ES2945966T3 - Composiciones y procedimiento para detectar ácido nucleico del parvovirus humano y ácido nucleico del virus de la hepatitis A - Google Patents
Composiciones y procedimiento para detectar ácido nucleico del parvovirus humano y ácido nucleico del virus de la hepatitis A Download PDFInfo
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Abstract
Se describe una combinación de oligómeros para detectar un ácido nucleico diana de parvovirus humano y un ácido nucleico diana de virus de la hepatitis A (VHA) en una muestra, comprendiendo dicha combinación de oligómeros: (I) oligómeros de amplificación primero y segundo para amplificar un ácido nucleico diana de parvovirus humano región, en la que (a) el primer oligómero de amplificación de parvovirus comprende una primera secuencia de hibridación de la diana que es de aproximadamente 14 a aproximadamente 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 181 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 179 o SEQ ID NO: 180; y (b) el segundo oligómero de amplificación de parvovirus comprende una segunda secuencia de hibridación de diana seleccionada del grupo que consiste en (i) una secuencia que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 189 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 188; y (ii) una secuencia que es de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 193 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 192; y (II) oligómeros de amplificación primero y segundo para amplificar una región diana de ácido nucleico de VHA, en el que (a) el primer oligómero de amplificación de VHA comprende una primera secuencia de hibridación de diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 174 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 173; y (b) el segundo oligómero de amplificación de HAV comprende una segunda secuencia de hibridación de la diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 175. 188; y (ii) una secuencia que es de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 193 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 192; y (II) oligómeros de amplificación primero y segundo para amplificar una región diana de ácido nucleico de VHA, en el que (a) el primer oligómero de amplificación de VHA comprende una primera secuencia de hibridación de diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 174 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 173; y (b) el segundo oligómero de amplificación de HAV comprende una segunda secuencia de hibridación de la diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 175. 188; y (ii) una secuencia que es de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 193 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 192; y (II) oligómeros de amplificación primero y segundo para amplificar una región diana de ácido nucleico de VHA, en el que (a) el primer oligómero de amplificación de VHA comprende una primera secuencia de hibridación de diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 174 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 173; y (b) el segundo oligómero de amplificación de HAV comprende una segunda secuencia de hibridación de la diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 175. 193 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 192; y (II) oligómeros de amplificación primero y segundo para amplificar una región diana de ácido nucleico de VHA, en el que (a) el primer oligómero de amplificación de VHA comprende una primera secuencia de hibridación de diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 174 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 173; y (b) el segundo oligómero de amplificación de HAV comprende una segunda secuencia de hibridación de la diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 175. 193 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 192; y (II) oligómeros de amplificación primero y segundo para amplificar una región diana de ácido nucleico de VHA, en el que (a) el primer oligómero de amplificación de VHA comprende una primera secuencia de hibridación de diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 174 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 173; y (b) el segundo oligómero de amplificación de HAV comprende una segunda secuencia de hibridación de la diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 175. en el que (a) el primer oligómero de amplificación del VHA comprende una primera secuencia de hibridación de la diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 174 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 173; y (b) el segundo oligómero de amplificación de HAV comprende una segunda secuencia de hibridación de la diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 175. en el que (a) el primer oligómero de amplificación del VHA comprende una primera secuencia de hibridación de la diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 174 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 173; y (b) el segundo oligómero de amplificación de HAV comprende una segunda secuencia de hibridación de la diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 175. 173; y (b) el segundo oligómero de amplificación de HAV comprende una segunda secuencia de hibridación de la diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 175. 173; y (b) el segundo oligómero de amplificación de HAV comprende una segunda secuencia de hibridación de la diana que tiene de aproximadamente 14 a aproximadamente 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye al menos la secuencia de SEQ ID NO: 175. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimiento para detectar ácido nucleico del parvovirus humano y ácido nucleico del virus de la hepatitis A
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reclama el beneficio de prioridad bajo 35 U.S.C. §119 de la Patente US61/508,597 presentada el 15 de julio de 2011.
SECTOR DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones de diagnóstico para detectar un agente infeccioso humano y, de manera específica, se refiere a procedimientos y composiciones para detectar in vitro el ácido nucleico de los genotipos 1,2 y 3 del parvovirus humano y el virus de la hepatitis A.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Empresas como Grifols, Baxter y CSL purifican a partir de plasma humano una serie de proteínas terapéuticas, entre las que se incluyen factores de coagulación, inmunoglobulina (IV1G) y albúmina. Es importante realizar pruebas de parvovirus B19 y HAV dado que son virus sin envoltura, lo que los hace resistentes a la inactivación durante el proceso de purificación (fraccionamiento). Solo se permite que existan niveles relativamente bajos de B19 en una fracción de plasma (las regulaciones actuales requieren menos de 10.000 UI en un lote de fabricación que puede contener de 4.000 a 5.000 unidades de plasma individuales). En lugar de correr el riesgo de agrupar un lote de fabricación grande y posteriormente descubrir que está contaminado con B19, los fraccionadores de plasma, normalmente, analizan lotes más pequeños para identificar unidades de plasma individuales que contienen títulos elevados de B19. Actualmente no existen regulaciones relacionadas con el HAV, pero de manera general, se realizan las pruebas porque éstas se han convertido en un estándar de la industria.
El parvovirus humano (género Erythrovirus) es un virus sin envoltura transmitido por la sangre que tiene un genoma de ADN monocatenario (ADNmc) de, aproximadamente, 5,5 kb (Shade et al., 1986, J. Virol. 58(3): 921-936, Brown et al., 1997, Ann. Rev. Med. 48: 59-67). Los viriones individuales contienen una copia de la cadena positiva o negativa del genoma, presente en números, aproximadamente, iguales. El genoma de ADNmc tiene repeticiones terminales invertidas que forman horquillas 5' y 3' de, aproximadamente, 350 nt, que son esenciales para la replicación viral. El genoma incluye dos marcos de lectura abiertos en la cadena positiva, que codifican proteínas estructurales (VP1 y VP2) y proteínas no estructurales (NS1).
Hubo un tiempo en que se creía que el parvovirus humano estaba altamente conservado, con menos del 2 % de diversidad genética. Más recientemente, sin embargo, se ha descubierto que un aislado de Erythrovirus humano, originalmente denominado V9, tiene una divergencia de más del 11 % en la secuencia del genoma en comparación con B19, con la disimilitud de ADN más llamativa en >20 %, observada dentro de la región del promotor p6. También se determinó que el aislado V9 tenía una presencia clínica superior al 11 %. Ahora, el grupo de Erythrovirus humanos se divide en tres genotipos de virus distintos: genotipo 1 (B19), genotipo 2 (de tipo A6 y LaLi) y genotipo 3 (de tipo V9). (Servant et al., 2002, J. Virol. 76(18): 9124-34; Ekman et al., 2007, J. Virol. 81(13): 6927-35). Servant et al., se refieren al genotipo 1 como virus correspondientes al parvovirus B19 y se refieren a los genotipos 2 y 3 como virus correspondientes a los relacionados con el parvovirus V9. Ekman et al., se refieren a los genotipos 1-3 como todos correspondientes al parvovirus B19. Por conveniencia en el presente documento, los genotipos 1, 2 y 3 se denominan genotipos de parvovirus 1, 2 y 3 o genotipos de parvovirus humano 1, 2 y 3. Los ensayos de detección de ácido nucleico que no detectan con precisión todos los genotipos de parvovirus dan como resultado que muchas mezclas de plasma permanezcan contaminados con parvovirus humano. De este modo, existe la necesidad de una prueba de ácido nucleico que detecte los genotipos 1, 2 y 3 del parvovirus humano.
La infección por parvovirus humano puede producirse por transmisión respiratoria o por sangre o productos sanguíneos infectados. Las personas infectadas pueden no presentar síntomas o tener síntomas de eritema infeccioso entre los que se incluyen síntomas leves similares a los de la gripe, erupción (“quinta enfermedad”), dolor articular temporal similar a la artritis (artropatía), crisis aplásica en pacientes con anemias hemolíticas, infección persistente por parvovirus y pérdida de, aproximadamente, el 10 % de los embarazos tempranos debido a la muerte fetal. De este modo, el fallo en la detección de parvovirus en una muestra de plasma agrupada o para el diagnóstico de infección tiene consecuencias graves.
Además, existe la necesidad de que los ensayos de detección proporcionen una sensibilidad de detección que permita la detección de títulos bajos de virus, tal como puede ocurrir al principio de una infección o en muestras diluidas o agrupadas. Los ensayos de detección de ácido nucleico de parvovirus que puedan detectar un nivel apropiado de contaminación pueden facilitar la extracción de unidades donadas infectadas del suministro de sangre o lotes contaminados de plasma agrupado antes de su utilización.
Muchos procedimientos de inmunodiagnóstico detectan anticuerpos anti-parvovirus (IgM o IgG) presentes en el suero o plasma de un individuo (por ejemplo, véanse las Patentes WO 96/09391 de Wolf et al. y Wo 96/27799 de Hedman et al.). Estos procedimientos tienen limitaciones para detectar infecciones recientes o actuales porque se basan en detectar la respuesta del cuerpo al agente infeccioso. El rápido aumento de la viremia después de la infección da como resultado niveles elevados de parvovirus en la sangre de un individuo sin los niveles detectables correspondientes de anticuerpos anti-parvovirus (véase, por ejemplo, la Patente US7,094,541 de Brentano et al. en su ejemplo 4). De este modo, los ensayos de detección basados en inmunología son susceptibles a resultados de falsos negativos. Además, la viremia a menudo se elimina rápidamente, sin embargo, una persona puede permanecer con anticuerpos positivos en ausencia de estas partículas infecciosas, lo que conduce a resultados de falsos positivos. Hasta el 90 % de los adultos son seropositivos para el parvovirus, lo que dificulta la detección inmunológica precisa de infecciones recientes o actuales. Otros ensayos similares detectan la presencia de parvovirus detectando el virus o la cápside viral vacía unida a un receptor celular purificado (Patente US5,449,608 de Young et al.), y estos ensayos basados en inmunología experimentan problemas similares.
Se han utilizado también procedimientos de hibridación y amplificación de ADN para detectar el parvovirus humano, aunque, de manera general, estas pruebas están dirigidas solamente a la detección del genotipo 1. Sin embargo, los organismos reguladores de EE. UU. y Europa han promulgado normas que especifican que las mezclas de plasma utilizadas para fabricar inmunoglobulina anti-D y otros derivados del plasma no pueden contener más de 10.000 Ul/ml (10 Ul/microlitro en Europa) de cualquier parvovirus humano. Tal como se ha discutido anteriormente, las mezclas de plasma terapéuticas y las pruebas de diagnóstico necesitan identificar de manera fiable los tipos 1, 2 y 3 de parvovirus humanos. De este modo, existe la necesidad en la técnica de composiciones, kits y procedimientos útiles en la detección in vitro de ácidos nucleicos de parvovirus humanos de tipos 1,2 y 3.
El virus de la hepatitis A (HAV, hepatitis A virus) es el agente causal de una forma de hepatitis que puede producir síntomas entre los que se incluyen fiebre, fatiga, náuseas, dolor abdominal, diarrea, pérdida del apetito e ictericia durante menos de dos meses. De las personas infectadas con el HAV, aproximadamente, del 10 % al 15 % tienen síntomas prolongados o recidivantes durante un período de seis a nueve meses después de la infección. La inmunidad al HAV, basada en la producción individual de inmunoglobulina G (IgG) anti-HAV, sigue a las infecciones sintomáticas y asintomáticas.
Aunque la incidencia de infecciones por HAV ha disminuido drásticamente en partes del mundo en las que la vacunación contra el HAV se ha utilizado ampliamente desde fines de la década de 1990, las epidemias de infecciones por HAV (>700 casos por 100.000 habitantes, y para niños que viven en áreas con tasas elevadas de hepatitis A, la tasa aumenta a >20 casos por 100.000 habitantes) pueden ocurrir en poblaciones no inmunes en las que existen malas condiciones sanitarias, incluso temporalmente, por ejemplo, después de un terremoto. La transmisión también puede ser el resultado del contacto con suero o productos sanguíneos contaminados con HAV. Incluso en los EE. UU., cada año mueren unas 100 personas por insuficiencia hepática aguda debido a la hepatitis A (tasa de mortalidad de, aproximadamente, el 0,015 %). Incluso en los casos de hepatitis A no fatales, están asociados costes sustanciales con las infecciones por HAV, entre los que se incluyen los que son resultado de la hospitalización del paciente, las visitas ambulatorias y los días de baja laboral.
El HAV es un virus de ARN de 27 nm (un picornavirus) que contiene un genoma de ARN monocatenario de sentido positivo de, aproximadamente, 7,5 kb. El virus se replica en el hígado, se excreta en la bilis y se elimina en las heces (por ejemplo, hasta 108 virus por ml) durante la fase aguda de la infección. El período de incubación suele ser de dos a seis semanas antes de que aparezcan los síntomas. Se ha encontrado un solo serotipo de HAV en todo el mundo. El diagnóstico de hepatitis A no se puede diferenciar de otros tipos de hepatitis viral por los síntomas u otras características clínicas (por ejemplo, niveles elevados de aminotransferasa sérica). Normalmente, el diagnóstico de hepatitis A se confirma mediante pruebas serológicas que proporcionan resultados positivos respecto a la presencia de inmunoglobulinas (Ig) anti-HAV. De manera general, la IgM anti-HAV está presente de cinco a diez días antes del inicio de los síntomas y es indetectable en la mayoría de los pacientes seis meses después, mientras que la IgG anti-HAV aparece de manera temprana durante la infección y permanece detectable durante toda la vida del individuo. El ARN del HAV se puede detectar en la sangre y las heces de la mayoría de las personas durante la fase aguda de la infección mediante la utilización de procedimientos de prueba de ácidos nucleicos, por ejemplo, la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y se ha utilizado la secuenciación de ácidos nucleicos para identificar la relación genética de hAv después de infecciones en toda la comunidad (Dato et al., Morbidity Mortality Wkly. Rpt., 2003, 52(47): 1155-57; LaPorte et al., Morbidity Mortality Wkly. Rpt., 2003, 52(24): 565-67). Estos procedimientos, sin embargo, no se utilizan de manera general con fines de diagnóstico.
La Patente US2006/0014142 enseña un procedimiento para detectar el parvovirus humano y el virus de la hepatitis A.
Por lo tanto, existe la necesidad de detectar con precisión la presencia de HAV en las muestras biológicas y ambientales. También existe la necesidad de detectar la presencia de contaminación por HAV en productos que se puedan utilizar en tratamientos médicos (por ejemplo, sangre o suero para transfusiones, o factores derivados de sangre o suero humanos). También existe la necesidad de detectar la presencia de HAV en materiales
potencialmente contaminados, tales como agua o alimentos, para prevenir brotes o epidemias en toda la comunidad como resultado del consumo de materiales contaminados.
La presente divulgación responde a estas necesidades al describir secuencias de oligonucleótidos que se utilizan en procedimientos de prueba de ácidos nucleicos para detectar la presencia de ácido nucleico del HAV (ARN del HAV o secuencias derivadas del mismo, por ejemplo, ADNc). La presente solicitud también describe procedimientos de prueba de ácido nucleico que detectan la presencia de ARN del HAV presente en una muestra.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a composiciones, kits y procedimientos para la detección de genotipos del virus de la hepatitis A y del parvovirus humano, tal como se define en las reivindicaciones. Estas composiciones, kits y procedimientos están configurados para amplificar las secuencias diana de los ácidos nucleicos del virus de la hepatitis A y del parvovirus humano y están configurados para detectar los ácidos nucleicos amplificados del virus de la hepatitis A y del parvovirus humano. En ciertas realizaciones y aspectos, se han identificado regiones particulares dentro de las secuencias diana del virus de la hepatitis A y regiones particulares dentro del parvovirus humano como dianas preferentes para las reacciones de amplificación de ácido nucleico de una muestra, entre las que se incluyen muestras biológicas derivadas de seres humanos infectados, tales como muestras de plasma. Los oligómeros de amplificación o los oligómeros de detección dirigidos a estas regiones pueden compartir secuencias centrales comunes y, de este modo, proporcionar una pluralidad de oligómeros de amplificación u oligómeros de detección particularmente preferentes. Los productos de amplificación generados utilizando dichos oligómeros de amplificación particularmente preferentes contendrán secuencias específicas de diana útiles para la detección específica de parvovirus humano o HAV a partir de una muestra. La detección de un producto de amplificación puede incluir cualquiera de una variedad de procedimientos entre los que se incluyen, sin limitación, detección basada en sondas, ensayos de protección de hibridación, ensayos basados en antorcha molecular, baliza molecular o interruptor molecular, espectrometría de masas, espectrometría de masas MALDI-TOF, espectrometría de masas ES1-TOF, ensayos de detección en tiempo real, electroforesis en gel, electroforesis SDS-PAGE, secuenciación de Sanger, secuenciación de nueva generación y similares. Estas regiones preferentes de una secuencia diana proporcionan mejoras en relación con la especificidad, sensibilidad o velocidad de detección y detección con sensibilidad elevada. Utilizando estos oligómeros de amplificación y/o detección, los procedimientos incluyen las etapas de amplificar secuencias diana dentro del genoma del parvovirus humano o un genoma del HAV y detectar los productos de amplificación. Los oligómeros de detección se utilizan, preferentemente, para detectar productos amplificados.
Una realización es una combinación de oligómeros para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, comprendiendo dicha combinación de oligómeros: (I) un primer y un segundo oligómeros de amplificación para amplificar una región diana de ácido nucleico de parvovirus humano, en la que, (a) el primer oligómero de amplificación de parvovirus comprende una primera secuencia de hibridación con la diana que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 181 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 179 o SEQ ID NO: 180; y (b) el segundo oligómero de amplificación de parvovirus comprende una segunda secuencia de hibridación con la diana seleccionada entre el grupo que consiste en: (i) una secuencia que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de s Eq ID NO: 189 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 188; y (ii) una secuencia que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 193 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 192; y/o (II) un primer y un segundo oligómeros de amplificación para amplificar una región diana de ácido nucleico de hAv , en la que (a) el primer oligómero de amplificación de HAv comprende una primera secuencia de hibridación con la diana que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 174 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 173; y (b) el segundo oligómero de amplificación de HAv comprende una segunda secuencia de hibridación con la diana que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 175.
En un aspecto, la combinación de oligómeros comprende el primer y el segundo oligómeros de amplificación de parvovirus de (1). En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 182 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 179. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 183 o SEQ ID NO: 117. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de (I)(a) tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 75-80. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 184. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 81-84. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 185 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 180. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 82-84. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 187 e incluye, como mínimo, la secuencia de
SEQ ID NO: 188. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 186. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 108-113. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 191. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 190. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 118-121. En un aspecto, el segundo oligómero de amplificación de parvovirus es un cebador promotor o un proveedor de promotor que comprende además una secuencia de promotor situada en 5' con respecto a la secuencia de hibridación con la diana. En un aspecto, la secuencia de promotor es una secuencia de promotor de T7. En un aspecto, la secuencia de promotor de T7 tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 196. En un aspecto, el segundo oligómero de amplificación de parvovirus tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 88 93 y 98-101.
En un aspecto, la combinación de oligómeros descrita anteriormente comprende además (III) un tercer y un cuarto oligómeros de amplificación para amplificar la región diana del ácido nucleico del parvovirus humano, en la que: (a) el tercer oligómero de amplificación de parvovirus comprende una tercera secuencia de hibridación con la diana que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 181 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 117 o SEQ ID NO: 180; y (b) el cuarto oligómero de amplificación de parvovirus comprende una cuarta secuencia de hibridación con la diana seleccionada entre el grupo que consiste en (i) una secuencia que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 189 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 188; y (ii) una secuencia que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 193 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 192; en la que la tercera secuencia de hibridación con la diana de (III)(a) es diferente de la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) y en la que la cuarta secuencia de hibridación con diana de (III)(b) es diferente de la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b).
En un aspecto, el tercer oligómero de amplificación de parvovirus es como se ha definido anteriormente y el primer oligómero de amplificación de parvovirus es como se establece a continuación: la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 182 e incluye, como mínimo, la secuencia de s Eq ID NO: 179; la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 117 o SEQ ID NO: 183; la primera secuencia de hibridación con la diana de (I)(a) tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 75-80; la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 184; la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 81-84; la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 185 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 180, o la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 82-84.
En un aspecto, el cuarto oligómero de amplificación de parvovirus es tal como se ha definido anteriormente y el segundo oligómero de amplificación es como se establece a continuación: la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 187 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 188; la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 186; la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 108-113; la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 191; la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 190; la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 118-121; el segundo oligómero de amplificación de parvovirus es un cebador promotor o un proveedor de promotor que comprende además una secuencia de promotor situada en 5’ con respecto a la secuencia de hibridación con la diana; el segundo oligómero de amplificación de parvovirus es un cebador promotor o proveedor de promotor que comprende además una secuencia de promotor que es una secuencia de promotor de T7; el segundo oligómero de amplificación de parvovirus es un cebador promotor o proveedor de promotor que comprende además y la secuencia del promotor de T7 tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 196; y el segundo oligómero de amplificación de parvovirus tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 88-93 y 98-101.
En una realización, se proporciona una combinación de oligómeros formada por cualquiera de los oligómeros de amplificación descritos en el presente documento y la combinación de oligómeros comprende además, como mínimo, un oligómero de sonda de captura específico de parvovirus que comprende una secuencia de hibridación con la diana unida covalentemente a una secuencia o resto que se une a una sonda inmovilizada, en el que dicha secuencia de hibridación con la diana se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 132-135. En un aspecto, el oligómero de sonda de captura específico de parvovirus tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 128-131.
En una realización, se proporciona una combinación de oligómeros formada por cualquiera de los oligómeros de amplificación descritos en el presente documento y la combinación de oligómeros comprende además un oligómero desplazador que comprende una secuencia de hibridación con la diana configurada para hibridarse con el ácido nucleico diana del parvovirus en la dirección 5’ desde el primer o el segundo oligómero de amplificación de parvovirus. En un aspecto, la combinación de oligómeros comprende, además, como mínimo, un oligómero de sonda de captura específico de parvovirus que comprende una secuencia de hibridación con la diana unida covalentemente a una secuencia o resto que se une a una sonda inmovilizada, en el que dicha secuencia de hibridación con la diana se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 132-135. En un aspecto, el oligómero de sonda de captura específico de parvovirus tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 128-131.
En una realización, se proporciona una combinación de oligómeros formada por cualquiera de los oligómeros de amplificación descritos en el presente documento y la combinación de oligómeros comprende además, como mínimo, un oligómero de sonda de detección específica de parvovirus que comprende una secuencia de hibridación con la diana que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 40 nucleótidos de longitud y está configurado para hibridarse específicamente con una secuencia diana contenida en la SEQ ID NO: 199 desde, aproximadamente, la posición de nucleótido 2921 hasta, aproximadamente, la posición de nucleótido 2966, o desde, aproximadamente, la posición de nucleótido 2921 hasta, aproximadamente, la posición de nucleótido 3067. En un aspecto, la secuencia de hibridación con la diana de la sonda de detección específica de parvovirus está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 194 o 195. En un aspecto, la secuencia de hibridación con la diana de la sonda de detección específica de parvovirus se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 137-169. En un aspecto, la combinación de oligómeros comprende además un oligómero desplazador que comprende una secuencia de hibridación con la diana configurada para hibridarse con el ácido nucleico diana de parvovirus en la dirección 5’ desde el primer o segundo oligómero de amplificación de parvovirus. En un aspecto, la combinación de oligómeros comprende, además, como mínimo, un oligómero de sonda de captura específico de parvovirus que comprende una secuencia de hibridación con la diana unida covalentemente a una secuencia o resto que se une a una sonda inmovilizada, en el que dicha secuencia de hibridación con la diana se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 132-135. En un aspecto, el oligómero de sonda de captura específico de parvovirus tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 128-131.
En una realización, la combinación de oligómeros es cualquiera de las combinaciones de oligómeros de parvovirus anteriores que comprenden además el primer y el segundo oligómeros de amplificación de HAV de (II). En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de (II)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 172. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de (II)(a) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 170. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-6 y 11. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(a) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 171. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-6. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de hAv de (II)(b) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 176. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(b) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29-38 y 45. En un aspecto, el segundo oligómero de amplificación de HAV es un cebador promotor o un proveedor de promotor que comprende además una secuencia de promotor situada en 5’ con respecto a la secuencia de hibridación con la diana. En un aspecto, la secuencia de promotor es una secuencia de promotor de T7. En un aspecto, la secuencia de promotor de T7 tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 196. En un aspecto, el segundo oligómero de amplificación de HAV tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12-21 y 28.
En una realización, la combinación de oligómeros es cualquiera de las combinaciones de oligómeros de parvovirus anteriores y la combinación de oligómeros de HAV, que comprende además (IV) un tercer y un cuarto oligómeros de amplificación para amplificar la región diana del ácido nucleico de HAV, en la que (a) el tercer oligómero de amplificación de HAV comprende una tercera secuencia de hibridación con la diana que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 174 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 173; y (b) el cuarto oligómero de amplificación de HAV comprende una cuarta secuencia de hibridación con la diana que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 175; en la que la tercera secuencia de hibridación con la diana de (IV)(a) es diferente de la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(a); y en la que la cuarta secuencia de hibridación con la diana de (IV)(b) es diferente de la segunda secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(b). En un aspecto, el tercer oligómero de amplificación de HAV es un oligómero, según se establece en cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34 para el primer oligómero de amplificación de HAV. En un aspecto, el cuarto oligómero de amplificación de HAV es un oligómero, según se establece en las reivindicaciones 35 a 40 para el segundo oligómero de amplificación de HAV.
En una realización, se proporciona una combinación de oligómeros formada por cualquiera de los oligómeros de amplificación descritos en el presente documento y la combinación de oligómeros comprende además, como
mínimo, un oligómero de sonda de captura específico de HAV que comprende una secuencia de hibridación con la diana unida covalentemente a una secuencia o resto que se une a una sonda inmovilizada, en el que dicha secuencia de hibridación con la diana se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 52-57. En un aspecto, el oligómero de sonda de captura específico de HAV tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 46-51.
En una realización, se proporciona una combinación de oligómeros formada por cualquiera de los oligómeros de amplificación descritos en el presente documento y la combinación de oligómeros comprende además un oligómero desplazador que comprende una secuencia de hibridación con la diana configurada para hibridarse con el ácido nucleico diana del HAV en la dirección 5’ desde el primer o el segundo oligómero de amplificación de HAV. En un aspecto, la combinación de oligómeros comprende además, como mínimo, un oligómero de sonda de captura específico de HAV que comprende una secuencia de hibridación con la diana unida covalentemente a una secuencia o resto que se une a una sonda inmovilizada, en el que dicha secuencia de hibridación con la diana se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 52-57. En un aspecto, el oligómero de sonda de captura específico de HAV tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 46-51.
En una realización, se proporciona una combinación de oligómeros formada por cualquiera de los oligómeros de amplificación descritos en el presente documento y la combinación de oligómeros comprende además, como mínimo, un oligómero de sonda de detección específica de HAV específico de parvovirus que comprende una secuencia de hibridación con la diana que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 40 nucleótidos de longitud y está configurado para hibridarse específicamente con una secuencia diana contenida en la SEQ ID NO: 198 desde, aproximadamente, la posición de nucleótido 5965 hasta, aproximadamente, la posición de nucleótido 6028. En un aspecto, el oligómero de sonda de captura específico de HAV tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 46-51. En un aspecto, la secuencia de hibridación con la diana de la sonda de detección específica de HAV está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 178. En un aspecto, la secuencia de hibridación con la diana de la sonda de detección específica de HAV se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 58-74. En un aspecto, la combinación de oligómeros formada por cualquiera de los oligómeros de amplificación descritos en el presente documento y la combinación de oligómeros comprende además un oligómero desplazador que comprende una secuencia de hibridación con la diana configurada para hibridarse con el ácido nucleico diana del HAV en la dirección 5’ desde el primer o segundo oligómero de amplificación del HAV. En un aspecto, la combinación de oligómeros comprende, además, como mínimo, un oligómero de sonda de captura específico de HAV que comprende una secuencia de hibridación con la diana unida covalentemente a una secuencia o resto que se une a una sonda inmovilizada, en la que dicha secuencia de hibridación con la diana se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 52-57.
Una realización es un kit que comprende cualquiera de las combinaciones de oligómeros descritas en el presente documento. Una realización es una mezcla de reacción que comprende cualquiera de las combinaciones de oligómeros descritas en el presente documento. Una realización es un ensayo de amplificación uniplex para la amplificación del virus de la hepatitis A utilizando, como mínimo, un oligómero de amplificación descrito en el presente documento. En un aspecto, el ensayo de amplificación uniplex del virus de la hepatitis A es para la amplificación y detección del virus de la hepatitis A utilizando, como mínimo, un oligómero de sonda de detección descrito en el presente documento. Una realización es un ensayo de amplificación uniplex para la amplificación de parvovirus utilizando, como mínimo, un oligómero de amplificación descrito en el presente documento. En un aspecto, el ensayo de amplificación uniplex de parvovirus es para la amplificación y detección de parvovirus utilizando, como mínimo, un oligómero de sonda de detección descrito en el presente documento. Una realización es un ensayo de amplificación múltiplex para la amplificación del virus de la hepatitis A y el parvovirus utilizando, como mínimo, un oligómero de amplificación descrito en el presente documento. En un aspecto, el ensayo de amplificación múltiplex del virus de la hepatitis A y el parvovirus es para la amplificación y detección del virus de la hepatitis A y el parvovirus utilizando, como mínimo, un oligómero de sonda de detección descrito en el presente documento.
Una realización es un procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, comprendiendo el procedimiento: (A) proporcionar una muestra, en la que se sospecha que la muestra contiene, como mínimo, uno de parvovirus humano y HAV; (B) poner en contacto dicha muestra con una combinación de oligómeros para amplificar, como mínimo, una región diana de ácido nucleico de parvovirus humano y una región diana de ácido nucleico de HAV, comprendiendo dicha combinación de oligómeros (I) para la región diana de parvovirus, (a) un primer oligómero de amplificación de parvovirus que comprende una primera secuencia de hibridación con la diana que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de s Eq ID NO: 181 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 179 o SEQ ID NO: 180; y (b) un segundo oligómero de amplificación de parvovirus que comprende una segunda secuencia de hibridación con la diana seleccionada entre el grupo que consiste en (i) una secuencia que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 189 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 188, y (ii) una secuencia que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 193 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 192; y/o (II) para la región diana del HAV, (a) un primer oligómero de amplificación de HAV que comprende una primera secuencia de hibridación con la diana que tiene de,
aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 174 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 173; y (b) un segundo oligómero de amplificación de HAV que comprende una segunda secuencia de hibridación con la diana que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 175; (C) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico in vitro, en la que cualquier ácido nucleico diana de parvovirus y/o HAV presente en dicha muestra se utiliza como plantilla para generar un producto de amplificación de parvovirus y/o HAV; y (D) detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación de parvovirus y/o HAV, indicando de esta manera la presencia o ausencia de parvovirus y/o HAV en dicha muestra.
En un aspecto, el procedimiento es para detectar el ácido nucleico diana del parvovirus humano y la muestra se pone en contacto con el primer y el segundo oligómeros de amplificación de parvovirus (I). En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de s Eq ID NO: 182 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 179. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 117 o SEQ ID NO: 183. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 75-80. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 184. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 75, 76, 77 y 81-84. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 185 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 180. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 82-84. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 187 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEq ID NO: 188. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 186. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 108-113. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 191. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 190. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 118-121. En un aspecto, el segundo oligómero de amplificación de parvovirus es un cebador promotor o un proveedor de promotor que comprende además una secuencia de promotor situada en 5’ con respecto a la secuencia de hibridación con la diana. En un aspecto, la secuencia de promotor es una secuencia de promotor de T7. En un aspecto, la secuencia de promotor de T7 tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 196. En un aspecto, el segundo oligómero de amplificación de parvovirus tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 88-93 y 98-101.
En una realización, la etapa (B) comprende además poner en contacto la muestra con (III) el tercer y el cuarto oligómeros de amplificación para amplificar la región diana del ácido nucleico del parvovirus humano, en la que (a) el tercer oligómero de amplificación de parvovirus comprende una tercera secuencia de hibridación con la diana que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEq ID NO: 181 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 179 o SEQ ID NO: 180 y (b) el cuarto oligómero de amplificación de parvovirus comprende una cuarta secuencia de hibridación con la diana seleccionada entre el grupo que consiste en (i) una secuencia que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 189 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 188, y (ii) una secuencia que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 193 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 192; en la que la tercera secuencia de hibridación con la diana de (III)(a) es diferente de la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) y en la que la cuarta secuencia de hibridación con la diana de (III)(b) es diferente de la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b). En un aspecto, el tercer oligómero de amplificación de parvovirus es un oligómero contenido en la secuencia de SEQ ID NO: 182 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 179. En un aspecto, la tercera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 117 o SEQ ID NO: 183. En un aspecto, la tercera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 75-80. En un aspecto, la tercera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 184. En un aspecto, la tercera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 75-77 y 81-84. En un aspecto, la tercera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 185 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 180. En un aspecto, la tercera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 82-84. En un aspecto, el cuarto oligómero de amplificación de parvovirus está contenido en la secuencia de SEQ ID NO: 187 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 188. En un aspecto, la cuarta secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 186. En un aspecto, la cuarta secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 108-113. En un aspecto, la cuarta secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) está contenida en la secuencia de
SEQ ID NO: 191. En un aspecto, la cuarta secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 190. En un aspecto, la cuarta secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 118-121. En un aspecto, el cuarto oligómero de amplificación de parvovirus es un cebador promotor o un proveedor de promotor que comprende además una secuencia de promotor situada en 5' con respecto a la secuencia de hibridación con la diana. En un aspecto, la secuencia de promotor es una secuencia de promotor de T7. En un aspecto, la secuencia de promotor de T7 tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 196. En un aspecto, el cuarto oligómero de amplificación de parvovirus tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 88-93 y 98-101.
En una realización, el procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra comprende además purificar el ácido nucleico diana del parvovirus de otros componentes en la muestra antes de la etapa (B). En un aspecto, la etapa de purificación comprende poner en contacto la muestra con, como mínimo, un oligómero de sonda de captura específico de parvovirus que comprende una secuencia de hibridación con la diana unida covalentemente a una secuencia o resto que se une a una sonda inmovilizada, en la que dicha secuencia de hibridación con la diana se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 132-135. En un aspecto, el oligómero de sonda de captura específico de parvovirus tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 128-131.
En una realización del procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, la etapa (B) comprende además poner en contacto la muestra con un oligómero desplazador que comprende una secuencia de hibridación con la diana configurada para hibridarse con el ácido nucleico diana de parvovirus en la dirección 5’ desde el primer o segundo oligómero de amplificación de parvovirus.
En una realización del procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, la etapa de detección (D) comprende poner en contacto dicha reacción de amplificación de ácido nucleico in vitro con un oligómero de sonda de detección específica de parvovirus configurado para hibridarse específicamente con el producto de amplificación de parvovirus en condiciones en las que se determina la presencia o ausencia del producto de amplificación de parvovirus, indicando de esta manera la presencia o ausencia de parvovirus en dicha muestra. En un aspecto, el oligómero de sonda de detección específica de parvovirus comprende una secuencia de hibridación con la diana que tiene una longitud de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 40 nucleótidos y está configurado para hibridarse específicamente con una secuencia de diana contenida en la SEQ ID NO: 199 desde, aproximadamente, la posición de nucleótido 2921 hasta, aproximadamente, la posición de nucleótido 2966, o desde, aproximadamente, la posición de nucleótido 2921 hasta, aproximadamente, la posición de nucleótido 3067. En un aspecto, la secuencia de hibridación con la diana de la sonda de detección específica de parvovirus está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 194 o 195. En un aspecto, la secuencia de hibridación con la diana de la sonda de detección específica de parvovirus se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 137-169. En un aspecto, la sonda de detección específica de parvovirus comprende un marcador seleccionado entre el grupo que consiste en (a) un marcador quimioluminiscente; (b) un marcador fluorescente; (c) un extintor (“quencher”); y (d) una combinación de uno o más de (a), (b) y (c).
En una realización, el procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, comprende además poner en contacto la muestra con un oligómero pseudodiana que se puede amplificar, utilizando el primer y el segundo oligómeros de amplificación de parvovirus, en la reacción de amplificación de ácidos nucleicos in vitro para generar un segundo producto de amplificación que no se hibrida específicamente con la sonda de detección específica de parvovirus en las condiciones de la reacción de detección.
En una realización, el procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra comprende además poner en contacto la muestra con un oligómero de sonda fría que compite con el oligómero de sonda de detección específica de parvovirus por la hibridación con el producto de amplificación de parvovirus.
En una realización, el procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra comprende además poner en contacto la muestra con un oligómero sintonizador configurado para hibridarse específicamente con el primer y el segundo oligómeros de amplificación de parvovirus.
En una realización del procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, la etapa de detección (D) tiene lugar durante la etapa de amplificación (C). En un aspecto, la sonda de detección específica de parvovirus comprende un marcador fluorescente, un extintor o ambos. En un aspecto, la sonda de detección específica de parvovirus es una sonda de detección TaqMan o una baliza molecular. En un aspecto, la sonda de detección específica de parvovirus comprende un marcador seleccionado entre el grupo que consiste en (a) un marcador
quimioluminiscente; (b) un marcador fluorescente; (c) un extintor; y (d) una combinación de uno o más de (a), (b) y (c). En un aspecto, la sonda de detección específica de parvovirus comprende además una secuencia de hibridación no diana. En un aspecto, la sonda de detección específica de parvovirus es una sonda de detección de horquilla. En un aspecto, la sonda de detección de horquilla es una baliza molecular o una antorcha molecular.
En una realización del procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, la reacción de amplificación en la etapa (C) es una reacción de amplificación isotérmica. En un aspecto, la reacción de amplificación es una reacción de amplificación en tiempo real.
En una realización del procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, la reacción de amplificación en la etapa (C) es una reacción de amplificación mediante PCR. En un aspecto, la reacción de amplificación es una reacción de amplificación en tiempo real.
En una realización del procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, en el que el procedimiento es para detectar el ácido nucleico diana del HAV, la muestra se pone en contacto con el primer y el segundo oligómeros de amplificación de HAV de (II). En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (I I)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 172. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(a) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 170. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-6 y 11. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de hAv de (II)(a) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 171. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-6. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(b) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 176. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(b) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29-38 y 45. En un aspecto, el segundo oligómero de amplificación de HAV es un cebador promotor o un proveedor de promotor que comprende además una secuencia de promotor situada en 5' con respecto a la secuencia de hibridación con la diana. En un aspecto, la secuencia de promotor es una secuencia de promotor de T7. En un aspecto, la secuencia de promotor de T7 tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 196. En un aspecto, el segundo oligómero de amplificación de HAV tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12-21 y 28.
En una realización, la etapa (B) comprende además poner en contacto la muestra con (IV) el tercer y el cuarto oligómeros de amplificación para amplificar la región diana del ácido nucleico del HAV, en la que (a) el tercer oligómero de amplificación de HAV comprende una tercera secuencia de hibridación con la diana que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 174 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 173; y (b) el cuarto oligómero de amplificación de HAV comprende una cuarta secuencia de hibridación con la diana que tiene de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 175; en la que la tercera secuencia de hibridación con la diana de (IV)(a) es diferente de la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(a); y en la que la cuarta secuencia de hibridación con la diana de (IV)(b) es diferente de la segunda secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(b). En un aspecto, el tercer oligómero de amplificación de HAV es un oligómero, según se establece en cualquiera de las reivindicaciones 96 a 100 para el primer oligómero de amplificación de HAV. En un aspecto, el cuarto oligómero de amplificación de HAV es un oligómero, según se establece en las reivindicaciones 101 a 106 para el segundo oligómero de amplificación de HAV.
En una realización, el procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra comprende además purificar el ácido nucleico diana del HAV de otros componentes en la muestra antes de la etapa (B). En un aspecto, la etapa de purificación comprende poner en contacto la muestra con, como mínimo, un oligómero de sonda de captura específico de HAV que comprende una secuencia de hibridación con la diana unida covalentemente a una secuencia o resto que se une a una sonda inmovilizada, en la que dicha secuencia de hibridación con la diana se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 52-57. En un aspecto, el oligómero de sonda de captura específico de HAV tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 46-51.
En una realización, el procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra comprende además en la etapa de amplificación, utilizar un oligómero desplazador que comprende una secuencia de hibridación con la diana configurada para hibridarse con el ácido nucleico diana de HAV en la dirección 5’ desde el primer o segundo oligómero de amplificación de HAV.
En una realización del procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, la etapa de detección (D)
comprende poner en contacto dicha reacción de amplificación de ácido nucleico in vitro con un oligómero de sonda de detección específica de HAV configurado para hibridarse específicamente con el producto de amplificación de HAV en condiciones en las que se determina la presencia o ausencia del producto de amplificación de HAV, lo que indica la presencia o ausencia de HAV en dicha muestra. En un aspecto, el oligómero de sonda de detección específica de HAV comprende una secuencia de hibridación con la diana que tiene una longitud de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 40 nucleótidos y está configurado para hibridarse específicamente con una secuencia diana contenida en la SEQ ID NO: 198 desde, aproximadamente, la posición de nucleótido 5965 hasta, aproximadamente, la posición de nucleótido 6028. En un aspecto, la secuencia de hibridación con la diana de la sonda de detección específica de HAV está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 178. En un aspecto, la secuencia de hibridación con la diana de la sonda de detección específica de HAV se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 58-74. En un aspecto, la sonda de detección específica de HAV comprende un marcador seleccionado entre el grupo que consiste en (a) un marcador quimioluminiscente; (b) un marcador fluorescente; (c) un extintor; y (d) una combinación de uno o más de (a), (b) y (c).
En una realización, el procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra comprende además poner en contacto la muestra con un oligómero pseudodiana que puede amplificarse, utilizando el primer y el segundo oligómeros de amplificación de HAV, en la reacción de amplificación de ácidos nucleicos in vitro para generar un segundo producto de amplificación que no se hibrida específicamente con la sonda de detección específica de HAV en las condiciones de la reacción de detección.
En una realización, el procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra comprende además poner en contacto la muestra con un oligómero de sonda fría que compite con el oligómero de sonda de detección específica del HAV por la hibridación con el producto de amplificación de HAV.
En una realización, el procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra comprende además poner en contacto la muestra con un oligómero sintonizador configurado para hibridarse específicamente con el primer y el segundo oligómeros de amplificación de HAV.
En una realización del procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, la etapa de detección (D) tiene lugar durante la etapa de amplificación (C). En un aspecto, la sonda de detección específica de HAV comprende un marcador fluorescente, un extintor o ambos. En un aspecto, la sonda de detección específica de HAV es una sonda de detección TaqMan o una baliza molecular. En un aspecto, la sonda de detección específica de HAV comprende un marcador seleccionado entre el grupo que consiste en (a) un marcador quimioluminiscente; (b) un marcador fluorescente; (c) un extintor y (d) una combinación de uno o más de (a), (b) y (c). En un aspecto, la sonda de detección específica de HAV comprende además una secuencia de hibridación no diana. En un aspecto, la sonda de detección específica de HAV es una sonda de detección de horquilla. En un aspecto, la sonda de detección de horquilla es una baliza molecular o una antorcha molecular.
En una realización del procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, la reacción de amplificación ©la etapa (C) es una reacción de amplificación isotérmica.
En una realización del procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, la reacción de amplificación en la etapa (C) es una reacción de amplificación mediante PCR.
En una realización del procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, la reacción de amplificación es una reacción de amplificación en tiempo real.
En una realización del procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, la muestra es de un paciente individual. En un aspecto, la muestra se agrupa. En un aspecto, la muestra agrupada es una muestra de plasma agrupado. En un aspecto, la muestra es una muestra de plasma para derivar un compuesto terapéutico. En un aspecto, la muestra es una muestra de plasma para derivar un compuesto que es trombina humana, un anticuerpo humano o partes del mismo, una proteína humana, un receptor de citocina humano, un ligando de citocina humano u otro compuesto derivado de plasma.
En una realización del procedimiento para detectar, como mínimo, uno de un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, en el que el procedimiento es para detectar tanto el ácido nucleico diana del parvovirus humano como el ácido nucleico diana del HAV, y en el que la etapa de detección (D) comprende poner en contacto dicha reacción de amplificación de ácido nucleico in vitro
con un oligómero de sonda de detección específica de parvovirus y un oligómero de sonda de detección específica de HAV configurados para hibridarse específicamente, respectivamente, con el producto de amplificación de parvovirus y el de amplificación de HAV en condiciones en las que se determina la presencia o ausencia del producto de amplificación de parvovirus y el producto de amplificación de HAV, lo que indica la presencia o ausencia de parvovirus y HAV en dicha muestra. En un aspecto, los oligómeros de sonda de detección específica de parvovirus y específica de HAV están marcados de manera diferencial. En un aspecto en el que cada uno de los oligómeros de sonda de detección específica de parvovirus y específica de hAv comprende un marcador, los marcadores se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en (a) un marcador quimioluminiscente y (b) un marcador fluorescente. En un aspecto, cada uno de los oligómeros de sonda de detección específica de parvovirus y específica de HAV comprende un marcador quimioluminiscente. En un aspecto, los marcadores quimioluminiscentes para los oligómeros de sonda de detección específica de parvovirus y específica de HAV se caracterizan por diferentes cinéticas de emisión de luz suficientes para distinguir entre las señales quimioluminiscentes específicas de parvovirus y específicas de HAV. En un aspecto, cada uno de los marcadores quimioluminiscentes para los oligómeros de sonda de detección específica de parvovirus y específica de HAV comprende un éster de acridinio (AE, acridinium ester). En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 182 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 117 o SEQ ID NO: 179. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 183. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 75-80. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 184. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 81-84. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de s Eq ID NO: 185 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 180. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 82-84. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 187 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 188. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 186. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 108-113. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) está contenida en la secuencia de SEq ID NO: 191. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 190. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 118-121. En un aspecto, el segundo oligómero de amplificación de parvovirus es un cebador promotor o un proveedor de promotor que comprende además una secuencia de promotor situada en 5' con respecto a la secuencia de hibridación con la diana. En un aspecto, la secuencia de promotor es una secuencia de promotor de T7. En un aspecto, la secuencia de promotor de T7 tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 196. En un aspecto, el segundo oligómero de amplificación de parvovirus tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 88-93 y 98-101. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 172. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(a) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 170. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1-6 y 11. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(a) incluye, como mínimo, la secuencia de SEq ID NO: 171. En un aspecto, la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEq ID NO: 1-6. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(b) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 176. En un aspecto, la segunda secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(b) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29-38 y 45. En un aspecto, el segundo oligómero de amplificación de HAV es un cebador promotor o un proveedor de promotor que comprende además una secuencia de promotor situada en 5' con respecto a la secuencia de hibridación con la diana. En un aspecto, la secuencia de promotor es una secuencia de promotor de T7. En un aspecto, la secuencia de promotor de T7 tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 196. En un aspecto, el segundo oligómero de amplificación de HAV tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12-21 y 28. En un aspecto, el oligómero de sonda de detección específica de parvovirus comprende una secuencia de hibridación con la diana que tiene una longitud de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 40 nucleótidos y está configurado para hibridarse específicamente con una secuencia diana contenida en la SEQ ID NO: 199 desde, aproximadamente, la posición de nucleótido 2921 hasta, aproximadamente, la posición de nucleótido 2966, o desde, aproximadamente, la posición de nucleótido 2921 hasta, aproximadamente, la posición de nucleótido 3067. En un aspecto, la secuencia de hibridación con la diana de la sonda de detección específica de parvovirus está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 194 o 195. En un aspecto, la secuencia de hibridación con la diana de la sonda de detección específica de parvovirus se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 137-169. En un aspecto, el oligómero de sonda de detección específica de HAV comprende una secuencia de hibridación con la diana que tiene una longitud de, aproximadamente, 14 a, aproximadamente, 40 nucleótidos y está configurado para hibridarse específicamente con una secuencia diana contenida en la SEQ ID NO: 198 desde, aproximadamente, la posición de nucleótido 5965 hasta, aproximadamente, la posición de nucleótido 6028. En un aspecto, la secuencia de hibridación con la diana de la sonda de detección específica de
HAV está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 178. En un aspecto, la secuencia de hibridación con la diana de la sonda de detección específica de HAV se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 58-74.
En una realización, se da a conocer un procedimiento para la amplificación y detección múltiplex de ácidos nucleicos diana de los genotipos 1,2 y 3 del parvovirus humano y el ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A a partir de una muestra. En un aspecto de esta realización, los oligómeros de amplificación para la amplificación y la detección de los genotipos 1,2 y 3 del parvovirus humano incluyen uno o más oligómeros de amplificación descritos en la tabla 3. En otro aspecto, dos o más oligómeros de amplificación descritos en la tabla 3. En otro aspecto, tres o más oligómeros de amplificación descritos en la tabla 3. En otro aspecto, cuatro o más oligómeros de amplificación descritos en la tabla 3. En otro aspecto, cinco o más oligómeros de amplificación descritos en la tabla 3. En otro aspecto, seis o más oligómeros de amplificación descritos en la tabla 3. En otro aspecto, siete o más oligómeros de amplificación descritos en la tabla 3. En un aspecto de esta realización, los oligómeros de amplificación para la amplificación y detección de HAV incluyen uno o más oligómeros de amplificación descritos en la tabla 3. En otro aspecto, dos o más oligómeros de amplificación descritos en la tabla 3. En otro aspecto, tres o más oligómeros de amplificación descritos en la tabla 3. En otro aspecto, cuatro o más oligómeros de amplificación descritos en la tabla 3. En otro aspecto, cinco o más oligómeros de amplificación descritos en la tabla 3. En otro aspecto, seis o más oligómeros de amplificación descritos en la tabla 3. En otro aspecto, siete o más oligómeros de amplificación descritos en la tabla 3. En un aspecto de esta realización, los oligómeros de sonda de detección para la detección de productos de amplificación generados a partir de los genotipos 1, 2 y 3 de parvovirus humano, y para la detección de productos de amplificación generados a partir de HAV incluyen una o más sondas de detección de parvovirus descritas en la tabla 3 y una o más más sondas de detección de HAV descritas en la tabla 3. En otro aspecto, los oligómeros de la sonda de detección están presentes durante la amplificación para una detección en tiempo real. En otro aspecto, los oligómeros de sonda de detección se combinan con los productos de amplificación después de la reacción de amplificación para una detección de punto final. En un aspecto de esta realización, la amplificación y detección múltiplex de los ácidos nucleicos diana de los genotipos 1, 2 y 3 del parvovirus humano es una reacción de detección y amplificación múltiplex cuantitativa. En un aspecto de esta realización, los ácidos nucleicos diana de los genotipos 1, 2 y 3 del parvovirus humano se aíslan de otros componentes de la muestra. En otro aspecto, el aislamiento se realiza utilizando un oligómero de captura de la diana. En un aspecto de esta realización, los ácidos nucleicos diana del HAV se aíslan de otros componentes de la muestra. En otro aspecto, el aislamiento se realiza utilizando un oligómero de captura de la diana. En un aspecto de esta realización, las reacciones de amplificación y detección incluyen un control interno.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente solicitud da a conocer secuencias de oligonucleótidos configuradas para su utilización como oligómeros de amplificación y oligómeros de sonda de detección para detectar, mediante un ensayo de amplificación de ácido nucleico in vitro, secuencias de ácido nucleico del virus de la hepatitis A y/o parvovirus tipos 1, 2 y 3 presentes en una muestra biológica. Una realización del procedimiento utiliza la amplificación de ácidos nucleicos mediada por transcripción (tal como se ha dado a conocer anteriormente en detalle en las Patentes US5,399,491 y US5,554,516 de Kacian et al.). Los procedimientos para detectar el ácido nucleico amplificado utilizan sondas específicas de secuencia que se hibridan específicamente con una parte de las secuencias amplificadas. En un aspecto, el procedimiento utiliza cualquier etapa de detección homogénea conocida para detectar, en una mezcla, una sonda marcada que se une a un ácido nucleico amplificado (por ejemplo, tal como se da a conocer por Arnold et al., Clin. Chem. 35:1588-1.594 (1989); Patente US5,658,737 de Nelson et al., y Patentes US5,118,801 y US5,312,728 de Lizardi et al.). La presente solicitud da a conocer también secuencias de oligonucleótidos que son útiles para capturar el ADN diana del virus de la hepatitis A o el ADN diana de parvovirus de tipos 1, 2 y 3 mediante la utilización de técnicas de hibridación de ácidos nucleicos. Una realización de la etapa de captura utiliza partículas magnéticas para separar la diana capturada (véase la Patente US6,110,678 de Weisburg et al.).
Cabe señalar que el término “un” o “una” entidad se refiere a una o más de dicha entidad; por ejemplo, se entiende que “un ácido nucleico” representa uno o más ácidos nucleicos. Como tal, los términos “un” (o “uno”), “uno o más” y “como mínimo, uno” se pueden utilizar indistintamente en el presente documento.
Por “muestra” o “muestra biológica” se entiende cualquier material derivado de un ser humano vivo o muerto que pueda contener ácido nucleico del parvovirus y/o ácido nucleico del virus de la hepatitis A, entre los que se incluyen, por ejemplo, esputo, sangre periférica, plasma, suero, tejido de biopsia que incluye ganglios linfáticos, tejido respiratorio o exudados, u otros fluidos, tejidos o materiales corporales. La muestra se puede tratar para alterar de manera física, química y/o mecánica la estructura tisular o celular, liberando de este modo los componentes intracelulares. La preparación de la muestra puede utilizar una solución que contenga tampones, sales, enzimas, detergentes y similares que se utilizan para preparar la muestra para el análisis. Las muestras se pueden agrupar a partir de dos o más fuentes (por ejemplo, una muestra de plasma agrupada a partir de dos o más donantes). Las muestras se pueden fraccionar (por ejemplo, una fracción de una muestra, tal como una muestra agrupada). Las muestras pueden ser una mezcla de plasma del fabricante para aislar componentes a partir de la misma.
“Ácido nucleico” se refiere a un compuesto multimérico que comprende dos o más nucleósidos o análogos de nucleósidos unidos covalentemente formados por un resto de azúcar y bases heterocíclicas nitrogenadas, o
análogos de bases. Los nucleósidos se unen entre sí mediante enlaces fosfodiéster u otros enlaces para formar polímeros u oligonucleótidos de ARN, ADN o ADN-ARN quimérico y análogos de los mismos. Un “esqueleto” de ácido nucleico puede estar formado por una variedad de enlaces (véase, por ejemplo, la Patente WO 95/32305). El resto de azúcar de uno o más residuos en el ácido nucleico puede ser ribosa o desoxirribosa, o compuestos similares que tengan sustituciones conocidas tales como, por ejemplo, sustituciones 2'-metoxi y sustituciones 2'-haluro (por ejemplo, 2'-F). La base nitrogenada de uno o más residuos en el ácido nucleico puede ser bases convencionales (A, G, C, T, U), análogos de las mismas (véase, por ejemplo, The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 11.a ed., 1992; Abraham et al., 2007, BioTechniques 43: 617-24), entre las que se incluyen derivados de bases purínicas o pirimidínicas (véanse, por ejemplo, las Patentes US5,378,825, US6,949,367 y WO 93/13121), o “abásicas” en las que la unidad de nucleósido carece de una base nitrogenada (véase, por ejemplo, la Patente US5,585,481). Los ácidos nucleicos pueden incluir uno o más residuos de “ácido nucleico bloqueado” (LNA, locked nucleic acid) (Vester et al., Biochemistry 43:13233-41, 2004). Los ácidos nucleicos pueden incluir un didesoxinucleótido 3'-terminal para bloquear la adición de nucleótidos adicionales al ácido nucleico. Los procedimientos sintéticos para producir ácidos nucleicos in vitro son bien conocidos en la técnica, aunque los ácidos nucleicos se pueden purificar a partir de fuentes naturales utilizando técnicas rutinarias. El esqueleto de un oligómero puede afectar la estabilidad de un complejo de hibridación (por ejemplo, formado entre un oligómero de captura y su ácido nucleico diana). Entre dichas realizaciones se incluyen enlaces peptídicos, enlaces 2'-O-metoxi y enlaces de tipo azúcar-fosfodiéster. Los ácidos nucleicos peptídicos son ventajosos para formar un complejo de hibridación con ARN. Un oligómero que tiene grupos de ARN sustituidos con 2'-metoxi o un ARN sustituido con 2'-fluoro puede mejorar la estabilidad del complejo de hibridación con respecto al ADN o ARN estándar y son preferentes para formar un complejo de hibridación con un ARN 2'-OH complementario. Un enlace que une dos grupos de azúcar puede afectar la estabilidad del complejo de hibridación al afectar la carga total o la densidad de la carga, o al afectar las interacciones estéricas (por ejemplo, los enlaces voluminosos pueden reducir la estabilidad del complejo de hibridación). Entre los enlaces preferentes se incluyen aquellos con grupos neutros (por ejemplo, metilfosfonatos) o grupos cargados (por ejemplo, fosforotioatos) para afectar la estabilidad del complejo.
El término “polinucleótido”, tal como se utiliza en el presente documento, indica una cadena de ácido nucleico. A lo largo de la presente solicitud, los ácidos nucleicos se designan desde el extremo 5' hasta el extremo 3'.
Un “nucleótido”, tal como se utiliza en el presente documento, es una subunidad de un ácido nucleico que consiste en un grupo fosfato, un azúcar de 5 carbonos y una base nitrogenada. El azúcar de 5 carbonos que se encuentra en el ARN es la ribosa. En el ADN, el azúcar de 5 carbonos es 2'-desoxirribosa. El término también incluye análogos de dichas subunidades, tales como un grupo metoxi en la posición 2' de la ribosa (2'-O-Mc). Tal como se utiliza en el presente documento, los oligonucleótidos metoxi que contienen residuos “T” tienen un grupo metoxi en la posición 2' del resto ribosa y un uracilo en la posición de base del nucleótido.
Una “unidad no nucleotídica”, tal como se utiliza en el presente documento, es una unidad que no participa significativamente en la hibridación de un polímero. Dichas unidades no deben, por ejemplo, participar en ningún enlace de hidrógeno significativo con un nucleótido, y se excluirían unidades que tengan como componente una de las cinco bases de nucleótidos o análogos de las mismas.
Los términos intercambiables “oligómero”, “oligo” y “oligonucleótido” se refieren a un polinucleótido que tiene una longitud de residuos de nucleótido (nt) contiguos de 1.000 nt a tan solo 5 nt. Se entiende que el intervalo de 1.000 a tan solo 5 es un intervalo inclusivo, de modo que 1000 nt, 5 nt y cada número entero de nt entre ellos están incluidos en el intervalo. Los oligonucleótidos se pueden purificar a partir de fuentes naturales o se pueden sintetizar utilizando cualquiera de una variedad de procedimientos enzimáticos o químicos bien conocidos. El término oligonucleótido no indica ninguna función particular del reactivo; más bien, se utiliza de manera genérica para cubrir todos los reactivos de ese tipo descritos en el presente documento.
Por “oligonucleótido de amplificación” u “oligómero de amplificación” se entiende un oligonucleótido cuyo, como mínimo, extremo 3’ es complementario a un ácido nucleico diana, y que se hibrida con un ácido nucleico diana, o su complemento, y participa en la amplificación del ácido nucleico. Entre los ejemplos de oligómeros de amplificación se incluyen cebadores y cebadores promotores. Preferentemente, un oligonucleótido de amplificación contiene, como mínimo, 10 bases contiguas y, más preferentemente, como mínimo, aproximadamente, 12 bases contiguas, pero menos de, aproximadamente, 70 bases, que se hibridan específicamente con una región de la secuencia de ácido nucleico diana en condiciones de hibridación estándar. Las bases contiguas que se hibridan con la secuencia diana tienen, como mínimo, aproximadamente, un 80 %, preferentemente, como mínimo, aproximadamente, un 90 % y más preferentemente, aproximadamente, un 100 % de complementariedad con la secuencia con la que se hibrida el oligonucleótido de amplificación. Como mínimo, aproximadamente, el X % se refiere a todo un intervalo de todos los números enteros y parciales desde el X % hasta el 100 %. Un oligonucleótido de amplificación puede incluir opcionalmente nucleótidos modificados.
Los oligómeros de amplificación se pueden denominar “cebadores” o “cebadores promotores”. Un “cebador” se refiere a un oligonucleótido que se hibrida con un ácido nucleico plantilla y tiene un extremo 3’ que se puede extender en una reacción de polimerización conocida. La región 5' del cebador puede ser no complementaria con el ácido nucleico diana, por ejemplo, la región 5' no complementaria puede incluir una secuencia de promotor y el
oligómero se denomina “cebador promotor” o puede incluir una secuencia de marcador, o puede incluir una secuencia adaptadora. Tal como se utiliza en el presente documento, un “promotor” es una secuencia específica de ácido nucleico que es reconocida por una ARN polimerasa dependiente de ADN (“transcriptasa”) como una señal para unirse al ácido nucleico y comenzar la transcripción del ARN en un sitio específico. Además, los cebadores promotores pueden comprender extremos 3' bloqueados para evitar su utilización como cebador y, en estos casos, el oligómero de amplificación se denomina proveedor de promotor. En algunas realizaciones, los restos bloqueantes reemplazan el 3’OH de un oligómero para evitar la extensión del oligómero mediada por enzimas en una reacción de amplificación. En realizaciones alternativas, un resto bloqueante puede estar dentro de los cinco residuos del extremo 3’ y es suficientemente grande para limitar la unión de una polimerasa al oligómero. En otras realizaciones, un resto bloqueante se une covalentemente al extremo 3’ de un oligómero. Se pueden utilizar muchos grupos químicos diferentes para bloquear el extremo 3’ de un oligómero, entre los que se incluyen, sin limitación, grupos alquilo, enlazadores no nucleótidos, residuos de didesoxinucleótidos de alcanodiol y cordicepina. Los expertos en la materia apreciarán además que cualquier oligómero que pueda funcionar como cebador (es decir, un oligonucleótido de amplificación que se hibrida específicamente con una secuencia diana y tiene un extremo 3' que puede extenderse mediante una polimerasa) se puede modificar para incluir una secuencia de promotor 5' y, por tanto, funcionan como un cebador promotor. De manera similar, cualquier cebador promotor se puede modificar mediante la eliminación de una secuencia de promotor, o sintetizar sin la misma y funcionar como cebador.
Un “ácido nucleico diana”, tal como se utiliza en el presente documento, es un ácido nucleico que comprende una “secuencia diana” que se va a amplificar. Los ácidos nucleicos diana pueden ser ADN o ARN, tal como se describe en el presente documento, y pueden ser monocatenarios o bicatenarios. El ácido nucleico diana puede incluir otras secuencias además de la secuencia diana, que pueden no amplificarse. Entre los ácidos nucleicos diana se incluyen el ácido nucleico genómico, un producto génico (por ejemplo, ARNm) y productos de amplificación de los mismos. Los ácidos nucleicos diana en el presente documento son ácidos nucleicos de parvovirus humano y ácidos nucleicos de HAV.
Por “aislado” se entiende que una muestra que contiene un ácido nucleico diana se toma de su medio natural, pero el término no implica ningún grado de purificación.
La expresión “secuencia diana”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la secuencia de nucleótidos particular del ácido nucleico diana que se va a amplificar y/o detectar. La “secuencia diana” incluye las secuencias complejantes con las que se complejan los oligonucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos cebadores y/u oligonucleótidos promotores) durante los procesos de amplificación. Cuando el ácido nucleico diana es originalmente monocatenario, el término “secuencia diana” también se referirá a la secuencia complementaria a la “secuencia diana” tal como está presente en el ácido nucleico diana. Cuando el ácido nucleico diana es originalmente bicatenario, el término “secuencia diana” se refiere a las cadenas sentido (+) y antisentido (-).
“Secuencia de unión a la diana” se utiliza en el presente documento para referirse a la porción de un oligómero que está configurada para hibridarse con una secuencia de ácido nucleico diana. Preferentemente, las secuencias de unión a la diana están configuradas para hibridarse específicamente con una secuencia de ácido nucleico diana. Las secuencias de unión a la diana pueden tener el 100 % de complementariedad con la porción de la secuencia diana con la que están configuradas para hibridarse, pero no necesariamente. Las secuencias de unión a la diana también pueden incluir residuos de nucleótidos insertados, eliminados y/o sustituidos con respecto a una secuencia diana. Puede surgir una complementariedad a una secuencia diana inferior al 100 % con una secuencia de unión a la diana, por ejemplo, cuando el ácido nucleico diana es una pluralidad de cepas dentro de una especie, como sería el caso de un oligómero configurado para hibridarse con las diversas cepas y genotipos del parvovirus humano. Se entiende que existen otras razones para configurar una secuencia de unión a la diana para que tenga menos del 100 % de complementariedad con un ácido nucleico diana.
La expresión “se dirige a una secuencia”, tal como se utiliza en el presente documento en referencia a una región de ácido nucleico de parvovirus humano, se refiere a un proceso mediante el cual un oligonucleótido se hibrida con la secuencia diana de una manera que permite la amplificación y detección, tal como se describe en el presente documento. En una realización, el oligonucleótido es complementario con la secuencia de ácido nucleico del parvovirus humano diana y no contiene apareamientos erróneos. En otra realización, el oligonucleótido es complementario, pero contiene 1, o 2, o 3, o 4 o 5 apareamientos erróneos con la secuencia de ácido nucleico del parvovirus humano diana. Preferentemente, el oligonucleótido que se hibrida con la secuencia de ácido nucleico del parvovirus humano incluye, como mínimo, de 10 a 50 nucleótidos complementarios con la secuencia diana. Se entiende que, como mínimo, 10 y hasta 50 es un intervalo inclusivo, de manera que se indican 10, 50 y cada número entero entre ellos. Preferentemente, el oligómero se hibrida específicamente con la secuencia diana. La expresión “configurada para dirigirse a una secuencia”, tal como se utiliza en el presente documento, significa que la región de hibridación con la diana de un oligonucleótido de amplificación está diseñada para tener una secuencia de polinucleótidos que podría hibridarse específicamente con la región de parvovirus humano referenciada o la región HAV referenciada. Dicho oligonucleótido de amplificación no está limitado solo a dirigirse solo a esa secuencia, sino que es útil como composición, en un kit o en un procedimiento para dirigirse a un ácido nucleico diana de parvovirus humano que incluye los genotipos 1, 2 y/o 3, o un ácido nucleico diana de HAV, tal como se describe en el presente
documento. La expresión “configurada para” indica una disposición real de la configuración de la secuencia de polinucleótidos de la secuencia de hibridación con la diana de los oligonucleótidos de amplificación.
El término “región”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una porción de un ácido nucleico en la que dicha porción es más pequeña que el ácido nucleico completo. Por ejemplo, cuando el ácido nucleico en referencia es un cebador promotor de un oligonucleótido, el término “región” se puede utilizar para referirse a la porción promotora más pequeña del oligonucleótido completo. De manera similar, y solo como ejemplo, cuando el ácido nucleico es un genoma de parvovirus humano, el término “región” se puede utilizar para referirse a un área más pequeña del ácido nucleico, en la que el área más pequeña es la diana de uno o más oligonucleótidos de la presente invención. La secuencia de unión a la diana de un oligonucleótido se puede hibridar con toda o una porción de una región. Una secuencia de unión a la diana que se hibrida con una porción de una región es una que se hibrida dentro de la región referenciada. Como otro ejemplo no limitante de la utilización del término región, cuando el ácido nucleico en referencia es un amplicón, el término región se puede utilizar para referirse a la secuencia de nucleótidos más pequeña identificada para la hibridación por la secuencia de unión a la diana de una sonda.
“Amplificación” se refiere a cualquier procedimiento conocido para obtener múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico diana o su complemento o fragmentos de la misma, y las realizaciones preferentes amplifican la diana de manera específica utilizando procedimientos específicos de secuencia. Entre los procedimientos de amplificación conocidos se incluyen, por ejemplo, amplificación mediada por transcripción, amplificación mediada por replicasa, amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction), incluyendo RT-PCR, amplificación mediante reacción en cadena de la ligasa (LCR, ligase chain reaction) y amplificación mediante desplazamiento de cadena (SDA, strand-displacement amplification). La amplificación mediada por replicasa utiliza moléculas de ARN autorreplicantes y una replicasa, tal como QB-replicasa (por ejemplo, véase la Patente US4,786,600 de Kramer et al. y la Patente WO 90/14439). La amplificación mediante PCR es bien conocida y utiliza ADN polimerasa, cebadores específicos de secuencia y ciclos térmicos para sintetizar múltiples copias de las dos cadenas complementarias de ADN o ADNc (por ejemplo, las Patentes US4,683,195, US4,683,202, y US4,800,159 de Mullis et al., y Methods in Enzymology, 1987, Vol. 155: 335-350). La amplificación mediante LCR utiliza, como mínimo, cuatro oligonucleótidos separados para amplificar una diana y su cadena complementaria utilizando múltiples ciclos de hibridación, ligadura y desnaturalización (Patente EP0 320 308). La SDA amplifica mediante la utilización de un cebador que contiene un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción que corta una cadena de un dúplex de ADN semimodificado que incluye la secuencia diana, seguido de la amplificación en una serie de etapas de extensión del cebador y desplazamiento de la cadena (Patente US5,422,252 de Walker et al.). Tal como se ilustra a continuación, las realizaciones preferentes utilizan la amplificación asociada a la transcripción. Será evidente para un experto en la materia que las etapas del procedimiento y los oligonucleótidos de amplificación de la presente invención se pueden adaptar fácilmente a una variedad de procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos basados en la extensión del cebador mediante una actividad de polimerasa.
La amplificación de un “fragmento” o “porción” de la secuencia diana se refiere a la producción de un ácido nucleico amplificado que contiene menos que la secuencia de ácido nucleico de la región diana completa. Dichos fragmentos se pueden producir amplificando una porción de la secuencia diana, por ejemplo, utilizando un oligonucleótido de amplificación que se hibrida e inicia la polimerización desde una posición interna en la secuencia diana.
Por “amplificación mediada por transcripción” (TMA, transcription-mediated amplification) o “amplificación asociada a la transcripción” se entiende una amplificación de ácido nucleico que utiliza una ARN polimerasa para producir múltiples transcritos de ARN a partir de una plantilla de ácido nucleico. De manera general, la amplificación asociada a la transcripción utiliza las actividades de ARN polimerasa y ADN polimerasa, trifosfatos de desoxirribonucleósido, trifosfatos de ribonucleósido y un cebador promotor y, opcionalmente, puede incluir uno o más oligonucleótidos de amplificación, entre los que se incluyen los oligómeros “auxiliares”. Las variaciones de la amplificación asociada a la transcripción son bien conocidas en la técnica y se describen en detalle en la bibliografía (véanse las Patentes US5,399,491 y US5,554,516 de Kacian et al., US5,437,990 de Burg et al., US5,130,238 de Malek et al., US4,868,105 y US5,124,246 de Urdea et al., WO 93/22461 de Kacian et al., WO 88/01302 y WO 88/10315 de Gingeras et al., las Patentes WO 94/03472 de McDonough et al. y w O 95/03430 de Ryder et al.). Los procedimientos de las Patentes US5,399,491 y US5,554,516 son realizaciones de amplificación preferentes. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “TMA en tiempo real” se refiere a la amplificación mediada por transcripción (“TMA”) de cebador único de ácido nucleico diana Que se controla mediante medios de detección en tiempo real.
Por “sonda”, “sonda de detección” u “oligómero de sonda de detección” se entiende un oligómero de ácido nucleico que se hibrida específicamente con una secuencia diana en un ácido nucleico, preferentemente en un ácido nucleico amplificado, en condiciones que permiten la hibridación, de manera que se permite la detección del ácido nucleico diana o amplificado. La detección puede ser directa (es decir, como resultado de la hibridación de una sonda directamente con la secuencia) o indirecta (es decir, como resultado de la hibridación de una sonda con una estructura molecular intermedia que une la sonda con la diana). De manera general, la “diana” de la sonda se refiere a una secuencia dentro de una secuencia de ácido nucleico amplificada o un subconjunto de la misma que se hibrida específicamente con, como mínimo, una porción de un oligómero de sonda mediante enlaces de hidrógeno estándar (es decir, emparejamiento de bases). Una sonda puede comprender secuencias específicas de la diana y
otras secuencias que contribuyen a la conformación tridimensional de la sonda (por ejemplo, las Patentes US5,118.801 y US5,312,728 de Lizardi et al. y US6,361,945 B1 de Becker et al.). Las sondas pueden ser de ADN, ARN, análogos de los mismos o combinaciones de los mismos y pueden estar marcadas o sin marcar. Las secuencias de la sonda son lo suficientemente complementarias a sus secuencias diana si están configuradas para permitir una hibridación estable en condiciones de hibridación apropiadas entre el oligómero de la sonda y una secuencia diana que no tiene complementariedad completa con la secuencia específica de la diana de la sonda.
Una “sonda fría” se refiere a un oligonucleótido que tiene una secuencia de oligonucleótidos sustancialmente similar o idéntica en comparación con un oligómero de sonda de detección. La principal diferencia entre la sonda fría y la sonda de detección es que la sonda fría carece de un marcador detectable, mientras que el oligómero de la sonda de detección posee un marcador detectable. Los oligómeros de sonda fría se utilizan en reacciones de detección para competir con el oligómero de sonda de detección, disminuyendo de este modo la señal total recibida en una etapa de detección. La señal de detección a menudo disminuye para una diana de un ensayo de detección y amplificación múltiplex en el que uno o más, pero no todos, los ácidos nucleicos diana tienen una cinética de amplificación robusta en comparación con uno o más miembros del múltiplex. La sonda fría se utiliza para competir con la sonda de detección en las amplificaciones más potentes, por lo que, en cierto sentido, “desajusta” la o las amplificaciones robustas. Las amplificaciones desajustadas se desplazan entonces a un intervalo que es más comparable con las especies de amplificación más débiles del múltiplex. De manera similar, una pseudodiana es un ácido nucleico que se aplica a una reacción de amplificación múltiplex para desajustar una especie de amplificación más fuerte, haciendo de este modo que su cinética de reacción sea más similar a la de una especie de amplificación más débil. Una pseudodiana es un ácido nucleico que normalmente contiene sitios de unión para los cebadores de las especies de amplificación más fuertes, pero tiene poca o ninguna secuencia adicional entre ellos. Entonces, los cebadores se desvían de la generación del producto de amplificación para las especies de amplificación más fuertes.
Por “complementario/a” se entiende que las secuencias de nucleótidos de regiones similares de dos ácidos nucleicos monocatenarios, o de regiones diferentes del mismo ácido nucleico monocatenario, tienen una composición de bases de nucleótidos que permite que las regiones monocatenarias se hibriden entre sí en una región bicatenaria unida por enlaces de hidrógeno estables en condiciones estrictas de hibridación o amplificación. Las secuencias que se hibridan entre sí pueden ser completamente complementarias o parcialmente complementarias con la secuencia diana prevista mediante emparejamiento de bases de ácidos nucleicos estándar (por ejemplo, emparejamiento G:C, A:T o A:U). Por “suficientemente complementario/a” se entiende una secuencia contigua que es capaz de hibridarse con otra secuencia mediante enlaces de hidrógeno entre una serie de bases complementarias, que pueden ser complementarias en cada posición de la secuencia mediante emparejamiento de bases estándar o pueden contener uno o más residuos no complementarios, entre los que se incluyen residuos abásicos. Las secuencias contiguas suficientemente complementarias tienen normalmente, como mínimo, un 80 % o, como mínimo, un 90 %, de complementariedad con una secuencia con la que se pretende que un oligómero se hibride específicamente (incluidos todos los números enteros y racionales hasta el 100 % inclusive). Las secuencias que son “suficientemente complementarias” permiten la hibridación estable de un oligómero de ácido nucleico con su secuencia diana en condiciones de hibridación apropiadas, incluso si las secuencias no son completamente complementarias. Cuando una secuencia contigua de nucleótidos de una región monocatenaria es capaz de formar una serie de pares de bases “canónicas” unidas por enlaces de hidrógeno con una secuencia análoga de nucleótidos de la otra región monocatenaria, de modo que A está emparejado con U o T y C está emparejado con G, las secuencias de nucleótidos son “completamente” complementarias (por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) en §§ 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 y 11.47-11.57, particularmente, en §§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 y 11.55-11.57).
Por “hibridarse preferentemente” o “hibridarse específicamente” se entiende que, en condiciones estrictas de ensayo de hibridación, las sondas se hibriden con sus secuencias diana, o réplicas de las mismas, para formar híbridos sonda:diana estables, a la vez que al mismo tiempo se minimiza la formación híbridos de sonda:no diana estables. De este modo, una sonda se hibrida con una secuencia diana o se replica a partir de la misma en un grado suficientemente mayor que con una secuencia no diana, para permitir que un experto en la materia detecte con precisión las réplicas de ARN o el ADN complementario (ADNc) de la secuencia diana formado durante la amplificación. Las condiciones de hibridación apropiadas son bien conocidas en la técnica, se pueden predecir en función de la composición de la secuencia o se pueden determinar mediante la utilización de procedimientos de prueba de rutina (por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) en §§ 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 y 11.47-11.57, particularmente en §§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 y 11.55-11.57).
Por “oligonucleótido de captura” u “oligómero de captura” o “sonda de captura” se entiende un oligómero de ácido nucleico que se hibrida específicamente con un ácido nucleico diana a capturar y proporciona un medio para aislar y/o concentrar la diana de otros componentes de la muestra. Las realizaciones de los oligómeros de captura incluyen dos regiones de unión: una región de unión a la diana y una región de unión a la sonda inmovilizada, por lo que el oligómero de captura forma un complejo de hibridación en el que la región de unión a la diana del oligómero de captura se une a la secuencia diana y la región de unión a la sonda inmovilizada se une a un oligómero
inmovilizado sobre un soporte sólido (véanse las Patentes US6,110,678 y US6,280,952 de Weisburg et al.). Aunque la región de unión a la diana y la región de unión a la sonda inmovilizada normalmente están en el mismo oligómero de captura, las dos regiones funcionales pueden estar presentes en dos oligómeros diferentes unidos por uno o más conectores. Por ejemplo, una región de unión a la sonda inmovilizada puede estar presente en un primer oligómero, una región de unión a la diana puede estar presente en un segundo oligómero y los dos oligómeros se unen mediante enlaces de hidrógeno con un tercer oligómero que es un enlazador que se hibrida específicamente con las secuencias del primer y segundo oligómeros. La región de unión a la diana de una sonda de captura se puede denominar también porción específica de la diana de la sonda de captura y la región de unión a la sonda inmovilizada se puede denominar porción de cola. Entre las realizaciones de porciones de cola se incluyen homopolímeros (por ejemplo, poli-dT o poli-dA) o no homopolímeros (por ejemplo, T0-3A15-30), preferentemente unidos al extremo 3' de la porción específica de la diana del oligómero.
Por “sonda inmovilizada” u “oligómero inmovilizado” se entiende un oligómero de ácido nucleico que une, directa o indirectamente, un oligómero de captura a un soporte inmovilizado. Una sonda inmovilizada unida a un soporte sólido facilita la separación de la secuencia diana unida del material no unido en una muestra. Se puede utilizar cualquier soporte sólido conocido, tal como matrices y partículas en solución, por ejemplo, nitrocelulosa, nailon, vidrio, poliacrilato, polímeros mixtos, poliestireno, polipropilensilano y partículas metálicas, preferentemente partículas magnéticamente atrayentes. Los soportes preferentes son esferas paramagnéticas monodispersas (por ejemplo, tamaño uniforme ± 5 %), para proporcionar resultados consistentes, a las que se une una sonda inmovilizada directamente (por ejemplo, a través de un enlace covalente directo, quelación o interacción iónica), o indirectamente (por ejemplo, a través de uno o más enlazadores), en los que el enlace o la interacción es estable durante las condiciones de hibridación de ácidos nucleicos.
“Preparación de muestra” se refiere a cualquier etapa o procedimiento que trata una muestra para la posterior amplificación y/o detección de ácidos nucleicos de parvovirus humanos presentes en la muestra. Las muestras pueden ser mezclas complejas de componentes de las que el ácido nucleico diana es un componente minoritario. La preparación de muestras puede incluir cualquier procedimiento conocido de concentración de componentes, tales como microbios o ácidos nucleicos, a partir de un volumen de muestra más grande, tal como mediante filtración de partículas en el aire o en el agua a partir de una muestra de mayor volumen o por aislamiento de microbios de una muestra utilizando procedimientos de microbiología estándar. La preparación de la muestra puede incluir la disrupción física y/o la lisis química de los componentes celulares para liberar los componentes intracelulares en una fase sustancialmente acuosa u orgánica y la eliminación de desechos, tal como mediante filtración, centrifugación o adsorción. La preparación de la muestra puede incluir la utilización de un oligonucleótido de ácido nucleico que capture de manera selectiva o no específica un ácido nucleico diana y lo separe de otros componentes de la muestra (por ejemplo, tal como se describe en las Patentes US6,110,678 y WO 2008/016988).
Por “separar” o “purificar” se entiende que uno o más componentes de la muestra biológica se eliminan de, como mínimo, otro componente de la muestra. Entre los componentes de la muestra se incluyen de manera general una solución acuosa de ácidos nucleicos, sales, proteínas, carbohidratos y lípidos. Una etapa de separación o purificación de un ácido nucleico elimina, como mínimo, el 70 % aproximadamente, preferentemente, como mínimo, el 90 % aproximadamente y, más preferentemente, como mínimo, el 95 % aproximadamente, de los otros componentes en la muestra.
Por “marcador” se entiende un resto o compuesto molecular que se puede detectar o puede conducir a una señal detectable. Un marcador se une, directa o indirectamente, a una sonda de ácido nucleico. El marcado directo utiliza enlaces o interacciones que enlazan el marcador con la sonda, entre los que se incluyen enlaces covalentes o interacciones no covalentes, tales como enlaces de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas e iónicas, o mediante la formación de quelatos o complejos de coordinación. El marcado indirecto utiliza un resto puente o “enlazador” (por ejemplo, oligonucleótido o anticuerpo) para unir el marcador y la sonda. Los enlazadores se pueden utilizar para amplificar una señal detectable. Los marcadores son cualquier resto detectable conocido, por ejemplo, radionúclido, ligando (por ejemplo, biotina, avidina), enzima o sustrato de enzima, grupo reactivo o cromóforo, tal como un colorante o partícula detectable (por ejemplo, micropartículas de látex o partículas de metal), compuestos luminiscentes (por ejemplo, marcadores bioluminiscentes, fosforescentes o quimioluminiscentes) y compuestos fluorescentes. Preferentemente, el marcador en una sonda marcada es detectable en una reacción homogénea (es decir, en una mezcla, la sonda marcada unida muestra un cambio detectable, tal como estabilidad o degradación diferencial, en comparación con la sonda marcada no unida). Una realización de un marcador para su utilización en un ensayo homogéneo es un compuesto quimioluminiscente (por ejemplo, descrito en detalle en las Patentes US5,656,207 de Woodhead et al., US5,658,737 de Nelson et al., y US5,639,604 to Arnold, Jr., et al.). Los marcadores quimioluminiscentes preferentes son compuestos de éster de acridinio (AE), tales como AE estándar o derivados del mismo (por ejemplo, naftil-AE, orfo-AE, 1-metil-AE o 3-metil-AE, 2,7-dimetil-AE, 4,5-dimetil-AE, orto-dibromo-AE, orto-dimetil-AE, meta-dimetil-AE, orto-metoxi-AE, orto-metoxi(cinamil)-AE, orto-metil-AE, orto-fluoro-AE, 1-metil-orto-fluoro-AE o 3-metil-orfo-fluoro-AE, 1-metil-meta-difluoro-AE o 3-metil-meta-difluoro-AE y 2-metil-AE). La síntesis y los procedimientos para unir marcadores a ácidos nucleicos y detectar marcadores son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), Capítulo 10; Patentes US4,581,333 de Kourilsky et al., US5,658,737 de Nelson et al., US5,656,207 de Woodhead et al., US5.547.842 de Hogan et al., US5,283,174 de
Arnold, Jr. Et al. y la Patente EP 0747706 de Becker et al.). Otra realización de un marcador para su utilización en un ensayo homogéneo es un compuesto fluorescente unido a una sonda con un compuesto inhibidor en proximidad funcional al marcador fluorescente cuando la sonda no está hibridada con su diana (por ejemplo, Patentes US5,118,801 y US5,312,728 de Lizardi et al., y US6,361,945 B1 de Becker et al.).
Un “marcador detectable homogéneo” se refiere a un marcador cuya presencia se puede detectar de manera homogénea en función de si la sonda marcada se hibrida con una secuencia diana (es decir, se puede detectar sin eliminar físicamente el marcador no hibridado o la sonda marcada). Se han descrito realizaciones de marcadores detectables homogéneos y procedimientos para detectarlos (Patente US5,283,174 de Arnold et al., US5,656,207 de Woodhead et al., US5,658,737 de Nelson et al., US5,118,801 y US5,312,728 de Lizardi et al., y US6,361,945 B1 de Becker et al.).
Por “que consiste esencialmente en” se entiende que se pueden incluir uno o más componentes adicionales y etapas del procedimiento que no cambien materialmente las características básicas y novedosas de la presente invención. Entre dichas características se incluyen sales, agentes reguladores de pH, oligómeros de ácidos nucleicos y reactivos bioquímicos similares que no tienen un efecto material sobre las características de los componentes reivindicados o las etapas del procedimiento descritos en el presente documento que detectan las secuencias de ácidos nucleicos del virus de la hepatitis A y/o el parvovirus de tipos 1, 2 y 3. De manera similar, se pueden incluir etapas adicionales del procedimiento que no tengan un efecto material sobre la naturaleza básica del ensayo.
Tal como se utiliza en el presente documento, un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico “que comprende” o “que consiste en” o “que consiste esencialmente en” una secuencia seleccionada entre un grupo de secuencias específicas significa que el oligonucleótido, como característica básica y novedosa, es capaz de hibridarse de manera estable con un ácido nucleico que tiene el complemento exacto de una de las secuencias de ácido nucleico enumeradas del grupo en condiciones de hibridación estrictas. Un complemento exacto incluye la correspondiente secuencia de ADN o ARN.
Tal como se utiliza en el presente documento, un oligonucleótido que “corresponde a” o “correspondiente a” una secuencia de ácido nucleico específica significa que el oligonucleótido al que se hace referencia es suficientemente similar a la secuencia de ácido nucleico de referencia, de modo que el oligonucleótido tiene propiedades de hibridación similares a la secuencia del ácido nucleico de referencia, en el sentido de que se hibridaría con la misma secuencia de ácido nucleico diana en condiciones de hibridación estrictas. Un experto en la materia entenderá que los “oligonucleótidos correspondientes” pueden variar de la secuencia a la que se hace referencia y aun así hibridarse con la misma secuencia de ácido nucleico diana. También se entiende que un primer ácido nucleico correspondiente a un segundo ácido nucleico incluye los complementos del mismo e incluye el ARN y el ADN del mismo. Esta variación del ácido nucleico se puede expresar en términos de porcentaje de bases idénticas dentro de la secuencia o el porcentaje de bases perfectamente complementarias entre la sonda o el cebador y su secuencia diana. De este modo, un oligonucleótido “corresponde a” una secuencia de ácido nucleico de referencia si estos porcentajes de identidad o complementariedad de bases son del 100 % a, aproximadamente, el 80 %. En realizaciones preferentes, el porcentaje es del 100 % a, aproximadamente, el 85 %. En realizaciones más preferentes, este porcentaje puede ser del 100 % a, aproximadamente, el 90 %; en otras realizaciones preferentes, este porcentaje es del 100 % a, aproximadamente, el 95 %. De manera similar, en el presente documento una región de un ácido nucleico o un ácido nucleico amplificado se puede denominar como correspondiente a una secuencia de ácido nucleico de referencia. Un experto en la materia comprenderá las diversas modificaciones de las condiciones de hibridación que podrían ser necesarias en diversos porcentajes de complementariedad para permitir la hibridación con una secuencia diana específica sin causar un nivel inaceptable de hibridación no específica.
El término “amplicón” o la expresión “producto de amplificación”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la molécula de ácido nucleico generada durante un procedimiento de amplificación que es complementaria u homóloga a una secuencia contenida dentro de la secuencia diana. Esta secuencia complementaria u homóloga de un amplicón a veces se denomina en el presente documento “secuencia específica de la diana”. Los amplicones pueden ser monocatenarios o bicatenarios y pueden incluir ADN, ARN o ambos. Por ejemplo, la ARN polimerasa dependiente de ADN transcribe amplicones monocatenarios a partir de ADN bicatenario durante los procedimientos de amplificación mediada por transcripción. Estos amplicones monocatenarios son amplicones de ARN y pueden ser cualquier cadena de un complejo bicatenario, dependiendo de cómo se diseñen los oligómeros de amplificación. De este modo, los amplicones pueden ser ARN monocatenarios. Las ADN polimerasas dependientes de ARN sintetizan una cadena de a Dn que es complementaria a una plantilla de ARN. De este modo, los amplicones pueden ser híbridos de ADN y ARN bicatenario. Las ADN polimerasas dependientes de ARN incluyen habitualmente actividad de ARNasa o se utilizan junto con una ARNasa, que degrada la cadena de ARN. De este modo, los amplicones pueden ser ADN monocatenario. Las ADN polimerasas dependientes de ARN y las ADN polimerasas dependientes de ADN sintetizan cadenas de ADN complementarias a partir de plantillas de ADN. De este modo, los amplicones pueden ser ADN bicatenario. Las ARN polimerasas dependientes de ARN sintetizan ARN a partir de una plantilla de ARN. De este modo, los amplicones pueden ser ARN bicatenario. Las ARN polimerasas dependientes de ADN sintetizan ARN a partir de plantillas de ADN bicatenario, también denominada transcripción. De este modo, los amplicones pueden ser ARN monocatenarios. Los amplicones y los procedimientos para generar amplicones son
conocidos por los expertos en la materia. Por conveniencia en el presente documento, una cadena sencilla de ARN o una cadena sencilla de ADN pueden representar un amplicón generado por una combinación de oligómeros de amplificación de la presente invención. Dicha representación no pretende limitar el amplicón a la representación mostrada. Los expertos en la materia que posean la presente divulgación utilizarán oligómeros de amplificación y enzimas polimerasas para generar cualquiera de los numerosos tipos de amplicones.
Una “secuencia no específica de la diana”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una región de una secuencia de oligómero, en la que dicha región no se hibrida de manera estable con una secuencia diana en condiciones de hibridación estándar. Entre los oligómeros con secuencias no específicas de la diana se incluyen, entre otros, cebadores promotores y balizas moleculares. Un oligómero de amplificación puede contener una secuencia que no es complementaria a la secuencia diana o plantilla; por ejemplo, la región 5’ de un cebador puede incluir una secuencia de promotor que no es complementaria al ácido nucleico diana (denominado “cebador promotor”). Los expertos en la materia comprenderán que un oligómero de amplificación que funciona como cebador se puede modificar para incluir una secuencia de promotor 5’ y, por tanto, funcionar como cebador promotor. De manera similar, un cebador promotor se puede modificar mediante la eliminación de una secuencia de promotor, o sintetizarse sin la misma, y seguir funcionando como cebador. Un oligómero de amplificación bloqueado en 3’ puede proporcionar una secuencia de promotor y servir como plantilla para la polimerización (denominado “proveedor de promotor”). De este modo, un amplicón que se genera mediante un miembro de oligómero de amplificación, tal como un cebador promotor, comprenderá una secuencia específica de la diana y una secuencia no específica de la diana.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión “unidad de luz relativa” (“RLU”, relative light unit) es una unidad de medida arbitraria que indica el número relativo de fotones emitidos por la muestra en una longitud de onda o banda de longitudes de onda dada. La RLU varía con las características de los medios de detección utilizados para la medición.
El término “especificidad”, en el contexto de un sistema de amplificación y/o detección, se utiliza en el presente documento para referirse a la característica del sistema que describe su capacidad para distinguir entre secuencias diana y no diana dependiendo de la secuencia y las condiciones del ensayo. En términos de amplificación de ácidos nucleicos, la especificidad se refiere, de manera general, a la relación entre la cantidad de amplicones específicos producidos y la cantidad de productos secundarios (por ejemplo, la relación señal/ruido). En términos de detección, la especificidad se refiere, de manera general, a la proporción entre la señal producida a partir de los ácidos nucleicos diana respecto a la señal producida por los ácidos nucleicos no diana.
El término “sensibilidad” se utiliza en el presente documento para referirse a la precisión con la que se puede detectar o cuantificar una reacción de amplificación de ácido nucleico. La sensibilidad de una reacción de amplificación es, de manera general, una medida del número más pequeño de copias del ácido nucleico diana que se puede detectar de manera fiable en el sistema de amplificación y dependerá, por ejemplo, del ensayo de detección que se utilice y de la especificidad de la reacción de amplificación, por ejemplo, la proporción de amplicones específicos respecto a productos secundarios.
Los ensayos de la presente divulgación detectan el parvovirus humano presente en una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, plasma, esputo, lavado bronquial). En una realización, el ensayo detectó ácidos nucleicos diana de parvovirus y/o HAV en muestras de plasma que proceden de donantes individuales o de una colección agrupada de muestras de donantes. Para preparar las muestras de plasma, las muestras de sangre completa se centrifugaron utilizando procedimientos estándar y el plasma se almacenó a 4 °C o a -20 °C antes de la prueba. Para lisar las partículas virales en la muestra, se mezcló la muestra con un reactivo de lisis que contenía un detergente para liberar los ácidos nucleicos diana a partir de las partículas virales. El procesamiento de las muestras puede combinar la lisis viral con la purificación de los ácidos nucleicos virales diana al incluir un oligómero de captura y un oligómero inmovilizado en el reactivo de lisis. A continuación, el procedimiento incluye una etapa de captura de la diana en la que los ácidos nucleicos diana se hibridan específicamente con los oligómeros de captura que, a continuación, se hibridan con oligómeros inmovilizados, y cada complejo unido (es decir, oligómero inmovilizado, oligómero de captura y ácido nucleico diana) se separa sustancialmente de otros componentes de la muestra. Lavar el soporte sólido con el complejo que contiene parvovirus unido elimina los componentes residuales de la muestra. De este modo, el ácido nucleico diana se separa de otros componentes de la muestra y se concentra en los complejos unidos, sin liberar el ácido nucleico diana unido del soporte sólido.
El procesamiento normal de muestras implicó las siguientes etapas (descritas en detalle en la Patente US6,110,678, Patente WO 2008/016988 y Patente US2006/0068417). Las partículas virales en el fluido corporal (por ejemplo, 0,5 ml de plasma) se lisaron por contacto a 60 °C con reactivo de captura de la diana (HEPES 790 mM, LiOH 680 mM, laurilsulfato de litio (LLS) al 10 %, succinato 230 mM, como mínimo, una sonda de captura a 7 μm/ml y 100 |¿g/ml de poli-dT 14 unido a partículas magnéticas (SERADYN™, Indianápolis, Indiana)). Los oligómeros de captura comprendían una secuencia de región de unión con la diana en 5'. Los oligómeros de captura comprendían además una secuencia de cola 3' de homopolímero o no homopolímero que se hibrida con el oligómero complementario unido al soporte sólido (por ejemplo, un oligo-dT unido a un soporte sólido y una porción de cola de oligo-dA de un oligómero de captura). La hibridación de captura de la diana tiene lugar en esta mezcla de reacción al incubarse la mezcla a una primera temperatura (60 °C), permitiendo que el oligómero de captura se una específicamente a su
secuencia diana complementaria en un ácido nucleico diana. A continuación, la mezcla se enfrió a 40 °C o inferior (por ejemplo, temperatura ambiente) para permitir que la cola 3' del oligómero de captura se hibride con su oligómero complementario en la partícula. Después de la segunda hibridación, la mezcla se trata para separar el soporte sólido con su complejo unido de ácidos nucleicos de los otros componentes de la muestra, por ejemplo, utilizando separación gravitacional, centrífuga o magnética. De manera general, la separación utilizó una rejilla que contenía un imán para arrastrar las partículas magnéticas con complejos de ácido nucleico unidos hacia el costado del tubo. A continuación, se eliminó el sobrenadante y los complejos unidos a las partículas se lavaron con 1 ml de un tampón de lavado (HEPES 10 mM, NaOH 6,5 mM, EDTA 1 mM, etanol absoluto al 0,3 % (v/v), metilparabeno al 0,02 % (p/v)), propilparabeno al 0,01 % (p/v), NaCl 150 mM, dodecilsulfato de sodio al 0,1 % (SDS), pH 7,5) suspendiendo las partículas magnéticas en tampón de lavado, separando las partículas en el lado del tubo y eliminando el sobrenadante.
Después de la preparación de la muestra, se consiguió la amplificación del ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A y/o del parvovirus mediante la utilización de oligómeros de amplificación que definen los extremos 5' y 3' de la región amplificada mediante la síntesis de ácido nucleico mediada por enzimas in vitro para generar un amplicón. Una realización utiliza un procedimiento de amplificación mediada por transcripción (TMA), sustancialmente tal como se describe en las Patentes US5,399,491 y US5,554,516, que es un sistema sustancialmente isotérmico que produce una gran cantidad de productos de amplificación (transcritos de ARN) que se pueden detectar. Las realizaciones preferentes del procedimiento utilizaron mezclas de oligómeros de amplificación en las que, como mínimo, un cebador promotor se combina con, como mínimo, un cebador.
Una realización preferente de combinaciones de oligómeros de amplificación comprende un miembro oligómero cebador y un miembro oligómero basado en promotor. Preferentemente, un oligómero de amplificación basado en un promotor es un cebador promotor que comprende una secuencia de promotor de ARN polimerasa en 5' y una secuencia de unión a la diana en 3'. Se sabe en la técnica que entre las secuencias promotoras de ARN polimerasa se incluyen, sin limitación, secuencias promotoras de ARN polimerasa sp6, secuencias promotoras de ARN polimerasa T3 y secuencias promotoras de ARN polimerasa T7. En las realizaciones preferentes, un cebador promotor comprende una secuencia de promotor de ARN polimerasa T7 en 5' y una secuencia de unión a la diana en 3'. De la manera más preferentemente, la secuencia del promotor de ARN polimerasa T7 en 5' es la SEQ ID NO: 196.
En una realización preferente, la secuencia de unión a la diana en 3' de un oligómero de amplificación basado en un promotor tiene una longitud de, aproximadamente, 10 a, aproximadamente, 40 nucleobases y comprende una secuencia de ácido nucleico que está configurada para hibridarse específicamente con una región dentro de una secuencia diana de un ácido nucleico de parvovirus humano o un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A. Otros cebadores promotores preferentes comprenden una secuencia de marcador interno, que está flanqueada en su extremo 5’ por una secuencia de promotor y en su extremo 3' por una secuencia de unión a la diana. Las secuencias de marcadores internos se denominan también en el presente documento secuencias de inserción. Una secuencia de marcador interno es cualquier secuencia de ácido nucleico que, preferentemente, no se hibrida de manera estable con el ácido nucleico diana ni interfiere con la secuencia de unión diana que se hibrida con el ácido nucleico diana. Además, una secuencia de marcador interno tiene, preferentemente, una longitud y una composición suficientes para que, una vez incorporada en un producto de amplificación, se pueda utilizar un oligómero de amplificación específico de marcador para participar en rondas posteriores para generar el producto de amplificación. Una secuencia de marcador preferente tiene una longitud de, aproximadamente, 10 nucleótidos a, aproximadamente, 50 nucleótidos. Además, se reconoce que las secuencias de inserción se pueden incluir con cualquiera de los miembros de oligómeros basados en promotores de la presente divulgación.
En una realización preferente, la combinación de oligómeros de amplificación comprende, como mínimo, un miembro oligómero de amplificación cebador. Los oligómeros de amplificación cebadores preferentes tienen una longitud de, aproximadamente, 10 nucleobases a, aproximadamente, 50 nucleobases, y tienen una composición de nucleótidos configurada para hibridarse específicamente con el virus de la hepatitis A o el parvovirus humano de tipos 1, 2 y 3 para generar un producto de amplificación detectable cuando se utiliza en una reacción de amplificación de la presente divulgación. Un oligómero cebador preferente tiene una longitud de, aproximadamente, 10 a, aproximadamente, 50 nucleobases. Los miembros oligómeros cebadores de la presente invención se definen en las reivindicaciones. Estas descripciones no necesitan repetirse en el presente documento. Otros miembros oligómeros cebadores preferentes comprenden una secuencia de marcador en 5'. Una secuencia de marcador en 5' es cualquier secuencia de ácido nucleico que, preferentemente, no se hibrida de manera estable con el ácido nucleico diana ni interfiere con la secuencia de unión a la diana que se hibrida con el ácido nucleico diana. Además, una secuencia de marcador en 5' tiene, preferentemente, una longitud y una composición suficientes para que, una vez incorporada en un producto de amplificación, se pueda utilizar un oligómero de amplificación específico de marcador para participar en rondas posteriores para generar el producto de amplificación. Una secuencia de marcador en 5' preferente tiene una longitud de, aproximadamente, 10 nucleótidos a, aproximadamente, 50 nucleótidos. Otra secuencia de marcador preferente tiene una longitud de, aproximadamente, 12 nucleótidos. Además, se reconoce que las secuencias de marcadores en 5' se pueden incluir con cualquiera de los miembros oligómeros cebadores de la presente divulgación.
La amplificación del ácido nucleico diana mediante la amplificación mediada por transcripción produce muchas cadenas de ácido nucleico a partir de una única copia del ácido nucleico diana, lo que permite la detección de la diana mediante la detección de sondas que se hibridan con las secuencias del producto de amplificación. De manera general, la mezcla de reacción incluye el ácido nucleico diana y, como mínimo, dos oligómeros de amplificación que comprenden, como mínimo, un cebador, como mínimo, un cebador promotor, actividades de transcriptasa inversa y ARN polimerasa, sustratos de síntesis de ácidos nucleicos (desoxirribonucleósidos trifosfato y ribonucleósidos trifosfato) y sales y tampones apropiados en solución para producir múltiples transcritos de ARN a partir de una plantilla de ácido nucleico. Brevemente, un cebador promotor se hibrida específicamente con una porción de la secuencia diana. La transcriptasa inversa que incluye actividad de ARNasa H crea una primera cadena de ADNc mediante la extensión en 3' del cebador promotor. El ADNc se hibrida con un cebador en la dirección 3’ del cebador promotor y se sintetiza una nueva cadena de ADN a partir del extremo 3' del cebador utilizando la transcriptasa inversa para crear un ADNbc que tiene una secuencia de promotor funcional en un extremo. La ARN polimerasa se une al ADNbc en la secuencia del promotor y transcribe múltiples transcritos o amplicones. Estos amplicones se utilizan posteriormente en el proceso de amplificación, sirviendo como plantilla para una nueva ronda de replicación, para generar finalmente grandes cantidades de ácido nucleico amplificado monocatenario a partir de la secuencia diana inicial (por ejemplo, de 100 a 3.000 copias de ARN sintetizado a partir de una sola plantilla). El proceso utiliza condiciones de reacción sustancialmente constantes (es decir, sustancialmente isotérmicas). Una reacción de amplificación típica de 100 μl utiliza 75 μl de una mezcla de reactivos de amplificación (Base Tris 11,6 mM, Tris-HCl 15,0 mM, MgCl222,7 mM, KCl 23,3 mM, glicerol al 3,33 %, acetato de Zn (dihidrato) 0,05 mM, dATP, dCTP, dGTP y dTTP, cada uno a 0,665 mM, ATP, CTP, GTP y UTP, cada uno a 5,32 mM, pH 7) y 25 μl de una mezcla de reactivos enzimáticos (700 U de ARN polimerasa T7, 1.400 U de transcriptasa inversa de virus Moloney murino de la leucemia (MMLV-RT, Moloney Marine Leukemia Virus reverse transcriptase), HEPES 16 mM (ácido libre, dihidrato), N-acetil-L-cisteína 70 mM, EDTA 3 mM, Na-azida al 0,05 % (p/v), base Tris 20 mM, KCl 50 mM, glicerol anhidro al 20 % (v/v), TRITON® X-102 al 10 % (v/v) y trehalosa 150 mM (dihidrato), pH 7), mezclada preferentemente con el ácido nucleico diana capturado retenido sobre las partículas sólidas. Para las actividades enzimáticas, 1 U de ARN polimerasa T7 incorpora 1 nmol de ATP en el ARN en 1 hora a 37 °C utilizando una plantilla de ADN que contiene un promotor de T7, y 1 U de MMLV-RT incorpora 1 nmol de dTTP en ADN en 10 minutos a 37 °C utilizando 200-400 μmol de poli(A) cebado con oligo dT como plantilla. Los oligómeros de amplificación están en el intervalo de, aproximadamente, 5-20 μmol/reacción, o más normalmente, 7-15 μmol/reacción, aproximadamente, o más normalmente, 5-15 μmol/reacción, aproximadamente, o más normalmente, 5-10 μmol/reacción, aproximadamente, incluyendo estos intervalos todos los números enteros y parciales en los mismos.
En una realización preferente, se realiza una reacción de TMA utilizando una combinación de oligómeros de amplificación, en la que dicha combinación comprende, como mínimo, un miembro oligómero cebador promotor y, como mínimo, un miembro oligómero cebador, y en la que dicha combinación está configurada para generar productos de amplificación para la detección de virus de la hepatitis A y/o parvovirus humano de tipo 1, 2 y 3. En un aspecto particular, se realiza una reacción de TMA que utiliza, como mínimo, un oligómero de amplificación no T7 del virus de la hepatitis A (SEQ ID NO: 1-11) y, como mínimo, un oligómero de amplificación basado en promotor del virus de la hepatitis A (SEQ ID NO: 12-28). En un aspecto particular, se realiza una reacción de TMA que utiliza, como mínimo, un oligómero de amplificación no T7 de parvovirus (SEQ ID NO: 75-87) y, como mínimo, un oligómero de amplificación basado en promotor de parvovirus (SEQ ID NO: 88-107). En un aspecto particular, se realiza una reacción de TMA múltiplex que utiliza, como mínimo, un oligómero de amplificación no T7 del virus de la hepatitis A (SEQ ID NO: 1-11) y, como mínimo, un oligómero de amplificación basado en promotor del virus de la hepatitis A (SEQ ID NO: 12-28). En un aspecto particular, se realiza una reacción de TMA múltiplex que utiliza, como mínimo, un oligómero de amplificación no T7 de parvovirus (SEQ ID NO: 75-87) y, como mínimo, un oligómero de amplificación basado en promotor de parvovirus (SEQ ID NO: 88-107). En un aspecto particular, se realiza una reacción de TMA múltiplex que utiliza, como mínimo, un oligómero de amplificación no T7 de parvovirus (SEQ ID NO: 75-87), como mínimo, un oligómero de amplificación basado en promotor de parvovirus (SEQ ID NO: 88-107), como mínimo, un oligómero de amplificación no T7 del virus de la hepatitis A (SEQ ID NO: 1-11) y, como mínimo, un oligómero de amplificación basado en promotor del virus de la hepatitis A (SEQ ID NO: 12-28). En un aspecto de esta realización, la combinación de oligómeros de amplificación comprende, como mínimo, un miembro de oligómero cebador promotor que comprende una secuencia de promotor en 5', una secuencia de marcador interno y una secuencia de unión a la diana en 3'. En un aspecto de esta realización, la combinación de oligómeros de amplificación comprende, como mínimo, un miembro oligómero cebador promotor que comprende una secuencia de promotor en 5', una secuencia de marcador interno y una secuencia de unión a la diana en 3', y comprende también, como mínimo, un miembro oligómero cebador promotor que comprende una secuencia de promotor en 5' y una secuencia de unión a la diana 3'. En un aspecto de esta realización, la combinación de oligómeros de amplificación comprende, como mínimo, un miembro de oligómero cebador que comprende una secuencia de marcador en 5' y una secuencia de unión a la diana en 3'. En un aspecto de esta realización, la combinación de oligómeros de amplificación comprende, como mínimo, un miembro oligómero cebador que comprende una secuencia de marcador en 5' y una secuencia de unión a la diana en 3', y también comprende, como mínimo, un miembro oligómero cebador que comprende una secuencia de unión a la diana en 3'.
En otra realización preferente, la reacción de TMA se realiza con una combinación de oligómeros de amplificación que comprende, como mínimo, un miembro oligómero cebador promotor y, como mínimo, un miembro oligómero cebador, que se configura para generar productos de amplificación para la detección de parvovirus humano de tipos
1, 2 y 3 y/o que comprende, como mínimo, un miembro oligómero cebador promotor y, como mínimo, un miembro oligómero cebador, que se configura para generar productos de amplificación para la detección del virus de la hepatitis A. En una realización, la reacción de TMA para parvovirus es una reacción de detección y amplificación cuantitativa. En una realización, la reacción de TMA para el virus de la hepatitis A es una reacción de detección y amplificación cuantitativa. En una realización, la reacción de TMA para el parvovirus y la reacción de TMA para el virus de la hepatitis A son reacciones de detección y amplificación cuantitativas. En un aspecto, estas reacciones de amplificación son reacciones de amplificación múltiplex, y la detección de productos de amplificación se realiza en una etapa de detección que utiliza una o más sondas de detección en las SEQ ID NO: 58-74 y/o una o más sondas de detección en las SEQ ID NO:137-169. En un aspecto, las reacciones de amplificación son reacciones de amplificación uniplex, y la detección de productos de amplificación se realiza en una etapa de detección que utiliza una o más sondas de detección en las SEQ ID NO: 58-74 o una o más sondas de detección en las SEQ ID NO: 137 169.
Ya sea después de o durante la reacción de amplificación, las secuencias amplificadas generadas a partir del ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A y/o del ácido nucleico diana del parvovirus se detectan, preferentemente, mediante hibridación con, como mínimo, una sonda de ácido nucleico marcada que se hibrida específicamente con una porción de la secuencia amplificada. Entre las realizaciones de sonda se incluyen aquellas que tienen una Tm en el intervalo de, aproximadamente, 80 °C a, aproximadamente, 85 °C. Entre las algunas realizaciones de sonda preferentes se incluyen oligómeros que tienen una longitud de nucleótidos de, aproximadamente, 15 a, aproximadamente, 40 nucleótidos y una secuencia de ácido nucleico que es ADN, ARN o una combinación de los mismos y están configurados para hibridarse específicamente con toda o una porción de una región de una secuencia de un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A o un ácido nucleico del parvovirus humano o un ácido nucleico amplificado. Los oligómeros de detección de la presente divulgación pueden comprender además uno o más residuos de LNA. La detección de la sonda se consigue mediante la detección de un marcador que se puede detectar en una reacción homogénea. Por lo tanto, algunas realizaciones preferentes comprenden además sondas marcadas con un compuesto de éster de acridinio (AE) utilizando procedimientos bien conocidos que permiten una detección homogénea (por ejemplo, los marcadores y los procedimientos de detección se describen en detalle en las Patentes US5,283,174 de Arnold, Jr., et al., US5,656,207 de Woodhead et al., y US5,658,737 de Nelson et al.). Un compuesto de AE quimioluminiscente se une a la secuencia de la sonda a través de un compuesto enlazador (sustancialmente tal como se describe en las Patentes US5,585,481 y US5,639,604 de Arnold, Jr., et al., por ejemplo, consúltese la columna 10, línea 6 a la columna 11, línea 3 y el ejemplo 8). En una realización, el oligómero de sonda marcado tiene, como mínimo, un enlace 2'-O-metoxi en el esqueleto del ácido nucleico. En una realización de una etapa de detección normal, el reactivo de la sonda incluyó succinato 100 mM, LLS al 2 % (p/v), LiOH (monohidrato) 230 mM, 2,2'-ditiodipiridina (ALDRITHIOL-2) 15 mM, LiCl 1,2 M, EDTA 20 mM, EGTA 20 mM, etanol absoluto al 3 % (v/v), llevado a un pH de, aproximadamente, 4,7 con LiOH, y el reactivo de selección utilizado para hidrolizar el marcador en la sonda no unida incluía ácido bórico 600 mM, NaOH 182 mM, TRITON®) X-100 al 1 % (v/v). La sonda de detección se añade a la reacción de detección en un intervalo de, aproximadamente, 1E7-5E7 unidades relativas de luz (RLU) por reacción, más normalmente, 1E7-3E7, RLU, aproximadamente, por reacción, más normalmente, 2E7-5E7 RLU por reacción, o más normalmente, 2E7-4E7 RLU por reacción; en la que los intervalos incluyen todos los números enteros y parciales en los mismos. La señal se detectó como RLU utilizando un luminómetro (por ejemplo, LEADER™ 450HC+, Gen-Probe Incorporated, San Diego, California).
Para seleccionar secuencias de ADN apropiadas para su utilización como oligómeros de captura, oligómeros de amplificación y sondas de detección, las secuencias de ADN, incluidas las secuencias parciales o complementarias, disponibles en bases de datos de acceso público (por ejemplo, GenBank) se alinearon comparando regiones de secuencias iguales o similares y se compararon utilizando técnicas bien conocidas de biología molecular. Aunque las comparaciones de secuencias se pueden facilitar mediante la utilización de algoritmos, los expertos en la materia pueden realizar fácilmente dichas comparaciones de manera manual y visual. De manera general, las porciones de secuencias que contienen relativamente pocas variantes entre las secuencias comparadas se eligieron como base para diseñar oligómeros sintéticos para su utilización en la presente invención. Otras consideraciones en el diseño de oligómeros incluyeron el contenido relativo de GC (que afecta a la Tm) y la ausencia relativa de la estructura secundaria predicha (que forma potencialmente híbridos intramoleculares) dentro de una secuencia, determinada mediante la utilización de procedimientos bien conocidos.
En una realización, el ensayo se lleva a cabo en un solo tubo utilizando una muestra de 0,5 a 1 ml de fluido corporal (por ejemplo, plasma) para detectar el ácido nucleico diana con una sensibilidad de, aproximadamente, 100 a 500 copias/ml de ADN diana por reacción. En otras realizaciones, el ensayo detectó cantidades más elevadas de ácido nucleico diana en la muestra, que puede ser una muestra agrupada de muestras individuales.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos científicos y técnicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden de manera común los expertos en la materia pertinente. Las definiciones generales de muchos de los términos utilizados en el presente documento se proporcionan en Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a ed. (Singleton et al., 1994, John Wiley & Sons, Nueva York, Nueva York), The Harper Collins Dictionary of Biology (Hale & Marham, 1991, Harper Perennial, Nueva York, Nueva York), y Taber’s Cyclopedic Medical Dictionary, 17a ed. (FA Davis Co., Filadelfia, Pennsylvania, 1993). A menos que se indique de otro modo, las técnicas utilizadas o contempladas en el presente documento son metodologías estándar
bien conocidas por los expertos en la materia. Los siguientes ejemplos ilustran algunas de las realizaciones preferentes de la presente invención y se proporcionan únicamente con fines ilustrativos.
Ejemplo 1: Amplificación de una diana de HAV utilizando un cebador y un proveedor de promotor y sin utilizar captura de la diana.
Se estableció un ensayo de amplificación del virus de la hepatitis A utilizando 1,25 UI de HAV por reacción y una de dos condiciones de amplificación: SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 13. La detección del producto de amplificación se realizó utilizando un gel de separación y tinción con bromuro de etidio. Los ensayos se establecieron haciendo una dilución en serie de una reserva de HAV diana (primer patrón internacional de la OMS del Instituto Nacional de Patrones y Controles Biológicos (NIBSC #00/560, a 5E4 UI por vial)) y, a continuación, se añadieron las diluciones a pocillos separados de una placa de 96 pocillos. A continuación, se añadió cada una de las dos condiciones de amplificación a pocillos separados que contenían una dilución. Se realizó una reacción de amplificación isotérmica y, al final de la reacción, se transfirió una alícuota de cada reacción a un pocillo separado de un gel y a continuación se tiñó con EtBr. Los resultados de este estudio mostraron que cada condición de amplificación detectó tan solo 1,25 UI de ácidos nucleicos del virus de la hepatitis A.
Ejemplo 2: Amplificación de una diana de HAV utilizando un cebador y un proveedor de promotor y utilizando captura de la diana.
Se estableció un ensayo de amplificación del virus de la hepatitis A, tal como en el ejemplo 1, excepto por que el ensayo incluyó una etapa inicial de captura de la diana de las diferentes diluciones y excepto por que la detección del producto de amplificación se realizó utilizando una sonda de detección (SEQ ID NO: 62). Los ensayos se establecieron capturando en primer lugar la diana de HAV de cada una de las diluciones separadas y añadiendo los ácidos nucleicos diana del HAV capturados a pocillos separados en una placa de 96 pocillos. Los oligómeros de captura de la diana utilizados procedían de un grupo de oligómeros que tenían una cola dT3dA30 y una región de captura de la diana K18. Las regiones de captura de la diana de los oligómeros de captura de la diana se sintetizaron para que cada una tuviera una variedad aleatoria de residuos G y U, de este modo la población de oligómeros de captura de la diana utilizada en este ejemplo era una colección mixta de secuencias. La etapa de detección fue una reacción de detección de punto final y los resultados mostraron que este sistema de ensayo tenía una detección del 95 % de, como mínimo, 3,87 UI/ml de ácido nucleico diana del HAV (tabla 1).
Tabla 1.
Este experimento muestra que la utilización de un sistema de captura de las dianas no específico combinado con la condición de amplificación y detección proporciona una amplificación y detección sensibles de los ácidos nucleicos diana del HAV, aunque la amplificación y la detección no fueron tan sensibles como se vio en el ejemplo 1, en el que una cantidad conocida de ácido nucleico diana se añadió directamente a la reacción de amplificación.
Ejemplo 3: Amplificación de los genotipos 1, 2 y 3 de parvovirus utilizando un cebador y un proveedor de promotor y utilizando captura de la diana.
Se estableció una reacción de amplificación para probar una pluralidad de combinaciones de oligómeros de amplificación para la amplificación del genotipo I de parvovirus a concentraciones variables. El ensayo de amplificación se estableció con todas las combinaciones de oligómeros de amplificación no T7 y oligómeros de amplificación T7 que se podían producir a partir de lo siguiente: combinar cada una de las SEQ ID NO: 75-87 con cada una de las SEQ ID NO: 88-99, en la que cada combinación es solo un solo no T7 y un solo T7. Cada oligómero de amplificación se diseñó para amplificar los genotipos de parvovirus 1, 2 y 3. El ácido nucleico diana fue la SEQ ID NO: 203. El ácido nucleico de partida se diluyó y se añadió a pocillos de placas de reacción a razón de 0 copias por reacción, 10 copias por reacción, 100 copias por reacción y 100.000 copias por reacción. El reactivo de amplificación sin cebador se preparó tal como se ha descrito anteriormente de manera general y se añadió a cada pocillo de cada
placa de reacción para las reacciones de 0, 10, 100 y 100.000 copias. Las diversas condiciones de cebador de las combinaciones anteriores de oligómeros de amplificación T7 y no T7 se añadieron a pocillos separados en estas placas. La reacción de amplificación fue isotérmica e incluyó etapas iniciales de incubación a, aproximadamente, 62 °C y, aproximadamente, 42 °C durante 10 y 20 minutos, respectivamente, seguidas de una amplificación de 50 minutos a 42 °C en presencia de polimerasa. La detección del producto de amplificación se realizó utilizando la SEQ ID NO: 145 y un luminómetro Leader HC. Las RLU detectadas para la placa con 0 copias de parvovirus fueron de 934 RLU a 14.698 RLU. Las RLU detectadas para la placa que tenía 10 copias de parvovirus por reacción fueron de 2.015 RLU a 8.040.373 RLU, y más de la mitad de las combinaciones proporcionaron una señal muy por encima del fondo. Las RLU detectadas para la placa que tenía 100 copias de parvovirus por reacción fueron de 2.439 RLU a 8.114.133 RLU. Las RLU detectadas para la placa con 100.000 copias de parvovirus por reacción fueron de 495.680 RLU a 8.308.252 RLU. A partir de los resultados de estos ensayos, se identificaron diversas combinaciones de oligómeros de amplificación que son útiles para una reacción de amplificación de parvovirus que amplifica tan solo 10 copias de parvovirus.
Se estableció un ensayo adicional para la amplificación y detección de cada uno de los genotipos 1, 2 y 3 de parvovirus. Estas reacciones de amplificación utilizaron las siguientes condiciones de oligómeros de amplificación: las SEQ ID NO: 80 y 92; las SEQ ID NO: 80 y 91; y las SEQ ID NO: 81 y 92, cada una de las cuales está diseñada para la amplificación de los tres genotipos de parvovirus. Los ácidos nucleicos diana eran transcritos in vitro de una porción de cada genotipo 1-3 de parvovirus (SEQ ID NO: 200, 201 y 202, respectivamente) y se proporcionaron al ensayo como una dilución en serie de una concentración de partida. La captura de las dianas se realizó utilizando el sistema de captura de las dianas no específico discutido en el ejemplo 2. La detección fue una detección de punto final utilizando la SEQ ID NO: 146. Los resultados de este ensayo de amplificación y detección mostraron que los tres sistemas tenían una sensibilidad constante hasta, como mínimo, 80 copias de la diana por ml, y tenían una buena sensibilidad hasta 5 copias/ml, aunque hubo variaciones en la detección entre los tres genotipos (por ejemplo, a 5 copias por ml, el 40 % de los pocillos con el genotipo 1 fueron reactivos, mientras que solo, aproximadamente, el 20 % de los pocillos del genotipo 3 fueron reactivos).
Se realizó una reacción de amplificación adicional para la amplificación y detección de ácidos nucleicos de parvovirus en la que la combinación de oligómeros de amplificación incluía un oligómero de amplificación no T7 y dos oligómeros de amplificación T7. Las combinaciones de oligómeros de amplificación fueron las siguientes: SEQ ID NO: 80, 90 y 99; SEQ ID NO: 80, 91 y 99; SEQ ID NO: 80, 92 y 99; SEQ ID NO: 81, 90 y 99, SEQ ID NO: 81,91 y 99; SEQ ID NO: 81, 92 y 99; SEQ ID NO: 82, 90 y 99; SEQ ID NO: 82, 91 y 99; y SEQ ID NO: 82, 92 y 99. Las reacciones de amplificación y detección se prepararon tal como se ha descrito anteriormente de manera general, y cada reacción se realizó en 10 pocillos. El ácido nucleico diana era la SEQ ID NO: 203. Los resultados mostraron que las SEQ ID NO: 80, 90 y 99; las SEQ ID NO: 80, 91 y 99; las SEQ ID NO: 80, 92 y 99; y las SEQ ID NO: 81,91 y 99 detectaron, todas, hasta 50 copias de ácidos nucleicos diana con un 100 % de reactividad para los pocillos, mientras que las otras combinaciones fueron de, aproximadamente, un 80 % de reactivos respecto a no reactivos. Las combinaciones SEQ ID NO: 80, 91 y 99; SEQ ID NO: 80, 92 y 99 y SEQ ID NO: 82, 90 y 99 se analizaron a continuación contra las SEQ ID NO: 200-202, proporcionándose cada ácido nucleico diana a 45 copias por reacción, 15 copias por reacción y 5 copias por reacción. Cada condición de reacción se probó en 10 pocillos separados. Las reacciones de amplificación y detección se establecieron tal como se ha descrito de manera general anteriormente. Las tres combinaciones de oligómeros de amplificación fueron el 100 % reactivas para detectar 45 copias de cada genotipo de parvovirus. Las tres combinaciones de oligómeros de amplificación fueron del 100 % reactivas al 70 % reactivas para detectar 15 copias de los tres genotipos de parvovirus. Las tres combinaciones de oligómeros de amplificación fueron del 70 % reactivas al 40 % reactivas para detectar 5 copias de los tres genotipos de parvovirus. De este modo, las combinaciones de oligómeros de amplificación de parvovirus pudieron detectar hasta tan solo 5 copias de cada genotipo con una eficiencia de, aproximadamente, el 40 % al 70 %.
Ejemplo 4: Amplificación y detección del virus de la hepatitis A en presencia de parvovirus.
Se realizó un ensayo de amplificación para amplificar y detectar ácidos nucleicos diana del virus de la hepatitis A en presencia de ácidos nucleicos de parvovirus. El ácido nucleico diana del HAV fue el patrón de la OMS descrito en el ejemplo 1. Se realizó una dilución en serie del patrón de HAV y cada dilución se añadió a pocillos separados en una placa de 96 pocillos. Se añadieron 5E6 copias de la SEQ ID NO: 200 a cada pocillo. Se preparó una mezcla de reacción de amplificación de HAV para incluir de 5 a 10 μM/reacc. de las SEQ ID NO: 2 y 18. Se preparó una mezcla de reacción de detección de punto final de la SEQ ID NO: 62 para incluir 5E6 RLU por reacción. Se realizó la reacción de amplificación y, a continuación, se detuvo la reacción y se realizó la reacción de detección. Los resultados de este ensayo muestran que el 100 % de los pocillos que contenían tan solo 40 copias de HAV y el 90 % de los pocillos que contenían tan solo 20 copias de HAV se detectaron en presencia de 5E6 copias de parvovirus. Ejemplo 5: Amplificación y detección cuantitativas de ácidos nucleicos diana de parvovirus.
Se realizó un ensayo cuantitativo para la amplificación y detección de parvovirus de genotipos 1, 2 y 3. Los ácidos nucleicos diana de parvovirus eran ácidos nucleicos del panel de referencia internacional de la OMS para genotipos de parvovirus B19 (NIBSC 99/800, que es 5,98 log10 UI/ml de genotipo 1,5,94 log10 UI/ml de genotipo 2, 5,97 log10
UI/ml de genotipo 3 en el que una UI es de, aproximadamente, 0,12 copias de cada genotipo). Los ácidos nucleicos diana del parvovirus se diluyeron a 10.000 UI/ml y 1.000 UI/ml y cada una de las diluciones se añadió a diferentes pocillos de placas de 96 pocillos separadas. Los oligómeros de amplificación de parvovirus fueron las SEQ ID NO: 91 y 131. El oligómero de la sonda de detección fue la SEQ ID NO: 144. Se añadió una secuencia competidora de parvovirus (SEQ ID NO: 197) a la mezcla de reacción de amplificación. Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2
Estos resultados muestran que el ensayo cuantitativo actual muestra una buena linealidad con los ácidos nucleicos diana patrones de la OMS, aunque el ensayo del genotipo 2 cuantificó con una variación relativamente mayor del patrón.
Ejemplo 6: Amplificación y detección cuantitativas de ácidos nucleicos diana de parvovirus añadidos a muestras de plasma humano negativas para parvovirus.
Este ensayo de detección y amplificación cuantitativas se estableció según el ejemplo 5 anterior, excepto por que se resuspendieron 10.000 UI/ml de los ácidos nucleicos diana en plasma humano de donantes que se determinó que eran negativos para parvovirus. La cantidad esperada de parvovirus detectada en cada muestra fue de 4 Log(copias/ml), y los resultados promedio observados fueron de 3,92(±0,059) Log(copias/ml). De este modo, el ensayo cuantitativo de parvovirus proporciona resultados precisos al amplificar y detectar todos los ácidos nucleicos diana de parvovirus en muestras de plasma humano.
Ejemplo 7: Amplificación y detección de ácidos nucleicos del virus de la hepatitis A y ácidos nucleicos diana del parvovirus utilizando captura de la diana específica.
Se realizó una reacción de amplificación y detección en ácidos nucleicos diana que se separaron a partir de una muestra utilizando oligómeros de captura de la diana específicos de la diana. Los oligómeros de captura de la diana para la captura de ácidos nucleicos del virus de la hepatitis A son las SEQ ID NO: 46-51, y los oligómeros de captura de la diana para la captura de ácidos nucleicos de parvovirus son las SEQ ID NO: 128-131. Los oligómeros de captura de la diana se utilizaron individualmente y en combinaciones (es decir, dos o más oligómeros de captura de la diana dirigidos al virus de la hepatitis A o dos o más oligómeros de captura de la diana dirigidos al parvovirus) en una reacción de captura de la diana. Las muestras y las condiciones de reacción fueron las descritas anteriormente para las reacciones uniplex del virus de la hepatitis A y para las reacciones uniplex del parvovirus. Los oligómeros de captura de la diana específicos individuales y combinados demostraron una mayor sensibilidad y eficiencia de captura en comparación con los procedimientos de captura de la diana no específicos.
Tabla 3: Ejemplos de oligómeros, secuencias y regiones de referencia
La presente invención se ha descrito en el contexto de ejemplos particulares y realizaciones preferentes. Los expertos en la materia apreciarán que otras realizaciones están abarcadas dentro de la presente invención, según se define por las siguientes reivindicaciones.
Claims (11)
1. Combinación de oligómeros para detectar un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, comprendiendo dicha combinación de oligómeros:
(I) un primer y un segundo oligómeros de amplificación para amplificar una región diana de ácido nucleico de parvovirus humano, en la que
(a) el primer oligómero de amplificación de parvovirus comprende una primera secuencia de hibridación con la diana que tiene de 14 a 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 181 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 179 o SEQ ID NO: 180; y
(b) el segundo oligómero de amplificación de parvovirus comprende una segunda secuencia de hibridación con la diana que tiene de 14 a 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 189 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 188; y
(II) un primer y un segundo oligómeros de amplificación para amplificar una región diana de ácido nucleico de HAV, en la que
(a) el primer oligómero de amplificación de HAV comprende una primera secuencia de hibridación con la diana que tiene de 14 a 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 174 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 173; y
(b) el segundo oligómero de amplificación de HAV comprende una segunda secuencia de hibridación con la diana que tiene de 14 a 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 175.
2. Combinación de oligómeros, según la reivindicación 1, en la que la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 182 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 179; preferentemente,
en la que la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (l)(a) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 183 o SEQ ID NO: 117; preferentemente,
en la que la primera secuencia de hibridación con la diana de (l)(a) tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 75-80.
3. Combinación de oligómeros, según la reivindicación 1, en la que la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (l)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 184; preferentemente,
en la que la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (l)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 81-84.
4. Combinación de oligómeros, según la reivindicación 1, en la que la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (l)(a) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 185 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 180; preferentemente,
en la que la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (l)(a) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 82-84.
5. Combinación de oligómeros, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) está contenida en la secuencia de SEQ ID NO: 187 e incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 188; preferentemente,
en la que la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 186; preferentemente,
en la que la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b) se selecciona entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 108-113.
6. Combinación de oligómeros, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende, además
(III) un tercer y un cuarto oligómeros de amplificación para amplificar la región diana del ácido nucleico del parvovirus humano, en la que
(a) el tercer oligómero de amplificación de parvovirus comprende una tercera secuencia de hibridación con la diana que tiene de 14 a 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 181 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 179 o SEQ ID NO: 180; y
(b) el cuarto oligómero de amplificación de parvovirus comprende una cuarta secuencia de hibridación con la diana seleccionada entre el grupo que consiste en
(i) una secuencia que tiene de 14 a 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 189 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 188; y
(ii) una secuencia que tiene de 14 a 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 193 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 192;
en la que la tercera secuencia de hibridación con la diana de (III)(a) es diferente de la primera secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(a); y
en la que la cuarta secuencia de hibridación con la diana de (III)(b) es diferente de la segunda secuencia de hibridación con la diana de parvovirus de (I)(b).
7. Combinación de oligómeros, según la reivindicación 1 que comprende, además
(IV) un tercer y un cuarto oligómeros de amplificación para amplificar la región diana del ácido nucleico del HAV, en la que
(a) el tercer oligómero de amplificación de HAV comprende una tercera secuencia de hibridación con la diana que tiene de 14 a 27 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 174 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 173; y
(b) el cuarto oligómero de amplificación de HAV comprende una cuarta secuencia de hibridación con la diana que tiene de 14 a 30 nucleótidos contiguos contenidos en la secuencia de SEQ ID NO: 177 y que incluye, como mínimo, la secuencia de SEQ ID NO: 175;
en la que la tercera secuencia de hibridación con la diana de (IV)(a) es diferente de la primera secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(a); y
en la que la cuarta secuencia de hibridación con la diana de (IV)(b) es diferente de la segunda secuencia de hibridación con la diana de HAV de (II)(b).
8. Kit que comprende la combinación de oligómeros, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Mezcla de reacción que comprende la combinación de oligómeros, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Procedimiento para detectar un ácido nucleico diana del parvovirus humano y un ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra, comprendiendo dicho procedimiento:
(A) poner en contacto una muestra sospechosa de contener parvovirus humano y HAV con la combinación de oligómeros, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el kit, según la reivindicación 8, o la mezcla de reacción, según la reivindicación 9;
(B) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico in vitro, en la que cualquier ácido nucleico diana de parvovirus y/o HAV presente en dicha muestra se utiliza como plantilla para generar un producto de amplificación de parvovirus y/o HAV; y
(C) detectar la presencia o ausencia del producto de amplificación de parvovirus y/o HAV, indicando de esta manera la presencia o ausencia de parvovirus y/o HAV en dicha muestra.
11. Utilización de la combinación de oligómeros, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o el kit, según la reivindicación 8, o la mezcla de reacción, según la reivindicación 9, para detectar el ácido nucleico diana del parvovirus humano y el ácido nucleico diana del virus de la hepatitis A (HAV) en una muestra in vitro.
REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN
Esta lista de referencias citada por el solicitante es únicamente para mayor comodidad del lector. No forman parte del documento de la Patente Europea. Incluso teniendo en cuenta que la compilación de las referencias se ha efectuado con gran cuidado, los errores u omisiones no pueden descartarse; la EPO se exime de toda responsabilidad al respecto.
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