-
Die vorliegende Erfindung betrifft
Zusammensetzungen zur externen Verwendung auf der Basis von Antiseptika
sowie ihre Anwendungen, insbesondere in der allgemeinen
Hygiene und ganz besonders in Form entweder von
Mikrokapseln oder Mikrosphären, insbesondere in Assoziation mit
einer prophylaktischen Vorrichtung aus Elastomermaterial,
wie ein Kondom, ein Fingerling, ein Handschuh oder ein
Analog davon, ein Verband, eine Binde oder als Schäume
oder Bäder.[0001]
-
Zahlreiche antiseptische Zusammensetzungen wurden
im Stand der Technik beschrieben; sie üben allgemein eher
eine bakteriostatische oder bakterizide Aktivität aus; die
europäische Patentanmeldung Nr. 0 099 209 beschreibt
Zusammensetzungen, die ein C&sub1;-C&sub4;-Alkanol (60 bis 80%), ein
antimikrobielles Mittel vom Biguanidtyp und insbesondere
Chlorhexidin, und ein quaternäres Ammoniumsalz enthalten,
die eine biozide Restaktivität besitzen. Derartige
Zusammensetzungen aus dem Stand der Technik erlauben nicht den
Erhalt eines sehr raschen Schutzes gleichzeitig gegen
Bakterien, Viren und Pilze. Andernfalls ist es zur
Installierung eines leicht durchzuführenden Reinigungsprogramms,
insbesondere im Krankenhaus, wichtig, über eine
antiseptische Zusammensetzung mit polyvalenter Wirkung gegenüber
den meisten pathogenen Organismen und gegebenenfalls
Spermatozoiden zu besitzen; außerdem macht im Rahmen der
Pflege der Bedarf einer pflegenden Schutzausrüstung zur
Vermeidung der Kontaminationsrisiken, die beispielsweise
durch Schnitt, Stechen oder Zerreissen eines Handschuhs
dargestellt werden, den Einsatz von in sehr kurzen Zeiten
aktiven Zusammensetzungen (zwischen einigen Bruchteilen
von Sekunden und einigen Sekunden, auch gegenüber von
Bak
terien, die insbesondere im Krankenhaus angetroffen
werden, sowie gegenüber viralen Infektionen, wie AIDS,
Hepatitis oder Herpes) notwendig, die in Schutzhandschuhe
eingearbeitet werden können, d. h. die mit
Elastomermaterialien kompatibel sind, was bei den Zusammensetzungen aus dem
Stand der Technik nicht der Fall ist, die in den wirksamen
verwendeten Dosen den Hauptnachteil zeigen, daß sie mit
Elastomermaterial inkompatibel sind.[0002]
-
Folglich liegt der vorliegenden Erfindung die
Aufgabe zugrunde, antiseptische Zusammensetzungen
bereitzustellen, die besser den Notwendigkeiten der Praxis
entsprechen als die früher im Stand dar Technik
vorgeschlagenen Zusammensetzungen, insbesondere, daß sie eine
polyvalente viruzide, bakterizide und fungizide Aktivität zeigen
können, und so die Verwendung eines verstärkten extrem
raschen Schutzes sowohl gegen pathogene Bakterien, die
üblicherweise beim Menschen angetroffen werden, als auch gegen
Viren und genauer HIV1, HSV und HBV, die jeweils für AIDS,
Herpes und Hepatitis verantwortlich sind, zu
gewährleisten.[0003]
-
Die vorliegende Erfindung betrifft
Zusammensetzungen auf der Basis von Antiseptika, die dadurch
gekennzeichnet sind, daß sie aus einem Paar quaternäres
Ammoniumsalz-Chlorhexidindigluconat bestehen, worin jedes der
Antiseptika in minimalen, wirksamen Konzentrationen
vermindert um mindestens einen Faktor 5 vorhanden ist,
bezogen auf die minimalen, wirksamen Konzentrationen jedes der
Antiseptika isoliert genommen, daß das Paar von
Antiseptika eine rasche und polyvalente Wirkung gegenüber den
folgenden Organismen ausübt: grampositive Bakterien,
gramnegative Bakterien, Viren, Pilze und. Spermatozoide, daß das
quaternäre Ammoniumsalz Didecyldimethylammoniumchlorid
ist, daß die Konzentration von
Didecyldimethylammoniumchlorid zwischen 0,00005 und 0,4% liegt und die
Konzentration an Chlorhexidindigluconat zwischen 0,00005 und 0,5%
liegt und daß die Zusammensetzungen in Mikrokügelchen oder
Mikrokapseln eingearbeitet werden können, die in einem
Material, wie ein Elastomermaterial, eingeschlossen werden
können, wobei die Zusammensetzungen nur durch Anschneiden,
Anstechen oder Einreißen des Materials freigesetzt werden.[0004]
-
Derartige Zusammensetzungen besitzen den Vorteil,
daß sie die Verwendung von Antiseptika erlauben, die diese
in Konzentrationen enthalten, die unter denjenigen liegen,
in denen sie ihre antiseptische Wirkung ausüben, wenn sie
alleine verwendet werden.[0005]
-
In der Tat stellen diese Konzentrationen eine Gabel
dar, in denen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ihre
polyvalente Wirkung gegen die verschiedenen pathogenen
Organismen ausüben: Viren, Bakterien, Pilze und
Spermatozoiden.[0006]
-
Erfindungsgemäß bedeutet Polyvalenz gleichzeitig
Polyvalenz zwischen den Gruppen (d. h. Aktivität
gleichzeitig gegen die genannten Organismen) und Polyvalenz in der
Gruppe (d. h. Aktivität gleichzeitig gegen grampositive und
gramnegative Bakterien, verschiedene Viren, wie HIV-1,
HSV, HBV, und verschiedene Pilze).[0007]
-
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der
Zusammensetzungen bestehen sie aus einem Paar quaternäres
Ammoniumsalz-Chlorhexidindigluconat, worin die
Verhältnisse Didecyldimethylammoniumchlorid Chlorhexidindigluconat
zwischen 99,5 : 0,5 und 84 : 16 liegen.[0008]
-
Vorteilhafterweise umfassen die Zusammensetzungen
diese beiden Antiseptika in identischen Konzentrationen,
bevorzugt zwischen 0,00005 und 0,04%.[0009]
-
Auch vorteilhafterweise sind diese
Zusammensetzungen mit mindestens einem Lösungsmittel, ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus Wasser und Polyolen, assoziiert.[0010]
-
Gemäß einer vorteilhaften Variante dieser
Ausführungsform werden diese Polyole aus Polypropylenglykol
,Polyethylenglykol oder Glycerin ausgewählt.[0011]
-
Überraschenderweise besitzen diese
Zusammensetzungen eine deutlich verbesserte Stabilität, unabhängig von
der Konzentration der Antiseptika
(Didecyldimethylammoniumchlorid und Chlorhexidindigluconat), wenn sie in genau
den nachstehend genannten Anteilen (99,5 : 0,5 und 84 : 16)
vorhanden sind, und finden so in einer Formulierung
Anwendung, die in Mikrokapseln eingebracht werden kann oder die
direkt verwendet werden kann (Schäume, Bäder zur lokalen
Verwendung, Instrumentenreinigung).[0012]
-
Überraschenderweise besitzen die erfindungsgemäßen
Zusammensetzungen eine rasche polyvalente antiseptische
Aktivität (einige Bruchteile von Sekunden bis Sekunden)
gegenüber pathogenen Organismen: bakterizide Wirkung
gegenüber grampositiven und gramnegativen Bakterien,
fungizide Wirkung (insbesondere Operationsflora und
Vaginalflora) und viruzide Wirkung gegen HIVL, HSV und HBV, die sehr
rasch ist, und gegebenenfalls eine spermizide Wirkung in
Dosen, in denen deren Bestandteile die genannten
Aktivitäten nicht besitzen. Derartige Zusammensetzungen besitzen
nun eine besonders bedeutende Wirksynergie.[0013]
-
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eignen
sich, abgesehen von ihrer Wirksynergie, gegenüber
verschiedenen vorstehend genannten Organismen besonders zur
Verwendung in Form von Mikrokapseln (Anwesenheit eines
einzigen quaternären Ammoniumsalzes, geringe Konzentrat
ionen erlauben den Verbleib in Flüssigphase, ohne das
Problem der späteren Bildung eines Niederschlags.[0014]
-
Diese erfindungsgemäßen antiseptischen
Zusammensetzungen, die in Mikrokapseln eingearbeitet sind, behalten
trotzdem ihre bakteriziden, fungiziden, viruziden oder
spermiziden Eigenschaften und können auch in ein
Elastomermaterial zur Verwendung als Kondom, Fingerling,
Handschuh oder Analogon oder auch in einer Gewebsbandage oder
in einem Verband eingearbeitet werden.[0015]
-
Diese Zusammensetzungen, die in Mikrokapseln
eingeschlossen sind und in Elastomermaterialien eingearbeitet
sind (beispielsweise Schutzhandschuhe) schützen den
Verwender, indem sie beispielsweise die sofortige
Desinfektion einer gebrauchten und gegebenenfalls kontaminierten
Nadel während eines akzidentellen Stichs oder eines
akzidentellen Zerreissens der mit Mikrokapseln beladenen
Handschuhe erlauben.[0016]
-
Außerdem sind die erfindungsgemäßen
Zusammensetzungen, die mindestens ein Polyol in den vorstehend
definierten Anteilen enthalten, besonders gut der Herstellung von
Mikrokapseln angepaßt, die während ihres Einbaus in eine
Vorrichtung aus Elastomermaterial insbesondere eine
Erhitzungsstufe auf Temperaturen über 80ºC benötigen; derartige
Zusammensetzungen besitzen auch den Vorteil" daß sie die
Verdampfung des Lösungsmittels vermeiden und so die
Eigenschaften der mikroverkapselten Lösungen konservieren.
Außerdem erlauben derartige Zusammensetzungen den Erhalt
einer besseren Diffusion der Antiseptika in Kontakt mit
biologischen Flüssigkeiten, wie Blut, Sperma,
Vaginalsekretionen und anderen.[0017]
-
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungean bieten auch
einen wirksamen viruziden, bakteriziden, fungiziden
und/oder spermiziden Schutz, wenn sie mit pharmazeutisch
verträglichen Trägern für eine lokale Verwendung auf
Schleimhäuten (Schäume zur Vaginalverwendung,
Peelingcreme, Creme, Suppositorien, Ovula) assoziiert sind.[0018]
-
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen stellen
auch ein Hygieneprodukt oder Desinfektionsprodukt zur
vorteilhaften äußeren Verwendung (Reinigung von
chirurgischen, zahnmedizinischen und gynäkologischen Instrumenten)
dar.[0019]
-
Als Funktion der Konzentrationen der verschiedenen
Bestandteile erhält man entweder eine Zusammensetzung mit
spezifischer Wirkung (viruzid, bakterizid, fungizid oder
spermizid) oder eine Zusammensetzung mit polyvalenter
Wirkung.[0020]
-
In dem Fall, in dem die Zusammensetzungen als
spcermizid verwendet werden, sind sie vorteilhafterweise mit
einem Verdünnungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe
bestehend aus Proteasen pflanzlischen Ursprungs (Bromelain) und
lytischen Enzymen (Trypsin) assoziiert.[0021]
-
Außer den vorstehenden Ausführungsformen umfaßt die
Erfindung noch andere Ausführungsformen, die aus der
folgenden Beschreibung hervorgehen, die sich auf
Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens beziehen.[0022]
-
Es ist jedoch jedenfalls zu verstehen, daß diese
Beispiele nur der Erläuterung des Gegenstands der
Erfindung dienen und in keiner Weise eine Beschränkung davon
darstellen.[0023]
BEISPIEL 1: Viruzide Wirkung der erfindungsgemäßen
Zusammensetzungen gegenüber Hiv-Viren (AIDS)
I - Kationisches Antiseptikum-Chlorhexidinsalz
A) ARBEITSPROTOKOLL
1. Material:
a) Verwendete Produkte:
-
Die in den Tabellen angegebenen Konzentrationen
entsprechen den Endkonzentrationen an Bardac 22.500
(Didecyldimethylammoniumchlorid).[0024]
b) Für die Zellkultur verwendetes Medium:
-
Die Untersuchung der Cytotoxizität wurde an einer
T-Zellinie durchgeführt, das Kulturmedium entspricht dem
von RPMI 1640, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum
(BIO-LAB), -1% Glutamin (GIBCO), 1% Antibiotika (PSN,
GIBCO).[0025]
-
Zur Untersuchung der nach der Behandlung der
viralen Präparate verbleibenden infektiösen Kraft entspricht
das Kulturmedium der normalen menschlichen T-Lymphozyten
(vollständiges Medium) dem vorstehenden Medium, dem 10%
Interleukin II, Polybren (2 ug/ml) und Antihuman-
Interferonserum 1/2500 (M. A. REY et al., Biochem. Biophys.
Res. Com., 1984, 121, 126-133) zugesetzt wurde.[0026]
c) Zellen:
-
Die Cyctotoxizität wird an einem Clon von CEM-
Zellen, einer frühen T-Lymphozytenlinie, untersucht.[0027]
-
Die Infektiosität wird an T-Lymphozyten, die aus
peripherem Blut eines menschlichen Blutspenders erhalten
wurden und über einen Ficoll-Gradienten getrennt wurden,
untersucht.[0028]
-
Die Lymphozyten werden 3 Tage mit
Phytohämagglutinin P (PHA-P) stimuliert, 1/500 verdünnt und in
vollständigem Medium gezüchtet. Die blastischen T-Zellen werden
mit dem Virus infiziert, behandelt oder nicht, um die
verbleibende infektiöse Kraft nachzuweisen.[0029]
d) HIV1-Virus:
-
Das Virus wird aus dem Kulturülöerstand der mit
HIV1-infizierten CEM-Linie erhalten. Diese mit HIV1
infizierte T-lymphoblastoide Zellinie wird für die virale
Produktion verwendet.[0030]
-
Der Titer der verwendeten Überstände wird nach
Bestimmung der Aktivität der reversen Transkriptase (ART)
des Virus bewertet.[0031]
-
In den folgenden Tests wird ein Überstand, dessen
ART 1,8 · 10&sup6; cpm/ml beträgt, verwendet.[0032]
2. Methoden:
a) Untersuchung der Cytotoxizität der Verbindungen auf T-
Zellen:
-
[0033]
-
Zellen: Zellsuspension des CEM-Clons in einer
Konzentration von 1 · 10&sup6; Zellen/ml.
-
Produkte: verschiedene Verdünnungen in RPMI-
1640-Medium werden mit den Verbindungen
hergestellt.
-
[0034] In einer Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen
werden 0,5 ml jeder der Verdünnungen mit 0,5 ml
Zellsuspension des Clons CEM (5 · 10&sup5; Zellen) in einem Inkubator bei
37ºC inkubiert.
-
[0035] Das zelluläre Wachstum wird nach Auszählen der
Zellsuspensionen mit Trypanblau, bezogen auf eine
Kontrolle von nichtbehandelten Zellen, bewertet.
-
b) Wirkung der Produkte allein oder in Assoziation gemäß
der Erfindung auf die infektiöse Kraft des HIV1-Virus
gegenüber normalen menschlichen T-Lymphozyten:
-
[0036]
-
- Herstellung der viralen Lösung:
-
mehrere Röhrchen, die 1 ml viralen Überstand, ART 1,8 ·
10&sup6; cpm/ml enthalten, werden durch
UltraLzentrifugation konzentriert. Die so erhaltenen Bodensätze des
Virus werden entweder durch jede der hergestellten
Produktverdünnungen in sterilem, wie destilliertem
Wasser oder mit Wasser (nichtbehandeltes Kontrollvirus)
aufgenomen.
-
- Behandlung der viralen Präparate:
-
Die konzentrierten viralen Präparate werden alle
gemäß dem nachstehend angegebenen Protokoll behandelt.:
-
- behandelte virale Proben:
-
die durch Ultrazentrifugation konzentrierten
Bodensätze des Virus werden in 100 ul jeder der
untersuchten Produktkonzentrationen
resuspendiert und 10 Minuten inkubiert.
-
- virale Kontrollprobe:
-
nichtbehandeltes Kontrollvirus: das Produkt wird
durch 100 ul steriles bidestilliertes Wasser
ersetzt.
-
Nach der 10minütigen Inkubationszeit wird das in jeder
Probe vorhandene Virus gespült, darin durch Zugabe von 12
ml RPMI-1640-Medium und Ultrazentrifugation
aufkonzentriert. Die Bodensätze des Virus werden dann in 1 ml
vollständiges Medium aufgenommen und zur Infektion normaler
menschlicher T-Lymphozyten verwendet.
-
- Messung der Infektivität der Froben:
-
4 · 10&sup6; normale menschliche T-Lymphozyten werden mit jedem
der behandelten Viral- oder Kontrollpräparate, wie
nachstehend angegeben, infiziert. Die Infektion der T-Zellen
wird gemäß einem früher beschriebenen Verfahren (F. BARRE-
SINOUSSI et al., Science, 1983, 220, 868-871)
durchgeführt. Zusammenfassend werden 4 · 10&sup6; Zellen in Suspension in
1 ml vollständigem Medium mit 1 ml jedes der behandelten
viralen Präparate oder Kontrollpräparate 1 Stunde bei 37ºC
inkubiert.
-
Nach 2 Waschungen mit mehreren ml Kulturmedium werden die
Zellsuspensionen auf die Konzentration von 140 Zellen pro
ml eingestellt. Der Tag der Infektion gilt als Tag 0.
-
- Kontrollzellen:
-
440 T-Lymphozyten werden gezüchtet, und alle 3 oder 4
Vage unter den gleichen Bedingungen wie alle anderen Proben
passagiert.
-
Diese Kontrolle entspricht der negativen Kontrolle der
viralen Produktion im Verlauf der Manipulation. Die virale
Produktion im Verlauf der Zeit wird durch Messen der
Aktivität der reversen Transkriptase, die in den
Kulturüberständen vorhanden ist, gemäß dem nachstehend beschriebenen
Protokoll bestimmt.
-
- Messung der Aktivität der reversen Transkriptase der
viralen Kontrollpräparate und der viralen Proben, die mit
den Produkten behandelt sind:
-
Diese Bestimmung erlaubt die Bewertung der Anwesenheit des
nichtinaktivierten Restvirus in der Ausgangsprobe. Sie
wird mit 1 ml Kulturüberstand durchgeführt, der alle 3 bis
4 Tage entnommen wird und ultrazentrifugiert wird.
-
[0037] Die enzymatischen Aktivitäten werden in 50 ul eines
Reaktionsgemisches, das 50 mM Tris pH 7,8, 20 mM MgCl&sub2;, 20
mM KCl, 2 mM Dithiothreit, 0,25 OD/ml oligo dT, 0,25 OD/ml
poly rA, 0,1% Triton X 100 und 2,5 uCi 3H DTTP enthält,
gemessen.
-
[0038] Nach einer einstündigen Inkubation bei 37ºC wird
die Reaktion durch Zugabe von 10 ul 0,2 M EDTA gestoppt,
und die Proben werden auf DE81-Membranen ausgebracht.
-
[0039] Nach mehreren Waschungen mit 5% Na&sub2;HPO&sub4;,
anschließend mit destilliertem Wasser werden die Membranen
getrocknet, und die Radioaktivität wird mit Hilfe eines β-
Szintillationszählers (PACKARD) gemessen.
B) ERGEBNISSE
-
[0040] Wirkung einer Behandlung der viralen Proben mit
verschiedenen Produkten auf die Infektiosität des HIV-1-
Virus.
TABELLE I
-
T1: mit 100 ul bidestilliertem Wasser behandeltes Kontrollvirus
-
T2: mit 100 ul bidestilliertem Wasser behandeltes Kontrollvirus
-
T3: Kontrollvirus zu Kontrolle
-
T4: Nichtinfizierte Kontrollzellen
-
[0041] Diese Tabelle zeigt gut die: Wirksynergie der
Assoziation von Bardac®/Chlorhexidindigluconat in geringer
Konzentration (Konzentration 0,002 + 0,002), die die
Abwesenheit des Virus vom 30. Tag an zeigt; in der Tat sind
bei diesen gleichen Konzentrationen die zwei allein
verwendeten Produkte nicht viruzid.
BEISPIEL 2: Viruzide Wirkung der erfindungsgemäßen
Zusammensetzungen auf die HBV-Viren
I Wirkung auf den in vitro-Abbau des Antigens des
Hepatitis-B-Virus (AgHBs) des Hepatitis-B-Virus: Viruzid +
Humanserum eines Kranken (1/1000)
A. Getestete Gemische:
-
[0042]
-
* CHG ist eine Abkürzung für Chlorhexidindigluconat
B. Ergebnisse:
-
[0043]
-
[0044] Das Gemisch aus 0,1% Bardac® und 0,1% CHG zeigt
eine wichtige Aktivität, während die Dosis um die
Größenordnung 50%, bezogen auf 0,2% Bardac® allein vermindert ist.
-
II-In-vivo-Tests an der Ente (Verabreichungsweg i. v.)
-
[0045]
-
0,02% Bardac® (Dosis 100mal geringer als diejenige,
die in vitro für Bardac® allein wirksam ist) - 0,025%
CHG gegen ein Inokulum von 2 · 10&sup7; vge/geschützte Ente
3/3 Enten (Fig. 2).
-
- 0,1% Bardac® (Dosis 5mal stärker als in einer
erfindungsgemäßen Zusammensetzung zum Erhalt eines
äquivalenten Schutzes gegen Inokulum mit 2 · 10&sup7;
vge/geschützte Ente 4/4 Enten (vge = virales
Genomequivalent) (Fig. 3):
-
[0046] Es ergibt sich, daß in vitro bereits bei geringen
Konzentrationen des Gemisches, wie 0,02 bis 0,25% ein
Schutz vorliegt, was bestätigt, daß die Suppression der
DNA-Polymeraseaktivität ein guter Marker der Wirksamkeit
der getesteten Viruzide ist.
-
[0047] Die Fig. 1 entspricht einer Kontrolle der
Infektion: 4/4 mit 240 vge inokulierte Enten entwickeln eine
Virämie, deren Gipfel zwischen dem 5. und 10. Tag liegt.
III - Allgemeine Schlußfolgerung für die verschiedenen
getesteten Gemische
-
[0048] Nur das Antigen des verbleibenden Hepatitis-B-Virus
erlaubt eine Unterscheidung zwischen den getesteten
Gemischen aus Bardac®-CHG.
-
[0049j Ein Gemisch in gleichen Konzentrationen an Bardac®
und CHG scheint optimal und erwies sich als in vivo-Schutz
von Konzentrationen von 0,02 bis 0,025 gegenüber einem
Inokulum das 2 · 10&sup7; vge/Ente (entspricht etwa 3000 ID50 pro
Ente) enthält.
-
[0050] Es scheint, daß 0,02% Bardac® in Assoziation mit
0,025 CHG ebenso effizient ist wie Bardac® in einer
Konzentration von 0,1%. Diese Verringerung um einen Faktor 5
ist signifikant und bedeutend, insbesondere bei der
Anwendung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung in
Assoziation mit einem Elastomermaterial, wobei Bardac® besonders
toxisch für ein Elastomer ist.
BEISPIEL 3: Viruzide Wirkung der erfindungsgemäßen
Zusammensetzungen gegen HSV
I-In vitro-Assays
a) Durchgeführte Tests:
-
- Viraler Stamm
-
[0051] Es handelt sich um einen Stamm des Herpesvirus
Hominis-Typ-1, Stamm Bey (HSV1), er wird auf menschlichen
Fibroblastenzellen oder auf KB-Zellen gehalten und hatte
sich eine Reihe von bedeutenden Passagen an dem einen cder
anderen Typ von Zellen unterzogen.
-
[0052] Es wird eine bei -80ºC eingefrorene virale Charge
nach Erhalt eines cytopathischen Effekts, der bei
mindestens 80% der Zellen erhalten wird, ohne vorherige
Zentrifugation, die das Inokulum vom Hauptteil der Zelltrümmer
befreit hätte, verwendet. In der Tat, es scheint, daß die
Infektiosität des Virus sehr rasch verschwindet, wenn es
extrazellulär vorliegt und folglich ist man näher an der
Realität der in vivo-Infektion, wenn eine virale Charge
verwendet wird, in der die Virionen sich noch in den
Zelltrümmern befinden können.
-
[0053] Diese Charge wurde nach Verteilung in 0,5-ml-
Aliquote titriert, bei -80ºC auf menschlichen
Fibroblastenzellen aufbewahrt:
-
- durch Verdünnung 10 zu 10 und Inokulationen von 8
Kulturröhrchen durch Verdünnung: 10&sup6;/ml;
-
- durch Inokulation der Kulturen in Petrischalen (35
mm) und Hinzufügen von Anti-HSV1-Serum in den
Überstand, um die Virionen zu neutralisieren, die in dem
Flüssigmedium freigesetzt werden konnten, was so die
Auszählung der Kulturen erlaubt: 100 bis 150
Einbeiten bilden dabei pro mit 0,5 ml einer auf 10&supmin;&sup4;
verdünnten viralen Lösung inokulierten Schale Kulturen.
-
[0054] Es werden Cytotoxizitätskontrollen der Produkte für
die in den Tests verwendeten Zellkulturen, d. h.
menschliche Fibroblastenzellen, durchgeführt.
-
[0055] Die Zellen werden in Dulbecco-Medium, das mit 10%
fötalem Kälberserum angereichert wurde, gezüchtet; im
Augenblick ihrer Verwendung werden die Zellen gewaschen, und
es wird das gleiche Kulturmedium, aber ohne Kälberserum
verwendet.
-
[0056] Für jedes getestete Produkt oder jede getestete
Zusammensetzung werden 10 Zellkulturröhrchen verwendet, und
nach Inokulation des Produkts werden die Röhrchen 3 Tage
lang überwacht.
-
b) Beobachtete Wirkung mit verschiedenen Produkten allein:
-
[0057] Jedes Produkt wurde sukkzesive in. reiner Form und
in Verdünnungen von 10&supmin;¹, 10&supmin;², 10&supmin;³ verwendet und den
Kulturröhrchen, die 1 ml Nährmedium enthalten, in einem
Volumen von 0,1 ml zugesetzt.
-
[0058] Die Ergebnisse sind die folgenden:
-
- Bardac®, 0,04%ige Lösung: nichttoxisch bei einer
Verdünnung von 10&supmin;³,
-
- Chlorhexidindigluconatlösung in einer Konzentration
von 0,05%: keine Toxizität.
-
c) Unmittelbare mit den erfindungsgemäßen Gemischen
beobachtete viruzide Wirkung:
-
1. Messung der Aktivität:
-
* Protokoll:
-
[0059] Es werden 0,2 ml der viralen Suspension mit 0,2 ml
einer der zu testenden Lösungen (siehe nachstehende
Tabelle) vermischt. Anschließend wird eine unmittelbare
Verdünnung von 0,2 ml des Gemisches mit 10&supmin;&sup4; vorgenommen, was
die Aktivität des Produktes stoppt. Diese Verdünnung des
Gemisches wird in einem Volumen von 1 ml auf eine Schicht
von gezüchteten Verozellen in einer Petrischale mit einem
Durchmesser von 6 cm aufgebracht.
-
[0060] Nach einer 1stündigen Adsorption wird die
überstehende Flüssigkeit abgezogen und durch 5 ml. Kulturmedium
ohne Tierserum, aber unter Zusatz von 1% polyclonalem
Kaninchen-Anti-Herpesvirus-Typ-1-Serum ersetzt.
-
[0061] Das stört nicht die intrazelluläre Multiplikation
des Virus, aber neutralisiert die Teilchen, die in die
Flüssigphase während der Zerstörung der infizierten Zellen
wandern. Nach Ablaufen von 4 bis 5 Tagen beobachtet man
mit dem unbewaffneten Auge zelluläre Lysezonen, die sich
als Ölfleck erstrecken, und theoretisch jeder, bei der
Multiplikation einer Kultur-bildenden Einheit (PBU), die
in der viralen Verdünnung vorhanden ist, die in die Kultur
eingebracht wurde, entsprechen. Eine Plaque-bildende
Einheit kann grob als Äquivalent einem infizierenden Teilchen
oder auch einem Virion beurteilt werden.
TABELLE II
-
d) Verzögerung des Auftretens der Aktivität
-
1) es werden 0,2 ml der nichtverdünnten Viralen Suspension
mit 0,2 ml jedes der zwei folgenden Gemische vermischt
-
[0062]
-
- Bardac® 0,04% + CHG (Digluconat) 0,05%
-
- Bardac 0,02% + CHG 0,025%.
-
[0063] Nach einer Inkubation von 1, 5 und 15 Minuten wird
ein Tropfen des Gemisches in 5 Kulturröhrchen inokuliert
und 5 Tage lang überwacht.
-
[0064] Als Kontrolle wird das auf gleiche Weise verdünnte
Virus in ein Kulturmedium anstelle der Gemische
inokuliert.
-
2) Tabelle III: bei D2 an 5 Röhrchen für die zwei
vorstehend genannten Gemische beobachteten Ergebnisse:
-
[0065]
TABELLE III
-
II-In vivo-Assays
-
[0066] An Nude-Mäusen durchgeführte Tests, entweder durch
direktes Stechen mit einer intramuskulären Nadel, die in
eine virale Suspension eingetaucht wurde, oder durch
Stechen nach Passage der infizierten Nadel (d. h. eingetaucht
in eine virale Suspension) durch Mikrokapseln, wie
nachstehend beschrieben (Beispiel 8, Probe 1), die mit Latex
bedeckt sind, zeigen, daß die Passage der Nadel durch die
Mikrokapseln eine sofortige Verringerung des
Infektionsgrads der Tiere in überaus signifikanter Weise erlaubt.
[0067] Das Arbeitsprotokoll ist ähnlich dem von Beispiel
8, ausgenommen, die Kulturmedien, die dem Hearpesvirus
angepaßt sein müssen.
BEISPIEL 4: Bakterizide Wirkung der erfindungsgemäßen
Zusammensetzungen
ASSAY 1
I - Material
A) Getestete Mikroorganismen:
-
[0068]
- Referenzstämme:
-
- Pseudomonas aeruginosa CIP A22
-
- Escherichia coli CIP 54127
-
- Staphylococcus aureus CIP 53154 Stamm Oxford
- Krankenhausstämme:
-
Pseudomonas aeruginosa
-
Escherichia coli
-
Staphylococcus aureus
-
Proteus vulgaris
-
Candida albicans.
-
B) - Millipore-Membranen: HAE P047S0 (0,45 um)
-
[0069]
-
- Gelose Mueller Hinton 2 : 4 3301 (Biomerieux)
-
- Steriles und apyrogenes destilliertes Wasser
(Biosedra)
II - Protokoll
A) Unterhalt der Stämme:
-
[0070] Jeder Bakterienstamm wurde 3mal auf Mueller-Hinton-
Gelosen in 24stündigen Intervallen vor seiner Verwendung
wiederaufgenommen.
B) Herstellung der bakteriellen Inokula
-
- anfängliche Bakteriensuspension: A
-
[0071] Hergestellt aus einer Bakterienisolierung, muß sie
einer Opazität, äquivalent Punkt 1 von McFarland
entsprechen. Sie wird für die definitiven Assays verwendet.
-
- Suspension, die für die Kontrollen und die
vorläufigen Assays verwendet wird: B
-
[0072] Sie wird durch sukkzessive Verdünnungen der
Suspension A bis zu 10&supmin;&sup6; hergestellt.
C) Zählungen der Kontrolle:
-
[0073] 1 ml der Suspension B wird in die Masse einer
Mueller-Hinton-Gelose inseminiert.
D) Kontrollaufzählungen der Filtration:
-
[0074] 1 ml der Suspension B wird durch eine Millipore-
Membran filtriert und mit 50 ml destilliertem Wasser
gewaschen.
-
[0075] Zählung der Kolonien nach 24 Stunden bei 37ºC.
E) Vorläufige Assays:
-
[0076] Für jedes der 4 antiseptischen Gemische und für
jeden Bakterienstamm wird der folgende Assay durchgeführt:
-
- Filtration von 1 ml des antiseptischen Gemisches
-
- Waschung (2mal 50 ml destilliertes Wasser)
-
- Filtration von 1 ml der Suspension B
-
- Spülen mit 50 ml destilliertem Wasser
-
- Zählung der Kolonien auf der Membran nach 24 Stuncien
bei 37ºC.
F) Definitive Assays:
-
[0077] Jedes antiseptische Gemisch in doppelter
Konzentration wird während 1, 5 und 10 min in Kontakt mit 1 ml der
Suspension A gebracht, anschließend filtriert.
-
[0078] Nach durch den vorläufigen Assay definierten
Waschungen werden die Membranen 24 Stunden bei 37ºC
gehalten.
III-Interpretation der Ergebnisse
-
[0079] In dem angenommenen Protokoll gilt ein Gemisch, das
antiseptisch sein soll, als bakterizid, wenn es nach einer
definierten Kontaktzeit das Bakterieninokulum um
mindestens 5 Logarithmusstufen verringert.
-
[0080] Dieser Effekt wird durch Zählung der Anzahl der
Kolonien an den Membranen der definierten Tests, bezogen auf
diejenige, die im vorläufigen Assay, entsprechend dem
gleichen Stamm und dem gleichen Gemisch, beobacht wurde,
sichtbar gemacht.
Ergebnisse:
-
- Wirksamkeit bei t = 1 min: W oder NW (wirksam cder
nichtwirksam)
-
[0081]
-
Wirksamkeit bei t = 5 min:
-
[0082]
-
Wirksamkeit bei t = 10 min:
-
[0083]
IV - Schlußfolgerung
-
[0084]
-
- Nach 1 Minute Kontakt ist kein Gemisch an allen
untersuchten Stämmen wirksam. Das Gemisch Nr. 2 ist jedoch
am wirksamsten, da nur ein Stamm von Proteus vulgaris
unempfindlich zu sein scheint.
-
- Nach 5minütigem Kontakt könnte das Gemisch Nr. 2 als
wirksam angesehen werden, wenn nicht nur der gleiche Stamm
von Proteus vulgaris verblieb, der dem Produkt selbst nach
5 Minuten widerstand.
-
- Nach 10minütigem Kontakt ergeben die Gemische 1 und 2
ein zufriedenstellendes Ergebnis an der Gesamtheit der
untersuchten Stämme.
ASSAY 2
-
[0085] Ein anderer Assay wurde mit den folgenden Lösungen
durchgeführt.
-
- 100 ml einer 0,1%igen Chlorhexidindigluconatlösung
(pH 6) und
-
- 100 ml einer 0,1%igen Bardac 22®-Lösung
-
[0086] Die Aktivität dieser Lösungen allein oder in
Kombination wurde ganz besonders gegenüber Staphylococcus
aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 11229 und Candida
albicans ATCC 10231 getestet.
-
[0087] Die Tests wurden gemäß dem in Kapitel I/2.1 und 2.2
der Richtlinien für die Prüfung und Bewerbung chemischer
Desinfektionsverfahren der DGHM, Stand 1.1. 1981,
beschriebenen Protokoll durchgeführt.
-
[0088] Die Tabellen A, B und C erläutern jeweils die
bakterizide und fungizide Aktivität einer wäßrigen 0,1%igen
Chlorhexidindigluconatlösung, einer wäßrigen 0,1%igen
Bardac 22®-Lösung und eines Gemisches zu gleichen Teilen der
zwei Komponenten. Die Protokolle, deren Ergebnisse die
Tabellen zeigen, umfassen eine 72stündige Inkubation bei
37ºC und die Verwendung der folgenden inaktivierenden
Substanzen als Kontrolle:
-
A: 3% Tween 80 + 0,3% Lecithin + 0,1% Cystein,
-
B: 3% Tween®80 + 3% Saponin + 0,1% Cystein + 0,1%
Histidin,
-
C: 3% Tween®80 + 0,3% Lecithin + 0,1% Histidin + 0,5%
Natriumthiosulfat.
-
[0089] In diesen Tabellen bezeichnet das Zeichen "+"
Wachstum und das Zeichen "-" Fehlen von Wachstum.
-
[0090] Die folgende Tabelle A, die die bakterizide und
fungizide Aktivität einer 0,1%igen wäßrigen
Chlorhexidindigluconatlösung (1% der Testlösung entspricht 0,001%
Digluconat) erläutert, zeigt die Hemmung des Wachstums von
S. aureus und E. coli durch eine 0,5%ige Verdünnung der
vorstehend genannten Chlorhexidindigluconatlösung,
entsprechend einer Konzentration an aktiver Substanz von
0, 0005%; C. albicans wird durch eine 1%ige Verdünnung der
Lösung (0,001% Chlorhexidindigluconat) gehemmt. In der
Tabelle B zeigt das Didecyldimethylammoniumchlorid eine noch
ausgeprägtere Hemmwirkung auf die grampositiven Organismen
S. aureus und C. albicans mit einer 0,1%igen Verdünnung ( =
0,0001% Didecyldimethylammoniumchlorid) und eine Hemmung
von E. coli (gramnegativer Organismus) mit einer 0,5%igen
Verdünnung ( = 0, 0005% Didecyldimethylammoniumchlorid) an.
(Tabelle B).
-
[0091] Die Tabelle C zeigt, daß die Assoziation dieser
beiden Antiseptika die Hemmung des Wachstums der
vorstehend genannten Mikroorganismen in signifikant größeren
Verdünnungen (Wirkung gegenüber E. coli und C. albicans in
Konzentrationen von 0,00025% Chlorhexidindigluconat und
0,00025% Didecyldimethylammoniumchlorid; Wirkung gegenüber
S. aureus für eine Konzentration von 0,00005% für jedes
der zwei vorstehend genannten Antiseptika) erlaubt.
TABELLE A
TABELLE B
TABELLE C
-
[0092] Die Tests, deren Ergebnisse in den Tabellen D, E
und F dargestellt sind, wurden bei einer
Reaktionstemperatur von 22º mit einer Inkubation der Subkulturen von 72
Stunden bei 37ºC mit folgenden inaktivierenden Substanzen
durchgeführt: 3% Tween®80 + 3% Saponin + 0,1% Cystein +
0,1% Histidin; diese Tabellen erläutern jeweils die
bakterizide und fungizide Aktivität einer 0,1%igen
Chlorhexi
dindigluconatlösung, einer wäßrigen 0,1%igen Bardac22®-
Lösung und eines Gemisches zu gleichen 7"eilen der beiden
Komponenten und zeigen die Wirkung der vorstehend
genannten Antiseptika als Funktion der Kontaktzeit und lassen
die gleiche Wirksynergie der Assoziation wie vorstehend in
dem Umfang erkennen, in dem die Assoziation der beiden
Komponenten die signifikante Verringerung ihrer
Konzentration erlaubt, um einen gleichen Effekt zu erhalten.
TABELLE D
TABELLE E
TABELLE F
BEISPIEL 5: Spermizide Wirkung
1. PROTOKOLL
-
[0093] Die verschiedenen Spermaproben (ein Tropfen
Sperma/Probe) wurden von gesunden Freiwilligen erhalten.
- Messung der Vitalität:
-
[0094] Ein Tropfen Sperma wird mit Eosinigrosin behandelt.
Ein dünner Farbauftrag wird anschließend vorgenommen, und
100 Spermatozoiden werden im Mikroskop untersucht. Die
abgestorbenen Zellen sind entweder vollständig oder
teilweise rotgefärbt. Die lebenden Zellen sind ungefärbt.
- Untersuchte Substanzen:
-
[0095] Die untersuchten Substanzen waren Bardac und
Chlorhexidindigluconat, die entweder allein oder in
erfindungsgemäßer Assoziation getestet wurden. Die
verschiedenen Stufen des Protokolls sind in den Tabellen IV bis VI
dargestellt.
-
[0096] Die maximale Kontaktzeit der verschiedenen
Substanzen und des Spermas waren auf 3 Minuten begrenzt, um die
Wirksamkeit des Verfahrens unter den
Verwendungsbedingungen zu gewährleisten: Die Konzentration der aktiven
Lösungen in Sperma wurde auf 10% beschränkt, um die
Toxizitätsrisiken der Produkte für die Schleimhäute zu vermindern.
Tabelle IV
Tabelle V
Tabelle VI
BEISPIEL 6: Untersuchung des Gemisches Bardac 22®-
Chlorhexidindigluconat in wäßriger Lösung.
-
[0097] Alle Gemische wurden in
Gewicht-/Gewichtprozentsätzen in Plastikkolben, die lichtgeschützt bei
Umgebungstemperatur (20ºC ± 1ºC) aufbewahrt wurden,
durchgeführt.
-
[0098] Eine tägliche Beobachtung dieser Kolben erlaubte
den Nachweis oder fehlenden Nachweis der Anwesenheit eines
weißen Niederschlags. Dieser (sobald er sich bildet)
fin
det sich in der Hauptsache im Bodensatz des Kolbens, aber
auch auf den mit Flüssigkeit benetzten Wänden.
-
1) Untersuchung der Bardac®-Chlorhexidin-50/50-Lösungen in
verschiedenen Konzentrationen:
-
[0099] Die Untersuchung wurde zuerst an wäßrigen Lösungen
mit verschiedenen Konzentrationen an Wirkstoffen
durchgeführt, aber für ein Gemisch der zwei Wirkstoffe (Bardac®
und Chlorhexidindigluconat) in gleichen Anteilen (50/50):
-
Lösung mit 30% Wirkstoffen Gefällt bei 24 h
-
Lösung mit 20% Wirkstoffen Gefällt bei 24 h
-
Lösung mit 10% Wirkstoffen Gefällt bei 24 h
-
Lösung mit 5% Wirkstoffen Gefällt bei 24 h
-
Lösung mit 1% Wirkstoffen Gefällt bei 24 h
-
2) Untersuchung von 10- und 20%igen Lösungen aus Bardac®
und Chlorhexidin in verschiedenen Anteilen:
-
[0100] Beim zweiten Mal wurden die Konzentrationen an
Wirkstoffen auf 10% und 20% fixiert, aber es wurden die
Anteile der beiden Wirkstoffe variiert.
Tabelle
Tabelle
BEISPIEL 7: Untersuchung des Bardac
22®-Chlorhexidindigluconatgemisches in alkoholischer Lösung.
-
[0101] Die Auflösungen in den für Wasser angegebenen
Anteilen sind identisch, wenn die zwei Produkte in Glycerin
in Lösung sind.
-
BEISPIEL 8: Untersuchung der desinfizierenden Kapazität
gegenüber Bakterien und Pilzen von Mikrokapseln, die eine
erfindungsgemäße Zusammensetzung enthalten und in
Polyvinylgewebe eingeschlossen sind, nach Stechen des
Gewebes mit einer Nadel.
a) Material und Methoden:
-
[0102]
-
* Zwei Proben mit in Polyvinyl- oder Latexgewebe
eingeschlossenen Mikrokapseln umfassen:
-
- Probe 1: Mikrokapseln, enthaltend eine
erfindungsgemäße Zusammensetzung, eingeschlossen in PVDC. Die Dicke
des Gewebes, das die Mikrokapseln bedeckt, beträgt etwa
500 um, und die Gesamtdicke des Gewebes beträgt etwa 1300
um,
und die Menge des verfügbaren Desinfektionsmittels
nach Zerreissen des Gewebes durch eine Nadel (0,5 · 16 mm)
beträgt etwa 1,5 ug;
-
- Probe 2: Mikrokapseln, die eine erfindungsgemäße
Zusammensetzung vom Typ Paar I enthalten, eingeschlossen in
EVA. Die Dicke des Gewebes, das die Mikrokapseln bedeckt,
beträgt etwa 500 um, und die Menge des verfügbaren
Desinfektionsmittels nach Zerreissen des Gewebes mit einer
Nadel (0,5 · 16 mm) beträgt etwa 0,4 ug.
-
* Die mikrobiologischen Proben werden zur Durchführung des
Tests unter Verwendung der folgenden Mikroorganismen
durchgeführt: Escherichia coli ATCC 1122, Staphylococcus
aureus ATCC 6538 und Candida albicans ATCC 10231.
-
Die Stämme werden in CSL-Medium (Merck) 24 Stunden bei
37ºC gezüchtet, dann werden Verdünnungen zwischen 10&supmin;³ und
in einer 0,9%igen Natriumchloridlösung vorgenommen.
-
1 ml jeder der verschiedenen erhaltenen Kulturen (verdünnt
oder nichtverdünnt) wird zu 9 ml eines Pools aus
menschlichem inaktiviertem Serum gegeben. Die Anzahl der
Mikrorganismen pro Milliliter Testlösung ist in der
nachstehenden Tabelle VIII dargestellt.
-
* Drei Typen von Nadeln wurden Verwendet: 0,7 · 30 mm
(22 Gx1 1/4", Terumo), 0,5 · 16 mm (25 Gx5/8", Terumo),
0,3 · 13 mm (30 Gx1/2", Microlance, Becton-Dickinson).
[0103] Diese Nadeln wurden auf 1 ml Spritzen montiert, in
eine mikrobielle Lösung, wie vorstehend beschrieben,
eingetaucht (mindestens 1 cm Nadel muß in die Lösung
eintauchen) und 0,1 ml Lösung wurde angesaugt. Anschließend
wurden die vorstehend beschriebenen Gewebe durchstochen, in
Petrischalen bedeckt mit Casoagar (Merck, Medium,
supple
mentiert mit 3% Tween®80 und 0,3% Lecithin) mit den Nadeln
gegeben.
-
[0104] Die Orte, an denen der Agar durch die Nadel
inokuliert wurde, wurden markiert, anschließend wurden die
Kulturmedien 72 h bei 37ºC inkubiert, bevor die Ergebnisse
abgelesen wurden.
b) Ergebnisse:
-
[0105] Die Tabelle VII zeigt die Anzahl der positiven
Kulturen, die nach Perforation (5 PeriEorationen pro Test) mit
einer 0,3-x-13-mm-Nadel (30 Gxl/2", Microlance, Becton-
Dickinson) erhalten wurden, und die Züchtung des
perforierten Gewebes auf Casoagarmedium (Merck), das wie
vorstehend näher ausgeführt, supplementiert war.
Tabelle VII:
-
+ Wachstum von Mikroorganismen, - fehlendes Wachstum
-
[0106] Diese Ergebnisse zeigen insbesondere, daß geringe
Konzentrationen an Bakterien oder Pilzen (10²/ml)
mechanisch von den Polyvinylgeweben absorbiert oder eliminiert
werden; eine Konzentration von 10&sup5; Organismen/ml kann als
Grenze gelten, die kein Wachstum ergibt, wenn die
kleinsten Nadeln verwendet werden (0,3 · 13 mm, Tabelle VIII);
im Gegensatz dazu werden Ergebnisse der gleichen
Größenordnung mit 0,7 · 30 mm Nadeln bzw. 0,5 · 16 mm Nadeln
erhalten. Es wird ein Wachstum nur für die erhöhten
Bakterienkonzentrationen (10&sup8;/ml) oder Pilzkonzentrationen
(10&sup7;/ml) erhalten, wenn nur die Perforation der
Kontrollgewebe erfolgt (Probe 1).
-
[0107] Diese Ergebnisse zeigen auch, daß die Mikrokapseln
von Probe 1 (PVDC) wirksamer sind als die Mikrokapseln von
Probe 2 (EVA).
c) Schlußfolgerung:
-
[0108] Die mit Probe 1 durchgeführten Assays zeigen die
quasi sofortige desinfizierende Wirkung der
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die in Mikrokapseln eingearbeitet
wurden unter Bedingungen, die denjenigen, die im
Krankenhaus auftreten, nahekommen.
-
[0109] Aus den vorstehenden Ausführungen folgt, daß die
Erfindung sich in keiner Weise auf diese
Durchführungsformen und näher beschriebenen Anwendungen beschränkt; sie
umfaßt im Gegensatz dazu alle Varianten, die einem
Fachmann einfallen können, ohne vom Umfang oder Gehalt der
vorliegenden Erfindung abzuweichen.