DE4020028A1 - Charakterisierung von viren - Google Patents
Charakterisierung von virenInfo
- Publication number
- DE4020028A1 DE4020028A1 DE19904020028 DE4020028A DE4020028A1 DE 4020028 A1 DE4020028 A1 DE 4020028A1 DE 19904020028 DE19904020028 DE 19904020028 DE 4020028 A DE4020028 A DE 4020028A DE 4020028 A1 DE4020028 A1 DE 4020028A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- sequence
- primer
- rhinoviruses
- viruses
- hrv2
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
- C12Q1/683—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism involving restriction enzymes, e.g. restriction fragment length polymorphism [RFLP]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zur Charakterisierung von Viren sowie dessen Verwendung
zur Typisierung.
Über 100 Serotypen humaner Rhinoviren (HRV), die
Hauptverantwortlichen für Erkältungskrankheiten, sind
mittlerweile beschrieben worden (Stott & Killington,
1972; Cooney et al., 1982; Hamparian et al., 1987).
Obwohl die durch rhinovirale Infektionen verursachten
Krankheiten normalerweise selbst nicht ernsthafter
Natur sind, kann es zu Sekundärinfektionen des
geschwächten Organismus kommen; diese Sekundär
infektionen sind von ökonomischer und sozialer
Bedeutung. Trotz der beachtlichen Fortschritte in dem
Verständnis dieser Virusgruppe, ist eine effektive
Impfung bisher aufgrund der Anzahl an Serotypen noch
immer ausgeschlossen. Die Diagnose eines Rhinovirus
sowie die Bestimmung des Serotyps, der innerhalb einer
Population zirkuliert, kann zur Zeit nur durch
aufwendige serologische Typisierung erreicht werden
(Cooney et al., 1982; Kellner et al., 1988).
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin,
eine vereinfachte Typisierungsmethode für Viren,
insbesondere für Rhinoviren zu entwickeln.
Bisher sind die Nukleotidsequenzen der RNA-Genome von 4
HRV-Stämmen bestimmt worden: HRV1B (Hughes et al.,
1988), HRV2 (Skern et al., 1985), HRV14 (Stanway et
al., 1984; Callahan et al., 1985) und HRV89 (Duechler
et al., 1987). Eine Analyse der Sequenzen ergab, daß es
signifikante Bereiche von Sequenzidentitäten innerhalb
der 5′-nicht-kodierenden Regionen dieser und anderer
picornaviraler Genome gibt (Rivera et al., 1988). Zwei
solcher Blocks (Klammersequenzen) sind in den vier
bisher sequenzierten Rhinovirus-Serotypen konserviert.
Diese Blocks weisen einmal 23 identische Nukleotide
auf, nämlich zwischen den Nukleotiden 531 bis 553
(1. Klammersequenz) sowie einmal 21 identische
Nukleotide zwischen 161 bis 181 (2. Klammersequenz).
Die Positionsangaben beziehen sich, soweit nicht anders
angegeben, auf die Numerierung des HRV2 (Skern et al.
1985).
Erfindungsgemäß wurden Oligonukleotide aus diesen
Bereichen verwendet, um mit Hilfe der kürzlich
entwickelten "Polymerase Chain Reaction" (PCR; Saiki et
al., 1988) Sequenzen von rhinoviralen Serotypen zu
amplifizieren. Die "Polymerase Chain Reaction"
ermöglicht die enzymatische Amplifizierung auch
unbekannter DNA-Sequenzen in vitro. Eingesetzt werden
hierzu zwei Oligonukleotid-Primer, die das zu
amplifizierende DNA-Fragment flankieren. Diese Primer
sind so konstruiert, daß der eine an den (+) -Strang,
der andere an den (-)-Strang bindet, und so orientiert,
daß die DNA Synthese durch die DNA-Polymerase über die
zwischen den Primern liegende Region erfolgt. Durch die
mehrfache, vorzugsweise bis zu dreißigfache
Wiederholung eines Zyklus von drei Stufen: 1.)
Hitzedenaturierung der DNA; 2.) Binden der Primer an
die komplementären Sequenzen; 3.) Verlängerung mit
DNA-Polymerase (in jedem Zyklus wird die Menge des
DNA-Fragmentes verdoppelt), kommt es zu einer
exponentiellen Anhäufung des von den Primern
flankierten DNA-Fragments. Durch den vorzugsweisen
Einsatz einer thermostabilen DNA-Polymerase,
beispielsweise aus dem Bakterium Thermus aquaticus kann
die PCR automatisiert werden.
Wie gezeigt werden konnte, erstreckt sich die
Konservierung dieser Regionen nicht nur auf die bereits
strukturell aufgeklärten Rhinovirus Serotypen sondern
zumindest auch auf drei bisher strukturell unbekannte
Serotypen. Überraschenderweise war es möglich, mit
Hilfe der PCR und spezifischen Primern 1 und 2 ein
DNA-Fragment der Rhinoviren HRV1A, HRV49 und HRV70 zu
generieren (Fig. 1).
Zwei aus den konservierten Regionen abgeleitete Primer
bieten daher die Möglichkeit, sie universell zur
Amplifikation auch unbekannter DNA-Sequenzen
einzusetzen. Diese Primer, insbesondere ein 18- und ein
14-mer, vorzugsweise der Oligonukleotid-Primer 1
(Sequenz 161 bis 178) und der Oligonukleotid-Primer 2
(komplementär zur Sequenz 531 bis 544), die nach
bekannten Oligonukleotidsyntheseverfahren hergestellt
worden waren, bilden daher die Grundlage der
erfindungsgemäßen Typisierungsmethode.
Zur Typisierung von Viren bzw. Serotypen von Viren ist
es erforderlich, charakteristische Unterschiede
zwischen den einzelnen Vertretern aufzuzeigen. Bisher
wurden zur Typisierung, wie bereits erwähnt, die
Reaktion mit Antikörpern herangezogen und die
Kreuzreaktivitäten bestimmt. Eine andere Möglichkeit
ist die Aufdeckung struktureller Unterschiede; eine
Methode, die sich normalerweise kaum als schnelles und
einfaches diagnostisches Mittel verwenden läßt, ist die
Strukturaufklärung in der Regel doch sehr aufwendig.
Andererseits ist eine Typisierung aufgrund
struktureller Unterscheidungsmerkmale als ausgesprochen
sicher anzusehen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher
darin, eine Typisierungsmethode zu entwickeln, die sich
strukturelle Unterscheidungen zwischen verschiedenen
Viren zunutze macht.
Gelöst wurde diese Aufgabe dadurch, daß man
erfindungsgemäß bestimmte "Indikatoren" für
strukturelle Unterschiede ausnutzte.
Diese "Indikatoren" können im Falle von DNA bzw. RNA
spezielle Restriktionsenzymerkennungsstellen sein. (Die
Methode ist insofern allgemein auf
Nukleinsäuresequenzen anwendbar als RNA durch reverse
Transkription in DNA umgeschrieben werden kann.) Wie
dem Fachmann bekannt, sind Restriktionsenzyme im
allgemeinen äußerst spezifisch. So kann bereits in
vielen Fällen schon die Anderung einer Base innerhalb
einer speziellen Erkennungssequenz dazu führen, daß das
spezielle Restriktionsenzym die Sequenz nicht mehr
erkennt.
Um diese spezifischen "Indikatoren" beispielsweise für
die Rhinoviren zu ermitteln, wurden die amplifizierten
Fragmente sowohl der strukturell bekannten
Rhinovirus-Serotypen als auch der bisher strukturell
unbekannten Rhinovirus-Serotypen miteinander verglichen.
Überraschenderweise weisen die vier strukturell
bekannten Serotypen trotz des hohen
Konservierungsgrades untereinander signifikante
Unterschiede zwischen den Regionen identischer
Klammersequenzen auf. Die sich hieraus ergebenden
charakteristischen Unterschiede im Restriktionsmuster
jedes Serotyps, die auch in den von diesen Regionen
ausgehenden amplifizierten Fragmenten vorhanden sind,
werden erfindungsgemäß verwendet, um die der Erfindung
zugrunde liegende Aufgabe zu lösen.
Da keine Sequenzinformationen zum HRV1A, HRV49 und
HRV70 zur Verfügung standen, wurde die DNA-Sequenz aus
den amplifizierten Fragmenten von HRV1A und HRV49
bestimmt, um zu ermitteln, ob charakteristische
Restriktionsstellen präsent sind. Dies Ergebnis
korrelliert gut mit dem Grad an Kreuzreaktivität
zwischen diesen Paaren (Cooney et al., 1982). Die
Unterschiede zwischen den Sequenzen von HRV2 und HRV49
und zwischen denen von HRV1A und HRV1B sind in den
Fig. 2a bzw. 2b dargestellt. lnsgesamt konnten 15
Basenaustausche und 2 Deletionen zwischen HRV2 und
HRV49 innerhalb der 241 sequenzierten Basenpaare
beobachtet werden. Bei den 210 bp, die von HRV1A und
HRV1B analysiert wurden, konnten 9 Basenaustausche und
1 Insertion beobachtet werden. Diese Veränderungen
führten in beiden Fällen zur Bildung oder zum Verlust
von einer oder mehr Restriktionsschnittstellen (s. Fig.
2). Mit Hilfe dieses Amplifikationsexperimentes konnte
also gezeigt werden, daß für jeden Serotyp
charakteristische Schnittstellen ausgewählt werden
können.
Um die erfindungsgemäße Aufgabe zu lösen, wurden solche
Restriktionsenzyme ausgewählt, mit denen die Serotypen
zweifelsfrei identifiziert werden können; Tabelle 1
zeigt die ausgewählten Enzyme zusammen mit den
Fragmentstellen für das rhinovirale System. Ein
Vergleich der DNA-Fragmente zeigte, daß die Fragmente
von HRV2, HRV49 und HRV89 für das Enzym BanII eine
Schnittstelle aufweisen (Fig. 3a), die Fragmente von
HRV1A, HRV1B und HRV14 jedoch nicht (Fig. 3b).
Vorzugsweise lassen sich durch die Verwendung dieses
Enzyms die Serotypen daher in zwei Gruppen aufteilen
und erleichtern damit die Identifizierung der
Serotypen: die amplifizierten Fragmente jedes Serotyps
wurden mit BanII geschnitten und die Produkte auf
Polyacrylamidgelen analysiert. Auch die
unterschiedlichen Fragmentlängen, die bei HRV2 und
HRV89 erhalten wurden, erlauben die Identifizierung
dieser Serotypen wie in Fig. 3a gezeigt ist. Die
charakteristische HindIII-Stelle des HRV2 sowie die
RsaI-Stelle des HRV89 bestätigten diese
Identifizierung. HRV2 konnte durch die Abwesenheit der
HindIII-Stelle im HRV49 von diesem unterschieden werden.
Die Serotypen, die keine BanII-Stelle aufweisen (Fig.
3b), wurden folgendermaßen identifiziert: HRV14 wurde
über die EcoRl-Stelle identifiziert. HRV1B und HRV1A
weisen beide eine BglII-Stelle an derselben Position
auf; hier erlaubte die Präsenz einer HinPI-Stelle im
HRV1A die eindeutige Unterscheidung der beiden
Serotypen.
Erfindungsgemäß ist es daher überraschenderweise
möglich, auch unbekannte Viren zu typisieren. So hätten
beispielsweise bei Anwesenheit der 6 Serotypen in einem
Blindversuch durch Verdau mit BanII und anschließend
mit HindIII HRV2, HRV49 und HRV89 eindeutig
identifiziert werden können.
Eine Überprüfung der Datenbanken ergab zwar, daß die
erfindungsgemäßen Primer ebenfalls zur Amplifikation
von RNA sämtlicher Stämme Poliovirus Typ 1 und 2,
jedoch nur des Stammes 23 127 des Typs 3 (Cameron 1988)
geeignet sind. Außerdem ist bekannt, daß Poliovirus aus
Nasalmembranen von Patienten sezerniert wird, die das
Sabin-Vaccin erhalten haben; RNA der Typen 1 und 2
würde daher bei einem erfindungsgemäßen
Typisierungsversuch ebenfalls amplifiziert werden.
Berücksichtigt man jedoch den beachtlichen Grad an
Unterschieden zwischen Rhinovirus und Poliovirus, so
gibt es charakteristische Restriktionsstellen für
Poliovirus, mit denen jedwede Mißinterpretation
auszuschließen ist. Die Primer können andererseits aber
auch vorteilhaft verwendet werden, um die Schnelligkeit
des U/C-Wechsel an Position 472 von Poliovirus zu
überprüfen, ein Wechsel, von dem gezeigt worden war,
daß er für die Virulenz verantworlich ist und daß er
bei der Passage der Sabin-Stämme im Menschen auftritt
(Cann et al., 1984). Unter stringenten
Amplifikationsbedingungen ist eine Amplifikation der
Coxsackie-Viren mit diesen Primern nicht zu erwarten.
Die Verfügbarkeit dieser schnellen, erfindungsgemäßen
Methode zur Typisierung von Viren wird die
Identifizierung beispielsweise der zirkulierenden
Rhinovirus-Serotypen innerhalb einer Population
ermöglichen und damit epidemiologische Studien
erleichtern. Um die Anwesenheit irgendeines Virus zu
bestimmen, werden stets nasale Sekretspülungen
routinemäßig in HeLa-Zellen eingebracht, was notwendig
ist, um ausreichende Mengen für weitere Analysen zu
erhalten. Die in den hier beschriebenen Experimenten
benötigte Menge an Material für ein
Amplifikationsexperiment ist ähnlich der, die man nach
einer einmaligen Passage erhält; empfehlenswert ist es
aber, mit den nasalen Sekretspülungen direkt zu
arbeiten, wie dies durch Gama et al. (1988) beschrieben
wurde. Es war sogar möglich, die cDNA von einer RNA,
die aus einem einzigen Plaque isoliert worden war, mit
den hier verwendeten Primern zu amplifizieren. Kürzlich
wurde berichtet, daß Oligonukleotide, die zu Sequenzen
aus den 5′-nicht kodierenden Regionen von Rhinoviren
komplementär waren, verwendet werden konnten, um
Rhinovirus RNA von über 50 Serotypen in nasalen
Sekretspülungen nachzuweisen (Bruce et al., 1988). Es
ist möglich, daß die hier beschriebenen Primer in
Verbindung mit einem ähnlichen Hybridisierungsassay
verwendet werden können, um die Empfindlichkeit zu
verbessern und um zwischen verschiedenen Serotypen
unterscheiden zu können.
Zusammengefaßt bleibt festzuhalten: es konnte gezeigt
werden, daß die PCR in Verbindung mit zwei Primern
verwendet werden kann, um ein DNA-Fragment von
verschiedenen Rhinovirus-Serotypen zu amplifizieren.
Durch den Einsatz verschiedener spezifischer
Restriktionsenzyme auf diese amplifizierten Fragmente
konnte dann zwischen den verschiedenen Serotypen
unterschieden werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Methode,
mit der man Viren, die ein Arrangement konservierter
Sequenzblocks zwischen verschiedenen Serotypen
aufweisen, insbesondere Rhinoviren typisieren kann.
Anfänglich wird es noch nötig sein , die amplifizierte
DNA von solchen Viren, die kein bekanntes
Restriktionsenzymmuster besitzen, zu sequenzieren und
den Serotyp mit Antikörpern zu identifizieren. Auf
diese Weise wird es möglich sein, einen Katalog von
Restriktionsenzymmustern beispielsweise aller
Rhinovirus-Serotypen zu erstellen, ein Katalog, der
regelmäßig kontinuierlich auf den neuesten Stand
gebracht werden kann und der auf Dauer eine
Antikörper-Typisierung überflüssig werden läßt. Viren,
die auf diese Weise charakterisiert werden können sind
beispielsweise: HIV, Maul- und Klauenseuche-Virus,
Echoviren, Coxsackieviren.
Mit Hilfe dieser Kataloge und des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist es daher möglich, Viren auf schnelle Art
zu charakterisieren und zu typisieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren
zur Charakterisierung von Viren, dadurch
gekennzeichnet, daß
- a) die RNA des Virus in die cDNA überführt wird,
- b) die cDNA in Gegenwart der Primer 1 und 2 aus dem Bereich der Sequenzidentitäten mit Hilfe der "Polymerase Chain Reaction" amplifiziert wird,
- c) die amplifizierte DNA mit Hilfe verschiedener Restriktionsenzyme analysiert wird und
- d) das erhaltene Restriktionsmuster mit dem Restriktionsmuster bekannter Viren verglichen wird.
Der Primer 1 kann vorzugsweise aus der 1.
Klammersequenz der Rhinoviren, der Primer 2
vorzugsweise aus der 2. Klammersequenz der Rhinoviren
abgeleitet sein. Vorzugsweise wird bei dem
erfindungsgemäßen Verfahren in der Stufe a) der Primer
2 verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders geeignet,
Rhinoviren, vorzugsweise humane Rhinoviren zu
charakterisieren. Hierbei sind als Primer 1 die
Oligonukleotide der Sequenz 161 bis 178 des HRV2 und
als Primer 2 die Oligonukleotide komplementär zur
Sequenz 531 bis 544 des HRV2 vorzugsweise zu
verwenden.
Als besonders geeignete Restriktionsenzyme für die
Charakterisierung von Rhinoviren haben sich BanII,
HindIII, RsaI, EcoRI, BglII, PvuII, DraIII und HinPI
herausgestellt.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich zur
Typisierung von Viren, insbesondere von Rhinoviren,
besonders bevorzugt von humanen Rhinoviren verwenden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein
Kit zur Charakterisierung von Viren, dadurch
gekennzeichnet, daß er Primer aus dem Bereich der
Sequenzidentitäten sowie spezifische Restriktionsenzyme
enthält, wobei vorzugsweise der Primer 1 aus der 1.
Klammersequenz der Rhinoviren und der Primer 2 aus der
2. Klammersequenz der Rhinoviren abgeleitet ist.
Besonders bevorzugt ist ein Kit, der als Primer 1 ein
Oligonukleotid der Sequenz 161 bis 178 und als Primer
2 ein Oligonukleotid der Sequenz komplementär zur
Sequenz 531 bis 544 des HRV2 und die
Restriktionsenzyme BanII, HindIII, RsaI, EcoRI, BglII,
PvuII, DraIII und HinPI enthält.
Fig. 1 Polyacrylamidgelanalyse der PCR-Produkte.
Aliquote amplifizierter cDNA, die von einer
RNA erhalten wurde, die aus Rohlysat-
Präparationen (Serotypen 1B, 2, 49, 70 und
89) oder aus mit Rhinovirus infizierten
HeLa-Lysaten (Serotypen 1A und 14) isoliert
worden war. Die Serotypen sind am Kopf der
Banden angegeben; m: Marker-DNA; c:
Kontrolle mit aus nicht-infizierten
HeLa-Zellen isolierter RNA. Die Größen (in
Basenpaaren) sowohl von drei
Markerfragmenten als auch vom amplifizierten
Fragment sind angegeben.
Fig. 2 Verwandtschaft zwischen humanen Rhinovirus-
Serotypen in der 5′-nicht-kodierenden Region.
Die HRV2 Sequenz von Nukleotid 241 bis 490
ist dargestellt. Unterschiede zwischen
dieser und der HRV49 Sequenz (bestimmt aus
den Nukleotiden korrespondierend zu 241 bis
482) sind unterhalb angegeben.
Die HRV1B Sequenz von Nukleotid 203 bis 412
ist dargestellt. Unterschiede zwischen
dieser und der HRV1A Sequenz (aus der
entsprechenden Region bestimmt) sind
unterhalb angegeben.
Ein Strich markiert Deletion eines
Nukleotids. Restriktionsstellen, die
verwendet wurden, sind angegeben.
Fig. 3 Polyacrylamidgelanalyse der durch
Restriktionsenzymverdau der amplifizierten
DNA erhaltenen Fragmente.
Die amplifizierten DNA Fragmente wurden mit
den in Tabelle 1 angegebenen Enzymen
verdaut. Die Serotypen und Enzyme sind
oberhalb der einzelnen Banden angegeben.
Abkürzungen : Ba: BanII, Bg: BglII; Dr:
DraIII; Ec: EcoRI,; Hi: HinPI; Hd: HindIII;
Pv: PvuII; Rs: RsaI; m: Marker. Die Größen
der Marker sind in Basenpaaren angegeben.
Sämtliche Virus Serotypen wurden von der ATCC erhalten
und plaque-gereinigt. HeLa Zellen (Stamm Ohio) wurden
in 150 cm2 T-Kolben kultiviert und bei einer MOI von
ungefähr 1 wie bei Skern et al. (1984) beschrieben mit
den HRV-Stämmen infiziert. Die Menge an Virus betrug
üblicherweise 109 PFU in 3 jml Medium. Nach zwei
Zyklen Frieren/Tauen zur Zellyse wurde das Medium von
Zelltrümmern durch niedrigtourige Zentrifugation
geklärt. Das Virus wurde mit Polyethylenglykol 6000
(PEG) aus dem Medium konzentriert und in 1 ml Phosphat
gepufferter Salzlösung resuspendiert. Bei Verwendung
von infizierten HeLa-Lysaten wurde auf die
PEG-Präzipitation verzichtet.
Die RNA wurde durch Behandeln von 0,1-0,5 ml der
viralen, PEG konzentrierten Suspension oder von 0,5 ml
nicht-konzentrierter Suspension mit 1% SDS und 10 mM
EDTA hergestellt. Nach der Extraktion mit
Phenol/Chloroform wurden 2 µg der Carrier tRNA
zugegeben und die RNA mit Ethanol präzipitiert. Die
cDNA wurde hergestellt, indem die gesamte
RNA-Präparation, 10 pmol des Primer 2 und 10 Einheiten
Reverse Transkriptase (Super RT, Anglian Biotechnology)
in 20 µl Endvolumen entsprechend der Vorschriften des
Herstellers eingesetzt wurde. Anfänglich wurde die cDNA
durch Extraktion mit Phenol/Chloroform und
Ethanol-Präzipitation gereinigt; in späteren
Experimenten wurde die cDNA-Mischung direkt für die
"Polymerase Chain Reaction" verwendet.
Die "Polymerase Chain Reaction" (PCR) wurde in einem
Gesamtvolumen von 50 µl mit 10 µl der
cDNA-Präparation, jeweils 100 pmol Primer 1 und Primer
2, 0,4 mM aller vier dNTPs, 2 Einheiten von Thermus
aquaticus DNA Polymerase (Cetus) im Puffer der Firma
Cetus Corp., unter Verwendung des von Torgersen et al.
(1989) beschriebenen Apparates für 30 Zyklen bei einer
Einstellung von 92°C (2 Min.), 40°C (3 Min.) und 70°C
(3 Min.) durchgeführt. 10 µl der Reaktionsmischung
wurden direkt auf einem 6% Polyacrylamid-Gel (Maniatis
et al., 1982) analysiert. Restriktionsanalysen wurden
an Aliquoten der amplifizierten DNA, unter Verwendung
der in Tabelle 1 gezeigten Enzyme durchgeführt; die
Produkte wurden auf 6% Polyacrylamid-Gel analysiert.
Zur Sequenzierung wurde die Dideoxy Sequenzierungs
methode nach Sanger verwendet (Sanger et al., 1977).
Die nach der PCR erhaltene doppelsträngige DNA wurde
von dem Polyacrylamid-Gel elektroeluiert und unter
Verwendung der Primer 1 und 2 und der modifizierten T7
Polymerase (Pharmacia) entsprechend der
Herstellungsvorschriften sequenziert. Die Computeranalyse
der DNA-Sequenzen wurde unter Verwendung der von Isono
modifizierten Staden-Programme durchgeführt (Isono,
1982).
Ein Vergleich der Nukleotidsequenzen von HRVlB (Hughes
et al., 1988), HRV2 (Skern et al., 1985) und HRV89
(Duechler et al., 1987) zeigte Identität der Regionen
zwischen den Nukleotiden 161 und 181 bzw. 531 und
553 (die Numerierung erfolgte gemäß HRV2, Skern et al.,
1985). Überraschenderweise weisen die vier Serotypen
untereinander signifikante Unterschiede zwischen diesen
Regionen identischer Klammersequenzen auf. Die sich
hieraus ergebenden charakteristischen Unterschiede im
Restriktionsmuster jedes Serotyps, die auch in den von
diesen Regionen ausgehenden amplifizierten Fragmenten
vorhanden sind, werden erfindungsgemäß verwendet, um
die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe zu lösen.
Hierzu wurden zwei Primer synthetisiert:
Oligonukleotid-Primer 1 (Sequenz 161 bis 178:
CAAGCACTTCTGTTTCCC) und Oligonukleotid-Primer 2
(komplementär zu 531 bis 544: ACTACTTTGGGTGT). Die
cDNA wurde aus viraler RNA hergestellt und unter
Verwendung der Primer 1 und 2 wie oben beschrieben
amplifiziert.
Fig. 1 zeigt die Polyacrylamidgelanalyse eines
Amplifikationsexperiments, bei dem 7 verschiedene HRV-
Serotypen verwendet wurden. In allen Fällen wurde ein
DNA-Fragment von annähernd 380 bp generiert (das
entspricht dem Abstand zwischen den beiden Primern).
Damit konnte gezeigt werden, daß die Primer in der Lage
sind, auch an die cDNA sowohl des HRV1A, als auch HRV49
und HRV70 zu binden, implizierend, daß die
entsprechenden Sequenzen auch in diesen Serotypen
präsent sind. Da keine Sequenzinformationen von HRV1A,
HRV49 und HRV70 zur Verfügung standen, wurde die
DNA-Sequenz aus den amplifizierten Fragmenten von HRV1A
und HRV49 bestimmt, um zu ermitteln, ob
charakteristische Restriktionsstellen präsent sind. 241 bp
der Sequenz für HRV49 und 210 bp für HRV1A wurden
erhalten. Eine Computer-Analyse ergab, daß die Sequenz
des HRV49 der des HRV2 und die Sequenz des HRV1A der
des HRV1B eng verwandt ist (um die Genauigkeit der
HRV49 Sequenz zu verbessern, wurden die
Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung der Primer 1
und 2 an einem Plasmid durchgeführt, das die HRV2
5′-nicht kodierende Region enthielt, so daß die
Unterschiede eindeutig feststellbar waren). Die
Unterschiede zwischen den Sequenzen von HRV2 und HRV49
und zwischen denen von HRV1A und HRV1B sind in den
Fig. 2a bzw. 2b dargestellt. Insgesamt konnten 15
Basenaustausche und 2 Deletionen zwischen HRV2 und
HRV49 innerhalb der 241 sequenzierten Basenpaare
beobachtet werden. Bei den 210 bp, die von HRV1A und
HRV1B analysiert wurden, konnten 9 Basenaustausche und
1 Insertion beobachtet werden. Diese Veränderungen
führten in beiden Fällen zur Bildung oder zum Verlust
einer Restriktionsschnittstelle (wie in Fig. 2
dargestellt, ging bezogen auf HRV2 im HRV49 eine
HindIII-Stelle verloren und eine DraIII-Stelle wurde
geschaffen). Mit Hilfe dieses
Amplifikationsexperimentes konnte also gezeigt werden,
daß für jeden Serotyp charakteristische Schnittstellen
ausgewählt werden können.
Um die erfindungsgemäße Aufgabe zu lösen, wurden solche
Restriktionsenzyme ausgewählt, mit denen die Serotypen
zweifelsfrei identifiziert werden können; Tabelle 1
zeigt die ausgewählten Enzyme zusammen mit den
Fragmentstellen. Für HRV1A und HRV49 wurde unterstellt,
daß in dem unbekannten Bereich keine weiteren Stellen
für die entsprechenden Enzyme vorliegen. Ein Vergleich
der DNA-Fragmente zeigte, daß die Fragmente von HRV2,
HRV49 und HRV89 für das Enzym BanII eine Schnittstelle
aufweisen (Fig. 3a), die Fragmente von HRV1A, HRV1B und
HRV14 jedoch nicht (Fig. 3b). Vorzugsweise lassen sich
durch die Verwendung dieses Enzyms die Serotypen in
zwei Gruppen aufteilen: Um die Identifizierung der
Serotypen zu vereinfachen, wurden die amplifizierten
Fragmente jedes Serotyps mit BanII geschnitten und die
Produkte auf Polyacrylamidgelen analysiert. Auch die
unterschiedlichen Fragmentlängen, die bei HRV2 und
HRV89 erhalten wurden, erlauben die Identifizierung
dieser Serotypen wie in Fig. 3a gezeigt ist. Die
charakteristische HindIII-Stelle des HRV2 sowie die
Rsa-Stelle des HRV89 bestätigten die Identifizierung
(das 96 bp RsaI-Fragment war zu schwach, um auf diesem
Gel gesehen zu werden). HRV2 und HRV49 konnten durch
die Abwesenheit der HindIII-Stelle im HRV49
unterschieden werden.
Die Serotypen, die keine BanII-Stelle aufweisen (Fig.
3b), wurden folgendermaßen identifiziert: HRV14 wurde
über die EcoRI-Stelle identifiziert (der Verdau
erfolgte teilweise). HRV1B und HRV1A haben beide eine
BglII-Stelle an derselben Position; hier erlaubte die
Präsenz einer HinPI-Stelle im HRV1A die eindeutige
Unterscheidung der beiden Serotypen. Da nur zwei
Fragmente mit HinPI erhalten wurden, muß die in Fig. 2
markierte Stelle tatsächlich die einzige in dem
amplifizierten Fragment sein.
Bruce, C.B., Al-Nakib W. Tyrell, D.A.J. and Almond,
J.W. (1988). Synthetic oligonucleotides as diagnostic
probes. Lancet, 8601, 53.
Callahan, P.L., Mizutani, S., and Colonno, R.J. (1985).
Molecular cloning and complete sequence determination
of RNA sequence of human rhinovirus type 14. Rroc.
Natl. Acad. Sci, U.S.A., 82, 732-736.
Cameron, G.N. (1988). The EMBL data library. Nucleic
Acids Res., 16, 1865-1867.
Cann, A., Stanway, G., Hughes, P.J., Evans, D.M.A.,
Schild, C.C. and Almond, J.W. (1984). Reversion to
neurovirulence of the live-attenuated Sabin type 3 oral
poliovirus vaccine. Nucleic Acids Res., 12, 7787-7792.
Cooney, M.K., Fox, J.P. and Kenney, G.E. (1982).
Antigenic groupings of 90 rhinovirus serotypes. Infect.
Imm., 37, 642-647.
Duechler, M., Skern, T., Sommergruber, W., Neubauer,
Ch., Gruendler, P., Fogy, I., Blaas, D. and Kuechler,
E. (1987). Evolutionary relationships within the human
rhinovirus genus; comparison of serotypes 89, 2 and 14.
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 1605-2609.
Gama, R.E., Hughes, P.J., Bruce, C.B. and Stanway, G.
(1988). Polymerase chain reaction amplification of
rhinovirus nucleic acids from clinical material.
Nucleic Acids Res., 16, 9346.
Hamparian, V.V., Colonno, R.J., Cooney, M.K., Dick,
E.C., Gwaltney J.M., Jr. Hughes, J.H., Jordan, W.S.,
Kapikian, A.Z., Mogabgab, W.J., Monto, A., Philips,
C.A., Rückert, R.R., Schieble, J.H., Stott, E.J. and
Tyrell, D.A.J. (1987). A collaborative report:
Rhinoviruses - Extension of the numbering system from
89 to 100. Virology, 159, 191-192.
Hughes, P.J., North, C., Jellis, C.H., Minor, P.D. and
Stanway, G. (1988). The nucleotide sequence of human
rhinovirus 1B: molecular relationships within the
rhinovirus genus. J. Gen. Virol., 69, 49-58.
Isono, K. (1982). Computer programs to analyse DNA and
amino acid sequence data. Nucleic Acids Res., 10,
85-89.
Kellner, G., Popow-Kraupp, T., Kundi, M., Binder, C.,
Mallner H. and Kunz, C. (1988). Contribution of
rhinoviruses respiratory infections in childhood: a
prospective study in a mainly hospitalized infant
population. J. Med. Virol., 25, 455-469.
Maniatis, T., Fritsch, F. and Sambrook, J. (1982).
Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring
Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York.
Rivera, V.M., Welsh, J.D. and Maizel, J.V. (1988).
Comparative sequence analysis of the 5′non-coding
region of enteroviruses and rhinoviruses. Virology 165,
42-50.
Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, St.J.,
Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. and Erliche, H.A.
(1988). Primer directed enzymatic amplification of DNA
with a thermostable DNA polymerase. Science 239,
487-491.
Sanger, F., Nickley, S. and Coulson, A.R. (1977). DNA
sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463-5467.
Skern, T., Sommergruber, W., Blaas, D., Pieler, Ch. and
Kuechler, D. (1984). Relationship of human rhinovirus
strain 2 and poliovirus as indicated by comparison of
the polymerase gene regions. Virology 136, 125-132.
Skern, T., Sommergruber, W., Blaas, D., Gruendler, P.,
Fraundorfer, F., Pieler, C., Fogy, I. and Kuechler, B.
(1985). Human Rhinovirus 2: complete nucleotide
sequence and proteolytic processing signals in the
capsid protein region. Nucleic Acids Res., 13,
2111-2126.
Stanway, G., Hughes, P.J., Mountford, R.C., Minor, P.D.
and Almond, J.W. (1984). The complete nucleotide
sequence of a common cold virus: human rhinovirus 14.
Nuc. Acids. Res., 12, 7859-7875.
Stott, E.J. and Killington, R.A. (1972). Rhinoviruses.
Ann. Rev. Microbiol., 26, 503-525.
Torgersen, H., Blaas, D. and Skern, T. (1989). Low cost
apparatus for primer-directed DNA amplification. Anal.
Biochem., 176, 33-35.
Claims (10)
1. Verfahren zur Charakterisierung von Viren, dadurch
gekennzeichnet, daß
- a) die RNA des Virus in die cDNA überführt wird,
- b) die cDNA in Gegenwart der Primer 1 und 2 aus dem Bereich der Sequenzidentitäten mit Hilfe der "Polymerase Chain Reaction" amplifiziert wird,
- c) die amplifizierte DNA mit Hilfe verschiedener Restriktionsenzyme kartiert wird und
- d) das erhaltene Restriktionsmuster mit dem Restriktionsmuster bekannter Viren verglichen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der Primer 1 aus der 1. Klammersequenz der
Rhinoviren und der Primer 2 aus der 2.
Klammersequenz der Rhinoviren abgeleitet ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß der Primer 1 die Sequenz 161 bis 178 des HRV2
und der Primer 2 eine Sequenz komplementär zur
Sequenz 531 bis 544 des HRV2 aufweist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß in der Stufe a) der
Primer 2 verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die zu
charakterisierenden Viren Rhinoviren, vorzugsweise
humane Rhinoviren sind.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß die Restriktionsenzyme BanII, HindIII, RsaI,
EcoRI, BglII, PvuII, DraIII und HinPI verwendet
werden.
7. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche
1 bis 6 zur Typisierung von Viren, insbesondere von
Rhinoviren, besonders bevorzugt von humanen
Rhinoviren.
8. Kit zur Charakterisierung von Viren, dadurch
gekennzeichnet, daß er Primer aus dem Bereich der
Sequenzidentitäten sowie spezifische
Restriktionsenzyme enthält.
9. Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
der Primer 1 aus der 1. Klammersequenz der
Rhinoviren und der Primer 2 aus der 2.
Klammersequenz der Rhinoviren abgeleitet ist.
10. Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er
als Primer 1 ein Oligonukleotid der Sequenz 161
bis 178 und als Primer 2 ein Oligonukleotid der
Sequenz komplementär zur Sequenz 531 bis 544 des
HRV2 und die Restriktionsenzyme BanII, HindIII,
RsaI, EcoRI, BglII, PvuII, DraIII und HinPI enthält.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19904020028 DE4020028A1 (de) | 1989-06-24 | 1990-06-23 | Charakterisierung von viren |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3920754 | 1989-06-24 | ||
DE19904020028 DE4020028A1 (de) | 1989-06-24 | 1990-06-23 | Charakterisierung von viren |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE4020028A1 true DE4020028A1 (de) | 1991-01-03 |
Family
ID=25882311
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19904020028 Withdrawn DE4020028A1 (de) | 1989-06-24 | 1990-06-23 | Charakterisierung von viren |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE4020028A1 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4433194A1 (de) * | 1994-09-17 | 1996-03-21 | Meier Ewert Herbert Univ Prof | Technik zur molekularbiologischen Typisierung von Virusvarianten |
DE19829034A1 (de) * | 1998-06-30 | 2000-01-05 | Eberhard Manz | Verfahren zum Nachweis der Abstammung und/oder zur Identifizierung von Tieren oder von biologischem Material |
-
1990
- 1990-06-23 DE DE19904020028 patent/DE4020028A1/de not_active Withdrawn
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4433194A1 (de) * | 1994-09-17 | 1996-03-21 | Meier Ewert Herbert Univ Prof | Technik zur molekularbiologischen Typisierung von Virusvarianten |
DE19829034A1 (de) * | 1998-06-30 | 2000-01-05 | Eberhard Manz | Verfahren zum Nachweis der Abstammung und/oder zur Identifizierung von Tieren oder von biologischem Material |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69019795T2 (de) | Verfahren zur Feststellung der Empfindlichkeit von HIV-1 für Zidovudine und dazu geeignete Oligonukleotide. | |
DE68928222T2 (de) | 4 Selbstfortsetzendes System für Sequenzreplikation | |
DE69833160T2 (de) | Amplifizierung und Detektion von HIV-1 und/oder HIV-2 | |
DE69016079T2 (de) | Methode zur Extraktion, Amplifikation und zum Nachweis einer Nukleinsäure aus einer Fraktion mononuklearer Zellen von peripherem Blut. | |
DE3852177T2 (de) | Transkriptionsbasierte nukleinsäure-verstärkungs/nachweissysteme. | |
DE69026449T2 (de) | Verfahren zur Diagnose und zur Amplifikation, das das Problem einer Fehlpaarung zwischen Primer und Zielsequenz am 3'-Ende des Primers überwindet | |
DE69011722T2 (de) | Diagnoseausrüstung, Primerzusammensetzung und ihre Verwendung zur Erwiderung oder zum Nachweis von Nukleinsäuren. | |
DE60030811T2 (de) | Verfahren zur Ampifizierung von RNA | |
DE69434688T2 (de) | Diagnostischer nachweis von rna und reagentiensätze unter verwendung binärer rna proben und einer rna-abhängigen rna ligase | |
EP2446054B1 (de) | Verfahren zur amplifikation von dna unter verwendung von tetraethylenglykol | |
EP1389242B1 (de) | Nachweis und differenzierung von mikroorganismen der spezies yersinia pestis/yersinia pseudotuberculosis | |
AT409383B (de) | Verfahren zur detektion und quantifizierung von nukleinsäuren in einer probe | |
Nanda et al. | Universal virus detection by degenerate-oligonucleotide primed polymerase chain reaction of purified viral nucleic acids | |
EP1124993A2 (de) | Neue primer und sonden zum nachweis von hiv | |
EP0405376B1 (de) | Typisierung humaner Rhinoviren | |
DE102015012691A1 (de) | Verfahren zum quantitativen Nachweis von Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus und Vibrio cholerae | |
DE4020028A1 (de) | Charakterisierung von viren | |
CN114807453B (zh) | 一组针对新冠病毒omicron株S基因的特异性引物组及其应用 | |
KR102267326B1 (ko) | 코로나 바이러스 진단방법 및 진단용 키트 | |
Giomi et al. | Heterogeneity of the polyribocytidilic acid tract in aphthovirus: changes in the size of the poly (C) of viruses recovered from persistently infected cattle | |
DE10030376A1 (de) | Neues Verfahren zum Auffinden neuer Wirkstoffe | |
DE60124984T2 (de) | Verfahren zum kontrollieren der qualität eines abgeschwächten varicella phasen-impfstoffes | |
Takayama et al. | New method of differentiating wild-type varicella-zoster virus (VZV) strains from Oka varicella vaccine strain by VZV ORF 6-based PCR and restriction fragment length polymorphism analysis | |
DE60011789T2 (de) | Verfahren zur Herstellung einer qualitätsgesicherten biologischen Probe und Zusammensetzung, welche diese enthält | |
CN110157836B (zh) | 一种检测ibrv和bvdv的引物、探针及方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8141 | Disposal/no request for examination |