ES2300375T3 - Composiciones y metodos para la deteccion del virus de la inmunodeficiencia humana 2 (hiv-2). - Google Patents
Composiciones y metodos para la deteccion del virus de la inmunodeficiencia humana 2 (hiv-2). Download PDFInfo
- Publication number
- ES2300375T3 ES2300375T3 ES01988788T ES01988788T ES2300375T3 ES 2300375 T3 ES2300375 T3 ES 2300375T3 ES 01988788 T ES01988788 T ES 01988788T ES 01988788 T ES01988788 T ES 01988788T ES 2300375 T3 ES2300375 T3 ES 2300375T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- seq
- sequence
- hiv
- oligonucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
Abstract
Un kit para la detección de ácidos nucleicos del HIV-2, el cual comprende (a) un primer oligonucleótido de amplificación que contiene la SEQ ID NO:10 y opcionalmente contiene una secuencia de promotor 5¿ no complementaria al ácido nucleico del HIV-2; y (b) un segundo oligonucleótido de amplificación que contiene una secuencia de 19-40 bases contiguas de la secuencia SEQ ID NO:1, teniendo dicho segundo oligonucleótido de amplificación una longitud de hasta 100 nucleótidos.
Description
Composiciones y métodos para la detección del
virus de la inmunodeficiencia humana 2 (HIV-2).
La presente invención se refiere al campo de la
biotecnología. Más específicamente, la invención se refiere a los
ensayos de diagnóstico para la detección de las secuencias de los
ácidos nucleicos del HIV-2.
Aunque el HIV/SIDA pandémico es debido
principalmente a la infección por HIV-1, ha
aparecido un retrovirus diferente como otra causa del SIDA. El
llamado virus "HIV-2" se aisló primeramente de
pacientes de SIDA en el Oeste de África en 1986, y más tarde se
detectó como un agente infeccioso por primera vez en Estados Unidos
al año siguiente. Menos de 100 casos de HIV-2 fueron
informados en los Estados Unidos al final de 1994. A pesar de este
aparente bajo número, el HIV-2 ha sido identificado
como el agente etiológico en número creciente en enfermedades
inmunosupresoras que son clínicamente indistinguibles de los casos
de SIDA que resultan de la infección por HIV-1
(Kanki et al., Science 232:238 (1986); Kanki
et al Science 236:827 (1987); Clavel et al.,
Science 233:343 (1986); Clavel et al., N. Engl.
J. Med. 316: 1180 (1987)). Aunque el
HIV-2 es afín al HIV-1 por su
morfología y tropismo para las células CD4^{+}, es claramente un
virus distinto y no simplemente una variante envolvente del
HIV-1.
Efectivamente, dado que el HIV-2
se diferencia solamente del HIV-1, en que conserva
aproximadamente el 50% de los aminoácidos de las proteínas
gag y pol, y menos del 30% de los productos del gen
env, su presencia no se detecta eficazmente con los ensayos
serológicos empleados en la detección de la infección por
HIV-1 (Constantine NT, AIDS 7:1 (1993);
Markovitz DM, Ann. Intern. Med. 118:211 (1993)). En
consecuencia, se han realizado tentativas para desarrollar sondas
de ácido nucleico que puedan emplearse para detectar específicamente
los ácidos nucleicos víricos del HIV-2.
Es interesante que los genomas de ambos
HIV-1 y HIV-2 muestren una
substancial heterogeneidad de secuencias entre los diferentes
aislados. Como consecuencia de esta heterogeneidad, ha sido
imposible encontrar substancialmente, regiones de conservación
absoluta de las secuencias entre todos los aislados del
HIV-1 ó todos los aislados del
HIV-2 (ver la solicitud de patente europea publicada
EP 0 887 427).
En efecto, numerosos aislados víricos con
secuencias de polinucleótidos únicos han sido identificadas para
cada uno de estos virus, un factor que además complica la
construcción de sondas para un ensayo fiable y efectivo de un ácido
nucleico.
Puesto que, como sucede con el
HIV-1, el HIV-2 es también
transmisible a través de un intercambio de fluidos corporales,
incluyendo sangre y plasma, es importante ser capaces de detectar
los fluidos corporales infectados antes de que los anticuerpos
contra el virus sean detectables o los síntomas sean evidentes en un
individuo infectado. Para la protección de los pacientes que de
otra manera podrían recibir un fluido corporal infectado por
HIV-2 (p. ej., sangre o plasma enteros durante una
transfusión), o productos derivados de la sangre o plasma de
donantes, es particularmente importante detectar la presencia del
virus en el fluido corporal donado para impedir su empleo en dichos
procedimientos o productos. Es también importante que los
procedimientos y reactivos empleados para la detección del
HIV-2 sean capaces de detectar un número
relativamente bajo de copias virales que puedan estar presentes en
un individuo infectado, que puede ser un donante, durante los
primeros estadios de la infección.
Los ensayos y reactivos para la detección del
HIV-2 han sido previamente descritos por ejemplo en
las patentes U.S. n^{os} 6.020.123, 5.688.637, 5.545.726 y
5.319.651; patentes europeas n^{os} EP 0404625 B1 y EP 0239425
B1; y solicitudes de patentes europeas publicadas n^{os} EP
1026236 A2, EP 0887427 A2.
Un primer aspecto de la invención se refiere a
un kit para la detección de una secuencia de ácido nucleico del
HIV-2. El kit incluye un primer oligonucleótido de
amplificación que contiene la SEQ ID NO:10 y opcionalmente contiene
una secuencia de promotor 5' no complementaria al ácido nucleico del
HIV-2. Está también incluido en el kit un segundo
oligonucleótido de amplificación que tiene una longitud de hasta 100
nucleótidos. Este segundo oligonucleótido de amplificación incluye
una secuencia de 19-40 bases contiguas de la
secuencia SEQ ID NO:1. En una versión preferida de la invención, la
longitud del segundo oligonucleótido de amplificación es de
19-40 nucleótidos. Un primer oligonucleótido de
amplificación que tiene una longitud de 25 nucleótidos viene dado
por SEQ ID NO:10. En otra versión preferida, cuando la longitud del
segundo oligonucleótido de amplificación está en el margen de
19-40 nucleótidos, la longitud del primer
oligonucleótido de amplificación es de hasta 60 nucleótidos e
incluye una secuencia de un promotor.
De acuerdo con otra versión preferida de la
invención, la longitud del segundo oligonucleótido de amplificación
está en el margen de 19-21 nucleótidos. En otra
versión todavía más preferida, cuando el primer oligonucleótido de
amplificación tiene una longitud de hasta 60 nucleótidos, el segundo
oligonucleótido de amplificación tiene una longitud de
19-21 nucleótidos. Todavía en otra versión preferida
de la invención, el primer oligonucleótido de amplificación tiene
una longitud de hasta 60 nucleótidos, y el segundo oligonucleótido
de amplificación tiene una longitud de 19-40
nucleótidos, el primer oligonucleótido de amplificación es un
promotor-cebador que tiene la secuencia SEQ ID
NO:15. Todavía en otra versión preferida de la invención, cuando el
primer oligonucleótido de amplificación tiene una longitud de hasta
60 nucleótidos, y el segundo oligonucleótido de amplificación tiene
una longitud de 19-21 nucleótidos, el segundo
oligonucleótido de amplificación puede tener la secuencia de
cualquiera de las SEQ ID NO:2-7. Todavía en otra
versión preferida de la invención, cuando el primer oligonucleótido
de amplificación tiene una longitud de hasta 60 nucleótidos y el
segundo oligonucleótido de amplificación tiene una longitud de
19-21 nucleótidos, el primer oligonucleótido de
amplificación puede incluir además, una secuencia de un promotor.
Por ejemplo, el primer oligonucleótido de amplificación puede ser
una promotor-cebador que tiene la secuencia SEQ ID
NO:15. Alternativamente, cuando el primer oligonucleótido de
amplificación tiene una longitud de hasta 60 nucleótidos, cuando el
segundo oligonucleótido de amplificación tiene una longitud se
19-21 nucleótidos, y cuando el primer
oligonucleótido de amplificación incluye además una secuencia de un
promotor, la secuencia del segundo oligonucleótido de amplificación
puede ser una cualquiera de las SEQ ID NO:2-7.
Todavía en otra versión preferida de la invención, cuando el primer
oligonucleótido de amplificación tiene una longitud de hasta 60
nucleótidos, cuando el segundo oligonucleótido de amplificación
tiene una longitud de 19-21 nucleótidos, y cuando
el primer oligonucleótido de amplificación es un
promotor-cebador que tiene la secuencia SEQ ID
NO:15, el segundo oligonucleótido de amplificación puede tener una
secuencia dada por una cualquiera de las SEQ ID NO:
2-7. De acuerdo con otra versión preferida de la
invención, el primer oligonucleótido de amplificación consta de SEQ
ID NO:10, y la longitud del segundo oligonucleótido de amplificación
es de 19-21 nucleótidos. Cuando este es el caso, el
primer oligonucleótido de amplificación puede tener una secuencia
que es, por ejemplo, SEQ ID NO;10. Alternativamente, cuando la
longitud del primer oligonucleótido de amplificación es de 25
nucleótidos, y la longitud del segundo oligonucleótido de
amplificación es de 19-21 nucleótidos, el segundo
oligonucleótido de amplificación puede tener una secuencia dada por
una cualquiera de las SEQ ID NO:2-7. Todavía en
otra versión altamente preferida de la invención, cuando la longitud
del segundo oligonucleótido de amplificación es de
19-21 nucleótidos, y cuando el primer
oligonucleótido de amplificación tiene la secuencia dada por SEQ ID
NO: 10, el segundo oligonucleótido de amplificación puede ser una
cualquiera de las SEQ ID NO:2-7. De acuerdo con
otra versión, la composición que incluye el primero y segundo
oligonucleótidos de la amplificación, teniendo este último una
longitud de hasta 100 nucleótidos, puede incluir además una sonda
de detección de oligonucleótidos que tiene una secuencia que incluye
la SEQ ID NO:21 ó el complemento de la misma, y una marca
detectable. De preferencia, la sonda de detección tiene una longitud
de hasta 18 nucleótidos, y con más preferencia tiene la secuencia
de una cualquiera de las SEQ ID NO 22-27. En una
versión altamente preferida, la secuencia del primer
oligonucleótido de amplificación es SEQ ID NO: 10 ó 15; la secuencia
del segundo oligonucleótido de amplificación es una cualquiera de
las SEQ ID NO 2-7, y la secuencia de la sonda de
detección de oligonucleótidos es una cualquiera de las SEQ ID NO:
22-27.
La sonda de detección de nucleótidos tiene una
longitud de hasta 35 nucleótidos, e incluye la secuencia de SEQ ID
NO:21 ó el complemento de la misma y una marca detectable. En
ciertas versiones preferidas, la sonda de oligonucleótidos marcada
tiene una longitud de hasta 22 nucleótidos. De preferencia, la sonda
de oligonucleótidos tiene por lo menos 16 nucleótidos contiguos
contenidos dentro de la secuencia SEQ ID NO:20 ó el complemento de
la misma. En una versión, la sonda de oligonucleótidos tiene la
secuencia de SEQ ID NO:20 o el complemento de la misma. En otra
versión preferida, la sonda de oligonucleótidos que incluye la
secuencia de SEQ ID NO:21 ó el complemento de la misma, tiene una
longitud de hasta 18 nucleótidos. Por ejemplo, la sonda de
oligonucleótidos puede tener la secuencia de una cualquiera de las
SEQ ID NO: 22 ó el complemento de la misma, SEQ ID NO:23 ó el
complemento de la misma, SEQ ID NO:24 ó el complemento de la misma,
SEQ ID NO:25 ó el complemento de la misma, SEQ ID NO: 26 ó el
complemento de la misma, y SEQ ID NO:27 ó el complemento de la
misma. Ciertas sondas de oligonucleótidos marcados tienen
longitudes de exactamente 18 nucleótidos. En otras versiones de la
invención, en donde la sonda de oligonucleótidos tiene una longitud
de hasta 22 nucleótidos e incluye la secuencia de SEQ ID NO: 21 ó
el complemento de la misma, la sonda de oligonucleótidos puede ser
ADN, pero alternativamente puede incluir por lo menos un análogo de
nucleótido. De preferencia, el análogo de nucleótido tiene un grupo
metoxi en la posición 2' en el grupo de la ribosa. En otra versión
preferida de la invención, la sonda de oligonucleótidos incluye la
secuencia SEQ ID NO:21 ó el complemento de la misma y la que tiene
una longitud de hasta 18 nucleótidos, incluye también una marca
detectable. Ejemplos de marcas detectables útiles incluyen marcas
quimioluminiscentes y marcas radiactivas. Un ejemplo particularmente
preferido de una marca quimioluminiscente es un éster de
acridinio.
La sonda de detección de oligonucleótidos puede
emplearse para la detección de amplicones de HIV-2
que fueron sintetizados empleando el primero y segundo
oligonucleótidos de amplificación. Los kits de la invención pueden
contener además, oligonucleótidos de captura que pueden emplearse
para la purificación de ácidos nucleicos del molde de
HIV-2, aparte de otras especies antes de efectuar
una amplificación. Ejemplos de captura de oligonucleótidos que
pueden ser empaquetados en kits tienen las secuencias de SEQ ID
NO:31 y SEQ ID NO:32.
Los siguientes términos tienen los siguientes
significados para los fines de esta descripción, a no ser que
expresamente se especifique otra cosa.
Como se emplea en la presente, una "muestra
biológica" es cualquier tejido o material obtenido de un humano,
que contiene polinucleótidos. Las muestras biológicas de acuerdo con
la invención, incluyen sangre periférica, plasma, suero, médula
ósea, tejido de biopsia incluyendo nódulos linfáticos, tejidos o
exudados respiratorios, tejido gastrointestinal, muestras
cervicales con un "swab" ("tomamuestras"), semen u otros
fluidos corporales, tejidos o materiales. Una muestra biológica
puede ser tratada cuando se rompe un tejido o estructura celular,
liberando con ello componentes intracelulares en una solución, la
cual puede contener enzimas, tampones, sales, detergentes y
similares.
Como se emplea en la presente, el término
"poli-nucleótido" significa o bien ARN ó bien
ADN, juntamente con cualquier análogo nucleótido sintético u otras
moléculas que pueden estar presentes en la secuencia, y que no
evitan la hibridación del polinucleótido con una segunda molécula
que tiene una secuencia complementaria. El término incluye los
polímeros que contienen análogos de nucleótidos al estado natural e
incluye particularmente análogos que tienen un grupo metoxi en la
posición 2' de la ribosa (OMe). Como se utiliza en la presente, los
metoxi polinucleótidos u oligonucleótidos que contienen residuos
"T" tienen un grupo metoxi en la posición 2' del grupo de las
ribosas, y un uracilo en la posición de la base del nucleótido.
Cuando se especifica particularmente como "OMeT", significa
que la posición de la base del nucleótido está ocupada por un
residuo de timina.
Como se emplea en la presente, una "marca
detectable" es una especie química que puede ser detectada o que
puede conducir a una respuesta detectable. Las marcas detectables de
acuerdo con la invención, pueden estar unidas a sondas de
polinucleótidos, o bien directamente o bien indirectamente, y están
incluidos los radioisótopos, enzimas, haptenos, cromóforos tales
como colorantes o partículas que comunican un color detectable (p.
ej., perlas de látex o partículas de metal), compuestos
luminiscentes (p. ej., grupos bioluminiscentes, fosforescentes o
quimioluminiscentes) y compuestos fluorescentes.
Una "marca homogéneamente detectable" se
refiere a una marca que puede ser detectada de una manera detectable
determinando si la marca está sobre la sonda hibridada a sobre una
secuencia diana. Es decir, las marcas homogéneamente detectables
pueden ser detectadas sin separar físicamente las formas hibridadas
de las no hibridadas de la marca o sonda marcada. Estas marcas han
sido descritas en detalle por Arnold et al., U.S. patente nº
5.283.174; Woodhead et al., U.S. patente nº 5.656.207; y
Nelson et al., U.S. patente nº 5.658.737. Las marcas
preferidas para emplear en ensayos homogéneos incluyen los
compuestos quimioluminiscentes (p. ej., ver Woodhead et al.,
patente U.S. nº 5.656.207; Nelson et al., patente U.S. nº
5.658.737; y Arnold, Jr, et al, patente U.S. nº 5.639.604).
Marcas quimioluminiscentes preferidas son los compuestos de éster
de acridinio ("AE") como el AE estándar o derivados del mismo
(p. ej., naftil-AE, orto-AE, 1- ó
3-metil-AE,
2,7-dimetil-AE,
4,5-dimetil-AE,
orto-dibromo-AE,
orto-dimetil-AE,
meta-dimetil-AE,
orto-metoxi-AE,
orto-metoxi(cinamil)-AE,
orto-metil-AE,
orto-fluor-AE, 1- ó
3-metil-orto-fluor-AE,
1- ó
3-metil-meta-difluor-AE,
y 2-metil-AE). La síntesis y métodos
para unir las marcas a los ácidos nucleicos y la detección de las
marcas son ya bien conocidos en la técnica (p. ej., ver Sambrook
et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2ª edición
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY, 1989),
capítulo 10; Nelson et al., patente U.S. nº 5.658.737;
Woodhead et al., patente U.S. nº 5.656.207; Hogan et
al., patente U.S. nº 5.547.842; Arnold et al., patente
U.S. nº 5.283.174; Kourilsky et al., patente U.S. nº
4.581.333; y Becker et al., solicitud de patente europea nº 0
747 706).
Como se emplea en la presente,
"amplificación" se refiere a un procedimiento in vitro
para la obtención de múltiples copias de una secuencia diana de
ácido nucleico, su complemento o fragmentos del mismo.
Por "ácido nucleico diana" o "diana"
se entiende un ácido nucleico que contiene una secuencia diana de
ácido nucleico.
Por "secuencia diana de ácido nucleico",
"secuencia diana de nucleótidos" "secuencia diana" ó
"región diana" se entiende una secuencia específica de
desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos que comprende toda o parte
de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico de
cadena única, y la secuencia de desoxirribonucleótidos o
ribonucleótidos complementaria a la misma.
Por "amplificación asociada a la
transcripción" se entiende cualquier tipo de amplificación de
ácido nucleico que emplea una ARN polimerasa para producir
múltiples transcriptos de ARN a partir de un molde de ácido
nucleico. Un ejemplo de un método de amplificación asociada a la
transcripción, llamado "amplificación mediada por la
transcripción" (TMA), emplea generalmente una ARN polimerasa, una
ADN polimerasa, desoxirribonucleósido trifosfatos, ribonucleósido
trifosfatos, y un promotor-oligonucleótido
complementario del molde, y opcionalmente puede incluir uno o más
oligonucleótidos análogos. Las variaciones de la TMA son ya bien
conocidas en la técnica como se describen en detalle en Burg et
al., patente U.S. nº 5.437.990; Kacian et al., patente
U.S. n^{os} 5.399.491 y 5.554.516; Kacian et al., PCT nº
WO 93/22461; Gingeras et al., PCT nº WO 88/01302; Gingeras et
al., PCT nº WO 88/10315; Malek et al., patente U.S. nº
5.130.238; Urdea et al., patente U.S. n^{os} 4.868.105 y
5.124.246; McDonough et al., PCT nº WO 94/03472; y Ryder
et al., PCT nº WO 95/03430. Los métodos de Kacian et
al. son los preferidos para llevar a cabo los procedimientos de
ampliación del ácido nucleico del tipo descrito en la presente.
El término "sonda" como se emplea en la
presente, es un oligonucleótido de ácidos nucleicos que hibrida
específicamente a una secuencia diana de un ácido nucleico, de
preferencia de un ácido nucleico amplificado, bajo condiciones que
promueven la hibridación, para formar un híbrido detectable. Una
sonda puede contener un grupo detectable el cual, o bien puede
estar unido al (a los) extremo(s) de la sonda o puede ser
interno. Los nucleótidos de la sonda que se combinan con el
polinucleótido diana no necesitan ser estrictamente contiguos, como
puede ser el caso de un grupo interno detectable de la secuencia de
la sonda. La detección puede ser o bien directa (es decir,
resultante de una hibridación con sonda directamente a la secuencia
diana o ácido nucleico amplificado), o indirecta (es decir,
resultante de una hibridación con sonda a una estructura molecular
intermedia que une la sonda a la secuencia diana o ácido nucleico
amplificado). La "diana" de una sonda se refiere generalmente
a una secuencia contenida dentro de una secuencia de ácido nucleico
amplificado la cual hibrida específicamente en por lo menos una
porción de un oligonucleótido de la sonda empleando una unión
estándar de hidrógeno (a saber, un par de bases). Una sonda puede
comprender secuencias específicas de la diana y otras secuencias
que contribuyen a la conformación tridimensional de la sonda (p.
ej., como describe Lizardi et al., en las patentes U.S.
n^{os} 5.118.801 y 5.312.728). Las secuencias que son
"suficientemente complementarias" permiten una hibridación
estable de un oligonucleótido de la sonda con una secuencia diana
que no es completamente complementaria a la secuencia de la sonda
específica de la diana.
Como se emplea en la presente, un
"oligonucleótido" u "oligómero" es una cadena polimérica
de por lo menos dos, generalmente entre aproximadamente cinco y
aproximadamente 100, subunidades químicas, comprendiendo cada
subunidad un grupo base nucleótida, un grupo azúcar, y un grupo de
unión que une las subunidades en una configuración espacial lineal.
Los grupos base nucleótidas habituales son la guanina (G), la
adenina (A), la citosina (C), la timina (T) y el uracilo (U),
aunque otras bases de nucleótidos raras o modificadas capaces de un
enlace hidrógeno, son también conocidas por los expertos en la
técnica. Los oligonucleótidos preferidos de la presente invención
tienen un tamaño que oscila desde un límite inferior de
aproximadamente 10 hasta aproximadamente 60 residuos. Los
oligonucleótidos pueden ser purificados a partir de fuentes
naturales, pero de preferencia están sintetizados empleando
cualquiera de una variedad de métodos enzimáticos o químicos bien
conocidos.
Como se emplea en la presente, un "cebador de
amplificación" u "oligonucleótido de amplificación", es un
oligonucleótido que hibrida con un ácido nucleico diana o su
complemento, y participa en una reacción de amplificación del ácido
nucleico. Los cebadores de amplificación, o más simplemente
"cebadores" pueden ser opcionalmente
oligo-nucleótidos modificados que son capaces de
hibridar con un ácido nucleico molde, y el cual tiene un extremo 3'
y que puede extenderse mediante la actividad de una ADN
polimerasa.
Por "substancialmente homólogo"
"substancialmente correspondiente" o "corresponde
substancialmente", se entiende que el oligonucleótido en
cuestión tiene una secuencia de bases que contiene una región de 10
bases contiguas que es por lo menos un 70% homólogo, de preferencia
por lo menos un 80% homólogo, con más preferencia por lo menos un
90% homólogo y con la mayor preferencia, un 100% homólogo, con una
región de por lo menos 10 bases contiguas presente en una secuencia
de bases de referencia (excluyendo los equivalentes de ARN y ADN).
Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente modificaciones que
podrían hacerse en las condiciones del ensayo de hibridación a
varios porcentajes de homología para permitir la hibridación del
oligonucleótido a la secuencia diana, a la vez que se evitan
niveles inaceptables de hibridación no específica. El grado de
similitud se determina por comparación del orden de nucleobases que
completan las dos secuencias sin tomar en consideración otras
diferencias estructurales que puedan existir entre las dos
secuencias, con la condición que las diferencias estructurales no
impidan los enlaces hidrógeno con las bases complementarias. El
grado de homología entre dos secuencias puede también expresarse en
términos del número de malos apareamientos presentes en cada
conjunto de por lo menos 10 bases contiguas que se comparan, el
cual número puede oscilar de 0 a 2 bases diferentes.
Por "substancialmente complementario", se
entiende que el oligonucleótido en cuestión tiene una secuencia de
bases que contiene por lo menos una región de 10 bases contiguas que
es por lo menos un 70% complementaria, de preferencia por lo menos
un 80% complementaria, con más preferencia por lo menos un 90%
complementaria, y con la máxima preferencia un 100% complementaria,
a por lo menos una región de 10 bases contiguas presente en una
secuencia diana del ácido nucleico (excluyendo los equivalentes de
ARN y ADN) (los expertos en la técnica apreciarán fácilmente
modificaciones que podrían hacerse a las condiciones del ensayo de
hibridación con varios porcentajes de complementariedad para
permitir la hibridación del oligonucleótido a la secuencia diana a
la vez que se evitan niveles inaceptables de hibridación no
específica). El grado de complementariedad se determina por
comparación del orden de nucleobases que completan las dos
secuencias sin tomar en consideración otras diferencias
estructurales que puedan existir entre las dos secuencias, a
condición de que las diferencias estructurales no impidan los
enlaces de hidrógeno con las bases complementarias. El grado de
complementariedad entre dos secuencias puede también expresarse por
comparación en términos del número de malos apareamientos de bases
presentes en cada conjunto de por lo menos 10 bases contiguas, el
cual número puede oscilar de 0 a 2 malos apareamientos de bases.
Por "suficiente complementariedad" se
entiende una secuencia de bases de ácidos nucleicos contiguos que es
capaz de hibridar con otra secuencia de bases mediante enlaces de
hidrógeno entre una serie de bases complementarias. Las secuencias
de bases complementarias pueden ser complementarias en cada posición
de la secuencia de bases de un oligonucleótido empleando un
apareamiento estándar de bases (p. ej., apareamiento G:C, A:T ó
A:U), ó bien puede contener uno o más residuos que no son
complementarios empleando enlaces de hidrógeno estándar (incluyendo
los "nucleótidos abásicos"), pero en los cuales la secuencia de
bases completamente complementaria es capaz de hibridar
específicamente con otra secuencia de bases en condiciones
apropiadas de hibridación. Las bases contiguas son de preferencia
por lo menos aproximadamente el 80%, con más preferencia por lo
menos aproximadamente el 90%, y con la mayor preferencia
aproximadamente el 100% complementarias a una secuencia a la cual
se pretende que un oligonucleótido hibride específicamente. Las
condiciones apropiadas de hibridación son ya bien conocidas para
los expertos en la técnica, y pueden predecirse fácilmente en base a
la composición de la secuencia de bases, o puede determinarse
empíricamente empleando un ensayo de rutina (p. ej., ver Sambrook
et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª
edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
NY, 1989) at \NAK\NAK 1.90-1.91,
7.37-7.57, 9.47-9.51 y
11.47-11.57 particularmente a \NAK\NAK
9.50-9.51, 11.12-11.13,
11.45-11.47 y 11.55-11.57).
Por "oligonucleótido de captura", se
entiende por lo menos un oligonucleótido de ácidos nucleicos que
proporciona los medios para unir específicamente una secuencia
diana y un oligonucleótido inmovilizado debido a la hibridación del
par de bases. El oligonucleótido de captura incluye de preferencia
dos regiones de unión: una región de unión a la secuencia diana, y
una región de unión a la sonda inmovilizada, habitualmente contiguas
en el mismo oligonucleótido, aunque el oligonucleótido de captura
puede incluir una región diana de unión a la secuencia y una región
de unión a la sonda inmovilizada, las cuales están presentes en dos
oligonucleótidos diferentes unidos juntamente por uno o más
engarces. Por ejemplo, una región de unión a la sonda inmovilizada
puede estar presente en un primer oligonucleótido, la región diana
de unión a la secuencia puede estar presente en un segundo
oligo-nucleótido, y los dos diferentes
oligonucleótidos están unidos mediante un enlace hidrógeno con un
engarce que es un tercer oligonucleótido que contiene secuencias que
hibridan específicamente a las secuencias del primer y segundo
oligonucleótidos.
Por "sonda inmovilizada" ó "ácido
nucleico inmovilizado" se entiende un ácido nucleico que une
directa o indirectamente un oligonucleótido de captura a un soporte
inmovilizado. Una sonda inmovilizada es un oligonucleótido unido a
un soporte sólido que facilita la separación de una secuencia diana
unida, a partir de un material no unido en una muestra.
Por "separación" ó "purificación" se
entiende que uno o más componentes de la muestra biológica se
eliminan de uno o más componentes de la muestra. Los componentes de
la muestra incluyen ácidos nucleicos en general en una fase de
solución acuosa, y puede incluir también materiales tales como
proteínas, hidratos de carbono, lípidos y sondas marcadas. De
preferencia, el paso de separación o purificación elimina por lo
menos aproximadamente el 70%, con más preferencia, por lo menos
aproximadamente el 90% e incluso con más preferencia por lo menos
aproximadamente el 95% de otros componentes presentes en la
muestra.
Por "ARN y ADN equivalentes" se entiende
moléculas de ARN y de ADN, que tienen las mismas propiedades de
hibridación del par de bases complementarias. Los ARN y ADN
equivalentes tienen diferentes grupos de azúcar (p. ej., ribosa
frente a desoxirribosa) y pueden diferir por la presencia de uracilo
en el ARN y de tiamina en el ADN. Las diferencias entre los ARN y
ADN equivalentes no contribuyen a la diferencia de homología, debido
a que los equivalentes tienen el mismo grado de complementariedad a
una secuencia determinada.
Por "consistiendo esencialmente", se
entiende que puede(n) incluirse (un) componente(s)
adicional(es) que no cambia(n) materialmente las
características básicas y nuevas de la presente invención, en los
kits de la presente invención. Dichas características incluyen la
capacidad para detectar selectivamente los ácidos nucleicos del
HIV-2 en muestras biológicas tales como la sangre
entera o el plasma, con un número de copias de aproximadamente 100
copias del ácido nucleico del HIV-2. Cualquier
componente(s), composición(es), o paso(s) de
método que tengan un efecto material sobre las características
básicas y nuevas de la presente invención caerían fuera del término
en cuestión.
La figura 1 es un diagrama esquemático que
ilustra los diferentes polinucleótidos que pueden emplearse para la
detección de una región diana dentro del ácido nucleico del
HIV-2 (representada por una línea gruesa
horizontal). Se muestran las posiciones de los siguientes ácidos
nucleicos relativas a la región diana: "oligonucleótidos de
captura" se refiere al ácido nucleico empleado para hibridar al,
y capturar el, ácido nucleico diana antes de la amplificación, en
donde "T" se refiere a una secuencia de cola empleada para
hibridar un oligonucleótido inmovilizado que tiene una secuencia
complementaria (no mostrada) "cebador no T7", y
"cebador-promotor T7" representa dos cebadores
de amplificación empleados para efectuar la TMA, en donde "P"
indica la secuencia promotora del cebador-promotor
T7; y "sonda" se refiere a la sonda empleada para la detección
del ácido nucleico amplificado.
La presente invención se refiere a kits para la
detección selectiva de los ácidos nucleicos del
HIV-2. Los kits que se describen en la presente son
útiles para la amplificación y detección de estos ácidos nucleicos
en muestras biológicas tales como la sangre humana, suero, plasma u
otro fluido o tejido corporal que deban analizarse para detectar la
presencia de ácidos nucleicos víricos. Los cebadores de
amplificación que aquí se describen, pueden usarse ventajosamente
como componentes de reacciones de amplificación múltiplex, en donde
pueden producirse diferentes especies de amplicones, a partir de un
surtido complejo de cebadores y polinucleótidos accesorios. Por
ejemplo, los cebadores descritos aquí pueden utilizarse en
reacciones de amplificación múltiplex que sintetizan amplicones
correspondientes a polinucleótidos de virus inconexos.
Las sondas, cebadores y métodos descritos en la
presente pueden emplearse o bien en aplicaciones diagnósticas o
bien para seleccionar sangre y productos de la sangre procedente de
donantes u otros tejidos que puedan contener partículas
infecciosas.
Aquellos expertos con un nivel normal de
experiencia en la técnica, apreciarán que el ensayo del ácido
nucleico representa un método conveniente y altamente sensible para
la detección de polinucleótidos específicos de virus en muestras
biológicas tales como sangre o plasma procedente de donantes. Dado
que los nuevos infectados con HIV-1 producen
niveles detectables de anticuerpos reactivos con antígenos víricos
al cabo de 1-2 meses después de la infección, un
ensayo serológico durante el primer mes siguiente a la exposición al
virus podría dar un resultado falsamente negativo y permitir que
muestras contaminadas con HIV-1 entraran en el
suministro de sangre con consecuencias devastadoras. De la misma
manera que la detección temprana de la exposición al
HIV-1 puede ayudar a asegurar la bondad del
suministro de sangre procedente de donantes, la detección temprana
de la exposición al HIV-2 podría proporcionar los
mismos beneficios. En consecuencia, los procedimientos de ensayo
más sensibles en la detección del HIV-2
proporcionarán la detección de los ácidos nucleicos específicos del
virus discerniéndolos de la respuesta inmunológica del anfitrión a
la infección.
La presente invención incluye kits (conteniendo
oligonucleótidos de amplificación y sondas) para la detección de
los ácidos nucleicos del HIV-2 en una muestra
biológica. Para diseñar las secuencias de oligonucleótidos
apropiadas para esta finalidad, secuencias del ADN de
HIV-2 conocidas, incluyendo los subtipos, se
alinearon en primer lugar emparejando las regiones que tienen
secuencias similares y a continuación comparando las secuencias
para identificar regiones candidatas del genoma vírico del
HIV-2 que podrían servir como reactivas en un ensayo
de diagnóstico. En base a estas comparaciones, se seleccionó la
región LTR del genoma del HIV-2 para la detección
empleando los oligonucleótidos de captura, cebadores y sondas que se
muestran esquemáticamente en la figura 1. Se escogieron porciones
de las secuencias conteniendo relativamente pocas variantes de
secuencias entre las secuencias comparadas, como puntos de partida
para diseñar oligonucleótidos sintéticos adecuados para el empleo
en la captura, amplificación y detección de secuencias amplificadas.
Otras consideraciones en el diseño de los oligonucleótidos incluyen
el contenido relativo de GC de la secuencia (variando desde
aproximadamente un 30% hasta aproximadamente un 55%), y la ausencia
relativa de una estructura secundaria pronosticada (p. ej., formas
de horquilla formando híbridos intramoleculares) dentro de una
secuencia.
En base a estos análisis, se diseñaron el
oligo-nucleótido de captura, los oligonucleótidos de
amplificación y las secuencias de la sonda, que se presentan más
adelante. Aquellos expertos con un nivel normal de experiencia en
la técnica, apreciarán que las secuencias del cebador específicas
para el HIV-2, con o sin la secuencia del promotor
T7, pueden ser empleadas como cebadores en los diferentes métodos de
amplificación in vitro basados en cebadores, descritos más
adelante. Adicionalmente, se contempla también que las sondas de
hibridación descritas en la presente, podrían emplearse como
cebadores de amplificación y que los cebadores de amplificación
descritos en la presente podrían emplearse como sondas de
hibridación. El ensayo de amplificación y detección detallado más
adelante es útil para la detección por lo menos de los subtipos A,
B, C y D de HIV-2. Se hace notar que la porción del
genoma del HIV-2 que sirve como diana para las
sondas descritas en la presente, no tiene una secuencia
correspondiente en el genoma del HIV-1. De esta
forma, las sondas son específicas para el HIV-2 y no
lo son para el HIV-1.
Los métodos útiles de amplificación en conexión
con la presente invención incluyen:
Amplificación mediada por la transcripción
(TMA), reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación
basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación de
desplazamiento de la cadena (SDA), y métodos de amplificación
empleando moléculas de polinucleótido autorreplicantes, y enzimas de
replicación como p. ej., MDV-1 ARN y enzima
Q-beta. Los métodos para llevar a cabo estas
diferentes técnicas de amplificación pueden encontrarse
respectivamente en la patente U.S. nº 5.399.491; patente U.S. nº
4.965.188; solicitud publicada de la patente europea EP 0 525
882, patente U.S. nº 5.455.166, patente U.S. nº 5.472.840 y Lizardi
et al., BioTechnology 6: 1197 (1988). La
patente U.S. nº 5.554.516 describe un método de amplificación de una
secuencia de ARN diana, empleando un único
promotor-cebador en ausencia de un cebador, el cual
forma un híbrido con el complemento de la secuencia de ARN
diana.
En una versión altamente preferida de la
invención, las secuencias de ácido nucleico del
HIV-2 se amplifican empleando un protocolo de TMA.
De acuerdo con este protocolo, la transcriptasa inversa que
proporciona la actividad ADN polimerasa posee también una actividad
RNasa H endógena. Uno de los cebadores empleados en este
procedimiento contiene una secuencia promotora posicionada corriente
arriba, de una secuencia que es complementaria a una cadena de un
ácido nucleico diana que hay que amplificar. En el primer paso de la
amplificación, un promotor-cebador hibrida al ARN
del HIV-2 diana en un sitio definido. La
transcriptasa inversa crea una copia de ADN a partir de la ARN
diana mediante la extensión del extremo 3' del
promotor-cebador. La cadena de ARN en el dúplex
ARN:ADN resultante se degrada mediante una actividad RNasa H, la
cual opcionalmente puede ser una actividad inherente de la
transcriptasa inversa. A continuación, un segundo cebador se une a
la cadena de ADN. Una segunda cadena de ADN se sintetiza a partir
del extremo del cebador por la transcriptasa inversa, creando con
ello una molécula de ADN de doble cadena. La ARN polimerasa reconoce
la secuencia promotora en este molde de ADN de doble cadena e
inicia la transcripción. Cada uno de los amplicones de ARN recién
sintetizados entra de nuevo en el proceso TMA y sirve de molde para
una nueva ronda de replicación, conduciendo con ello a una
expansión exponencial del amplicón de ARN. Puesto que cada uno de
los moldes de ADN puede hacer 100-1000 copias del
amplicón de ARN, esta expansión puede dar por resultado 10 mil
millones de amplicones en menos de una hora. El proceso completo es
autocatalítico y se efectúa a temperatura constante.
Los métodos de detección de los amplicones del
HIV-2 pueden ser tan sencillos como la tintura de
los productos de amplificación del ácido nucleico separados
electro-foréticamente, empleando un par de cebadores
oligo-nucleótidos. Como se detalla más adelante,
los métodos de detección preferidos emplean sondas de hibridación
específicas del HIV-2.
Como se ha indicado más arriba, un
"cebador" se refiere a un oligonucleótido opcionalmente
modificado el cual es capaz de hibridar a un ácido nucleico molde y
el cual tiene un extremo 3' que puede ser prolongado mediante una
actividad ADN polimerasa. La región 5' del cebador puede ser no
complementaria al ácido nucleico diana. Si la región 5' no
complementaria incluye una secuencia de promotor, recibe el nombre
de "cebador-promotor". Los expertos en la
técnica apreciarán que cualquier oligonucleótido que pueda funcionar
como un cebador (es decir, un oligonucleótido que hibrida
específicamente a una secuencia diana y tiene un extremo 3' capaz de
prolongarse mediante una actividad ADN polimerasa) puede ser
modificado para incluir una secuencia 5' promotora, y de esta forma
podría funcionar como un cebador-promotor. De manera
similar puede modificarse cualquier cebador-promotor
mediante la eliminación de, o mediante la síntesis sin, una
secuencia promotora y funcionar todavía como un cebador.
Los grupos de bases de los nucleótidos pueden
modificarse p. ej., mediante la adición de grupos propino, en tanto
el grupo de bases modificado conserve la capacidad de formar una
asociación no covalente con G, A, C, T ó U, y un oligonucleótido
que comprende por lo menos un grupo de bases de nucleótido
modificado no esté estéricamente impedido de hibridar con un ácido
nucleico de una sola cadena. Los grupos de azúcar habituales que
comprende la columna vertebral del cebador, incluyen la ribosa y la
desoxirribosa, aunque también pueden emplearse la
2'-O-metil-ribosa
(OMe), los azúcares halogenados, y otros azúcares modificados.
Normalmente, el grupo de engarce de la columna vertebral del
cebador es un grupo que contiene fósforo, lo más habitualmente, un
engarce fosfo-diéster, aunque otros engarces tales
como por ejemplo, los fosforotioatos, los metilfosfonatos y
engarces que no contienen fósforo tales como engarces del tipo
péptido, como los que se encuentran en los "ácidos péptido
nucleicos" (PNA), también se proponen para ser empleados en el
ensayo aquí descrito.
En principio, cualquier sistema de marcado y
detección que pueda ser empleado para la monitorización de la
hibridación específica del ácido nucleico, puede emplearse
juntamente con la presente invención. Incluidos entre la colección
de marcas de utilidad están las marcas radiactivas, enzimas,
haptenos, oligonucleótidos engarzados, moléculas
quimioluminiscentes y grupos redox activos que son aptos para los
métodos de detección electrónica. Las moléculas quimioluminiscentes
preferidas incluyen los ésteres de acridinio del tipo descrito por
Arnold et al., en la patente U.S. nº 5.283.174 para emplear
en conexión con ensayos homogéneos de protección, y del tipo
descrito por Woodhead et al., en la patente U.S. nº 5.656.207
para emplear en conexión con ensayos que cuantifican múltiples
dianas en una única reacción. Los métodos de marcado electrónico y
detección preferidos están descritos en las patentes U.S. nº
5.591.578 y 5.770.369 y la solicitud de patente internacional
publicada WO 98/57158. Los grupos activos redox de utilidad como
marcadores en la presente invención incluyen los metales de
transición tales como el Cd, Mg, Cu, Co, Pd, Zn, Fe y Ru.
Las marcas detectables para sondas
particularmente preferidas de acuerdo con la presente invención, son
detectables en sistemas homogéneos de ensayo (es decir, en donde,
en una mezcla, la sonda marcada unida presenta un cambio detectable
tal como la estabilidad o una degradación diferencial, comparada con
la sonda marcada sin unir). Una marca preferida para emplear en
ensayos homogéneos es un compuesto quimioluminiscente (p.ej. como
describe Woodhead et al., en la patente U.S. nº 5.656.207;
Nelson et al., en la patente U.S. 5.658.737; ó Arnold et
al., en la patente U.S. nº 5.639.604). Las marcas
quimioluminiscentes particularmente preferidas incluyen los
compuestos de éster de acridinio ("AE") tales como el AE
estándar o derivados del mismo tales como el
AE-naftilo, orto-AE, 1- ó
3-metil-AE,
2,7-dimetil-AE,
4,5-dimetil-AE,
orto-dibromo-AE,
orto-dimetil-AE,
meta-dimetil-AE,
orto-metoxi-AE,
orto-metoxi(cinamil)-AE,
orto-metil-AE,
orto-fluor-AE, 1- ó
3-metil-orto-fluor-AE,
1- ó
3-metil-meta-difluor-AE,
y 2-metil-AE.
En algunas aplicaciones, es deseable que las
sondas tengan por lo menos algún grado de
auto-complementariedad para facilitar la detección
de los dúplex sonda:diana en una muestra de ensayo sin que se
requiera previamente la eliminación de la sonda no hibridada antes
de la detección. A título de ejemplo, las estructuras llamadas
"antorchas moleculares", están diseñadas para incluir regiones
distinguibles de autocomplementariedad (llamadas "dominio de
unión a la diana" y "dominio de cierre de la diana"), las
cuales están conectadas mediante una región de unión y las cuales
hibridan entre sí en condiciones predeterminadas del ensayo de
hibridación. Cuando se exponen a las condiciones de
desnaturalización, las dos regiones complementarias (que pueden ser
total o parcialmente complementarias) de la antorcha molecular, se
funden, dejando el dominio de unión a la diana dispuesto para la
hibridación a una secuencia diana cuando las condiciones
predeterminadas del ensayo de hibridación se restablecen. Las
antorchas moleculares están diseñadas de forma que el dominio de
unión diana favorece la hibridación a la secuencia diana en el
dominio diana de cierre. El dominio diana de unión y el dominio
diana de cierre de una antorcha molecular incluyen marcas de
interacción (p. ej., luminiscente/apagador) situados de forma que
se produce una señal diferente cuando la antorcha molecular se
hibrida a sí misma, frente a cuando la antorcha molecular se
hibrida a un ácido nucleico diana, con lo cual se permite la
detección de los dúplex sonda:diana en una muestra de ensayo en
presencia de la sonda sin hibridar que tiene un nivel viable
asociado con la misma. Las antorchas moleculares están
completamente descritas en la publicación internacional nº WO
OO/01850.
Otro ejemplo de sonda de ensayo de hibridación
auto-complementaria es una estructura comúnmente
llamada "faro molecular". Un faro molecular comprende
moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia diana
complementaria, un par de afinidad (o brazos de ácido nucleico) que
sostienen la sonda en una configuración cerrada en ausencia de una
secuencia diana de ácido nucleico, y una pareja de marcas que
interaccionan cuando la sonda está en una configuración cerrada. La
hibridación del ácido nucleico diana y la secuencia de complemento
de la diana separa los miembros del par de afinidad con lo cual se
cambia la sonda a una configuración abierta. El cambio a una
conformación abierta es detectable debido a la reducida interacción
del par de marcado, el cual puede ser por ejemplo, un fluoróforo y
un extintor (p. ej., DABCYL y EDANS). Los faros moleculares están
completamente descritos en la patente U.S. nº 5.925.517.
Las técnicas de síntesis y métodos de unión de
marcas a los ácidos nucleicos y marcas de detección, son ya bien
conocidos en la técnica (p. ej., ver Sambrook et al.,
Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2ª edición (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989),
capítulo 10; Nelson et al., patente U.S. nº 5.658.737;
Woodhead et al., patente U.S. nº 5.656.297; Hogan et
al., patente U.S. nº 5.547.842; Arnold et al., patente
U.S. nº 5.283.174; y Kourilsky et al., patente U.S. nº
4.581.333).
Las sondas de acuerdo con la invención constan
de polinucleótidos o análogos de polinucleótidos y pueden llevar
marcas detectables covalentemente unidas a los mismos. Los
nucleósidos o nucleósidos análogos de la sonda comprenden bases
heterocíclicas nitrogenadas, o análogos de bases, en donde los
nucleósidos están unidos entre sí, por ejemplo mediante enlaces
fosfodiéster para formar un polinucleótido. En consecuencia, una
sonda puede contener ácido ribonucleico convencional (ARN) y ácido
desoxirribonucleico (ADN) pero puede contener también análogos
químicos de estas moléculas. La "columna vertebral" de una
sonda puede estar maquillada con una variedad de engarces ya
conocidos en la técnica, incluyendo uno o más engarces
azúcar-fosfodiéster, uniones péptido-ácido nucleico
(algunas veces llamados "ácidos péptido nucleicos" como se
describe por Hylding-Nielsen et al., PCT
Int'l Pub. nº WO 95/32305), engarces fosforotioatos, engarces
metilfosfonatos o combinaciones de los mismos. Los grupos azúcar de
la sonda pueden ser o bien ribosa o bien desoxirribosa, o compuestos
similares que tienen substituciones ya conocidas, tales como por
ejemplo, substituciones 2'metoxilo (OMe) y substituciones 2'haluro
(p. ej., 2'-F). Las bases nitrogenadas pueden ser
bases convencionales (A, G, C, T, U), análogos ya conocidos de las
mismas (p. ej., inosina ó "T"; ver The Biochemistry of the
Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed.,
11ª edición, 1992), derivados ya conocidos de bases de purina o
pirimidina (p. ej.,
N^{4}-metil-desoxigaunosina,
desaza- ó aza-purinas y desaza ó
aza-pirimidinas, bases pirimidínicas que tienen
grupos substituyentes en la posición 5 ó 6, bases purínicas que
tienen un substituyente alterado o de reemplazamiento en las
posiciones 2, 6 ó 8,
2-amino-6-metilaminopurina,
O^{6}-metilguanina,
4-tio-pirimidinas,
4-amino-pirimidinas,
4-dimetilhidrazina-pirimidinas, y
O^{4}-alquil-pirimidinas (ver,
Cook, PCT Int'l Pub. nº WO 93/13121) y residuos
"abásicos" en los cuales la columna vertebral no incluye
ninguna base nitrogenada para uno o más residuos del polímero (ver
Arnold et al., patente U.S. nº 5.585.481). Un ácido nucleico
puede comprender solamente azúcares convencionales, bases y
engarces encontrados en ARN y ADN, ó pueden incluir tanto
componentes convencionales como substituciones (p. ej., bases
convencionales unidas mediante una estructura de metoxilos, o un
ácido nucleico que incluye bases convencionales y una o más bases
análogas).
En la presente se describen normas de utilidad
para el diseño de cebadores y sondas de amplificación con
características deseadas. Los sitios óptimos para la amplificación
y sondado de los ácidos nucleicos del HIV-2,
contienen dos, y de preferencia tres, regiones conservadas mayores
de aproximadamente 15 bases de longitud, dentro de aproximadamente
350 bases, y de preferencia, dentro de 150 bases, de secuencias
contiguas. El grado de amplificación observado en un conjunto de
cebadores o cebadores- promotores, depende de varios factores,
incluyendo la capacidad de los oligonucleótidos de hibridar a sus
secuencias complementarias y su capacidad de ser prolongadas
enzimáticamente. Debido a que la extensión y especificidad de las
reacciones de hibridación están afectadas por un cierto número de
factores, la manipulación de aquellos factores determinará la exacta
sensibilidad y especificidad de un oligonucleótido particular,
tanto si es perfectamente complementario a su diana como si no lo
es. Los efectos de variar las condiciones de ensayo son ya
conocidos por los expertos en la técnica, y están descritos por
Hogan et al., en la patente U.S. nº 5.840.488.
La longitud de la secuencia del ácido nucleico
diana, y en consecuencia, la longitud de la secuencia del cebador o
la secuencia de la sonda puede ser importante. En algunos casos,
pueden existir diferentes secuencias a partir de una región diana
particular, que varían en situación y longitud, las cuales
suministrarán cebadores o sondas que tendrán las deseadas
características de hibridación. Mientras sea posible que los ácidos
nucleicos que no son perfectamente complementarios puedan hibridar,
el tramo más largo de una secuencia de bases perfectamente
homólogas determinará normalmente la estabilidad primaria del
híbrido.
Los cebadores de amplificación y las sondas
deben estar posicionados para minimizar la estabilidad del híbrido
de ácido nucleico, oligonuceótido:ácido nucleico no diana (es decir,
el ácido nucleico con una secuencia similar al ácido nucleico
diana). Se prefiere que los cebadores de amplificación y las sondas
de detección sean capaces de distinguir entre secuencias diana y
secuencias no diana. Al diseñar los cebadores y las sondas, las
diferencias en estos valores T_{m} deben ser tan grandes como sea
posible (p. ej., por lo menos 2ºC y de preferencia 5ºC).
Las regiones de ácido nucleico que son conocidas
por formar fuertes estructuras internas que inhiben la hibridación,
son menos preferidas como cebadores o sondas. Ejemplos de dichas
estructuras incluyen bucles en forma de horquilla. De forma
similar, deben obviarse los oligo-nucleótidos con
una auto complementariedad para la extensión.
El grado de extensión no específica
(cebadores-dímeros o copias no diana) pueden afectar
también la eficiencia de la amplificación. Por esta razón, los
cebadores se seleccionan por tener una baja o una auto
complementariedad ó una complementariedad cruzada, particularmente
en los extremos 3' de la secuencia. Se evitan los tramos
homopolímeros largos y un alto contenido en GC para reducir la falsa
extensión del cebador. Se dispone de un programa de ordenador
comercialmente asequible para ayudar en este aspecto del diseño. Los
programas de ordenador disponibles incluyen el programa
MaxDNASIS^{TM} 2.0 (Hitachi Software Engineering American Ltd.) y
OLIGO® versión 4.1 (National Bioscience).
Los expertos en la técnica con un nivel normal
de experiencia, apreciarán que la hibridación implica la asociación
de dos cadenas simples de ácido nucleico complementario para formar
una cadena doble con enlaces de hidrógeno. Se entiende por sí mismo
que si una de las dos cadenas está total o parcialmente implicada en
un híbrido, será menos capaz de participar en la formación de un
híbrido nuevo. Diseñando los cebadores y las sondas de forma que
las porciones substanciales de las secuencias de interés sean de una
sola cadena, la velocidad y extensión de la hibridación puede ser
grandemente aumentada. Si la diana es una secuencia genómica
integrada, entonces se encontrará naturalmente en forma de cadena
doble (como es el caso del producto de la reacción en cadena de la
polimerasa). Estas dianas de doble cadena son naturalmente
inhibidoras a la hibridación con una sonda y necesitan una
desnaturalización antes del paso de hibridación.
La velocidad de hibridación de los
polinucleótidos puede medirse mediante la determinación de
C_{0}t_{1/2}. La velocidad a la cual un polinucleótido hibrida
a su diana es una medida de la estabilidad térmica de la estructura
secundaria de la diana en la región diana de unión. La medición
estándar de la velocidad de hibridación es el C_{0}t_{1/2} que
se mide como moles de nucleótido por litro multiplicado por los
segundos. Así pues, es la concentración de la sonda multiplicada
por el tiempo en el cual tiene lugar el 50% de la hibridación
máxima a aquella concentración. Este valor se determina hibridando
diferentes cantidades de polinucleótido a una cantidad constante de
la diana durante un tiempo fijo. El C_{0}t_{1/2} se encuentra
gráficamente mediante procedimientos estándar habituales para los
expertos con un nivel normal de experiencia en la técnica.
Los cebadores de utilidad para efectuar las
reacciones de amplificación tienen diferentes longitudes. Por
ejemplo, los oligonucleótidos de amplificación complementarios a una
cadena de la secuencia del ácido nucleico diana de
HIV-2, tienen de preferencia, longitudes de hasta
100 bases, con más preferencia, de 18 a 60 bases, todavía con más
preferencia de 18 a 34 ó todavía con más preferencia, de 18 a 25
bases e incluyen por lo menos 9 y hasta 34 bases contiguas
substancialmente complementarias a la secuencia dada por
AAAATCCCTAGCAGGTTGGCGCCC
GAACAGGGAC (SEQ ID NO:8). Dicho en otras palabras, pero identificando los mismos oligo-nucleótidos, estos cebadores incluyen por lo menos 9 y hasta 34 bases contiguas contenidas en una secuencia substancialmente correspondiente a GTCCTGTTCGGGCGCCAACCTGCTAGGGATTTT (SEQ ID NO:9). Aunque no se cree que es esencial para la operabilidad de la invención, todos los cebadores listados en la tabla 2 comparten la secuencia central común CGGGCGCCA (SEQ ID NO:34). Nuestro descubrimiento de que los emparejamientos están tolerados entre la secuencia de SEQ ID NO:9 y la secuencia del cebador situada corriente abajo (3') de la secuencia de SEQ ID NO:34, muestra la utilidad general de los cebadores que tienen un subgrupo de la secuencia de SEQ ID NO:9. En otras palabras, las secuencias de cebadores que se derivan de la SEQ ID NO:9 y que hibridan a una diana que tiene la secuencia de SEQ ID NO:8 en unas condiciones de amplificación tales como las empleadas en la presente, pueden ser empleadas en los procedimientos de amplificación descritos en la presente. En general, los cebadores que tienen 9-34 bases contiguas de SEQ ID NO:9 son altamente preferidos para emplear como cebadores-promotores, tales como los promotores cebadores T7. Por supuesto, si el cebador es un cebador-promotor T7, estará incluido en el extremo 5' del cebador una secuencia del promotor T7 la cual típicamente añade aproximadamente 27-33 bases a la longitud del cebador. Un ejemplo de un cebador de amplificación preferido, de acuerdo con este aspecto de la invención, incluye un oligonucleótido que tiene la secuencia dada por SEQ ID NO:10. El cebador promotor T7 descrito en la presente es particularmente útil para realizar las reacciones de amplificación del ácido nucleico empleando los métodos descritos por Kacian et al., en las patentes U.S. n^{os} 5.399.491 y 5.554.516. Los cebadores pueden incluir opcionalmente nucleótidos modificados o nucleótidos análogos. De preferencia, la detección de los amplicones sintetizados empleando estos cebadores se efectúa empleando sondas de detección de oligonucleótidos descritas en la presente.
GAACAGGGAC (SEQ ID NO:8). Dicho en otras palabras, pero identificando los mismos oligo-nucleótidos, estos cebadores incluyen por lo menos 9 y hasta 34 bases contiguas contenidas en una secuencia substancialmente correspondiente a GTCCTGTTCGGGCGCCAACCTGCTAGGGATTTT (SEQ ID NO:9). Aunque no se cree que es esencial para la operabilidad de la invención, todos los cebadores listados en la tabla 2 comparten la secuencia central común CGGGCGCCA (SEQ ID NO:34). Nuestro descubrimiento de que los emparejamientos están tolerados entre la secuencia de SEQ ID NO:9 y la secuencia del cebador situada corriente abajo (3') de la secuencia de SEQ ID NO:34, muestra la utilidad general de los cebadores que tienen un subgrupo de la secuencia de SEQ ID NO:9. En otras palabras, las secuencias de cebadores que se derivan de la SEQ ID NO:9 y que hibridan a una diana que tiene la secuencia de SEQ ID NO:8 en unas condiciones de amplificación tales como las empleadas en la presente, pueden ser empleadas en los procedimientos de amplificación descritos en la presente. En general, los cebadores que tienen 9-34 bases contiguas de SEQ ID NO:9 son altamente preferidos para emplear como cebadores-promotores, tales como los promotores cebadores T7. Por supuesto, si el cebador es un cebador-promotor T7, estará incluido en el extremo 5' del cebador una secuencia del promotor T7 la cual típicamente añade aproximadamente 27-33 bases a la longitud del cebador. Un ejemplo de un cebador de amplificación preferido, de acuerdo con este aspecto de la invención, incluye un oligonucleótido que tiene la secuencia dada por SEQ ID NO:10. El cebador promotor T7 descrito en la presente es particularmente útil para realizar las reacciones de amplificación del ácido nucleico empleando los métodos descritos por Kacian et al., en las patentes U.S. n^{os} 5.399.491 y 5.554.516. Los cebadores pueden incluir opcionalmente nucleótidos modificados o nucleótidos análogos. De preferencia, la detección de los amplicones sintetizados empleando estos cebadores se efectúa empleando sondas de detección de oligonucleótidos descritas en la presente.
Otros cebadores de amplificación que pueden ser
empleados en cualquier combinación con los cebadores descritos más
arriba, para llevar a cabo las reacciones de amplificación, son
complementarias a la cadena opuesta de la secuencia de ácido
nucleico diana de HIV-2. Los cebadores de
amplificación complementarios a esta cadena opuesta de la secuencia
de ácido nucleico diana del HIV-2, tienen de
preferencia longitudes de hasta 100 bases, ó con más preferencia 19
a 40 bases, ó todavía con más preferencia 19 a 21 bases. Estos
cebadores son particularmente útiles como cebadores no promotores.
Como se describe en la presente, estos cebadores tienen por lo menos
19 bases contiguas de una secuencia que corresponde
substancialmente a GTGTGTGTTCCCATCTCTCCTAGTCGCCGCCTGGTCATTC (SEQ ID
NO:1). Ejemplos de cebadores de amplificación particular que
cumplen estas condiciones incluyen oligonucleótidos que tienen las
secuencias dadas por SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID
NO:5, SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7.
Debe entenderse que las longitudes variables
especificadas más arriba de los cebadores de amplificación y de las
sondas de detección se pretende que acomoden la inclusión de
secuencias extrañas que pueden no participar en la unión a dianas,
y que pueden no afectar substancialmente los procedimientos de
amplificación o detección. Por ejemplo, los
cebadores-promotores útiles para llevar a cabo las
reacciones de amplificación de acuerdo con la invención, tienen por
lo menos una secuencia mínima que hibrida al ácido nucleico diana
del HIV-2, y una secuencia de promotor situada
corriente arriba de esta secuencia mínima. Sin embargo, la inserción
de secuencias entre la secuencia de unión a la diana y la secuencia
de promotor podría cambiar la longitud del cebador sin comprometer
su utilidad en la reacción de amplificación. Adicionalmente, las
longitudes de los cebadores de amplificación y de las sondas de
detección son un problema de elección en tanto las secuencias de
estos oligonucleótidos están conformes con los requisitos mínimos
esenciales para la hibridación de la secuencia complementaria
deseada. Las secuencias de la sonda deben incluir las secuencias de
14 términos de la SEQ ID NO:21, ó el complemento de la misma, como
un núcleo común. Esto define un dominio de unión a la sonda en la
secuencia diana del HIV-2, ó en los amplicones
sintetizados mediante un procedimiento de amplificación. Los
cebadores de amplificación que hibridan corriente abajo del dominio
de unión a la sonda deben tener secuencias que comprenden la
secuencia SEQ ID NO:1, opcionalmente conteniendo una secuencia de
promotor 5' no complementaria al ácido nucleico de
HIV-2. Finalmente, los cebadores de amplificación
que hibridan corriente arriba del dominio de unión de la sonda
deben tener por lo menos 19 bases contiguas de la secuencia SEQ ID
NO:1.
Las dos tablas siguientes presentan ejemplos
específicos de secuencias de oligonucleótidos que fueron empleadas
como cebadores para la amplificación de los ácidos nucleicos del
HIV-2. La tabla 1 presenta las secuencias de
cebadores no T7 que fueron complementarias a las secuencias del
HIV-2 en una cadena del àcido nucleico. La tabla 2
presenta las secuencias tanto de las secuencias complementarias
diana del HIV-2 como de todas las secuencias para
los cebadores-promotores T7 que fueron empleados
durante el desarrollo de la invención. Comparadas con las
secuencias de oligonucleótidos de la tabla 1, las secuencias de
oligonucleótidos de la tabla 2 son complementarias a la cadena de
ácido nucleico opuesta. Como se ha indicado más arriba, todos los
cebadores-promotores T7 incluyen secuencias
complementarias a una diana HIV-2 en sus extremos
3', y una secuencia de promotor T7 en sus extremos 5'.
La tabla 2 presenta una secuencia de
oligonucleótidos complementaria-diana del
HIV-2 (SEQ ID NO:10), y la respectiva
correspondiente secuencia del cebador-promotor T7
(SEQ ID NO:15).
Los grupos de cebadores preferidos para la
amplificación de la región LTR del HIV-2 en una
reacción de amplificación mediada por la transcripción, incluyen un
primer cebador que hibrida el transcripto LTR del
HIV-2 (como por ejemplo uno de los cebadores
listados en la tabla 2), y un segundo cebador que es complementario
a la secuencia de un producto de extensión del primer cebador (como
por ejemplo una de las secuencias de cebadores listadas en la tabla
1). En una versión altamente preferida, el primer cebador es un
cebador-promotor que incluye una secuencia del
promotor T7 en su extremo 5'.
En ciertas versiones preferidas se proporciona
un juego de por lo menos dos cebadores de amplificación para
amplificar el ácido nucleico de HIV-2, el cual
incluye: (i) un primer cebador de amplificación que consta de la
secuencia de bases de SEQ ID NO:10; e (ii) un segundo cebador de
amplificación que contiene un oligonucleótido que tiene o
corresponde substancialmente a la secuencia de bases de SEQ ID NO:2,
SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 ó SEQ ID NO:7.
En una combinación particularmente preferida, el primer cebador de
amplificación es un cebador-promotor que contiene un
oligonucleótido que tiene o corresponde substancialmente a la
secuencia de bases de SEQ ID NO:10, y el segundo cebador de
amplificación contiene un oligonucleótido que tiene o corresponde
substancialmente a la secuencia de bases de SEQ ID NO:6.
Los métodos para la amplificación de una
secuencia diana de ácido nucleico presente en el ácido nucleico del
HIV-2, pueden incluir un paso adicional para la
detección de los amplicones del HIV-2. Este
procedimiento para la detección de los ácidos nucleicos del
HIV-2 (incluyendo los amplicones de
HIV-2) incluye los pasos para: contactar una
muestra de ensayo con una sonda de ensayo de hibridación la cual
hibrida de preferencia a la secuencia de ácido nucleico diana, o el
complemento de la misma, bajo condiciones restrictivas de
hibridación, formando con ello un dúplex sonda:diana que es estable
para la detección. A continuación se efectúa un paso para la
determinación de si el híbrido está presente en la muestra de ensayo
como una indicación de la presencia o ausencia de
HIV-2 en la muestra de ensayo. Esto puede implicar
la detección del dúplex sonda:diana como indicador de la presencia
de HIV-2 en la muestra biológica.
Sondas de ensayo de hibridación útiles para la
detección de las secuencias de ácidos nucleicos del
HIV-2, incluyen una secuencia de bases
substancialmente complementaria a un ARN de HIV-2
transcrito ó el ADN codificante. Así pues, las sondas de la
invención hibridan una cadena de una secuencia de ácido nucleico
diana del HIV-2, ó el complemento de la misma.
Todas las sondas de la presente invención hibridan de forma estable
una secuencia diana de HIV-2 en condiciones
restrictivas del ensayo de hibridación. Estas sondas pueden tener
también bases adicionales externas de la región del ácido nucleico
diana, la cual puede ser o puede no ser complementaria del ácido
nucleico del HIV-2.
Las sondas preferidas son suficientemente
homólogas al ácido nucleico diana para hibridar en condiciones
restrictivas de hibridación correspondientes aproximadamente a 60ºC
cuando la concentración de sal está en el margen de
0,6-0,9M. Las sales preferidas incluyen el cloruro
de litio, pero otras sales tales como el cloruro de sodio y citrato
de sodio pueden también emplearse en la solución de hibridación.
Ejemplo de condiciones de hibridación altamente restrictivas son
alternativamente proporcionadas por 0,48M de tampón de fosfato de
sodio, 0,1% de dodecilsulfato de sodio y 1 mM de cada uno de EDTA y
EGTA, ó por 0,6M de LiCl, 1% de laurilsulfato de litio, 60 mM de
succinato de litio y 10 mM de cada uno de EDTA y EGTA.
En ciertas versiones de la invención, las sondas
tiene de preferencia secuencias complementarias a la diana de hasta
22 bases, con más preferencia hasta 18 bases y todavía con más
preferencia, hasta 16 bases; e incluyen entre 14 y 22 nucleótidos
contiguos contenidos en una secuencia que corresponde
substancialmente a CCTGGTCTGTTAG
GACCCTTCT (SEQ ID NO:20). Se hace notar que, cada una de las sondas empleadas en los ejemplos descritos en la presente contenían una secuencia común de 14 bases GTCTGTTAGGACCC (SEQ ID NO:21). Por supuesto, las sondas de la presente invención pueden tener alternativamente secuencias que son complementarias de las secuencias de las sondas anteriores. En todos los casos, cuando las sondas son enteramente complementarias a los ácidos nucleicos del HIV-2 (incluyendo los amplicones del HIV-2), las longitudes de las sondas son de preferencia hasta de 35 nucleótidos, con más preferencia hasta de 22 nucleótidos, y todavía con mayor preferencia, hasta de 18 nucleótidos, e incluso con mayor preferencia hasta de 16 nucleótidos. Como se ha indicado más arriba, las sondas pueden estar hechas de ADN, ARN, una combinación de ADN y ARN, un análogo de ácido nucleico, o contener uno o más nucleósidos modificados (p. ej., un ribonucleósido que tenga una substitución 2'-O-metilo en el grupo ribofuranosilo).
GACCCTTCT (SEQ ID NO:20). Se hace notar que, cada una de las sondas empleadas en los ejemplos descritos en la presente contenían una secuencia común de 14 bases GTCTGTTAGGACCC (SEQ ID NO:21). Por supuesto, las sondas de la presente invención pueden tener alternativamente secuencias que son complementarias de las secuencias de las sondas anteriores. En todos los casos, cuando las sondas son enteramente complementarias a los ácidos nucleicos del HIV-2 (incluyendo los amplicones del HIV-2), las longitudes de las sondas son de preferencia hasta de 35 nucleótidos, con más preferencia hasta de 22 nucleótidos, y todavía con mayor preferencia, hasta de 18 nucleótidos, e incluso con mayor preferencia hasta de 16 nucleótidos. Como se ha indicado más arriba, las sondas pueden estar hechas de ADN, ARN, una combinación de ADN y ARN, un análogo de ácido nucleico, o contener uno o más nucleósidos modificados (p. ej., un ribonucleósido que tenga una substitución 2'-O-metilo en el grupo ribofuranosilo).
Ejemplos específicos de sondas que pueden
emplearse para llevar a cabo el ensayo descrito en la presente,
incluyen oligonucleótidos que tienen o que substancialmente
corresponden a las secuencias de bases, o complementos de las
mismas, dadas por SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID
NO:25, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27. Se prefiere también para las
sondas de acuerdo con la presente invención, el incluir una marca de
éster de acridinio unida a la sonda por medio de un engarce
no-nucleótido. Por ejemplo, una sonda altamente
preferida incluye una marca de éster de acridinio unida a la sonda
mediante un engarce no nucleótido situado entre los nucleótidos 9 y
10 (lectura de 5' a 3') de SEQ ID NO:26.
La tabla siguiente presenta las secuencias de
las sondas de detección preferidas que fueron empleadas para la
detección de los amplicones del HIV-2. Dado que las
sondas alternativas para la detección de las secuencias de ácido
nucleico del HIV-2 pueden hibridar la cadena de
sentido opuesto de HIV-2, la presente invención
incluye también los oligonucleótidos que son complementarios de las
secuencias presentadas en la tabla 3.
En algunas versiones de la invención, la
secuencia de la sonda para la detección de las secuencias del LTR
amplificado, incluye una estructura de metoxilos o por lo menos un
engarce metoxilo en la estructura de ácidos nucleicos. De
preferencia, las sondas de detección están marcadas con compuestos
AE quimioluminiscentes que están unidos a las secuencias de la
sonda por medio de un engarce substancialmente como se ha descrito
en la patente U.S. nº 5.585.481; y en la patente U.S. 5.639.604,
particularmente como se describe en la columna 10, línea 6 hasta la
columna 11 línea 3, y en el ejemplo 8.
Los oligonucleótidos de captura preferidos
incluyen una primera secuencia que es complementaria a una secuencia
del HIV-2 en la región LTR (es decir, una secuencia
de unión al HIV-2), covalentemente unida a una
segunda secuencia (es decir, una secuencia de "cola"), que
sirve como diana para la inmovilización sobre un soporte sólido.
Puede emplearse cualquier estructura para unir la secuencia de bases
de un oligonucleótido de captura. En ciertas versiones preferidas
el oligonucleótido de captura incluye por lo menos un engarce
metoxilo en la estructura. La secuencia de cola, la cual está de
preferencia en el extremo 3' de un oligonucleótido de captura, se
emplea para hibridar a una secuencia de bases complementaria para
proporcionar unos medios para la captura del ácido nucleico del
HIV-2 diana hibridado de preferencia a otros
componentes de la muestra biológica.
Aunque en una secuencia de cola puede emplearse
cualquier secuencia de bases que hibrida a una secuencia de bases
complementaria, se prefiere que la secuencia que hibrida se extienda
en una longitud de aproximadamente 5 a 50 restos nucleótidos. Las
secuencias de cola particularmente preferidas son substancialmente
homopoliméricas y contienen aproximadamente de 10 a aproximadamente
40 restos de nucleótidos o con más preferencia, de aproximadamente
14 a aproximadamente 30 restos. Un oligonucleótido de captura puede
incluir una primera secuencia que une específicamente un
polinucleótido diana de HIV-2, y una segunda
secuencia que une específicamente un tramo oligo (dT) inmovilizado
en un soporte sólido.
Empleando los compuestos ilustrados en la figura
1, un ensayo para la detección de las secuencias del
HIV-2 en una muestra biológica incluye los pasos de
captura del ácido nucleico diana empleando el oligonucleótido de
captura, amplificando la región diana capturada empleando por lo
menos dos cebadores, y detectando el ácido nucleico amplificado
mediante en primer lugar, la hibridación de la sonda marcada a una
secuencia contenida en el ácido nucleico amplificado y a
continuación detectando una señal resultante de la sonda marcada
unida.
El paso de captura emplea de preferencia un
oligonucleótido de captura, en donde, en condiciones de hibridación,
una parte del oligonucleótido de captura hibrida específicamente a
una secuencia diana de ácido nucleico y una parte de la cola sirve
como un componente del par de unión, tal como un ligando (p. ej., un
par de unión biotina-avidina) que permite que la
región diana sea separada de otros componentes de la muestra. De
preferencia, la parte de la cola del oligonucleótido de captura es
una secuencia que hibrida a una secuencia complementaria
inmovilizada en una partícula de soporte sólido. De preferencia, en
primer lugar, el oligonucleótido de captura y el ácido nucleico
diana están en solución para tener ventaja sobre la cinética de
hibridación en fase solución. La hibridación produce un complejo de
captura oligonucleótido:ácido nucleico diana, que puede unirse a una
sonda inmovilizada a través de la hibridación de la parte de la
cola del oligonucleótido de captura con una secuencia
complementaria inmovilizada. Así pues, se forma un complejo que
comprende un ácido nucleico diana, un oligonucleótido de captura y
una sonda inmovilizada, en condiciones de hibridación. De
preferencia, la sonda inmovilizada es una secuencia de repetición,
y con más preferencia, una secuencia homopolimérica (p. ej.,
poli-A, poli-T,
poli-C ó poli-G) la cual es
complementaria a la secuencia de la cola y está unida a un soporte
sólido. Por ejemplo, si la parte de la cola del oligonucleótido de
captura contiene una secuencia poli-A, entonces la
sonda inmovilizada contendría una secuencia poli-T,
aunque puede emplearse cualquier combinación de secuencias
complementarias. El oligonucleótido de captura puede también
contener restos "espaciadores", los cuales son de una o más
bases situadas entre la secuencia de bases que hibrida a la diana y
la secuencia de bases de la cola que hibrida la sonda inmovilizada.
Puede emplearse cualquier soporte sólido para unir el complejo
ácido nucleico diana:oligonucleótido de captura. Soportes útiles
pueden ser, o bien matrices o bien partículas libres en solución
(p. ej., nitrocelulosa, nylon, vidrio, poliacrilato, mezcla de
polímeros, poliestireno, silano polipropileno y, de preferencia,
partículas que pueden atraerse magnéticamente). Los métodos de
unión de una sonda inmovilizada al soporte sólido son ya bien
conocidos. El soporte es de preferencia, una partícula que puede
ser recuperada de la solución empleando métodos estándar (p. ej.,
centrifugación, atracción magnética de partículas magnéticas, y
similares). Soportes preferidos son partículas
para-magnéticas monodispersas (es decir, de tamaño
uniforme \pm aproximadamente el 5%).
Recuperando el complejo ácido nucleico
diana:sonda inmovilizada del oligonucleótido de captura, se
concentra efectivamente el ácido nucleico diana (respecto a su
concentración en la muestra biológica) y se purifica el ácido
nucleico diana de los inhibidores de amplificación que pueden estar
presentes en la muestra biológica. El ácido nucleico diana
capturado puede lavarse una o más veces, a continuación purificarse
la diana, por ejemplo, resuspendiendo las partículas que llevan
unido el complejo ácido nucleico diana:oligonucleótido de
captura:sonda inmovilizada, en una solución de lavado y a
continuación recuperando las partículas que llevan unido el
complejo, de la solución de lavado, como se ha descrito más arriba.
En una versión preferida, los pasos de captura tienen lugar
hibridando secuencialmente el oligonucleótido de captura con el
ácido nucleico diana y a continuación ajustando las condiciones de
hibridación para permitir la hibridación de la parte de la cola del
oligonucleótido de captura con una secuencia complementaria
inmovilizada (p. ej., como se describe en la patente PCT nº WO
98/50583). Después de finalizado el paso de captura, y de
cualesquiera pasos opcionales de lavado, el ácido nucleico diana
puede amplificarse a continuación. Para limitar el número de pasos
de manipulación, el ácido nucleico diana opcionalmente puede ser
amplificado sin liberarlo del oligonucleótido de captura.
Los métodos preferidos para emplear en los kits
de la presente invención se describen e ilustran en los ejemplos
que se presentan más adelante. Con referencia a la figura 1, se
ilustra un sistema de detección de una región diana del genoma del
HIV-2 (mostrado por una línea horizontal gruesa).
Este sistema incluye cuatro oligonucleótidos (mostrados por líneas
contínuas más cortas): un oligonucleótido de captura que incluye una
secuencia que hibrida específicamente a la secuencia de
HIV-2 en la región diana y una cola ("T") que
hibrida a una secuencia complementaria inmovilizada sobre un
soporte sólido para capturar la región diana presente en una muestra
biológica; un cebador-promotor T7 el cual incluye
una secuencia que hibrida específicamente a una secuencia de
HIV-2 en la región diana y una secuencia del
promotor T7 ("P") la cual cuando es de doble cadena, sirve como
un promotor funcional para la T7 ARN polimerasa; un cebador no T7
el cual incluye una secuencia que hibrida específicamente a una
primera cadena de ADNc formada a partir de la secuencia de la
región diana empleando el cebador T7; y una sonda marcada la cual
incluye una secuencia que hibrida específicamente a una parte de la
región diana que se amplifica empleando los dos cebadores.
Como se ha indicado más arriba, la amplificación
de la región diana capturada empleando los dos cebadores puede
efectuarse empleando varias reacciones de amplificación de ácidos
nucleicos ya conocidas. En una versión preferida, se emplea una
reacción de amplificación asociada a la transcripción, tal como la
TMA. En dicha versión, se producen muchas cadenas de ácido nucleico
a partir de una única copia de ácido nucleico diana, permitiendo de
esta forma la detección de la diana mediante sondas de detección que
están unidas a las secuencias amplificadas. De preferencia, la
amplificación asociada a la transcripción emplea dos tipos de
cebadores (uno al que se llama cebador-promotor
debido a que contiene una secuencia promotora, marcada "P" en
la figura 1, para una ARN polimerasa) dos enzimas (una
transcriptasa inversa y una ARN polimerasa), y substratos
(desoxirribonucleósidos trifosfatos, ribonucleósidos trifosfatos)
con sales apropiadas y tampones en solución para producir múltiples
transcriptos de ARN a partir de un molde de ácido nucleico.
Con referencia a la figura 1, durante la
amplificación mediada por la transcripción, el ácido nucleico diana
capturado se hibrida a un primer cebador mostrado como un
cebador-promotor T7. Empleando transcriptasa
inversa, el ADNc se sintetiza a partir del
cebador-promotor T7 empleando el ARN diana como un
molde. El segundo cebador mostrado como un cebador no T7, hibrida a
la cadena de ADNc y se extiende por la acción de la transcriptasa
inversa para formar un dúplex de ADN, formando con ello una región
promotora T7 de doble cadena. La ARN polimerasa de T7 genera
entonces múltiples transcriptos de ARN empleando este promotor
funcional T7. El mecanismo autocatalítico de TMA emplea pasos
repetitivos de hibridación y polimerización que siguen al paso de
síntesis del ADNc para producir transcriptos adicionales de ARN,
amplificando con ello secuencias de ácido nucleico específicas de la
región diana.
El paso de detección emplea por lo menos una
sonda de detección que une específicamente a los transcriptos o
amplicones del ARN amplificado descritos más arriba. De preferencia,
la sonda de detección se marca con una marca detectable que puede
ser detectada empleando un sistema homogéneo de detección. Con más
preferencia, la sonda marcada se marca con un compuesto de éster de
acridinio a partir del cual se produce y se detecta una señal
quimioluminiscente, como se ha descrito más arriba.
La invención se refiere a kits para efectuar
reacciones de amplificación de polinucleótidos empleando moldes de
ácido nucleico del HIV-2. De preferencia los kits de
acuerdo con la presente invención contienen un par de cebadores
oligo-nucleótidos que pueden emplearse para la
amplificación de los ácidos nucleicos del HIV-2 en
una reacción de amplificación in vitro. Los kits típicos
incluyen: (1) un primer oligonucleótido de amplificación que
contiene SEC ID NO:10 y opcionalmente contiene una secuencia de
promotor 5' no complementaria al ácido nucleico de
HIV-2, y (2) un segundo oligonucleótido de
amplificación que incluye una secuencia de 19-40
bases contiguas de la secuencia SEQ ID NO:1, y que tiene una
longitud de hasta 100 nucleótidos. Por supuesto, pueden también
incluirse en el formato del kit oligo-nucleótidos de
amplificación más cortos los cuales se describen en la presente.
Los kits pueden contener además una sonda de detección de
oligonucleótidos que incluye la secuencia SEQ ID NO:21 ó el
complemento de la misma. Esta sonda puede ser de hasta 35
nucleótidos de longitud o más cortos como se ha descrito en la
presente. Todavía además, los kits pueden contener oligonucleótidos
de captura para la purificación de los ácidos nucleicos del molde
del HIV-2 separándolos de otras especies, antes de
la amplificación. Los oligonucleótidos de captura típicos tienen las
secuencias de SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:32.
Un formato de ensayo conveniente para la
detección de múltiples analitos polinucleótidos implica la ejecución
de reacciones simultáneas de amplificación empleando diferentes
juegos de cebadores, en donde los amplicones sintetizados en la
reacción se detectan por hibridación. En este aspecto, la firma
Gen-Probe Incorporated (San Diego, CA) ha
desarrollado un ensayo HIV-1/HCV que detecta los
ácidos nucleicos del HIV-1 y/o del HCV (virus de la
hepatitis C) en un formato multiplex de un único tubo empleando tres
pasos clave. En un procedimiento de preparación de la muestra
inicial, se trata el plasma con detergente para liberar el ARN
genómico vírico, los oligonucleótidos específicos de la diana se
hibridan a la diana y son capturados en micropartículas magnéticas,
las cuales se separan del plasma en un campo magnético. A
continuación, se emplea un sistema de amplificación de
polinucleótidos basado en la transcripción, para amplificar el
HIV-1 y/o el ARN diana del HCV en una reacción
única. Finalmente, la detección se efectúa empleando la hibridación
del ácido nucleico con sondas quimioluminiscentes que son
complementarias a los amplicones de HIV-1 ó HCV. Si
el ensayo da un resultado positivo, se efectúan ensayos
discriminatorios para diferenciar entre los dos virus.
Cuando el número de diferentes juegos de
cebadores en una reacción de amplificación multiplex aumenta, siendo
cada juego de cebadores específico para un diferente analito
polinucleótido, existe una mayor probabilidad de que se produzca
una interacción no deseada entre los mismos cebadores y entre los
cebadores y los inoportunos amplicones. Las secuencias de los
cebadores descritos ventajosamente en la presente pueden emplearse
como reactivos en una única reacción de amplificación de
polinucleótidos la cual es también capaz de amplificar las
secuencias específicas del virus, del HIV-1, del
virus de la hepatitis B (HBV) y del virus de la hepatitis C
(HCV).
Los principios generales de la presente
invención pueden apreciarse más completamente haciendo referencia a
los siguientes ejemplos no limitantes. El primer ejemplo describe
procedimientos útiles para la identificación de cebadores de
amplificación.
Combinaciones de cebadores preferidas, para las
secuencias de polinucleótidos de repeticiones terminales largas
(LTR) del HIV-2, fueron identificadas en una serie
de procedimientos que emplearon diferentes números de moléculas de
moldes de ácido nucleico. Como se describe más adelante, se efectuó
un ensayo inicial empleando un molde sintético de
HIV-2 a un nivel de 5.000 copias/reacción.
Subsiguientes ensayos efectuados empleando ó bien 100 ó bien 500
copias/reacción, proporcionaron información acerca de la
sensibilidad del ensayo. El análisis de los resultados de repetidas
pruebas proporcionaron valores medios de la producción de amplicones
así como también información acerca de la reproducibilidad del
procedimiento. Cebadores-promotores T7 y cebadores
no T7 se exploraron en combinación, empleando el procedimiento de
fase en solución descrito más adelante. Aunque los procedimientos
descritos más adelante se efectuaron particularmente empleando un
protocolo de amplificación mediada por transcripción (TMA), los
cebadores descritos en la presente pueden emplearse para producir
amplicones mediante métodos alternativos que serán familiares a los
expertos con un nivel normal de experiencia en la técnica.
El ejemplo 1 describe los métodos empleados para
la identificación de cebadores que amplificaron las secuencias de
polinucleótidos del HIV-2.
Se preparó el ARN transcrito in vitro que
incluía las secuencias de bases 1-644 de la región
LTR del subtipo HIV2FG del HIV-2 (GenBank número de
inscripción J03654), empleando un clon de plásmido linealizado como
molde, de acuerdo con procedimientos estándar de laboratorio. Los
transcriptos in vitro resultantes se emplearon a
continuación como un molde en las reacciones de amplificación que
emplearon juegos emparejados de cebadores en reacciones TMA
esencialmente como describe Kacian et al., en la patente U.S.
nº 5.399.491. Cada cebador promotor incluía o bien una secuencia de
promotor T7, AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA (SEQ ID NO:28) ó
GATAA
TACGACT CACTATAGGGAGACCACA (SEQ ID NO:29) en el extremo 5', y una secuencia complementaria diana en el extremo 3'. Las reacciones de amplificación fueron inicialmente efectuadas por algunas de las combinaciones de cebadores empleando 5.000 copias del molde de ARN sintético y 15 pmoles de cada cebador en 100 \mul de tampón de reacción estándar. El ácido nucleico y los cebadores se calentaron a 60ºC durante 10 minutos y a continuación se enfriaron a 42ºC para facilitar la reasociación del cebador. La transcriptasa inversa del virus de la leucemia del ratón Moloney (MMLV) (2000 unidades) y la ARN polimerasa de T7 (2000 unidades) se añadieron a continuación a las mezclas. Las reacciones de amplificación finales contenían 50 mM de Tris HCl (pH 8,5), 35 mM de KCl, 4 mM de GTP, 4 mM de ATP, 4 mM de UTP, 4 mM de CTP, 1 mM de dATP, 1 mM de dTTP, 1 mM de dCTP, 1 mM de dGTP, 20 mM de MgCl_{2}, 20 mM de N-acetil-L-cisteína, y 5% (p/v) de glicerina. Después de una hora de incubación a 42ºC, toda la reacción de amplificación de 100 \mul fue ensayada por hibridación esencialmente como describe Arnold et al., en la patente U.S. nº 5.639.604, la descripción de la cual se incluye a la presente como referencia, empleando una sonda marcada con éster de acridinio en un ensayo homogéneo de protección. Una sonda que tiene la secuencia de SEQ ID NO:27 se marcó con AE hasta una actividad específica de 1,94 x 10^{8} RLU/pmoles y a continuación se empleó en una cantidad equivalente a 1,9 x 10^{7} RLU para cada reacción de hibridación para detectar los amplicones del HIV-2. La hibridación de la sonda se efectuó en 200 \mul de una solución que contenía 0,05M de succinato de litio (pH 5), 0,6 M de LiCl, 1% (p/v) de laurilsulfato de litio, 10 mM de EDTA, 10 mM de EGTA, a 60ºC durante 15 minutos, seguido por la adición de 300 \mul de tetraborato de sodio 0,15M (pH 8,5), 1% de TRITON® X-100 (Union Carbide Corporation; Danbury, CT). Esta mezcla se incubó en primer lugar a 60ºC durante 10 minutos para inactivar la sonda no hibridada y a continuación se enfrió a temperatura ambiente. Se determinó la quimioluminiscencia restante en cada muestra empleando un luminómetro Gen-Probe LEADER® I configurado para inyección automática de 1 mM de ácido nítrico y 0,1% (v/v) de peróxido de hidrógeno seguido por la inyección de una solución conteniendo hidróxido de sodio 1N. Los resultados medidos de la reacción de quimioluminiscencia se expresaron en unidades de luz relativas (RLU).
TACGACT CACTATAGGGAGACCACA (SEQ ID NO:29) en el extremo 5', y una secuencia complementaria diana en el extremo 3'. Las reacciones de amplificación fueron inicialmente efectuadas por algunas de las combinaciones de cebadores empleando 5.000 copias del molde de ARN sintético y 15 pmoles de cada cebador en 100 \mul de tampón de reacción estándar. El ácido nucleico y los cebadores se calentaron a 60ºC durante 10 minutos y a continuación se enfriaron a 42ºC para facilitar la reasociación del cebador. La transcriptasa inversa del virus de la leucemia del ratón Moloney (MMLV) (2000 unidades) y la ARN polimerasa de T7 (2000 unidades) se añadieron a continuación a las mezclas. Las reacciones de amplificación finales contenían 50 mM de Tris HCl (pH 8,5), 35 mM de KCl, 4 mM de GTP, 4 mM de ATP, 4 mM de UTP, 4 mM de CTP, 1 mM de dATP, 1 mM de dTTP, 1 mM de dCTP, 1 mM de dGTP, 20 mM de MgCl_{2}, 20 mM de N-acetil-L-cisteína, y 5% (p/v) de glicerina. Después de una hora de incubación a 42ºC, toda la reacción de amplificación de 100 \mul fue ensayada por hibridación esencialmente como describe Arnold et al., en la patente U.S. nº 5.639.604, la descripción de la cual se incluye a la presente como referencia, empleando una sonda marcada con éster de acridinio en un ensayo homogéneo de protección. Una sonda que tiene la secuencia de SEQ ID NO:27 se marcó con AE hasta una actividad específica de 1,94 x 10^{8} RLU/pmoles y a continuación se empleó en una cantidad equivalente a 1,9 x 10^{7} RLU para cada reacción de hibridación para detectar los amplicones del HIV-2. La hibridación de la sonda se efectuó en 200 \mul de una solución que contenía 0,05M de succinato de litio (pH 5), 0,6 M de LiCl, 1% (p/v) de laurilsulfato de litio, 10 mM de EDTA, 10 mM de EGTA, a 60ºC durante 15 minutos, seguido por la adición de 300 \mul de tetraborato de sodio 0,15M (pH 8,5), 1% de TRITON® X-100 (Union Carbide Corporation; Danbury, CT). Esta mezcla se incubó en primer lugar a 60ºC durante 10 minutos para inactivar la sonda no hibridada y a continuación se enfrió a temperatura ambiente. Se determinó la quimioluminiscencia restante en cada muestra empleando un luminómetro Gen-Probe LEADER® I configurado para inyección automática de 1 mM de ácido nítrico y 0,1% (v/v) de peróxido de hidrógeno seguido por la inyección de una solución conteniendo hidróxido de sodio 1N. Los resultados medidos de la reacción de quimioluminiscencia se expresaron en unidades de luz relativas (RLU).
La tabla 4 presenta los resultados de los
procedimientos de amplificación que se obtuvieron empleando 5.000
copias del polinucleótido molde. Notablemente, el
cebador-promotor que tenía la secuencia de SEQ ID
NO:17 amplificó eficientemente las secuencias de polinucleótidos
del HIV-1 (datos no mostrados) y se incluyó en el
presente procedimiento para determinar si los ácidos nucleicos de
HIV y HIV-2 podían ser
co-amplificados empleando un cebador común. La
secuencia de este cebador expandió una región de la secuencia en
donde el HIV-1 y el HIV-2 difieren
en una inserción/supresión. Así pues, comparada con la secuencia de
SEQ ID NO:9 (de la cual se derivan las secuencias del
cebador-promotor de la presente invención), la parte
complementaria a la diana del HIV-2 del
cebador-promotor tiene un mal apareamiento en la
posición 28 de los nucleótidos y una supresión de dos nucleótidos
correspondientes al par de nucleótidos AC en las posiciones
19-20 de la secuencia SEQ ID NO:9. Los resultados
mostrados en la tabla se derivan de replicados de 4 pruebas (para el
cebador-promotor que tiene la secuencia SEQ ID
NO:16) ó 5 pruebas para los cebadores promotores que tienen las
secuencias SEQ ID NO:15 y 17) del procedimiento de amplificación y
detección. Algunas de las entradas de control negativo ("Neg.
control") mostradas en la tabla fueron obtenidos a partir de
ensayos efectuados en tiempos diferentes. Todos los valores de
controles negativos se obtuvieron de pruebas efectuadas en ausencia
de cualquier molde de HIV-2. A la vista de la
naturaleza altamente reproducible del ensayo, asumimos
razonablemente que la magnitud de las reacciones del control
negativo serían también comparables a través de diferentes
experimentos. Los datos que no están disponibles se representan en
la tabla por "NA".
Los resultados presentados en la tabla 4
muestran que cada una de las combinaciones de cebadores ensayada a
niveles del molde de 5.000 copias/reacción dió resultados positivos.
Aunque todos los cebadores-promotores del
procedimiento dieron fácilmente señales detectables de
amplificación, el cebador-promotor identificado
como SEQ ID NO:5 dio ventajosamente buenos resultados cuando se
empleó en combinación con cada uno de los cebadores no T7 que se
ensayaron. Notablemente, las reacciones de amplificación que
incluían el cebador-promotor que tenían la
secuencia SEQ ID NO:15 uniformemente, se asociaron con bajos valores
de %CV, indicando con ello un alto grado de reproducibilidad y una
particular energía de las reacciones de amplificación que incluían
este cebador. De forma interesante, los resultados mostrados en la
tabla indican que incluso el cebador-promotor que
tiene la secuencia SEQ ID NO:17, el cual amplifica las secuencias de
una manera altamente eficiente, amplifica también las secuencias
del HIV-2 en este procedimiento.
En base a los resultados presentados en la tabla
4, se efectuaron ensayos adicionales empleando
cebadores-promotores adicionales y más bajos
niveles de molde de entrada para demostrar la flexibilidad con
respecto al diseño de cebadores-promotores útiles y
sensibilidad del ensayo. Más particularmente, los procedimientos de
ampliación y detección descritos más arriba se repitieron empleando
los cebadores-promotores que tienen las secuencias
SEQ ID NO:15 y 17 en combinación con cebadores no T7 e incluso 100 ó
500 copias del molde HIV-2 en cada reacción. A
continuación, se seleccionó uno de los cebadores no T7 para el
ensayo en combinación con una colección de
cebadores-promotores T7 que tenían secuencias de
promotor T7 y secuencias diana complementarias diferentes de las
que están presentes en uno cualquiera de los
cebadores-promotores que tienen secuencias
identificadas mediante las SEQ ID NO: 15-17. Los
resultados de estos procedimientos están presentados en las tablas
5-8.
Los resultados presentados en las Tablas 5 y 6
confirmaron que el cebador-promotor identificado por
SEQ ID NO:15 amplificó eficientemente las secuencias de
polinucleótidos del HIV-2, con cada uno de los
cebadores no T7 indicados, incluso a niveles del molde de entrada
de solamente 100 copias/reacción. El
cebador-promotor que tiene la secuencia SEQ ID
NO:17 fue también útil como un componente en la reacción de
amplificación, aunque a un nivel algo reducido comparado con el
cebador-promotor que tiene la secuencia de SEQ ID
NO:15. Pensado claramente, estos dos cebadores definen una reacción
de la región LTR que fue útil como diana para la unión del cebador
en el ensayo de amplificación de los ácidos nucleicos del
HIV-2.
Se sintetizaron tres cebadores no T7
adicionales, y se ensayaron en combinación con el
cebador-promotor de SEQ ID NO:15 en el ensayo de
amplificación del HIV-2. Estos cebadores adicionales
tienen la secuencia dada por SEQ ID NO: 4-6, en
donde las posiciones 1-4 de cada oligonucleótido fue
ocupada por restos 2' metoxi. La tabla 7 presenta los resultados
obtenidos cuando estos juegos de cebadores fueron ensayados con el
protocolo de amplificación descrito más arriba empleando 100 copias
del ARN del molde sintético del HIV-2 en cada
reacción y los productos de la amplificación fueron detectados
esencialmente como se ha descrito más arriba.
Los resultados presentado en la tabla 7
mostraron que las tres combinaciones de cebadores dieron
excepcionalmente buenos resultados en el procedimiento de
amplificación. Notablemente, la combinación del cebador que tiene
la secuencia SEQ ID NO:6 y el cebador-promotor que
tiene la secuencia SEQ ID NO:15 amplificó eficientemente la
secuencia del molde de HIV-2 y ventajosamente dio
una lectura muy baja para la reacción de control negativo. La
combinación del cebador que tiene la secuencia SEQ ID NO:6 y el
cebador-promotor que tiene la secuencia SEQ ID
NO:15 es una combinación altamente preferida para la amplificación
de las secuencias de polinucleótidos del HIV-2.
Finalmente, el cebador que tiene la secuencia
SEQ ID NO:6 se ensayó en combinación con los
cebadores-promotores identificados por SEQ ID NO:18
y 19, en reacciones de amplificación que se efectuaron empleando o
bien 500 ó bien 100 copias/reacción del molde del
HIV-2. Significativamente, tanto la secuencia
complementaria diana como la secuencia del promotor T7 en los dos
cebadores fueron diferentes de la secuencia del promotor T7 empleado
en los cebadores, promotores de SEQ ID NO:15-17.
También es significativo el hecho de que el
cebador-promotor identificado por SEQ ID NO:18
contiene una única supresión de bases que corresponde al resto A de
la posición 19 de la secuencia dada por SEQ ID NO:9. Los valores
numéricos presentados en la tabla 8 son respectivamente los
resultados de las pruebas repetidas 5 y 4 efectuadas empleando 500 y
100 copias/reacción ó la diana HIV-2.
Los resultados presentados en la tabla 8
demostraron que ambos cebadores-promotores T7
identificados por SEQ ID NO:18-19, dieron buenos
resultados en el ensayo de amplificación, con señales positivas
oscilando de 500-1.000 veces por encima de las
señales medidas en las reacciones de control negativo efectuadas
empleando 500 copias/reacción del HIV-2 diana.
Remarcablemente, las señales de hibridación de la sonda medida en
las reacciones del control negativo que incluían estos
cebadores-promotores fueron ventajosamente muy
bajas. Los resultados demostraron además que podían emplearse
secuencias diferentes del promotor T7, en el procedimiento de
amplificación, obteniendo buenos resultados.
Los resultados adicionales presentados en las
tablas 3-7 mostraron que la región diana de LTR
unida mediante cada uno de los cebadores no T7 descritos más
arriba, definían un dominio que podía ser empleado para diseñar
cebadores adicionales para emplear en combinación con
cebadores-promotores T7 para la amplificación las
secuencias de HIV-2. Este dominio abarcaba la
secuencia de 40 nucleótidos de longitud dada por
GTGTGTGTTCCCATCTCTCC
TAGTCGCCGCCTGGTCATTC (SEQ ID NO:1). El oligonucleótido que tiene las secuencias substancialmente correspondientes a esta secuencia, o un subconjunto de la misma, pueden emplearse como cebadores en las reacciones de amplificación descritas en la presente. Adicionalmente, los resultados de las tablas 4-8 mostraron que la región diana de LTR unida mediante cada uno de los cebadores promotores T7 más arriba descritos, definía un dominio que podía emplearse en combinación con cebadores no T7 para amplificar secuencias de HIV-2. Este dominio abarcaba la secuencia de 34 nucleótidos de longitud AAAATCCCTAG CAGGTTGGCGCCCGAACAGGGAC (/SEQ ID NO:8). Los oligonucleótidos complementarios a esta secuencia o a una secuencia substancialmente complementaria a esta secuencia, pueden ser empleados como cebadores en las reacciones de amplificación descritas en la presente.
TAGTCGCCGCCTGGTCATTC (SEQ ID NO:1). El oligonucleótido que tiene las secuencias substancialmente correspondientes a esta secuencia, o un subconjunto de la misma, pueden emplearse como cebadores en las reacciones de amplificación descritas en la presente. Adicionalmente, los resultados de las tablas 4-8 mostraron que la región diana de LTR unida mediante cada uno de los cebadores promotores T7 más arriba descritos, definía un dominio que podía emplearse en combinación con cebadores no T7 para amplificar secuencias de HIV-2. Este dominio abarcaba la secuencia de 34 nucleótidos de longitud AAAATCCCTAG CAGGTTGGCGCCCGAACAGGGAC (/SEQ ID NO:8). Los oligonucleótidos complementarios a esta secuencia o a una secuencia substancialmente complementaria a esta secuencia, pueden ser empleados como cebadores en las reacciones de amplificación descritas en la presente.
El ejemplo 2 describe los métodos empleados para
identificar las sondas que fueron útiles para la detección de los
amplicones del HIV-2. En este procedimiento una
única diana sintética de oligonucleótidos complementaria a una
serie de diferentes secuencias de sondas, sirve como diana en un
ensayo de unión a la sonda.
Un oligonucleótido de HIV-2
antisentido sintético, que tiene la secuencia
GAAGGGUCCUAACAGACCAGG
GUCUUGUUA (SEQ ID NO:30) se preparó empleando nucleótidos 2' metoxilo, de acuerdo con procedimientos estándar de laboratorio. Este oligonucleótido sirvió de modelo de ARN diana. Seis diferentes oligonucleótidos que fueron preparados empleando 2' metoxi nucleótidos y ensayados como sondas tenían las secuencias dadas en la
Tabla 3.
GUCUUGUUA (SEQ ID NO:30) se preparó empleando nucleótidos 2' metoxilo, de acuerdo con procedimientos estándar de laboratorio. Este oligonucleótido sirvió de modelo de ARN diana. Seis diferentes oligonucleótidos que fueron preparados empleando 2' metoxi nucleótidos y ensayados como sondas tenían las secuencias dadas en la
Tabla 3.
Las reacciones de hibridación constan de
volúmenes de 100 \mul de tampón de protección de la sonda que
contiene cantidades de sonda marcada con AE correspondientes a 1 x
10^{6} RLU y 100 \mul que contienen 2 pmoles del ARN diana del
HIV-2 sintético. La solución tampón incluía 75 mM de
ácido succínico, 129 mM de laurilsulfato de sodio, 75 mM de
hidróxido de litio, 15 mM de aldritiol-2, 1,0 M de
cloruro de litio. 1 mM de EDTA 3% v/v de alcohol etílico, y se
ajustó el pH a 4,2. Las mezclas se hibridaron durante 15 minutos a
60ºC y a continuación se seleccionaron con 250 \mul de solución
reactivo de selección que incluía 600 mM de ácido bórico, 235 mM de
NaOH y 1% vol/vol de TRITON X-100 (estando ajustado
el pH de la solución a pH 9), durante 10 minutos y a continuación
enfriado a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las reacciones
de hibridación de control negativo obviaron el oligonucleótido
diana de HIV-2 antisentido. La quimioluminiscencia
que reflejaba la cantidad de marca AE asociada con la sonda
hibridada se determinó empleando el método descrito más arriba. Los
resultados de este procedimiento están presentados en la Tabla
9.
Como indican los resultados presentados por la
Tabla 9, cada una de las sondas ensayadas en el procedimiento dio
bajos niveles de hibridación de fondo y por lo menos niveles
moderados de reacción positiva con la secuencia diana de
HIV-2. Más particularmente, los valores de control
negativo fueron todos inferiores al 0,25%, mientras que las
reacciones efectuadas en presencia de la secuencia diana de
HIV-2 fueron todas mayores del 15% del nivel de
entrada de la sonda. Teniendo en cuenta juntamente con lo mostrado
en el ejemplo 1 de que la sonda que tiene la secuencia SEQ ID NO:27
es útil para la detección de los amplicones del
HIV-2, los resultados de la Tabla 9 mostraron que
todas las secuencias presentadas en la Tabla 3 eran útiles como
sondas de detección.
El éxito conseguido por el procedimiento
anterior definió un dominio de secuencias de HIV-2
que podía ser empleado para el diseño de sondas de detección
adicionales. Más particularmente, este dominio extendía un tramo de
22 nucleótidos de largo, que tenía la secuencia
CCTGGTCTGTTAGGACCCTTCT (SEQ ID NO:20). Los oligonucleótidos que
tienen secuencias que substancialmente corresponden a esta
secuencia, un subgrupo de las mismos o el complemento de los
mismos, pueden emplearse como sondas para la detección de ácidos
nucleicos del HIV-2. Por supuesto, las sondas
útiles pueden ser más largas que la longitud de este dominio, y la
parte complementaria del HIV-2 de sondas útiles
puede ser incorporada en las sondas, como por ejemplo, faros
moleculares, que tienen particulares estructuras secundarias. Dado
que la secuencia SEQ ID NO:20 deriva de una parte del genoma del
HIV-2 que está ausente del genoma del
HIV-1, estas sondas son específicas para el
HIV-2 y no para el HIV-1.
De manera notable, las sondas que tienen las
secuencias SEQ ID NO:26 y 25 dieron inusualmente buenos resultados
en este procedimiento. Las secuencias de oligonucleótidos de estas
sondas son altamente preferidas para emplear en el paso de
detección del ensayo descrito más arriba. Por supuesto, la posición
de cualquier marca detectable puede variar de manera que caiga
todavía dentro del ámbito de la invención. Por ejemplo, es altamente
preferido emplear una sonda que tiene la secuencia SEQ ID NO:26 con
una marca AE unida entre las posiciones 9 y 10 para la detección
del amplicón de HIV-2 empleando los procedimientos
descritos más arriba.
Los métodos para la determinación de si los
oligo-nucleótidos candidatos pueden emplearse para
la captura de los ácidos nucleicos del HIV-2 de la
solución, fueron efectuados empleando el ARN del
HIV-2 transcrito in vitro descrito más
arriba, como diana modelo. Cada uno de los dos diferentes
oligonucleótidos candidatos de captura, incluían una secuencia
específica del HIV-2 unida a un tramo oligo-(dA).
Cuando se combinó con el ARN diana del HIV-2 y las
partículas magnéticas modificadas para exhibir el oligo-(dT), un
oligonucleótido funcional de captura puenteó la diana del
HIV-2 y la partícula, e inmovilizó el
HIV-2 diana. Eliminando los complejos de las
partículas de la solución, se representó efectivamente un medio para
el enriquecimiento del molde del HIV-2. En el
procedimiento descrito en el ejemplo siguiente, dos oligonucleótidos
de captura fueron conectados por separado con el ARN de
HIV-2 y las partículas magnéticas modificadas con el
oligo-(dT). Después de recoger y lavar las partículas, se
detectaron las secuencias de HIV-2 unidas en ensayos
homogéneos de protección. En cada caso, el oligonucleótido de
captura inmovilizó el ARN diana del HIV-2 sobre la
partícula magnética.
El ejemplo siguiente describe métodos que fueron
empleados para la identificación de oligonucleótidos de captura del
HIV-2.
Se dispersaron 5 x 10^{11} copias de un ARN
diana de LTR de HIV-2 transcrito in vitro
(descrito más arriba), en 400 \mul de tampón de lisis/captura que
contenía o bien 0,15 pmoles, o bien 3,5 pmoles ó bien 5 pmoles de
oligonucleótidos de captura que tenían las secuencias SEQ ID NO:31 y
32, y aproximadamente 100 \mug de poli-(dT_{14}) inmovilizado
unido a partículas paramagnéticas (partículas de
0,75-1,05 \mu, Seradyn, Indianápolis, IN). El
tampón de lisis/captura incluía 790 mM de HEPES, 230 mM de ácido
succínico, 10% (p/v) de lauril sulfato de litio, 680 mM de
hidróxido de litio monohidrato. El oligonucleótido de captura que
tiene la secuencia SEQ ID NO:31 tenía las posiciones
1-20 ocupadas por análogos del
2'-metoxi nucleótido y las posiciones
21-53 ocupadas por desoxirribonucleótidos. El
oligonucleótido de captura que tiene la secuencia SEQ ID NO:32
tenía las posiciones 1-18 ocupadas por análogos del
2'-metoxi nucleótido y las posiciones
19-51 ocupadas por desoxirribonucleótidos. Un
espaciador representado por la secuencia
5'-TTT-3' estaba interpuesto entre
la secuencia complementaria del HIV-2 y la región
de cola poli(A) para cada uno de los oligonucleótidos de
captura. El poli-(dT_{14}) se unió a las partículas
paramagnéticas empleando la química de la carbodiimida como está
descrito por Lund et al., en Nuc. Acids Res.
16: 10861-10880 (1988). Las mezclas se
calentaron a 55-60ºC durante aproximadamente 15 a
30 minutos y a continuación se enfriaron a temperatura ambiente para
permitir la hibridación. Se aplicó un campo magnético para recoger
los complejos en partículas que contenían el oligonucleótido de
captura inmovilizado y el ARN del HIV-2, empleando
procedimientos tales como los descritos por Wang en la patente U.S.
nº 4.895.650. Las partículas se lavaron dos veces con 1 ml de un
tampón de lavado (10 mM de HEPES, 6,5 mM de NaOH, 1 mM de EDTA,
0,3% (v/v) de etanol, 0,02% (p/v) de metil-paraben,
0,01% (p/v) de propil-paraben, 150 mM de NaCl, 0,1%
(p/v) de lauril sulfato de sodio) por resuspensión y repetición del
paso de separación magnética. Las partículas lavadas se
suspendieron en 100 \mul de tampón de hibridación, y la mezcla se
sometió al procedimiento de hibridación de la sonda y detección,
descrito en el ejemplo anterior, excepto que se empleó una sonda
con la secuencia SEQ ID NO:33 en lugar de una sonda con la secuencia
SEQ ID NO:27. Para cada condición de ensayo, un control de captura
simulado indicó el valor máximo de quimioluminiscencia que podía
lograrse en el ensayo. La Tabla 10 presenta las mediciones de
quimioluminiscencia para los dos replicados de dos ensayos para cada
nivel de oligonucleótido de captura.
Los resultados presentados en la Tabla 10
confirmaron que los dos oligonucleótidos ensayados en el
procedimiento podían emplearse para la captura del ARN del
HIV-2 de la solución.
El ejemplo 4 describe procedimientos que pueden
seguirse para detectar los ácidos nucleicos del
HIV-2 en una muestra biológica. Aunque este ejemplo
describe una muestra de control que contiene una cantidad conocida
de ácidos nucleicos de HIV-2, debe entenderse que
podría ser substituida por una muestra de plasma obtenida a partir
de una muestra de sangre de un donante humano. Un resultado positivo
de la hibridación en el último caso, indicaría la presencia de los
ácidos nucleicos del HIV-2 en la muestra del
donante.
Una primera muestra de plasma humano que
contenía una cantidad conocida de HIV-2 (100 copias
de HIV-2 por tubo de reacción), se mezcla con un
volumen igual de un tampón de lisis/captura, como se describe en el
ejemplo 3. Para capturar el ARN diana del HIV-2, la
mezcla contiene también aproximadamente 3,5 pmoles de
oligonucleótido de captura que tiene la secuencia de SEQ ID NO:31 y
aproximadamente 100 \mug de sonda poli-dT_{14}
inmovilizada, unida a partículas para-magnéticas
(partículas de 0,7-1,05 \mu, Seradyn,
Indianápolis, IN). La mezcla se calienta a 55-60ºC
durante aproximadamente 15 a 30 minutos y a continuación se enfría a
temperatura ambiente para permitir la hibridación. A continuación
se aplica un campo magnético para separar los complejos de las
partículas. Las partículas se lavan dos veces con 1 ml de un tampón
de lavado y a continuación se resuspenden en 75 \mul de una
solución reactiva de amplificación de ácido nucleico para la
amplificación asociada a la transcripción, empleando métodos
substancialmente como describe Kacian et al., en las patentes
U.S. nº 5.399.491 y 5.554.516.
En breves palabras, las partículas lavadas con
los complejos unidos, se mezclan con 15 pmoles cada uno de los
oligonucleótidos de amplificación que tienen las secuencias SEQ ID
NO:15 y 6 en una mezcla de reacción (40 mM de Tris base (pH 7,5);
17,5 mM de KCl, 20 mM de MgCl_{2}, 5% de polivinilpirrolidona
(PVP), 1 mM de cada dNTP, 4 mM de cada rNTP), se cubren con una
capa de aceite inerte para impedir la evaporación, se incuba a 60ºC
durante 10 minutos, y a continuación, a 41,5-42ºC
durante 10 minutos. Se añaden enzimas (aproximadamente 3.000
unidades de MMLV transcriptasa inversa y aproximadamente 3.000
unidades de 7T ARN polimerasa por reacción), se mezcla, y el ácido
nucleico del HIV-2 diana se amplifica a
41,5-42ºC durante 1 hora.
Las secuencias diana del HIV-2
amplificadas, se hibridan con una sonda marcada con AE que tiene la
secuencia SEQ ID NO:26 y a continuación se detecta por
quimioluminiscencia, y los resultados se expresan en unidades
relativas de luz (RLU), substancialmente como se ha descrito
anteriormente. Para cada condición de ensayo, los controles
negativos tienen un volumen igual de plasma que no contiene ningún
ácido nucleico de HIV-2, substituido por las
muestras que contienen el HIV-2. A continuación, se
comparan las lecturas detectadas de RLU de estos
ensayos.
ensayos.
Los resultados de estos procedimientos muestran
que las secuencias de ácido nucleico del HIV-2
pueden ser fácilmente detectadas en una muestra biológica empleando
los métodos de la presente invención. Más particularmente, las
muestras de control negativo dan resultados de hibridación de la
sonda que corresponden a las señales de fondo solamente. A la
inversa, las muestras que contienen ácidos nucleicos de
HIV-2 dan señales de hibridación que son varias
veces mayores que el fondo. Esto indica que las reacciones de
amplificación y detección son viables.
\newpage
Esta invención ha sido descrita con referencia a
un número específico de ejemplos y versiones de la misma. Por
supuesto, un número de diferentes versiones de la presente invención
serán sugeridas por los expertos en la técnica después de revisar
la anterior descripción detallada. Así pues, el verdadero ámbito de
la presente invención ha de determinarse después de la referencia a
las reivindicaciones del apéndice.
<110> Yang, Yeasing
\hskip1cm Burell, Terrie
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Composiciones y métodos para la
detección del virus de la inmunodeficiencia humana 2
(HIV-2)
\vskip0.400000\baselineskip
<130> GP117-03.UT
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/242.620
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-10-23
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/280.058
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-03-30
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows versión 3.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgtgtgttc ccatctctcc tagtcgccgc ctggtcattc
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtgtgtgttc ccatctctc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgtgttccca tctctcctag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttcccatct ctcctagtcg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcctagtcgc cgcctggtca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctagtcgcc gcctggtca
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptagtcgccgc ctggtcattc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaatcccta gcaggttggc gcccgaacag ggac
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccctgttc gggcgccaac ctgctaggga tttt
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggcgccaa cctgctaggg atttt
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtccctgttc gggcgcca
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El cebador se empareja mal con la
secuencia de HIV-2 por supresión de dos nucleótidos
y mutación en una tercera posición
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggcgccac tgctagagat ttt
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El cebador se empareja mal con la
secuencia de HIV-2 por supresión de un
nucleotido.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggcgccac ctgctaggga tttt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccctgttcgg gcgccaacct gctag
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador del promotor T7 que tiene
una secuencia de promotor con una adición en el extremo 5' de una
secuencia de cebador complementaria del HIV-2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatttaatac gactcactat agggagacgg gcgccaacct gctagggatt tt
\hfill52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador del promotor T7 que tiene
una secuencia de promotor con una adición en el extremo 5' de una
secuencia de cebador complementaria del HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatttaatac gactcactat agggagagtc cctgttcggg cgcca
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador del promotor T7 que tiene
una secuencia de promotor con una adición en el extremo 5' de una
secuencia dada, como SEQ ID NO:12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatttaatac gactcactat agggagacgg gcgccactgc tagagatttt
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador del promotor T7 que tiene
una secuencia de promotor con una adición en el extremo 5' de una
secuencia dada, como SEQ ID NO:13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaattaata cgactcacta tagggagacc acacgggcgc cacctgctag ggatttt
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador del promotor T7 que tiene
una secuencia de promotor con una adicción en el extremo 5' de una
secuencia de cebador complementaria del HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaattaata cgactcacta tagggagacc acaccctgtt cgggcgccaa cctgctag
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctggtctgt taggaccctt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctgttagg accc
\hfill14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctggtctgt taggaccc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggtctgtt aggaccct
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggtctgtta ggaccctt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtctgttag gacccttc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctgttagg accctt
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctgttagg acccttct
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaatttaatac gactcactat agggaga
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaattaata cgactcacta tagggagacc aca
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaggguccu aacagaccag ggucuuguua
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcctgccgc ccttactgcc tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcctgccgc ccttactgtt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagggtcct aacaga
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HIV-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgggcgcca
\hfill9
Claims (23)
1. Un kit para la detección de ácidos nucleicos
del HIV-2, el cual comprende
(a) un primer oligonucleótido de amplificación
que contiene la SEQ ID NO:10 y opcionalmente contiene una secuencia
de promotor 5' no complementaria al ácido nucleico del
HIV-2; y
(b) un segundo oligonucleótido de amplificación
que contiene una secuencia de 19-40 bases contiguas
de la secuencia SEQ ID NO:1, teniendo dicho segundo oligonucleótido
de amplificación una longitud de hasta 100 nucleótidos.
2. El kit de la reivindicación 1, el cual
comprende además:
(c) una sonda de detección de oligonucleótidos
que contiene la secuencia SEQ ID NO:21 ó el complemento de la
misma, y una marca detectable.
3. El kit de la reivindicación 1, en donde la
longitud del segundo oligonucleótido de amplificación es de
19-40 nucleótidos.
4. El kit de la reivindicación 3, en donde la
longitud del segundo oligonucleótido de amplificación es de
19-21 nucleótidos.
5. El kit de la reivindicación 3 ó 4, en donde
la longitud del primer oligonucleótido de amplificación es de hasta
60 nucleótidos.
6. El kit de la reivindicación 5, en donde el
primer oligonucleótido de amplificación incluye dicha secuencia
opcional de promotor 5'.
7. El kit de la reivindicación 6, en donde el
primer oligonucleótido de amplificación es el
cebador-promotor de SEQ ID NO:15.
8. El kit de la reivindicación 1, en donde el
primer oligonucleótido de amplificación consiste en la SEQ ID
NO:10, y en donde la longitud del segundo oligonucleótido de
amplificación es de 19-21 nucleótidos.
9. El kit de una cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 8, en donde el segundo oligonucleótido de
amplificación se selecciona del grupo formado por SEQ ID NO:2, SEQ
ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, y SEQ ID NO:7.
10. El kit de la reivindicación 2, en donde
dicha sonda de detección de oligonucleótidos tiene una longitud de
hasta 35 nucleótidos.
11. El kit de la reivindicación 10, en donde la
longitud de dicha sonda de detección de oligonucleótidos es de
hasta 22 nucleótidos.
12. El kit de la reivindicación 11, en donde
dicha sonda de detección de oligonucleótidos tiene una longitud de
hasta 18 nucleótidos.
13. El kit de la reivindicación 12, en donde la
secuencia de dicha sonda de detección de oligonucleótidos se
selecciona del grupo formado por SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID
NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, y SEQ ID NO:27.
14. El kit de la reivindicación 13, en donde la
secuencia del primer oligonucleótido de amplificación es la SEQ ID
NO:10 ó la SEQ ID NO:15, y en donde la secuencia del segundo
oligonucleótido de amplificación se selecciona del grupo formado
por SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6,
y SEQ ID NO:7.
15. El kit de la reivindicación 11 ó 12, en
donde dicha sonda de detección de oligonucleótidos consta por lo
menos de 16 nucleótidos contiguos contenidos dentro de la secuencia
SEQ ID NO:20 ó el complemento de la misma.
16. El kit de la reivindicación 11, en donde
dicha sonda de detección de oligonucleótidos tiene la secuencia SEQ
ID NO:20 ó el complemento de la misma.
17. El kit de la reivindicación 15, en donde la
longitud de dicha sonda de detección de oligonucleótidos es de 18
nucleótidos.
18. El kit de la reivindicación 15, en donde
dicha sonda de detección de oligonucleótidos tiene una secuencia
seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO:22 ó el complemento de
la misma, SEQ ID NO:23 ó el complemento de la misma, SEQ ID NO:24 ó
el complemento de la misma, SEQ ID NO:25 ó el complemento de la
misma, SEQ ID NO:26 ó el complemento de la misma, y SEQ ID NO:27 ó
el complemento de la misma.
19. El kit de la reivindicación 10, en donde
dicha sonda de detección de oligonucleótidos está formada por
ADN.
20. El kit de la reivindicación 10, en donde
dicha sonda de detección de oligonucleótidos comprende por lo menos
un nucleótido análogo.
21. El kit de la reivindicación 20, en donde por
lo menos dicho nucleótido análogo, comprende un grupo metoxi en la
posición 2' de un grupo ribosa.
22. El kit de la reivindicación 18, en donde la
marca detectable es una marca quimioluminiscente o una marca
radiactiva.
23. El kit de la reivindicación 22, en donde la
marca detectable es un éster de acridinio.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US24262000P | 2000-10-23 | 2000-10-23 | |
| US242620P | 2000-10-23 | ||
| US28005801P | 2001-03-30 | 2001-03-30 | |
| US280058P | 2001-03-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2300375T3 true ES2300375T3 (es) | 2008-06-16 |
Family
ID=26935205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01988788T Expired - Lifetime ES2300375T3 (es) | 2000-10-23 | 2001-10-22 | Composiciones y metodos para la deteccion del virus de la inmunodeficiencia humana 2 (hiv-2). |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6870045B2 (es) |
| EP (1) | EP1399585B1 (es) |
| JP (1) | JP4202750B2 (es) |
| AT (1) | ATE386821T1 (es) |
| AU (2) | AU3054502A (es) |
| CA (1) | CA2422956C (es) |
| DE (1) | DE60132924T2 (es) |
| ES (1) | ES2300375T3 (es) |
| WO (1) | WO2002034951A2 (es) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2860006B1 (fr) * | 2003-09-24 | 2006-12-22 | Commissariat Energie Atomique | Dispositif pour separer et/ou analyser plusieurs cibles moleculaires en solution dans un melange complexe |
| GB0701253D0 (en) | 2007-01-23 | 2007-02-28 | Diagnostics For The Real World | Nucleic acid amplification and testing |
| KR100924243B1 (ko) * | 2007-11-19 | 2009-10-29 | (주)바이오메트릭스 테크놀로지 | 상온 교잡반응이 가능한 유전자칩 및 칩 제조를 위한 탐침 유전자 디자인 신기술 |
| WO2009158119A2 (en) | 2008-05-30 | 2009-12-30 | Gen-Probe Incorporated | Compositions, kits and related methods for the detection and/or monitoring of salmonella |
| EP2172563A1 (en) * | 2008-09-24 | 2010-04-07 | bioMérieux S.A. | Method for lowering the dependency towards sequence variation of a nucleic acid target in a diagnostic hybridization assay |
| DK2459743T3 (da) | 2009-07-30 | 2017-11-06 | Hoffmann La Roche | Sæt af oligonukleotidprober såvel som fremgangsmåder og anvendelser relateret dertil |
| CA2772020A1 (en) | 2009-08-31 | 2011-03-03 | Mbio Diagnostics, Inc. | Integrated sample preparation and analyte detection |
| CA2793959C (en) | 2010-03-25 | 2019-06-04 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| DE102010003781B4 (de) * | 2010-04-08 | 2012-08-16 | Aj Innuscreen Gmbh | Verfahren zum Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen |
| RS57397B8 (sr) | 2011-06-10 | 2020-01-31 | Univ Oregon Health & Science | Cmv glikoproteini i rekombinantni vektori |
| AU2012216792A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-28 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| US9127317B2 (en) | 2012-03-02 | 2015-09-08 | Winthrop-University Hospital | Method for using probe based PCR detection to measure the levels of circulating demethylated β cell derived DNA as a measure of β cell loss in diabetes |
| ES2631608T3 (es) | 2012-06-27 | 2017-09-01 | International Aids Vaccine Initiative | Variante de la glicoproteína Env del VIH-1 |
| CN103966355A (zh) * | 2013-01-25 | 2014-08-06 | 上海星耀医学科技发展有限公司 | 人类免疫缺陷病毒1型一步法基因分型rt-pcr检测试剂盒 |
| EP2848937A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-18 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel HIV-1 immunogens |
| EP2873423B1 (en) | 2013-10-07 | 2017-05-31 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| EP3069730A3 (en) | 2015-03-20 | 2017-03-15 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| EP3072901A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-09-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| CN112359146A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-02-12 | 浙江大学 | 一种用于快速检测乙型肝炎病毒基因的试剂盒及其检测方法 |
Family Cites Families (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5008182A (en) | 1986-01-10 | 1991-04-16 | Cetus Corporation | Detection of AIDS associated virus by polymerase chain reaction |
| US5176995A (en) | 1985-03-28 | 1993-01-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of viruses by amplification and hybridization |
| US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
| US4868105A (en) | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
| EP0239425B1 (fr) | 1986-01-22 | 1989-11-02 | Institut Pasteur | Rétrovirus du type HIV-2 susceptible de provoquer le SIDA, et ses constituants antigéniques et nucléiques |
| US5310651A (en) | 1986-01-22 | 1994-05-10 | Institut Pasteur | DNA probes of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), and methods employing these probes for dectecting the presence of HIV-2 |
| US5066782A (en) | 1986-01-22 | 1991-11-19 | Institut Pasteur | Retrovirus capable of causing AIDS, means and method for detecting it in vitro |
| EP0276302B1 (en) | 1986-08-11 | 1993-04-28 | Siska Diagnostics,Inc. | Nucleic acid probe assay methods and compositions |
| US5541308A (en) | 1986-11-24 | 1996-07-30 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes for detection and/or quantitation of non-viral organisms |
| ATE417108T1 (de) | 1987-01-16 | 2008-12-15 | Pasteur Institut | Hiv-2 und siv-1 nukleotidsequenzen |
| IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| CA1340843C (en) | 1987-07-31 | 1999-12-07 | J. Lawrence Burg | Selective amplification of target polynucleotide sequences |
| US5639604A (en) | 1987-09-21 | 1997-06-17 | Gen-Probe Incorporated | Homogeneous protection assay |
| US5283174A (en) | 1987-09-21 | 1994-02-01 | Gen-Probe, Incorporated | Homogenous protection assay |
| US5124246A (en) | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
| CA1340747C (en) | 1988-06-14 | 1999-09-14 | Karsten Henco | Hiv-2 virus variants |
| US5130238A (en) | 1988-06-24 | 1992-07-14 | Cangene Corporation | Enhanced nucleic acid amplification process |
| JP3276955B2 (ja) | 1988-09-30 | 2002-04-22 | ジーン−トラック・システムス | Ｒｎａの鋳型の末端に結合したプローブ構造およびその使用方法 |
| US5223423A (en) | 1989-03-31 | 1993-06-29 | United States Of America | Characterization of replication competent human immunodeficiency type 2 proviral clone hiv-2sbl/isy |
| CA2585164C (fr) | 1989-06-02 | 2010-02-02 | Institut Pasteur | Sequences nucleotidiques issues du genome des retrovirus du type hiv-1, hiv-2 et siv, et leurs applications notamment pour l'amplification des genomes de ces retrovirus et pour lediagnostic in vitro des infections dues a ces virus |
| FR2647810B1 (fr) | 1989-06-02 | 1994-07-22 | Pasteur Institut | Amorces oligonucleotidiques pour l'amplification du genome des retrovirus du type hiv-2 et siv, et leurs applications au diagnostic in vitro des infections dues a ces virus |
| US5656207A (en) | 1989-06-24 | 1997-08-12 | Gen Probe Incorporated | Detecting or quantifying multiple analytes using labelling techniques |
| US5856088A (en) | 1989-07-11 | 1999-01-05 | Gen-Probe Incorporated | Detection of human immunodeficiency virus type 1 |
| CA2020958C (en) | 1989-07-11 | 2005-01-11 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification methods |
| US5455166A (en) | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
| DE69233285T2 (de) | 1991-08-02 | 2004-11-25 | bioMérieux B.V. | Quantifikation von Nukleinsäuren |
| US5846717A (en) | 1996-01-24 | 1998-12-08 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acid sequences by invader-directed cleavage |
| WO1993022461A1 (en) | 1992-05-06 | 1993-11-11 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit |
| US5827935A (en) | 1992-05-27 | 1998-10-27 | City Of Hope | Chimeric tRNAlys -ribozyme molecules |
| CA2141430C (en) | 1992-08-04 | 2009-05-12 | Sherrol H. Mcdonough | Nucleic acid sequence amplification |
| US5843654A (en) | 1992-12-07 | 1998-12-01 | Third Wave Technologies, Inc. | Rapid detection of mutations in the p53 gene |
| FR2699538B1 (fr) | 1992-12-22 | 1995-02-03 | Agronomique Inst Nat Rech | Sous-unité d'une capsule protéique CS31A modifiée par au moins un peptide hétérologue, capsule protéique CS31A et microorganismes portant ces sous-unités; procédés d'obtention et utilisation de ceux-ci. |
| US5470572A (en) * | 1993-07-16 | 1995-11-28 | University Of Puerto Rico | Non-infectious simian immunodeficiency virus particles produced by cell line CRL 11393 |
| AU689789B2 (en) | 1993-07-23 | 1998-04-09 | Gen-Probe Incorporated | Methods for enhancing nucleic acid amplification |
| US5998172A (en) | 1993-11-02 | 1999-12-07 | Duke University | Anti-CD6 ligand antibodies |
| CA2176496C (en) | 1993-11-29 | 1999-09-28 | Kathleen A. Clark | Method for extracting nucleic acids from a wide range of organisms |
| US5824473A (en) | 1993-12-10 | 1998-10-20 | California Institute Of Technology | Nucleic acid mediated electron transfer |
| US5591578A (en) | 1993-12-10 | 1997-01-07 | California Institute Of Technology | Nucleic acid mediated electron transfer |
| US5516653A (en) | 1993-12-28 | 1996-05-14 | Synaptic Pharmaceutical Corporation | DNA encoding a human neuropeptide Y/peptide YY/pancreatic polypeptide receptor (Y4) and uses thereof |
| JPH10500310A (ja) | 1994-05-19 | 1998-01-13 | ダコ アクティーゼルスカブ | 淋菌及びトラコーマ クラミジアの検出のためのｐｎａ プローブ |
| ATE340866T1 (de) * | 1994-10-28 | 2006-10-15 | Gen Probe Inc | Zusammensetzungen und verfahren für die gleichzeitige detektion und quantifizierung von einer mehrheit spezifischer nuklein säure sequenzen |
| US6060245A (en) * | 1996-12-13 | 2000-05-09 | Stratagene | Methods and adaptors for generating specific nucleic acid populations |
| DK0975807T3 (da) | 1997-05-02 | 2007-01-29 | Gen Probe Inc | To-trins hybridisering og indfangning af et polynukleotid |
| GB9711578D0 (en) | 1997-06-04 | 1997-07-30 | Oxford Biomedica Ltd | Novel retroviral vector production systems |
| US5962665A (en) | 1997-06-16 | 1999-10-05 | Abbott Laboratories | Nucleic acid primers and probes for detecting HIV-1 and HIV-2 |
| US6001558A (en) | 1997-06-25 | 1999-12-14 | Ortho Clinical Diagnostics, Inc. | Amplification and detection of HIV-1 and/or HIV 2 |
| AU762728B2 (en) | 1998-07-02 | 2003-07-03 | Gen-Probe Incorporated | Molecular torches |
| US6303293B1 (en) * | 1999-02-02 | 2001-10-16 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Oligonucleotide reverse transcription primers for efficient detection of HIV-1 and HIV-2 and methods of use thereof |
| AU7855300A (en) | 1999-10-04 | 2001-05-10 | Cytogenix, Inc. | Altering gene expression with ssDNA produced in vivo |
-
2001
- 2001-10-22 DE DE60132924T patent/DE60132924T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-22 ES ES01988788T patent/ES2300375T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-22 AU AU3054502A patent/AU3054502A/xx active Pending
- 2001-10-22 AU AU2002230545A patent/AU2002230545B2/en not_active Expired
- 2001-10-22 US US10/001,407 patent/US6870045B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-22 CA CA2422956A patent/CA2422956C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-22 JP JP2002537919A patent/JP4202750B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-10-22 EP EP01988788A patent/EP1399585B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-10-22 WO PCT/US2001/045396 patent/WO2002034951A2/en active IP Right Grant
- 2001-10-22 AT AT01988788T patent/ATE386821T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20020177127A1 (en) | 2002-11-28 |
| ATE386821T1 (de) | 2008-03-15 |
| JP2004518416A (ja) | 2004-06-24 |
| WO2002034951A2 (en) | 2002-05-02 |
| EP1399585B1 (en) | 2008-02-20 |
| DE60132924D1 (de) | 2008-04-03 |
| AU2002230545B2 (en) | 2006-09-21 |
| AU2002230545C1 (en) | 2002-05-06 |
| US6870045B2 (en) | 2005-03-22 |
| WO2002034951A3 (en) | 2003-12-24 |
| CA2422956A1 (en) | 2002-05-02 |
| EP1399585A2 (en) | 2004-03-24 |
| JP4202750B2 (ja) | 2008-12-24 |
| AU3054502A (en) | 2002-05-06 |
| DE60132924T2 (de) | 2009-03-05 |
| CA2422956C (en) | 2010-10-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2300375T3 (es) | Composiciones y metodos para la deteccion del virus de la inmunodeficiencia humana 2 (hiv-2). | |
| ES2370169T3 (es) | Composiciones y métodos para detectar el virus de la hepatitis b. | |
| ES2890882T3 (es) | Composiciones y procedimientos para detectar el virus del Nilo occidental | |
| JP7015288B2 (ja) | シングルプレックス又はマルチプレックスアッセイにおいてヒトパルボウイルス核酸を検出及びａ型肝炎ウイルス核酸を検出するための組成物及び方法 | |
| JP2009261404A (ja) | ヒトパルボウイルスｂ１９核酸の検出のためのアッセイ | |
| AU2002230545A1 (en) | Compositions and methods for detecting human immunodeficiency virus 2 (HIV-2) | |
| JP2024003255A (ja) | Ｈｅｖ核酸を検出するための組成物および方法 | |
| JP2011517959A (ja) | チクングニヤウイルスを検出するための方法 | |
| CA2929741A1 (en) | Assay for detecting and quantifying hiv-1 | |
| ES2383947T3 (es) | Composiciones, métodos y equipos para la detección de ácidos nucleicos del vih-1 y vih-2 | |
| ES2349543T3 (es) | Composiciones, métodos y equipos para la detección de ácidos nucleicos del vih-1 y vih-2. | |
| AU2014203075B2 (en) | Compositions and methods for detecting hepatitis B virus | |
| AU2011253599B2 (en) | Assay for detecting and quantifying HIV-1 | |
| JP2022508954A (ja) | ヒトポリオーマウイルスｂｋウイルスを増幅、検出または定量化するための組成物および方法 |