DE69929616T2

DE69929616T2 - Oxyhuminsäure und ihre verwendung zur behandlung von verschiedenenen störungen

Info

Publication number: DE69929616T2
Application number: DE69929616T
Authority: DE
Inventors: Johannes Dekker; Constance Elizabeth Medlen
Original assignee: Pfeinsmith Ltd
Current assignee: Pfeinsmith Ltd
Priority date: 1998-09-23
Filing date: 1999-09-22
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2019-09-23
Also published as: WO2000016785A2; WO2000016785A3; AU5643299A; DE69929616D1; AU5643499A; ATE316379T1; AU772123B2; EP1115408A2; WO2000016786A2; EP1115408B1; US6630179B1; WO2000016786A3

Description

Diese Erfindung betrifft eine bestimmte Oxihuminsäure und deren Verwendung bei der Behandlung verschiedener Zustände.
Huminsäuren werden während der Zersetzung von organischer Materie gebildet und lassen sich folglich in praktisch jeder natürlichen Umgebung nachweisen, in der organische Materialien und Mikroorganismen gegenwärtig sind oder waren (Visser, 1973). Huminsäuren werden in der Medizin in einer Dosierung von zwischen 0,9 und 1,8 g täglich zur Behandlung von Hyperazidität und anderen Magenstörungen bei Menschen verwendet (Gramsch, 1961; Reichert, 1966). Bei den vorstehend genannten Dosen wurden keine ungünstigen Nebenwirkungen beobachtet.
Huminsäuren werden aufgrund ihrer lokalen antiphlogistischen, hyperämischen und analgetischen Eigenschaften auch erfolgreich als antiphlogistische Mittel (Salz, 1974; Motohisa et al., 1974) und als eine systemische Behandlung für Anämie und Hypercholesterinämie (Soloveyva und Lotosh, 1984) verwendet.
Torfextrakte werden seit vielen Jahren in therapeutischen Bädern zur Behandlung verschiedener Zustände verwendet (Brandt, 1964; Eichelsdörfer, 1976). Die antiseptischen Eigenschaften von Torf wurden erstmals während des 1. Weltkriegs erkannt, als dieser direkt auf Kriegswunden aufgetragen wurde, um Infektionen zu verhindern (Haanel, 1924). Die mögliche Anwendung von kohlestämmiger Huminsäure und Fulvinsäure als antimikrobielle Mittel wurde vor kurzem von Cloete et al. (1990) vom Institut für Mikrobiologie, Universität Pretoria, untersucht.
Etwas später wurde Humat bei der Behandlung des von Willebrand-Jürgens-Syndroms verwendet (Lopez-Fernandez et al., 1992). Patienten wurden mit einer Infusion von 35 mg/kg Körpergewicht behandelt, wonach sich normale VIII-Spiegel einstellten.
Es wurde berichtet, dass Huminsäuren, die entweder aus der Zersetzung von organischer Materie (Sato et al., 1986) oder der Oxidation von Kohle (Bernacchi et al., 1996) abstammen, nicht als Mutagene wirken, sondern sich stattdessen interessanterweise eher als Antimutagene verhalten (Takahiko et al., 1986), indem sie die Mutagenität ausgewählter Mutagene hemmen.
Die tumorhemmenden Eigenschaften von Huminsäuren wurden in vivo erstmals von Zsindely et al. (1971) untersucht, die berichteten, dass Mäuse, die 5 Tage lang oral 10–40 mg Huminsäuren erhalten hatten, nach experimenteller Einführung von Krebs durch Gabe von Aszites-Sarkom oder -Lymphom (IP) nach 10 Tagen eine erheblich geringere Tumorbelastung zeigten. Sie stellten ebenfalls fest, dass die Huminsäurebehandlung zu einem 20–25%igen Rückgang des RNS- und DNS-Gehalts in Tumorzellen führte. Es hat sich auch gezeigt, dass Huminsäuren Gebärmutterkrebs bei Ratten entgegenwirkt (Davies, 1996).
Da diese Säuren eine hohe Grenzflächenaktivität aufweisen (Visser, 1982), können sie auf die Membranen von malignen Zellen einwirken, deren Struktur und Funktion sich häufig von der normaler Zellen unterscheidet (Bennet & Connon, 1957). Adamek (1976) berichtete, dass eine oral, rektal oder intramuskulär an den Orten des Tumors verabreichte Torfzubereitung deren Stillstand oder Rückbildung verursachte.
Von Thiel et al. (1981) wurden bei einer Konzentration von 100 μg/ml Ammoniumhumat in vitro antivirale Eigenschaften beschrieben, was zur erfolgreichen Verwendung dieses Mittels als topische Behandlung für Hautkrankheiten führte, die durch das Herpes-Virus verursacht wurden (Klocking et al., 1983). Schneider et al. (1996) berichteten über die Anti-HIV-Aktivität von synthetischen Humatanalogen, die von Hydrochinon abstammen. Diese Verbindungen hemmten eine HIV-1-Infektion von MT-2-Zellen mit einem beeindruckend niedrigen IC₅₀ von 50–300 ng/ml. Die Ansteckungsfähigkeit von HIV-Teilchen wurde durch eine Störung der CD4-induzierten proteolytischen Spaltung der V3-Schleife des Virion gp120SU gehemmt.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird die Verwendung von Oxihuminsäure, die kohlestämmig ist und durch ein Nassoxidationsverfahren gewonnen wird, oder einem Salz, Ester oder Derivat davon mit folgender Analyse der funktionellen Gruppen:
Säuregruppen, insgesamt: 3–13 meq/g;
Carboxylgruppen: 0,5–12 meq/g und
Phenolgruppen: 0,5–9 meq/g;
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung als Immunstimulans bereitgestellt.
Üblicherweise wird das Arzneimittel bei der Behandlung einer Krankheit verwendet, die mit einer Virusinfektion, und ganz besonders einer HIV-Infektion, assoziiert ist.
Das Arzneimittel wird auch üblicherweise zum Hemmen von Krebswachstum bei einem Patienten verwendet.
Üblicherweise wird das Arzneimittel oral verabreicht. Es hat sich herausgestellt, dass die Oxihuminsäure, ein Salz, Ester oder Derivat davon bei oraler Verabreichung schnell vom Patienten aufgenommen wird.
Der Patient kann ein Mensch, ein Tier oder ein Vogel sein.
Die erfindungsgemäß verwendete Oxihuminsäure kann mittels des Nassoxidationsverfahrens hergestellt werden, das in US-Patent 4,912,256 beschrieben ist. Das Kalium- oder Natriumsalz der Oxihuminsäure kann mittels des Verfahrens hergestellt werden, das in US-Patent 5,004,831 beschrieben ist. Oxihuminsäure weist keine bestimmte Struktur auf. Sie ist eine komplexe Mischung aus organischen Verbindungen. Sie ist aufgrund ihrer Carboxyl- und Phenolgruppen inhärent sauer. Oxihuminsäure ist bei einem niedrigen pH-Wert in Wasser praktisch unlöslich, wird aber in einem alkalischen wässrigen Medium löslich.
Oxihuminsäure kann somit als ein relativ hochmolekulares Produkt mit Carboxyl- und Phenolgruppen betrachtet werden. Oxihuminsäure hat im Vergleich mit so genannten natürlichen Huminsäuren einen relativ hohen Aromatizitätsgrad. Nachstehend ist eine bevorzugte Analyse der funktionellen Gruppen der Oxihuminsäure angeführt:
Säuregruppen, insgesamt: 5,4 meq/g
Carboxylgruppen: 2,2 meq/g
Phenolgruppen: 3,2 meq/g
Die Oxihuminsäure, ein Salz, Ester oder Derivat davon werden vorzugsweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt, die für die orale Verabreichung geeignet ist. Eine besonders geeignete Form ist eine Kapsel. Der Wirkstoff kann mit oder ohne Hilfsstoffe in der Kapsel vorliegen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 bis 29 veranschaulichen grafisch die Ergebnisse bestimmter Versuche, die mit Kaliumoxihumat und Huminsäure durchgeführt wurden.
BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Kaliumoxihumat mit der vorstehend genannten bevorzugten Analyse der funktionellen Gruppen und nachstehend als "Oxihumat" bezeichnet, wurde einer Reihe von In-vitro- und In-vivo-Studien unterworfen und diese sind nachstehend beschrieben.
i) Wirkungen von Oxihumat auf die proliferativen Reaktionen von humanen Lymphozyten, die mit Phytohämagglutinin (PHA) stimuliert wurden.
Bei diesen Versuchen wurden Suspensionen gereinigter humaner monozytenabgereicherter Lymphozyten mit einer Konzentration von 1 × 10⁶ Lymphozyten/ml in RPMI-Nährlösung angereichert mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) in die Wells von Mikrotiterplatten gegeben. Zu einigen der Wells wurde ein Mitogen (Phytohämagglutinin, PHA) in einer Konzentration von 2,5 μg/ml gegeben. Die Kulturen wurden entweder mit oder ohne Oxihumat (5–100 μg/ml) 72 h lang bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ inkubiert. Das Ausmaß der Lymphozytenproliferation wurde mittels MTT-Reaktivität [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] untersucht, womit nur lebensfähige Zellen erfasst werden.
Oxihumat zeigte keine Wirkung bei Lymphozyten im Ruhezustand, erhöhte jedoch die proliferative Reaktion von mit PHA stimulierten Lymphozyten auf eine dosisabhängige Weise (1).
Ähnliche Ergebnisse wurden mit einer synthetischen Huminsäure (Sigma Chemicals Co., St. Louis, Mo) erzielt. Oxihumat war bei 80 und 100 μg/ml durchschnittlich wirksamer als die synthetische Huminsäure (2).
ii) Wirkungen von Oxihumat auf die Expression der Aktivierungsmarker CD25 und CD38 auf humanen Lymphozyten.
Im Ruhezustand befindliche oder mit PHA stimulierte humane Lymphozyten wurden 72 h lang in Reagenzgläsern in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI-Nährlösung angereichert mit 10 % FCS in entweder der Gegenwart oder der Abwesenheit von Oxihumat (100 μg/ml) inkubiert und die Expression des IL-2-Rezeptors (CD25) und von CD38 (einem Molekül, das an der Signaltransduktion und der Zelladhäsion beteiligt ist) wurde unter Verwendung eines Durchflusszytometers (Coulter Epics XL-MCL) analysiert. Es wurde beobachtet, dass Oxihumat keine Wirkung auf die Expression von entweder CD25 oder CD38 bei Lymphozyten im Ruhezustand zeigte (Ergebnisse nicht dargestellt), jedoch die Expression von CD25 bei mit PHA stimulierten Zellen wesentlich erhöhte, während die Expression von CD38 bei diesen Zellen durch die Oxihumat-Behandlung zurückging (3).
iii) Die Produktion von Interleukin 2 (IL-2), Interleukin 4 (IL-4) und Interleukin 6 (IL-6) durch humane Lymphozyten.
Kulturen von mit PHA stimulierten humanen Lymphozyten wurden wie vorstehend 48 h lang mit Oxihumat, 60, 80 und 100 μg/ml, behandelt, wonach die Zellen zentrifugiert wurden und der zellfreie Überstand mit einem Human-ELISA-System Biotrak TM von Amersham TM (Amersham International Plc, Buckinghamshire, Großbritannien) auf den Gehalt an IL-2, IL-4 oder IL-6 untersucht wurde. Die anhand von 4 verschiedenen Versuchen erhaltenen Ergebnisse gehen aus 4 bis 6 hervor. Oxihumat verursachte bei allen drei geprüften Konzentrationen eine statistisch signifikante Steigerung der IL-2- und IL-4-Produktion durch stimulierte Lymphozyten (4 und 5). Eine geringe, aber nicht signifikante Steigerung der IL-6-Produktion durch Oxihumat wurde ebenfalls beobachtet (6).
iv) Gesteigerte Produktion von Antikörpern gegen die Newcastle-Krankheit bei mit Oxihumat behandelten Hühnern
Bei einem Versuch zur Bestimmung der Wirksamkeit von Oxihumat zur Bekämpfung einer Infektion mit Mycoplasma gallisepticum bei Ross-308-Hähnchen wurden 2550 Tage alte Hähnchen auf 5 Gruppen verteilt, mit dem Organismus infiziert und wie folgt behandelt:
Behandlung 1: Kontrolle, nicht behandelt
Behandlung 2–4: 50, 100 oder 200 mg Oxihumat/kg/Tag
Behandlung 5: Baytril, 10 mg/kg/Tag, 3 Tage lang in der ersten Lebenswoche, anschließend eintägige Behandlung am 21. Lebenstag
Alle Hühner wurden am 16. Lebenstag gegen die Newcastle-Krankheit und infektiöse Bursitis geimpft, um die Wirkung festzustellen, die Oxihumat auf die Produktion von Antikörpern gegen diese Krankheiten bei Geflügel hat.
Am 28. Tag wurden Blutproben von 15 Vögeln pro Behandlung und am 42. Tag von 45 Vögeln pro Behandlung genommen, um die Titer für Antikörper gegen die Newcastle-Krankheit und infektiöse Bursitis unter Verwendung des ELISA-Versuchssystems zu bestimmen. Bei den Titern für Antikörper gegen die infektiöse Bursitis wurden keine Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen und der Kontrollgruppe festgestellt (Ergebnisse nicht dargestellt).
Sowohl die Gruppe mit Baytril-Behandlung als auch die Gruppe, die mit 100 mg Oxihumat/kg/Tag behandelt wurde, zeigten jedoch am 28. und am 42. Tag einen 2- bis 4-fachen Anstieg der Titer gegen die Newcastle-Krankheit (7), was ein Anzeichen für die Fähigkeit dieser beiden Verbindungen ist, die humorale Immunreaktion zu stimulieren.
Ergebnisse bezüglich der Gegenwart von M. gallisepticum in den Behandlungsgruppen und der Kontrollgruppe stehen noch nicht zur Verfügung.
Ein Anstieg von IL-2, das für eine zellvermittelte (T_H1-Typ) Immunität erforderlich ist, sowie ein Anstieg von IL-4 und IL-6, die für eine humorale (T_H2-Typ) Immunität erforderlich sind, zeigen an, dass diese Verbindung ein wirksames Immunostimulans sein kann, das sich als geeignet für die Anwendung bei Patienten erweisen kann, die an Virus- oder Bakterieninfektionen leiden.
v) Produktion von Interleukin 10 (IL-10) durch mit Oxihumat behandelte Lymphozyten
Kulturen von mit PHA stimulierten humanen Lymphozyten wurden 48 h lang mit Oxihumat, 60, 80 und 100 μg/ml, behandelt, wonach die Zellen zentrifugiert wurden und der zellfreie Überstand mit einem hoch empfindlichen IL-10-ELISA-System Biotrak von Amersham TM (Amersham International Plc, Buckinghamshire, Großbritannien) auf IL-10-Gehalt untersucht wurde.
Die anhand von 3 verschiedenen Versuchen erhaltenen Ergebnisse gehen aus 8 hervor. Oxihumat hemmte die IL-10-Produktion durch mit PHA stimulierte Lymphozyten bei allen drei geprüften Konzentrationen.
Die Ergebnisse bestätigen die IL-2-Ergebnisse, ein Anzeichen für eine Erhöhung der T_H1-Zellaktivität.
vi) Produktion von Leukotrien B4 (LTB4) durch mit Oxihumat behandelte Lymphozyten
Mit Phorbol-l2-myristat-l3-acetat (PMA, 100 ng/ml) stimulierte humane Lymphozytenkulturen (1 × 10⁶ Lymphozyten/ml in RPMI-Nährlösung angereichert mit 10 % FCS) wurden 20 min lang bei 37 °C mit Oxihumat, 60, 80 und 100 μg/ml, behandelt. Die Kulturen wurden zentrifugiert und die Überstände unter Verwendung eines LTB4-Enzym-Immunassaysystems Biotrak von Amersham International Plc, Buckinghamshire, Großbritannien, auf LTB4-Gehalt untersucht.
Die anhand von 4 verschiedenen Versuchen erhaltenen Ergebnisse gehen aus 9 hervor. Oxihumat steigerte bei allen 3 geprüften Konzentrationen die LTB4-Produktion durch mit PMA stimulierte humane Lymphozyten um mehr als 300 % verglichen mit den nicht behandelten Kontrollen (9B).
Die Rolle von Leukotrienen bei der Immunreaktion ist unklar. Verschiedene Wissenschaftler haben berichtet, dass LTB4 als ein multifunktioneller Regulator der Zytokinproduktion wirksam sein kann und dass es im Stande ist, sowohl T_H1- als auch T_H2-Subpopulationen zu stimulieren. LTB4 spielt nicht nur bei der Auslösung der IL-2-Produktion eine wichtige Rolle, sondern erhöht auch die Aktivität zytotoxischer T-Zellen und dies könnte möglicherweise die Steigerung der IL-2-Produktion sowie den Anstieg der Zytotoxizität von mit Oxihumat behandelten Lymphozytenkulturen erklären.
vii) Produktion von Prostaglandin E2 (PGE2) durch mit Oxihumat behandelte Lymphozyten
Mit Phorbol-l2-myristat-l3-acetat (PMA, 100 ng/ml) stimulierte humane Lymphozytenkulturen (1 × 10⁶ Lymphozyten/ml in RPMI Nährlösung angereichert mit 10 % FCS) wurden 20 min lang bei 37 °C mit Oxihumat, 60, 80 und 100 μg/ml, behandelt. Die Kulturen wurden zentrifugiert und die Überstände unter Verwendung eines PGE2-Enzym-Immunassaysystems Biotrak von Amersham International Plc, Buckinghamshire, Großbritannien, auf PGE2-Gehalt untersucht.
Die anhand von 8 verschiedenen Versuchen erhaltenen Ergebnisse gehen aus 10 hervor. Oxihumat steigerte bei allen 3 geprüften Konzentrationen die PGE2-Produktion durch mit PMA stimulierte humane Lymphozyten um zwischen 20 und 30 % verglichen mit den nicht behandelten Kontrollen (10B).
PGE2 ist für seine Fähigkeit bekannt, Schmerzen und Fieber auszulösen. Es hemmt die T-Zellen-Proliferation durch eine Downregulation der mit T_H1 assoziierten Zytokinproduktion (IFN-λ, TNF-β und IL-2). Die durch Oxihumat (bis zu 100 μg/ml) vermittelte Hemmung der PGE2-Produktion war zwar nicht größer als 30 % der Kontrollwerte, ein geringerer Gehalt kann jedoch zu einem Anstieg von Lymphozytenproliferation und mit T_H1 assoziierten Zytokinen führen.
viii) Produktion von Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) durch mit Oxihumat behandelte Lymphozyten
Mit PHA stimulierte humane Lymphozyten wurden 24 h lang bei 37 °C mit Oxihumat, 10, 20, 40, 60, 80 und 100 μg/ml behandelt und die Überstände unter Verwendung eines TNF-α-Enzym-Immunassaysystems Biotrak von Amersham International Plc, Buckinghamshire, Großbritannien, auf TNG-Gehalt untersucht.
Oxihumat senkte bei Konzentrationen von 10, 20 und 40 μg/ml die Produktion von TNF durch mit PHA stimulierte humane Lymphozyten signifikant verglichen mit den nicht behandelten Kontrollen (11).
TNF spielt bei Entzündungen eine wichtige Rolle und wirkt auf Endothel, Leukozyten und Fibroblasten, insbesondere bei der Auslösung der systemischen Reaktionen der akuten Phase, die mit Infektion oder Trauma verbunden sind. Er induziert die Synthese von endothelen Adhäsionsmolekülen, anderen Zytokinen, Wachstumsfaktoren und Stickstoff(II)-oxid. TNF verursacht auch Aggregation und die Aktivierung von Neutrophilen, was zu einer erhöhten Reaktion dieser Zellen auf andere Mediatoren und die Freisetzung von proteolytischen Enzymen aus Mesenchemalzellen führt, was zur Gewebeschädigung beiträgt. Eine geringere Produktion von TNF würde folglich zu einer günstigen Reaktion sowohl bei akuten als auch bei chronischen Entzündungszuständen führen.
ix) Zytotoxische Aktivität von mit Oxihumat behandelten humanen Lymphozyten
PLC-Zellen (eine humane Leberkrebszelllinie) (5 × 10⁵/ml) wurden 72 h lang in RPMI-Nährlösung angereichert mit 10 FCS in 96-Well-Mikrotiterplatten mit Rundboden in entweder der Gegenwart oder der Abwesenheit von humanen Lymphozyten (Verhältnis 1:2 von Zielzellen:Lymphozyten) gezüchtet. Diese Kulturen wurden 72 h lang mit Oxihumat (5–100 μg/ml) behandelt, wonach die Lymphozyten durch Waschen entfernt wurden und die Mitochondrienaktivität der adhärenten PLC-Zellen unter Verwendung eines üblichen MTT-Assays bestimmt wurde.
Oxihumat hemmte die Vermehrung der PLC-Zellen bei Konzentrationen von 10 μg/ml und höher (12). Die Zugabe von humanen Lymphozyten zu dem System erhöhte das Ausmaß der Hemmung signifikant (13).
xi) Antivirale Aktivität von Oxihumat bei Herpes-simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) und Coxsackie-Virus Typ 1 (CBV-1) in vitro
Zur Untersuchung der Wirkung von Oxihumat auf die Replikation jedes Virus wurden 42 h alte Einzelschichten von Nierenzellen der Grünen Meerkatze (VK) mit entweder HSV-1 oder CBV-1 infiziert. Nach einer Stunde wurde nicht gebundenes Virus entfernt und die Zellen wurden 7 Tage lang bei 37 °C in einer CO₂-Feuchtatmosphäre mit verschiedenen Konzentrationen von Oxihumat in serumfreiem MEM (Minimum Eagle's Medium) behandelt.
Zur Untersuchung der Wirkung von Oxihumat auf die virale Absorption in Zellen wurden Oxihumat und die Virussuspension gleichzeitig zu den Zellkulturen gegeben und 7 Tage lang bei 37 °C in einer CO₂-Feuchtatmosphäre inkubiert.
Zur Untersuchung der Wirkung von Oxihumat auf die Ansteckungsfähigkeit von Virusteilchen wurden gleiche Volumen Virussuspensionen mit Oxihumat-Verdünnungen gemischt und eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Oxihumat/Virussuspension wurde zu einer 24 h alten Kultur gegeben und 7 Tage lang bei 37 °C in einer CO₂-Feuchtatmosphäre inkubiert. Das Auftreten einer zytopathischen Wirkung (CPE) galt als Anzeichen für eine fehlende Hemmung der Virusreplikation. Die angegebene prozentuale CPE ist der Durchschnittswert der prozentualen CPE, die in jedem der 6 Versuchswells festgestellt wurde.
Bei allen drei Verfahren wurden Zellen 7 Tage lang täglich mittels Lichtmikroskopie untersucht.
Oxihumat (3,9–1000 μg/ml) hatte keine Wirkung auf die Adsorption und/oder Replikation von CBV-1 (Ergebnisse nicht dargestellt). Im Gegensatz dazu wurde bei Konzentrationen von 62,5 bis 250 μg/ml eine deutliche antivirale Aktivität gegenüber HSV-1 festgestellt (13 und 14). Da das Virus empfindlicher war, wenn es gleichzeitig mit den Verbindungen zu den Zellen gegeben wurde (14), lassen die Daten folglich darauf schließen, dass Oxihumat die Adsorption an und die anschließende Replikation von HSV-1 in einer Zellkultur stört.
Bei der Beurteilung der Ansteckungsfähigkeit von sowohl CBV-1 als auch HSV-1 nach 1-stündigem Kontakt mit den verschiedenen Konzentrationen Oxihumat bei 37 °C wurde eine vollständige Hemmung der Ansteckungsfähigkeit von HSV-1 sowie CBV-1 bei Konzentrationen von 62,5–500 μg/ml bzw. 125–500 μg/ml festgestellt. (Tabelle 1). TABELLE 1 Dosisreaktion von Coxsackie-B-Virus Typ 1 bei Nierenzellen der Grünen Meerkatze nach 1-stündigem Kontakt mit Oxihumat bei 37 °C

^a Die angegebene prozentuale CPE ist der Durchschnittswert der prozentualen CPE, die in jedem der 4 Versuchswells festgestellt wurde.

xi) Antivirale Aktivität von Oxihumat gegenüber HIV-1 in vitro
Zur Untersuchung der Wirkung von Oxihumat auf die Replikation eines Laborstamms von HIV-1 III_B wurde vor der Zugabe von MT-2-Zellen (einer CD4-positiven humanen Lymphozytenzelllinie) eine Suspension des Virus (HIV-1) 15 min lang bei Raumtemperatur zu Oxihumat-Konzentrationen zwischen 0,35 und 200 μg/ml gegeben. Die Zellkulturen wurden 5 Tage lang bei 37 °C in einer CO₂-Feuchtatmosphäre inkubiert, wonach die Synzytiumbildung mittels Lichtmikroskopie bestimmt wurde. Die Ergebnisse von drei Versuchen in Dreifachausführung gehen aus 15 hervor. Bei einer Oxihumat-Konzentration von 16 μg/ml wurde eine 50%ige Hemmung der Virusvermehrung beobachtet.
Diese Ergebnisse wurden von einer anderen Forschergruppe bestätigt, die dasselbe (Laborstamm von HIV-1 III_B) und ein anderes (HIV-1 D) Isolat von HIV-1 verwendete (16 und 17). In diesen Fällen wurde die Aktivität von Oxihumat mit der von AZT verglichen. 25 μg/ml Oxihumat senkte in beiden Fällen die Vermehrung der Viren auf dasselbe Niveau wie 0,3 μM und 12,5 μM AZT.
Die Hemmung von HIV-1 in Zellkulturen durch ein synthetisches Humatanalog wurde zwar bereits von Schneider et al. 1996, beschrieben, die vorliegenden Ergebnisse sind jedoch der erste Nachweise der Anti-HIV-1-Aktivität von Oxihumat.
xii) Klinischer Phase-I-Versuch mit oralem Oxihumat bei HIV-infizierten Patienten
HIV-infizierte Patienten wurden zwei Wochen lang mit entweder 2 g, 4 g oder 6 g Oxihumat pro Tag behandelt.
Neun Patienten jeder Gruppe wurden auf eine doppeltblinde Weise in 2 Arme randomisiert: ein Arm, in dem 7 Patienten Oxihumat in einer Dosis von entweder 2 g, 4 g oder 6 g pro Tag erhielten und ein anderer Arm mit 2 Patienten, die ein Placebo erhielten. Die Patienten wurden 2 Wochen lang behandelt und zwei Wochen nach der Beendigung der Behandlung einer Nachuntersuchung unterzogen.
Klinische Beurteilung:
Keiner der Patienten zeigte vorangegangene AIDS definierende Ereignisse und im Laufe der Studie trat kein derartiges Ereignis auf. Alle Patienten litten an vorangegangenen HIV-Infektionen, zwei Wochen Behandlung war jedoch ein zu kurzer Zeitraum, um zu aussagekräftigen Schlussfolgerungen zu kommen.
Das Gewicht der Patienten, die die drei Dosen Oxihumat erhielten, erhöhte sich im Vergleich zur Placebo-Kontrolle im Laufe des Studienzeitraums signifikant (18).
Die meisten der mit Oxihumat behandelten Patienten berichteten von einer signifikanten Verbesserung ihrer Energie.
Die Patienten erlebten während der Behandlung keine Nebenwirkungen im Magen-Darm-Trakt, wie Übelkeit oder Erbrechen. Die meisten Patienten berichteten von gesteigertem Appetit.
Toxizität
Es wurden keine Veränderungen bei Elektrolyten (19) oder Glucose (20) beobachtet. Es wurde keine Toxizität hinsichtlich Leber- (21) und Nierenfunktion (22) beobachtet. Hämoglobin-Spiegel (23) und Thrombozytenzahl (24) blieben stabil. Die absolute Neutrophilenzahl (25) erhöhte sich in einigen Fällen (2 g/Tag), ohne dass ein Anzeichen einer Infektion als Ursache festgestellt wurde, der Anstieg war jedoch nicht signifikant.
Virusbelastung und CD₄-Zahl
Es wurden keine signifikanten Veränderungen der Virusbelastung (26), der absoluten Lymphozytenzahl (27) und der CD₄-Zahl (28) festgestellt.
Schlussfolgerung
Bei einer Dosierung von 2 g, 4 g und 6 g Oxihumat pro Tag über einen Zeitraum von zwei Wochen wurde keine offensichtliche Toxizität festgestellt, während auch keine signifikanten Veränderungen bei einem der Marker, die die Funktion des Immunsystems widerspiegeln, festgestellt wurden.
Wirkungen einer 2-wöchigen Behandlung von HIV-positiven Patienten mit Oxihumat (4 g und 6 g pro Tag) auf die proliferative Reaktion von humanen Lymphozyten, die durch Phytohämagglutinin (PHA) (5 mg/ml) stimuliert wurden.
Die In-vivo-Behandlung mit Oxihumat erhöhte die proliferative Reaktion in vitro (29).
xiv) Pharmakokinetik:
Die Pharmakokinetik von ¹²³I-Oxihumat beim Pavian wurde von Prof I Dormehl am Atomic Energy Corporation Institute for Life Sciences untersucht (Tabelle 2). Acht Paviane fasteten 24 Stunden lang. Vier erhielten eine Mischung aus kaltem und mit ¹²³I markiertem Oxihumat (55 mg/kg) über eine Magensonde direkt in den Magen und vier erhielten die Substanz endoskopisch direkt in das Duodenum. Es wurden regelmäßig Szintigramme erstellt und Urin- und Blutproben genommen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen gehen aus Tabelle 2 hervor.
Innerhalb von 30 min wurde eine schnelle systemische Aufnahme von Oxihumat beobachtet, die im Duodenum schneller als im Magen erfolgte. Die markierte Substanz erschien nach 30 min im Blutspeicher des Herzens und nach 23 Stunden betrug die maximale Restaktivität 11, 7 %. Die Zielorgane der ¹²³I-Oxihumat-Ansammlung waren der Magen-Darm-Trakt, die Leber, die Nieren, die Schleimhäute und Lymphozyten und die Ausscheidung erfolgte über Darm und Nieren. Während der Studie wurden keine Nebenwirkungen beobachtetet. TABELLE 2 Die Pharmakokinetik von Oxihuminsäure, die mit ¹²³I markiert ist, gemessen als prozentualer Anteil der injizierten Restdosis in jedem Kompartiment

% Abgang über Urin (der injizierten Dosis)
1–4 h: 5,71 + 0.62
1–5 h: 12,8 h + 3,7
18–23 h: 21,43
23–28 h: 9,9 + 2,4 %

xv) Toxizitätsstudien bei Tieren
Die Toxizität von Oxihumat wurde umfassend mit Versuchstieren geprüft (Tabelle 3). Einzelheiten zu den Prüfungen und den Ergebnissen sind nachstehend angeführt. Außerdem zeigte Oxihumat keine messbare Toxizität während sowohl der akuten als auch der subchronischen oralen und dermalen Exposition.
TABELLE 3 Toxizitätsstudien mit Oxihumat
DISKUSSION DER ERGEBNISSE
Studie 1503: Akute orale Toxizität bei Ratten.
Es wird vermutet, dass der orale LD₅₀-Wert größer als 3456 mg/kg ist. Damit kann der Wirkstoff als für den Menschen praktisch nicht giftig eingestuft werden.
Studie 1504: Akute dermale Toxizität bei Ratten.
Es wird vermutet, dass der dermale LD₅₀-Wert größer als 4147 mg/kg ist.
Studie 1505: Prüfung der akuten Reizung/Ätzung der Haut bei Kaninchen.
Die Beurteilung des primären Reizungsindexes (PPI) erfolgte gemäß sowohl EPA- als auch EEG-Kriterien. Während der Studie wurden kein Ödem, Erythem oder sichtbare Hautverletzungen beobachtet.
Gemäß EEG-Kriterien wird Oxihumat hinsichtlich Erythem und Ödem als nicht reizend eingestuft. Analog wird Kaliumoxihumat gemäß EPA-Kriterien als nicht reizend eingestuft.
Studie 1506: Prüfung der akuten Reizung/Ätzung der Augen bei Kaninchen.
Unter den Bedingungen dieser Studie wird Oxihumat als für Augengewebe des Kaninchens leicht reizend betrachtet. Gemäß EEG-Bewertungskriterien für das Auge wird das Humat als nicht reizend hinsichtlich der Hornhaut, nicht reizend hinsichtlich Irisverletzungen, nicht reizend hinsichtlich Bindehautrötung und nicht reizend hinsichtlich Bindehautödem betrachtet.
Studie 1507: Kontakthypersensibilisierung bei Albino-Meerschweinchen (Magnusson-Kligman-Maximierungstest).
Bei keinem der Tiere wurde während der Beobachtungsperiode Ödem oder Erythem beobachtet. Daraus kann folglich geschlossen werden, dass die reine Prüfsubstanz keine Hautsensibilisierung bei den Tieren hervorrief. Sie wird deshalb gemäß den Magnusson-Kligman-Maximierungskriterien als im Besitz eines geringen Sensibilisierungspotenzials eingestuft.
Studie 1511: Subchronische orale Toxizität bei Nagern: 90-tägige Studie mit Kaliumoxihumat.
"Keines der Tiere starb während der 90-tägigen Studiendauer infolge der Versuchssubstanz. Zwischen der Pathologie und den Organmassen der Tiere, die die Versuchssubstanz er hielten, wurden keine nennenswerten Unterschiede im Vergleich zu den Kontrolltieren festgestellt. Bei Tieren, die die Versuchssubstanz erhielten, wurden keine abnormalen klinischen Anzeichen beobachtet. Die einzigen nennenswerten Veränderungen waren der konsequente Anstieg an Serumglobulinen sowie ein arzneimittelbezogener Anstieg der Hämoglobinisierung der roten Blutzellen der behandelten Tiere. Außerdem wurde ein Rückgang von anorganischem Serumphosphat und eine Senkung der zirkulierenden Lymphozyten festgestellt. Die beobachteten Wirkungen waren vornehmlich bei weiblichen Ratten sichtbar. Bei männlichen behandelten Tieren der beiden hochdosierten Gruppen wurde ein statistisch signifikanter Rückgang der endgültigen Körpermasse festgestellt. Die endgültigen Körpermassen der beiden Gruppen lagen jedoch innerhalb des Bezugsbereichs für Tiere dieser Altersgruppe.
Die Beobachtungen der Blutchemie zeigen nicht unbedingt nachteilige Wirkungen auf und können sogar ein Anzeichen für vorteilhafte Eigenschaften darstellen, die weiter untersucht werden sollten. Tiere der hochdosierten Gruppe erhielten Oxihumat in einer Dosisrate von 1000 mg/kg/Tag über eine 90-tägige Studiendauer. Unter Berücksichtigung der hohen Dosisrate kann angenommen werden, dass Oxihumat innerhalb dieses Expositionszeitraums bei dieser bestimmten Dosis praktisch nicht toxisch ist.
Studie 1557: Subchronische dermale Toxizität bei Nagern: 90-tägige Studie mit Kaliumoxihumat.
Tiere erhielten Oxihumat in einer Dosisrate von 1000 mg/kg/Tag über eine 90-tägige Dauer. Keines der Tiere zeigte abnormale klinische Anzeichen oder starb während der 90-tägigen Studiendauer. Zwischen der gemessenen Pathologie und den gemessenen Körpermassen und Organmassen der Tiere, die die Versuchssubstanz erhielten, wurden keine Unterschiede im Vergleich zu den Kontrolltieren festgestellt.
Die Versuchssubstanz veränderte einige der Parameter der chemischen Pathologie. Die Ergebnisse waren jedoch nicht einheitlich. Die Ergebnisse lassen eine sehr geringe Säure-Base-Störung vermuten.
Wie durch die beurteilten Parameter angezeigt, scheint die Versuchssubstanz bei der verwendeten Dosis und in der aufgetragenen Weise keine schwere nachteilige Wirkung auf die Versuchstiere zu haben.
Studie 1633: Subchronische orale Toxizitätsstudie für Kaliumoxihumat mit Hunden.
Die Versuchssubstanz induzierte selbst bei 1200 mg/kg/Tag keine deutlichen klinischen Toxizitätsanzeichen. Während der gesamten Studiendauer zeigten alle Tiere ein normales körperliches Aussehen und normale Verhaltensmuster.
Die klinischen pathologischen Daten zeigten, dass die Versuchssubstanz einige, jedoch üblicherweise geringe, Auswirkungen auf die gemessenen Parameter hatte. Die meisten Veränderungen waren jedoch nicht konsequent dosisbezogen und hatten vermutlich keinerlei klinische Bedeutung. Viele Veränderungen waren bei älteren Tieren zu erwarten.
Die Tiere wurden nach dem 90-tägigen Zeitraum getötet und es wurde eine umfassende Obduktion sowie eine histopathologische Beurteilung einer umfassenden Liste Organe vorgenommen. Diese Untersuchung ergab, dass die Versuchssubstanz keine messbare Pathologie auf makroskopischer und mikroskopischer Ebene induzierte. Dieser Befund korreliert mit der klinisch-pathologischen Untersuchung.
Oxihumat scheint eine Substanz bei der verwendeten Dosis und in der aufgetragenen Weise mit geringer Toxizität zu sein.
Die Ergebnisse dieser Studie waren mit der subchronischen Toxizitätsstudie bei Nagern vergleichbar.
Studie 1639: Kombinierte Studie der chronischen Toxizität und Karzinogenität. (Zwischenbericht nach zwölf Monaten).
Während der ersten zwölf Monate beider Studien wurden keine abnormalen Anzeichen in einem der mit der Versuchssubstanz dosierten Tiere beobachtet. Keines der Tiere starb infolge der Versuchssubstanz und keines der Tiere zeigen in diesem Stadium Anzeichen von Krebs.
Oxihumat ist folglich eine Verbindung, die:

i) die Lymphozytenproliferation erhöht. Diese Eigenschaft wird von synthetischen Huminsäuren geteilt;
ii) antivirale Aktivität gegenüber umhüllten Viren, wie HIV-1 und HSV-1, zeigt;
iii) die IL-2-Produktion durch stimulierte Lymphozyten in vitro steigert, ein Zytokin, das die stetig abnehmende CD4-Lymphozytenpopulation bei HIV-infizierten Patienten retten kann;
iv) die IL-4- und IL-6-Produktion durch stimulierte Lymphozyten in vitro steigert, Zytokine, die mit humoraler Immunität assoziiert sind;
v) die Produktion von Antikörpern gegen die Newcastle-Krankheit bei Hühnern steigert;
vi) die Sekretion von IL-10 durch stimulierte Lymphozyten in vitro hemmt, ein Zytokin, das mit einem Rückgang der IL-2-Produktion verbunden ist;
vii) die zytotoxische Aktivität von sowohl im Ruhezustand befindlichen als auch durch PHA stimulierten Lymphozyten erhöht, wobei eine humane Leberkrebszelllinie als Ziel verwendet wird;
viii) sowohl die T_H1- als auch die T_H2-Lymphozytenaktivität in vitro erhöht, wichtige Wirtsabwehrmechanismen, die gegen Virus- und Bakterieninfektionen eingesetzt werden;
ix) die Sekretion von LTB4 durch stimulierte Lymphozyten erhöht, eine Verbindung, die mit einer Steigerung der Produktion von Zytokinen verbunden ist, welche mit sowohl T_H1 als auch T_H2 sowie einer erhöhten zytotoxischen Aktivität von Lymphozyten verbunden sind;
x) die PGE2-Sekretion durch stimulierte Lymphozyten senkt, eine Verbindung, die mit Entzündung, Schmerzen und Fieber verbunden ist;
xi) die TNF-Sekretion durch stimulierte Lymphozyten senkt, eine Verbindung, die mit Entzündung verbunden ist;
xii) die CD38-Spiegel in vitro senkt, einem kräftigen negativen Prognosemarker für HIV-infizierte Personen;
xiii) schnell aufgenommen wird und innerhalb von 30 Minuten im Serum nachweisbar ist;
xiv) gegenüber Versuchstieren eine sehr geringe Toxizität hat;
xv) bis zu einer Dosierung von 6 g pro Tag bei HIV-infizierten Personen nicht toxisch ist;
xvi) nach zwei Wochen die lymphoproliferative Reaktion bei und das Gewicht von HIV-infizierten Personen erhöht.

LITERATUR

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Claims

Verwendung von Oxihuminsäure, die kohlestämmig ist und durch ein Nassoxidationsverfahren gewonnen wird, oder einem Salz, Ester oder Derivat davon mit folgender Analyse der funktionellen Gruppen bereitgestellt: Säuregruppen, insgesamt: 3–13 meq/g; Carboxylgruppen: 0,5–12 meq/g und Phenolgruppen: 0,5–9 meq/g; zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung als Immunstimulans bereitgestellt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel zum Hemmen von Krebswachstum bei einem Patienten verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel bei der Behandlung einer Krankheit verwendet wird, die mit einer Virusinfektion assoziiert ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Arzneimittel zur Behandlung einer HIV-Infektion verwendet wird.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Arzneimittel oral verabreicht wird.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Patient ein Mensch, ein Tier oder ein Vogel ist.