CN118048465A - 一种基于多重pcr技术鉴定微生物的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于多重PCR技术鉴定微生物的方法和应用。所述方法包括使用如本发明所述的正向茎环引物、反向茎环引物、茎环引物对或茎环引物对的组合扩增待测样本中的核酸，测序和比对分析扩增后的产物，鉴定所述待测样本中微生物的种类。本发明提供的基于多重PCR技术鉴定微生物的方法包含了几百重的检测范围(最多可包含924对检测引物对)，远高于现有的多重PCR技术中几重至十多重的范围，能够以更少的成本、更高的检测效率、检测灵敏度和特异性对待测样本中的微生物进行鉴定。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于多重PCR技术鉴定微生物的方法和应用。
背景技术
多重PCR(multiplex polymerase chain reaction，mPCR)也称复合PCR，即可在一个反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段。目前，已经被广泛应用于应用在动植物病原菌检测、基因分型、遗传育种和司法鉴定等方面。多重PCR技术在病原菌检测上的应用目前多数仅处于几重至十多重这样的范围内，目前多重PCR结合高通量测序技术受限于扩增效率和引物二聚体等问题还没有广泛的使用。
当使用的引物对数量越多，引物对彼此间存在同源部分的可能性越高、且不同引物对之间扩增效率差异极大，因此要过滤掉同源性过高的序列防止引物二聚体的产生，同时又要控制剩下的引物对之间扩增效率相当，这样的困难是随着引物对数量的增加指数级地升高的。此外，茎环结构的引物会导致PCR扩增效率下降，从而导致监测的灵敏度的降低，因此目前无法将其直接应用于多重PCR领域。
综上，仍需针对本领域现存的缺陷开发新的基于多重PCR技术鉴定微生物的方法。
发明内容
为了克服现有技术中利用多重PCR技术鉴定微生物时，引物之间容易形成引物二聚体、引物的扩增效率低、容易扩增出非特异产物以及产量不均一的技术问题，本发明提供了一种基于多重PCR技术鉴定微生物的方法和应用，可以保证避免非特异扩增和产量均一性的同时，极大的减少引物二聚体的产量，进一步提升该方法的效率，减少测序量，节约成本。
本发明鉴定微生物的步骤包含两部分，整体实验流程如图1所示：
第一部分为超多重建库，包含两轮PCR：第一轮PCR包含两类引物，第一类引物为茎环引物，第二类引物为通用引物，两类引物存在浓度差异(茎环引物：通用引物的浓度比为1:100)，其中第一类引物远少于第二类引物，这一设计是为了减少引物二聚体形成的同时对目标序列进行富集。第二轮PCR引物则包含测序引物序列和8个随机核苷酸组成的分子标签序列。
第二部分为测序，采用Illumina Miseq测序平台，PE50测序策略。
为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种正向茎环引物，所述正向茎环引物的核苷酸序列从5’到3’方向依次包括正向互补序列、连接序列、正向通用序列和正向特异性序列；所述正向通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述正向互补序列包含能够与所述正向通用序列碱基互补配对的序列。
在本发明的具体实施方案中，所述正向互补序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；和/或，所述连接序列的核苷酸序列为：ATAATA。
在本发明的较佳实施方案中，所述正向特异性序列的核苷酸序列选自下表中的任一种：
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，或者所述正向特异性序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15或SEQID NO: 17所示；
和/或，所述正向茎环引物在所述连接序列和所述正向通用序列之间还含有正向间隔序列；例如所述正向间隔序列的核苷酸序列为GCTGC。
通过美国国家生物技术信息中心NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)能够检索到上表中的NCBI Gene ID所对应的基因组或基因序列，所述正向特异性序列的核苷酸序列分别为在相应的基因组或基因序列上从“正向特异性序列在NCBI Gene ID对应的序列的起始位点”到“正向特异性序列在NCBI Gene ID对应的序列的终止位点”的核苷酸序列。例如，根据上表，所述正向特异性序列的核苷酸序列可以为在NCBI上检索“NC_012532.1”所获得的全长基因组序列中的第9611～9630位核苷酸。
为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种反向茎环引物，所述反向茎环引物的核苷酸序列从5’到3’方向依次包括反向互补序列、连接序列、反向通用序列和反向特异性序列；所述反向通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示，所述反向互补序列包含能够与所述反向通用序列碱基互补配对的序列。
在本发明的较佳实施方案中，所述反向互补序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示；和/或，所述连接序列的核苷酸序列为：ATAATA。
在本发明的更佳实施方案中，所述反向特异性序列的核苷酸序列选自下表中的任一种：
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，或者所述反向特异性序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16或SEQID NO: 18所示；
和/或，所述反向茎环引物在所述连接序列和所述反向通用序列之间还含有反向间隔序列；例如所述反向间隔序列的核苷酸序列为TACCA。
通过美国国家生物技术信息中心NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)能够检索到上表中的NCBI Gene ID所对应的基因组或基因序列，所述反向特异性序列的核苷酸序列分别为在相应的基因组或基因序列上从“反向特异性序列在NCBI Gene ID对应的序列的起始位点”到“反向特异性序列在NCBI Gene ID对应的序列的终止位点”的核苷酸序列。例如，根据上表，所述反向特异性序列的核苷酸序列可以为在NCBI上检索“NC_012532.1”所获得的全长基因组序列中的第9797～9816位核苷酸。
为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种茎环引物对，所述茎环引物对包含如本发明所述的正向茎环引物和如本发明所述的反向茎环引物。
在本发明的较佳实施方案中，所述茎环引物对中所述正向茎环引物的正向特异性序列如SEQ ID NO: 13所示，且所述反向茎环引物的反向特异性序列如SEQ ID NO: 14所示；
或者，所述茎环引物对中所述正向茎环引物的正向特异性序列如SEQ ID NO: 15所示，且所述反向茎环引物的反向特异性序列如SEQ ID NO: 16所示；
或者，所述茎环引物对中所述正向茎环引物的正向特异性序列如SEQ ID NO: 17所示，且所述反向茎环引物的反向特异性序列如SEQ ID NO: 18所示；
或者，所述茎环引物对选自下表中的任一种：
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通过美国国家生物技术信息中心NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)能够检索到上表中的NCBI Gene ID所对应的基因组或基因序列。“正向特异性序列在NCBI GeneID对应的序列的起始位点”和“正向特异性序列在NCBI Gene ID对应的序列的终止位点”表示所述正向茎环引物的正向特异性序列位于相应的基因组或基因序列上的第几位到第几位；“反向特异性序列在NCBI Gene ID对应的序列的起始位点”和“反向特异性序列在NCBIGene ID对应的序列的终止位点”表示所述反向茎环引物的反向特异性序列位于相应的基因组或基因序列上的第几位到第几位。例如，茎环引物对924包含的正向茎环引物的正向特异性序列的核苷酸序列为在NCBI上检索“NC_012532.1”所获得的全长基因组序列中的第9611～9630位核苷酸；茎环引物对924包含的反向茎环引物的反向特异性序列的核苷酸序列为在NCBI上检索“NC_012532.1”所获得的全长基因组序列中的第9797～9816位核苷酸。
为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种茎环引物对的组合，所述茎环引物对具有正向茎环引物和反向茎环引物，所述正向茎环引物从5’到3’方向包含正向茎环序列和正向特异性序列，所述反向茎环引物从5’到3’方向包含反向茎环序列和反向特异性序列；所述茎环引物对的组合包含以下茎环引物对：
正向茎环引物的正向特异性序列如SEQ ID NO: 13所示，且反向茎环引物的反向特异性序列如SEQ ID NO: 14所示的茎环引物对；
正向茎环引物的正向特异性序列如SEQ ID NO: 15所示，且反向茎环引物的反向特异性序列如SEQ ID NO: 16所示的茎环引物对；
正向茎环引物的正向特异性序列如SEQ ID NO: 17所示，且反向茎环引物的反向特异性序列如SEQ ID NO: 18所示的茎环引物对；
和，如下表所示的茎环引物对：
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并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
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并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
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并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
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并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
在本发明的具体实施方案中，所述茎环引物对的组合包含上述茎环引物对编号为1～924的所有的茎环引物对。
在本发明的具体实施方案中，所述正向茎环序列从5’到3’方向依次包括正向互补序列、连接序列和正向通用序列；所述正向通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述正向互补序列包含能够与所述正向通用序列碱基互补配对的序列；和/或，所述反向茎环序列从5’到3’方向依次包括反向互补序列、连接序列和反向通用序列；所述反向通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述反向互补序列包含能够与所述反向通用序列碱基互补配对的序列。
在本发明的较佳实施方案中，所述正向互补序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，和/或，所述连接序列的核苷酸序列为：ATAATA；和/或，所述反向互补序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示，和/或，所述连接序列的核苷酸序列为：ATAATA。
在本发明的更佳实施方案中，所述正向茎环引物在所述连接序列和所述正向通用序列之间还含有正向间隔序列，所述正向间隔序列的核苷酸序列例如为GCTGC；和/或，所述反向茎环引物在所述连接序列和所述反向通用序列之间还含有反向间隔序列，所述反向间隔序列的核苷酸序列例如为TACCA。
为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种试剂盒，所述试剂盒包含如本发明所述的正向茎环引物、如本发明所述的反向茎环引物、如本发明所述的茎环引物对或如本发明所述的组合。
在本发明的较佳实施方案中，所述试剂盒还包含正向通用引物和/或反向通用引物；所述正向通用引物包含能够与所述正向互补序列碱基互补配对的序列；所述反向通用引物包含能够与所述反向互补序列碱基互补配对的序列。
在本发明的更佳实施方案中，所述正向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示，和/或，所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：一种鉴定微生物的方法，所述方法包括：使用如本发明所述的正向茎环引物、如本发明所述的反向茎环引物、如本发明所述的茎环引物对或如本发明所述的组合以及正向通用引物和反向通用引物，或使用如本发明所述的试剂盒，扩增待测样本中的核酸，测序和比对分析扩增后的产物，鉴定所述待测样本中微生物的种类；所述正向通用引物包含能够与所述正向互补序列碱基互补配对的序列；所述反向通用引物包含能够与所述反向互补序列碱基互补配对的序列。
在本发明的优选实施方案中，所述方法为非诊断和/或治疗目的的；和/或，所述微生物为病原微生物。
在本发明的具体实施方案中，所述扩增的扩增反应体系中，所述正向茎环引物和所述反向茎环引物与所述正向通用引物和反向通用引物的浓度比为1:80～1:125，优选1:100；和/或，所述测序为高通量测序。
在本发明的较佳实施方案中，所述正向茎环引物和所述反向茎环引物的浓度为0.09～0.11 μM，优选0.1 μM；所述正向通用引物和反向通用引物的浓度为9～11 μM，优选10 μM；和/或，所述高通量测序为Illumina Miseq测序，优选PE50测序。
在本发明的更佳实施方案中，所述正向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示，和/或，所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；和/或，所述测序的正向测序接头引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，和/或，所述测序的反向测序接头引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
为解决上述技术问题，本发明提供的一个技术方案为：如本发明所述的正向茎环引物、如本发明所述的反向茎环引物、如本发明所述的茎环引物对、如本发明所述的组合或如本发明所述的试剂盒在鉴定微生物中的应用。
在本发明的优选实施方案中，所述应用为非诊断和/或治疗目的的；和/或，所述微生物为病原微生物。
在本发明中，所述“非诊断和/或治疗目的”的应用场景包括但不限于在实验室中出于科研目的鉴定实验待测样本中包含哪些微生物。所述“待测样本”可以来自人体或其他动物体，也可以来自非生物体的表面或内部，例如固体(如医疗器械)的表面或内部，或液体(如待测水源)等。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1、在引物特异性设计方面，根据保守性、引物长度、扩增产物、GC含量等进行了严格的筛选，保证了引物的特异性；
2、引物结构设计上：在特异性引物的5'端，引入了一段通用的茎环序列，避免二聚体的产生；
3、在产物均一性上，首先计算了每对引物的扩增效率，结合实验数据筛选出扩增效率相当的引物；在实验过程中，摸索出特异性引物的低浓度进行循环的扩增后，再由高浓度的通用引物进行PCR扩增，保证了各个产物的均一性，提高了检测灵敏度。
本发明提供的基于多重PCR技术鉴定微生物的方法包含了几百重的检测范围(最多可包含924对检测引物对)，远高于现有的多重PCR技术中几重至十多重的范围，能够以更少的成本、更高的检测效率、检测灵敏度和特异性对待测样本中的微生物进行鉴定。
附图说明
图1为本发明鉴定微生物的整体实验流程图。
图2为包含茎环结构的引物的结构示意图。
图3为二聚体跑胶确认图，其中泳道从左至右依次为：1：marker；2-3：线性引物，混合引物浓度10μM；4-5：线性引物，混合引物浓度1μM；6-7：线性引物，混合引物浓度0.1μM；8-9：茎环引物，混合引物浓度0.1μM。
图4为建库跑胶图，其中泳道从左至右依次为：1：marker；2-6：阳性混合质粒2轮扩增电泳条带。
图5为捕获的924个载体片段构建的文库的测序库检图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1 多重PCR引物设计
(1) 不同微生物的保守性片段获取
a) 微生物基因组的准备：在NCBI数据库中，下载质量较好的基因组序列，选择顺序：complete>chromosome>scaffold>conting；尽量选择有完整或达到染色体级别的基因组，对于没有测序或者拼接较差的基因组的物种，可以在NCBI上下载已经经过验证报道的基因、序列片段或保守序列(ITS序列等)；
b) 微生物比对注释数据库的准备：下载NCBI(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/FASTA/)nt.gz所有物种的数据库，去除植物、动物(仅保留人的)、载体和预测序列(依据个人目的进行排除)，构建一个病原微生物的数据库。然后采用taxonomy文件(https://ftp.ncbi.nih.gov/pub/taxonomy/)将构建的病原微生物数据库进行注释，保存为微生物比对注释文件；
c) 保守序列的鉴定：将需要鉴定分析微生物基因组或基因序列，进行Kmer切割分析，切割成500bp，步长为50bp，形成保守序列候选池。使用每个物种的保守序列候选池与上述的微生物比对注释文件进行blastn比对分析。依据比对结果，过滤掉比对到非该物种(属)的片段，仅仅保留比对到目的微生物的片段；
d) 获得特异性保守序列：依据组成分析方法，进行查找特异性保守序列。对上述保留的比对到目的微生物的片段进行排序，其排序依据是按照该片段对比到目的微生物的条目种类，按照从少到多进行排序。为了确保其保守性，选择排序前10条序列作为保守性序列候选序列。进一步的为了满足能覆盖更多的种和亚种，将候选序列按照比对到的该微生物的种和亚种进行排序，按照从多到少进行排序，挑选覆盖更多种和亚种的序列。一般的，挑选3-6条序列即可。
(2)多重PCR引物设计
a)引物设置条件：利用primer3软件，对上述获得的特异性保守序列进行引物设计，设置条件如下：引物长度在18-26个碱基，优选的是20个碱基；扩增产物长度在180-220个碱基，优选的是200个碱基；引物的GC含量为40％-60％，优选的是50％；引物的寡核苷酸重复数最大容忍度为3个；单个引物的(局部)自互补性时允许的最大局部比对得分为8；正向和反向引物之间的互补性时允许的最大局部比对得分为3；每个特异性保守序列保留最好的3对引物；
b)将所有设计的引物形成一个引物池，然后使用blastn将引物池进行自身比对，根据比对结果，过滤超过4个碱基能比对到其他引物的引物；每个特异性保守片段仅保留一对引物。最终形成多重PCR的引物池，保证每种目标微生物至少有3对引物。
c)对于不同微生物有着不同引物组合的设计，其中细菌，由于其基因组大小适中，突变概率等因素，引物设计优选至少为3对，最多不应该大于6对引物组合；真菌，依据其现有提取的问题，引物优选至少5对以上，最多不应该多于12对；病毒由于其突变率较高，引物优选至少在6对以上，最多不应该多于10对；其他的物种，引物设计优选不低于3对，最多也不应该大于6对引物。实际引物对的数量可根据具体物种的特点调整。
(3)引物扩增效率计算
a)根据以上设计原则得到PCR的引物池，根据文献Mallona I,Weiss J,Egea-CortinesM.pcrEfficiency:a Web tool for PCR amplification efficiencyprediction.BMC Bioinformatics.2011 Oct 20；12:404.doi:10.1186/1471-2105-12-404.PMID:22014212；PMCID:PMC3234296.计算每对引物的扩增效率，选用广义加性模型，计算模型如下：
efficiency～s(lengthSequence,gcSequence)+s(primersLength,gcPrimers)+s(gcImbalance,primerDimers)
其中，lengthSequence为扩增序列的长度；gcSequence为扩增序列的GC含量，计算公式为：序列中G的数量+序列中C的数量/序列中G的数量+序列中C的数量+序列中A的数量+序列中T的数量；primersLength为正向引物和反向引物的长度总和，gcPrimers为扩增引物的GC含量，计算公式为：正向引物的GC含量+反向引物的GC含量/2；gcImbalance为正向引物的GC含量-反向引物的GC含量的绝对值，primerDimers打分具体步骤为分别将正反向引物按照每三个碱基进行切割形成两个碱基池，然后遍历正向引物池，一旦正向引物的三个碱基存在于反向引物池中，计分加一。
b)根据以上步骤得到的引物扩增效率对引物对序列进行筛选，合成引物后混合成引物池，模板为本发明实施例4中合成的目标片段构建的载体，实验条件为本发明实施例4中所列的扩增条件。完成两轮扩增后建库，然后进行二代测序。最后使用BWA-MEM软件将扩增子比对到对应的数据库，计算每对引物的reads数量；计算扩增效率与reads数量的线性规律的相关性，并根据该相关性对引物对进行筛选，尽量选取扩增效率一致的引物对，选取的引物对及其扩增效率如表1所示。
表1引物对及其扩增效率
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表1中：
引物spike_in-2-F，SEQ ID NO: 13：GAAGGCTATCATGCGATACA
引物spike_in-2-R，SEQ ID NO: 14：ATATGCTAGCTCGCCAGCGC
引物spike_in-3-F，SEQ ID NO: 15：AAATTGGCTCTGCGATTCCT
引物spike_in-3-R，SEQ ID NO: 16：GCAGCGTGTCTATCCTACTG
引物spike_in-5-F，SEQ ID NO: 17：GGGTCTGGATACGAGGAATC
引物spike_in-5-R，SEQ ID NO: 18：CAGTTAATAATGGCAGCTCC
表1中编号为4～924的引物对的序列可以根据表1中的NCBI Gene ID通过美国国家生物技术信息中心NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)检索到相应物种的基因组或基因序列，“primer_id”后的“start”和“end”分别对应该引物的序列位于相应的基因组上的第几位到第几位。例如，引物对编号4包含两条引物“Acanthamoeba_astronyxis-7-F”和“Acanthamoeba_astronyxis-7-R”，其中“Acanthamoeba_astronyxis-7-F”的核苷酸序列为在NCBI上检索“CDFH01096962.1”所获得的全长基因组序列中的第147～166位核苷酸；“Acanthamoeba_astronyxis-7-R”的核苷酸序列为在NCBI上检索“CDFH01096962.1”所获得的全长基因组序列中的第329～348位核苷酸。
实施例2茎环接头设计
为了减少在扩增过程中形成二聚体，本发明在实施例1中筛选获得的正反向引物中引入了茎环结构，用于第一轮扩增体系。包含茎环结构引物的序列从5’到3’方向依次包括了茎环序列(互补序列、连接序列、间隔序列和通用序列)和特异性序列。
其中正向互补序列为：taatgaacacgtg(SEQ ID NO:1)，正向连接序列为：ATAATA，正向间隔序列为：GCTGC，正向通用序列为：CACGTGTTCATTA(SEQ ID NO:2)；反向互补序列为：acttctaggacca(SEQ ID NO:3)，反向连接序列为：ATAATA，反向间隔序列为：TACCA，反向通用序列为：TGGTCCTAGAAGT(SEQ ID NO:4)；特异性序列即实施例1的表1中筛选获得的正向或反向引物。具体的结构如图2所示。其中间隔序列并非是茎环引物的必须结构，其能够起到标记定位作用，可以设计不同的5个碱基标记不同的样本，防止样本间的污染。
实施例3验证二聚体减少效果实验
分别设计合成了如表1所示的924对常规线性化引物和924对茎环引物，分别作为线性引物和茎环引物的引物panel，使用水作为模板，进行扩增，验证引物二聚体是否会减少。
PCR体系：
多重酶mix(诺维赞，Taq Pro Multiplex DNA Polymerase)25μl
引物panel 3μl
无菌水至50μl
PCR程序：
扩增完成后，制备1％的琼脂糖胶，进行跑胶确认，引物二聚体情况如图3所示，泳道8-9所对应的茎环引物的引物二聚体条带明显更淡，说明混合的茎环引物明显减少了引物二聚体的形成。
实施例4阳性质粒多重捕获实验
1、多重捕获
设计合成了924个基因片段序列，分别构建到Puc57载体上获得相应的阳性质粒。该924个基因片段如表1“比对菌片段”所示，片段的全长从正向引物的“start”到其反向引物的“end”，例如，片段“棘阿米巴原虫-7”的核苷酸序列为在NCBI上检索“CDFH01096962.1”所获得的全长基因组序列中的第147～348位核苷酸。
另外，比对菌片段“内参-2”、“内参-3”和“内参-5”的片段序列如下：
片段内参-2，SEQ ID NO:19
TGTAAGCCGTAACACCCGTATTACTTCATAATCGTTTGTAATTCAGAGCTTGATCTACATTGG
ATTGCCATTCTCTCAAAGTATTATGCAGAATGGCGTACGCATTCCATATAAACCTATCATAATTTAC
CTGAAACTAGTTAGAAATGTGGCTAGATTTTTGCTCACGCATCTAATCGGTCCACGTTTGGTTTTT
AAAATCCAATGATCTTCAAAACATTACAAGATTCTCAACCTGCTTTACTAAGTACTGGATCCTATT
CCAGCGGGATTTTTTATCTAAAGACAATGAGAGAAGTATTCGTCAGACCACATAGCTTTCATGTT
CTGATCGGAAGGATCGTTGGCGCCCGATCCTCAGATTCTATAGTGAGTTCTATGTCTGAGTCATTG
TATGCGAGATCGATAGATTAATAGGGGATACAGAATATCTCTGGATACAATAGACGAACAGTTTGA
TATCTTAAGTGTAATCACGCGTCTAAACTCAGCTCTATTTT
片段内参-3，SEQ ID NO:20
CGATTGCATTGCCATTCTCCGAGTGATTTAGCGTGACAGCCGCAGGGAACCCATAAAATGCA
ATCGTAGTCCACCTGATCGTACTTAGAAATGAGGGTCCCCTTTTGCCCACGCACCTGTTCGCTCG
TCGTTTGCTTTTAAGAACCGCACGAACCACAGAGCATAAAGAGAACCTCTAGCTCCTTTACAAA
GTACTGGTTCCCTTTCCAGCGGGATGCCTTATCTAAACGCAATGACAGACGTATTCCTCAGGCCA
CATCGCTTCCTACTTCCGCTGGGATCCATCATTGGCGGCCGAAGCCGCCATTCCATAGTGAGTCCT
TCGTCTGTGTCTTTCTGTGCCAGATCGTCTAGCAAATTGCCGATCCAGTTTATCTCACGAAACTAT
AGTCGTACAGACCGAAATCTTAAGTCAAATCACGCGACTAGGCTCAGCTCTATTTTAGTGGTCAT
GGGTTTTGGTCCGCCCGAGCGGTGCAACCGATTAGGACCATGTAAAA
片段内参-5，SEQ ID NO:21
GTTAGAGGCCCGCTAAACCGCACCGCCGGCGCCCCCTGGGTACTTTACGCCAGCATCGGGT
GGGCTGGCATGTACCTTCCCTCCCAGGGGCATGCGGGTGCGCGGACGAGCGGGCAGCGAACGT
AAATTCCCGGCGTGCTTGGCGCCCCGCGTCCCTCCTGGGGATCGAGGGAGTGTTCCGCGACCGA
GCGAGAGGCCGCCCTGCGGAATGGATTTGCGCTACTGCCCGCGTGAGGAGACCGGTGTAGCCAA
GGACGAGGGCGACCCTAGGTCCCAACCGCCGGCTCCGGCGGTGAGGCATCACTCAGGGAGCAG
GCACCGATAGGCACGGTCCAGCGGACCGTCTGACGGCTGGGCCAAATCGGGCGGTCCGGTATCG
GCGTGTCCGGCCTTAGGACTCGGCGCAGCGCGCTGGCCCGGGTCGAGCTGAAAACACCGGCGC
CCAAGACCAGGCGGGCCCGCCGCGTCGGCTAACCCCGGTACATCCTGTAAACGACGTT
引物池(引物panel)为带有实施例2中茎环结构的如表1所示的对应的924对茎环引物，混合成浓度为0.1μM作为工作浓度。模板为将上述924个阳性质粒用引物M13F/R(M13F：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’，SEQ ID NO:5；M13R：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’，SEQ ID NO:6)扩增后获得的基因片段分别稀释成10ng/μl后，等量混合，使用无菌水稀释成1ng/μl，作为投入模板的浓度。额外投入1对高浓度(10μM)的通用引物(TY-F GCTGCCACGTGTTCATTA，SEQ ID NO:11；TY-R TACCATGGTCCTAGAAGT，SEQID NO:12)，保证各个扩增子的均一性。其扩增体系如下：
PCR体系：
PCR程序：
2、第一轮PCR产物纯化
(1)向样品管中加入待纯化的上述PCR产物的DNA样本溶液。
(2)取1.3×样品体积的磁珠(诺维赞，VAHTS DNA Clean Beads，货号：N411-01)溶液加入样品中，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置结合5min。
(3)将离心管瞬离约3s并置于磁力架中，待溶液澄清后(>2min)，小心移除上清保留磁珠。
(4)保持离心管始终置于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温静置30s，小心移除上清。
(5)重复步骤(4)。
(6)保持离心管始终置于磁力架中，开盖室温晾干磁珠至刚刚出现龟裂(约5min)。
(7)将离心管从磁力架中取出，加入适量DEPC水(≥20μl)，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5min，小心吸取上清至干净的管中，即完成纯化。
3、添加测序接头
PCR富集产物纯化后，进行第二轮PCR扩增，为产物添加高通量测序的测序接头。
接头引物序列为：
2P-1-C-F(SEQ ID NO:7)
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTGCCACGTGTTCATTA
2P-1-C-R(SEQ ID NO:8)
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTACCATGGTCCTAGAAGT
PCR体系：
PCR程序：
4、第二轮PCR产物纯化
1)涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
(2)向DNA溶液中加入第一轮对应体积分选磁珠(0.7×)，瞬离3s，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。
(3)室温结合5min。
(4)将离心管瞬离约3s并置于磁力架中，待溶液澄清后(>2min)，小心转移上清至一支干净的离心管中。
(5)向上清中加入第二轮对应体积分选磁珠(0.2×)，瞬离3s，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。
(6)室温结合5min。
(7)将离心管瞬离约3s并置于磁力架中，待溶液澄清后(>2min)，小心移除上清。
(8)保持离心管始终置于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温静置30s，小心移除上清。
(9)重复步骤(8)。
(10)保持离心管始终置于磁力架中，开盖室温晾干磁珠至刚刚出现龟裂(约5min)。
(11)将离心管从磁力架中取出，加入适量DEPC水(≥20μl)，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5min，小心吸取上清至干净的管中，即完成分选。
5、跑胶确认
制备1％的琼脂糖胶，进行跑胶确认，建库的片段大小应该在350bp左右，图4为跑胶结果，条带大小正确，无二聚体。外送测序库建，如图5所示，片段大小合适而且无二聚体。
测序的检测结果如下表2所示(A1、A2和A3分别代表3次实验重复)，924个载体片段均捕获获得，进行了三次重复检测分析，结果显示重复性良好。
表2混合载体片段捕获测序结果(部分展示)
| 载体片段名称 | A1_numreads | A2_numreads | A3_numreads |
| Aspergillus_fumigatus-82 | 35678 | 27584 | 40181 |
| Epstein_barr_virus1-506 | 33990 | 22611 | 50587 |
| Influenza_B_virus-824 | 26433 | 18767 | 34540 |
| Aspergillus_flavus-73 | 25497 | 18848 | 25311 |
| Pseudomonas_aeruginosa-1325 | 25485 | 22628 | 25531 |
| Mycobacterium_tuberculosis-1099 | 20724 | 17562 | 24533 |
| Mycoplasma_pneumoniae-1165 | 20067 | 16713 | 24525 |
| Epstein_barr_virus2-524 | 20042 | 17568 | 20621 |
| Aspergillus_flavus-74 | 18157 | 14687 | 19282 |
| Klebsiella_pneumoniae-845 | 15152 | 11855 | 19505 |
| Streptococcus_mitis-1517 | 14085 | 12334 | 16593 |
| Influenza_A_virus1-805 | 12535 | 9668 | 14482 |
| Haemophilus_influenzae-601 | 10312 | 8949 | 12341 |
| Pseudomonas_aeruginosa-1320 | 10257 | 9751 | 10761 |
| Influenza_A_virus1-810 | 9676 | 8168 | 10597 |
| Klebsiella_pneumoniae-843 | 9657 | 7464 | 9915 |
| Klebsiella_pneumoniae-842 | 9071 | 7733 | 13965 |
| Klebsiella_pneumoniae-847 | 8680 | 7866 | 7841 |
| Aspergillus_fumigatus-85 | 8167 | 6102 | 10579 |
| Klebsiella_pneumoniae-846 | 8115 | 6589 | 8636 |
| Aspergillus_fumigatus-83 | 7510 | 5409 | 8331 |
对比例1茎环接头设计
特别说明的是，本发明通用序列是经过优化筛选的，需满足如下条件：1)序列长度小于特异性引物长度4个碱基以上，但是引物长度不短于16nt；2)序列不应该存在于自然界中，与nt库比对筛选；3)通用引物的GC含量45％-55％，最优选的是50％。
除了实施例2中的茎环序列，按照上述条件另外设计了如下一对茎环序列：
正向茎环序列(SEQ ID NO:9)：TY-F:tatcttgagtgaAAGGCATCACTCAAGATA
反向茎环序列(SEQ ID NO:10)：TY-R:cgtacgttaccgaCAGGCTCGGTAACGTACG
按照与实施例2相同的方法，构建包含本对比例中正向或反向茎环序列和如实施例1的表1所示的正向或反向引物作为特异性序列的茎环引物，并且按照与实施例4完全相同的方法，用本对比例构建的924对茎环引物进行阳性质粒多重捕获实验，测序的检测结果如下表3所示(A1、A2和A3分别代表3次实验重复)。
本对比例构建的茎环引物无法完全捕获到全部的924个载体片段，进行了三次重复检测分析，结果显示重复性差。
表3混合载体片段捕获测序结果(部分展示)
| 载体片段名称 | A1_numreads | A2_numreads | A3_numreads |
| Aspergillus_fumigatus-82 | 1080 | 1038 | 1179 |
| Epstein_barr_virus1-506 | 954 | 808 | 1241 |
| Influenza_B_virus-824 | 914 | 657 | 998 |
| Aspergillus_flavus-73 | 837 | 758 | 880 |
| Pseudomonas_aeruginosa-1325 | 817 | 734 | 783 |
| Mycobacterium_tuberculosis-1099 | 739 | 661 | 643 |
| Mycoplasma_pneumoniae-1165 | 727 | 723 | 872 |
| Epstein_barr_virus2-524 | 515 | 444 | 505 |
| Aspergillus_flavus-74 | 464 | 358 | 457 |
| Klebsiella_pneumoniae-845 | 397 | 346 | 513 |
| Streptococcus_mitis-1517 | 115 | 126 | 148 |
| Influenza_A_virus1-805 | 47 | 33 | 45 |
| Haemophilus_influenzae-601 | 40 | 50 | 61 |
| Pseudomonas_aeruginosa-1320 | 5 | 5 | 5 |
| Influenza_A_virus1-810 | 5 | 4 | 9 |
| Klebsiella_pneumoniae-843 | 1 | 0 | 1 |
| Klebsiella_pneumoniae-842 | 1 | 0 | 2 |
| Klebsiella_pneumoniae-847 | 0 | 1 | 0 |
| Aspergillus_fumigatus-85 | 0 | 2 | 0 |
| Klebsiella_pneumoniae-846 | 3 | 1 | 0 |
| Aspergillus_fumigatus-83 | 0 | 2 | 11 |
实施例5临床阳性样本上的应用
本实验经过良培基因生物科技(武汉)有限公司伦理委员会审核通过，所有病人样本和数据采集符合《医疗卫生机构科研用人类生物样本管理暂行办法(征求意见稿)》规定。且取得了病人个人的知情同意。
针对临床上的156种病原菌，设计了924对引物，每种菌平均5～6对引物。收集了32个临床患者的肺泡灌洗液，进行多重实验，实验方法和实验流程与实施例4相同(第一轮PCR的模板分别为从32个临床患者的肺泡灌洗液中抽提的DNA)。与宏基因检测结果对比，获得如下表4所示的结果(其中，“/”表示未检出病原菌)：
表4临床阳性样本病原菌检测结果与宏基因检测结果对比
宏基因组检测范围广，但是检测灵敏度不高，胞内菌检出较差。与宏基因检出结果相比，检出结果完全一致的有16个(占比45％)，如表4所示。本发明检出阳性为30例，宏基因检出为29例，多检出1例阳性。本发明的相比于宏基因检测使用更少的成本，但检测效率、检测灵敏度和特异性均更高。
收集了21个临床患者的肺泡灌洗液，进行多重实验，实验方法和实验流程与实施例4相同(第一轮PCR的模板分别为从21个临床患者的肺泡灌洗液中抽提的DNA)。与医院培养结果对比，获得如下表5所示的结果(其中，“/”表示未检出病原菌)：
表5临床阳性样本病原菌检测结果与医院培养结果对比
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培养法是目前公认的金标准，但是其检出通量低、有些病原难培养。从表5的结果可以看出，本发明与培养法的结果一致，但是本发明更灵敏，检出了很多不能培养的病原微生物。
Claims (10)
1.一种正向茎环引物，其特征在于，所述正向茎环引物的核苷酸序列从5’到3’方向依次包括正向互补序列、连接序列、正向通用序列和正向特异性序列；
所述正向通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述正向互补序列包含能够与所述正向通用序列碱基互补配对的序列。
2.如权利要求1所述的正向茎环引物，其特征在于，所述正向互补序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；和/或，所述连接序列的核苷酸序列为：ATAATA；
较佳地，所述正向特异性序列的核苷酸序列选自下表中的任一种：
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或者所述正向特异性序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17所示；
和/或，所述正向茎环引物在所述连接序列和所述正向通用序列之间还含有正向间隔序列；例如所述正向间隔序列的核苷酸序列为GCTGC。
3.一种反向茎环引物，其特征在于，所述反向茎环引物的核苷酸序列从5’到3’方向依次包括反向互补序列、连接序列、反向通用序列和反向特异性序列；
所述反向通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述反向互补序列包含能够与所述反向通用序列碱基互补配对的序列；
较佳地，所述反向互补序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和/或，所述连接序列的核苷酸序列为：ATAATA；
更佳地，所述反向特异性序列的核苷酸序列选自下表中的任一种：
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或者所述反向特异性序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:18所示；
和/或，所述反向茎环引物在所述连接序列和所述反向通用序列之间还含有反向间隔序列；例如所述反向间隔序列的核苷酸序列为TACCA。
4.一种茎环引物对，其特征在于，所述茎环引物对包含如权利要求1或2所述的正向茎环引物和如权利要求3所述的反向茎环引物；
较佳地，所述茎环引物对中所述正向茎环引物的正向特异性序列如SEQ ID NO:13所示，且所述反向茎环引物的反向特异性序列如SEQ ID NO:14所示；
或者，所述茎环引物对中所述正向茎环引物的正向特异性序列如SEQ ID NO:15所示，且所述反向茎环引物的反向特异性序列如SEQ ID NO:16所示；
或者，所述茎环引物对中所述正向茎环引物的正向特异性序列如SEQ ID NO:17所示，且所述反向茎环引物的反向特异性序列如SEQ ID NO:18所示；
或者，所述茎环引物对选自下表中的任一种：
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5.一种茎环引物对的组合，其特征在于，所述茎环引物对具有正向茎环引物和反向茎环引物，所述正向茎环引物从5’到3’方向包含正向茎环序列和正向特异性序列，所述反向茎环引物从5’到3’方向包含反向茎环序列和反向特异性序列；所述茎环引物对的组合包含以下茎环引物对：
正向茎环引物的正向特异性序列如SEQ ID NO:13所示，且反向茎环引物的反向特异性序列如SEQ ID NO:14所示的茎环引物对；
正向茎环引物的正向特异性序列如SEQ ID NO:15所示，且反向茎环引物的反向特异性序列如SEQ ID NO:16所示的茎环引物对；
正向茎环引物的正向特异性序列如SEQ ID NO:17所示，且反向茎环引物的反向特异性序列如SEQ ID NO:18所示的茎环引物对；
和，如下表所示的茎环引物对：
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并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
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并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
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并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
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并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
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并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
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并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意三对或三对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意五对或五对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
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并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
并且，所述茎环引物对的组合还包含选自以下茎环引物对中的任意六对或六对以上：
6.如权利要求5所述的茎环引物对的组合，其特征在于，所述正向茎环序列从5’到3’方向依次包括正向互补序列、连接序列和正向通用序列；所述正向通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述正向互补序列包含能够与所述正向通用序列碱基互补配对的序列；和/或，所述反向茎环序列从5’到3’方向依次包括反向互补序列、连接序列和反向通用序列；所述反向通用序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述反向互补序列包含能够与所述反向通用序列碱基互补配对的序列；
较佳地，所述正向互补序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，和/或，所述连接序列的核苷酸序列为：ATAATA；和/或，所述反向互补序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，和/或，所述连接序列的核苷酸序列为：ATAATA；
更佳地，所述正向茎环引物在所述连接序列和所述正向通用序列之间还含有正向间隔序列，所述正向间隔序列的核苷酸序列例如为GCTGC；和/或，所述反向茎环引物在所述连接序列和所述反向通用序列之间还含有反向间隔序列，所述反向间隔序列的核苷酸序列例如为TACCA。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1或2所述的正向茎环引物、如权利要求3所述的反向茎环引物、如权利要求4所述的茎环引物对或如权利要求5或6所述的组合；
较佳地，所述试剂盒还包含正向通用引物和/或反向通用引物；所述正向通用引物包含能够与所述正向互补序列碱基互补配对的序列；所述反向通用引物包含能够与所述反向互补序列碱基互补配对的序列；
更佳地，所述正向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，和/或，所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
8.一种鉴定微生物的方法，其特征在于，所述方法包括：使用如权利要求1或2所述的正向茎环引物、如权利要求3所述的反向茎环引物、如权利要求4所述的茎环引物对或如权利要求5或6所述的组合以及正向通用引物和反向通用引物，或使用如权利要求7所述的试剂盒，扩增待测样本中的核酸，测序和比对分析扩增后的产物，鉴定所述待测样本中微生物的种类；
所述正向通用引物包含能够与所述正向互补序列碱基互补配对的序列；所述反向通用引物包含能够与所述反向互补序列碱基互补配对的序列；
优选地，所述方法为非诊断和/或治疗目的的；和/或，所述微生物为病原微生物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增的扩增反应体系中，所述正向茎环引物和所述反向茎环引物与所述正向通用引物和反向通用引物的浓度比为1:80～1:125，优选1:100；和/或，所述测序为高通量测序；
较佳地，所述正向茎环引物和所述反向茎环引物的浓度为0.09～0.11μM，优选0.1μM；所述正向通用引物和反向通用引物的浓度为9～11μM，优选10μM；和/或，所述高通量测序为Illumina Miseq测序，优选PE50测序；
更佳地，所述正向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，和/或，所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；和/或，所述测序的正向测序接头引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，和/或，所述测序的反向测序接头引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
10.如权利要求1或2所述的正向茎环引物、如权利要求3所述的反向茎环引物、如权利要求4所述的茎环引物对、如权利要求5或6所述的组合或如权利要求7所述的试剂盒在鉴定微生物中的应用；
优选地，所述应用为非诊断和/或治疗目的的；和/或，所述微生物为病原微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311193828.9A CN118048465A (zh) | 2023-09-15 | 2023-09-15 | 一种基于多重pcr技术鉴定微生物的方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311193828.9A CN118048465A (zh) | 2023-09-15 | 2023-09-15 | 一种基于多重pcr技术鉴定微生物的方法和应用 |
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2023
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