AT410218B - Verfahren zur herstellung eines qualitätsgesicherten pools biologischer proben - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines qualitätsgesicherten pools biologischer proben Download PDF

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Description


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   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines hinsichtlich der Belastung mit Mikro- organismen qualitätsgesicherten Pools biologischer Proben unter Verwendung von Nukleinsäure- Amplifikationsverfahren 
Biologische Proben, wie etwa Plasmaspenden oder Chargen von Zellkulturüberständen kön- nen mit unerwunschten Mikroorganismen, insbesondere Viren oder Fremd-DNA kontaminiert sein Diese Kontaminationen konnen zu unerwünschten Reaktionen in Präparaten führen, die aus derar- tigen biologischen Präparaten hergestellt und an Menschen verabreicht werden 
Vor allem menschliches Plasma ist als Ausgangsmaterial zur Herstellung von   Plasmadenvaten   von ausserordentlicher klinischer Bedeutung,

   insbesondere zur Substitutionstherapie bei angebore- nem oder erworbenem Mangel an Plasmakomponenten Derzeitige pharmazeutische Praparatio- nen werden in der Regel nicht aus Einzelspenden, sondern aus einem Plasma-Pool, bestehend aus sehr vielen   Einzelspenden,   hergestellt. 



   Bei der Verwendung von menschlichem Plasma ist aber darauf zu achten, dass keine infektiö- sen Agentien enthalten sind, die mit dem pharmazeutischen Präparat bzw. mit den Plasmaderiva- ten übertragen werden konnen Zu den möglicherweise im Blut vorkommenden   infektiösen   Agen- tien zählen vor allem Viren, die durch Blut übertragbar sind (haematogene Viren), z. B. HI-Viren oder Hepatitisviren (A, B, C, D, E oder G), aber auch Parvovirus 
Aufgrund des grossen Bedarfs an Arzneimitteln enthaltend Plasmaderivate ist die ökonomische Herstellung dieser Arzneimittel nur im industriellen Massstab möglich. 



   Plasma wird von Spendern erhalten und zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten gepoolt Die Grosse eines üblichen Pools betragt etwa 2000-6000 Emzelplasmaspenden Dabei besteht das Risiko dass durch eine einzelne Virus-kontaminierte Plasmaspende der gesamte Plasma-Pool kontaminiert wird. 



   Obwohl es bereits gegen Ende der ersten Hälfte des 20 Jahrhunderts gelungen war. mensch- liches Albumin durch Erhitzen zu einem virussicheren Präparat zu verarbeiten, war dies bei allen anderen aus Plasma gewinnbaren Arzneimitteln wegen ihrer Empfindlichkeit gegenüber Hitze zunächst nicht möglich Bis heute sind bei millionenfacher Anwendung von adäquat hergestellten Albuminpräparaten nie Infektionen mit beim Menschen im Blut auftretenden Viren vorgekommen. 



   Im Gegensatz hierzu wurde bei vielen anderen aus Plasma hergestellten Arzneimitteln immer wieder uber Virusinfektionen, insbesondere mit Hepatitisviren, berichtet und seit den 80iger Jahren im grossen Umfang auch über Infektionen mit Aids-Virus 
Um 1980 wurden erstmals bei entsprechend stabilisierten Faktor VIII-Konzentraten Hitzebe- handlungen durchgeführt, mit der Absicht, hierdurch Inaktivierungen von Viruskontaminanten zu erreichen Zunächst musste aber ein grosser Verlust an Faktor VIII-Aktivitat in Kauf genommen werden bzw blieb das tatsächliche Inaktivierungspotential zunachst unbekannt. 



   Durch Verbesserung der Hitzeinaktivierungsverfahren und Anwendung von anderen, neuen In- aktivierungsverfahren konnten schliesslich Arzneimittel aus Plasma hergestellt werden, die in den meisten Fällen zu keinen Virusinfektionen beim Empfänger führten Hand in Hand mit dieser Ent- wicklung ging auch die Verbesserung der Spender- und Spendenauswahl mit der Zielrichtung, jene Spender und Spenden auszuschliessen, bei denen der Verdacht einer   Virämie   und damit eines virushältigen Plasmas bestand 
Seit längerer Zeit wird entweder durch Antigennachweis oder durch Antikorpernachweis von bzw gegen ein bestimmtes Virus im Blut versucht, solche Spenden, die ein positives Ergebnis liefern, auszuschliessen und sie nicht in einen grösseren Plasmapool einzubringen, der als Aus- gangsmaterial für die Herstellung von Blutprodukten dienen soll.

   Bei Einzelspendern, die in allen Untersuchungen keine Krankheitssymptome oder pathologische Untersuchungsergebnisse aufwei- sen, trotzdem aber bestimmte Viren in ihrem Blut sogar in hoher Konzentration über längere Zeit- räume beherbergen konnen, kann nunmehr das Auftreten solcher Virämien durch ein bestimmtes Virus mit Hilfe einer Amplifikationsmethode eindeutig nachgewiesen werden 
Durch das Poolen von   Plasmaeinheiten   wird zwar naturgemäss eine einzelne mit Viren konta- minierte Plasmaspende verdünnt, der Nachweis von viralen Genomsequenzen mit Hilfe von Ampli- fikationsreaktionen ist aber so empfindlich, dass selbst in den Verdünnungen Virusgenome bzw deren Sequenzen eindeutig bestimmbar sind und falls sie, wie oben erwähnt, unter eine bestimmte Bestimmbarkeitsgrenze fallen,

   dann nicht mehr eine klinische Relevanz im Sinne der Möglichkeit einer Infektion aufweisen. 

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   Die EG-Richtlinie gemäss dem "EEC Regulatory Document Note for Guidance", Guidelines for Medicinal Products Derived from Human Blood and Plasma (Biologicals 1992,20 159-164) schlägt ein   Qualitatssicherheitssystem   zur Kontrolle der Plasmaspender bzw. Plasmaspenden vor Dem- nach muss jede Plasmaspende mit validierten Tests auf die Abwesenheit von Virus-Markern, wie Hepatitis-B Antigen, HIV-1- und HIV-2-Antikörpern untersucht werden, da diese indikativ für eine entsprechende virale Infektion des Plasmaspenders sind. Tests zum Ausschluss einer Hepatitis C-Infektion sollen gleichfalls vorgenommen werden. 



   Gemäss der europaischen Pharmacopoeia ist beschrieben, dass spezielle Tests zur Bestim- mung von Hepatitis B-Oberflächenantigen, fur Hepatitis C-Virus-Antikörper und für HIV-Antikorper an jeder Spende durchgeführt werden sollen (European Pharmacopoeia, 2 Ausgabe, Teil 11, 1994, Seiten 853 bis 853-4). 



   Eine   FDA-Richtlmie   vom 14.3.1995 sieht die PCR-Testung an einem Endprodukt (Immunglobu- lin-Produkt) als zusätzlichen Sicherheitsfaktor vor. 



   Trotz der vorgeschlagenen Tests wird in der EG-Richtlinie betont, dass die Sicherheit von ein- zelnen Plasmaspenden nur allein durch eine Kontrolle dieser Virus-Marker nicht ausreichend ist. 



  Auch wenn die Abwesenheit der genannten Marker in einer Plasmaprobe bestätigt wird, ist eine Virämie des Spenders nicht auszuschliessen. Virale Antigene und entsprechende Antikörper sind nämlich nicht immer sofort nach der Infektion nachweisbar, die ersten Marker für eine virale Infekti- on treten oft erst nach Wochen oder Monaten nach dem Kontakt mit infektiösem Material auf. 



  Dieser kritische Zeitraum nach Infektion und vor dem Auftreten von Antikörpern wird allgemein als   &num;Window-Periode"   bezeichnet. Der Zeitpunkt nach Infektion, bei dem die ersten viralen Marker nachweisbar sind, ist jedoch von Virus zu Virus verschieden. 



   Daruberhinaus ist auch bekannt, dass für manche aus Plasma hergestellte Arzneimittel es im Rahmen des Herstellungsverfahrens zu einer Abreicherung bzw. Inaktivierung von Viren kommt und solche Produkte von sich aus in hohem Ausmass virussicher sind. 



   Obwohl   Virusinaktivierungen   von   Plasmadenvaten   im industriellen Ausmass äusserst erfolgreich durchgeführt wurden, kam es in seltenen Fallen trotzdem zu Übertragungen haematogener Viren wie AIDS, Hepatitis A, B, C-Virus, wodurch angenommen werden muss, dass Hersteller trotz Anwendung einer gleichbleibenden Herstellungsmethode bei einigen wenigen Herstellungschargen viruskontaminierte Produkte erzeugten (Lancet 340,305-306 (1992) ; MMWR 43 (28), 505-509 (1994); Thromb. Haemost. 68,781 (1992)).

   Die Ursache dafür ist wahrscheinlich in einer überaus hohen Kontamination bestimmter Ausgangschargen zu suchen Da bei der Gewinnung des Plas- mas nur indirekte Methoden zum Ausschluss von   viruskontammierten   Plasmaspenden zur Verfü- gung stehen, besteht die Möglichkeit, dass das Ausgangsmaterial so stark kontaminiert ist, dass die ansonsten erfolgreich anwendbaren Virusinaktivierungs- und Virusabreicherungsmethoden nicht mehr genügen, um virussichere Endprodukte herzustellen. 



   Da für die meisten human-pathogenen Viren eine menschliche infektiöse Dosis nicht bekannt und auch derzeit gar nicht bestimmbar ist, versucht man bei der Testung von Plasma-Pools mög- lichst jegliche Kontamination durch Auffinden der kontaminierten Einzelproben auszusortieren Die dabei verwendeten Nukleinsaure-Amplifikationstestungen sind zwar äusserst empfindlich, jedoch sehr teuer, so dass deren Anwendung zwar bei bekanntermassen human-pathogenen Viren gerechtfertigt ist, bei anderen Mikroorganismen von denen entweder keine human-pathogene Wirkung bekannt oder beschrieben ist oder bei welchen nur eine erhohte Pathogen-Dosis   infektiös   ist,

   wäre dieser Aufwand nicht notwendig 
So beschreiben insbesondere die WO 96/35437 und die US 5 591 573-A Testsysteme für Plasma-Pools unter Verwendung von Nukleinsaure-Amplifizierungsverfahren und/oder Antikörper- testungen Die US 5 591 573 offenbart ein Verfahren zum Testen von Plasma-Pools. Bei diesem Verfahren wird ein 1. Pool hergestellt und mittels PCR getestet Falls dieser PCR-Test positiv ist wird ein 2., kleinerer Sub-Pool hergestellt und wiederum mittels PCR getestet Dieses Verfahren wird solange wiederholt, bis die kontaminierte Einzelspende identifiziert ist Gemass der WO 96/35437 sind auch Antikörpertestungen vorgesehen bzw. die Einhaltung vorgegebener definierter Grenzwerte, im Rahmen des Screening-Verfahrens offenbart. 



   Den beschriebenen Nukleinsaure-Amplifizierungs-Verfahren ist jedoch gemein, dass stets ver- sucht wird diejenige Amplifikationsmethode zu verwenden, die die grosste Sensitivität erlaubt. 



  Derartige hoch-sensitive PCR-Testungen sind aber wie erwähnt äusserst kostspielig, vor allem bei 

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 Reihentestungen von Pools von biologischen Einzelproben. PCR-Testungen mit niedriger Sensitivi- tät, die weitaus kostengünstiger waren, werden bei derartigen Untersuchungen aber generell vermieden, da damit das Risiko von Kontaminationen, die unter der (erhöhten) Nachweisgrenze liegen, einhergehen würde. 



   Analog dazu kommt es auch bei Überständen aus rekombinanten Zellkulturen immer wieder zu Verunreinigungen durch Mikroorganismen oder durch Nukleinsaure-Matenal der Wirtszelle. Derar- tige Kontaminationen sollten im, aus den Überständen aufzureinigenden, pharmazeutischen Prä- parationen selbstverständlich nicht bzw. nur zu einem bestimmten Höchstwert (Grenzwert) vorhan- den sein. 



   Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung eines hinsichtlich der Belastung mit Mikroorganismen, insbesondere mit Viren, qualitätsgesicherten Pools biologi- scher Proben unter Verwendung von Nukleinsäure-Amplifikations-Verfahren zur Verfügung zu stellen, welches einerseits ein verlassliches Aussondern von kontaminierten Einzelproben, insbe- sondere von hoch kontaminierten Einzelproben, sowie die Einhaltung bestimmter Grenzwerte an derartigen Verunreinigungen im Pool erlaubt, aber auf der anderen Seite eine Kostenreduktion und ein gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Pool-Testungsverfahren einfacheres Verfahren mit sich bringt. 



     Erfindungsgemass   wird diese Aufgabe gelost durch ein Verfahren zur Herstellung eines hin- sichtlich der Belastung mit Mikroorganismen qualitätsgesicherten Pools biologischer Proben, ausgewählt aus der Gruppe Blut-Einzelspenden, Plasma, Serum oder Zellkulturchargen unter Verwendung von Nukleinsaure-Amplifikations-Verfahren, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist - Entnehmen von Aliquoten aus den biologischen Proben, 
Vereinigen der entnommenen Aliquote zu einem Screening-Pool, 
Testen des Screening-Pools hinsichtlich des Vorhandenseins von oder des Gehaltes an 
Genomäquivalenten von Mikroorganismen mittels eines ersten Nukleinsaure-Amplifika- tons-Verfahrens, das gegenüber den zu testenden Mikroorganismen ein bestimmtes, aus- gewähltes Detektionslimit DL-1 aufweist,

   - Aufspalten des Screening-Pools in Sub-Screening-Pools durch erneutes Vereinigen von entnommenen Aliquoten in kleineren Pools, wenn beim Testen des Screening-Pools ein vorgegebener Grenzwert an   Genomaquivalenten   überschritten wird, erneutes Testen der Sub-Screening-Pools hinsichtlich des Vorhandenseins von oder des 
Gehaltes an Genomäquivalenten der zu testenden Mikroorganismen mittels eines weiteren 
Nukleinsaure-Amplifikations-Verfahrens, das gegenüber den zu testenden Mikroorganis- men ein bestimmtes, ausgewähltes Detektionslimit DL-2 aufweist, wobei DL-1 < DL-2, 
Auffinden und Eliminieren derjenigen Proben, die DL-2 überschreiten, und - Vereinigen der nicht-eliminierten Proben zu einem qualitätsgesicherten Pool 
Durch das Vorsehen von mindestens zwei Nukleinsaure-Amplifikations-Verfahren, die sich hin- sichtlich ihrer Sensitivität unterscheiden,

   kann somit   erfmdungsgemass   ein effizientes (aufgrund der hohen Sensitivität der Pool-Testung) und dennoch kostengunstiges Verfahren zur Verfügung gestellt werden, da das Testen der Sub-Pools bis hinunter zu den Einzelproben durch ein weniger sensitives Nukleinsaure-Amplifikations-Verfahren ohne vorhergehende weitere Extraktion der   Nukleinsaure   (weiches deshalb entscheidend kostengünstiger und aufwandsreduziert ist) vorge- nommen wird 
Mit dem erfindungsgemassen Verfahren wird somit in einem ersten Schritt der Screening-Pool mit einem sehr sensitiven und quantitativen Verfahren hinsichtlich der Nukleinsaure-Kontaminatio- nen geprüft und die sehr viel aufwendigere Auffindung der kontaminierten Einzelprobe oder Einzel- spende, die eine sehr viel höhere Zahl an weiteren Untersuchungen mit sich bringt,

   mit einem weniger sensitiven Nukleinsaure-Amplifikations-Verfahren bestimmt. Damit wird keinerlei Risiko eingegangen, dass eine relevante Kontamination übersehen wird, da die Screening-Pool-Testung mit einer möglichst sensitiven Methode erfolgt, andererseits aber die Kosten und der Zeitaufwand des Aussonderungsverfahrens für die kontaminierte Einzelprobe oder -charge entscheidend redu- ziert werden. In den Fällen, in denen die Auffindung derartiger kontaminierter Einzelspenden bislang aus diesen Gründen unterblieben ist, bietet das   erfindungsgemasse   Verfahren erstmalig die Möglichkeit, den wertvollen Rohstoff, den die Einzelspenden darstellen ebenfalls kostengünstig, 

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 einer Nutzung zuzuführen und das Verwerfen dieser Proben zu verhindern. 



   Die Sensitivität des   Nukleinsäure-Amplifikations-Verfahrens   wird erfindungsgemäss als das mit der jeweiligen Nukleinsäure-Amplifikations-Methode gerade noch detektierbare Ausmass an Ge- nomäquivalenten festgesetzt. Das Vorsehen derartiger Verfahren mit genau festgelegten Grenz- werten ist für den Fachmann ohne weiteres moglich und gehört zu seinen üblichen Kenntnissen. 



   Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich vor allem zur Qualitätssicherung von Pools hin- sichtlich der Belastung von Mikroorganismen, die von geringer Pathogenizität bzw Toxizitat sind bzw von denen angenommen werden kann, dass eine Belastung, die unter dem festgelegten Grenzwert liegt, im Zuge des anschliessenden Aufreinigungsprozesses bis zur Fertigstellung des pharmazeutischen Präparates jedenfalls eliminiert wird bzw. die diesem Grenzwert entsprechende Menge an Kontamination in einem derartigen pharmazeutischen Präparat unbedenklich und ohne Nebenreaktionen ist. Ein besonderes Beispiel hierfur stellen Kontaminationen mit Parvoviren, insbesondere Parvo B19, dar. 



   Das Parvovirus B19ist ein   emsträngiges   DNA Virus mit 32 nm Durchmesser, das keine Lipid- membran besitzt und deshalb relativ stabil gegenüber Virusinaktivierungsverfahren ist. So zeigen die meisten inaktivierungsverfahren, beispielsweise physikalische Methoden wie beispielsweise Pasteurisieren (60 C uber 12h) oder chemischen Behandlungen, beispielsweise organische Lo- sungsmittel (TNBP und/oder Detergenz) keine befriedigenden Ergebnisse Allein eine Trockenhit- zebehandlung scheint sich als effektiv zu erweisen. 



   Das Parvovirus B19 ist Verursacher der harmlosen Ringelröteln (Erythema invectiosum), gele- gentlich werden Arthralgien und Arthritiden beobachtet. Gefurchtet sind intrauterine Infektionen, die nicht selten mit dem Fruchttod enden. Zum begrenzten Kreis B19-gefährdeter Patienten gehören solche mit chronisch-hämolytischer Anämie, nach Knochenmarkstransplantation, mit kongenitaler/ erworbener Immundefizienz sowie Schwangere (Sibrowski et al., Beitr Infusionsther. Basel, Karger, 1990, 26, 22-26). 



   Die Seroprävalenz in Industrielandern ist 2-10% in Kindern unter 5 Jahren und 40-60% in Er- wachsenen über 20 Jahren und 85% bei über 70-jährigen. Diese hohe Seropravalenz bedingt daher bei Plasma-Pool-Testungen eine grosse Anzahl von positiven Ergebnissen, wodurch eine Vielzahl von weiteren Tests notwendig wird, um die hoch kontaminierte   Einzelprobe   zu bestimmen. 



   In der EP-A-0 922 771 ist ein Verfahren zum Nachweis von hohen Viruskonzentrationen im Blutplasma beschrieben, bei dem die Empfindlichkeit der PCR durch Anwendung suboptimaler Bedingungen bei der Extraktion, Amplifikation oder Detektion gedrosselt wird, so dass die Parvo- virus-DNA nur noch in Proben nachgewiesen werden kann, deren DNA-Gehalt grösser als   106-107   Genomäquivalente/ml ist. Dieses Verfahren hat allerdings den Nachteil, dass es sich nicht für das Testen von Pools eignet. 



   Nichtsdestotrotz können   erfindungsgemass   samtlichen vorgekommenen Mikroorganismen, wie Bakterien oder Viren, analysiert werden, wobei vor allem hinsichtlich der Testung von Blut- und Plasma-Einzelspenden die Qualitätssicherung bezüglich Viren besonders vorrangig ist 
Bevorzugterweise werden dabei Hepatitisviren, insbesondere HAV, HBV, HCV, HDV, HEV und HGV, Retroviren, insbesondere HIV-1 und HIV-2, und Parvoviren, insbesondere Parvo B19, mit dem erfindungsgemässen Verfahren getestet bzw. Plasma-Pools hinsichtlich derartiger Viren quali- tatsgesichert. 



   Bei der Testung von verschiedenen Chargen einer rekombinanten Produktion von Proteinen wird erfindungsgemäss bevorzugt die Einhaltung bestimmter (z.T. vorgeschriebenen) Grenzwerte an Kontamination mit Wirtszellen-Nukleinsauren (wobei hier als Mikroorganismen eukaryontische oder prokaryontische Zellen bzw DNA bzw RNA detektiert werden) oder die Kontamination mit bestimmten bakteriellen oder viralen Verunreinigungen überprüft. 



   Eine besonders bevorzugte Verfahrensvariante besteht   erfindungsgemass   darin, dass der Grenzwert beim Testen des Screening-Pools zwischen der Nachweisgrenze des ersten   Nuklem-   saure-Amplifikations-Verfahrens DL-1 und 105 Gemomaquivalenten/ml vorgegeben wird, wobei sich insbesondere ein Wert um 104 Genomäquivalenten/ml, fur etwa Parvo B19, als besonders effizient herausgestellt hat. Bevorzugterweise kann der jeweilige Grenzwert auch mit dem jeweili- gen Detektionslimit übereinstimmen. 



   Die Detektionslimits fur das erste Nukleinsäure-Amplifikations-Verfahren DL-1 liegen bevor- zugterweise in der Grossenordnung von 102-104 Genomaquivalenten/ml (können aber bis zu 

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 10-50 GE/ml oder - in Ausnahmefallen - noch weiter darunter liegen), wohingegen die Detektions- limits DL-2 üblicherweise bei   104-107   Genomäquivalenten/ml gewählt werden.

   DL-1 und DL-2 unterscheiden sich vorzugsweise um zumindest eine Zehnerpotenz, besonders effizient hat sich aber   erfindungsgemass   eine Differenz von etwa 2 Zehnerpotenzen herausgestellt, da damit auf der einen Seite doch noch verlasslich die kontaminierte Einzelspende aufgefunden werden kann (dies ist erfindungsgemäss erforderlich) und andererseits die Kosten und der Aufwand für das Sub- Screening-Verfahren erheblich gegenuber den bekannten Methoden reduziert werden konnen. 



   Die Amplifikation von Nukleinsäuren kann   erfindungsgemass   durch eine Reihe von in der Litera- tur beschriebenen Amplifikations-Prozessen erfolgen, besonders bewährt hat sich dabei das PCR- Verfahren, das in Folge seiner breiten Anwendung und industrieller Verfügbarkeit auch von den Kosten her bevorzugt wird Das PCR-Amplifikationsverfahren wurde erstmals 1983 von Mullis et al. 



  (US 4,683,195 und US 4,683,202) beschrieben Virale Genomsequenzen konnen ebenfalls durch "nested PCR" (Methods Enzymol 155 (1987), 335-350) amplifiziert werden Für die Amplifikation und den Nachweis von RNA muss die RNA erst in die DNA transkribiert werden Dieses Verfahren wird unter Verwendung der Reversen-Transkriptase durchgeführt und als RT-PCR bezeichnet (Cell 50 (1987), 831-840). 



   Die Analyse der Amplifikationsprodukte kann durch Verwendung von markierten Nukleotiden oder Oligonukleotid-Pnmern beim Elongationsprozess und der anschliessenden Hybridisierung oder   gelelektrophoretischen   Auftrennung der Produkte erfolgen 
Der Nachweis der amplifizierten DNA Fragmente kann beispielsweise mittels einer Sonde, die zwei Fluoreszenzfarbstoffe trägt, erfolgen. Diese Methode ist beispielsweise von Livak et al (PCR Method and Appl 1995 ; 4 357-362) beschrieben.

   Die besondere Eigenschaft dieser Sonde besteht dann, dass die Fluoreszenz des am 5'Ende der Sonde befestigten Farbstoff (FAM), des Reporters, durch die Nahe des am 3'Ende des Primers angeordneten zweiten Fluoreszenzfarbstoffes (TAMRA), des Quencher, reduziert wird 
Im Verlaufe der Amplifikation wird nun unter der Einwirkung einer thermostabilen DNA-Polyme- rase, vorzugsweise der Taq Polymerase, der neue DNA Strang synthetisiert. Dabei verdrangt die DNA-Polymerase die Sonde nicht nur vom   Einzelstrang,   sondern zerlegt sie mittels ihrer endo- nukleolytischen Aktivitat und setzt dabei die beiden Fluoreszenzfarbstoffe frei Die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffes wird nicht mehr durch den Quencherfarbstoff unterdruckt und steigt an.

   Dieser Anstieg der Fluoreszenz wird im ABI Prism 7700 während des Laufes der PCR kontinuierlich aufgezeichnet Im Vergleich zu mehreren Negativkontrollen wird der Schwellenwert ermittelt, ab dem ein Anstieg der Fluoreszenz als positives Signal gewertet wird. 



   Die Quantifizierung der Belastung mit einem Mikroorganismus, beispielsweise von Parvo B19, in einer unbekannten Probe erfolgt uber eine externe Eichkurve Ein   kloniertes   Stuck des Parvo B19 DNA in einem Tragerplasmid, welches die zu amplifizierende Sequenz umfasst, wird dazu in linearisierter Form in Konzentrationen von 106 Kopien/Reaktion bis 10 Kopien/Reaktion mitamplifi- ziert.

   Durch Ermittlung eines Schwellenwertes (Threshold-Wertes, entspricht einem PCR Zyklus, bei dem das Fluoreszenzsignal des Reporterfarbstoffes zum ersten Mal über die Grundlinie an- steigt) wird im Programm eine Eichgerade erstellt mit deren Hilfe der Gehalt an Parvo B19 DNA einer unbekannten Probe uber ihren Threshold-Wert quantifiziert wird 
Alternativ-Verfahren zur PCR umfassen die Ligase-Kettenreaktion (LCR), entsprechend der EP 0 320 308 A und der EP 0 336 731 A, sowie nucleic acid sequence based amplification (NASBA), self-sustained sequenced replication (SSR), entsprechend der EP 0 310 229, oder die transcnption based amplification system (TAS), entsprechend der EP 0 373 960 A In diesen Verfahren wird eine Reihe von Enzymen verwendet, die gleichzeitig oder schrittweise bei der Amplifikation verwendet werden können,

   wie z B eine DNA-Polymerase oder eine RNA-Polyme- rase 
 EMI5.1 
 zugesetzt werden, mit welchen das prinzipielle Funktionieren der Amplifikation gewahrleistet wird In Routinetests kann die Interpretation der mit dem   erfindungsgemassen   Verfahren erhaltenen Resultate üblicherweise folgendermassen erfolgen a) keine Detektion des internen Standards (z.B keine sichtbare Bande)- die Bestimmung hat z B. wegen der Amplifikationsreaktion (z.B. die PCR) nicht funktioniert, dadurch konnen falsch negative Resultate ausgeschlossen werden 

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 b) nur der interne Standard ist detektierbar (z B nur die Standard-Bande ist sichtbar)- die 
Bestimmung inklusive der Amplifikationsreaktion (z. B. die PCR) hat funktioniert, die Probe ist negativ, c) Standard und Proben-Nukleinsäure sind detektierbar (z.B beide Banden sind sichtbar): positive Probe. 



   Die erfindungsgemäss vorrangig zu testenden biologischen Proben sind ausgewählt aus der Gruppe der Blut-Einzelspenden, Plasma, Serum oder Zellkultur-Chargen. Gerade bei diesen biologischen Proben kann es zu den erwahnten Kontaminationen kommen und diese werden auch vorrangig in der industriellen Herstellung von Arzneiverwendung aus biogenen Quellen verwendet 
Das erfindungsgemässe Verfahren kann automatisiert mittels Robotersteuerung durchgeführt werden, wobei sich konventionelle Plattformen hierfür besonders eignen. Um solche Screening- Pools herzustellen sind dem Fachmann verschiedenste Möglichkeiten bekannt.

   So werden bei- spielsweise von Mortimer (Vox Sang. 1997,73:93-96), 2 dimensionale (2D), 3 dimensionale (3D) und sogar 4 dimensionale (4D) Pools beschrieben Um nun einen beispielsweise 3D Pool herge- stellt aus 512 (8x8x8) Einzelproben aufzulösen, müssen hier beispielsweise 24 Sub-Pools herge- stellt werden, um eine kontaminierte Einzelprobe eindeutig identifizieren zu können. 



   Erfindungsgemäss wird bevorzugterweise das zweite Nukleinsäure-Amplifikations-Verfahren unmittelbar aus dem Sub-Pool nach der ersten Nukleinsäure-Amplifikation durchgeführt Das bedeutet, dass keine weitere Extraktion der Nukleinsäure erfolgt, sondern diese direkt in den Sub- Pools bestimmt wird 
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch einen qualitätsgesicher- ten Pool biologischer Proben, welcher durch das erfindungsgemässe Verfahren erhalten werden kann, sowie ein pharmazeutischen Praparat, das ausgehend von einem erfindungsgemäss quali- tatsgesicherten Praparat hergestellt wird oder hergestellt werden kann. Diese pharmazeutischen Präparate enthalten bevorzugterweise mindestens eine Komponente, ausgewählt aus der Gruppe der Proteine, insbesondere Plasmaproteine sowie rekombinant hergestellte Proteine, und Enzyme. 



   Die Erfindung wird anhand des nachfolgenden Beispiels, auf das es jedoch nicht eingeschränkt sein soll, näher erläutert. 



   Beispiel 
Pooling 
Aliquots von 512 Plasmaspenden werden mittels eines 3-dimensionalen Schemas zu einem Screening-Pool und 24 Sub-Pools gepoolt. 



   Extraktion 
Die Nukleinsäureextraktion aus einem Screening-Pool wird mittels eines modifizierten Proto- kolls des QIAmp Viral Kits von QIAGEN durchgeführt Dazu wird 1 ml des Screening-Pools einer Ultrazentrifugation unterworfen, der Überstand bis auf 140  l abgenommen. Nach Zugabe von 560  l AVL Lysepuffer gemass Kit von QIAGEN wird 10 min bei 56 C im Thermoschüttler inkubiert. 



  Das Lysat wird auf eine Silikasaule aufgetragen und durch Zentrifugation bei 8000 rpm durch die Saule gedrückt Nach Waschen mit je 0,5 ml Waschpuffer AW1 und AW2 wird die auf der Säule gebundene Nukleinsaure mit 50  l H20 eluiert 
Amplifikation 
Ein kleines Fragment der Parvo B19DNA wird durch Zugabe von 20  l Extrakt zu 30  l Master- mix amplifiziert. 



   (Perkin Eimer, TaqMan PCR Core Reagent Kit mit 5  l 10xTaqMan Puffer, 14  l 25 mM   MgCI2,   
 EMI6.1 
 PT1.r (5'GCTAACTTGCCCAGGCTTGT3'), 1  l 5  M PT1.p(5'6-FAM-CCAGTAGCAGTCATGCAGAACCTAGAGGAGA-TAMRA3'), 1  l Tween 20 (1%), 
 EMI6.2 
 Die Amplifikation erfolgt unter folgenden Bedingungen in einem ABI Pnsm 7700 : 1. AmpErase UNG Reaktion 2 Minuten, 50 C 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 
2 Initiale Denaturierung 10 Minuten, 95 C 
3. Zyklen jeweils 15 Sekunden 95 C und 1 Minute, 58 C 
Auswertung 
Die PCR wird uber die Zunahme der Fluoreszenz wahrend der PCR augewertet. Der Thres- hold-Wert (d. h der Zyklus bei dem das Signal uber das Grundrauschen ansteigt) dient dabei der Quantifizierung.

   Die Threshold-Werte einer Standardreihe eines   lineansierten   Plasmides mit einem klonierten Fragment des Parvo B19 Genomes dienen dabei als Grundlage zur Ermittlung der Parvo B19 Konzentration im Extrakt des Screening-Pools Liegt die Anzahl der in der Probe gemessenen   Genomaquivalente   unter dem Grenzwert von   104 GE/ml   im Screening-Pool werden die im diesem enthaltenen Proben freigegeben Wird hinge- gen ein Wert über dem Grenzwert errechnet, wird der Screening-Pool aufgelost. 



   Auflösung 
Die 24 Sub-Pools eines Screening-Pools werden mittels eines Roboters in mehreren Schritten in   H20dest   1. 200 verdünnt und ohne Extraktion in die TaqMan PCR eingesetzt. 



   Amplifikation der Auflösung 
Ein kleines Fragment der Parvo B19 DANN wird durch Zugabe von 20  l Sub-Pool- Verdünnung (entspricht 0,1 l des Sub-Pools) zu 30  l Mastermix amplifiziert   (Perkin   Eimer, TaqMan Gold Kit mit 5  l 10xTaqMan Puffer, 14  l 25 mM   MgCI2,   4  l 2.

   5 mM dNTPs, 1,5  l 10  l   PT1.f(5'GACAGTTATCTGACCACCCCCA3'),  1,5  l   10 uM     PT1 r (5'GCTAACTTGCCCAGGCTTGT3'), 1 l 5  M   PT1   p(5'6-FAM-CCAGTAGCAG T CA T GCAGAACC T AGAGGAGA-TAMRA3'),   1  l Tween 20 (1%), 
 EMI7.1 
 
Die Amplifikation erfolgt unter folgenden Bedingungen in einem ABI Pnsm 7700 
1 AmpErase UNG Reaktion 2 Minuten, 50 C 
2 Initiale Denaturierung 10 Minuten, 95 C 
3 Zyklen jeweils 15 Sekunden 95 C und 1 Minute, 58 C 
Auswertung 
Die PCR wird über die Zunahme der Fluoreszenz wahrend der PCR ausgewertet Durch die Ermittlung des Threshold-Wertes (d h der Zyklus bei dem das Signal über das Grundrauschen ansteigt) im Vergleich mit den Werten einer bekannten Standardreihe, die mitamplifiziert wurde,

   wird die Anzahl der Genomaquivalente im Extrakt der Screening-Probe bestimmt 
Da bei Zugabe von 0,1 l Material nur Proben mit einem Gehalt von mindestens 104 GE/mi ein Signal ergeben konnen, werden alle in der Auflosung positiv erkannten   Einzelspenden   verworfen und die restlichen freigegeben. 

**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.

Claims (8)

  1. PATENTANSPRÜCHE : 1 Verfahren zur Herstellung eines hinsichtlich der Belastung mit Mikroorganismen qualltats- gesicherten Pools biologischer Proben ausgewahlt aus der Gruppe Blut-Einzelspenden, Plasma, Serum oder Zellkultur-Chargen, unter Verwendung von Nukleinsäure-Amplifika- tions-Verfahren, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte Entnehmen von Aliquoten aus den biologischen Proben, Vereinigen der entnommenen Aliquote zu einem Screening-Pool, Testen des Screening-Pools hinsichtlich des Vorhandenseins von oder des Gehaltes an Genomaquivalenten von Mikroorganismen mittels eines ersten Nuklemsaure- Amplifikations-Verfahrens, das gegenüber den zu testenden Mikroorganismen ein be- stimmtes Detektionslimit DL-1 aufweist,
    - Aufspalten des Screening-Pools in Sub-Screening-Pools durch erneutes Vereinigen von entnommenen Aliquoten in kleineren Pools, wenn beim Testen des Screening- <Desc/Clms Page number 8> Pools ein vorgegebener Grenzwert an Genomaquivalenten überschritten wird, - erneutes Testen der Sub-Screening-Pools hinsichtlich des Vorhandenseins von oder des Gehaltes an Genomäquivalenten der zu testenden Mikroorganismen mittels eines weiteren Nukleinsaure-Amplifikations-Verfahrens, das gegenüber den zu testenden Mikroorganismen ein bestimmtes, ausgewähltes Detektionslimit DL-2 aufweist, wobei DL-1 < DL-2, - Auffinden und Eliminieren derjenigen Proben, die DL-2 überschreiten, und - Vereinigen der nicht-eliminierten Proben zu einem qualitatsgesicherten Pool
  2. 2 Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
    dass als Nukleinsaure-Amplifika- tions-Verfahren eine PCR eingesetzt wird.
  3. 3 Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zu testenden Mikro- organismen Viren sind.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass die zu testenden Mikroorganismen ausgewählt sind aus der Gruppe Hepatitisviren, insbesondere HAV, HBV, HCV, HDV, HEV und HGV, Retroviren, insbesondere HIV-1 und HIV-2, und Parvo- viren, insbesondere Parvo B19.
  5. 5 Verfahren nach einem der Anspruche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass der Grenzwert beim Testen des Screening-Pools zwischen DL-1 und 105 Genomaquivalenten/ml, insbe- sondere um 104 Genomäquivalenten/ml vorgegeben wird.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass der Screening- Pool aus 512 biologischen Proben gebildet wird und in 24 Sub-Pools aufgespalten wird.
  7. 7 Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass das weitere Nukleinsäure-Amplifikations-Verfahren unmittelbar nach dem ersten Nukleinsäure-Amplifi- kations-Verfahren durchgeführt wird.
  8. 8. Qualitätsgesicherter Pool biologischer Proben, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7.
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