CN101875942B

CN101875942B - 甲型肝炎病毒基因组全序列

Info

Publication number: CN101875942B
Application number: CN2009100504746A
Authority: CN
Inventors: 张爱晖; 施松明; 周平华; 吴克
Original assignee: Shanghai Zerun Biotech Co Ltd
Current assignee: Yuxi Walvax Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2009-04-30
Filing date: 2009-04-30
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2029-04-30
Also published as: CN101875942A

Abstract

本发明涉及甲型肝炎病毒基因组全序列。更具体地，本发明涉及全序列如SEQ ID NO：1所示的甲型肝炎病毒的基因组序列及其应用。本发明还提供了甲型肝炎病毒特异性的引物和探针。

Description

甲型肝炎病毒基因组全序列

技术领域

本发明涉及病毒基因组学领域。更具体地，本发明涉及甲型肝炎病毒的基因组序列及其应用。

背景技术

甲型肝炎是由甲型肝炎病毒感染人体引起的一种急性肠道传病。甲型肝炎是现已发现的严重影响人类健康的六种病毒性肝炎之一，且感染率为最高。我国是甲型肝炎高流行区，常引起季节性流行。由于该病的高发病率及较长的病程，给人民健康及经济发展带来严重影响。

目前，对于甲型肝炎迄今人们尚无有效的治疗手段，接种疫苗是迄今人类控制该疾病最有效和最经济的措施。

中国专利申请01140508.2公开了一种甲肝病毒中国株和减毒株的培育及互补脱氧核糖核酸序列。然而，甲肝减毒活疫苗存在着明显的缺点，最为突出的是毒力返祖和次传播问题，对接种者及其密切接触者构成潜在的安全隐患。其次，对免疫功能低下或缺陷者高度危险。此外，减毒活疫苗还存在热稳定性差、运输贮存条件要求苛刻等缺点。

因灭活疫苗病毒蛋白纯度高，故免疫效果好，安全性高，这也是发达国家和地区迄今只使用甲肝灭活疫苗的重要原因。此外灭活疫苗是公认制备多价疫苗、联合疫苗的重要环节，而联合疫苗是世界卫生组织(WHO)与各国卫生当局所倡导的疫苗发展方向和策略。

现有的甲肝灭活疫(包括减毒疫苗)的甲肝病毒株所适应的细胞基质均为人二倍体细胞或人成纤维细胞，繁殖效率不高是其共同缺点，而制备灭活疫苗需要大量纯化的病毒抗原，这是甲肝灭活苗制备成本高昂的根本原因。

中国专利申请02106985中公开了一种甲型肝炎病毒株，该病毒株具有在Vero细胞(ATCC NO：CCL-81)上高效稳定增殖的特性，增殖效率是其它甲肝毒株在人二倍体细胞增殖10倍以上，且动物试验已证明该甲肝病毒株YN5具有良好的免疫原性，可以用作生产灭活疫苗的毒种。

然而，目前对于各种类型甲型肝炎病毒的基因组还了解甚少。本领域迫切需要开发类型甲型肝炎病毒的基因组，以便了解不同HAV毒株之间区别以及用于检测应用。

发明内容

本发明的目的就是通过对甲型肝炎病毒基因组进行全序列的测定，为检测HAV、研究HAV感染途径等目的奠定可靠的基础。

在本发明的第一方面，提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子具有或其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其反义序列。

在另一类优选例中，所述的核酸分子是DNA或RNA。

在本发明的第二方面，提供了本发明第一方面中所述的核酸分子的用途，它们被用于制备检测甲型肝炎病毒的引物、探针或试剂盒。

在另一类优选例中，所述的引物长度为15-100个核苷酸。

在另一类优选例中，所述的探针的长度为25-5000个核苷酸。

在另一类优选例中，所述的探针的长度为50-500个核苷酸。

在本发明的第三方面，提供了一种分离的DNA分子，该DNA分子由SEQ IDNO：1所示序列或其反义序列中连续的150-7473个核苷酸所构成。

在另一类优选例中，所述的DNA分子由SEQ ID NO：1所示序列或其反义序列中连续的300-7473个核苷酸所构成。

在另一类优选例中，所述的DNA分子由SEQ ID NO：1所示序列或其反义序列中连续的1000-7473个核苷酸所构成。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次获得了具有在Vero细胞上高效稳定增殖的特性甲肝病毒的全基因组序列。在此基础上，完成了本发明。

总体而言，本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明的基因组全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

第一方面，本发明提供了一核酸，该核酸含有在SEQ ID NO：1所示的甲肝病毒的基因组核苷酸序列。还提供了含有与本文所公开的核苷酸序列有序列相同性的序列的核酸。根据具体的序列，序列相同性的程度宜大于50％(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)。这些序列包括例如突变体和等位基因变体。

本发明还提供了包含本文所公开的一种或多种核苷酸序列片段的核酸。这些片段应包含诸序列中至少n个连续的氨基酸，并且根据具体的序列，n为10或更高(例如，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，50，60，75，100或更高)。较佳地，该片段是甲肝病毒基因组特有的，换言之在其他生物体的基因组中并不存在。更佳地，该片段是甲肝病毒毒株的基因组特有的。本发明还提供了与本文所提供的核酸发生杂交的核酸。杂交条件如本文中所述。

本发明还提供了一核酸，该核酸包含与上述序列互补的序列(例如，用于反义、用于探针、或用于扩增引物)。

当然，本发明的核酸可以用多种方法制备(例如，化学合成、从DNA文库、或从生物体本身制得等)，并可采用各种形式(例如单链、双链、载体、探针、引物等)。术语“核酸”包括DNA和RNA，以及它们的类似物，如含有修饰骨架的那些类似物，还包括肽核酸(PNA)等。

应理解，因为SEQ ID NO：1基本上代表了甲肝病毒的完整基因组。

本发明还提供了含有本发明的核苷酸序列的载体(如表达载体、测序载体、克隆载体等)以及用这些载体转化的宿主细胞。

第二方面，本发明还提供了一种蛋白质，该蛋白质含有本文所示的甲肝病毒核苷酸序列中所编码的氨基酸序列。还提供了含有与这些蛋白质有序列相同性的序列的蛋白。根据具体的序列，序列相同性程度宜大于50％(例如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)。序列相同性用如上所述的方法确定。这些同源蛋白包括本文所示的甲肝病毒核苷酸序列中所编码的突变体和等位基因变体。

本发明还提供了一种蛋白质，该蛋白质含有序列表中所公开的甲肝病毒核苷酸序列中所编码的氨基酸序列片段。这些片段应包含诸序列中至少n个连续的氨基酸，并且根据具体的序列，n为7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20或更高)。这些片段宜包含该序列的表位。

可用各种测试来评估本发明蛋白的体内免疫原性。例如，蛋白质可以重组表达或者化学合成，并通过免疫印迹用于筛选病人的血清。蛋白质与病人血清之间发生阳性反应，就表示病人早已对有关蛋白质产生过免疫应答，即该蛋白是免疫原。该方法可用于鉴别免疫优势蛋白。

本发明还提供了编码本发明蛋白的核酸。

第三方面，本发明还提供了含有本发明核酸的核苷酸序列的计算机、计算机存储器、计算机存储介质(如软盘、硬盘、CD-ROM等)和/或计算机数据库。较佳地，它含有本文列出的一种或多种甲肝病毒核苷酸序列。

这可用于分析本文所列出甲肝病毒核苷酸序列。例如，可用于检索以鉴别序列中的开放阅读框(ORF)或编码序列。

第四方面，本发明提供了鉴别氨基酸序列的方法，它包括步骤：检索本文所列出的甲肝病毒核苷酸序列中推定的开放阅读框或蛋白编码序列。类似地，本发明提供了此处所列出的甲肝病毒核苷酸序列在检索推定的开放阅读框或蛋白质编码序列中的用途。

开放阅读框或蛋白编码序列分析通常在计算机上用标准的生物信息技术进行。用于分析的典型算法或程序包括：ORFFINDER(NCBI)，GENMARK[Borodovsky &McIninch(1993)Computers Chem17：122-133]和GLIMMER[Salzberg et al.(1998)Nucl Acids Res 26：544-548]。

对开放阅读框或蛋白编码序列的检索可包括步骤：检索此处所列出的甲肝病毒核苷酸序列中的起始密码子和检索上游序列中的处于读框中终止密码子。中间的密码子就代表了推定的蛋白编码序列。通常，应检索一个序列中6种可能的读框。

用这种方法鉴别出的氨基酸序列可用任何合适的系统进行表达，以获得蛋白。该蛋白可用于产生抗体，而该抗体识别在鉴别出的氨基酸序列中的表位。这些抗体可用于筛选甲肝病毒，以检测是否存在含所鉴别氨基酸序列的蛋白质。

此外，一旦鉴别出ORF或蛋白编码序列，那么就可将该序列与序列数据库进行比较。序列分析工具可在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)处找到，例如BLAST，BLAST2，BLASTn，BLASTp，tBLASTn，BLASTx，和tBLASTx算法[还可参见Altschul等人.(1997)Gapped BLAST and PSI-BLAST：new generationof protein database search programs.Nucleic Acids Research25：2289-3402]。用于比较的合适数据库包括非冗余GenBank，EMBL，DDBJ和PDB序列，以及非冗余GenBank CDS翻译物，PDB，SwissProt，Spupdate和PIR序列。这种比较可给出蛋白质功能的指示。

氨基酸序列中的疏水区可用以上算法加以预测，例如基于Esposti等人的统计学研究的算法[″膜蛋白亲水性的关键评价″(Critical evaluation of thehydropathy of membrane proteins)(1990)Eur J Biochem 190：207-219]。疏水区代表了潜在的跨膜区或疏水性前导序列，这暗示蛋白质可以被分泌或位于表面。这些特性通常是良好免疫原的标志。

类似地，可用PSORT算法(http://www.psort.nibb.ac.jp)来预测跨膜区或前导序列，以及用MOTIFS程序来预测功能区(GCG Wisconsin & PROSITE)。

本发明还提供了一种核酸，该核酸含有本文所列出的甲肝病毒核苷酸序列中的开放阅读框或蛋白编码序列。此外，基于本发明所提供的基因组序列，还提供了若干种蛋白质，该蛋白质含有所述开放阅读框或蛋白编码序列所编码的氨基酸序列。例如，SEQ ID NO：1中第730-7413位的ORF就编码一个长度为2229个氨基酸的前原蛋白(pre-proprotein)(SEQ ID NO：2)。

第五方面，本发明提供了结合这些蛋白的抗体。它们可能是多克隆的或单克隆的，可用本领域技术人员已知的任何合适方法制得。

本发明的抗体可以以各种不同方式使用，例如用于证实蛋白质的表达，或用于证实蛋白质表达的场所。例如，标记的抗体(如荧光标记以用于FACS(流式细胞分选仪))可以与完整的病毒一起孵育，而在病毒表面上存在标记就证实蛋白质的位置。

第六方面，本发明提供了各种方法。

本发明提供了一种生产本发明的蛋白的方法，该方法包括步骤：在诱导蛋白表达的条件下，培育本发明的宿主细胞。一种方法还可包括化学合成蛋白或化学合成(至少部分合成)核苷酸。

本发明提供了一种检测本发明的多核苷酸的方法，该方法包括下列步骤：(a)在杂交条件下使本发明的核酸探针与生物样品接触，形成双链体；和(b)检测所述双链体。

本发明提供了一种检测本发明的蛋白质的方法，该方法包括下列步骤：(a)在适合形成抗体-抗原复合物的条件下使本发明的抗体和生物样品接触；和(b)检测所述复合物。

第七方面，本发明提供了检测选择性结合于抗原或多肽或蛋白质的抗体的方法，这些抗原或多肽或蛋白质是对甲肝病毒的任何毒种或毒株特异性的，较佳地是对甲肝病毒毒株特异性的，但更佳地是对甲肝病毒特异的。该方法包括步骤：(a)在适合形成抗体-抗原复合物的条件下，使本发明抗原或多肽或蛋白质与生物样品接触；和(b)检测所述复合物。

方法综述

本发明提供了甲肝病毒HAV核苷酸序列、和其所编码的氨基酸序列。利用这些所公开的序列，可以产生核酸探针试验和表达盒及载体。蛋白质还可化学合成。表达载体可以转入宿主细胞以产生蛋白。纯化或分离的多肽可用于产生抗体以检测HAV蛋白。而且，宿主细胞或提取物可用于生物试验以分离促效剂和拮抗剂。此外，利用这些序列，人们可检索以鉴定开放读框(ORF)和鉴定氨基酸序列。蛋白质还可用于免疫原性组合物以及用作疫苗组份。

除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有全面的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验手册》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编.1984)；《转录和翻译》(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)；《动物细胞培养》(R.I.Freshney编，1986)；《固定化细胞和酶》(IRL出版社，1986)；B.Perbal，《分子克隆实用指南》(1984)；《酶学方法》系列丛书(Academic Press，Inc.)，尤其是154和155卷；《哺乳动物细胞的基因转移载体》(J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Mayer和Walker编(1987)，《细胞和分子生物学的免疫化学方法》(Academic Press，London)；Scopes，(1987)《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编1986)。

在本说明书中采用了核苷酸和氨基酸的标准缩写。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请均全部纳入本文作参考。

免疫诊断试验

本发明的甲肝病毒HAV抗原或其抗原性片段，可用于免疫试验来检测抗体水平(或相反，可用抗甲肝病毒抗体来检测抗原水平)。根据明确的免疫试验，可以开发重组抗原，以代替侵入性诊断方法。可检测生物学样品(例如包括血液或血清样品)中的抗甲肝病毒HAV蛋白或其片段的抗体。免疫试验的设计可作很大变化，其各种方案均是本领域中已知的。免疫试验的方案可基于例如竞争性、或直接反应或夹心型试验。方案例如还可采用固体支持物，或可以采用免疫沉淀法。大多数试验涉及采用标记的抗体或多肽；该标记例如可以是荧光标记、化学发光标记、放射活性标记或染料分子。扩增探针信号的试验也是已知的；其例子是采用生物素和亲和素的试验，酶标记的和介导的免疫试验，如ELISA试验。

将合适的材料(包括本发明的组合物)以及进行试验所需的其它试剂和材料(例如合适的缓冲液、盐溶液等)和合适的试验说明书包装到合适的容器中，构成适用于免疫诊断且含有适当标记的试剂的试剂盒。

核酸杂交

“杂交”指两个核酸序列相互之间通过氢键而结合。通常，一个序列固定于固体载体，另一个将游离于溶液内。然后，在有利于形成氢键的条件下使两个序列相互接触。影响这种结合的因素包括：溶剂的类型和体积；反应温度；杂交时间；搅拌；封闭液相序列与固体载体非特异性结合的试剂(Denhardt’s试剂或BLOTTO)；各序列的浓度；是否使用化合物来增加序列结合的速度(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；以及杂交后洗涤条件的严谨程度。见Sambrook等人[同上]第2卷，第9章，9.47至9.57页。

“严谨性”指有利于非常相似的序列结合而不利于不同序列结合的杂交反应条件。例如，应选择温度和盐浓度的组合，使温度比所研究的杂交的Tm计算值低大约120至200℃。温度和盐浓度常可在前期初步实验中通过经验来确定，在初步实验中，固定在滤膜上的基因组DNA样品与感兴趣的序列杂交，然后在不同的严谨度条件下洗涤。见Sambrook等人第9.50页。

在设计杂交实验时，影响核酸杂交的一些因素可以方便地予以改变。杂交和洗涤时的温度以及洗涤时的盐浓度的调节最为简单。随着杂交温度(即严谨度)的升高，不同源的链之间发生杂交的可能性变得更少，结果背景值降低。如果放射性标记的探针并非与固定的片段完全同源(这在基因家族和种间杂交实验中是常见的)，则必须降低杂交温度，而背景值将会增加。洗涤温度以类似的方式影响杂交带的强度和背景值的程度。洗涤的严谨性也随盐浓度的降低而升高。

通常，在50％甲酰胺存在下的方便的杂交温度是：对于靶片段同源性达95％至100％的探针而言，是42℃；对于同源性为90％至95％的探针，为37℃；对于同源性为85％和90％的探针，为32℃。对于较低的同源性，应用上述方程式应相应地降低甲酰胺含量和调节温度。如果探针和靶片段之间的同源性是未知的，则最简单的方法是从非严谨的杂交和洗涤条件开始。如果在放射自显影后发现了非特异性的条带或高背景值，则可在高严谨性下洗涤滤膜，并重新曝光。如果曝光所需时间使得该方法不切实际，则应平行测试几种杂交和/或洗涤严谨性。

核酸探针试验

采用本发明的核酸探针的方法(如PCR、分支DNA探针试验或印迹技术)能确定cDNA或mRNA的存在。如果探针和本发明的序列能形成稳定地足以被检测到的双链体或双链复合物，则称探针与本发明的序列“杂交”。

核酸探针将与本发明的甲肝病毒核苷酸序列(包括有义和反义链)杂交。尽管有许多不同的核苷酸序列编码该氨基酸序列，但是天然的甲肝病毒序列是较佳的，因为它是实际存在于细胞中的序列。mRNA代表一种编码序列，因此探针应与该编码序列互补；单链cDNA与mRNA互补，因此cDNA探针应与非编码序列互补。

探针的确切长度和序列将取决于杂交条件，如温度、盐浓度等。例如，对于诊断应用，根据分析物序列的复杂程度，核酸探针通常含有至少10-20个核苷酸，较佳的15-25个，更佳的至少30个核苷酸，但是也可短于该长度。短的引物通常需要较低温度，以便和模板形成足够稳定的杂交复合物。

探针可用合成方法产生，例如Matteucci等人[J.Am.Chem.Soc.(1981)103：3185]的方法或Urdea等人[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80：7461]的方法，或用市售的自动寡核苷酸合成仪合成。

可以根据偏好选择探针的化学特征。对于某些应用，DNA或RNA是合适的。对于其它的应用，可以加入修饰，例如骨架修饰，如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，可用来增加体内半衰期，改变RNA亲和力，增加核酸酶抗性等[例如参见Agrawal和Iyer(1995)Curr Opin Biotechnol 6：12-19；Agrawal(1996)TIBTECH14：376-387]；还可采用类似物如肽核酸[例如参见Corey(1997)TIBTECH15：224-229；Buchardt等人(1993)TIBTECH11：384-386]。

另外，聚合酶链反应(PCR)是另一个熟知的检测少量靶核酸的手段。该试验在Mullis等人[Meth.Enzymol.(1987)155：335-350]；美国专利4,683,195和4,683,202中有所描述。用两个“引物”核苷酸与靶核酸杂交，并用来引导反应。引物可包含不与扩增靶序列(或其互补序列)杂交的序列，以帮助双链体的稳定性，或例如可插入一个简便的限制性位点。这些序列通常侧接所需的甲肝病毒序列。

利用最初的靶核酸作为模板，热稳定的聚合酶能从引物产生靶核酸的拷贝。在聚合酶产生临界量的靶核酸后，它们可用较传统的方法(如Southern印迹)来检测。当采用Southern印迹方法时，标记的探针将与甲肝病毒序列(如其互补序列)杂交。

另外，mRNA或cDNA也可用Sambrook等人[同上]描述的传统印迹技术来检测。用凝胶电泳可纯化并分离利用聚合酶从mRNA产生的mRNA或cDNA。然后，将凝胶上的核酸印迹到固体载体如硝酸纤维素上。使固体载体与标记的探针接触，然后洗涤除去所有未杂交的探针。然后，检测含有标记探针的双链体。该探针通常用放射活性物质作标记。

基因组序列的应用

基于对甲型肝炎病毒基因组全序列的测定，可以了解与该病毒增殖及重要调控功能有关的基因结构和功能，找到其分子生理机制以及如何侵染宿主的关键点，寻找病毒致病甚至致死基因。

一种应用方法是，用甲型肝炎病毒感染Vero细胞，建立cDNA文库。用双向末端法测定cDNA克隆，或直接对HAV cDNA的文库用PCR扩增的方法进行序列测定。基于本发明所提供的甲型肝炎病毒基因组序列，可以大大方便引物的设计以及克隆的进程。

另一种直接的应用是使用本发明的引物或探针，来检测样品中是否存在甲型肝炎病毒或其遗传物质。

对于探针而言，这种检测方法包括步骤：

将DNA样品与本发明的探针接触，

观察是否形成DNA-探针复合物，形成了复合物就表示样品中存在甲型肝炎病毒或遗传物质。

对于引物而言，这种检测方法包括步骤：

用本发明的特异性引物，对样品进行PCR反应，

观察是否扩增产生了特异性的扩增产物，产生了特异性扩增产物就表示样品中存在甲型肝炎病毒或遗传物质。

在本发明的一个实例中，甲型肝炎病毒的基因组序列是通过如下方法获得的，该方法包括步骤：

1.分离纯化HAV病毒，获取高纯度RNA样品。

2.以此RNA样品为模板，采用“RT-PCR”合成单链cDNA。继续以此cDNA为模板，利用32mer寡核苷酸引物，在Taq和Deep Vent DNA多聚酶的作用下进行PCR扩增，得到7.4k片段

3.将得到的序列输入计算机，利用软件(如Innerpeace软件)进行拼接，再经后期工作得到完整的病毒基因组全序列。

经过多次反复测序，在平均每个碱基测序约6次的基础上获得了如SEQ IDNO：1所示的甲型肝炎病毒基因组全序列。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

病毒RNA的提取

取甲型肝炎病毒株YN5感染Vero细胞，进行超声破碎3～5秒，将细胞破碎。4℃800rpm离心5min后取上清液，进行蔗糖/甘油非连续密度梯度离心，获得高纯度HAV病毒。

逆转录PCR(RT-PCR)

设计并合成引物1：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTAT-3’(SEQ ID NO：3)。取前述制备的RNA病毒5μL置于200μL的PCR扩增专用小管中，加入100pmol的引物1，置于65℃变性10min后，立即置于冰上，加入10×逆转录缓冲液2μL，1mmol/L 4×dNTP，20U RNasin，和50U Expand Reverse Transcriptase，加水至终体积20μL。混匀后42℃温育2h。

PCR扩增

设计并合成以下引物2和引物3。

引物2：5’-TTCAAGAGGGGTCTCCGGGAATTTCCGGAGTC-3’(SEQ ID NO：4)；

引物3：5’-ATTTATTTACTAATAAAAGAAATAAACAAACC-3’(SEQ ID NO：5)。

取上述逆转录产物5μL置于200μL的PCR扩增专用小管内，加入10×PCR缓冲液2μL，350μmol 4×dNTP，350nmol引物2和引物3，8U含Deep Vent的Taq DNA聚合酶，混匀后置PCR仪进行扩增，循环参数：96℃ 2min 1个循环，93℃10s，69℃50s，72℃15min 10个循环；93℃10s，69℃50s，72℃15min(每次增加20s)，30个循环。反应产物取2μL于0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，将大小为7.4Kb的片段割下，然后进行DNA片段的纯化。

连接反应

按如下条件与pUC18质粒进行连接：

10×PCR缓冲液	1ul
		pUC18	0.2ul
DNA	3.3ul
		T4连接酶	0.5ul

转化

取50ul的大肠杆菌DH5α，加入连接反应产物，在冰上放置30分钟。42℃条件下放置1分钟，再进行冰浴1～2分钟。加入250ul 37℃的SOC营养液，摇菌一小时，涂板。

测序

然后，挑取大肠杆菌阳性克隆进行PCR。对PCR产物进行末端双脱氧法法测序。

经过多次反复测序，在平均每个碱基测序约6次的基础上，获得了如SEQ IDNO：1所示的甲型肝炎病毒基因组全序列。

实施例2

对甲型肝炎病毒基因组序列的验证

根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，按每800bp左右长度设计引物，进行PCR反应，对PCR产物进行测序验证。结果表明SEQ ID NO：1的核苷酸序列是正确的。

实施例3

检测甲型肝炎病毒病毒株的试剂盒

基于SEQ ID NO：1中所示的基因组序列，合成以下PCR引物和探针：

有义引物1：序列为SEQ ID NO：1中第1393-1416位。

反义引物2：序列为SEQ ID NO：1中第1537-1560位的互补序列。

探针3：序列为SEQ ID NO：1中第1444-1473位。

制备一试剂盒(检测100次)，它含有：

名称	浓度
		有义引物1	100pmol
反义引物2	100pmol
		探针3	100pmol
PCR反应液	含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液

取甲型肝炎病毒株YN5感染Vero细胞，如实施例1获得甲肝病毒株并通过RT-PCR获得cDNA样品。将该cDNA样品稀释10⁴、10⁵、10⁶和10⁷倍制得样品A、B、C、D，用上述试剂盒进行PCR扩增和杂交检测，同时设置阳性对照和阴性对照。

结果表明，该试剂盒可以检测稀释度为10⁴、10⁵、10⁶和10⁷倍的HAV样品。

此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海泽润生物科技有限公司

<120>甲型肝炎病毒基因组全序列

<130>091191

<160>5

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>7473

<212>DNA

<213>Hepatitis A virus

<220>

<221>CDS

<222>(730)..(7413)

<400>1

ttcaagaggg gtgtccggga atttacggag tccctcttgg aagtccatgg tgaggggact 60

tgatacctca ccgccgtttg cctaggctat aggctaaatt ttccctttcc cttttccctt 120

tcccattccc ttttgcttgt aaatattgat tcctgcaggt tcagggttct taaatctgtt 180

tctctataag aacactcatt ttcacgcttt ctgtcttctt tcttccaggg ctctcccctt 240

gccctaggct ctggccgttg cgcccggcgg ggtcaactcc atgattagca tggagctgta 300

ggagtctaaa ttggggacac agatgtttgg aacgtcacct tgcagtgtta acttggcttt 360

catgaatctc tttgatcttc cacaaggggt aggctacggg tgaaacctct taggctaata 420

cttctatgaa gagatgcctt ggatagggta acagcggcgg atattggtga gttgttaaga 480

caaaaaccat tcaacgccgg aggactggct ctcatccagt ggatgcattg agtgaattga 540

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tggccttaaa tgggatcctg tgagaggggg tccctccatt gccagctgga ctgttctttg 660

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taaataata atg aat atg gcc aaa caa gga att ttc cag act gtt ggg agt 771

Met Asn Met Ala Lys Gln Gly Ile Phe Gln Thr Val Gly Ser

1 5 10

ggc ctt gac cac atc ctg tct ctg gca gac att gag gaa gag caa atg 819

Gly Leu Asp His Ile Leu Ser Leu Ala Asp Ile Glu Glu Glu Gln Met

15 20 25 30

att cag tcc gtt gat agg act gca gtg act ggt gct tct tat ttc act 867

Ile Gln Ser Val Asp Arg Thr Ala Val Thr Gly Ala Ser Tyr Phe Thr

35 40 45

tct gtg gac caa tct tca gtt cac act gct gag gtt ggc tca cat caa 915

Ser Val Asp Gln Ser Ser Val His Thr Ala Glu Val Gly Ser His Gln

50 55 60

att gaa cct ttg aaa acc tct gtt gac aaa cct ggt tct aag aag act 963

Ile Glu Pro Leu Lys Thr Ser Val Asp Lys Pro Gly Ser Lys Lys Thr

65 70 75

cag ggg gag aag ttt ttc ttg att cac tct gct gat tgg ctc act aca 1011

Gln Gly Glu Lys Phe Phe Leu Ile His Ser Ala Asp Trp Leu Thr Thr

80 85 90

cat gct ctt ttt cat gaa gtt gca aaa ttg gat gtg gtg aaa ttg ctg 1059

His Ala Leu Phe His Glu Val Ala Lys Leu Asp Val Val Lys Leu Leu

95 100 105 110

tat aat gag cag ttt gct gtc caa ggc ttg ttg aga tat cat aca tat 1107

Tyr Asn Glu Gln Phe Ala Val Gln Gly Leu Leu Arg Tyr His Thr Tyr

115 120 125

gca aga ttt ggc att gag att caa gtt cag ata aac cct aca ccc ttt 1155

Ala Arg Phe Gly Ile Glu Ile Gln Val Gln Ile Asn Pro Thr Pro Phe

130 135 140

cag caa ggg gga ttg att tgt gcc atg gtt cct ggt gac caa agt tat 1203

Gln Gln Gly Gly Leu Ile Cys Ala Met Val Pro Gly Asp Gln Ser Tyr

145 150 155

ggt tca ata gca tcc ttg act gtt tat cct cat ggt ttg tta aat tgt 1251

Gly Ser Ile Ala Ser Leu Thr Val Tyr Pro His Gly Leu Leu Asn Cys

160 165 170

aac atc aac aat gtt gtt aga ata aag gtt cca ttt att tat act aga 1299

Asn Ile Asn Asn Val Val Arg Ile Lys Val Pro Phe Ile Tyr Thr Arg

175 180 185 190

ggt gct tat cat ttt aaa gat cca cag tac cca gtt tgg gaa tta aca 1347

Gly Ala Tyr His Phe Lys Asp Pro Gln Tyr Pro Val Trp Glu Leu Thr

195 200 205

atc aga gtt tgg tca gag ttg aat att gga aca gga act tca gct tac 1395

Ile Arg Val Trp Ser Glu Leu Asn Ile Gly Thr Gly Thr Ser Ala Tyr

210 215 220

act tca ctt aat gtt tta gct agg ttt aca gat ttg gag tta cat ggg 1443

Thr Ser Leu Asn Val Leu Ala Arg Phe Thr Asp Leu Glu Leu His Gly

225 230 235

tta act cct ctt tct aca cag atg atg aga aat gaa ttc aga gtt agt 1491

Leu Thr Pro Leu Ser Thr Gln Met Met Arg Asn Glu Phe Arg Val Ser

240 245 250

act act gaa aat gtt gta aat ttg tca aat tat gaa gat gca agg gca 1539

Thr Thr Glu Asn Val Val Asn Leu Ser Asn Tyr Glu Asp Ala Arg Ala

255 260 265 270

aaa atg tct ttt gct ttg gat cag gaa gat tgg aag tct gac ccc tct 1587

Lys Met Ser Phe Ala Leu Asp Gln Glu Asp Trp Lys Ser Asp Pro Ser

275 280 285

caa ggt ggt ggg att aga att act cat ttt act act tgg aca tcc att 1635

Gln Gly Gly Gly Ile Arg Ile Thr His Phe Thr Thr Trp Thr Ser Ile

290 295 300

cca act tta gct gcc cag ttt ccg ttt aat gct tca gat tcg gtt ggg 1683

Pro Thr Leu Ala Ala Gln Phe Pro Phe Asn Ala Ser Asp Ser Val Gly

305 310 315

caa caa att aaa gtt att cca gtg gac cca tat ttt ttc cag atg aca 1731

Gln Gln Ile Lys Val Ile Pro Val Asp Pro Tyr Phe Phe Gln Met Thr

320 325 330

aac act aat cct gac caa aaa tgt ata act gct ctg gct tct att tgt 1779

Asn Thr Asn Pro Asp Gln Lys Cys Ile Thr Ala Leu Ala Ser Ile Cys

335 340 345 350

cag atg ttt tgt ttt tgg agg ggt gat ctt gtt ttt gat ttt cag gtt 1827

Gln Met Phe Cys Phe Trp Arg Gly Asp Leu Val Phe Asp Phe Gln Val

355 360 365

ttt cca acc aaa tat cat tca ggt aga tta ttg ttt tgt ttt gtt cct 1875

Phe Pro Thr Lys Tyr His Ser Gly Arg Leu Leu Phe Cys Phe Val Pro

370 375 380

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Gly Asn Glu Leu Ile Asp Val Thr Gly Ile Thr Leu Lys Gln Ala Thr

385 390 395

act gct cct tgt gca gta atg gac att aca gga gtg caa tca acc ttg 1971

Thr Ala Pro Cys Ala Val Met Asp Ile Thr Gly Val Gln Ser Thr Leu

400 405 410

aga ttt cgt gtt cct tgg att tct gat aca ccc tat cga gtg aat agg 2019

Arg Phe Arg Val Pro Trp Ile Ser Asp Thr Pro Tyr Arg Val Asn Arg

415 420 425 430

tat acg aag tcg gca cat caa aaa ggt gag tac act gcc att gga aag 2067

Tyr Thr Lys Ser Ala His Gln Lys Gly Glu Tyr Thr Ala lle Gly Lys

435 440 445

ctt att gtg tac tgt tac aat aga ctg act tct cct tct aat gtt gct 2115

Leu Ile Val Tyr Cys Tyr Asn Arg Leu Thr Ser Pro Ser Asn Val Ala

450 455 460

tct cat gtt aga gtt aat gtt tat ctt tca gca att aat ctg gaa tgt 2163

Ser His Val Arg Val Asn Val Tyr Leu Ser Ala Ile Asn Leu Glu Cys

465 470 475

ttt gct cct ctt tat cat gct atg gat gtt acc aca cag gtt gga gat 2211

Phe Ala Pro Leu Tyr His Ala Met Asp Val Thr Thr Gln Val Gly Asp

480 485 490

gat tca gga ggt ttt tca aca aca gtt tct aca gag cag aat gtc cct 2259

Asp Ser Gly Gly Phe Ser Thr Thr Val Ser Thr Glu Gln Asn Val Pro

495 500 505 510

gat ccc caa gtt ggc ata aca acc atg agg gat cta aaa ggg aaa gcc 2307

Asp Pro Gln Val Gly Ile Thr Thr Met Arg Asp Leu Lys Gly Lys Ala

515 520 525

aac agg gga aag atg gat gtt tca gga gtg caa gca cct gtg gga gct 2355

Asn Arg Gly Lys Met Asp Val Ser Gly Val Gln Ala Pro Val Gly Ala

530 535 540

att aca aca att gag gat cca gtt tta gca aag aaa gtg cct gag aca 2403

Ile Thr Thr Ile Glu Asp Pro Val Leu Ala Lys Lys Val Pro Glu Thr

545 550 555

ttt cct gaa ttg aag cct gga gag tcc aga cat aca tca gat cat atg 2451

Phe Pro Glu Leu Lys Pro Gly Glu Ser Arg His Thr Ser Asp His Met

560 565 570

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Ser Ile Tyr Lys Phe Met Gly Arg Ser His Phe Leu Cys Thr Phe Thr

575 580 585 590

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Phe Asn Ser Asn Asn Lys Glu Tyr Thr Phe Pro Ile Thr Leu Ser Ser

595 600 605

act tct aat cct cct cat ggt tta cca tca aca tta agg tgg ttt ttc 2595

Thr Ser Asn Pro Pro His Gly Leu Pro Ser Thr Leu Arg Trp Phe Phe

610 615 620

aat ttg ttc cag ttg tat aga gga cca ctg gat ttg aca att att atc 2643

Asn Leu Phe Gln Leu Tyr Arg Gly Pro Leu Asp Leu Thr Ile Ile Ile

625 630 635

aca gga gcc act gat gtg gat ggt atg gcc tgg ttc act cca gta ggc 2691

Thr Gly Ala Thr Asp Val Asp Gly Met Ala Trp Phe Thr Pro Val Gly

640 645 650

ctt gct gtc gac acc cct tgg gtg gaa aag gag tca gct ttg tct att 2739

Leu Ala Val Asp Thr Pro Trp Val Glu Lys Glu Ser Ala Leu Ser Ile

655 660 665 670

gat tac aaa act gct ctt gga gct gtt aga ttt aat aca aga aga aca 2787

Asp Tyr Lys Thr Ala Leu Gly Ala Val Arg Phe Asn Thr Arg Arg Thr

675 680 685

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Gly Asn Ile Gln Ile Arg Leu Pro Trp Tyr Ser Tyr Leu Tyr Ala Val

690 695 700

tct gga gca ctg gat ggc ttg gga gat aaa aca gat tct aca ttt gga 2883

Ser Gly Ala Leu Asp Gly Leu Gly Asp Lys Thr Asp Ser Thr Phe Gly

705 710 715

ttg gtt tct att cag att gca aat tac aat cat tct gat gaa tat ttg 2931

Leu Val Ser Ile Gln Ile Ala Asn Tyr Asn His Ser Asp Glu Tyr Leu

720 725 730

tcc ttt agt tgt tat ttg tct gtt aca gaa caa tca gag ttc tat ttt 2979

Ser Phe Ser Cys Tyr Leu Ser Val Thr Glu Gln Ser Glu Phe Tyr Phe

735 740 745 750

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Pro Arg Ala Pro Leu Asn Ser Asn Ala Met Leu Ser Thr Glu Ser Met

755 760 765

atg agc aga att gca gct ggg gac ttg gag tca tcg gtg gat gat cct 3075

Met Ser Arg Ile Ala Ala Gly Asp Leu Glu Ser Ser Val Asp Asp Pro

770 775 780

aga tca gag gag gac aga aga ttt gag agt cat ata gaa tgt agg aaa 3123

Arg Ser Glu Glu Asp Arg Arg Phe Glu Ser His Ile Glu Cys Arg Lys

785 790 795

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Pro Tyr Lys Glu Leu Arg Leu Glu Val Gly Lys Gln Arg Leu Lys Tyr

800 805 810

gct cag gaa gaa ttg tca aat gaa gtg ctt cca cct cct agg aaa atg 3219

Ala Gln Glu Glu Leu Ser Asn Glu Val Leu Pro Pro Pro Arg Lys Met

815 820 825 830

aaa ggg cta ttt tca caa gct aaa att tct ctt ttc tat act gag gag 3267

Lys Gly Leu Phe Ser Gln Ala Lys Ile Ser Leu Phe Tyr Thr Glu Glu

835 840 845

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His Glu Ile Met Lys Phe Ser Trp Arg Gly Val Thr Ala Asp Thr Arg

850 855 860

gct ttg aga aga ttt gga ttc tct atg gct gct ggt aga agt gtg tgg 3363

Ala Leu Arg Arg Phe Gly Phe Ser Met Ala Ala Gly Arg Ser Val Trp

865 870 875

act ctt gag atg gat gct gga gtt ctt act gga aga ttg gtc aga ttg 3411

Thr Leu Glu Met Asp Ala Gly Val Leu Thr Gly Arg Leu Val Arg Leu

880 885 890

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Asn Asp Glu Lys Trp Thr Glu Met Lys Asp Asp Lys Ile Val Ser Leu

895 900 905 910

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Val Glu Lys Phe Thr Ser Asn Lys Tyr Trp Ser Lys Val Asn Phe Pro

915 920 925

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His Gly Met Leu Asp Leu Glu Glu Lle Ala Ala Asn Ser Lys Asp Phe

930 935 940

cca aat atg tct gag aca gat ttg tgt ttc ctg ttg cat tgg ttg aat 3603

Pro Asn Met Ser Glu Thr Asp Leu Cys Phe Leu Leu His Trp Leu Asn

945 950 955

cca aag aaa atc aat tta gca aat aga atg ctt gga ttg tct gga gtg 3651

Pro Lys Lys Ile Asn Leu Ala Asn Arg Met Leu Gly Leu Ser Gly Val

960 965 970

cag gaa att aaa gaa cag ggt gtt gga ttg ata gca gag tgc aga act 3699

Gln Glu Ile Lys Glu Gln Gly Val Gly Leu Ile Ala Glu Cys Arg Thr

975 980 985 990

ttc ttg gat tct att gct ggg act ctg aaa tcc atg atg ttt gga ttt 3747

Phe Leu Asp Ser Ile Ala Gly Thr Leu Lys Ser Met Met Phe Gly Phe

995 1000 1005

cat cat tct gtg act gtt gaa att ata aat act gta ctt tgt ttt 3792

His His Ser Val Thr Val Glu Ile Ile Asn Thr Val Leu Cys Phe

1010 1015 1020

gtt aag agt gga att ctg ctc tat gtc ata caa caa ttg aac caa 3837

Val Lys Ser Gly Ile Leu Leu Tyr Val Ile Gln Gln Leu Asn Gln

1025 1030 1035

gat gag cac tcc cac ata att ggt ttg ttg aga gtt atg aat tat 3882

Asp Glu His Ser His Ile Ile Gly Leu Leu Arg Val Met Asn Tyr

1040 1045 1050

gca gac att ggc tgc tca gtt att tca tgt ggc aaa gtt ttt tct 3927

Ala Asp Ile Gly Cys Ser Val Ile Ser Cys Gly Lys Val Phe Ser

1055 1060 1065

aaa atg tta gaa aca gtt ttt aat tgg caa atg gac tcc aga atg 3972

Lys Met Leu Glu Thr Val Phe Asn Trp Gln Met Asp Ser Arg Met

1070 1075 1080

atg gag ctg aga act cag agc ttt tcc aac tgg tta aga gac att 4017

Met Glu Leu Arg Thr Gln Ser Phe Ser Asn Trp Leu Arg Asp Ile

1085 1090 1095

tgt tca gga att act att ttt aaa agt ctt aag gat gcc ata tat 4062

Cys Ser Gly Ile Thr Ile Phe Lys Ser Leu Lys Asp Ala Ile Tyr

1100 1105 1110

tgg cta tat aca aaa ttg aag gat ttt tat gaa gta aac tat ggc 4107

Trp Leu Tyr Thr Lys Leu Lys Asp Phe Tyr Glu Val Asn Tyr Gly

1115 1120 1125

aag aag aag gat gtt ctt aat att ctt aaa gac aac cag caa aaa 4152

Lys Lys Lys Asp Val Leu Asn Ile Leu Lys Asp Asn Gln Gln Lys

1130 1135 1140

att gaa aaa gcc att gaa gaa gca gac aat ttt tgc att ttg caa 4197

Ile Glu Lys Ala Ile Glu Glu Ala Asp Asn Phe Cys Ile Leu Gln

1145 1150 1155

att caa gat gta gag aga ttt gat cag tat cag aaa ggg gtt gat 4242

Ile Gln Asp Val Glu Arg Phe Asp Gln Tyr Gln Lys Gly Val Asp

1160 1165 1170

tta ata caa aaa ctg agg act gtt cat tca atg gct caa gtt gac 4287

Leu Ile Gln Lys Leu Arg Thr Val His Ser Met Ala Gln Val Asp

1175 1180 1185

cct aac ctt ggg gtt cat ttg tca cct ctt aga gat tgc ata gcc 4332

Pro Asn Leu Gly Val His Leu Ser Pro Leu Arg Asp Cys Ile Ala

1190 1195 1200

aga gtc cac caa aag ctc aag aat ctt gga tct ata aat cag gcc 4377

Arg Val His Gln Lys Leu Lys Asn Leu Gly Ser Ile Asn Gln Ala

1205 1210 1215

atg gtg aca agg tgt gag cca gtt gtt tgc tat tta tat ggc aaa 4422

Met Val Thr Arg Cys Glu Pro Val Val Cys Tyr Leu Tyr Gly Lys

1220 1225 1230

aga gga gga ggg aaa agt ttg act tta att gca ttg gca acc aaa 4467

Arg Gly Gly Gly Lys Ser Leu Thr Leu Ile Ala Leu Ala Thr Lys

1235 1240 1245

att tgt aaa cac tat ggt gtt gaa cct gag aaa aat att tac act 4512

Ile Cys Lys His Tyr Gly Val Glu Pro Glu Lys Asn Ile Tyr Thr

1250 1255 1260

aaa cct gtg gcc tca gac tat tgg gat ggt tac agt gga caa ttg 4557

Lys Pro Val Ala Ser Asp Tyr Trp Asp Gly Tyr Ser Gly Gln Leu

1265 1270 1275

gtt tgc att att gat gat att ggc caa aat aca aca gat gaa gat 4602

Val Cys Ile Ile Asp Asp Ile Gly Gln Asn Thr Thr Asp Glu Asp

1280 1285 1290

tgg tca gat ttt tgt caa tta gtg tca gga tgt cca atg aga ttg 4647

Trp Ser Asp Phe Cys Gln Leu Val Ser Gly Cys Pro Met Arg Leu

1295 1300 1305

aac atg gct tct ctt gag gag aag ggc aga cat ttt tcc tct cct 4692

Asn Met Ala Ser Leu Glu Glu Lys Gly Arg His Phe Ser Ser Pro

1310 1315 1320

ttt ata ata gca act tca aat tgg tca aat cca agt cca aaa aca 4737

Phe Ile Ile Ala Thr Ser Asn Trp Ser Asn Pro Ser Pro Lys Thr

1325 1330 1335

gtt tat gtt aag gaa gca att gat cgt agg ctt cat ttc aag gtt 4782

Val Tyr Val Lys Glu Ala Ile Asp Arg Arg Leu His Phe Lys Va1

1340 1345 1350

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Glu VaI Lys Pro Ala Ser Phe Phe Lys Asn Pro His Asn Asp Met

1355 1360 1365

tta aat gtt aat ttg gct aaa aca aat gat gca ata aag gat atg 4872

Leu Asn Val Asn Leu Ala Lys Thr Asn Asp Ala Ile Lys Asp Met

1370 1375 1380

tct tgt gtt gat cta gta atg gat gga cat aat atc tca ttg atg 4917

Ser Cys Val Asp Leu Val Met Asp Gly His Asn Ile Ser Leu Met

1385 1390 1395

gat tta ctt agt tct tta gta atg aca gtt gaa att agg aag caa 4962

Asp Leu Leu Ser Ser Leu Val Met Thr Val Glu Ile Arg Lys Gln

1400 1405 1410

aat atg agt gaa ttc atg gag ttg tgg tcc cag gga atc tca gat 5007

Asn Met Ser Glu Phe Met Glu Leu Trp Ser Gln Gly Ile Ser Asp

1415 1420 1425

gat gac aat gat agt gca gta gct gag ttt ttc caa tct ttt cca 5052

Asp Asp Asn Asp Ser Ala Val Ala Glu Phe Phe Gln Ser Phe Pro

1430 1435 1440

tct ggt gaa cca tca aat tcc aaa tta tct agt ttt ttc caa tct 5097

Ser Gly Glu Pro Ser Asn Ser Lys Leu Ser Ser Phe Phe Gln Ser

1445 1450 1455

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Val Thr Asn His Lys Trp Val Ala Val Gly Ala Ala Val Gly Ile

1460 1465 1470

ctt gga gtg ctt gtg gga gga tgg ttt gtg tac aag cat ttc tcc 5187

Leu Gly Val Leu Val Gly Gly Trp Phe Val Tyr Lys His Phe Ser

1475 1480 1485

cgc aaa gag gaa gaa cca att cca gct gaa ggg gtt tat cat ggt 5232

Arg Lys Glu Glu Glu Pro Ile Pro Ala Glu Gly Val Tyr His Gly

1490 1495 1500

gtg act aag ccc aaa cag gtg att aaa ttg gat gca gat cca gta 5277

Val Thr Lys Pro Lys Gln Val Ile Lys Leu Asp Ala Asp Pro Val

1505 1510 1515

gag tct cag tca act tta gaa ata gca gga tta gtt agg aaa aat 5322

Glu Ser Gln Ser Thr Leu Glu Ile Ala Gly Leu Val Arg Lys Asn

1520 1525 1530

ttg gtt cag ttt gga gtt ggg gag aaa aat gga tgt gtg aga tgg 5367

Leu Val Gln Phe Gly Val Gly Glu Lys Asn Gly Cys Val Arg Trp

1535 1540 1545

gtt atg aat gcc tta gga gtg aag gat gat tgg tta tta gta cct 5412

Val Met Asn Ala Leu Gly Val Lys Asp Asp Trp Leu Leu Val Pro

1550 1555 1560

tct cat gct tat aaa ttt gaa aag gat tat gaa atg atg gag ttc 5457

Ser His Ala Tyr Lys Phe Glu Lys Asp Tyr Glu Met Met Glu Phe

1565 1570 1575

tat ttc aat aga ggt gga act tac tat tca att tca gct ggc aat 5502

Tyr Phe Asn Arg Gly Gly Thr Tyr Tyr Ser Ile Ser Ala Gly Asn

1580 1585 1590

ggt ggt att caa tct tta gat gtg ggg ttt caa gat gtt gtt cta 5547

Gly Gly Ile Gln Ser Leu Asp Val Gly Phe Gln Asp Val Val Leu

1595 1600 1605

atg aag gtt cct aca att ccc aag ttt aga gat att act caa cat 5592

Met Lys Val Pro Thr Ile Pro Lys Phe Arg Asp Ile Thr Gln His

1610 1615 1620

ttt att aag aaa gga gat gta cct aga gcc ttg aat cgc ttg gca 5637

Phe Ile Lys Lys Gly Asp Val Pro Arg Ala Leu Asn Arg Leu Ala

1625 1630 1635

aca tta gtg aca act gtt aat gga act cct atg tta att tct gag 5682

Thr Leu Val Thr Thr Val Asn Gly Thr Pro Met Leu Ile Ser Glu

1640 1645 1650

gga cca tta aag atg gag gag aag gcc acc tat gtt cat aag aag 5727

Gly Pro Leu Lys Met Glu Glu Lys Ala Thr Tyr Val His Lys Lys

1655 1660 1665

aat gat ggt acc aca gtt gat tta act gtt gat cag gca tgg aga 5772

Asn Asp Gly Thr Thr Val Asp Leu Thr Val Asp Gln Ala Trp Arg

1670 1675 1680

gga aaa ggt gaa ggt ctt cct gga atg tgt ggt ggg gcc ttg gtg 5817

Gly Lys Gly Glu Gly Leu Pro Gly Met Cys Gly Gly Ala Leu Val

1685 1690 1695

tca tca aat cag tcc ata cag aat gca att ttg ggt att cat gtt 5862

Ser Ser Asn Gln Ser Ile Gln Asn Ala Ile Leu Gly Ile His Val

1700 1705 1710

gct gga gga aat tca att ctt gtg gca aag ttg gtt act caa gaa 5907

Ala Gly Gly Asn Ser Ile Leu Val Ala Lys Leu Val Thr Gln Glu

1715 1720 1725

atg ttt caa aac att gat aag aaa att gaa agt cag aga ata atg 5952

Met Phe Gln Asn Ile Asp Lys Lys Ile Glu Ser Gln Arg Ile Met

1730 1735 1740

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Lys Val Glu Phe Thr Gln Cys Ser Met Asn Val Val Ser Lys Thr

1745 1750 1755

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Leu Phe Lys Lys Ser Pro Ile His His His Ile Asp Lys Thr Met

1760 1765 1770

att aat ttt cct gca gct atg cct ttt tct aaa gct gaa att gat 6087

Ile Asn Phe Pro Ala Ala Met Pro Phe Ser Lys Ala Glu Ile Asp

1775 1780 1785

cca atg gct gtg atg ttg tct aaa tat tca tta cct att gtg gaa 6132

Pro Met Ala Val Met Leu Ser Lys Tyr Ser Leu Pro Ile Val Glu

1790 1795 1800

gaa cca gag gat tac aaa gaa gct tca gtt ttt tat caa aat aaa 6177

Glu Pro Glu Asp Tyr Lys Glu Ala Ser Val Phe Tyr Gln Asn Lys

1805 1810 1815

ata gta ggc aag act cag tta gtt gat gac ttt cta gat ctt gat 6222

Ile Val Gly Lys Thr Gln Leu Val Asp Asp Phe Leu Asp Leu Asp

1820 1825 1830

atg gct att aca ggg gct cca ggc att gat gct att aat atg gat 6267

Met Ala Ile Thr Gly Ala Pro Gly Ile Asp Ala Ile Asn Met Asp

1835 1840 1845

tca tct tct ggg ttt cct tat gtt caa gaa aaa ttg acc aaa aga 6312

Ser Ser Ser Gly Phe Pro Tyr Val Gln Glu Lys Leu Thr Lys Arg

1850 1855 1860

gat tta att tgg ttg gat gaa aat ggt ttg ctg cta gga gtt cat 6357

Asp Leu Ile Trp Leu Asp Glu Asn Gly Leu Leu Leu Gly Val His

1865 1870 1875

cca aga ttg gcc cag aga att tta ttt aat act gtt atg atg gaa 6402

Pro Arg Leu Ala Gln Arg Ile Leu Phe Asn Thr Val Met Met Glu

1880 1885 1890

aat tgt tct gac cta gat gtt gtt ttc aca act tgt cca aaa gat 6447

Asn Cys Ser Asp Leu Asp Val Val Phe Thr Thr Cys Pro Lys Asp

1895 1900 1905

gaa ttg aga cca ttg gag aaa gtt ttg gaa tca aaa aca aga gca 6492

Glu Leu Arg Pro Leu Glu Lys Val Leu Glu Ser Lys Thr Arg Ala

1910 1915 1920

att gat gct tgt cct ttg gat tat aca att cta tgc cga atg tac 6537

Ile Asp Ala Cys Pro Leu Asp Tyr Thr Ile Leu Cys Arg Met Tyr

1925 1930 1935

tgg ggt cca gct att agt tat ttt cat ctg aat cca ggg ttt cat 6582

Trp Gly Pro Ala Ile Ser Tyr Phe His Leu Asn Pro Gly Phe His

1940 1945 1950

aca ggt gtt gct att ggc ata gat cct gat aga cag tgg gat gaa 6627

Thr Gly Val Ala Ile Gly Ile Asp Pro Asp Arg Gln Trp Asp Glu

1955 1960 1965

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Leu Phe Lys Thr Met Ile Arg Phe Gly Asp Val Gly Leu Asp Leu

1970 1975 1980

gat ttt tcc gct ttt gat gct agt ctt agt cca ttc atg att agg 6717

Asp Phe Ser Ala Phe Asp Ala Ser Leu Ser Pro Phe Met Ile Arg

1985 1990 1995

gag gcg ggt aga att atg agt gaa tta tct gga aca cca tct cat 6762

Glu Ala Gly Arg Ile Met Ser Glu Leu Ser Gly Thr Pro Ser His

2000 2005 2010

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Phe Gly Thr Ala Leu Ile Asn Thr Ile Ile Tyr Ser Lys His Leu

2015 2020 2025

ctg tat aat tgt tgt tat cat gtt tgt ggt tca atg cct tct ggg 6852

Leu Tyr Asn Cys Cys Tyr His Val Cys Gly Ser Met Pro Ser Gly

2030 2035 2040

tct cct tgt aca gct ttg ttg aat tca att att aac aac att aat 6897

Ser Pro Cys Thr Ala Leu Leu Asn Ser Ile Ile Asn Asn Ile Asn

2045 2050 2055

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Leu Tyr Tyr Val Phe Ser Lys Ile Phe Gly Lys Ser Pro Val Phe

2060 2065 2070

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Phe Cys Gln Ala Leu Arg Ile Leu Cys Tyr Gly Glu Asp Val Leu

2075 2080 2085

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Ile Val Phe Ser Arg Asp Val Gln Ile Asp Asn Leu Asp Leu Ile

2090 2095 2100

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Gly Gln Lys Ile Val Asp Glu Phe Lys Lys Leu Gly Met Thr Ala

2105 2110 2115

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Thr Ser Ala Asp Lys Asn Val Pro Gln Leu Lys Pro Val Ser Glu

2120 2125 2130

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Leu Thr Phe Leu Lys Arg Ser Phe Asn Leu Val Glu Asp Arg Ile

2135 2140 2145

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Arg Pro Ala Ile Ser Glu Lys Thr Ile Trp Ser Leu Ile Thr Trp

2150 2155 2160

cag aga agt aac gct gag ttt gag cag aac tta gaa aat gct cag 7257

Gln Arg Ser Asn Ala Glu Phe Glu Gln Asn Leu Glu Asn Ala Gln

2165 2170 2175

tgg ttt gcc ttt atg cat ggc tat gag ttt tat cag aaa ttt tat 7302

Trp Phe Ala Phe Met His Gly Tyr Glu Phe Tyr Gln Lys Phe Tyr

2180 2185 2190

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Tyr Phe Gly Gln Ser Cys Leu Glu Lys Glu Met Ile Glu Tyr Arg

2195 2200 2205

ctt aaa tct tat gat tgg tgg aga atg aga ttt tat gac cag tgt 7392

Leu Lys Ser Tyr Asp Trp Trp Arg Met Arg Phe Tyr Asp Gln Cys

2210 2215 2220

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Phe Ile Cys Asp Leu Ser

2225

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<210>2

<211>2227

<212>PRT

<213>Hepatitis A virus

<400>2

Met Asn Met Ala Lys Gln Gly Ile Phe Gln Thr Val Gly Ser Gly Leu

1 5 10 15

Asp His Ile Leu Ser Leu Ala Asp Ile Glu Glu Glu Gln Met Ile Gln

20 25 30

Ser Val Asp Arg Thr Ala Val Thr Gly Ala Ser Tyr Phe Thr Ser Val

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Asp Gln Ser Ser Val His Thr Ala Glu Val Gly Ser His Gln Ile Glu

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Glu Lys Phe Phe Leu Ile His Ser Ala Asp Trp Leu Thr Thr His Ala

85 90 95

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100 105 110

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165 170 175

Asn Asn Val Val Arg Ile Lys Val Pro Phe Ile Tyr Thr Arg Gly Ala

180 185 190

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195 200 205

Val Trp Ser Glu Leu Asn Ile Gly Thr Gly Thr Ser Ala Tyr Thr Ser

210 215 220

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Ser Ala Phe Asp Ala Ser Leu Ser Pro Phe Met Ile Arg Glu Ala

1985 1990 1995

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2000 2005 2010

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2015 2020 2025

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<212>DNA

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<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>5

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Claims

1.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO:1所示或其反义序列，且所述核酸分子来源于甲肝病毒株YN5。

2.一种权利要求1所述的核酸分子的用途，其特征在于，用于制备检测甲型肝炎病毒的引物、探针或试剂盒。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的引物长度为15-100个核苷酸。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的探针的长度为25-5000个核苷酸。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的探针的长度为50-500个核苷酸。