DE60018926T2

DE60018926T2 - "cort"-pcr assay zur unterscheidung von endogener reversen transkriptase aktivität in eukaryontischen zellen von einer kontamination durch infektiöse retroviren

Info

Publication number: DE60018926T2
Application number: DE60018926T
Authority: DE
Inventors: Scott Goebel; Maurice Harmon; Jim Tartaglia; William Lapps; Francois Pelloquin; W. Dennis TRENT
Original assignee: Aventis Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 1999-06-14
Filing date: 2000-06-14
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2020-06-15
Also published as: US6465171B1; EP1185703B1; CA2376535A1; EP1185703A2; US20030008280A1; WO2000077243A2; CA2376535C; JP2003517813A; DE60018926D1; WO2000077243A3; ATE291640T1; AU785093B2; AU5611500A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft den Nachweis des Vorliegens der enzymatischen Aktivität von reverser Transkriptase in eukaryontischen Zell-Linien. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Unterscheidung von endogener reverser Transkriptase-Aktivität in Vogelzell-Linien, die als Substrate für die Herstellung von biologischen Produkten einschließlich viraler Vakzine verwendet werden von endogenen infektiösen Retroviren.
ZUSAMMENFASSUNG DES STANDS DER TECHNIK
Von den üblicherweise verwendeten viralen Vakzinen, die in den Vereinigten Staaten amtlich zugelassen sind, werden Masern, Mumps, Gelbfieber und Influenza in Zellen des Huhns, die von embryonalen Eiern abgeleitet sind, hervorgerufen (Plotkin and Mortimer (1994) Vaccines, 2. Ausgabe, Philadelphia, PA, Saunders). Weiter können Zellsubstrate zur Herstellung einer Vielzahl von biologischen Produkten wie Vakzine für Hepatitis A, Polio und Tollwut sowie Proteine, Glykoproteine und Lipoproteine verwendet werden. Die Verwendung von lebenden Zellsubstraten für die Herstellung von lebend attenuiertem Virus bietet die Möglichkeit einer Infektion von diesen Zelllinien durch weitere (sekundäre) Retroviren. Diese lebend attenuierten Vakzine können als Vehikel für die Übertragung von unterschiedlichen Arten von Mikroorganismen oder anderen unerwünschten Agenzien wirken. Das Risiko einer versehentlichen Übertragung ist besonders bei lebend attenuierten Virus-Vakzinen hoch, da diese keinem Inaktivierungsverfahren unterzogen werden können und die meisten von ihnen in den Menschen injiziert werden und dadurch nicht spezifische Immunschutzmechanismen umgehen. Um aus diesem Grund die Sicherheit von Vakzinen für eine Verwendung in Menschen sicherzustellen, wurde die Verwendung der Zellsubstrate für die Vakzin-Herstellung auf das Vorliegen von replikationskompetenten Retroviren getestet, die während einer Immunisierung auf menschliche Wirte übertragen werden könnten (WHO Technical Report Series, 1994). Bei Vakzinen, die in kontinuierlichen Zell-Linien von einem beliebigen Ursprung hergestellt werden, ist es für die Fachleute auf dem Gebiet erforderlich, dass diese keine RT-Aktivität aufweisen (Boni et al., (1996) Clin. & Diag. Virol. 5: 43–53).
Vogelzelllinien werden häufig für die Herstellung von Vakzinen verwendet. Es wurde gezeigt, dass Vogel-Retroviren, die in die ALSV-Untergruppe E klassifiziert wurden, in der Keimbahn als endogene Virus (ev)-Loci aufrechterhalten werden und auf die Nachkommen in Mendel'scher Art übertragen werden (16). Es wurde gezeigt, dass eine Brut von Hühnern, die gegenüber endogenen Viren der ALSV-Untergruppe E resistent sind (z.B. Hühner der Linie 0) und daher keine ALV-(ev)-Loci aufweisen, andere Keimbahnsequenzen besitzen, wobei einige von ihnen vermutlich Überreste von ehemaligen proviralen Genomen sind. Eine andere Familie von endogenen Vogel-Retroviren von Interesse wird als (EAV-0) bezeichnet, da sie als erstes von dem (ev-)-Genom von Hühnern der Linie-0 isoliert worden sind (17–20). Es wurde gezeigt, dass die EAV-0-Loci in embryonalen Stammzellen, die von dem Vogelgenus Gallus abgeleitet sind, hochexprimiert werden (21). Darüber hinaus wurde bei diesen Partikeln gezeigt, dass sie RNA-Genome mit aktiver RT-Primer tRNA enthalten. Kürzliche Untersuchungen haben gezeigt, dass die Partikel aus der endogenen Retrovirusfamilie EAV-0 sehr wahrscheinlich zu einem großen Teil zu der Partikelassoziierten RT-Aktivität beitragen, die in Überständen von Fibroblasten von kultivierten Embryonen des Huhns gefunden wird (21). Sequenz-Analysen von mehreren unterschiedlichen EAV-0 Isolaten zeigten, dass eine große Deletion in dem env-Gen vorhanden ist, was die wissenschaftliche Grundlage und einen unmittelbaren Beweis für die Replikationsinkompetenz der Partikel-assoziierten RT-Aktivität in Zellkultur liefert (21).
Das Testen des Vorliegens von Retrovirus in Zellsubstraten wurde durchgeführt, indem untersucht wurde, ob eine reverse Transkriptase (RT)-Aktivität, basierend auf der RNA-abhängigen Synthese von DNA vorhanden ist (US-Patent Nr.3,755,086; Poiesz et al., (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 1415; Hoffmann et al., (1985) Virology 147: 326). Das RT-Enzym oder die RNA-abhängige DNA-Polymerase ist für die Etablierung des proviralen Zustands nach einer Infektion einer Zelle essentiell und stellt daher einen obligatorischen Bestandteil des Viruspartikels dar. Leider sind diese RT-Assays unabhängig von den verwendeten Matrizen und Primern relativ unempfindlich im Vergleich zu anderen zeitaufwändigeren Assays für den Nachweis von Retroviren wie beispielsweise Zellkultur- oder Antigen- Detektionsverfahren. Versuche, die gemacht wurden, um nicht charakterisierte Retroviren durch die Verwendung von Polymerasenkettenreaktion (PCR) mit Primern aus konservierten genomischen Regionen nachzuweisen, führten teilweise zum Erfolg, allerdings waren diese nicht in der Lage mehr als ein infektiöses Virus zur selben Zeit zu untersuchen, so dass der PCR-Test kein unbeschränkter Test ist. Eine PCR wird weiterhin nicht das Vorliegen eines unbekannten Virus oder Viren, die in der Region des für die PCR-Amplifikation verwendeten Genoms mutiert worden sind, nachweisen. PCR-Verfahren, die Primer für spezifische Retroviren einsetzen, können unter Umständen keine Mutanten-Variationen des Virus nachweisen, wenn die Mutation in einem Bereich vorhanden ist, an dem die Primer hybridisieren. Weiter können PCR-Verfahren, die Primer für spezifische Retroviren einsetzen, mehrmalige und zeitaufwändige Wiederholungen erforderlich machen, um alle möglichen retroviralen Spezies, welche die Substratzelle infizieren können, nachzuweisen. Daher sind sowohl der traditionelle RT-Assay als auch eine auf PCR basierte Detektion von Retrovirus basierend auf der Amplifikation von spezifischen Sequenzen beide relativ unempfindlich und können zeitaufwändig und schwierig sein.
Kürzlich wurden hochempfindliche auf PCR basierende Assays entwickelt, die RNA-abhängige DNA-Polymerase in einer Größenordung von 1 bis 10 Partikeln nachweisen können (Silver et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21: 3593-4; US-Patent Nr. 5,807,669). Ein solcher Assay, der als PBRT (PCR-basierende reverse Transkriptase) bezeichnet wird, wurde verwendet, um eine RT-Aktivität in einer Vielzahl von Proben nachzuweisen (Pyra et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51: 1544-8; Boni, et al. (1996) J. Med. Virol. 49: 23–28). Dieser Assay ist 10⁶–10⁷ mal empfindlicher als der konventionelle RT-Assay. Beispielsweise wurde PBRT verwendet, um eine RT-Aktivität in lebend attenuierten viralen Vakzinen, die in Hühnerzellen gewachsen sind, nachzuweisen (Boni et al (1996) Clin. Diag. Virol. 5: 43–53). Das Vorliegen von RT-Aktivität in Vogel-Substratzellen, in denen zuvor noch keine nachgewiesen worden ist, löst mögliche Bedenken aus, da diese Aktivität auf das Vorliegen von einem Retrovirus hinweisen könnte, das sich potentiell in menschlichen Zellen replizieren kann. Daher kann die Verabreichung eines amtlich zugelassenen viralen Vakzins der Kanal für die versehentliche Verabreichung eines sekundären Retrovirus sein, der menschliche Zellen infizieren und als ein integraler Teil des Wirtsgenoms langfristig bestehen bleiben kann. Dies erfolgt über den retroviralen Replikationszyklus, der für alle Retroviren charakteristisch ist und hängt teilweise von der Enzymaktivität von RT ab (Varmus and Swanstrom (1984), RNA Tumor Viruses, Molecular Biology of Tumor Viruses vol 2, 2. Ausgabe, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, Seiten 75–134; Baltimore (1970) Nature 226: 1209–11). Da Retroviren in anfälligen Spezies pathogen sein können, sollten Vakzine und andere biologische Produkte, die für die Verwendung beim Menschen bestimmt sind, keine infektiösen Retroviren enthalten.
Alternativ kann das Vorliegen von RT-Aktivität, die mit Zellsubstraten verbunden ist, die bei der Herstellung von viralen Vakzinen verwendet werden, auf niedrige Spiegel von RT-ähnlicher Aktivität, die mit endogenen Polymerasen in den Zellsubstraten assoziiert ist, zurückzuführen sein. Darüber hinaus wurde kürzlich festgestellt, dass mindestens ein Teil der RT-Aktivität, die mit Hühnerzellen, die als Substrate für die Herstellung von lebend attenuierten viralen Vakzinen verwendet werden, assoziiert ist, mit einem Partikel assoziiert ist, der RNAs enthält, die mit Retroviren der EAV-0-Familie verwandt sind (Weissmahr et al. (1997) J. Virol. 71: 3005-12). Sequenzen der EAV-0-Familie kommen in dem Genus Gallus häufig vor und wurden als frühere provirale Genome beschrieben (Dunwiddie et al. (1986) J. Virol. 59: 669–75); Resnick et al (1990) J. Virol. 64: 4640–53; Boyce-Jacino et al (1992) J. Virol. 66: 4919–29). Frühere Untersuchungen, in denen traditionelle RT-Assays zum Einsatz kamen, berichteten über eine Partikel-assoziierte RT-Aktivität in der Allantois-Flüssigkeit von embryonalen Hühnereiern aus Retrovirus-freien Hühnern und im konzentrierten Medium von primären und sekundären Hühnerembryo-Fibroblastenkulturen (Bauer & Hoffschneider (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 3025–9; Bauer et al. (1977) Eur. J. Biochem. 79: 345–54; Bauer et al. (1978) Biochim. Biophys. Acta 518: 125–37). Es wurde kein infektiöses Retrovirus gefunden, das mit der RT-Aktivität bei Verwendung von Zielzellen des Vogels assoziiert war (Bauer et al. (1978) Exp. Cell Res. 117: 383–92). Daher ist der Einsatz von empfindlicheren PBRT-Assays zum Testen von viralen Vakzinsubstratzellen auf das Vorliegen von exogener RT-Aktivität problematisch, da vermehrt Anzeichen von Falsch-Positiv-Ergebnissen aufgrund des Vorliegens einer endogenen RT-Aktivität vorhanden sind. Mehrere Forscher versuchten das Problem von Falsch-Positiven in dem PBRT-Assay anzugehen, indem sie die Assay-Bedingungen modifizierten, um die RT-Aktivität, die von bestimmten Nicht-RT-Polymerasen erzeugt wird, abzuschwächen. Mandru und Peden (J. Virol. Methods, 66: 247–61 (1997)) waren in der Lage, die Spiegel von Hintergrund-RT-Aktivität, die durch die RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität von Taq-Polymerase erzeugt wurde, abzusenken, indem ein Ribonukleotid-Verdauschritt vor der Amplifikation des cDNA-Produkts der RT-Reaktion durch PCR eingeführt wurde und indem eine thermostabile DNA-Polymerase verwendet wurde, bei der eine verminderte RNA-abhängige DNA- Polymerase-Aktivität festgestellt wurde. Chang et al. (J. Virol. Methods, 65: 45–54 (1997)) beschreibt einen PBRT-Assay, bei dem der pH der RT-Reaktion erniedrigt wurde, die Inkubationszeit der RT-Reaktion verkürzt wurde und Protease-Inhibitoren zu der RT-Reaktion zugesetzt wurden, um die RT-Aktivität von kontaminierenden zellulären Polymerasen abzusenken. Lugert et al. (Biotechniques 20: 210-7 (1996)) beschreibt einen modifizierten RT-PCR-Assay, bei dem die Menge von aktivierter DNA erhöht wurde, um die RT-Aktivität, die mit endogenen Polymerasen assoziiert ist, zu inhibieren, ohne die RT-Aktivität von den richtigen RT-Molekülen zu beeinflussen. Keiner der oben genannten PBRT-Assays kann eine RT-Aktivität von einem sekundären Retrovirus, der menschliche Zellen infizieren kann, von einer endogenen RT-Quelle, die nicht-infektiös ist, wie EAV-0, unterscheiden.
Daher besteht ein Bedarf für ein Screening-Verfahren für RT-Aktivität in Substratzellen, die für die Herstellung von biologischen Produkten verwendet werden, insbesondere von lebend attenuierten Virus für Vakzine, das zwischen einer nicht-infektiösen endogenen RT-Aktivität und einer RT-Aktivität, die mit exogenen infektiösen Retroviren assoziiert ist, unterscheiden kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von exogener reverser Transkriptase (RT) Aktivität in einer biologischen Probe ohne Beeinflussung durch eine endogene RT-Aktivität bereit. Dieses Verfahren ist besonders nützlich, wenn das zelluläre Substrat einen hohen Spiegel von endogener RT-Aktivität (z.B. Vogelzellen) aufweist, was es unmöglich macht, das Vorliegen von kontaminierenden infektiösen Retroviren lediglich auf der Basis des Merkmals einer RT-Aktivität festzustellen. Das vorliegende Verfahren erreicht dies, indem ein optimierter Übertragbarkeits-Assay (für eine infektiöse retrovirale Amplifikation) mit einem optimierten PBRT-Assay zum Nachweis von RT-Aktivität miteinander verbunden werden. Die Anzahl von PCR-Zyklen, die in den PBRT-Assay eingesetzt wird, wird so ausgewählt, dass ein Nachweis der RT-Aktivität von dem amplifizierten exogenen Retrovirus möglich ist, nicht aber der Nachweis des niedrigeren Spiegels der endogenen RT-Aktivität. Das Verbinden eines Retrovirus-Amplifikationsprozesses mit PBRT wird als Co-RT (CoRT) bezeichnet, um die Einordnung der beiden Assays wiederzuspiegeln.
Am Anfang bestimmt man die Anzahl von PCR-Zyklen in dem PBRT-Assay, die notwendig sind, um eine endogene RT-Aktivität in einem ausgewählten zellulären Sub strat, das eine retrovirale Infektion zulässt, nachzuweisen, wobei das Substrat für eine exogene infektiöse Retrovirus-Amplifikation verwendet werden soll. Dann wird der Übertragbarkeits-Assay eingesetzt, um die Amplifikationsparameter zu bestimmen, die erforderlich sind, um einen RT-Aktivitätsspiegel zu erreichen, der größer ist als die endogene RT-Aktivität des zellulären Substrats und der mit dem PBRT-Assay unter Verwendung einer Anzahl von PCR-Zyklen nachgewiesen werden kann, die geringer ist als die Mindestzyklen, die erforderlich sind, um eine endogene RT-Aktivität des zellulären Substrats nachzuweisen. Der notwendige Amplifikationsgrad wie er durch den Übertragbarkeits-Assay bestimmt wurde, wird natürlich sowohl von der endogenen RT-Aktivität abhängen als auch von dem Anfangsspiegel der exogenen infektiösen RT-Aktivität – je niedriger der Spiegel von exogener infektiöser RT-Aktivität im Vergleich zu dem Spiegel von endogener RT-Aktivität, um so größer ist der notwendige Amplifikationsgrad. Es wird für jedes bestimmte Amplifikationsprotokoll einen Schwellenwert bei dem Spiegel von der detektierbaren exogenen RT-Aktivität in dem CoRT-Assay geben. Der Schwellenwert des Spiegels von exogenem infektiösem Retrovirus, der in einem vorhandenen Satz von CoRT-Assay-Parametern nachweisbar ist, entspricht dem Betrag, der nach einer Amplifikation eine RT-Aktivität hervorbringt, die durch eine Anzahl von PCR-Zyklen in dem PBRT-Assay nachweisbar ist, wobei diese mindestens um einen Betrag geringer ist als der, der zum Nachweis einer endogenen RT-Aktivität erforderlich ist.
Wenn die Parameter für die Amplifikation von dem Übertragbarkeits-Assay und der Nachweis von dem PBRT-Assay bestimmt worden sind, kann der CoRT-Assay entsprechend der Erfindung routinemäßig und mehrmals auf biologischen Proben von Interesse unter Verwendung dieser Parameter durchgeführt werden. Wie hier gezeigt, ist die Empfindlichkeit, die mit 1,0 TCID₅₀ unter Verwendung des CoRT-Assays erreicht wird, ähnlich der, wie sie bei Verwendung der spezifischen PCR-Assays erreicht wird.
Das Vorangehende fasst lediglich bestimmte Aspekte der Erfindung zusammen und soll nicht die Erfindung beschränken. Alle Patente und andere Publikationen sind hiermit unter Bezugnahme vollständig mit eingeschlossen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Ergebnisse von vergleichenden PBRT-Analysen mit 20, 24, 27 und 32 Zyklen einer PCR-Amplifikation.
2 zeigt die Ergebnisse eines anfänglichen Übertragbarkeits-Assays, um die Menge von detektierbarer RT-Aktivität in einer biologischen Probe bei einem vorhandenen Satz von Parametern und PCR-Zyklen zu bestimmen.
3 stellt die Ergebnisse von spezifischen PCR-Analysen dar, die verwendet wurden, um die CoRT-Analysen zu bestätigen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Verfahren zum Nachweis einer exogenen infektiösen Retroviruskontamination in eukaryontischen Zell-Linien, insbesondere solche, die als Substrate für die Herstellung von biologischen Produkten verwendet werden. Im Gegensatz zu anderen Verfahren im Stand der Technik ist das erfindungsgemäße Verfahren in der Lage zwischen einer endogenen RT-Aktivität und einer exogenen infektiösen Retrovirus-RT-Aktivität unter Beibehaltung einer hohen Empfindlichkeit zu unterscheiden. Dies wird erreicht, indem ein optimierter Übertragbarkeits-Assay (für eine infektiöse Retrovirus-Amplifikation) mit einem PBRT-Assay verbunden wird, indem eine vorbestimmte Anzahl von PCR-Zyklen eingesetzt wird, wobei die vorbestimmte Anzahl von PCR-Zyklen ausreicht, um eine RT-Aktivität von amplifizierten exogenen infektiösen Retroviren nachzuweisen, aber nicht ausreicht, um eine endogene RT-Aktivität im zellulären Substrat nachzuweisen.
Ein anfänglicher PBRT-Assay wird als erstes durchgeführt, um die Mindestanzahl von PCR-Zyklen, die für den Nachweis einer endogenen RT-Aktivität in einem zellulären Substrat, das eine Retrovirusinfektion zulässt, erforderlich ist, zu bestimmen. Der Assay wird mit dem Substrat mit einer unterschiedlichen Anzahl von PCR-Zyklen durchgeführt und die Mindestzahl von Zyklen, die für den Nachweis der endogenen RT-Aktivität erforderlich sind, wird bestimmt. Wie angedeutet, sollte das zelluläre Substrat so ausgewählt sein, dass es eine Infektion mit infektiösen Retroviren, die mit hoher Wahrscheinlichkeit in der biologischen Probe von Interesse anzutreffen sind, zulässt. Es sind viele zelluläre Substrate auf dem Gebiet bekannt.
Dann wird ein Übertragbarkeits-Assay unter Verwendung einer bekannten Menge eines bekannten replikationskompetenten Virus eingesetzt, um bei einem gegebenen Schwellenwert eines Spiegels von exogener und endogener RT-Aktivität den Retrovirus-Amplifikationsgrad zu bestimmen, der notwendig ist, um einen infektiösen exogenen RT-Aktivitätsspiegel in dem zellulären Substrat hervorzubringen, der durch einen PBRT-Assay unter Verwendung von einem oder mehreren PCR-Zyklen weniger als die, die notwendig sind, um eine endogene RT-Aktivität in dem zellulären Substrat nachzuweisen, nachweisbar ist. Der Fachmann wird routinemäßig die Parameter des Übertragbarkeits-Assays anpassen, bis der geeignete Amplifikationsspiegel erreicht wird.
Die Parameter, die von dem anfänglichen PBRT-Assay und dem Übertragbarkeits-Assay bestimmt werden, können dann auf eine biologische Probe von Interesse übertragen werden, um zu bestimmen, ob die Probe eine RT-Aktivität von einem infektiösen Retrovirus aufweist, die gleich oder geringer ist als der Spiegel des Schwellenwerts. Dies wird folgendermaßen durchgeführt:

a) Co-Kultivieren der biologischen Probe mit einem zellulären Substrat, das eine Retrovirusinfektion zulässt, unter Bedingungen, die eine Retrovirus-Amplifikation zulassen, wobei das infektiöse Retrovirus, das in der biologischen Probe vorliegt, amplifiziert wird, um einen Spiegel von infektiöser Retrovirus-RT-Aktivität zu erzeugen, der größer ist als die endogene, nicht-infektiöse Retrovirus-RT-Aktivität des zellulären Substrats;
b) Durchlaufen eines PBRT-Assays mit der Co-Kultur, wobei eine Anzahl von PCR-Zyklen in den PBRT-Assay eingesetzt wird, die gleich oder größer ist als die Anzahl, die zum Nachweis der exogenen, infektiösen RT-Aktivität in der Co-Kultur erforderlich ist, aber geringer ist als die Anzahl, die zum Nachweis der endogenen, nicht-infektiösen RT-Aktivität erforderlich ist;
c) Feststellen, ob die PCR-amplifizierte Nukleinsäure in der Co-Kultur, die den PBRT-Assay durchläuft, vorliegt.

DEFINITIONEN VON BEGRIFFEN
Der Begriff Nukleotid bezeichnet ein beliebiges Ribonukleotidmonophosphat und Desoxyribonukleotidmonophosphat mit einer beliebigen natürlichen oder modifizierten Base in dieser Struktur, die als ein Bestandteil einer Nukleinsäure vorkommt.
Die Begriffe rNTP und dNTP bezeichnen ein Ribonukleotidtriphosphat bzw. ein Desoxyribonukleotidtriphosphat mit einer beliebigen natürlichen oder modifizierten Base. Die Begriffe rNTP und dNTP bezeichnen ein Gemisch von Ribonukleo tidtriphosphat bzw. Desoxyribonukleotidtriphosphat mit beliebigen natürlichen oder modifizierten Basen.
Der Begriff Nukleinsäure bezeichnet ein einzelsträngiges oder ein zum Teil oder vollständig doppelsträngiges Oligomer oder Polymer. RNA besteht vollständig aus Ribonukleotidmonophosphaten und DNA besteht vollständig aus Desoxyribonukleotidmonophosphaten, jedoch kann eine Nukleinsäure sowohl aus Ribonukleotidmonophosphaten als auch aus Desoxyribonukleotidmonophosphaten bestehen. Die Ausdrücke und ss und ds kennzeichnen eine Nukleinsäure als eine einzelsträngige bzw. doppelsträngige Nukleinsäure.
Der Begriff Oligonukleotid bezeichnet eine einzelsträngige Nukleinsäure, die mindestens zwischen zwei und ungefähr 100 natürliche oder modifizierte Nukleotide oder ein Gemisch davon umfasst. Das Oligonukleotid kann von einer natürlichen Nukleinsäure stammen oder durch eine chemische oder enzymatische Synthese hergestellt werden.
Der Begriff Polynukleotid bezeichnet eine einzelsträngige Nukleinsäure, die ungefähr 100 oder mehr natürliche oder modifizierte Nukleotide oder ein Gemisch davon umfasst.
Die Begriffe stromaufwärts und stromabwärts bezeichnen die relative Position innerhalb einer Nukleinsäure; stromaufwärts bezeichnet eine Richtung zum 5'-Ende der Nukleinsäure, stromabwärts bezeichnet eine Richtung zum 3'-Ende der Nukleinsäure.
Der Begriff reverse Transkriptase (RT) bezeichnet ein Enzym, das in seiner natürlichen Funktion in einer Primer-abhängigen Reaktion und unter Verwendung von dNTPs eine DNA synthetisiert, die komplementär ist zu einer Matrizen-RNA.
Der Begriff reverse Transkriptase-Aktivität bezeichnet die Aktivität eines beliebigen Enzyms, das in einer Primer-abhängigen Reaktion und unter Verwendung von dNTPs eine DNA synthetisiert, die komplementär ist zu einer Matrizen-RNA.
Der Begriff Primer bezeichnet eine Nukleinsäure einer Sequenz, die komplementär ist zu einer anderen Nukleinsäure. Wenn er an diese Nukleinsäure hybridisiert ist, dient der Primer mittels dessen freier 3'-OH-Gruppe als eine Stelle, an der die Syn these eines Nukleinsäurestrangs durch eine RT-Aktivität oder eine DNA-abhängige DNA-Polymerase eingeleitet wird.
Der Begriff „RT-Primer" bezeichnet den Primer, der die Funktion eines Primers für eine RT-Aktivität ausübt.
Der Begriff „Matrizen-Nukleinsäure" bezeichnet die einzelsträngige Nukleinsäure, an der, zumindest teilweise, ein komplementärer DNA-Strang durch eine reverse Transkriptase-Aktivität synthetisiert wird.
Der Begriff „Matrizen-RNA" bezeichnet solche Teile der Matrizen-Nukleinsäure, die aus RNA bestehen und an die, zumindest teilweise, eine cDNA synthetisiert wird.
Der Begriff „Matrizen-DNA" bezeichnet solche Teile der Matrizen-Nukleinsäure, die aus DNA bestehen.
Der Begriff „cDNA" bezeichnet die Nukleinsäure, die aus DNA besteht, die komplementär ist zu der Matrizen-Nukleinsäure und die durch eine RT-Aktivität synthetisiert worden ist, sowie alle Bestandteile des RT-Primers.
RAV1, RAV2 und RAV0 bezeichnen eine Vogel-Leukosis-Sarcom-Gruppe, Rous-assoziierte Virus-Untergruppen A, B bzw. E.
REV bezeichnet ein Säugetier C-Typ-Virus, Reticuloendotheliosis-Virus.
Wie hier verwendet, bezeichnet der „Übertragbarkeits-Assay" sowohl (a) den Anfangs-Assay, um die Amplifikationsparameter zu bestimmen, die notwendig sind, um einen Spiegel von exogener infektiöser RT-Aktivität hervorzubringen, der mit einem PBRT-Assay unter Verwendung einer geringeren Anzahl von PCR-Zyklen, die erforderlich sind, um eine endogene RT-Aktivität in einem gegebenen zellulären Substrat nachzuweisen, nachweisbar ist, als auch (b) der Amplifikationsteil des CoRT-Assays unter Verwendung der Parameter, die durch den Anfangs-Assay der in (a) beschrieben wurde, bestimmt wurden.
PBRT-ASSAY
Wie in dem Abschnitt zum Hintergrund der Erfindung gezeigt, ist der PBRT-Assay auf dem Gebiet bekannt und es kann ein beliebiges der veröffentlichten Protokolle durch den Fachmann als Teil der erfindungsgemäßen CoRT-Assays verwendet werden (und bei Bedarf modifiziert werden).
Wie hier verwendet, umfasst der PBRT-Assay für die RT-Aktivität mehrere Schritte. Am Anfang muss eine zu testende Probe präpariert werden. Geeignete Probenquellen umfassen Zell-Linien, aus denen ein lebend attenuiertes virales Vakzin präpariert worden ist oder präpariert werden wird, Überstände von Zellen, die verwendet werden, um ein lebend attenuiertes virales Vakzin herzustellen und das lebend attenuierte Vakzin selbst. Nach der Präparation der zu testenden Probe, wird die Probe in nicht-infizierte Zell-Linien inkubiert, so dass ein beliebiges exogenes Virus amplifiziert werden wird. Der nächste Schritt des Assays verwendet eine beliebige RT-Aktivität in der Probe, um eine komplementäre DNA (cDNA) von einer endogenen oder exogenen RNA-Matrize herzustellen. Die Herstellung von cDNA unter Verwendung der inhärenten RT-Aktivität der Probe erfordert auch einen Primer, der zumindest zu einem Teil der RNA-Matrize komplementär ist. Nach der Herstellung der cDNA wird dieses Produkt durch PCR (Polymerasenkettenreaktion) amplifiziert. Mehrere Erhitzungs- und Abkühlungszyklen der Matrizen-DNA in Verbindung mit den geeigneten Primern und einer thermostabilen DNA-abhängigen DNA-Polymerase führen zu einem Anstieg bei der Anzahl von cDNA-Molekülen in einem geometrischen Verlauf. Schließlich wird die amplifizierte DNA identifiziert und/oder quantifiziert.
Vorab wird der Schwellenwert von PCR-Zyklen in dem PBRT-Assay, der notwendig ist, um eine endogene RT-Aktivität nachzuweisen, bestimmt. Mehrere biologische Proben von einer einzelnen Quelle, die höchstwahrscheinlich keine infektiösen Retroviren enthalten, werden für einen Assay mit PBRT ausgewählt. Wie hier beschrieben, kann eine Vielzahl von biologischen Proben verwendet werden. Die biologischen Proben werden vorbehandelt, um so die Proben für einen PBRT-Assay zu präparieren. Die RT-Reaktion des PBRT-Assays wird dann unter Reaktionsbedingungen durchgeführt, die für die jeweiligen Proben und der ausgewählten Primer-Matrizen-Kombination optimiert worden sind. Nach der Behandlung zum Entfernen der Matrizen-Nukleinsäure wird jede hergestellte cDNA in der RT-Reaktion dann durch PCR mit Primern und Reaktionsbedingungen, die so ausgewählt sind, dass sie die PCR-Reaktion optimieren, amplifiziert. Jede biologische Probe wird mit verschiedenen PCR-Zyklus-Zahlen laufen gelassen, um den Spiegel (falls vorhanden) der PCR-Amplifikation, der erforderlich ist, um ein positives Ergebnis hervorzubringen, zu bestimmen. Die Anzahl der ausgewählten PCR-Zyklen beträgt vorzugsweise zwischen ungefähr 15 und ungefähr 35 Zyklen. Nachdem die PCR-Reaktion beendet ist, werden die Proben einem Detektionsverfahren ausgesetzt, bei dem bestimmt wird, ob ein Produkt von der PCR-Reaktion erhalten worden ist. Wenn ein Produkt erhalten worden ist, ist der Test für eine RT-Aktivität positiv (oberhalb einer detektierbaren Mindestschwelle); wenn kein Produkt erhalten wird, ist der Test für eine RT-Aktivität negativ. Verschiedene PCR-Zyklus-Zahlen sollten zu Ergebnissen führen, bei denen niedrige Zyklus-Zahlen negative RT-Aktivitätsergebnisse hervorbringen werden, während höhere Zyklus-Zahlen positive RT-Aktivitätsergebnisse hervorbringen werden. Diese Ergebnisse sind allerdings tatsächlich „Falsch-Positive" und bedeuten, dass kein exogenes infektiöses Retrovirus in der Probe vorhanden ist. Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet unterschiedliche Ergebnisse von dem PBRT-Assay, um einen Schwellenwert von PCR-Zyklen zu definieren, unter dem die RT-Aktivität von einer endogenen nicht-infektiösen RT-Aktivitätsquelle nicht detektierbar ist. Es können dann ein paar weniger PCR-Zyklen als dieser Schwellenwert verwendet werden, um den CoRT-Assay durchzuführen, bei dem eine endogene RT-Aktivität in Testproben nicht nachzuweisen ist, während eine RT-Aktivität aufgrund des Vorliegens von einem exogenen replizierenden Retrovirus in der Probe nachweisbar ist.
Die Anzahl von PCR-Zyklen, die erforderlich ist, um zwischen den RT-Aktivitätsquellen zu unterscheiden, wird mit der Probe von Interesse als auch der Empfindlichkeit und Selektivität der Matrizen und Primer und den Bedingungen, die für die RT- und PCR-Teile des CoRT-Assays gewählt worden sind, variieren. Zum Beispiel kann in einer Probe, in der der endogene Hintergrund sehr niedrig ist, die PCR-Zyklus-Zahl größer sein als in einer Probe, in der der Spiegel der endogenen Aktivität den Spiegel einer exogenen retroviralen RT-Aktivitätsquelle erreicht. Das Ziel ist es, die Empfindlichkeit und die Selektivität des PRBT-Assays für ein infektiöses Retrovirus zu maximieren, ohne ungefährliche, nicht-infektiöse RT-Quellen nachzuweisen, um dadurch das Auftreten von Falsch-Positiven möglichst gering zu halten.
Zum Beispiel wurden nicht infizierte Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) vorbehandelt und einer optimierten RT-Reaktion unter Verwendung von einer RNA-Matrize von dem Bakteriophagen MS2 und RTC-1-Primer ausgesetzt. Die Matrizen-Nukleinsäure wurde unter Verwendung von RNAse verdaut und die Proben wurden dann einer PCR bei 20, 24, 27 und 32 Zyklen ausgesetzt. Es wurde kein Produkt in den Proben, die 20 oder 24 Zyklen ausgesetzt waren, beobachtet, jedoch konnte ein Produkt in den Proben, die 27 und 32 Zyklen ausgesetzt waren, beobachtet werden. Daher sollte die Anzahl der PCR-Zyklen, die für einen CoRT-Assay für CEF ausgewählt werden, geringer sein als 27 und vorzugsweise zwischen 20 und 26, mehr bevorzugt zwischen 24 und 26 sein.
Eine Verringerung der Anzahl von PCR-Zyklen führt zu einem Abfall bei der Empfindlichkeit des PRBT-Assays. Um dies zu kompensieren, verwendet der erfindungsgemäße CoRT-Assay während des Übertragbarkeits-Assays virale Amplifikationsparameter, die sicherstellen, dass die RT-Aktivität von exogenen infektiösen Retroviren oberhalb des Hintergrundspiegels der endogenen RT-Aktivität liegt. Die Amplifikation wird anhand von replikationskompetenten Kontrollviren quantifiziert.
ÜBERTRAGBARKEITS-ASSAY
Der Übertragbarkeits-Assay und die eingesetzten Amplifikationsprotokolle sind auf dem Gebiet bekannt und es können veröffentlichte Protokolle routinemäßig verwendet (und modifiziert) werden, als Teil des CoRT-Assays durch den Fachmann. Kahn et al., J. Clin. Virol. 1998; 11: 7–18; Robertson und Minor, Biologicals. 1996; 24: 289–90; Tsang et al., J. Virol. 1999; 73: 5843–51; Bauer et al., Biochim. Biophy. Acta. 1978; 518: 125–37; und Bauer et al., Eur. J. Biochem. 1977; 79: 345–54.
Vorab wird ein anfänglicher Übertragbarkeits-Assay durchgeführt, um den Amplifikationsbetrag zu bestimmen, der für eine gegebene Menge von Retrovirus (und dem entsprechenden RT-Spiegel) notwendig ist, um einen Nachweis der RT-Aktivität durch den PBRT-Assay zu ermöglichen, der weniger PCR-Zyklen verwendet als notwendig sind, um eine endogene RT-Aktivität nachzuweisen. Der Übertragbarkeits-Assay kann eine Inkubation von positiven Kontrollzellen, die mit infektiösem Virus in dem Bereich von ungefähr 1 bis 1 × 10⁵ TCID₅₀ angeimpft wurden, umfassen. Es kann auch eine Negativkontrolle in dem erfindungsgemäßen Übertragbarkeits-Assay eingesetzt werden, in dem Zellen mit nicht-infektiösem Virus im Bereich von ungefähr 1 bis 1 × 10⁵ TCID₅₀ angeimpft und inkubiert werden. Die Inkubationslänge und andere Inkubationsbedingungen und Parameter werden entsprechend den auf dem Gebiet vorhandenen Kenntnissen an den Zelltyp angepasst, es ist jedoch Ziel eine Virusamplifikation in den Kontrollzellen und in den Probenzellen auch dann zu erlauben, wenn ein infektiöses Retrovirus vorhanden ist. Vorzugsweise wird der Übertragbarkeits-Assay mit CEF durchgeführt und das infektiöse Virus ist ausgewählt aus RAV-1, RAV-2 oder REV, das nicht-infektiöse Virus ist EAV-0 und die Inkubationsdauer beträgt sieben Tage. Es werden CEF-Zellen für die Herstel lung von Lebend-Vakzinen verwendet und diese sind für die meisten bekannten Vogel-Retroviren permissiv. Es ist daher zweckmäßig diese als das Zellsubstrat für eine CoRT-Amplifikation zu verwenden. Es wurde festgestellt, dass endogene RT-Spiegel von Assay zu Assay ziemlich konstant sind, wenn eine Vielzahl von Präparationen von Primärzellen verwendet wird.
Der Überstand aus der ersten Inkubation wird sowohl von den Kontroll- als auch von den Testproben entfernt und zentrifugiert, um Feststoffe zu entfernen. Ein Teil des Überstandes wird dem PBRT-Assay wie hier beschrieben unterzogen und auf das Vorliegen des PCR-Produkts hin untersucht. Die Zellen aus dem Positiv- und Negativ-Kontrollen werden behandelt, um genomische DNA zu isolieren. Die genomische DNA kann auf eine Vielzahl von Wegen erhalten werden, die für den Fachmann bekannt sind. Ein Teil dieser genomischen DNA wird einer PCR ausgesetzt unter Verwendung von Primern, die spezifisch für das Virus sowohl von dem positiven als auch dem negativen Kontroll-Inokulum sind. Die Auswahl von Primern und die PCR-Bedingungen zur Optimierung das Virus-spezifischen PCR sind für den Fachmann bekannt. Die PCR-Reaktion wird auf das Vorliegen von PCR-Produkt analysiert. Idealerweise werden die Ergebnisse der spezifischen PCR-Amplifikation und die Ergebnisse des RT-PCR (PBRT)-Assays korrelieren. Das bedeutet, dass ein positives Ergebnis in der spezifischen PCR auch ein positives Ergebnis in der RT-PCR ergeben würde und ein negatives Ergebnis in der spezifischen PCR auch ein negatives Ergebnis in der RT-PCR ergeben würde. Offensichtlich hängt diese Korrelation von dem Spiegel der anfänglichen viralen Infektion und der Anzahl der PCR-Zyklen, die in der RT-PCR verwendet wurden, ab.
Es können mehrere Inkubationsperioden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um die Amplifikation des Virus je nach Bedarf zu erhöhen. Dies ist zur Bestimmung des Spiegels von dem anfänglichen exogenen infektiösen Retrovirus, der unter Verwendung des CoRT-Assays bestimmt werden kann, wichtig. Genauso wie der PBRT-Assay vorab auf nicht infizierten Zellen durchgeführt wird, um die Anzahl von PCR-Zyklen zu bestimmen, die erforderlich sind, um eine endogene RT-Aktivität nachzuweisen (wie oben beschrieben), wird der Übertragbarkeits-Assay auch vorab durchgeführt, um den Spiegel von infektiösem Retrovirus zu bestimmen, der durch den Assay unter Verwendung der Zyklus-Parameter, die in dem RT-PCR (PBRT) Teil des Assays bestimmt worden sind, nachzuweisen. Um den Spiegel von infektiösem Retrovirus, der von einer Anfangsinfektion nachgewiesen werden kann, zu bestimmen, muss man mehrere virale Amplifikationen durchführen. Nach jeder Inkubationsperiode wird die Hälfte des Volumens der Kontroll- und Testproben in einen anderen Behälter mit dem selben Zelltyp, wie er bei der ersten Inkubation verwendet worden ist, überführt. Die spezifischen PCR-Tests und der CoRT-Assay können am Ende von einer oder allen Inkubationsperioden laufen gelassen werden. Somit hängen die Empfindlichkeitsspiegel zum Nachweis des infektiösen Retrovirus in dem CoRT-Assay von der Menge des anfänglichen infektiösen Retrovirus, dem viralen Amplifikationsgrad und der Auswahl der Zyklusparameter in dem RT-PCR-Teil des Assays ab.
Zum Beispiel betrug in der hier beschriebenen CEF-Probe nach einer sieben Tage langen Inkubation der Spiegel des anfänglichen Virusinputs, der durch den CoRT-Assay nachgewiesen werden konnte, 100 TCID₅₀ bei einer RT-PCR, in der zwischen 24 und 26 Zyklen zum Einsatz kamen. Nach weiteren sieben Tagen einer viralen Amplifikation betrug der Spiegel des anfänglichen Virus-Inputs, der durch den CoRT nachgewiesen werden konnte, 1 TCID₅₀ unter den selben Bedingungen. Daher hängt die Auswahl der Anzahl und der Länge von viralen Amplifikationen von 1) der gewünschten Empfindlichkeit und 2) dem Hintergrundsspiegel der endogenen RT-Aktivität ab. Daher ist, wenn die endogene Hintergrundsaktivität hoch ist, die Anzahl der PCR-Zyklen, die ohne einen Nachweis einer endogenen RT-Aktivität laufen gelassen werden können, geringer als wenn die endogene Hintergrunds-RT-Aktivität gering ist. Je niedriger die Anzahl der Zyklen ist, umso weniger empfindlich ist der Assay für exogenes replizierendes Retrovirus und umso größer ist der Bedarf an einer erhöhten viralen Amplifikation. In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Wechselwirkung zwischen diesen beiden antagonistischen Faktoren optimiert, so dass ein exogenes replizierendes Retrovirus nachgewiesen wird, nicht jedoch eine endogene RT-Aktivität.
Wie oben angedeutet, wird anfangs ein Übertragbarkeits-Assay durchgeführt, um den Empfindlichkeitsspiegel der RT-PCR, die keine Falsch-Negativen unter den oben genannten Zyklus-Bedingungen produziert, zu bestimmen (der Assay wird reverse Transkription, das in den Proben vorhanden ist, nachweisen). Die Ergebnisse des anfänglichen Übertragbarkeits-Assays ermöglichen es einem den geeigneten viralen Amplifikationsspiegel, der in Kombination mit dem RT-PCR-Test verwendet werden soll (d.h. PBRT) zu bestimmen, um den CoRT-Assay für einen bestimmten Probentyp und für eine bestimmte Empfindlichkeit herzustellen.
Die Kombination der geeigneten viralen Amplifikation (Übertragbarkeit) und RT-PCR (PBRT) mit den geeigneten Zyklusparametern bringen einen CoRT-Test hervor, der eine empfindliche Detektion von exogenem replizierenden Retrovirus (keine Falsch-Negativen) ohne Detektion einer endogenen RT-Aktivität (keine Falsch-Positiven) ermöglicht.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren können spezifische PCR-Assays am Anfang in Verbindung mit dem CoRT-Assay verwendet werden, um die Ergebnisse, die für den CoRT-Assay erhalten werden, zu verifizieren. Diese spezifischen PCR-Assays machen sich die Tatsache zunutze, dass spezifische Viren einzigartige Genome aufweisen, wobei ein Teil davon durch eine PCR amplifiziert werden kann, wenn Primer ausgewählt werden, die für diese Regionen des Genoms spezifisch sind. Wenn daher ein gegebenes replizierendes Retrovirus in einer gegebenen Probe vorhanden ist, wird dessen Genom durch eine PCR, die für diesen Virus spezifisch ist, nachgewiesen. Umgekehrt, wenn das Retrovirus nicht vorhanden ist, wird die Detektion des Virus durch eine spezifische PCR negative Ergebnisse hervorbringen. Der erfindungsgemäße CoRT-Assay erfordert jedoch keine Verifizierung durch eine spezifische PCR.
Wie zuvor beschrieben, wird der PBRT-Assay auf einer Testprobe durchgeführt, die von biologischem Ursprung ist. Die Probe kann von menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein und umfasst sowohl eukaryontische als auch prokaryontische Zellen. Das Folgende sind Beispiele von biologischen Proben, die in dem PBRT-Assay getestet werden können:
Körpergewebe oder Organe mit menschlichem oder tierischem Ursprung, einschließlich

(a) Fluidgewebe wie Blut oder Blutfraktionen, z.B. Serum, Plasma, bestimmte Blutzellpopulationen oder -fraktionen, Blutprodukte, z.B. Blutproteine, Koagulationsfaktoren, Hyperimmunserum, Antikörperkonzentrate, Hormone
(b) Festgewebe und Organe wie Transplantate, Biopsie- oder Autopsiematerial, Schleim, der von Schleimhautmembranen und anderen Oberflächen entnommen wurde, einzelne Zellen oder Präparationen oder Extrakte wie Hormonpräparationen aus Drüsengeweben, Plazenta etc., Fleisch oder Fleischprodukten von Tieren
(c) Körperflüssigkeiten oder Ausscheidungen, sowohl physiologisch oder pathologisch, z.B. Hirnwasser, Urin, Speichel, Galle, Schweiß, Milch, andere Drüsen sekrete, Blaseninhalte, Fruchtwasser, Gelenkschmiere, Bauchwasser oder andere Flüssigkeitsansammlungen in Körperhöhlen, Lymphen, Stuhl etc. oder Produkte, die solche Stoffe enthalten.
(d) Proben von prokaryontischen und eukaryontischen Zellkulturen jeglicher Art, die in vitro vermehrt worden sind und biologische Produkte, die aus solchen hergestellt sind, z.B. Vakzine, Antikörper, Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, Hormone, rekombinante Proteine etc.
(e) Verschiedene Stoffe, z.B. Nahrungsmittelproben, Wasser und andere Getränke, Umweltproben, Hygieneproben, Proben von Nutzpflanzen (Gemüse, Obst, Gehölz, Faserpflanzen).

Vorzugsweise umfasst die Probe eukaryontische Zellkulturen jeglicher An, die in vitro vermehrt worden sind, beispielsweise umfassend Vakzine, Antikörper, Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, Hormone, rekombinante Proteine etc. Mehr bevorzugt umfasst die Probe Hühnerembryo-Fibroblasten, Überstandsfluid von Hühnerembryo-Fibroblastenzellen, Hühnerembryonen, Hühnerembryo-Fibroblastenlysate und Allantois-Flüssigkeit, die zur Herstellung von lebend attenuierten viralen Vakzinen verwendet werden. Proben können durch eine beliebige konventionelle Technik, die auf dem Gebiet bekannt ist, um eine Testprobe zum Testen von RT-Aktivität zu präparieren, präpariert werden. Solche Präparationsschritte umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Hochgeschwindigkeitszentrifugation, um Zellen, Zelltrümmer und andere teilchenförmigen Verunreinigungen zu entfernen; Ultrazentrifugation zum Pelletieren von Viruspartikeln oder zur Adsorption von Viruspartikeln an eine Festphase, die mit Antikörpern oder anderen geeigneten Molekülen beschichtet ist oder einen anderen geeigneten Träger, oder Präzipitation mittels Immunreagenzien oder chemischen Substanzen; Ultrafiltration mit Filtern von geeigneter Porengröße für die weitere Entfernung von kontaminierenden Feststoffen und Extraktion von RT-Aktivität mittels eines Puffers, der ein geeignetes Detergenz oder ein anderes chemisches oder physikalisches Verfahrensschutzmittel für das Enzym enthält.
In den erfindungsgemäßen CoRT-Assay wird die amplifizierte Probe auf eine RT-Aktivität hin untersucht. Die Probe wird wie oben beschrieben vorbehandelt, so dass die Probe in einen für den RT-Teil des Assays geeigneten Zustand versetzt wird. Zum Beispiel werden die Medien von den Zellsubstraten abgezogen und zentrifugiert, um Feststoffe zu entfernen, wenn es sich bei der Probe, die getestet werden soll, um Medien von Zellsubstraten handelt.
Eine Matrizen-Primer-Kombination ist für den Nachweis von RT-Aktivität erforderlich. Alle Matrizen-Primer-Kombinationen, die in dem CoRT-Assay verwendet werden, enthalten eine heteropolymere Matrizen-Nukleinsäure. Ein Teil von dieser, die vorzugsweise unmittelbar an das 5'-Ende einer Hybridisierungssequenz für einen RT-Primer folgt, besteht aus RNA und wird als Matrizen-RNA bezeichnet. Die Matrizen-RNA ist das tatsächliche Substrat für die RT-Aktivität; die Synthese eines DNA-Stranges, der komplementär ist zu einer Matrizen-RNA, kennzeichnet das Vorliegen von RT oder RT-Aktivität in dem Reaktionsgemisch. Die Matrizen-Nukleinsäure besteht gewöhnlicher Weise aus RNA von natürlichen, rekombinanten oder synthetischen Quellen, jedoch können auch Hybrid-DNA/RNA-Sequenzen verwendet werden.
Die Matrizen-Primer-Kombination ist so gewählt, dass das CoRT-Assay die maximale Empfindlichkeit und Spezifität zum Nachweis der Retroelemente garantiert. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass ein Nukleinsäure-Amplifikationsprozess nur dann eingeleitet wird, wenn während der reversen Transkription der Matrizen-Nukleinsäure das Stück Matrizen-RNA mit ausreichender Länge revers transkribiert worden ist. Weiter muss darauf geachtet werden, dass die Initiation des Amplifikationsprozesses durch eine Nukleinsäure in der Probe, die nichts mit der zu synthetisierenden Nukleinsäure zu tun hat, während einer reversen Transkription verhindert wird. Es ist wichtig für die Spezifität und Empfindlichkeit des CoRT-Assays, dass die ausgewählte Matrizen-Nukleinsäure weder identisch noch teilweise identisch mit irgendeiner anderen in der Probe vorhandenen Nukleinsäure ist, seien diese Teil des normalen Genoms einer Spezies oder eine Nukleinsäure von einem infektiösen Agenz oder von anderen kontaminierenden Nukleinsäuren, deren Vorliegen in der Probe nicht ausgeschlossen werden kann.
Um eine maximale Spezifität für den retroviralen RT-Test zu erreichen, ist eine heteropolymere Matrizen-RNA bevorzugt. Zusätzlich kann die Wirksamkeit der cDNA-Synthese durch verschiedene Arten von Enzymen mit RT-Aktivität beeinflusst werden, hauptsächlich durch die Prozessivität von diesen Enzymen. Die Matrizen-Nukleinsäure kann somit basierend auf solchen Erwägungen als Sekundärstruktur der Matrizen-Nukleinsäure ausgewählt werden. Vorzugsweise ist die Matrizen-Nukleinsäure eine Bakteriophagen-MS2-RNA-Matrize.
Neben der Hybridisierungssequenz, die für den CoRT-Assay verwendet wird, besitzen die meisten Nukleinsäurematrizen mindestens eine weitere Hybridisierungssequenz. Wenn Reportersonden verwendet werden und wann immer die Hybridisierungssequenz ausschließlich für die Auswahl der Reportersonde verwendet wird, kann die Matrizen-Nukleinsäure mehrere aufeinanderfolgende Hybridisierungssequenzen enthalten, die vorzugsweise durch Spacer-Sequenzen voneinander getrennt sind. Es wird dadurch möglich werden, mehrere Reportersonden zu hybridisieren.
Alle in dem Assay verwendeten RT-Primer sind Nukleinsäuren, die entweder teilweise oder vollständig aus doppelsträngiger oder einzelsträngiger RNA oder DNA oder einer Kombination davon bestehen. Die Primer umfassen mindestens eine Hybridisierungssequenz, über die sie an die Matrizen-Nukleinsäure binden. Es ist möglich, dass der RT-Primer Sequenzen enthält, die nicht komplementär sind zu der Matrizen-Nukleinsäure und die stromaufwärts von dem 3'-Ende der Hybridisierungssequenz lokalisiert sind. Die natürliche tRNA, die als ein RT-Primer in dem Replikationszyklus der Retroviren verwendet wird, ist ein Beispiel für diese Art von RT-Primer. Während einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der RT-Primer RTC-1 (SEQ ID NO.1: [(5'-d(GTAGTGCCACTGTTTCGTTTTG)-3']) verwendet.
In dem erfindungsgemäßen CoRT-Assay kann es notwendig sein, nach der Synthese der cDNA einen zweiten DNA-Strang herzustellen, der zumindest teilweise komplementär ist zu der cDNA. Darum muss mindestens eine weitere Nukleinsäure, vorzugsweise ein DNA-Oligonukleotid an die cDNA hybridisiert werden. Diese Art von DNA umfasst mindestens eine Hybridisierungssequenz.
Unter bestimmten Umständen wird mindestens eine weitere funktionelle Sequenz, die nicht komplementär ist zu der cDNA zugegeben. Auf dem zweiten DNA-Strang wird diese zusätzliche Sequenz in der terminalen Position bezüglich der Hybridisierungssequenz lokalisiert sein und entspricht dadurch einem Äquivalent der flankierenden Sequenz. Wenn diese nicht komplementären Sequenzen aus DNA bestehen, können sie für die Einführung von zusätzlichen funktionellen Sequenzen, die erforderlich sind, aber noch nicht in der Ziel-DNA vorhanden sind oder anderen gewünschten Funktionen verwendet werden.
Reportersonden sind Nukleinsäuren, die verwendet werden, um zu zeigen, dass eine cDNA synthetisiert worden ist, indem sie direkt oder indirekt an die cDNA mittels Hybridisierung binden. Diese Bindung kann durch eine direkte Hybridisierung an eine Hybridisierungssequenz der Reportersonde an die Hybridisierungssequenz der cDNA erfolgen. In diesem Falle unterscheidet sich die Reportersonde von der Matrizen-Nukleinsäure mit der Ausnahme von dieser Sequenz, die für die Hybridisierung an die cDNA verwendet worden ist. Die Reportersonde stellt entweder selbst oder enthält die zu amplifizierende Nukleinsäure oder ein Teil von ihr ist das Edukt einer weiteren Reaktion oder Reaktionsketten, welche die zu amplifizierende Nukleinsäure hervorbringen.
Die Empfindlichkeit des CoRT-Assays wird verbessert, wenn optimale Reaktionsverbindungen ausgewählt werden, indem die Bedingungen in solchen Reaktionen wie pH, Salzbedingungen, Innenkonzentration, Primerkonzentration, Matrizenkonzentration, dNTP-Konzentration kontrolliert werden. Eine Optimierung von solchen Reaktionsbedingungen fällt innerhalb des Bereichs eines Fachmanns auf diesem Gebiet.
In bestimmten Varianten des CoRT-Assays ist es vorteilhaft, die Matrizen-Nukleinsäure vor der Durchführung der PCR-Reaktion von dem Reaktionsmilieu zu entfernen, um die in der RT-Reaktion hergestellte Ziel-DNA zu amplifizieren. Mittel zum Entfernen der RNA umfassen den Gesamtabbau der RNA, die in dem Reaktionsgemisch enthalten ist, mittels enzymatischer Behandlung (RNAse) oder chemischer Behandlung (Basenhydrolyse) ohne jedoch die synthetisierte cDNA zu entfernen. Der Abbau der RNA zerstört auch die Funktion der Matrizen-Nukleinsäure, da sie notwendigerweise eine Matrizen-RNA enthält. Es ist auch möglich, einen Träger an das 5'-Ende eines RT-Primers anzuhängen, so dass nach einer darauf folgenden Synthese von einem cDNA-Molekül die cDNA über den RT-Primer an das Trägermolekül verknüpft wird. Es ist somit allgemein möglich, die Matrizen-Nukleinsäure durch Denaturierung und anschließendes Abwaschen zu entfernen.
Nachdem die RT-Reaktion beendet ist, umfasst das Reaktionsgemisch cDNA, die durch die Reaktion hergestellt worden ist. Im nächsten Schritt des erfindungsgemäßen CoRT-Assays dient die cDNA als eine Nukleinsäurematrize zur Amplifikation durch eine PCR.
Die PCR-Primer-Kombination wird so ausgewählt, dass der CoRT-Assay eine maximale Empfindlichkeit und Spezifität für die Amplifikation der cDNA, die in der RT-Reaktion hergestellt wird, garantiert. Ein Nukleinsäure-Amplifikationsprozess sollte nur dann eingeleitet werden, wenn während der reversen Transkription der Matritzennukleinsäure das Stück Matrizen-RNA von ausreichender Länge revers transkribiert worden ist. Weiterhin muss darauf geachtet werden, dass die Initiation des Amplifikationsprozesses durch eine Nukleinsäure in der Probe, die nichts mit der synthetisierten cDNA zu tun hat, während der reversen Transkription verhindert wird. Es ist wichtig für die Spezifität und Empfindlichkeit des Assays, dass die ausgewählte Primerkombination für die PCR nicht die in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren amplifiziert, seien diese Teil des normalen Genoms einer Spezies oder eine Nukleinsäure von einem infektiösen Agenz oder andere kontaminierenden Nukleinsäuren, deren Vorliegen in der Probe nicht ausgeschlossen werden kann. Techniken, um das Vorgenannte zu erreichen, sind bekannt und werden routinemäßig von dem Fachmann auf dem Gebiet verwendet. Maudru und Peden, J. Virol. Methods. 1997; 66: 247–61; Chang et al., J. Virol. Methods. 1997; 65: 45-54; und Lugert et al., Biotechniques. 1996; 20: 210–17.
Es können mehrere Primer verwendet werden, um die Spezifität und Empfindlichkeit zu erhöhen. Solche multiplen Primersysteme werden oft als verschachtelte Primer bezeichnet. In einem System, in dem verschachtelte Primer verwendet werden, werden zwei Primer ausgewählt, die in den ersten mehreren Runden der PCR-Reaktion verwendet werden. Nachdem eine Anzahl von Runden beendet sind, werden ein oder zwei neue Primer (verschachtelte Primer), die an die Matrize nach innen zu den anfänglichen Primern hybridisieren, in die PCR-Reaktion für alle nachfolgenden Amplifikationsrunden eingeführt. Die Position der Hybridisierungsstelle der verschachtelten Primer auf der PCR-Matrizen-Nukleinsäure stellt ein Produkt her, das kürzer ist als das Produkt, das durch die Primer hergestellt wird, die für die Anfangs-PCR-Runden ausgewählt worden sind.
Vorzugsweise wird der RT-Primer RTC-1 in Kombination mit RT-2 (SEQ ID NO.10; 5'-TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG-3') verwendet.
Wenn die PCR-Reaktion beendet ist, werden Produkte der PCR-Reaktion (wenn vorhanden) durch geeignete Mittel nachgewiesen. Zum Beispiel können PCR-Produkte auf einem Agarose-Gel laufen gelassen werden und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht werden.
Wenn die Optimierung zwischen der Übertragbarkeit und den Zyklen bestimmt wird, kann der CoRT-Assay auf einer beliebigen Testprobe mit dem vorbestimmten Spiegel einer viralen Replikation und der vorbestimmten Anzahl von PCR-Zyklen während einer RT-PCR laufen gelassen werden.
Das Fehlen von identifizierbarer amplifizierter DNA weist darauf hin, dass sich die Spiegel der RT-Aktivität einer Probe unterhalb der Nachweisgrenze des RT-Assays befinden (ungefähr 10^–9 E im Allgemeinen; ungefähr 10^–7 E für Vogelzellen) und deutet auf das Nicht-Vorhandensein von replikativen infektiösen Retrovirus und anderen potentiellen RT-Aktivitätsquellen hin. Das Vorliegen von identifizierbarer DNA deutet auf das Vorliegen von RT-Aktivität in der Probe hin und kann auf einen replizierenden infektiösen Retrovirus hindeuten. Der PBRT-Assay unterscheidet nicht zwischen den potentiellen RT-Aktivitätsquellen. Der Assay weist lediglich auf das Vorliegen oder auf die Abwesenheit von RT-Aktivität oberhalb eines bestimmten Spiegels hin.
Bezüglich der Vakzin-Herstellung wird das Herstellungsstadium, in dem der CoRT-Assay durchgeführt wird, von dem Herstellungsverfahren des viralen Vakzins abhängen. Beispielsweise kann es bei viralen Vakzinen, die aus primären Zell-Linien hergestellt werden, erforderlich sein, diese auf einer Lot zu Lot-Basis zu bestimmen, während es bei viralen Vakzinen, die von einer etablierten Zellbank hergestellt wurden und Viruskeimen ausreichen kann, die Zellbank(en) und Viruskeim(e) zu testen. Wie zuvor bezüglich CEF angemerkt, kann die Probe Hühnerembryo-Fibroblasten, Überstandsfluid von Hühnerembryo-Fibroblastenzellen, Hühnerembryonen, Hühnerembryo-Fibroblastenlysate und Allantois-Flüssigkeit umfassen, die für die Präparation von lebend attenuierten viralen Vakzinen verwendet werden.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
PBRT-ASSAY
Probenpräparation
Eine gereinigte Präparation des Überstandes von einer biologischen Probe, die mit CEF-Zellen co-inkubiert wurde, wurde 1:10 in einem Puffer bestehend aus 50 mM Tris/HCL pH 8.0, 5 mM DTT, 50 mM KCL, 0,25 m MEDTA, 0,025% (w/v) Triton X-100, 50% (v/v) Glycerol verdünnt. Bei Verwendung von dieser Verdünnung wurden 10 μl in dem Assay laufen gelassen.
Anlagerung
Anlagerungsreaktionsbedingungen:
CDNA Synthese

1. Der angelagerte Primer/Matrize wurde zu dem Add 3 Puffer zugegeben und gut gemischt.
2. 18 μl des Add 3-Puffers, der das angelagerte Primer/Matrizengemisch enthält, wurde in PCR-Gefäße in Aliquote aufgeteilt.
3. 10 μl des verdünnten Testüberstandes wurde zu dem PCR-Gefäß zugegeben und gut gemischt.

Add 3 Puffer:
CDNA Reaktionsbedingungen:
MS2-RNA-Abbau
1 μl RNAse (Boehringer Mannheim, Stammlösung 10 mg/ml) wurde zu jeder Reaktion zugegeben.
Reaktionsbedingungen:
PCR Amplifikation
75 μl des Kerngemisches wurde zu jeder Reaktion zugegeben.
Kerngemisch:
Reaktionsbedingungen:
Anzahl von verwendeten Zyklen: Assay bei 24 und 27
BEISPIEL 2
KONTROLL-RT-PCR-EMPFINDLICHKEITS-ASSAY
Um die Empfindlichkeit des PBRT-Assays zu bestimmen, wurden die folgenden Proben in dem PBRT-Assay wie in Beispiel 2 und 3 beschrieben bei einer Anzahl von unterschiedlichen Amplifikationszyklen eingesetzt:
BEISPIEL 3
SPEZIFISCHER PCR-ASSAY FÜR RETROVIRUS (VALIDIERUNG VON CoRT)
Die Nukleotidsequenzen der langen terminalen Wiederholungen (LTR) in RAV1, RAV2, REV, EAV wurden betrachtet, um geeignete Primer zur Amplifikation von spezifischen Nukleotidsequenzen innerhalb dieser Retroviren zu bestimmen. Es wurden sowohl für RAV1 als auch für RAV2 drei Sequenzen identifiziert:
ALV1: SEQ ID NO.2: 5'-CTCTGCAATGCGGAATTCAGTGGT-3'
ALV2: SEQ ID NO.3: 5'-AGGGGGAAATGTAGTCTTATGCAAT-3'
ALVnest: SEQ ID NO.4: 5'-ATACTCTTGTAGTCTTGCAACATG-3'
Für REV wurden drei Sequenzen identifiziert.
RevA1: SEQ ID NO.5: 5'-CATACTGAGCCAATGGTTGTAAAGGGCA-3'
RevA2: SEQ ID NO.6: 5'-AATGTTGTATCGAAATACTACGG-3'
Revnest2: SEQ ID NO.7: 5'-TTCAGTCCGGACCCCTACC-3'
Für EAV wurden zwei Sequenzen identifiziert.
Eav06: SEQ ID NO.8: 5'-ATAGGCGTGATCGGGGTCTCGGGATG-3'
Eav08: SEQ ID NO.9: 5'-AGCCTGCGGCTTGGCCAAATACCG-3'
1 μl der Proben RAV1, REV und EAV (oben beschrieben), die aus genomischer DNA von Zellen isoliert worden sind, wurden in PCR-Gefäße überführt, die 99 μl eines PCR-Gemisches enthielten (10 mM Tris-HCl, pH = 8,3, 250 μM dNTPs, 0,5 U von Taq thermostabiler DNA-Polymerase (Amplitaq, Perkin-Elmer Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). 0,25 μM von ALV1 und ALV2 wurden zu den RAV1-Proben zugegeben, 0,25 μM von RevA1 und RevA2 wurden zu den REV-Proben zugegeben und 0,25 μM von Eav06 und Eav08 wurden zu den EAV-Proben zugegeben. Die PCR-Reaktionen wurden auf den REV- und RAV1-Proben bei 94°C für eine Minute und 20 Zyklen bei 94°C für 30 Sek., 50°C für 30 Sek. und 72°C für 30 Sek. durchgeführt und dann wurde 1 μl des PCR-Reaktionsgemisches zu einem neuen Gefäß zugegeben, das das oben beschriebenen PCR-Gemisch enthielt, jedoch mit 0,25 μM Revnest2 und 0,25 μM ALVnest, die die REV- und ALV-Primer in den REV- bzw. RAV1-Proben ersetzten. Die verschachtelte PCR wurde für weitere fünf Zyklen bei 94°C für 30 Sek., 56°C für 30 Sek. und 72°C für 30 Sek. gefolgt von 72°C für 10 Min. durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden anhand einer 1,5% Agarose-Gel-Elektrophorese und Färbung mit Ethidiumbromid analysiert. Ein positives PCR-Ergebnis für RAV 1 brachte eine einzelne Bande bei 178 bp hervor. Ein positives PCR-Ergebnis für REV brachte eine einzelne Bande bei 230 bp hervor.
1 μl EAV-Proben wurden in PCR-Gefäße überführt, die 99 μl eines wie oben beschriebenen PCR-Gemisches enthielten. 0,25 μM von Eav06 und Eav08 waren in dem PCR-Gemisch enthalten. Die PCR-Reaktionen wurden bei 94°C für 1 Min. und 28 Zyklen bei 94° für 30 Sek., 56°C für 30 Sek. und 72°C für 30 Sek. gefolgt von 72°C für 10 Min. durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden durch eine 1,5% Agarose-Gel-Elektrophorese bei Färbung mit Ethidiumbromid durchgeführt. Ein positives PCR-Ergebnis brachte eine einzelne Bande bei 178 bp hervor.
BEISPIEL 4
ÜBERTRAGBARKEITS-ASSAY
Präparation von Monoschichten von primären Hühnerembryo-Fibroblasten Primäre Hühnerembryo-Fibroblasten (Select Laboratories) wurden gleichmäßig durch eine sanfte Bewegung gemischt und es wurden 15,9 ml entfernt und in einen sterilen Trichterfilter, der mit 18 Schichten Seihtuch umwickelt war, gegossen. Der Durchfluss wurde in einem 250 ml konischen Zentrifugationsröhrchen gesammelt. Das Volumen der Suspension in dem Zentrifugationsröhrchen wurde verdoppelt, indem Medium (DMEM 2% NCS) zugesetzt wurde. Die Suspension wurde zentrifugiert (200 g) für 10 Min. bei 4°C (1000 Upm in Beckman GPKR), um die roten Blutzellen zu sammeln. Der Überstand wurde in ein anderes 250 ml konisches Zentrifugationsröhrchen überführt und dann zentrifugiert (850 g) für 15 Min. bei 4°C (2000 Upm in Beckmann GPKR). Die Pellets von beiden Zentrifugationen wurden re-suspendiert (ohne das RBC-Pellet zu zerstören) und 12 ml der Re-Suspension wurde in ein 50 ml Sterilgefäß überführt, um die Zellen aufzuteilen und dann wurde die Suspension mit der endgültigen Zellsuspension gepoolt und auf TSA-II- und Sabourrand Dextrose Platten ausgestrichen. Die Zellen wurden dann in CEF-Medium re-suspendiert. Eine 1:10 Verdünnung der Zellen in dem CEF-Medium wurde hergestellt und eine zusätzlich 1:10 Verdünnung wurde in 0,2% Trypanblau hergestellt. Die lebenden Zellen wurden dann mit einem Hemacytometer gezählt. Die Zellen wurden dann bis zu einer Dichte von 2,5 × 106 Zellen/ml verdünnt und in eine 35 ml Platte umgesetzt.
Kontroll-Inokulationen
Für Kontrollexperimente wurden 35 ml Platten mit subkonfluenten primären CEF-Zellen (ungefähr 1,6 × 106 Zellen) in 2 ml Medium (DMEM mit 10% NCS) bei 1 bis 105 TCID₅₀ angeimpft mit einer Art eines Vogel-Retrovirus-Stocks, der in 1 ml bis auf die gewünschte Konzentration in DMEM mit 2% NCS (DMEM mit 4 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 1% Antibiotika/Antimycotika (Gibco), 2% NCS) verdünnt worden ist. Nach der Impfung wurden 1 ml Medium, ergänzt mit 8 μg/ml DEAE-Dextran zu den Platten zugegeben und die Platten wurden dann über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach der Übernacht-Inkubation wurde das Inokulum entfernt und es wurde frisches Medium (DMEM 2% NCS) zugegeben und die Platten wurden für 7 Tage bei 37°C inkubiert. Nach 7 Tagen wurde 1 ml Überstand von der Platte auf frische 35 mm Platten mit CEF-Zellen wie oben beschrieben überführt. 1 ml Medium, ergänzt mit 8 μg/ml DEAE-Dextran wurde zu den Platten zugegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach einer Übernacht-Inkubation wurde das Inokulum entfernt und es wurde frisches Medium (DMEM 2% NCS) zugegeben und die Platten wurden für 7 Tage bei 37°C inkubiert.
Test-Artikel-Inokulationen
Der Überstand von Masernvakzin-Zellkulturen, ALVAC-Konstrukt-Zellkultur oder Allantois-Flüssigkeit von einer Influenzaviruspräparation wurde geerntet und 1 ml des Ernteguts wurde verwendet, um subkonfluente primäre CEF-Zellen (ungefähr 1,6 × 106 Zellen) in 2 ml Medium (DMEM mit 10% NCS) in der Gegenwart oder Abwesenheit von 1,0 TCID₅₀ von RAV1 anzuimpfen. Nach der Inokulation wurde 1 ml Medium, ergänzt mit 8 μg/ml DEAE-Dextran zu den Platten zugegeben und die Platten wurden dann über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach der Übernacht-Inkubation wurde das Inokulum entfernt und es wurde frisches Medium (DMEM 2% NCS) zugegeben und die Platten wurden für 7 Tage bei 37°C über Nacht inkubiert. Nach 7 Tagen wurde 1 ml von dem Überstand der Platte auf frische 35 mm Platten, die die oben beschriebenen CEF-Zellen enthalten, überführt. 1 ml Medium, ergänzt mit 8 μg/ml DEAE-Dextran wurde zu den Platten zugegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach der Übernacht-Inkubation wurde das Inokulum entfernt und frisches Medium (DMEM 2% NCS) wurde zugegeben und die Platten wurden für 7 Tage bei 37°C inkubiert.
RT-PCR-Assay von Test-Artikel-Inokulationen
1 ml Kulturüberstand wurde von den Zellkulturen entfernt und in 1,5 ml Mikrozentrifugationsröhrchen gegeben. Der Überstand wurde bei 13 000 Upm für 5 Min. zentrifugiert. Der Überstand von der Zentrifugation wurde dekantiert von zellulären Trümmern und bei –80°C gelagert. Die Überstände wurden wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben den PBRT-Assay ausgesetzt.
Spezifischer PCR-Assay
Der Überstand wurde von den CEF-Monolayern in der 35 mm Platte entfernt und es wurde 1 ml PBS ohne Mg/Ca zugegeben. Die Zellen wurden von der Platte abgekratzt und durch wiederholtes Pipettieren re-suspendiert und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Die Zellen wurden kurz in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, um die Zellen in ein Pellet zusammenzufassen. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde 0,2 ml PBS ohne Mg²⁺/Ca²⁺ re-suspendiert. Die genomische DNA von dem CEF wurde aufgereinigt unter Verwendung eines Qiagen Blood-Kits (Qiagen) gemäß den Anweisungen auf den Seiten 15–17 des Anweisungshandbuches (Blood and body fluids). 1 μl (ungefähr 0,3–0,5 μg) genomischer DNA wurde zu 99 μl PCR-Gemisch mit ALV-Primern zugegeben und einer PCR wie in Beispiel 5 beschrieben unterzogen.
Unten ist ein Vergleich der Ergebnisse des PBRT-Assays und des spezifischen PCR-Assays bezüglich der Detektion eines PCR-Produkts auf einem 1,5% Agarose-Gel, das mit Ethidiumbromid gefärbt wurde, gezeigt.
Das Experiment wurde unter Verwendung von RAV2 wiederholt und die Ergebnisse waren ähnlich.
DISKUSSION
Die Ergebnisse der vorangehenden Beispiele sind weiter in den 1–3 veranschaulicht.
1 zeigt die Ergebnisse der vergleichenden PBRT-Analyse unter Verwendung von 20, 24, 27 und 32 Zyklen für die PCR-Amplifikation. Nach der CoRT-Analyse wurde die RT-Aktivität nachgewiesen, indem 20 μl von jeder PBRT-Reaktion auf einem 1,5% Agarose-Gel untersucht wurde. Eine positive Reaktivität wird durch das Vorliegen eines spezifischen PCR-Produkts bei 242 bp (Pfeil) angezeigt. In diesem Experiment wurde die Assay-Empfindlichkeit, die in Einheiten von nachgewiesenem AmvRT definiert wurde, mit der Selektivität verglichen, der Fähigkeit quantitativ zwischen einer zellulären endogenen RT-Aktivität und einer RT-Aktivität, die mit einer aktiven exogenen Retrovirus-Replikation verbunden ist, zu unterscheiden. Unter Verwendung von limitierenden PCR-Amplifikationsschritten mit 20, 24, 27 und 32 Zyklen (wie gezeigt) erhöht sich die Assay-Empfindlichkeit mit der Zykluszahl, jedoch geht die Selektivität bei einer Überamplifikation bei mehr als 24 PCR-Amplifikationszyklen verloren. Die Spuren 1 bis 15 stellen die selben Proben dar bei den gezeigten PCR-Amplifikationsspiegeln. Spur 1 Marker, Spuren (2–6) Puffer-Proben, die mit 5 × 10^–4, 5 × 10^–5, 5 × 10^–6, 5 × 10^–7 und 5 × 10^–8 Einheiten AmvRT versehen waren, Spuren (7 und 8) CEF-Zellen, die mit RAV1 bei 102 und 1,0 TCID₅₀ infiziert waren, Spuren (9–14) nicht infizierte CEF und Spur 15 negative Puffer-Kontrolle für eine RT-ähnliche Aktivität von Taq-Polymerase.
2 zeigt die Ergebnisse eines anfänglichen Übertragbarkeits-Assays, um die Menge von detektierbarer RT-Aktivität in einer biologischen Probe für einen gegebenen Satz von Parametern von PCR-Zyklen zu bestimmen. Nach dem Zellkulturteil des CoRT-Assays wird die RT-Aktivität festgestellt, indem 20 μl Aliquote von jeder PBRT-Reaktion auf einem 1,5% Agarose-Gel laufen gelassen werden. Eine positive Reaktivität wird durch das Vorliegen eines 242 bp spezifischen PCR-Produkts (Pfeile) angezeigt. Die folgenden Proben wurden auf RT-Aktivität nach 24 Zyklen (oben) und 27 Zyklen (unten) einer PCR-Amplifikation untersucht. Marker Spur (1); Puffer plus 5 × 10^–6 uAmvRT Spur (2); Puffer plus 5 × 10^–7 uAmvRT Spur (3); Test-Artikel ohne Spikes (d.h. ohne zugesetztes Retrovirus) Spuren (4 und 5); Test-Artikel plus RAV 1 Spike 10² TCID 50 Spuren (6 und 7); Test-Artikel plus RAV 1 Spike 1,0 TCID₅₀ Spuren (8 und 9); Test-Artikel plus bestrahltes RAV 1 Spike 10² TCID₅₀ Spuren (10 und 11); Kontroll-CEF Spuren (12 und 13); Puffer-Probe minus RT Spur (14); Marker Spur (15).
3 veranschaulicht die Ergebnisse von spezifischen PCR-Analysen, die verwendet wurden, um die CoRT-Analyse zu bestätigen. Genomische DNA wurde von den CEF-Kulturen, die in dem Übertragbarkeits-Assay verwendet wurden, hergestellt. Matrizen-DNA-Proben, die für eine PCR-Amplifikation verwendet wurden, sahen wie folgt aus: Marker Spur (1); Test-Artikel plus RAV1 Spike von 10² TCID-50 Spuren (2 und 3); Test-Artikel plus RAV1 Spike 1,0 TCID₅₀ Spuren (4 und 5); Test-Artikel plus bestrahltes RAV 1 Spike von 10² TCID₅₀ Spike Spuren (6 und 7); Test-Artikel kein Spike Spuren (8 und 9); Kontroll-CEF-Kulturen Spuren (10 und 11); Marker Spur (12). Der obere Satz der PCR-Reaktionen wurde mit den ALV-spezifischen Primerpaaren durchgeführt, gezeigt durch (ALV-Primer). Eine positive Reaktivität von den Probenspuren (2–5) wird anhand des Vorliegens des spezifischen 177 bp Produkts angezeigt. Der untere Satz von PCR-Reaktionen wurde mit dem EAV0-spezifischen Primerpaar durchgeführt, gezeigt durch (EAV-Primer), die für positive Matrizenkontrollen verwendet wurden. Die hoch redundante Natur von EAV0 und die Ähnlichkeit zu ALV(ev)-Loci führt zu der Amplifikation von mehreren Produkten, die in allen Proben vorgefunden werden, was darauf hinweist, dass alle amplifizierbare DNA enthalten.
Um den CoRT-Assay unter Verwendung von primären CEF in dem Übertragbarkeits-Assay zu entwickeln, war es notwendig den Grund(endogen)-Spiegel der RT-Aktivität, die mit dem Überstand von kultiviertem CEF assoziiert ist, zu bestimmen. Die Ergebnisse der vergleichenden PBRT-Analysen unter Verwendung von 20, 24, 27 und 32 PCR-Amplifikationszyklen sind in 1 gezeigt. Die vier Abschnitte stellen die selbe Probenreihenfolge mit den angegebenen PCR-Amplifikationsspiegeln dar. Die Daten in 1, Spuren 2–6, stellen Puffer-Proben, die mit gereinigtem AMV RT versehen waren. Wie erwartet, wurde eine quantitative, direkte Korrelation zwischen der Assay-Empfindlichkeit und der Anzahl der PCR-Zyklen beobachtet. Durch das Erhöhen der PCR-Zyklen von 20 auf 27 wurde die Assay-Empfindlichkeit um das Hundertfache erhöht, wie definiert durch Einheiten von nachgewiesenem AmvRT (1, Spur 3 bei 20 Zyklen und Spur 5 bei 27 Zyklen). Wichtiger ist jedoch, dass durch den Vergleich der gereinigten Probenüberstände, die von CEF-Zellen präpariert worden sind, die mit dem Vogel-Retrovirus RAV1 infiziert wurden (1, Spuren 7 und 8), zu den gereinigten Überständen, die von nicht infizierten CEF, die für den selben Zeitraum inkubiert wurden, präpariert worden sind (1, Spuren 9 bis 14), waren wir in der Lage Zyklusparameter zu definieren, um sowohl die Empfindlichkeit als auch die Fähigkeit zwischen dem RT-Aktivitätsspiegel, der inhärent zu den Zellen ist und dem, der mit exogenen replizierenden Viren assoziiert ist, quantitativ zu untersuchen. Proben von den mit exogenem Retrovirus infizierten CEF-Kulturen besitzen eine RT-Aktivität, die nach 20 Amplifikationszyklen nachweisbar ist (1, Spuren 7 und 8). Im Gegensatz dazu erfordern Proben aus nicht infizierten Kulturen (1, Spuren 9 bis 14) 27 Amplifikationszyklen, um eine signifikante Produktbande nachzuweisen. Eine kontrollierte PCR-Amplifikation machte daher einen tatsächlichen Unterschied zwischen einer RT-Aktivität, die mit Retrovirus gespickten Proben assoziiert ist und nicht infizierten Kontrollproben. Bei 32 PCR-Amplifikationszyklen wiesen alle Proben eine positive Reaktivität bezüglich der RT-ähnlichen Aktivität von Taq-Polymerase auf, einschließlich der Kontrolle (1, Spur 15 bei 32 Zyklen). Diese Ergebnisse bei 32 Amplifikationszyklen stimmen mit einer signifikanten PCR-Überamplifikation überein.
Der Amplifikationsspiegel, bei dem die Überstände in den nicht infizierten Proben bezüglich der RT-Aktivität positiv werden, definierten sowohl die Grundlinie für eine endogene RT-Aktivität in kultiviertem CEF als auch die Grenze der PBRT-Komponente der CoRT-Assay-Empfindlichkeit in kultivierten CEF-Zellen. Die Empfindlichkeit, die bei 27 PCR-Amplifikationszyklen erreicht wurde, betrug 5 × 10^–7 Einheiten AmvRT (1, Spur 5). Daher war es bei Verwendung von CoRT zum Nachweis des Vorliegens von exogenem Virus aus primären CEF-Überständen kritisch den PCR-Amplifikationsspiegel unterhalb von 27 Zyklen zu beschränken, um unterhalb der Schwelle der endogenen RT-Aktivität zu bleiben. Zieht man sowohl die Empfindlichkeit als auch die Selektivität in dem CoRT-Assay in Betracht, betrug der optimale PCR-Amplifikationsspiegel, der für die nachfolgende Entwicklung der PBRT-Detektion ausgewählt wurde, 24 Zyklen. Es ist hierbei wichtig zu erwähnen, dass nach 24 Amplifikationszyklen die RT-ähnliche Aktivität von Taq-Polymerase unterhalb der Detektion blieb wie sie mit der Puffer-Probe, die alle Reagenzien ohne eine RT-Quelle enthielt, blieb (1, Spur 14). Wenn Kontrollen sowohl für die endogene CEF-RT-Aktivität als auch für die RT-Aktivität, die mit Taq-Polymerase assoziiert ist, etabliert worden sind, war die positive Reaktivität von den CEF-Kulturen, die exogenes Virus enthalten, lediglich auf die RT-Aktivität zurückzuführen, die durch replizierende, exogene Virus-Partikel zustande kamen.
Nachweisgrenzen des CoRT-Assays
Nach 24 PCR-Amplifikationszyklen wies die Probe, die von CEF-Zellen präpariert wurde, die mit nur 1,0 TCID₅₀ des Vogel-Retrovirus RAV1 infiziert worden sind ( 1, Spur 8) eine positive Reaktivität in der PBRT-Analyse auf. Dies zeigte, dass eine so geringe Infektionsdosis von einem replikationskompetenten Virus von 1,0 in der Lage war auf einen Spiegel amplifiziert zu werden, so dass die assoziierte RT-Aktivität oberhalb der von nicht-infizierten Kontroll-Proben nachweisbar war. Nach 24 PCR-Amplifikationszyklen wies das nachgewiesene Produkt von beiden Proben, welche die exogene RT-Aktivität enthalten (1, Spuren 7 und 8) ein Signal auf, das äquivalent in der Intensität war zu dem, wie es mit 5 × 10^–6 Einheiten AmvRT (1, Spur 4) oder ungefähr 9 × 10⁵ Molekülen AmvRT zu beobachten war. Dieser Aktivitätsspiegel ist signifikant oberhalb der erforderlichen Schwelle von 5 × 10^–7 Einheiten oder 9 × 10⁴ Molekülen AmvRT in Proben, die lediglich eine endogene RT-Aktivität enthalten (1, Spuren 9 bis 14) und ermöglicht die Unterscheidung zwischen einer exogenen und einer endogenen Aktivität. Der Spiegel, bei dem eine endogene Aktivität in unserem PBRT-Detektions-Assay nachgewiesen wird, korreliert gut mit dem RT-Aktivitätsspiegel, der von EAV0 berichtet wird (21). Folglich müssen Test-Artikel, um eine positive Reaktivität in dem CoRT-Assay, in dem CEF-Zellen eingesetzt werden, aufzuweisen, einen damit verbundenen Virus-Spiegel besitzen, so dass nach einer Amplifikation die entstehende RT-Aktivität größer als die zelluläre endogene Schwelle von 5 × 10^–7 Einheiten AmvRT ist. Die Fähigkeit diesen Spiegel von einem replikationskompetenten Virus innerhalb des signifikanten RT-Hintergrunds von kultiviertem CEF nachzuweisen, ist auf eine spezifische Amplifikation von infektiösen Viruspartikeln während des Zellkulturübertragbarkeits-Teils des CoRT-Assays zurückzuführen.
Produkttest unter Verwendung des CoRT-Assays
Unter Verwendung des CoRT-Assays haben wir zahlreiche nicht-infizierte Kontrollzell-Rückhaltechargen (Zellüberstandsernten) von Batches der Vakzin-Herstellung getestet. Die Test-Artikel wurden untersucht, indem 1 ml des Test-Artikels mit oder ohne eines Stiches einer geeigneten Charge von Vogel-Retrovirus (RAV1) auf primären CEF, wie in Material und Methoden beschrieben, inkubiert wurden. Nach der Inkubationsperiode wurde der PBRT-Detektions-Assay verwendet, um die RT-Aktivität von den gereinigten Probenüberständen festzustellen. Repräsentative Daten sind in 2 dargestellt. Die Proben wurden entweder 24 Zyklen (oberer Teil) oder 27 Zyklen einer PCR-Amplifikation (unterer Teil) ausgesetzt. Wie erwartet, wies der Assay nach 24 PCR-Amplifikationszyklen eine Empfindlichkeit von 5 × 10^–6 Einheiten AmvRT auf (2, Spur 2). Die Test-Artikel wurden kontrolliert, indem ein Stich eines replikationskompetenten Vogel-Retrovirus RAV1 zugegeben wurde, um zu bestimmen, ob sie RT-inhibierende Faktoren enthalten. Proben von Test-Artikel, die Striche von 10² TCID₅₀ (2, Spuren 6 und 7) und 1,0 TCID₅₀ (2, Spur 8 und 9) von RAV enthalten, hatten eine positive Reaktivität in dem PBRT-Assay, was auf das Fehlen von Inhibitorenfaktoren hinweist. Test-Artikel, die mit ähnlichen Spiegeln von bestrahlten RAV1 (2, Spuren 10 und 11) oder ungespickten Proben versehen waren, zeigten keine Reaktivität nach 24 PCR-Amplifikationszyklen (2, Spuren 4 und 5). Nach 24 PCR-Amplifikationszyklen waren die nicht-infizierten Kontrollen für eine endogene RT-Aktivität von CEF (2, Spuren 12 und 13) und die Puffer-Probe (2, Spur 14) negativ, was darauf hinweist, dass die positive Reaktivität nicht das Ergebnis einer endogenen zellulären RT oder einer mit Taq-Polymerase assoziierten RT-ähnlichen Aktivität war.
Wenn die PCR-Amplifikationsspiegel auf 27 Zyklen erhöht wurden (2; unterer Teil), betrug die Empfindlichkeit des Assays 5 × 10^–7 Einheiten AmvRT (2, Spur 3). Jedoch wurden alle Proben von CEF-Kulturen ohne exogene Virus-Striche, die bei 24 Zyklen negativ waren, bei 27 Zyklen schwach positiv, da sie nun den Sequenz-Amplifikationsspiegel erreicht haben, der notwendig ist, um die zelluläre endogene RT-Aktivität nachzuweisen (2, Spuren 4 und 5 und 10 bis 13). Es wurde festgestellt, dass die Ergebnisse von allen PBRT-Assays hochreproduzierbar waren und die erreichte Assay-Empfindlichkeit betrug bei 24 Amplifikationszyklen 5 × 10^–6 Einheiten AmvRT. Unter Verwendung von positiven Virus-Strichen von 1,0 beschreibt TCID₅₀ den Detektionsspiegel beim CoRT-Assay gerade mal auf 1,0 Infektionsdosis von einem replikationskompetenten Retrovirus. Alle bis jetzt getesteten Artikel waren bezüglich einer exogenen RT-Aktivität negativ, wobei kein Anzeichen einer Assay-Inhibition auftrat.
Proben, die von den Zellkultur-Assays präpariert wurden, wurden auf das Vorliegen von infektiösen replizierenden Retroviren untersucht. Es wurden Zellkulturüberstände auf eine verstärkte RT-Aktivität unter Verwendung des PBRT-Assays untersucht, während zelluläre genomische DNA auf ein integriertes Provirus unter Verwendung eines spezifischen PCR-Assays hin untersucht wurde. Alle Test-Artikel, die mit infektiösen Virus gespickt worden sind, waren in dem PBRT-Assay und für das integrierte Provirus durch spezifische PCR positiv. Eine verstärkte RT-Aktivität ließ eine Replikation vermuten, während das Auffinden eines integrierten Provirus die Replikation und Amplifikation des Virus-Striches in der Gegenwart des Test-Artikels in dem Co-Kultur-Übertragbarkeits-Assay bestätigte. Die Tatsache, dass die UV-bestrahlten Virus-Striche kein positives Ergebnis, weder in dem PBRT- noch in dem PCR-Assay ergaben, unterstreicht weiter die Schlussfolgerung, dass eine virale Replikation notwendig ist, um positive Ergebnisse mit dem CoRT-Assay zu ergeben. Die negativen Ergebnisse von den ungespickten Test-Artikeln sowohl für die verstärkte RT-Aktivität als auch für das integrierte Provirus zeigten das Fehlen eines nachweisbaren replizierenden sekundären Retrovirus in jedem der Test-Artikel. Während wir die spezifischen PCR-Daten vorstellen, um die CoRT-Analyse zu bestätigen, beschränkt der enge Umfang eines spezifischen PCR-Tests die Einsetzbarkeit von solchen Assays für einen Produkt- oder Substrattest und verstärkt weiter die Entwicklung von breit angelegten Assays wie dem CoRT-Assay.
Bestätigung der Ergebnisse des CoRT-Assays unter Verwendung von Retrovirus-spezifischen PCR-Assays
Um die Ergebnisse, die mit dem CoRT-Assay erhalten wurden, zu bestätigen, wurden eine Reihe von Retrovirus-spezifischen PCR-Assays entwickelt, die integrierte genomische Provirus-Elemente zum Ziel haben. Diese Assays wurden auch entwickelt, um exogene provirale Retrovirus-Sequenzen von denen endogener proviraler Elemente zu unterscheiden. Bei der Entwicklung von spezifischen Primern für exogene ALV-Viren ist es wichtig zu berücksichtigen, dass alle CEF-Zellen ALV-endogene (ev)Loci-Sequenzen der Keimbahn tragen, soweit die Zellen nicht von Hühnern erhalten worden sind, die speziell gezüchtet worden sind, um gegenüber Viren der ALV-Unterklasse E resistent zu sein (28). Eine Sequenzanalyse, welche exogene und endogene ALV-Virus-Gruppen vergleicht, weist auf einen Sequenzunterschied innerhalb der LTR-U3-Region hin (29). Oligonukleotidprimer, die spezifisch für die U3-Region sind, wurden verwendet, um ein 177 bg Fragment von dem exogenen Provirus-Element zu amplifizieren. Zelluläre genomische DNA wurde von der Monoschicht von denselben Kulturen hergestellt, aus denen die gereinigten Überstände präpariert worden sind, um eine Korrelation zwischen den unterschiedlichen Assay-Systemen aufrechtzuerhalten. Unter Verwendung des spezifischen PCR-Assays für exogene ALV-Viren (3; obere Probenreihe) erhielten wir eine positive RT-Aktivität mit den Test-Artikel-Proben, die mit dem RAV1-Virus bei einem Spiegel von 10² TCID₅₀ (3, Spuren 2 und 3) und 1,0 TCID₅₀ (3, Spuren 4 und 5) gespickt waren. Zelluläre DNA, die von Proben präpariert wurde, die Test-Artikel enthielten, die mit 10² TCID₅₀ RAV1, das vor dem Ausplattieren bestrahlt wurde (3, Spuren 6 und 7) und Test-Artikel, die nicht gespickt waren (3; Spuren 8 und 9), waren für diese spezifischen proviralen Sequenzen negativ, was das Fehlen eines replizierenden ALV-ähnlichen Virus in den Test-Artikeln bestätigt. DNA, die aus nicht-infizierten Kulturen präpariert wurde (3, Spuren 10 und 11), war negativ, was auf keine Kreuzreaktivität der Primerpaare mit ALV(ev)Loci der Keimbahn hinweist. Um zu kontrollieren, dass die Integrität der DNA in erwarteten negativen ALV-spezifischen PCR auf Test-Artikel ohne Spikes zurückzuführen ist, verwendeten wir einen spezifischen PCR-Assay für die Amplifikation des hoch redundanten EAV0-Loci, der in allen CEF-Zellen vorhanden ist. Alle Proben (2–11) waren positiv, was darauf hinweist, dass alle Proben amplifizierbare genomische EAV0-spezifische Sequenzen aufwiesen.
LITERATURSTELLEN

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Claims

Verfahren zum Nachweis des Vorliegens einer größeren oder gleichen Menge eines vorausgewählten Spiegels von infektiösem Retrovirus in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren umfasst: a) Durchführen eines PBRT-Assays auf einem zellulären Substrat, das eine Retrovirusinfektion zulässt, um die Gesamtzahl der PCR-Zyklen in dem PBRT-Assay zu bestimmen die notwendig sind, um eine endogene reverse Transkriptase-Aktivität in dem zellulären Substrat nachzuweisen; b) Durchführen eines Anfangs-Transmissibilitäts-Assays, umfassend die Schritte des Inkubierens von Zellproben mit infektiösem Virus (Positivkontrolle) oder nichtinfektiösem Virus (Negativkonrolle) für eine ausreichend lange Zeit, Durchlaufens eines PBRT-Assays mit dem Überstand der Inkubationen, Isolierens der genomischen DNA aus den Zellen der Positiv- und Negativkontrolle, Durchlaufens einer Virusspezifischen PCR-Reaktion mit der isolierten genomischen DNA und Korrelierens der Ergebnisse der spezifischen PCR-Amplifikationen mit den Ergebnissen des PBRT-Assays, zur Bestimmung der Transmissibiltätsparameter, die einen Amplifikationsgrad ergeben, der für den vorausgewählten Spiegel einer Retrovirusinfektion notwendig ist, um eine in einem PBRT-Assay nachweisbare reverse Transkriptase-Aktivität zu erzeugen, unter Verwendung einer geringeren Mindestzahl von PCR-Zyklen die notwendig sind, um eine endogene reverse Transkriptase-Aktivität in dem zellulären Substrat nachzuweisen; c) Durchlaufen eines Transmissibiltäts-Assays mit der biologischen Probe unter Einsatz der in b) bestimmten Parameter um eine amplifizierte biologische Probe zu erzeugen; d) Durchlaufen eines PBRT-Assays mit der amplifizierten Probe aus c) unter Einsatz einer geringeren Mindestzahl von PCR-Zyklen die notwendig sind, um eine endogene reverse Transkriptase-Aktivität in dem zellulären Substrat nachzuweisen; e) Nachweisen des Vorliegens des PCR-Produkts, das einen Spiegel von infektiösem Retrovirus in der biologischen Probe anzeigt der größer oder gleich dem vorausgewählten Spiegel ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zelluläre Substrat aus einer Vogelart stammt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zelluläre Substrat Hühnerembro-Fibroblasten ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Anzahl der PCR-Zyklen in dem PBRT-Assay 24–26 beträgt.
Verfahren zum Nachweis des Vorliegens einer größeren oder gleichen Menge eines vorausgewählten Spiegels von infektiösem Retrovirus in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren umfasst: a) Ko-Kultivieren der biologischen Probe mit einem zellulären Substrat, das eine Retrovirusinfektion zulässt, unter Bedingungen, die eine Retrovirusamplifikation zulassen, wobei das infektiöse Retrovirus in der biologischen Probe amplifiziert wird, um einen Spiegel von infektiöser Retrovirus RT-Aktivität zu erzeugen, die größer ist, als die endogene, nicht-infektiöse Retrovirus RT-Aktivität des zellulären Substrats; b) Durchlaufen eines PBRT-Assays mit der Ko-Kultur, wobei eine Anzahl von PCR-Zyklen eingesetzt wird, die gleich oder größer ist als die Anzahl, die zum Nachweis der exogenen, infektiösen RT-Aktivität in der Ko-Kultur erforderlich ist, aber geringer ist als die Anzahl, die zum Nachweis der endogenen, nicht-infektiösen RT-Aktivität erforderlich ist; c) Feststellen, ob die PCR-amplifizierte Nukleinsäure in der Ko-Kultur, die den PBRT-Assay durchläuft, vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das zelluläre Substrat von einer Vogelart stammt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das zelluläre Substrat Hühnerembryo-Fibroblasten ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Anzahl der PCR-Zyklen in dem PBRT-Assay 24–26 beträgt.
Verbessertes Verfahren zum Nachweis der reversen Transkriptase-Aktivität in einer biologischen Probe unter Verwendung eines PBRT-Assays, wobei die Verbesserung umfasst: a) vor dem Durchführen des PBRT-Assays werden die infektiöse Retroviren in der biologischen Probe derart amplifiziert, dass der RT-Aktivitätsspiegel oberhalb des endogenen RT-Aktivitätsspiegels liegt; b) Durchführen des PBRT-Assays auf dem amplifizierten Produkt von a) unter Verwendung einer Anzahl von PCR-Zyklen die geringer ist diejenige die notwendig ist, um eine endogene reverse Transkriptase-Aktivität nachzuweisen und größer ist als diejenige, die erforderlich ist, um eine amplifizierte exogene, infektiöse reverse Transkriptase-Aktivität nachzuweisen.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das zelluläre Substrat von einer Vogelart stammt.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das zelluläre Substrat Hühnerembryo-Fibroblasten ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Anzahl der PCR-Zyklen in dem PBRT-Assay 24–26 beträgt.