DE68925975T2

DE68925975T2 - Zusammensetzung zur Verhinderung der übertragung von AIDS.

Info

Publication number: DE68925975T2
Application number: DE68925975T
Authority: DE
Inventors: Charles Fox; Shanta Modak
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 1988-10-18
Filing date: 1989-10-17
Publication date: 1996-07-25
Anticipated expiration: 2009-10-18
Also published as: AU622945B2; EP0640345A3; DE68925975D1; WO1990004390A1; EP0640345A2; JPH04502148A; JP2799210B2; AU4486489A; US4952411A; EP0439513A1; EP0439513B1; EP0439513A4

Description

Die Erfindung betrifft eine Zubereitung zum Verhindern der Übertragung von AIDS (erworbene Immunschwäche).
AIDS ist eine katastrophale, tödliche Krankheit, mit der gegenwärtig weltweit Millionen von Menschen infiziert sind. Obwohl sie sich ursprünglich auf Zentralafrika und bestimmte Risikogruppen in anderen geographischen Gebieten, einschließlich der Vereinigten Staaten, beschränkte, verbreitet sich AIDS nun auch auf andere Gebiete und tritt auch bei Individuen auf, die nicht zu den bekannten Risikogruppen gehören. Deswegen werden große Anstrengung unternommen, um Verfahren zur Verhinderung der Übertragung von AIDS, zur Heilung von AIDS nach der Infektion sowie zur Linderung der AIDS-Symptome zu entwickeln. Bis heute hat sich jedoch sowohl die Behandlung als auch die Vorbeugung von AIDS als schwierig erwiesen.
AIDS wird durch ein Virus verursacht. Dieses Virus ist in der Literatur unter einer Vielzahl von Namen beschrieben, die die Bezeichnungen HIV (Human Immunodeficiency Virus), LAV (Lymphadenopathy-Associated Virus), ARV (AIDS-related Virus) und HTLV-III (Human T-cell Leukemia Virus-III) einschließen. Der Einfachheit halber soll das Virus hier als AIDS-Virus bezeichnet werden.
Es ist allgemein bekannt, daß sich Viren, bezogen auf die Natur des genetischen Materials des jeweiligen Virus, in zwei Gruppen einteilen lassen. Einige Viren sind DNA- Viren, d.h. bei ihrem genetischen Material handelt es sich um Desoxyribonukleinsäure, während andere RNA-Viren (Ribonukleinsäureviren) sind. Die RNA-Viren lassen sich wiederum in zwei Gruppen aufteilen, nämlich in solche, bei denen die Replikation des viralen Genoms über die Herstellung einer RNA-Kopie direkt vom RNA-Genom verläuft, und solche, bei denen ein DNA-Intermediat beteiligt ist. Der letztere Typ von RNA-Viren wird Retrovirus genannt.
Das AIDS-Virus ist ein Retrovirus Es besitzt somit, wie andere Retroviren, ein reverse Transcriptase (oder RNA-abhängige DNA-Polymerase) genanntes Enzym, welches die Transcription viraler RNA in doppelhelikale DNA katalysiert Diese DNA-Sequenz wird in das Genom der infizieren Zelle integriert, wo es als Provirus bekannt ist. Die anschließende Transcription des Provirus durch den Transcriptionsmechanismus der infizierten Zelle erzeugt die neue virale RNA zur Verpackung in neue Viruspartikel.
Da der AIDS-Virus in einer infizierten Zelle über lange Zeit in Form des Provirus schlafen kann, war es schwierig, die exakten Infektionswege, über die AIDS verbreitet wird, nachzuweisen. Es ist jedoch bekannt, daß AIDS durch Transfusionen mit AIDS- Viren enthaltendem Blut auf eine Person übertragen werden kann. AIDS kann auch durch homosexuellen oder heterosexuellen Geschlechtsverkehr mit einem mit dem AIDS-Virus infizierten Partner auf eine andere Person übertragen werden. Die Übertragung von AIDS wird durch zuvor vorliegende sexuell übertragene andere Erkrankungen als AIDS (STD's = sexually transmitted diseases), beispielsweise Gonorrhoe, erleichtert. Weiterhin vermutet die Forschung, daß das AIDS-Virus deshalb während des Geschlechtsverkehrs leicht übertragen wird, weil das Gewebe zerreißt, was den Eintritt des AIDS-Virus in den Blutstrom erleichtern würde.
Auf die steigende Bedrohung durch die AIDS-Übertragung hin, wurde die Verwendung von Kondomen während des Geschlechtsverkehrs als eine Maßnahme vorgeschlagen, um der Übertragung des AIDS-Virus vorzubeugen. Deren falsche Verwendung sowie deren Perforation während des Geschlechtsverkehrs läßt Kondome jedoch nur teilweise wirksam werden. Dementsprechend besteht ein starkes Bedürfnis nach einem besseren Verfahren zum Verhindern der Übertragung des AIDS-Virus beim Menschen während des Geschlechtsverkehrs und während chirurgischer Eingriffe an infizierten Patienten. Es ist Aufgabe der Erfindung, ein solches Verfahren zur Verfügung zu stellen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine billige, leicht erhältliche und bequeme topische Zubereitung zur Verhinderung der Übertragung von sexuell übertragenen Krankheiten einschließlich AIDS und Hepatitis zur Verfügung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Zubereitung eine antiviral wirksame Menge eines Biguanids und ein Silbersalz in einer Menge enthält, mit der das Biguanid eine synergistische antivirale Wirkung zeigt, um die Übertragung des AIDS-Virus beim Menschen beispielsweise als Folge des Geschlechtsverkehrs zu verhindern. Die Erfindung beruht auf einem zweigleisigen Wirkmodus spezieller Verbindungen und Kombinationen derselben, die zu einer schnellen Abtötungswirkung innerhalb von Minuten führen. Diese Verbindungen bewirken eine Verminderung der Infektiosität des AIDS-Virus und töten auch die verursachenden Organismen anderer STD's nach kurzer Exposition ab. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher geeignet, das unmittelbare Risiko der AIDS-Übertragung zu verringern. Durch die Elimination der STDs-verursachenden Organismen, die das AIDS-Risiko erhöhen, verringert es auch das zukünftige Risiko der AIDS-Übertragung.
Unter den Verbindungen, die sich als antivirale Mittel gegen Retroviren einschließlich dem AIDS-Virus erwiesen haben, finden sich Silbersalze wie Silbersulfadiazin (AgSD). Diese Materialien waren zuvor als für die Behandlung von Verbrennungen bei Mensch und Tier geeignete antibakterielle Mittel bekannt (C.L. Fox, US-A-3 761 590). Für AgSD wurde außerdem nachgewiesen, daß es gegen bestimmte Viren wie Herpes Simplex und Herpes Zoster sowie gegen die verursachenden Organismen vieler STDs einschließlich Candida Albicans, Treponema Pallidum und Gonorrhoe wirksam ist. Darüber hinaus offenbart das US-Patent 4 415 565 von Wysor antivirale Wirkung von AgSD gegen bestimmte RNA-Viren, wobei keiner von diesen ein Retrovirus ist. Somit gab es, obwohl das AgSD ein gut untersuchtes Material darstellt, keinen Grund zu der Annahme, daß es gegen das AIDS-Retrovirus wirken würde, das sich als so schwierig zu inhibieren oder zerstören erwiesen hat.
In der europäischen Patentanmeldung Nr.88 301 620.6, angemeldet am 25.Februar und veröffentlicht unter der Nummer EP-A-0 287 204 (sie ist daher älteres Recht gemäß Art.54(3) EPÜ), ist ein Verfahren zur Verhinderung der Übertragung des AIDS-Virus beim Menschen während des Geschlechtsverkehrs beschrieben, bei dem man eine antiviral wirksame Menge Silbersulfadiazin in einer Sexualöffnung wie der Vaginal- oder Analöffnung eines Menschen vor oder während des Beischlafs aufträgt. Die Verwendung anderer Wirkstoffe ist nicht offenbart. Eine weitere Ausführungsform des Verfahrens besteht im Auftragen des Silbersulfadiazins als ein Bestandteil einer Beschichtung auf ein Kondom. Außerdem ist eine Zubereitung zum Verhindern der Übertragung von AIDS-Viren im Menschen beim Geschlechtsverkehr beschrieben, die eine antiviral wirksame Menge an Sibersulfadiazin enthält.
Biguanide wie das Chlorhexidin haben sich ebenfalls als Inhibitoren des AIDS-Virus wirksam erwiesen, wenn sie in ausreichend hohen Mengen verwendet werden.
Wir haben nun gefunden, daß Kombinationen dieser Verbindungen miteinander und mit anderen antibakteriellen Mitteln zu einer unerwarteten Verstärkung der antiviralen Wirkung des AgSD und auch zu einer schnellen Abtötungswirkung führen. Insbesondere ist AgSD in Kombination mit Chlorhexidin, einem Breitbandantibiotikum, wesentlich wirksamer in bezug auf eine Verringerung der Infektiosität des AIDS-Virus als AgSD alleine, und das trotz der Tatsache, daß Chlorhexidin alleine unter denselben Bedingungen keine Auswirkung auf die Infektiosität des AIDS-Virus hat. Eine erhöhte Wirkung wurde auch für Kombinationen von AgSD mit Detergenzien wie Desoxycholat registriert.
Im Hinblick auf diese Entdeckungen strebt die Erfindung die Verhinderung der Übertragung von AIDS an, indem man eine antiviral wirksame Menge Biguanid und Silbersalz wie Silbersulfadiazin topisch anwendet. Andere Mittel wie Desoxycholat können ebenfalls verwendet werden. Die Zubereitung wird vorteilhafterweise vor oder während des Geschlechtsverkehrs in einer Sexualöffüng des Menschen angewandt. Dieses kann geschehen, indem man eine Creme oder einen Schaum in die Sexualöffnung einführt oder die inhibitorische Zubereitung auf ein Kondom oder eine andere Vorrichtung, die in die Sexualöffnung eingeführt wird, aufträgt.
Fig. 1 zeigt eine Kurve der Einbaugeschwindigkeit von radioaktiv markiertem Thymidin durch Hepatitis-B-Viren nach dem Aussetzen an AgSD allein oder in Kombination mit anderen Mitteln.
Wie oben beschrieben, bewirkt die vorliegende Erfindung eine Inhibition der Übertragung des AIDS-Virus beim Menschen und anderen Säugern, wobei sie topisch in einer antiviral wirksamen Menge aufgetragen wird. Die Erfindung enthält ein Biguanid in Kombination mit anderen Wirkstoffen.
So wie er in der Beschreibung verwendet wird, bezieht sich der Begriff Sexualöffnung auf Vaginal- und Analöffnungen.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete antivirale Zubereitung enthält ein Biguanid wie Chlorhexidin oder eines seiner Salze.
Zusätzlich enthält die Zubereitung ein Silbersalz. Obwohl die folgenden Beispiele lediglich ein spezifisches Silbersalz, das AgSD, verwenden, können auch andere Silbersalze verwendet werden. Andere geeignete Silbersalze schließen Silberacetat, -benzoat, -carbonat, -chlorid, -jodat, -jodid, -lactat, -laurat, -nitrat, -oxid und -palmitat sowie Silbersalze von Proteinen ein.
Die erfindungsgemäße antivirale Zubereitung enthält außerdem einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile, die die antivirale Wirkung des Silbersalzes erhöhen. Demnach kann die antivirale Zubereitung Detergenzien wie Desoxycholat oder Benzalkoniumchlorid enthalten. Geeignete Salze dieser Materialien können ebenfalls verwendet werden.
Die antivirale Zubereitung kann zusätzlich noch andere Materialien enthalten, die gegen STD-verursachende Organismen wirken, wodurch das Langzeitrisiko einer AIDS-Infektion verringert wird. Beispiele für solche Materialien schließen Nonoxinol, das gegen Gonokokken wirkt, und Chinolon ein, das gegen zahlreiche STD-verursachende Organismen wirksam ist. Es sei angemerkt, daß Chlorhexidin und die oben genannten Detergenzien ebenfalls gegen eine Reihe von STD-verursachenden Organismen wirken, eingeschlossen das Herpes Simplex Virus (HSV) und Candida albicans.
Die antiviralen Zubereitungen für die ertindungsgemäße Verwendung können als (a) Dispersion in einem in Wasser dispergierbaren hydrophilen Träger, (b) als Dispersion in einem im wesentlichen wasserunlöslichen Träger, (c) als Dispersion in einem halbfesten oder cremeartigen, in Wasser dispergierbaren oder wasserlöslichen Öl-in-Wasser- Emulsionsträger oder (d) als Dispersion in einem wäßrigen Saccharoseträger, z.B. einer etwa 25 - 50 gew.-%igen wäßrigen Saccharoselösung vorliegen. Spezifische Beispiele für die Formulierung von Silbersulfadiazin in verschiedenen Trägerstoffen sind in der US-A-3 761 590 angegeben, die durch Bezugnahme eingeschlossen wird. Der Trägerstoff sollte vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 10 Gew.-% Silbersalz und bis zu 2 Gew.-% an anderen Wirkstoffen enthalten.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbare antivirale Zubereitung kann in einer ausdrückbaren Tube mit einer Düse zum Auftragen enthalten sein. Dies erleichtert die topische Anwendung der Zubereitung in der Sexualöffnung vor dem Geschlechtsverkehr durch Einführen der Düse in die Sexualöffnung und Ausdrücken der Tube zum Einpressen der antiviralen Zubereitung in die Sexualöffnung. Alternativ kann die antivirale Zubereitung mit Hilfe jedes der bekannten Applikatoren zum Auftragen von Wirkstoffen in einer Sexualöffnung angewendet werden. Die antivirale Zubereitung kann auch während des Beischlafs durch Auftragen auf den Penis selbst oder durch Beschichten eines Kondoms mit einem Gleitmittelmaterial wie dem K-Y-Gel (Johnson & Johnson), das das Silbersalz enthält, topisch angewendet werden.
Die erfindungsgemaße antivirale Zubereitung kann auch als Beschichtung auf einer Vorrichtung, die in die Sexualöffnung eingeführt werden soll, eingeführt werden. Beispiele für solche Vorrichtungen sind Kondome, medizinische Handschuhe und Diaphragmen. Die Vorrichtungen können mit der antiviralen Zubereitung beschichtet oder imprägniert werden, indem man die fertiggestellte Vorrichtung besprüht oder die antivirale Zubereitung während der Fertigung einbringt. Spezielle Verfahren zur Herstellung dieser Vorrichtungen sind beschrieben in der am 11 Februar 1988 eingereichten US-Anmeldung mit der Nr.154 920 und deren "Combination-in-part", eingereicht am 14 Oktober 1988, die beide durch Bezugnahme eingeschlossen werden.
Im folgenden werden die experimentellen Ergebnisse, die die Wirkung des beanspruchten Verfahrens belegen, angeführt. Die Tests involvieren das AIDS-Virus, ein anerkanntes Modellsystem für AIDS-Viren oder einen anerkannten STD-Organismus. Weiterhin sind, obwohl die Tests mit dem AIDS-Virus selbst im Hinblick auf die katastrophalen Folgen von AIDS notwendigerweise in-vitro-Tests darstellen, diese in-vitro-Tests sehr aussagekräftig und korrellieren gut mit in-vivo-Befunden. Daher unterstützen sie die überraschende Entdeckung, daß Biguanid und Silbersalz enthaltende Zubereitungen verwendet werden können, um die Übertragung von AIDS infolge des Geschlechtsverkehrs zu verhindern.

Vergleichsbeispiel 1

Die Wirkung von AgSD gegen das AIDS-Virus J1 wurde in vitro durch Testen der Infektiosität von HTLV-III-Proben gegen H9-Zellen nach 10-minütiger Exposition an AgSD ermittelt. Aufgrund der mit dem AIDS-Virus lediglich erreichbaren relativ geringen Titers war es notwendig, Hilfsmittel zum Abtrennen der Hauptmenge des AgSD vom zu testenden Virus zu entwickeln. Nach einer Reihe von Vorstudien ergab sich, daß das beste der getesteten Verfahren darin bestand, das AgSD/AIDS-Viren- Gemisch schnell über eine Sephadex G-25M-Säule zu geben, das die AIDS-Viren enthaltende Ausschlußvolumen zu gewinnen und das Virus unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) auszufällen.
Um die unter Verwendung dieses Verfahren erzielte Wiedergewinnung (Ausbeute) zu bestimmen, wurde eine Kontrollpräparation, die den Virus, aber kein AgSD enthielt, gleichermaßen verarbeitet.
Weiterhin war es notwendig, sicherzustellen, daß das Vorgehen die Entfernung des gesamten AgSD bewirkte. Dies wurde unter Verwendung von "Stop-Kontrollen" erreicht. Diese beinhalteten die alleinige Passage von AgSD durch die Säule, das Ausfällen derselben Fraktion mit PEG und anschließendes Hinzufügen von aktiven AIDS-Viren zum Niederschlag. Stimmt der Titer der Stop-Kontrolle mit demjenigen der Kontrollpräparation, die Viren, aber kein AgSD enthielt, überein, zeigt dies die Anwesenheit von wenig oder keinem AgSD im Niederschlag an. Tatsächlich lag jedoch der Titer in den Stop-Kontrollen (Proben 4 und 6) wesentlich unter demjenigen der entsprechenden Testproben ohne Silbersulfadiazin (Proben 1 und 2). Das deutet darauf hin, daß ein Teil des Silbersulfadiazins nicht abgetrennt wurde. Obwohl dies bedeutet, daß die Abtötung des Virus über wesentlich längere Zeit als die 10-minütige Kontaktdauer stattfand, legt es auch nahe, daß die viruzide Wirkung relativ stark ist und auch noch bei verringerten Konzentrationen vorhanden ist.
Die jeweils ausgeführten Tests sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Für jede Probe, der anfänglich der Virus zugesetzt wurde, bestand die Virusprobe aus einer Stammlösung, die aus einem von Bionetics Research erhaltenen 10000-fachen Konzentrat hergestellt worden war. Dieses Material wurde 1:10 mit einem konditionierten Infektionsmedium (CIM = conditioned infection medium) verdünnt, um eine Stammlösung mit einem aktuellen Virustiter von 105,5/ml zu erhalten. Außerdem wurden zwei AgSD-Stammlösungen hergestellt, eine mit 1 Gew.-% in einer 50 gew.-%igen Saccharoselösung und eine mit 0,5 Gew.-% in einer 25 gew.-%igen Saccharosezubereitung.
Zur Ausführung der Tests wurden, wie in Tabelle 1 angegeben, 60 µl-Aliquots der Virus-Stammlösung als Proben 1 - 3 und 6 in Mikrozentrifugenröhrchen eingebracht. Sie wurden mit 540 µl der jeweiligen AgSD-Lösungen in Röhrchen 3 und 5 bzw mit 540 µl CIM in Röhrchen 1 und 2 gemischt. Die Röhrchen 4 und 6 erhielten je 600 µl der angegebenen AgSD-Lösung, jedoch keine Viren. Jedes Röhrchen wurde mit Hilfe eines Vortex-Mixers gemischt und bei Raumtemperatur 10 Minuten stehengelassen.
Um das AgSD von den Viren abzutrennen, wurde jedes AgSD enthaltende Röhrchen anschließend in einer Mikrofuge 1 Minute lang zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Diese Überstände sowie die gesamte Probe aus Röhrchen 2 wurden dann auf eine Sephadex-25M-Säule gegeben. Die verwendeten Säulen wiesen eine Auftragsscheibe am oberen Ende der Säule auf und hatten ein Ausschlußvolumen von ungefähr 1 ml. Derartige Säulen werden üblicherweise in Natriumazid aufbewahrt; sie wurden durch Waschen unter sterilen Bedingungen mit 18 aufeinanderfolgenden 4 ml-Portionen an CIM-Medium am Tag vor dem Experiment vorbereitet.
Jede der Proben wurde solange auf die Säulen aufgetragen, bis sie durch die Auftragsscheibe gelangt war. Die Säule wurde anshließend mit 4 ml CIM-Medium eluiert. Die ersten 3 ml des Eluats wurden verworfen und der letze ml in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen aufgenommen, das 0,35 ml 30%iges PEG 6000 in Phosphatpuffer enthielt. Diese Röhrchen wurden für mindestens 30 Minuten bei 0 ºC gehalten und danach 1 Minute in einer Mikrofuge zentrifugiert. Die Sedimente wurden gesammelt und entweder in 0,5 ml CIM (Proben 2, 3 und 5) oder einem HTLV-III enthaltenden Medium resuspendiert, das durch Verdünnen von 0,7 Teilen der Virus-Stammlösung mit 6,3 Teilen CIM erhalten wurde.
Jede der 6 so erhaltenen Proben wurde vierfach in 10-facher Verdünnung mit CIM im Hinblick auf ihre Fähigkeit getestet, H9-Zellen zu infizieren. Dies geschah durch Zugabe von 50 µl einer 2,4x10&sup6;/ml H9-Zellen enthaltenden Präparation zu je 100 µl Probe oder Verdünnung, wobei die Zellen vorher 1 Stunde lang bei 37 C in CIM konditioniert wurden. Dieser Kultur wurden an den Tagen 4, 7 und 10 25 µl CIM zugesetzt. Am vierten Tag wurde die Zytotoxizität mit Hilfe visueller Untersuchung der Kultur ermittelt.
Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in Tabelle 1 angegeben. Wie deutlich zu sehen ist, verringerte AgSD die Infiktiosität des getesteten AIDS-Virus beträchtlich, ohne daß dabei eine Zytotoxizität beobachtet wurde.

Beispiel 2

Die Wirkung von AgSD, Chlorhexidin und Natriumdesoxycholat, beide allein oder in Kombination, auf die Infektiosität des ARV-2-Stammes des AIDS-Virus wurde an H9- Zellen getestet, wobei geringere Wirkstoffkonzentrationen verwendet wurden, wie sie in der Praxis auf einen Handschuh, ein Kondom oder eine andere Vorrichtung aufgetragen werden können. Diese Konzentrationen lagen, sogar während der Virusinkubation, deutlich unter der Konzentration, die eine beachtliche, sichtbare Zytotoxizität aufwies und töteten die Viren dennoch wirksam ab.
Eine 3 - 5x10&sup4; infektiöse Viruspartikel pro ml enthaltende Stammlösung wurde mit den, wie in Tabelle 2 angegebenen, verschiedenen Wirkstoffen 15 Minuten lang vorinkubiert. Die Virusproben wurden anschließend 4-fach verdünnt, um die Wirkstoffkonzentrationen unter die für die H9-Zellen toxischen Konzentrationen (siehe das folgende Beispiel 3) zu senken, und mit 250000 H9-Zellen in einem Gesamtvolumen von 1 ml gemischt. Nach 24 Stunden wurden die Zellen zur Bestimmung des Prozentsatzes der Kultur untersucht, der das virale Antigen exprimierte. Dieser Zeitraum wurde gewählt, da in ihm nur eine einzige Virusinfektionswelle auftreten kann, so daß die Anzahl der infizierten Zellen die Anzahl der infektiösen Virionen in der ursprünglichen Probe direkt widerspiegelt.
Wie aus Tabelle 2 entnommen werden kann, war AgSD in diesen geringen Konzentrationen nur sehr wenig wirksam, wobei jedoch bessere Ergebnisse erzielt wurden, wenn das AgSD im Kombination mit Natriumdesoxycholat oder Chlorhexidin verwendet wurde. Besonders signifikant ist die deutliche Verringerung der Infektiosität, die für die Kombination von AgSD (5 µg/ml) und Chlorhexidin (5 µg/ml) zu beobachten war, da Chlorhexidin selbst (10 µg/ml) die virale Infektiosität nicht verminderte.

Beispiel 3

Die Toxizität der verschiedenen, in den erfindungsgemäßen antiviralen Zubereitungen verwendeten Mittel gegenüber menschlichen T&sub4;-Lymphozyten (H9-Zellen und Makrophagen, die die Träger des AIDS-Virus darstellen) kann für die Wirksamkeit eines Wirkstoffs von Bedeutung sein. Dies beruht darauf, daß das Abtöten dieser Zellen, wenn sie in Sperma oder Vaginalflüssigkeiten vorliegen, zur Freisetzung des Virus führen kann, wodurch dieses für die Wirkung der Wirkstoffe empfanglicher wird. Im Hinblick auf diese Tatsache wurde die Wirkung kurzer Expositionen (10 Minuten) an AgSD und andere Wirkstoffe auf H9-Zellen durch Behandlung einer Suspension von H9-Zellen (1,6x10&sup6;/ml in HBSS (Hank's balanced salt solution = definiertes Kulturmedium) mit 50 bzw 100 ml/ml jedes Wirkstoffs oder Wirkstoffkombination getestet. Nach 10-minütiger Inkubation wurden die Zellen zweimal in 30 Volumen HBSS gewaschen, in RPMI 10 % FCS - NaPyruvat resuspendiert und bei einer Dichte von 4x10&sup5; Zellen/ml auf 24 Loch-Mikrotiterplatten ausplatiert. Die Zell-Lebensfähigkeit wurde nach 24 Stunden bestimmt und ist in Tabelle 3A als Anzahl der lebenden Zellen pro ml und Lebendprozent (lebende Zellen /(Lebende + tote Zellen)) dargestellt. Ersichtlich tötet jedes der getesteten Mittel einige Zellen ab, wobei jedoch die am stärksten signifikate Abtötung für 100 µg/ml AgSD sowie die Kombination aus AgSD und Natriumdesoxycholat beobachtet wird.
Die Effizienz beim Abtöten der Makrophagen wurde, wie in Tabelle 38 gezeigt, ebenfalls getestet. Bei diesem Experiment wurden peritoneale Makrophagen von normalen Mäusen durch Anheften an Petrischalen angereichert und auf eine Zelldichte von 5 - 10x10&sup6;/ml eingestellt. 0,1 ml-Aliquots dieser Suspension wurden auf Mikrotiterplatten ausgebracht und 10 bzw 5 µl jeder der vier Proben zugefügt. Die Kontrollplatte erhielt nur PBS (phosphate buffered saline = phosphatgepufferte Kochsalzlösung). Nach 20- minütiger Inkubation in einem CO-Inkubator wurden die Zellen unter Verwendung des Farbstoffs Tryphan-Blau auf ihre Lebensfähigkeit getestet. Die prozentuale Abtötung ist in Tabelle 3B dargestellt.

Beispiel 4

Unter Verwendung des Rauscher Leukämie Virus (RLV), einem anerkannten Modell für Retroviren, das von der FDA (Food and Drug Administration) zum Testen von Wirkstoffen zur Verwendung bei der Behandlung von AIDS eingesetzt wird, wurden invivo-Tests durchgeführt (bzgl. RLV siehe z.B. Nature 232, S.467-469 (1986), Ruprecht et al., PNAS USA 82, S.7733-7737 (1985)). RLV wurde in Balb/CICR-Mäuse eingebracht, in denen es die Milz infiziert. Das Ausmaß der Virusinfektiosität wurde durch Bestimmung des Gewichtszuwachses der Mäusemilz 20 Tage nach der Infektion quantifiziert.
Zunächst wurde ein Vorexperiment ausgeführt, um die Wirkung der zu testenden Wirkstoffe auf die Milz zu ermitteln. Neun Gruppen von je fünf Mäusen (6 Wochen alte, weibliche Mäuse) erhielten Injektionen in die Schwanzvene aus 0,25 ml je eines Extraktes eines Handschuhs, der mit einer der folgenden Lösungen behandelt worden war:
1. Silbersulfadiazin (2 %)
2. Natriumdesoxycholat (2 %)
3. Chlorhexidin (2 %)
4. Silbersulfadiazin (1 %) + Natriumdesoxycholat (1 %)
5. Silbersulfadiazin (1 %) + Chlorhexidin (1 %)
6. Fusidinsäure (2 %)
7. Fusidinsäure (1 %) + Chlorhexidin (1 %)
8. in Kochsalz inkubierter Handschuh
9. Kochsalz ohne Handschuh
Jede Behandlung wurde durch Inkubation von 1,5 ml Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 10 Minuten lang bei 37 ºC in einem Finger einer Latexhandschuhs vorbereitet. Nach der Inkubation wurde soviel Material wie möglich aus dem Handschuh entfernt. Anschließend wurden 0,4 ml PBS in den Handschuh gegeben; dabei handelte es sich um die dem Tier injizierte Probe. Tiere, die während der Injektion keinen sauberen Stich erhielten, wurden von der Studie ausgeschlossen. Daher enthielten zwei Gruppen nur vier bewertete Tiere.
Acht Tage nach der Infektion wurde jedes Tier getötet und Milzgewichte für jedes Tier bestimmt. Keine Gewichtszunahme der Milz wurde in keiner Gruppe beobachtet.
Weitere 11 Gruppen mit je 5 Mäusen wurden danach eingesetzt, um die Wirkung dieser selben Verbindungen in bezug auf die Infektiosität von RLV zu untersuchen. Jede Behandlung wurde durch 10-minütige Inkubation von 0,4 ml sterilem PBS, die RVB3 (einem RLV-Stamm) enthielt, in einem Handschuhfinger vorbereitet, wobei in dem Handschuhfinger zuvor je einer der Wirkstoffe bzw PBS wie oben beschrieben inkubiert worden war. Außerdem wurden drei zusätzliche Kontrollen (ein PBS-enthaltender Handschuh ohne Virus, eine nicht im Handschuh inkubierte Virusprobe und eine nicht im Handschuh inkubierte PBS-Probe) mitgeführt. In diesem Experiment wurden die Mäuse 20 Tage nach Injektion getötet und die Milzgewichte wie in Tabelle 4 dargestellt bestimmt. Jedes der getesteten Materialien zeigte eine beträchtliche Reduktion der Virusinfektiosität.

Beispiel 5

Die Kombination von AgSD mit Chlorhexidin und Desoxycholat erwies sich als besonders wirksam gegen verschiedene STD-verursachende Organismen. Wie in den Tabellen 5A und 5B dargestellt, ist Silbersulfadiazin in Kombination mit Chlorhexidin oder Natriumdesoxycholat besonders wirksam gegen Candida albicans. Gleichermaßen töten die Kombinationen Gonokokken (Tabelle 6) und Herpesviren (Tabellen 7A und 7B) ab.

Beispiel 6

Die Wirkung von AgSD in Kombination mit Chlorhexidin oder Natriumdesoxycholat auf die DNA-Synthese durch den Hepatitis-B-Virus wurde untersucht, indem die Geschwindigkeit des Einbaus von radioaktiv markiertem Thymidin gemessen wurde. Als Ergebnis wurde gefunden, daß AgSD in Kombination sowohl mit Chlorhexidin als auch mit Natriumdesoxycholat die RNA-abhängige DNA-Polymerase des Hepatitis-B-Virus inhibiert (Fig. 1). Tabelle 1 Testmischungen und Ergebnisse Bsp. Nr Material Gemisch Stop-Verfahren PEG-Sedim. resuspendiert in (0,5ml) log pro ml log Abtötung Zyto toxizität AgSD in wäßr Sucroselsg Säule Zentr* Stopkontr. * 1 Minute in der Mikrofuge zentrifugieren; Überstand auf die Säule geben ** Gewebskultur beeinträchtigende Dosis&sub5;&sub0; *** vergleichen zu Probe 2 **** SL21 = Stammlösung 21 Tabelle 2 Wirkstoff während der Inkubation (µg/ml) Endkonzentration % Infektion vs Kontrolle Chlorhexidin Natriumdesoxycholat Tabelle 3A lebensfähige Zellen/ml % Lebensfähige nur Zellen Zellen in schlechtem Zustand * AgSD - unlöslich. Um den Wirkstoff zu entfernen, wurden die Zellen bei 200g 15 s zentrifugiert (einschließlich der Beschleunigungs- und Abbremszeit), die Zellen abpipettiert und anschließend zweimal gewaschen. ** lebendige Zellen /(lebendige + tote Zellen) Tabelle 3B Ergebnisse: Abtötungsgeschwindigkeit der Makrophagen durch die Wirkstoffe % Abtötung Kontrolle Tabelle 4 Wirkstoff im Handschuh Konzentration in der Beschichtungslösung Milzgewicht(mg) (Mittelwert von 6 Tieren) Gewichtszuwachs bezogen auf die Kontrolle (mg) Silbersulfadiazin Desoxycholat Chlorhexidin Silbersulfadiazin + Desoxycholat Silbersulfadiazin + Chlorhexidin Fusidinsäure Fusidinsäure + Chlorhexidin Kontrollhandschuh + PBS-Medium nur PBS (kein Handschuh) Kontrollhandschuh + RVB3 nur RVB3 (kein Handschuh) Tabelle 5A Abtötungsgeschwindigkeit von Candida albicans durch Silbersulfadiazin und andere Mittel bei kurzer Exposition Wirkstoff Konzentration Koloniezahl in der Kultur (10 min Inkubation) Silbersulfadiazin Chlorhexidin Desoxycholat AgSD+Chlorhexidin AgSD+Desoxycholat Nonoxinol Kontrolle
Mit den obigen Wirkstoffen wurden 3 ml Saboraud-Brühe, die 10&sup5; Organismen der Spezies Candida albicans enthielt, inkubiert. Nach 5 bzw 10 Minuten wurden Aliquots entnommen und subkultiviert.

Tabelle 5B

Antibakterielle Wirkung der mit Wirkstoff beschichteten Handschuhe gegen Candida albicans

Die behandelten Handschuhfinger wurden über das obere Ende von Kulturgefäßen gestülpt, wobei sich die behandelte Seite an der Innenseite der Rundung befand. Anschließend wurden je 3,0 ml TSB, die 10³ Candida albicans-Organismen enthielten, in die Finger gegeben und alle in ein Wasserschüttelbad bei 37 ºC gestellt. Nach 15 Minuten sowie 1, 2 und 4 Stunden wurden Proben entnommen. Sie wurden 1:10 verdünnt und in einer Menge von 2,0 ml auf Blutagar ausplatiert. Wirkstoff im Handschuh Min Std Keiner Chlorhexidin Silbersulfadiazin Silbersulfadiazin + Chlorhexidin Silbersulfadiazin + Desoxycholat Silbersulfadiazin + Chlorhexidin + Nonoxinol Tabelle 6 Abtötung von Gonokokken durch Silbersulfadiazin und andere Mittel Wirkstoff Konzentration (µg/ml) Koloniezahl Kultur nach 5 min Koloniezahl Kultur nach 10 min AgSD Desoxycholat Chlorhexidin Nonoxinol AgSD+Chlorhexidin AgSD+Desoxycholat Kontrolle
Die Wirkstoffe wurden in 5 ml Kulturen suspendiert, die 105 Gonokokkenorganismen enthielten, und inkubiert. Nach Intervallen von 5 und 10 Minuten wurden Aliquots entnommen und zur Koloniezählung subkultiviert.

Tabelle 7A

Toxizität der Wirkstoffe für HSV

1 ml HSV mit einer Zelldichte von 3x10&sup6;/ml wurde mit 200 µl einer Wirkstoffstammlösung von 500 µg/ml inkubiert. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Viren auf Verozellen-Einzellschichten ausgebracht, 2 Stunden inkubiert und anschließend mit Methylcellulose bedeckt. Nach 48 Stunden wurden die Virustiter abgelesen. In den Reihen, in denen der Titer abgelesen wurde, war keine Toxiziträt* des Wirkstoffs zu sehen. zu 1 ml Virus zugefügte µl Titer (x10&sup5;) % Inhibition Chlorhexidin Benzalkoniumchlorid Wasser Medium * Die Wirkstoffkonzentration in der ersten Reihe betrug 4 - 8 µg/ml

Tabelle 7B

Wirkung der mit Wirkstoff behandelten Handschuhe auf HSV-I

HSV-I wurde in DME 10% FCS auf 3x10&sup6; PFU/ml verdünnt. 1 ml Virus wurde in einen sterilen, mit Wirkstoff behandelten Handschuh gegeben, 10 Minuten bei Raumtemperatur ihkubiert und anschließend gegen Verozellen der Titer bestimmt. Behandlung Titer Virus (kein Handschuh) Virus + Kontrollröhrchen Virus + Röhrchen w = Silbersulfadiazin x = Silbersulfadiazin + Desoxycholat y = Silbersulfadiazin + Chlorhexidin

Claims

1. Topische Zubereitung zur Verhinderung der Übertragung von sexuell übertragenen Krankheiten einschließlich AIDS und Hepatitis, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung eine antiviral wirksame Menge eines Biguanids und ein Silbersalz in einer Menge enthält, mit der das Biguanid eine synergistische antivirale Wirkung zeigt.

2. Topische Zubereitung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Biguanid Chlorhexidin oder ein Salz desselben ist.

3. Topische Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Silbersalz aus Silbersulfadiazin, -acetat, -benzoat, -carbonat, -chlorid, -jodat, -jodid, -lactat, -laurat, -nitrat, -oxid und -palmitat sowie Silbersalzen von Proteinen ausgewählt ist.

4. Topische Zubereitung gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Silbersalz Silbersulfadiazin ist.

5. Topische Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein Detergenz enthält.

6. Topische Zubereitung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Detergenz Natriumdesoxycholat ist.

7. Topische Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung eine Dispersion in einem in Wasser dispergierbaren hydrophilen Trägerstoff ist.

8. Topische Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung eine Dispersion in einem in Wasser dispergierbaren hydrophilen Trägerstoff ist.

9. Topische Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung eine Dispersion in einer halbfesten oder cremeartigen, in Wasser dispergierbaren oder wasserlöslichen Öl-in-Wasser-Emulsion ist.

10. Topische Zubereitung gemaß einem der Ansprüche 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung eine Dispersion in einer wäßrigen Saccharoselösung ist.

11. Topische Zubereitung gemaß einem der Ansprüche 3 - 10,dadurch gekennzeichnet, daß sie 0,1 bis 10 Gew.-% Silbersalz enthält.

12. Vorrichtung zum Einführen in eine Sexualöffnung, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 - 11 beschichtet ist.

13. Vorrichtung zum Einführen in eine Sexualöffnung, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 - 11 imprägniert ist.

14. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 12 - 13, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Vorrichtung um ein Kondom handelt.