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Die
Erfindung betrifft ein tuberkulozides Desinfektionsmittel, das eine
Lösung
eines quartären
Ammoniumsalzes enthält,
und dessen Verwendung.
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Die
Erfindung beschäftigt
sich somit mit antimikrobiellen Zusammensetzungen aus quartären Ammoniumsalzen
und Verfahren zur Behandlung bei bakteriellem Befall. Speziell betrifft
die Erfindung mycobakterizide und tuberkulozide Zusammensetzungen
mit quartären
Ammoniumsalzen.
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Quartäre Ammoniumsalzformulierungen
werden seit vielen Jahren als Desinfektionsmittel verwendet, und
diese Formulierungen zeigen ein breites Spektrum an antimikrobieller
Aktivität.
Obwohl Formulierungen, die höhere
Konzentrationen von quartären
Ammoniumsalzen enthalten, dafür
bekannt sind, daß sie
gegen bestimmte Gram-positive und Gram-negative Bakterien wirksam
sind, zeigen diese Formulierungen keine tuberkulozide Wirkung. Obgleich
zahlreiche viruzide, bakterizide, sporizide und fungizide Zusammensetzungen
bekannt sind, steht derzeit keine zur Verfügung, die ein wirksames Entfernen
von Mycobakterien gewährleistet und
sich gleichzeitig durch eine geringe Toxizität, Geruchlosigkeit, Nichtentzündbarkeit,
geringe Hautreizung und keine Fleckenbildung bei Berührung mit
einer Oberfläche
auszeichnet. Das Mycobacterium tuberculosis ist ein Organismus,
der gegenüber
der Behandlung mit den meisten bakteriziden Verbindungen unempfindlich ist.
Seine dreischichtige Zellwand, die sich aus 60 % Lipid, Peptidglykan,
Arabinoglykan, Trehalose-6,6'-dimycolat,
Sulfaten und Mykosiden zusammensetzt, erklärt diese ungewöhnlichen
Eigenschaften dieses Organismus: (a) relative Undurchlässigkeit
gegenüber
Färbmittel,
(b) Säurebeständigkeit,
und (c) ungewöhnliche
Widerstandsfähigkeit
gegenüber
Abtöten
durch Säuren
oder Laugen.
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Eine
weitverbreitete Klasse von Verbindungen, die zur Bekämpfung von
M. tuberculosis eingesetzt werden, sind die Aldehyde. Das bevorzugte
Aldehyd ist Glutaraldehyd, von dem man glaubt, daß dessen
abtötende
Wirkung daher zustandekommt, daß es
Radikale bildet, die in der Lage sind, in die schützende Zellwand
einzudringen. Glutaraldehyd ist ein Alkylierungsmittel und kann
daher chemisch mit den Sulfhydryl-, Hydroxyl- und Carboxylgruppen
von Proteinen reagieren. Oftmals schließen diese glutaraldehydhaltigen
Formulierungen ein anionisches oberflächenaktives Mittel ein, das
das Eindringen des Aldehydradikals dadurch unterstützt, daß es die
Zellmembran durch Bildung von oberflächenaktives Mittel-Lipid-Protein-Komplexen
solubilisiert. Glutaraldehyde weisen einige Nachteile beim Einsatz
als chemisches Desinfektionsmittel auf. Sie sind teuer und können nur
bis zu einer 0,5-prozentigen, oder im Alkalischen bis zu einer 2,0-prozentigen
Lösung verdünnt werden.
Bei der Handhabung werden 0,5-prozentige Lösungen als relativ toxisch
und 2,0-prozentige als
toxisch angesehen. Diese Lösungen
verursachen schwere Dermatitis und sind allergen. Sie haben sich
bei dem Abtöten
von M. tuberculosis als unzuverlässig
erwiesen. Aldehyde haben eine strengen Geruch und deren Dämpfe reizen
Schleimhäute
extrem stark. Sind diese Verbindungen einmal in Mischung gebracht,
so ist deren Haltbarkeit bei den am weitesten verbreiteten alkalischen
Formulierungen nicht größer als
dreißig
Tage.
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Alkohole
sind dafür
bekannt, daß sie
eine geringe, über
ein breites Spektrum wirkende keimtötende Aktivität aufweisen.
Ethanol, Benzylalkohol und Isopropanol werden zur Zeit in gegen
M. tuberculosis wirksamen Desinfektionsmitteln eingesetzt. Isopropanol
mit einer Konzentration von mehr als 50 Gew.-% ist der bevorzugte
Alkohol. Alkohole wirken dadurch, daß sie die Proteine der Mikroorganismen
denaturieren und ausfällen.
Alkohole haben sehr niedrige Dampfdrücke und sind demzufolge sehr
leicht entzündlich.
Ethylalkohol ist gegenüber
Mycobakterien nur in in Konzentratrionen über 50 % wirksam und stellt
bei jeder bakteriziden Zusammensetzung deswegen eine Gefahr dar,
da dessen Flammpunkt unter 38° C
liegt. Isopropanol stellt weniger ein Problem bezüglich der
Entflammbarkeit dar, jedoch bezüglich
den gesetzlichen Bestimmungen betreffend flüchtige organische Verbindungen
(VOC), so daß sein
Einsatz in bakteriziden Formulierungen problematisch ist.
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Phenole
werden aufgrund ihrer bakteriziden Wirkung im breiten Rahmen eingesetzt.
Die Phenole sind besonders wirkungsvoll dadurch, daß sie strukturelle
und enzymatische Proteine ausfällen
und somit zelluläre Prozesse
inaktivieren und letztendlich zum Abtöten der Zelle führen. Phenole,
die bei der Formulierung von mycobakteriellen Zusammensetzungen
eingesetzt werden, schließen
o-Phenylphenol, p-Tertiäramylphenol und
Benzylchlorphenol ein. Phenole haben einen strengen charakteristischen
Geruch und sind ziemlich toxisch. Selbst kürzlich entwickelte Phenole
mit hohem Molekulargewicht weisen einen stechenden Geruch auf, und
obwohl weniger toxisch als Phenol selbst, ist deren Toxizitätsgrad nach
wie vor von Bedeutung. Mit zunehmendem Molekulargewicht nimmt die
Löslichkeit
ab, und Verbindungen wie p-Tertiäramylphenol
sind relativ unlöslich
in Wasser.
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Zusammensetzungen,
die Jodophore enthalten, wurden schon gegen Mycobakterien eingesetzt.
Jodophore haben einen durchdringenden Jodgeruch und beflecken jede
Oberfläche,
mit der sie in Berührung
treten.
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Aus
der
DE 40 05 784 C2 ist
ein Desinfektionsmittel-Konzentrat und dessen Verwendung als Mykobakterizid
und Viruzid bekannt, das 10 bis 60 Gew.-% Phenoxyethanol oder eine
Mischung von Phenoxypropanolen, 0,1 bis 50 Gew.-% eines quartären Ammoniumsalzes,
3 bis 25 Gew.-% eines nichtionischen Tensides wie bspw. alkoxylierte
Fettalkohole und eine organische Base aufweist.
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Aus
der
DE 37 80 638 T2 ist
eine germizide Zusammensetzung bekannt, die als aktiven Wirkstoff
ein quartäres
Benzylammoniumfluorid aufweist, das als Feuchthaltemittel bzw. Emulgiermittel
Polypropylenglykol, Polyoxyethylenglykolester oder Polyglykol aufweisen
kann.
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Aus
der
DE 36 19 748 A1 ist
ein antimikrobielles Mittel bekannt, das quartäre Ammoniumsalze, ein Aminoxid
und einen ethoxilierten Fettalkohol enthalten kann.
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Aus
der
DE 35 19 557 A1 ist
ein desinfizierendes Präparat
bekannt, das 0,5 bis 35 % eines quartären Ammoniumsalzes und ein
nichtionisches Tensid mit einem Gehalt von 1 bis 20 % enthalten
kann, worunter auch Polyethylenglykolalkylether fallen.
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Aus
der
US 4,320,147 ist
ein Desinfektionsmittel, das wirksam gegenüber Gram-positive Gram-negative
Organismen ist und das quartäre
Ammoniumsalze enthält
und ggf. ein inertes nichtionisches Tensid der Formel H(OCH
2CH
2)
9–12OR
aufweist.
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Aus
der
US 4,540,505 ist
ein Desinfektionsmittel bekannt, das neben quartären Ammoniumsalzen in einem
Anteil von 0,45 bis 0,7 % einen Glykolmonoalkylether (4 bis 6 Gew.-%
aufweist), um die Zusammensetzung zu stabilisieren.
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Aus
der WO 86/05 509 A1 ist ein wässriges
Desinfektionsmittel bekannt, das ein quartäres Ammoniumsalz (0,01 bis
50 %) und ein nichtionisches Tensid aufweist, das die Formel RO(R-O)yZx aufweist, wobei
weitere Zusatzmittel wie organische Lösungsmittel vorhanden sind,
wie bspw. ein Diethylenglykolmonobuthylether.
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Es
ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, bei an sich bekannten desinfizierenden
Substanzen wie quartären
Ammoniumsalzen, deren Aktivität,
insbesondere gegenüber
Mykobakterien zu erhöhen
und ein entsprechendes Desinfektionsmittel bereitzustellen.
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Die
Erfindung stellt Desinfektionsmittel zur Verfügung, die auf quartären Ammoniumsalzen
basieren und die dadurch eine verstärkte Aktivität gegen
Mycobakterien und insbesondere Tuberkulose verursachende Mycobakterien
zeigen, daß die
dreischichtige Zellwand der Mycobakterien aufgebrochen wird, was
für das
Abtöten
der Zelle entscheidend ist, wobei dies in überraschender Weise durch die
Kombination von quartären Ammoniumsalzen
mit Glykolethern möglich
ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Bedingungen zur
Verfügung,
unter denen ein quartäres
Ammoniumsalz und ein Glykolether kombiniert werden können, um
die tuberkulozide Wirkung dieser Verbindungen zu optimieren.
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Die
Erfindung stellt darüber
hinaus ein wirksames Tuberkulozid zur Verfügung, das billig ist, geruchlos ist
und nicht entzündbar
ist.
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Ferner
stellt die Erfindung auch eine wirksame tuberkulozide Zusammensetzung
zur Verfügung,
die wenig toxisch, wenig haut- oder
schleimhautreizend ist, und die die Haut oder andere Oberflächen nicht
befleckt.
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Wie
dies nachfolgend noch ausführlich
erläutert
wird, wurde in überraschender
Weise festgestellt, daß die
Kombination einer spezifischen minimalen Konzentration von Glykolether
mit einem quartären
Ammoniumsalz eine gegen Tuberkulose verursachende Bakterien wirksame
tuberkulozide Zusammensetzung liefert. Dieses Ergebnis ist völlig unerwartet,
da die Wirkung gegen Mycobakterien bei quartären Ammoniumsalzen allein, auch
in hoher Konzentration, nicht nachgewiesen werden konnte, obwohl
sie gegen Viren und einige Gram-positive und Gram-negative Bakterien
wirksam sind. Quartäre
Ammoniumsalze sind sehr stabil, besitzen eine lange Haltbarkeit
und weisen oberflächenwirksame
Eigenschaften auf, die die bakterizide Wirkung verstärken.
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Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
weisen drei wesentliche Bestandteile auf, nämlich ein quartäres Ammoniumsalz,
einen Glykolether und als Lösemittel
Wasser. Es wurde überraschenderweise
festgestellt, daß mycobakterizide
Zusammensetzungen, die ein quartäres
Ammoniumsalz und zumindest etwa 8 Gew.-% eines Glykolethers enthalten,
als tuberkulozide, reinigende Zusammensetzungen wirksam sind. Die Zusammensetzungen
können
auch noch andere Bestandteile enthalten, wie dies ausführlicher
noch beschrieben wird.
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Die
für den
erfindungsgemäßen Gebrauch
geeigneten Glykolether sind Mono-, Di- und Trialkylenglykolether,
wobei der Alkylenabschnitt eine geradkettige oder verzweigte Alkylenkette
ist, die 2–6
Kohlenstoffatome enthält,
und wobei der Alkylabschnitt des Ethers eine Alkylgruppe ist, die
etwa 1–6
geradkettige oder verzweigte Kohlenstoffatome aufweist.
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Erfindungsgemäße tuberkulozide
Zusammensetzungen können
als Konzentrate oder als gebrauchsfertige (ready-to-use) Lösungen hergestellt
werden. Konzentrate können
als solche eingesetzt werden, oder für die beim Einsatz bevorzugte
Konzentration zu jeder beliebigen Zeit vor dem Einsatz verdünnt werden.
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Bei
konzentrierten Zusammensetzungen beträgt das Gewichtsverhältnis zwischen
Glykolether und quartärem
Ammoniumsalz zumindest etwa 4:1. Das Konzentrat muß so hergestellt
werden, daß es
einen Glykolethergehalt hat, der, nach einem Verdünnen auf
die endfertige Gebrauchskonzentration, bei mindestens etwa 8 Gew.-%
liegt. Bevorzugte Formulierungen enthalten den Glykolether und das
Ammoniumsalz in einem Verhältnis
von mindestens etwa 20:1, besonders bevorzugte Zusammensetzungen
weisen ein Verhältnis
zwischen Glykolether und Ammoniumsalz von etwa 40:1 auf.
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Die
Konzentration an quartärem
Ammoniumsalz in den gebrauchsfertigen (oder verdünnten) Zusammensetzungen liegt
zwischen 0,1–2,0
Gew.-%, vorzugsweise bei 0,2 Gew.-%. Die Glykoletherkonzentration liegt
vorzugsweise bei mindestens etwa 8 Gew.-%. Bei Zusammensetzungen,
die einen geringeren Gehalt als etwa 8 Gew.-% an Glykolether in
Verbindung mit einem quartären
Ammoniumsalz aufweisen, haben sich als solche nicht als besonders
wirksam gegen Mycobakterien erwiesen. Ab diesem Gehalt an Glykolether
kann immer eine Wirksamkeit gegen Mycobakterien nachgewiesen werden.
In sprühbaren
Zusammensetzungen ist die Hauptkomponente der erfindungsgemäßen Formulierung
Wasser, dessen Konzentration, bezogen auf das Gesamtgewicht der
drei wesentlichen Bestandteile etwa zwischen 70 und 90 Gew.-% liegt.
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Die
erfindungsgemäß eingesetzten
quartären
Ammoniumsalze besitzen die allgemeine Formel:
wobei R
1 und
R
2 geradkettige oder verzweigte niedere
Alkylgruppen mit ein bis sieben Kohlenstoffatomen sind; R
3 eine geradkettige oder verzweigte höhere Alkylgruppe
mit etwa acht bis zwanzig Kohlenstoffatomen oder eine Benzylgruppe
ist; R
4 eine geradkettige oder verzweigte
höhere
Alkylgruppe mit etwa acht bis zwanzig Kohlenstoffatomen ist; und
X ein Halogen-, ein Methosulfat- oder
ein Saccharinatanion ist.
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Bei
bevorzugten quartären
Ammoniumsalzen sind R1 und R2 Methylgruppen;
R3 ist ein Benzylrest oder eine geradlinige
oder verzweigte Alkylkette mit acht bis achtzehn Kohlenstoffatomen
und R4 ist eine geradlinige oder verzweigte
Alkylkette mit acht bis achtzehn Kohlenstoffatomen. Ein bevorzugtes
Halogen ist Chlor, es kann auch das Methosulfat- oder ein Saccharinatanion
sein.
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Beispielhafte
geeignete quartäre
Ammoniumsalze sind: Dioctyldimethylammoniumchlorid, Octyldecyldimethylammoniumchlorid,
Didecyldimethylammoniumchlorid, (C12-C18) n-Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid,
(C12-C18) n-Alkyldimethylethylbenzylammoniumchlorid,
und (C12-C18) n-Alkyldimethylbenzylammoniumsaccharinat.
Dies ist keine erschöpfende
Aufzählung,
andere quartäre
Ammoniumsalze mit keimtötender
Aktivität sind
ebenfalls ausreichend.
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Das
quartäre
Ammoniumsalz entsprechend der vorliegenden Erfindung muß nicht
ein Einzelsalz sein, sondern kann auch eine Mischung von zwei oder
mehreren quartären
Ammoniumsalzen sein. Der Gehalt, in Gew.-%, an quartärem Ammoniumsalz,
sei es als Einzelsalz oder als Mischung, liegt typischerweise im
Bereich zwischen 0,1 %–2,0
%. Das bevorzugte quartäre
keimtötende
quartäre
Ammoniumsalz ist eine Mischung von 34 Gew.-% C12 und
16 Gew.-% C14 n-Alkyldimethylethylbenzylammoniumchlorid
und etwa 30 Gew.-% C14, 15 Gew.-% C16, 2,5 Gew.-% C12 und
2,5 Gew.-% C18 n-Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid.
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Der
Glykolether kann aus der folgenden Gruppe ausgewählt sein, ohne auf diese Gruppe
beschränkt zu
sein, nämlich:
Diethylenglykolmonobutylether, Propylenglykolmonomethylether, Dipropylenglykolmonomethylether,
Tripropylenglykolmonomethylether, Propylenglykolmethyletheracetat,
Dipropylenglykolmethyletheracetat, Ethylenglykolmonobutylether,
Diethylenglykolmonobutylether, Triethylenglykolmonobutylether, Diethylenglykolmonoethylether,
Propylenglykoltertiärbutylether,
Propylenglykolmonobutylether, Dipropylenglykolmonobutylether und
Propylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht zwischen 200–1.000 Dalton.
Die für
diese Zusammensetzung bevorzugte Gruppe an Glykolethern sind die
Diethylenglykolmonoalkylether. Die Glykolether können entsprechend der vorliegeden
Erfindung von zumindest 8 bis 80 Gew.-% der Zusammensetzung enthalten
sein.
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Es
können
ein oder mehrere Bestandteile wahlweise zugefügt werden, um ästhetische
oder andere vorteilhafte Eigenschaften zu erzeugen. Solche wahlweisen
Bestandteile sind beispielsweise: Duftstoffe, oberflächenaktive
Mittel, weitere mikrobielle Mittel, Emulsionsmittel, Komplexbildner
oder alkalische Mittel. Einzige Bedingung ist, daß in jeglicher
Zusammensetzung diese Bestandteile mit den anderen Bestandteilen
verträglich
sein müssen.
Typische Komplexbildner, wie beispielsweise Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
können mit
einem Gehalt von 1 bis 5 Gew.-% in der Zusammensetzung eingesetzt
werden. Geruchsstoffe, wie beispielsweise Pinienduft, können der
Zusammensetzung mit 0,1 – 1,0
Gew.-% zugefügt
werden. Kationische, amphotere und nichtionische oberflächenaktive
Mittel, wie ethoxydierte Alkylphenole, können dazu eingesetzt werden,
um die membranlösenden
Fähigkeiten
der Zusammensetzung zu verstärken.
Alkalinitätsbilder,
wie Natriummetasilikat, können
dazu in die desinfizierenden Formulierungen eingebracht werden,
um die Reinigungskraft der Formulierung zu verstärken.
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Die
erfindungsgemäßen Formulierungen
können über einen
breiten pH-Bereich formuliert werden. Quartäre Ammoniumsalze sind über den
gesamten pH-Bereich, und zwar von stark sauren bis zu stark basischen
Lösungen,
haltbar. Geringfügige
Modifikationen der Zusammensetzung werden durch die Anwendungsart
bestimmt, nämlich
Dekontaminierung von Instrumenten, belebten oder unbelebten Oberflächen, Desinfizierung
von Haut, und dergleichen.
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Es
ist dem Fachmann klar, daß die
vorliegende Erfindung dementsprechend modifiziert werden kann, ohne
den Rahmen der Erfindung zu verlassen.
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Es
versteht sich, daß die
vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden
Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch
in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind,
ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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BEISPIEL 1
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Herstellung einer gebrauchsfertigen
(Ready-to-use) tuberkuloziden Zusammensetzung
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Eine
erfindungsgemäße gebrauchsfertige
tuberkulozide Formulierung wurde hergestellt, indem die in der nachfolgenden
Tabelle 1 aufgelisteten Bestandteile gemischt werden, bis eine klare
Lösung
erhalten wurde. Diese Formulierung wurde in einen Spraybehälter gefüllt, so
daß die
Formulierung dadurch auf Oberflächen
angewendet werden kann, indem die Lösung aus dem Behälter gepumpt
wird.
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TABELLE
1 – Formulierung
1
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- 1 BTC 2125M ist eine Mischung von
quartären
Ammoniumsalzen mit: 34 Gew.-% C12 und 16
Gew.-% C14 n-Alkyldimethylethylbenzylammoniumchlorid
und etwa 30 Gew.-% C14, 15 Gew.-% C16, 2,5 Gew.-% C12 und
2,5 Gew.-% C18 n-Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid.
- 2 Permakleer 100 ist eine 38%ige Lösung von
Ethylendiamintetraessigsäure.
- 3 Neutronyx® 656
ist ein Nonylethoxyphenol, das durchschnittlich 11 Mol Ethylenoxid
enthält.
- 4 Butyl Dioxitol ist von Shell erhältlich und
ist ein Diethylenglykolmonobutylether.
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BEISPIEL 2
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Eine
Formulierung 2 wurde im wesentlichen nach dem Verfahren der Formulierung
1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß der Gehalt an Butyl Dioxitol
auf 6 % reduziert wurde und der Gehalt an Wasser auf 88,380 % erhöht wurde.
Diese Formulierung ist nachfolgend in Tabelle 2 gezeigt.
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TABELLE
2 – Formulierung
2
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BEISPIEL 3
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Die
tuberkulozide Wirkung der vorliegenden Erfindung wird dadurch vermittelt,
daß eine
Oberfläche, die
Mycobakterien enthält,
mit der erfindungsgemäß quartäres Ammoniumsalz/Glykolether/Wasser-Lösung in Berührung gebracht
wird. Das Verfahren zur Bestimmung der tuberkuloziden Wirkung der
erfindungsgemäßen Zusammensetzung
ist durch die Association of Official Analytical Chemists (Official
Methods of Analysis of the AOAC, 15. Ausgabe, 1990, AOAC, Teile
961.02 & 965.12)
festgelegt. Die experimentelle Vorgehensweise war wie folgt:
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A. Herstellung des Probeorganismus
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Mycobakterium
bovis, ATCC #27289 (BCG) wurde in ein frisches modifiziertes Proskauer-Beck-Medium
(MPBM) eingeimpft und wurde unter leichtem Bewegen 21 – 25 Tage
lang bei 37 ± 1°C inkubiert.
Die reife Kultur wurde in einen sterilen Gewebszerkleinerer überbracht,
und es wurde 1,5 ml einer sterilen 2%igen Gelatinelösung pro
20 ml der Kultur zugefügt.
Diese Suspension wurde mazeriert und mit MPBM verdünnt, bis eine
Anzeige von 20 % bei 650 nm auf einem Spektrophotometer erreicht
wurde.
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B. Testverfahren
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Mikroskopieobjektträger wurden
sterilisiert, indem die einzelnen Objektträger in Petri-Schalen gebracht
wurden, die mit zwei Stück
eines 9 cm Whatman Nr. 2 Filterpapiers belegt wurden und in einem
Heißluftofen
für 2 Stunden
bei 180°C
erhitzt wurden, woraufhin sie abgekühlt und bis zur Verwendung
bei Raumtemperatur gehalten wurden.
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Die
Suspension wurde gründlich
geschüttelt
und 10 Minuten zur Absetzung in Ruhe gelassen. Eine Mikropipette
wurde verwendet, um 0,01 ml der Kultur auf den sterilen Testobjektträger aufzubringen,
die sich sofort gleichmäßig über eine
etwa 6 cm2 große Fläche ausbreitete. Dieser Vorgang
wurde solange wiederholt, bis genug Objektträger präpariert sind. Zwei nicht geimpfte
Objektträger
wurden als Sterilitätskontrolle
verwendet. Alle Objektträger
wurden 30 Minuten lang bei 37 ± 1°C getrocknet.
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Zwei
Gruppen von zehn geimpften Objektträgern wurden zweimal unter Verwendung
eines Bakam Modell 4 Pumpsprays, Nr. 22/415, das die Formulierungen
1 oder 2 enthält,
aus einer Entfernung von etwa 15–20 cm von der geimpften Oberfläche angesprüht, so daß die Objektträger völlig mit
der Formulierung überzogen
wurden. Jeder Objektträger
wurde 10 Minuten lang bei einer Temperatur von 20°C gehalten.
Die überschüssige Flüssigkeit
wurde abgetrocknet, und der Objektträger wurde daraufhin in ein
einzelnes 120 ml Gefäß mit Schraubdeckel
und weitem Hals gebracht, das 10 ml eines Neutralisierungsmittels
enthielt und zum Mischen geschüttelt
wurde. Die Objektträger
wurden daraufhin in einen zweiten Satz von 120 ml Gefäßen mit weitem
Hals übertragen,
die ein Neutralisierungsmittel (Glycin, Azolectin und Tweer® 80)
enthielten. Jeder Objektträger
wurde aus dem Neutralisierungsmittel unter Verwendung von geflammten
und gekühlten
Pinzetten entfernt, und in Gefäße eingebracht,
die 20 ml MPBM enthielten. Von jedem Neutralisierungsmittelgefäß wurden
2 ml in einem Röhrchen
mit Middlebrook 7H9-Brühe
(MB) und 2 ml in einem Röhrchen
mit Kirchners Medium (KM) als Nebenkultur angelegt. Diese Sequenz
wurde bei allen Objektträgern
wiederholt.
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C. Inkubation
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Jedes
Gefäß wurde
60 Tage lang bei 37 ± 1°C inkubiert
und die Ergebnisse wurden durch + (sichtbares Wachstum) oder – (nicht
sichtbares Wachstum) aufgezeichnet. Haben die Testkulturen nach
60 Tagen kein sichtbares Wachstum gezeigt, werden die Gefäße weitere
30 Tage zur Inkubation gebracht.
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D. Untersuchungen
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1. Phenoluntersuchung:
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Eine
Phenoluntersuchung wurde durchgeführt, um die Widerstandsfähigkeit
der BCG zu bestimmen, wenn sie zehn Minuten bei 20°C ± 1°C 1:75 und
1:50 Phenolverdünnungen
ausgesetzt werden. Die verdünnte Phenollösung wurde
aus einer 5%igen wäßrigen Phenolgrundlösung hergestellt.
Zehn Gefäße mit 1:75
und 1:50 Phenolverdünnungen
wurden verwendet und bei 20 ± 1°C gehalten.
Jedem Gefäß mit Phenollösung wurde
ein kontaminierter Objektträger
in 30 Sekundenintervallen zugefügt
und drei- oder viermal geschwenkt. Nach einem zehnminütigem Berührungszeitraum
wurde jeder Träger
in sein entsprechendes Gefäß gebracht, das
20 ml eines Neutralisierungsmittels enthielt und zum Mischen geschwenkt.
Von demselben Gefäß wurden 2
ml von MPGM als Nebenkultur in einem Gefäß mit MB und in einem Gefäß mit Kirchners
Medium angelegt. Diese Sequenz wurde bei allen Objektträgern wiederholt.
Jedes Röhrchen
wurde in derselben Weise wie die Testsubstanz zur Inkubation gebracht.
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2. Lebensfähigkeitsuntersuchung:
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Zur
Lebensfähigkeitsuntersuchung
wurde ein jeder Objektträger
mit der standardisierten BCG kontaminiert und eine Nebenkultur wurde
in einem Röhrchen
mit MPBM, Kirchners Medium und MB angelegt und in derselben Weise
wie die Testsubstanz inkubiert.
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3. Sterilitätsuntersuchung:
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Zur
Sterilitätsuntersuchung
wurden 2 ml eines Neutralisierungsmittels jeweils in ein Röhrchen mit MPBM,
ein Röhrchen
mit Kirchners Medium und ein Röhrchen
mit MB eingebracht und in derselben Weise wie die Testsubstanzen
inkubiert.
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Zusätzlich wurde
ein nicht geimpfter steriler Objektträger den Röhrchen mit MPBM, MB und Kirchners Medium
zugefügt
und in derselben Weise wie das Teströhrchen inkubiert.
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E. INTERPRETATION DER
TESTERGEBNISSE
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Eine
Formulierung erfüllt
die Erfordernisse der Wirksamkeit, wenn kein sichtbares Wachstum
in irgendeinem Teströhrchen
erfolgt; wenn kein Wachstum in dem Röhrchen mit der 1:50 Phenolverdünnung erfolgt;
und wenn kein Wachstum bei der Sterilitätsuntersuchung erfolgt. Wachstum
sollte bei der Lebensfähigkeitsuntersuchung
stattfinden und muß in
den Röhrchen
mit 1:75 Phenolverdünnungen
erfolgen.
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Eine
Formulierung erfüllt
die Erfordernisse an die Wirksamkeit nicht, wenn Wachstum in irgendeinem Teströhrchen oder
in den Röhrchen
mit der 1:50-Phenolverdünnung
erfolgt.
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Ein
Nichtbestehen der Untersuchungen macht den Test unwirksam.
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Die
Testergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 gezeigt.
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Zusammenfassung
der Ergebnisse
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Wie
der Tabelle 3 entnommen werden kann, bestand die Lösung aus
quartärem
Ammoniumsalz/8 % Glykolether den Test und ist daher wirksam beim
Abtöten
des Mycobakterium bovis, wogegen die Lösung aus quartärem Ammoniumsalz/6
% Glykolether den Test nicht bestanden hat und daher noch nicht
wirksam das Mycobakterium abtötet.
Solch ein Ergebnis ist unerwartet, da weder das quartäre Ammoniumsalz
noch das Glykol eine Mycobakterien abtötende Wirkung gezeigt haben,
wenn sie einzeln angewendet werden.