DE4433194A1

DE4433194A1 - Technik zur molekularbiologischen Typisierung von Virusvarianten

Info

Publication number: DE4433194A1
Application number: DE4433194A
Authority: DE
Inventors: Manfred Dr Rer Nat Marschall; Herbert Prof Dr Me Meier-Ewert
Original assignee: MEIER EWERT HERBERT UNIV PROF
Priority date: 1994-09-17
Filing date: 1994-09-17
Publication date: 1996-03-21
Anticipated expiration: 2014-09-18
Also published as: DE4433194C2

Description

Einleitung

Virusvarianten zeichnen sich durch geringfügige, aber häufig charakteristische und stabile Veränderungen in ihrer Genomsequenz aus. Das sichere Ansprechen einer bestimmten Variante, bzw. die Unterscheidung eines homogenen Isolats von genomischen Mischformen ist oft molekularbiologisch aufwendig. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) bietet die Möglichkeit eines empfindlichen Tests in kurzer Zeit. Ausschlaggebend für eine typspezifische Reaktion nach dem Alles-oder-Nichts-Gesetz ist das exakte Positionieren von Reaktionsprimern an kritische Sequenzstellen (5).

Aufgabenstellung

Die beiden Influenzavirus-Isolate (1, 2) C/AA-wt (Influenza C/Ann Arbor/1/50 Wildtyp) und C/AA-pi (Influenza C/Ann Arbor/1/50 persistierende Variante) unterscheiden sich an den beiden Nukleotidpositionen 871 und 872 ihres Oberflächenglykoproteins (Aminosäure 284) durch eine invariabel manifestierte Doppelpunktmutation (3, 4). Dieser Marker sollte derart in ein PCR- System integriert werden, daß die erfolgreiche Amplifikation direkt und absolut vom jeweiligen Sequenztyp abhängt. Dabei sollte das erhaltene Reaktionsmuster die Beurteilung in Typ A, Typ B oder Mischung A/B erlauben.

Lösungsweg

Für die Amplifikation von DNA-Matrizen durch die Taq-DNA-Polymerase (5) sind kurze DNA- Oligonukleotide als Primer (Starter) nötig. Deren äußere Endpunkte (3′-Position) dienen als unmittelbare Initiierungsstellen für den enzymatischen Prozeß. Schon bei geringfügigen Sequenzvariationen an genau diesen Endpunkten ist die gesamte Reaktionskaskade in Frage gestellt, so daß unter optimalen Reaktionsbedingungen (Annealing-Temperaturen etc.) eine qualitative Unterscheidung der Ausgangsviren über die Amplifikationsprodukte erfolgen kann.

Beschreibung der Erfindung

Aminosäure Nr. 284 des Oberflächenglycoproteins HEF (Genomsegment 4) eines als C/AA-pi bezeichneten Influenzavirus-Isolats ist durch eine Doppelpunktmutation zweier benachbarter Nukleotide von Threonin zu Leucin verändert. Darauf basierend wurden die 3′- Endpunkte von zwei alternativen PCR-Primern genau auf diesen Doppelaustausch gerichtet, so daß ein stammspezifisches Reaktionsprinzip erzielt werden konnte (Abb. 1). Verschiedene nicht-stammspezifische Hin- und Rückprimer (d. h. in messenger RNA- bzw. viraler RNA- Orientierung) wurden außerdem als Amplifikationspartner und als Kontrollen verwendet:
C/4-890/2(wt), ^5′TCACATTGCATTATTGGGGT^3′;
C/4-890/2(pi), ^5′TCACATTGCATTATTGGGAG^3′;
C/4-22/1, ^5′TTGAGCTCTAGATGTTTTTCTCATTACTCTIGATGTTGGGCC^3′;
C/4-510/1, ^5′ACATTGCATGAGCTTGG^3′;
C/4-860/2, ^5′TTCCCTGTGTAAGGTG^3′.

(Die Primer-Nomenklatur bezieht sich auf die Segment-Nr. 4, auf die erste 5′-Nukleotidposition und auf die Orientierung, d. h. 1 für mRNA- und 2 für vRNA-Orientierung.)

Die Spezifität und Verläßlichkeit des Primers C/4-890/2(pi) wurde getestet (Abb. 2). Dazu wurden RNA-Präparationen aus Virionen und aus infizierten Zellen verwendet. In beiden Fällen ergaben sich ausschließlich mit der Virusvariante C/AA-pi positive Signale. Ein Kontollprimerpaar (nicht-stammspezifisch) bestätigte dieses Prinzip.

Die Ausschließlichkeit in ihrem Reaktionsmuster wurde für die stammspezifischen Primer durch Mischungsexperimente ermittelt (Abb. 3). Hierzu wurden die RNAs der Virustypen C/AA- wt und C/AA-pi revers transkribiert und die resultierenden cDNAs in den angegebenen Verhältnissen gemischt. Je eine Hälfte aller Ansätze wurde mit wt-spezifischem Primer, die andere Hälfte mit pi-spezifischem Primer in der PCR zur Reaktion gebracht. Es ergab sich ein Reaktionsmuster, das klar die beiden ungemischten Ansätze als solche identifiziert. Alle Mischungen zeigten zu einem gewissen Grad Signale mit beiden Primertypen. Das heißt, homogene Ausgangsmaterialien können qualitativ von Mischformen, bzw. von genetisch instabilen Sequenzen unterschieden werden.

Die Anwendbarkeit dieses Testsystems für verschiedene Virusstudien wurden exemplarisch an Passagierungsexperimenten mit Influenza C/Ann Arbor/1/50-Virus untersucht. Wildtyp-Virus und die hier behandelte persistierende Variante wurden aus verschiedenen Langzeit-Passagen in Bruteiern, bzw. Zellkulturen geerntet. Jede dieser Linien wurde zur RNA- Extraktion, zur reversen Transkription und zur stammspezifischen PCR unter optimierter Annealing-Temperatur bei 55°C verwendet. Die erhaltenen Amplifikationssignale zeigen eine eindeutige und ausschließliche Reaktivität mit dem zugewiesenen Primer. Folglich sind die genomischen Virussequenzen über die Passagierungen konserviert und können anhand dieser Methodik auf molekularer Ebene charakterisiert werden.

Abb. 1: Nukleotidsequenz-Abschnitte auf dem Segment 4 von Influenza C-Wildtyp (C/AA-wt) oder von persistierendem Virus (C/AA-pi), jeweils komplementär zu den gewählten Primern (eingerahmt). Die Positionen sind in der mRNA-Orientierung angegeben und Sequenzaustausche zwischen den beiden Viren wurden schattiert. Zu beachten wäre, daß die beiden Primer bis auf die letzten zwei 3′-Nukleotide identisch sind.

Abb. 2: Spezifität des pi-Virus-gerichteten Primers C/4-890/2(pi). RNA wurde von Influenzavirionen aus infektiösen allantoischen Flüssigkeiten (1 µg pro Reaktion) und aus infizierten MDCK-Zellen (5 µg pro Reaktion) isoliert und einer reversen Transkription mittels dem Influenza-Universalprimer für cDNA unterworfen. Die nachfolgende PCR wurde in Parallelansätzen durchgeführt (Annealing-Temperatur 50°C), entweder mit einem stammspezifischen Primerpaar [Spuren 2: C/4-890/2(pi) und C/4-510/1] oder einem nicht diskriminativen Primerpaar [Spuren 1: C/4-860/2 und C/4-510/1]. Die erwarteten Elektrophoresegrößen sind rechts notiert.

Abb. 3: Stamm-spezifische PCR zur Untersuchung von artifiziellen Virusmischungen. Virion RNAs (C/AA-wt und C/AA-pi) wurden unabhängig voneinander isoliert und dann in abgestuften Mischungsverhältnissen, wie angegeben, getestet. 1 µg jeder viralen RNA-Kombination wurde revers transkribiert (Influenza-Universalprimer). Jede so erhaltene cDNA wurde zweigeteilt und in die PCR eingesetzt (Annealing-Temperatur 50°C), und zwar unter Verwendung von Wildtyp spezifischen [Ws: C/4-890/2(wt) und C/4-519/1] oder Persistenz-spezifischen Primern [ps: C/4- 890/2(pi) und C/4-519/1]. Die jeweiligen Produkte von 381 Bp sind auf Agarosegelausschnitten dargestellt.

Abb. 4: Demonstration der genetischen Stabilität und der Reinheit von oftmals passagierten Virusisolaten. RNAs, wie für die universelle, reverse Transkription verwendet, wurde aus verschiedenen Quellen gewonnen: C/AA-wt oder C/AA-pi - Influenza C/Ann Arbor/1/50 Wildtyp-virus oder persistierende Variante; c - Zellkultur-(cell) gewachsen; e - Brutei-(egg) gewachsen; c/1 - Zell-gewachsen während primärer Persistenz in der MDCK-pi Kultur (Hundenierenzellen); e/1 - Ei-gewachsen durch Inokulation von MDCK-pi Kulturüberstand in bebrühtete Hühnereier; e/2 - Zell-gewachsen während sekundärer Persistenz in der Wi38-pi Kultur (humane Lungenzellen); e/2 - Ei-gewachsen durch Inokulation von Wi38-pi Kulturüberstand. Die stamm-spezifische PCR-Amplifikation (Annealing-Temperatur 55°C) erfolgte mit den Primerpaaren Ws [C/4-890/2(wt) und C/4-22/1] oder ps [C/4-890/2(pi) und C/4- 22/1]. Ein 880-Bp Signal wurde im Vergleich zu einem Standardmarker ermittelt (*, Boehringer Mannheim DNA molecular weight marker no. VI).

Referenzen

(1) Camilleri, J. and Maassab, H. (1988) Characteristics of a persistent infection in Madin- Darby Canine Kidney cells with influenza C virus. Intervirology 29, 178-184.
(2) Marschall, M., Böswald, C., Schuler, A., Youzbashi, E. ∂ Meier-Ewert, H. (1993) Productive and non-productive phases during long-term persistence of influenza C virus. J. Gen. Virol. 74, 2019-2023.
(3) Marschall, M., Herrler, G., Böswald, C., Foerst, G. and Meier-Ewert, H. (in press) Persistent influenza C virus possesses distinct functional properties due to a modified HEF glycoprotein. J. Gen. Virol.
(4) Marschall M., Herrler G., Böswald C., Schuler A. and Meier-Ewert H.: Specific changes in the surface glycoprotein of influenza C virus are associated with a long term persistent phenotype. Molecular events in microbial pathogenesis, Santa Fe USA - New Mexico (1994) abstract
(5) Rolfs, A., Schuller, A., Finckh, U. and Weber-Rolfs, I. (eds) PCR: Clinical diagnostics and research. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg 1992.

Claims

1. Eine Methode, die es erlaubt, nah verwandte Virusisolate (Varianten) aufgrund geringfügiger Änderungen ihrer Genomsequenz zu identifizieren.

2. Eine Methode, nach Anspruch 1, die sich die Alles-oder-Nichts-Reaktivität der Polymerasekettenreaktion (PCR, d. h. die synthetische Amplifikation von Nukleinsäuren) für eine qualitative Interpretation zueigen macht.

3. Eine Methode nach Anspruch 2, die auf der funktionell wichtigen Komplementarität von Starteroligonukleotiden (PCR-Primern) zum Virusgenom beruht.

4. Eine Methode nach Anspruch 3, die unter sehr spezifisch angepaßten Reaktionsbedingungen (Primerlokalisation, Konzentrationen, Temperaturen) die Unterscheidung einer Genomsequenz von verwandten Formen an nur zwei benachbarten Nukleotiden erlaubt.

5. Ein Anspruch auf die Nutzung der ermittelten Primer und viralen Sequenzpositionen, die einer Ausführung von Techniken nach Anspruch 1 bis 4 zugrunde liegen.