目74)
工程(B)の前に、前記試料中の他の構成成分から前記パルボウイルス標的核酸を精製する工程を更に含む、項目53~73のいずれか一項に記載されている方法。
(項目75)
前記精製工程が、前記試料を、不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのパルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーに接触させる工程を含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号132~135からなる群から選択される、項目74に記載の方法。
(項目76)
前記パルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号128~131からなる群から選択される配列を有する、項目75に記載の方法。
(項目77)
工程(B)が、前記試料を、前記第1又は第2パルボウイルス増幅オリゴマーより上流の前記パルボウイルス標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目53~76のいずれか一項に記載の方法。
(項目78)
検出工程(D)が、前記パルボウイルス増幅産物の存在又は不在が決定される条件において、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記パルボウイルス増幅産物に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されているパルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のパルボウイルスの存在又は不在を示す工程を含む、項目53に記載の方法。
(項目79)
前記パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14~約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号199内のヌクレオチド位置約2921~約2966、又はヌクレオチド位置約2921~約3067に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目78に記載の方法。
(項目80)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号194又は195の配列内に包含される、項目79に記載の方法。
(項目81)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号137~169からなる群から選択される、項目80に記載の方法。
(項目82)
前記試料を、前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマーを用いて前記インビトロ核酸増幅反応において増幅され得る擬似標的オリゴマーに接触させて、前記検出反応条件下でパルボウイルス特異的検出プローブに対して特異的にハイブリダイズしない第2増幅産物を生成する工程を更に含む、項目78~81のいずれか一項に記載の方法。
(項目83)
前記試料を、前記パルボウイルス増幅産物に対してハイブリダイゼーションするための前記パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーと競合するコールドプローブオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目78~82のいずれか一項に記載の方法。
(項目84)
前記試料を、前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマー両方に特異的にハイブリダイズするよう構成されたチューナーオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目78~81のいずれか一項に記載の方法。
(項目85)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、
(a)化学発光標識、
(b)蛍光標識、
(c)消光剤、並びに
(d)(a)、(b)、及び(c)のうち1つ以上の組み合わせ、からなる群から選択される標識を含む、項目78~84のいずれか一項に記載の方法。
(項目86)
前記検出工程(D)が、前記増幅工程(C)中に起こる、項目78~85のいずれか一項に記載の方法。
(項目87)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、蛍光標識、消光剤、又は両方を含む、項目86に記載の方法。
(項目88)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、TaqMan検出プローブ又は分子ビーコンである、項目87に記載の方法。
(項目89)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む、項目78~87のいずれか一項に記載の方法。
(項目90)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、ヘアピン検出プローブである、項目89に記載の方法。
(項目91)
前記ヘアピン検出プローブが、分子ビーコン又は分子トーチである、項目90に記載の方法。
(項目92)
工程(C)の前記増幅反応が、等温増幅反応である、項目53~91のいずれか一項に記載の方法。
(項目93)
工程(C)の前記増幅反応が、PCR増幅反応である、項目53~91のいずれか一項に記載の方法。
(項目94)
前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、項目92又は93に記載の方法。
(項目95)
前記方法が、ヒトHAV標的核酸を検出するためのものであり、前記試料が(II)の前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマーに接触する、項目52に記載の方法。
(項目96)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号172の配列に包含される、項目95に記載の方法。
(項目97)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号170の配列を含む、項目96に記載の方法。
(項目98)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1~6及び11からなる群から選択される、項目97に記載の方法。
(項目99)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号171の配列を含む、項目96に記載の方法。
(項目100)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1~6からなる群から選択される、項目99に記載の方法。
(項目101)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号176の配列に包含される、項目95~100のいずれか一項に記載の方法。
(項目102)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号29~38及び45からなる群から選択される、項目101に記載の方法。
(項目103)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目95~102のいずれか一項に記載の方法。
(項目104)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目103に記載の方法。
(項目105)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目104に記載の方法。
(項目106)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、配列番号12~21及び28からなる群から選択される配列を有する、項目105に記載の方法。
(項目107)
工程(B)が、前記試料を、
(IV)HAV核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、ここで、(a)前記第3 HAV増幅オリゴマーは、配列番号174の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、(b)第4 HAV増幅オリゴマーは、配列番号177の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(IV)(a)の前記第3標的ハイブリダイズ配列は、(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(IV)(b)の前記第4標的ハイブリダイズ配列は、(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーと接触させる工程を更に含む、項目95~106のいずれか一項に記載の方法。
(項目108)
前記第3 HAV増幅オリゴマーが、前記第1 HAV増幅オリゴマーについて項目96~100のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目107に記載の方法。(項目109)
前記第4 HAV増幅オリゴマーが、前記第2 HAV増幅オリゴマーについて項目101~106で示されているオリゴマーである、項目107又は108に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目110)
工程(B)の前に、前記試料中の他の構成成分から前記HAV標的核酸を精製する工程を更に含む、項目95~109のいずれか一項に記載されている方法。
(項目111)
前記精製工程が、前記試料を、不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのHAV特異的キャプチャープローブオリゴマーに接触させる工程を含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号52~57からなる群から選択される、項目110に記載の方法。
(項目112)
前記HAV特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号46~51からなる群から選択される配列を有する、項目111に記載の方法。
(項目113)
前記第1又は第2 HAV増幅オリゴマーより上流の前記HAV標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーを更に含む、項目95~112のいずれか一項に記載の方法。
(項目114)
検出工程(D)が、前記HAV増幅産物の存在又は不在が決定される条件において、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記HAV増幅産物に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されているHAV特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のHAVの存在又は不在を示す工程を含む、項目95に記載の方法。
(項目115)
前記HAV特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14~約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号198内のヌクレオチド位置約5965~約6028に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目114に記載の方法。
(項目116)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号178の配列内に包含される、項目115に記載の方法。
(項目117)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号58~74からなる群から選択される、項目116に記載の方法。
(項目118)
前記試料を、前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマーを用いて前記インビトロ核酸増幅反応において増幅され得る擬似標的オリゴマーに接触させて、前記検出反応条件下でHAV特異的検出プローブに対して特異的にハイブリダイズしない第2増幅産物を生成する工程を更に含む、項目114~117のいずれか一項に記載の方法。
(項目119)
前記試料を、前記HAV増幅産物に対してハイブリダイゼーションするための前記HAV特異的検出プローブオリゴマーと競合するコールドプローブオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目114~118のいずれか一項に記載の方法。
(項目120)
前記試料を、前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマー両方に特異的にハイブリダイズするよう構成されたチューナーオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目114~117のいずれか一項に記載の方法。
(項目121)
前記HAV特異的検出プローブが、
(a)化学発光標識、
(b)蛍光標識、
(c)消光剤、並びに
(d)(a)、(b)、及び(c)のうち1つ以上の組み合わせ、からなる群から選択される標識を含む、項目114~120のいずれか一項に記載の方法。
(項目122)
前記検出工程(D)が、前記増幅工程(C)中に起こる、項目114~121のいずれか一項に記載の方法。
(項目123)
前記HAV特異的検出プローブが、蛍光標識、消光剤、又は両方を含む、項目122に記載の方法。
(項目124)
前記HAV特異的検出プローブが、TaqMan検出プローブ又は分子ビーコンである、項目123に記載の方法。
(項目125)
前記HAV特異的検出プローブが、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む、項目114~123のいずれか一項に記載の方法。
(項目126)
前記HAV特異的検出プローブが、ヘアピン検出プローブである、項目125に記載の方法。
(項目127)
前記ヘアピン検出プローブが、分子ビーコン又は分子トーチである、項目126に記載の方法。
(項目128)
工程(C)の前記増幅反応が、等温増幅反応である、項目95~127のいずれか一項に記載の方法。
(項目129)
工程(C)の前記増幅反応が、PCR増幅反応である、項目95~127のいずれか一項に記載の方法。
(項目130)
前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、項目128又は129に記載の方法。(項目131)
前記試料が、一個人患者からのものである、項目52~130のいずれか一項に記載の方法。
(項目132)
前記試料がプールされている、項目52~130のいずれか一項に記載の方法。
(項目133)
前記プールされている試料が、プールされた血漿試料である、項目132に記載の方法。
(項目134)
前記方法が、前記ヒトパルボウイルス標的核酸と前記HAV標的核酸の両方を検出するためのものであり、前記検出工程(D)が、前記パルボウイルス増幅産物及び前記HAV増幅産物の存在又は不在が決定される条件において、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記パルボウイルス増幅産物と前記HAV増幅産物に対してそれぞれ特異的にハイブリダイズするよう構成されている、パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーとHAV特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のパルボウイルス及びHAVの存在又は不在を示す工程を含む、項目52に記載の方法。
(項目135)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーが、区別されて標識される、項目135に記載の方法。
(項目136)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーのそれぞれが、独立して(a)化学発光標識及び(b)蛍光標識からなる群から選択される標識を含む、項目135に記載の方法。
(項目137)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーのそれぞれが、化学発光標識を含む、項目135に記載の方法。
(項目138)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーの前記化学発光標識が、パルボウイルス特異的化学発光信号とHAV特異的化学発光信号との間を区別するのに十分な、異なる発光キネティクスによって特徴付けられる、項目137に記載の方法。
(項目139)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーの化学発光標識のそれぞれが、アクリジニウムエステル(AE)を含む、項目138に記載の方法。
(項目140)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号182の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号179の配列を含む、項目134~139のいずれか一項に記載の方法。
(項目141)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号183の配列を含む、項目140に記載の方法。
(項目142)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号75~80からなる群から選択される配列を有する、項目141に記載の方法。
(項目143)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号184の配列に包含される、項目134~139のいずれか一項に記載の方法。
(項目144)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号81~84からなる群から選択される、項目143に記載の方法。
(項目145)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号185の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号180の配列を含む、項目134~139のいずれか一項に記載の方法。
(項目146)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号82~84からなる群から選択される、項目145に記載の方法。
(項目147)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号187の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む、項目134~146のいずれか一項に記載の方法。
(項目148)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号186の配列を含む、項目147に記載の方法。
(項目149)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号108~113からなる群から選択される、項目148に記載の方法。
(項目150)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号191の配列に包含される、項目134~146のいずれか一項に記載の方法。
(項目151)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号190の配列を含む、項目150に記載の方法。
(項目152)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号118~121からなる群から選択される、項目151に記載の方法。
(項目153)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目134~152のいずれか一項に記載の方法。
(項目154)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目153に記載の方法。
(項目155)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目154に記載の方法。
(項目156)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、配列番号88~93及び98~101からなる群から選択される配列を有する、項目155に記載の方法。
(項目157)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号172の配列に包含される、項目134~156のいずれか一項に記載の方法。
(項目158)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号170の配列を含む、項目157に記載の方法。
(項目159)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1~6及び11からなる群から選択される、項目158に記載の方法。
(項目160)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号171の配列を含む、項目157に記載の方法。
(項目161)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1~6からなる群から選択される、項目160に記載の方法。
(項目162)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号176の配列に包含される、項目134~161のいずれか一項に記載の方法。
(項目163)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号29~38及び45からなる群から選択される、項目162に記載の方法。
(項目164)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目134~163のいずれか一項に記載の方法。
(項目165)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目164に記載の方法。
(項目166)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目165に記載の方法。
(項目167)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、配列番号12~21及び28からなる群から選択される配列を有する、項目166に記載の方法。
(項目168)
前記パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14~約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号199内のヌクレオチド位置約2921~約2966、又はヌクレオチド位置約2921~約3067に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目134~167のいずれか一項に記載の方法。
(項目169)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号194又は195の配列内に包含される、項目168に記載の方法。
(項目170)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号137~169からなる群から選択される、項目169に記載の方法。
(項目171)
前記HAV特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14~約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号198内のヌクレオチド位置約5965~約6028に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目134~170のいずれか一項に記載の方法。
(項目172)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号178の配列内に包含される、項目171に記載の方法。
(項目173)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号58~74からなる群から選択される、項目172に記載の方法。
ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)の、§§ 1.90~1.91、7.37~7.57、9.47~9.51及び11.47~11.57、特に§§
9.50~9.51、11.12~11.13、11.45~11.47及び11.55~11.57)。
is “corresponding to”)」オリゴヌクレオチドとは、その参照されているオリゴ
ヌクレオチドが、参照の核酸配列に十分に類似しており、その結果、オリゴヌクレオチドがその参照の核酸配列と類似のハイブリダイゼーション特性を有するため、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、同じ標的核酸配列とハイブリダイズするであろうことを意味する。当業者には、「対応するオリゴヌクレオチド」が、参照されている配列とは異なり得ること、かつ依然として同じ標的核酸配列にハイブリダイズできることが理解されよう。また、第2核酸に対応する第1核酸には、その補体が含まれ、そのRNA及びDNAが含まれることも理解される。この核酸の変異物は、配列内の同一塩基のパーセンテージ、あるいはプローブ又はプライマーとその標的配列との間の完全な相補性塩基のパーセンテージによって、表現し得る。よって、塩基同一性又は相補性の割合が100%~約80%の場合、オリゴヌクレオチドは参照核酸配列に「対応する」ことになる。好ましい実施形態において、このパーセンテージは100%~約85%である。より好ましい実施形態では、このパーセンテージは100%~約90%であり、他の好ましい実施形態では、このパーセンテージは100%~約95%である。同様に、核酸又は増幅された核酸の領域は、本明細書において、参照核酸配列に対応する、と呼ばれることがある。当業者には、許容できないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを引き起こすことなく、特定の標的配列に対するハイブリダイゼーションを可能にするよう、様々なパーセンテージの相補性で必要になり得るハイブリダイゼーション条件に対する様々な改変が理解されよう。
A型肝炎ウイルス増幅アッセイが、1反応当たり1.25IUのHAVを用い、2つの増幅条件(配列番号2及び配列番号18、又は配列番号2及び配列番号13)のうち1つを用いて、セットアップされた。増幅産物の検出は、分離ゲルと臭化エチジウム染料を使用して実施された。アッセイは、HAV標的のストックの連続希釈物を作製し(National Institute for Biologic Standards and ControlsのWHO First International Standard(NIBSC #00/560、バイアル当たり5E4IU))、次にこの希釈物を96ウェルプレートの別々のウェルに入れてセットアップした。次いで、2つの増幅条件のそれぞれを、希釈物の入った別々のウェルに加えた。等温増幅反応が実施され、反応の終了時に、各反応のアリコートを、別のゲルのウェルに移し、EtBrで染色した。この研究の結果、各増幅条件が、最少1.25IUのA型肝炎ウイルス核酸を検出した。
実施例1と同様にA型肝炎ウイルス増幅アッセイをセットアップしたが、ただし、このアッセイは、異なる希釈物の初期標的キャプチャー工程を含み、増幅産物の検出は検出プローブ(配列番号62)を使用して行った。アッセイは、別個の希釈物それぞれからのHAV標的を最初にキャプチャーし、そのキャプチャーしたHAV標的核酸を96ウェルプレートの別々のウェルに入れてセットアップした。使用した標的キャプチャーオリゴマーは、dT3dA30テール及びK18標的キャプチャー領域を有するオリゴマーのプールからであった。標的キャプチャーオリゴマーの標的キャプチャー領域は、それぞれがG及びU残基の任意の組み合わせを有するよう合成され、これによって、この実施例で使用される標的キャプチャーオリゴマーの母集団は、混合した配列の集合となった。検出工程はエンドポイント検出反応であり、その結果、このアッセイシステムは、少なくとも3.87IU/mLのHAV標的核酸を95%検出した(表1)。
様々な濃度でパルボウイルス遺伝子型1の増幅について複数の増幅オリゴマー組み合わせを試験するため、増幅反応がセットアップされた。この増幅アッセイは、非T7増幅オリゴマーとT7増幅オリゴマーの組み合わせ全てを備えてセットアップされ、これは、配列番号75~87のそれぞれと、配列番号88~99のそれぞれを組み合わせることによって構成されることができ、ここで各組み合わせは単一の非T7と単一のT7のみであった。各増幅オリゴマーは、パルボウイルス遺伝子型1、2及び3を増幅することを目的とした。標的核酸は配列番号203であった。ストック核酸を希釈し、反応プレートウェルに、1反応当たり複製0個、1反応当たり複製10個、1反応当たり複製100個、及び1反応当たり複製100,000個を入れた。プライマーなしの増幅試薬を、概ね上述の通りに調製し、各反応プレートの各ウェルに、1反応当たり複製0個、10個、100個及び100,000個を入れた。上記の非T7及びT7増幅オリゴマーの組み合わせから様々なプライマー条件のものを、これらのプレートの別々のウェルに入れた。増幅反応は等温であり、これには約62℃で10分間、及び約42℃で20分間の初期インキュベーション、次にポリメラーゼ存在下において42℃で50分間増幅を行う工程が含まれた。増幅産物の検出は、配列番号145及びLeader HC照度計を用いて実施された。パルボウイルス複製0個を有するプレートで検出されたRLUは、934RLU~14698RLUであった。1反応当たりパルボウイルス複製10個を有するプレートで検出されたRLUは、2,015RLU~8,040,373RLUであり、組み合わせの半数以上がバックグラウンドを十分に上回る信号を提供した。1反応当たりパルボウイルス複製100個を有するプレートで検出されたRLUは、2,439RLU~8,114,133RLUであった。パルボウイルス複製100,000個を有するプレートで検出されたRLUは、495,680RLU~8,308,252RLUであった。これらのアッセイの結果から、数多くの増幅オリゴマーの組み合わせが、パルボウイルス複製最少10個を増幅するパルボウイルス増幅反応に有用であることが特定された。
パルボウイルス核酸の存在下でA型肝炎ウイルス標的核酸を増幅及び検出する増幅アッセイが実施された。HAV標的核酸は、実施例1に記述されたWHO標準であった。HAV標準の連続希釈物を作製し、各希釈物を96ウェルプレートの別々のウェルに入れた。配列番号200の5E6複製を各ウェルにスパイクした。HAV増幅反応混合物は、配列番号2 & 18を5~10pM/rxn含むよう調製された。エンドポイント検出反応混合物は、1反応当たり5E6RLUの配列番号62を含むよう調製された。増幅反応が実施され、次いで反応を停止し、検出反応を実施した。このアッセイの結果、HAVの複製最少40個を含むウェルで100%、HAVの複製最少20個を含むウェルで90%が、パルボウイルスの5E6複製存在下で検出された。
パルボウイルス遺伝子型1、2及び3の増幅及び検出の定量的アッセイが実施された。パルボウイルス標的核酸は、パルボウイルスB19遺伝子型のWHO International Reference Panelからの核酸であった(NIBSC 99/800、これは遺伝子型1が5.98log10 IU/mL、遺伝子型2が5.94log10 IU/mL、遺伝子型3が5.97log10 IU/mLであり、ここで1IUは各遺伝子型で複製約0.12個である)。パルボウイルス標的核酸は、10,000IU/mL及び1,000IU/mLまで希釈され、各希釈物を別個の96ウェルプレートの別々のウェルに入れた。パルボウイルス増幅オリゴマーは、配列番号91 & 131であった。検出プローブオリゴマーは、配列番号144であった。パルボウイルス競合配列(配列番号197)を、増幅反応混合物にスパイクした。結果を表2に示す。
この定量的増幅及び検出アッセイは、上述の実施例5に従ってセットアップされたが、ただし、10,000IU/lMの標的核酸を、パルボウイルス陰性であると判定された提供者からのヒト血漿中に再懸濁させた。各試料中に検出されるパルボウイルスの予測量は4Log(複製個数/mL)であり、観察平均結果は3.92(±0.059)Log(複製個数/mL)であった。よって、この定量的パルボウイルスアッセイは、ヒト血漿試料中の全てのパルボウイルス標的核酸の増幅及び検出を行い、正確な結果を提供した。
標的特異的標的キャプチャーオリゴマーを使用して、試料から分離された標的核酸に対して、増幅及び検出反応を実施した。A型肝炎ウイルス核酸のキャプチャーについての標的キャプチャーオリゴマーは配列番号46~51であり、パルボウイルス核酸のキャプチャーについての標的キャプチャーオリゴマーは配列番号128~131である。標的キャプチャーオリゴマーは単独で、及び組み合わせて(すなわち、A型肝炎ウイルスを標的とする2つ以上の標的キャプチャーオリゴマー、又はパルボウイルスを標的とする2つ以上の標的キャプチャーオリゴマーを意味する)、標的キャプチャー反応中に使用された。A型肝炎ウイルスシングルプレックス反応について、及びパルボウイルスシングルプレックス反応について、試料及び反応条件は、上述の通りであった。単独及び組み合わせでの特異的標的キャプチャーオリゴマーは、非特異的標的キャプチャー方法に比べ、改善された感度及びキャプチャー効率を示した。
Claims (173)
- 試料中のヒトパルボウイルス標的核酸及びA型肝炎ウイルス(HAV)標的核酸のうち少なくとも1つを検出するためのオリゴマー組み合わせであって、前記オリゴマー組み合わせが、
(I)ヒトパルボウイルス核酸標的領域を増幅するための第1及び第2増幅オリゴマーであって、ここで
(a)前記第1パルボウイルス増幅オリゴマーは、配列番号181の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーは、
(i)配列番号189の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び
(ii)配列番号193の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第2標的ハイブリダイズ配列を含む、第1及び第2増幅オリゴマーと、
並びに/又は
(II)HAV核酸標的領域を増幅するための第1及び第2増幅オリゴマーであって、
ここで
(a)第1 HAV増幅オリゴマーは、配列番号174の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)前記第2 HAV増幅オリゴマーは、配列番号177の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第2標的ハイブリダイズ配列を含む、第1及び第2増幅オリゴマーと、を含む、オリゴマー組み合わせ。 - 前記オリゴマー組み合わせが、(I)の前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマーを含む、請求項1に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号182の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号179の配列を含む、請求項2に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号183又は配列番号117の配列を含む、請求項3に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (I)(a)の前記第1標的ハイブリダイズ配列が、配列番号75~80からなる群から選択される配列を有する、請求項4に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号184の配列に包含される、請求項2に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号81~84からなる群から選択される、請求項6に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号185に包含され、かつ少なくとも配列番号180の配列を含む、請求項2に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号82~84からなる群から選択される、請求項8に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号187の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む、請求項2~9のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号186の配列を含む、請求項10に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号108~113からなる群から選択される、請求項11に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号191の配列に包含される、請求項2~9のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号190の配列を含む、請求項13に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号118~121からなる群から選択される、請求項14に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、請求項2~15のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、請求項16に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、請求項17に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、配列番号88~93及び98~101からなる群から選択される配列を有する、請求項18に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (III)ヒトパルボウイルス核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、ここで
(a)該第3パルボウイルス増幅オリゴマーは、配列番号181の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)第4パルボウイルス増幅オリゴマーは、
(i)配列番号189の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び
(ii)配列番号193の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(III)(a)の前記第3標的ハイブリダイズ配列は、(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(III)(b)の前記第4標的ハイブリダイズ配列は、(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーを更に含む、請求項2~19のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。 - 前記第3パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第1パルボウイルス増幅オリゴマーについて請求項3~9のいずれか一項で示されているオリゴマーである、請求項20に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記第4パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーについて請求項10~19のいずれか一項で示されているオリゴマーである、請求項20又は21に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのパルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーを更に含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号132~135からなる群から選択される、請求項2~22のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記パルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号128~131からなる群から選択される配列を有する、請求項23に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記第1又は第2パルボウイルス増幅オリゴマーより上流の前記パルボウイルス標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーを更に含む、請求項2~24のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 長さ約14~約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのパルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーを更に含み、配列番号199内のヌクレオチド位置約2921~約2966、又はヌクレオチド位置約2921~約3067に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、請求項2~25のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号194又は195の配列内に包含される、請求項26に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号137~169からなる群から選択される、請求項27に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記オリゴマー組み合わせが、(II)の前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマーを含む、請求項1~22のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (II)(a)の前記第1標的ハイブリダイズ配列が、配列番号172の配列に包含される、請求項29に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (II)(a)の前記第1標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号170の配列を含む、請求項30に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1~6及び11からなる群から選択される、請求項31に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号171の配列を含む、請求項30に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1~6からなる群から選択される、請求項33に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号176の配列に包含される、請求項29~34のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号29~38及び45からなる群から選択される、請求項35に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記第2 HAV増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、請求項29~36のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、請求項37に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、請求項38に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記第2 HAV増幅オリゴマーが、配列番号12~21及び28からなる群から選択される配列を有する、請求項39に記載のオリゴマー組み合わせ。
- (IV)HAV核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、ここで
(a)前記第3 HAV増幅オリゴマーは、配列番号174の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)第4 HAV増幅オリゴマーは、配列番号177の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(IV)(a)の前記第3標的ハイブリダイズ配列は、(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(IV)(b)の前記第4標的ハイブリダイズ配列は、(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーを更に含む、請求項29~40のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。 - 前記第3 HAV増幅オリゴマーが、前記第1 HAV増幅オリゴマーについて請求項30~34のいずれか一項で示されているオリゴマーである、請求項41に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記第4 HAV増幅オリゴマーが、前記第2 HAV増幅オリゴマーについて請求項35~40で示されているオリゴマーである、請求項41又は42に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのHAV特異的キャプチャープローブオリゴマーを更に含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号52~57からなる群から選択される、請求項29~43のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記HAV特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号46~51からなる群から選択される配列を有する、請求項44に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記第1又は第2 HAV増幅オリゴマーより上流の前記HAV標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーを更に含む、請求項29~45のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 長さ約14~約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのHAV特異的検出プローブオリゴマーを更に含み、配列番号198内のヌクレオチド位置約5965~約6028に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、請求項29~46のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号178の配列内に包含される、請求項47に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号58~74からなる群から選択される、請求項48に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 請求項1~49のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせを含むキット。
- 請求項1~49のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせを含む反応混合物。
- 試料中のヒトパルボウイルス標的核酸及びA型肝炎ウイルス(HAV)標的核酸のうち少なくとも1つを検出するための方法であって、前記方法が、
(A)ヒトパルボウイルスとHAVのうち少なくとも1つを含むことが疑われる試料を提供する工程と、
(B)該試料を、ヒトパルボウイルス核酸標的領域及びHAV核酸標的領域のうち少なくとも1つを増幅するためのオリゴマー組み合わせに接触させる工程であって、このオリゴマー組み合わせは、
(I)パルボウイルス標的領域について、(a)配列番号181の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含む、第1パルボウイルス増幅オリゴマーと、(b)(i)配列番号189の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び(ii)配列番号193の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第2標的ハイブリダイズ配列を含む第2パルボウイルス増幅オリゴマーと、
並びに/又は
(II)HAV標的領域について、(a)配列番号174の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含む、第1 HAV増幅オリゴマーと、(b)配列番号177の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第2標的ハイブリダイズ配列を含む、第2 HAV増幅オリゴマーと、を含む、工程と、
(C)試料中に存在する任意のパルボウイルス及び/又はHAVの標的核酸が、パルボウイルス及び/又はHAV増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、インビトロ核酸増幅反応を実施する工程と、
(D)パルボウイルス及び/又はHAV増幅産物の存在又は不在を検出することにより、前記試料中のパルボウイルス及び/又はHAVの存在又は不在を示す工程と、を含む、方法。 - 前記方法が、ヒトパルボウイルス標的核酸を検出するためのものであり、前記試料が(I)の前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマーに接触する、請求項52に記載の方法。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号182の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号117又は配列番号179の配列を含む、請求項53に記載の方法。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号183の配列を含む、請求項54に記載の方法。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号75~80からなる群から選択される配列を有する、請求項55に記載の方法。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号184の配列に包含される、請求項53に記載の方法。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号81~84からなる群から選択される、請求項57に記載の方法。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号185の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号180の配列を含む、請求項53に記載の方法。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号82~84からなる群から選択される、請求項59に記載の方法。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号187の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む、請求項53~60のいずれか一項に記載の方法。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号186の配列を含む、請求項61に記載の方法。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号108~113からなる群から選択される、請求項62に記載の方法。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号191の配列に包含される、請求項53~60のいずれか一項に記載の方法。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号190の配列を含む、請求項64に記載の方法。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号118~121からなる群から選択される、請求項65に記載の方法。
- 前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、請求項53~66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、請求項67に記載の方法。
- 前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、請求項68に記載の方法。
- 前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、配列番号88~93及び98~101からなる群から選択される配列を有する、請求項69に記載の方法。
- 工程(B)が、前記試料を、
(III)ヒトパルボウイルス核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、ここで(a)前記第3パルボウイルス増幅オリゴマーは、配列番号181の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)前記第4パルボウイルス増幅オリゴマーは、(i)配列番号189の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び(ii)配列番号193の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(III)(a)の該第3標的ハイブリダイズ配列は、(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(III)(b)の第4標的ハイブリダイズ配列は、(I)(b)の第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーとを接触させる工程を更に含む、請求項53~70のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第3パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第1パルボウイルス増幅オリゴマーについて請求項54~60のいずれか一項で示されているオリゴマーである、請求項71に記載の方法。
- 前記第4パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーについて請求項61~70のいずれか一項で示されているオリゴマーである、請求項71又は72に記載の方法。
- 工程(B)の前に、前記試料中の他の構成成分から前記パルボウイルス標的核酸を精製する工程を更に含む、請求項53~73のいずれか一項に記載されている方法。
- 前記精製工程が、前記試料を、不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのパルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーに接触させる工程を含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号132~135からなる群から選択される、請求項74に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号128~131からなる群から選択される配列を有する、請求項75に記載の方法。
- 工程(B)が、前記試料を、前記第1又は第2パルボウイルス増幅オリゴマーより上流の前記パルボウイルス標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーに接触させる工程を更に含む、請求項53~76のいずれか一項に記載の方法。
- 検出工程(D)が、前記パルボウイルス増幅産物の存在又は不在が決定される条件において、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記パルボウイルス増幅産物に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されているパルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のパルボウイルスの存在又は不在を示す工程を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14~約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号199内のヌクレオチド位置約2921~約2966、又はヌクレオチド位置約2921~約3067に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、請求項78に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号194又は195の配列内に包含される、請求項79に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号137~169からなる群から選択される、請求項80に記載の方法。
- 前記試料を、前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマーを用いて前記インビトロ核酸増幅反応において増幅され得る擬似標的オリゴマーに接触させて、前記検出反応条件下でパルボウイルス特異的検出プローブに対して特異的にハイブリダイズしない第2増幅産物を生成する工程を更に含む、請求項78~81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料を、前記パルボウイルス増幅産物に対してハイブリダイゼーションするための前記パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーと競合するコールドプローブオリゴマーに接触させる工程を更に含む、請求項78~82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料を、前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマー両方に特異的にハイブリダイズするよう構成されたチューナーオリゴマーに接触させる工程を更に含む、請求項78~81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的検出プローブが、
(a)化学発光標識、
(b)蛍光標識、
(c)消光剤、並びに
(d)(a)、(b)、及び(c)のうち1つ以上の組み合わせ、からなる群から選択される標識を含む、請求項78~84のいずれか一項に記載の方法。 - 前記検出工程(D)が、前記増幅工程(C)中に起こる、請求項78~85のいずれか一項に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的検出プローブが、蛍光標識、消光剤、又は両方を含む、請求項86に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的検出プローブが、TaqMan検出プローブ又は分子ビーコンである、請求項87に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的検出プローブが、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む、請求項78~87のいずれか一項に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的検出プローブが、ヘアピン検出プローブである、請求項89に記載の方法。
- 前記ヘアピン検出プローブが、分子ビーコン又は分子トーチである、請求項90に記載の方法。
- 工程(C)の前記増幅反応が、等温増幅反応である、請求項53~91のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(C)の前記増幅反応が、PCR増幅反応である、請求項53~91のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、請求項92又は93に記載の方法。
- 前記方法が、ヒトHAV標的核酸を検出するためのものであり、前記試料が(II)の前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマーに接触する、請求項52に記載の方法。
- (II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号172の配列に包含される、請求項95に記載の方法。
- (II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号170の配列を含む、請求項96に記載の方法。
- (II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1~6及び11からなる群から選択される、請求項97に記載の方法。
- (II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号171の配列を含む、請求項96に記載の方法。
- (II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1~6からなる群から選択される、請求項99に記載の方法。
- (II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号176の配列に包含される、請求項95~100のいずれか一項に記載の方法。
- (II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号29~38及び45からなる群から選択される、請求項101に記載の方法。
- 前記第2 HAV増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、請求項95~102のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、請求項103に記載の方法。
- 前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、請求項104に記載の方法。
- 前記第2 HAV増幅オリゴマーが、配列番号12~21及び28からなる群から選択される配列を有する、請求項105に記載の方法。
- 工程(B)が、前記試料を、
(IV)HAV核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、ここで、(a)前記第3 HAV増幅オリゴマーは、配列番号174の配列に包含される約14~約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、(b)第4 HAV増幅オリゴマーは、配列番号177の配列に包含される約14~約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(IV)(a)の前記第3標的ハイブリダイズ配列は、(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(IV)(b)の前記第4標的ハイブリダイズ配列は、(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーと接触させる工程を更に含む、請求項95~106のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第3 HAV増幅オリゴマーが、前記第1 HAV増幅オリゴマーについて請求項96~100のいずれか一項で示されているオリゴマーである、請求項107に記載の方法。
- 前記第4 HAV増幅オリゴマーが、前記第2 HAV増幅オリゴマーについて請求項101~106で示されているオリゴマーである、請求項107又は108に記載のオリゴマー組み合わせ。
- 工程(B)の前に、前記試料中の他の構成成分から前記HAV標的核酸を精製する工程を更に含む、請求項95~109のいずれか一項に記載されている方法。
- 前記精製工程が、前記試料を、不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのHAV特異的キャプチャープローブオリゴマーに接触させる工程を含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号52~57からなる群から選択される、請求項110に記載の方法。
- 前記HAV特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号46~51からなる群から選択される配列を有する、請求項111に記載の方法。
- 前記第1又は第2 HAV増幅オリゴマーより上流の前記HAV標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーを更に含む、請求項95~112のいずれか一項に記載の方法。
- 検出工程(D)が、前記HAV増幅産物の存在又は不在が決定される条件において、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記HAV増幅産物に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されているHAV特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のHAVの存在又は不在を示す工程を含む、請求項95に記載の方法。
- 前記HAV特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14~約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号198内のヌクレオチド位置約5965~約6028に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、請求項114に記載の方法。
- 前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号178の配列内に包含される、請求項115に記載の方法。
- 前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号58~74からなる群から選択される、請求項116に記載の方法。
- 前記試料を、前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマーを用いて前記インビトロ核酸増幅反応において増幅され得る擬似標的オリゴマーに接触させて、前記検出反応条件下でHAV特異的検出プローブに対して特異的にハイブリダイズしない第2増幅産物を生成する工程を更に含む、請求項114~117のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料を、前記HAV増幅産物に対してハイブリダイゼーションするための前記HAV特異的検出プローブオリゴマーと競合するコールドプローブオリゴマーに接触させる工程を更に含む、請求項114~118のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料を、前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマー両方に特異的にハイブリダイズするよう構成されたチューナーオリゴマーに接触させる工程を更に含む、請求項114~117のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HAV特異的検出プローブが、
(a)化学発光標識、
(b)蛍光標識、
(c)消光剤、並びに
(d)(a)、(b)、及び(c)のうち1つ以上の組み合わせ、からなる群から選択される標識を含む、請求項114~120のいずれか一項に記載の方法。 - 前記検出工程(D)が、前記増幅工程(C)中に起こる、請求項114~121のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HAV特異的検出プローブが、蛍光標識、消光剤、又は両方を含む、請求項122に記載の方法。
- 前記HAV特異的検出プローブが、TaqMan検出プローブ又は分子ビーコンである、請求項123に記載の方法。
- 前記HAV特異的検出プローブが、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む、請求項114~123のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HAV特異的検出プローブが、ヘアピン検出プローブである、請求項125に記載の方法。
- 前記ヘアピン検出プローブが、分子ビーコン又は分子トーチである、請求項126に記載の方法。
- 工程(C)の前記増幅反応が、等温増幅反応である、請求項95~127のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(C)の前記増幅反応が、PCR増幅反応である、請求項95~127のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、請求項128又は129に記載の方法。
- 前記試料が、一個人患者からのものである、請求項52~130のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料がプールされている、請求項52~130のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プールされている試料が、プールされた血漿試料である、請求項132に記載の方法。
- 前記方法が、前記ヒトパルボウイルス標的核酸と前記HAV標的核酸の両方を検出するためのものであり、前記検出工程(D)が、前記パルボウイルス増幅産物及び前記HAV増幅産物の存在又は不在が決定される条件において、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記パルボウイルス増幅産物と前記HAV増幅産物に対してそれぞれ特異的にハイブリダイズするよう構成されている、パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーとHAV特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のパルボウイルス及びHAVの存在又は不在を示す工程を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーが、区別されて標識される、請求項135に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーのそれぞれが、独立して(a)化学発光標識及び(b)蛍光標識からなる群から選択される標識を含む、請求項135に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーのそれぞれが、化学発光標識を含む、請求項135に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーの前記化学発光標識が、パルボウイルス特異的化学発光信号とHAV特異的化学発光信号との間を区別するのに十分な、異なる発光キネティクスによって特徴付けられる、請求項137に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーの化学発光標識のそれぞれが、アクリジニウムエステル(AE)を含む、請求項138に記載の方法。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号182の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号179の配列を含む、請求項134~139のいずれか一項に記載の方法。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号183の配列を含む、請求項140に記載の方法。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号75~80からなる群から選択される配列を有する、請求項141に記載の方法。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号184の配列に包含される、請求項134~139のいずれか一項に記載の方法。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号81~84からなる群から選択される、請求項143に記載の方法。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号185の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号180の配列を含む、請求項134~139のいずれか一項に記載の方法。
- (I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号82~84からなる群から選択される、請求項145に記載の方法。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号187の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む、請求項134~146のいずれか一項に記載の方法。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番
号186の配列を含む、請求項147に記載の方法。 - (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号108~113からなる群から選択される、請求項148に記載の方法。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号191の配列に包含される、請求項134~146のいずれか一項に記載の方法。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号190の配列を含む、請求項150に記載の方法。
- (I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号118~121からなる群から選択される、請求項151に記載の方法。
- 前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、請求項134~152のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、請求項153に記載の方法。
- 前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、請求項154に記載の方法。
- 前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、配列番号88~93及び98~101からなる群から選択される配列を有する、請求項155に記載の方法。
- (II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号172の配列に包含される、請求項134~156のいずれか一項に記載の方法。
- (II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号170の配列を含む、請求項157に記載の方法。
- (II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1~6及び11からなる群から選択される、請求項158に記載の方法。
- (II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号171の配列を含む、請求項157に記載の方法。
- (II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1~6からなる群から選択される、請求項160に記載の方法。
- (II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号176の配列に包含される、請求項134~161のいずれか一項に記載の方法。
- (II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号29~38及び45からなる群から選択される、請求項162に記載の方法。
- 前記第2 HAV増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、請求項134~163のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、請求項164に記載の方法。
- 前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、請求項165に記載の方法。
- 前記第2 HAV増幅オリゴマーが、配列番号12~21及び28からなる群から選択される配列を有する、請求項166に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14~約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号199内のヌクレオチド位置約2921~約2966、又はヌクレオチド位置約2921~約3067に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、請求項134~167のいずれか一項に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号194又は195の配列内に包含される、請求項168に記載の方法。
- 前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号137~169からなる群から選択される、請求項169に記載の方法。
- 前記HAV特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14~約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号198内のヌクレオチド位置約5965~約6028に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、請求項134~170のいずれか一項に記載の方法。
- 前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号178の配列内に包含される、請求項171に記載の方法。
- 前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号58~74からなる群から選択される、請求項172に記載の方法。
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