DE69021791T2 - Verwendung eines phagozytise-aktievierenden Stoffes : LPS oder IL-2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Staphylococcus-aureus-Infektionen bei Kühen. - Google Patents

Verwendung eines phagozytise-aktievierenden Stoffes : LPS oder IL-2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Staphylococcus-aureus-Infektionen bei Kühen.

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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Behandlung infektiöser Erkrankungen, die durch bakterielle Staphylococcus aureus-Infektionen bei Kühen verursacht werden. Mastitis ist ein Beispiel für eine derartige Erkrankung. Das vorliegende Verfahren beinhaltet die Aufstellung eines Therapieplans, um die Wirksamkeit von Phagozytenaktivierenden Mitteln entweder allein oder in Kombination mit anderen Therapien zu optimieren.
  • Die hauptsächliche Abwehr von Tieren und Pflanzen gegen akute und chronische Erkrankungen findet durch einen Mechanismus statt, der als Phagozytose bekannt ist. Krankheitsverursachende Organismen oder pathologische Zellen verursachen ein Einströmen von Phagozytenzellen, die durch das Phagozyten- und Immunsystem des Wirts diese krankheitsverursachenden Organismen oder pathologischen Zellen identifizieren und entfernen. Die erfolgreiche Beseitigung der Pathogene oder erkrankten Zellen beinhaltet eine komplexe Reihe von Schritten, welche die Phagozytenzellen aktivieren, um eine Phagozytose und eine intrazelluläre oder extrazelluläre Abtötung des Pathogens oder der erkrankten Zelle zu optimieren. Es ist bereits gezeigt worden, daß die quantitativen Zahlen der Phagozyten-Zellen in einer zyklischen Reaktion auf viele Erkrankungen (beispielsweise akute und chronische Infektionen des Atmungs-, Harnwegs und hämapoetischen Systems) ansteigen und abnehmen. Jedoch beschreibt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung warmblütiger Tiere, die eine Erkrankung aufweisen, bei dem man nicht nur quantitative Veränderungen bei den Phagozytenzellen, sondern auch qualitative Veränderungen in den Zellen während des Krankheitsprozesses auf präzise und vorhersehbare Weise überwacht und/oder manipuliert. Diese Veränderungen bei Phagozytenzellen können therapeutisch durch die Verabreichung gewisser Phagozyten-aktivierender Mittel beeinflußt werden. Deshalb ist zum ersten Mal durch die Manipulation dieser qualitativen Veränderung bei der Phagozytenzelle eine präzise Regulierung und vorhergesagte therapeutische Heilung bei der Behandlung der Erkrankung verfügbar.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen zur Behandlung infektiöser Erkrankungen, um durch Hervorrufen oder Bewirken einer 10- bis 10000-fachen Aktivierung normaler Phagozytose und intrazellulärer Abtötung von Pathogenen oder erkrankten Zellen eine Heilung zu bewirken. Eine ähnliche Aktivierung findet während normaler Pathophysiologie und zu vorhergesagten Zeitspannen während der Erkrankungen statt. Es ist eine unterstützte Veränderung im Aktivierungsstadium der Phagozytenzellen, nicht deren Zahl, welche das wichtige Merkmal beim Auffinden eines Verfahrens zur Behandlung infektiöser Erkrankungen ist, die hohe und niedrige Stadien zellulärer Aktivierung aufweisen. Deshalb ist jedes Phagozyten-aktivierende Mittel, das eine geeignete Aktivierung hervorrufen oder bewirken kann, ein wirksames therapeutisches Mittel. Demgemäß sind eine geeignete Dosierung und ein geeigneter Therapie- Zeitplan bei der Manipulierung der Phagozyten-aktivierenden Antwort zentral für eine vorhersagbare und wirksame Behandlung derartiger Erkrankungen. Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal ein derartiges Verfahren bereit, und sie stellt ein Verfahren zur Verstärkung der therapeutischen Wirksamkeit von Phagozytenzellen nicht aktivierenden Mitteln bereit, indem sie die Phagozytenzellen-aktivierenden Mittel der vorliegenden Erfindung mit diesen Zellen kombiniert.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Figur 1. Vier infizierte Euterdrüsen, die Felder A, B, C und D, von zwei Tieren werden über fünf aufeinanderfolgende Tage verfolgt. Sowohl die Zahl somatischer Zellen, SCC, als auch die Kolonien-bildenden Einheiten, CFU, von Staphylococcus aureus in Milch werden jeden Tag quantitativ bestimmt. Die Daten sind als mittlere SCC x 10³ oder die Zahl der CFU/0,1 ml plattiert ausgedrückt.
  • Figur 2. In Euterdrüsen werden Verbindungen infundiert, die mögliche chemoattraktive Eigenschaften aufweisen. Somatische Zellen aus den Eutersekreten werden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infusion in das Euter unter Verwendung eines Coulter-Zählers (Modell ZM & C256 Channelyzer, Coulter Electronis, Northwell Dr., Luton Beds, England) quantitativ bestimmt. Die zelluläre Antwort auf den Chemoattraktor wird als Stimulationsindex ausgedrückt ({Zellen-Zahl nach der Infusion}+{Zellen-Zahl vor der Infusion}).
  • Figur 3. In Euterdrüsen wird eine chemoattraktive Verbindung, wie Lipopolysaccharid (0,1 ug bis 25 ug Gesamtdosis), infundiert, und somatische Zellen aus den Eutersekreten werden 12, 24, 36 und 48 Stunden nach der Infusion in das Euter unter Verwendung eines Coulter-Zählers (Modell ZM & C256 Channelyzer, Coulter Electronics, Northwell Dr., Luton Beds, England) quantitativ bestimmt. Zelluläre Antworten auf den Chemoattraktor werden als Stimulationsindex ausgedrückt ({Zellen-Zahl nach der Infusion}+{Zellen-Zahl vor der Infusion}). Das Maximum und die Dauer der Antwort werden so angepaßt, daß sie für den individuellen behandelten Krankheitszustand optimal sind.
  • Figur 4. Verschiedene Chemoattraktoren werden verwendet, um ein Einströmen somatischer Zellen in die Milch zu induzieren. 8, 24, 36, 48 und 72 Stunden nach der Infusion werden die somatischen Zellen in der Milch gezählt. Zusätzlich wird die durchschnittliche Größe der induzierten Population mit einem Coulter Channelyzer (C256 Channelyzer, Coulter Electronics, Northwell Dr., Luton Beds, England) ausgewertet. Der Durchmesser der Maximum-Population wird gegen die Zeit nach der Infusion aufgetragen. Die normale nicht-infizierte somatische Drüsenzellenpopulation weist einen Zelldurchmesser im Maximum von 8,3 um auf.
  • Figur 5. Phagozyten-Zellen werden mit fluoreszierenden 2um-Perlen eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Der relative Fluoreszenzgrad wird dann unter Verwendung eines Durchflußzytometers (EPICS 753, Coulter Electronics, Hialeah, FL) quantitativ bestimmt. Der Prozentsatz an Zellen, der 0, 1, 2, 3 oder 4+ Perlen verschlingt, wird auf der Grundlage der Fluoreszenzintensität berechnet.
  • Figur 6. Rekombinantes Rinder-Interleukin-2, r-BoIL-2, wird durch eine einzige Infusion in das Euter zu 0,4 mg bis 40 mg in 10 ml Gesamtdosis einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung in Euterviertel von normalem Holstein-Milchvieh verabreicht. Die Anzahl der somatischen Zellen wird 24 Stunden nach der Infusion durch einen Coulter-Zähler (Modell ZM & C256 Channelyzer, Coulter Electronics, Northwell Dr., Luton Beds, England) überwacht. Der Stimulationsindex wird durch Dividieren der Zahl der somatischen Zellen vor der Infusion durch die Zahl der somatischen Zellen nach der Infusion berechnet.
  • Figur 7. Rekombinantes Rinder-Interleukin-2, r-BoIL-2, wird durch eine einzige Infusion in das Euter zu 2 mg in 10 ml Gesamtdosis in Euterviertel von mit Staphylococcus aureus-infiziertem Holstein-Milchvieh verabreicht. Der Phagozyten-Index von isolierten somatischen Zellen wird 0, 16, 24, 40 und 64 Stunden nach der Infusion durch die Aufnahme von fluoreszierenden Perlen überwacht und durch Durchflußzytometrie (EPICS 753, Coulter Electronics, Hialeah, FL) quantitativ bestimmt. Die Daten sind als Gesamtprozentsatz der polymorphonukleären Population von somatischen Zellen, die Perlen aufnehmen, ± Standardabweichung von 3 verschiedenen Proben, ausgedrückt.
  • Figur 8. Phagozyten-Zellen, die aus einzelnen Eutervierteln isoliert wurden, welche 64 Stunden mit 2 mg r-BoIL-2 behandelt waren, werden mit fluoreszierenden 2 um-Perlen eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Der relative Fluoreszenzgrad wird dann unter Verwendung eines Durchflußzytometers (EPICS 753, Coulter Electronics, Hialeah, FL) quantitativ bestimmt. Der Prozentsatz an Zellen, der 0, 1, 2, 3 oder 4+ Perlen ± Standardabweichung verschlingt, wird auf der Grundlage der Fluoreszenzintensität von Proben aus drei verschiedenen Tieren berechnet.
  • Figur 9. Rekombinantes Rinder-Interleukin-2, r-BoIL-2, wird dreimal alle 24 Stunden oder alle 48 Stunden durch Infusion in das Euter zu 2 mg bis 10 mg in 10 ml Gesamtdosis in Euterviertel von mit Staphylococcus aureus infiziertem Holstein-Milchvieh verabreicht. Der Phagozyten-Index isolierter somatischer Zellen wird über einen Zeitraum von 40 Stunden durch die Aufnahme von fluoreszierenden Perlen und mit Durchflußzytometrie (EPICS 753, Coulter Electronics, Hialeah, FL) überwacht. Die Daten sind als Gesamtprozentsatz der polymorphonukleären Population von somatischen Zellen ausgedrückt, die Perlen aufnehmen.
  • Figur 10. Rekombinantes Rinder-Interleukin-2, r-BoIL-2, wird dreimal alle 24 Stunden oder alle 48 Stunden durch Infusion in das Euter zu 2 mg in 10 ml Gesazatdosis in Brustviertel von mit Staphylococcus aureusinfiziertem Holstein-Milchvieh verabreicht. Der Phagozyten-Index isolierter somatischer Zellen wird 16 und 40 Stunden nach der Infusion in das Euter durch die Aufnahme von fluoreszierenden Perlen überwacht und mit Durchflußzytometrie (EPICS 753, Coulter Electronics, Hialeah, FL) quantitativ bestimmt. Die Daten sind als Gesamtprozentsatz der polymorphonukleären Population von somatischen Zellen, die 1, 2, 3 oder 4+ Perlen ± Standardabweichung auf nehmen, ausgedrückt.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung einer Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung infektiöser Erkrankungen durch Staphylococcus aureus bei Kühen bereit, wie in Anspruch 1 beansprucht.
  • Mit dieser Zusammensetzung wird die Phagozytenzellen-Antwort bei Kühen durch die Verwendung von Phagozyten-aktivierenden Mitteln manipuliert. Eine der oben erwähnten Erkrankungen ist Mastitis, die bei Kühen gefunden wird.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung von Tieren mit infektiösen Erkrankungen durch Verstärkung der hervorgerufenen Phagozytenzellen-Antwort, indem man eine Phagozyten-aktivierende Menge eines Phagozyten-aktivierenden Mittels verabreicht. Die folgenden Beispiele betreffen speziell bakterielle Staphylococcus aureus-Infektionen des Eutergewebes, aber der Fachmann wird erkennen, daß das vorliegende Verfahren zur Behandlung infektiöser Erkrankungen für jede Krankheit zutrifft, bei der eine zyklische Phagozyten-aktivierende Antwort vorhanden ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein wirksames Verfahren zur Verhütung von Erkrankungen wie Mastitis durch Verwendungen der Verbindungen bereit, die die Phagozyten-aktivierende Antwort hervorrufen. Spezieller wird Mastitis durch Verabreichung einer Mastitis-verhütenden Menge an Rinder-Interleukin-2 (bIL-2) verhütet.
    • Beispiel 1 Staphylococcus aureus-Infektionen in Eutergewebe von Kühen
  • Milchproben werden über ein Minimum von drei Wochen alle 24 Stunden aus Drüsen gesammelt, die experimentell mit Staphylococcus aureus (der American Type Culture-Stamm Newbould 305 wird bevorzugt) infiziert worden sind. Insgesamt 100 ul Milch werden auf einer Blut-Agarplatte ausplattiert und 18 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Zahl der ß- hämolytischen Kolonien wird bestimmt und als bakterielle Beladung pro ml Probe ausgedrückt. Ähnlich wird 1 ml Probe auch bezüglich der Zahl lebensfähiger somatischer Zellen ausgewertet. Mehr als 90% der somatischen Zellen in einer infizierten Drüse sind Phagozytenzellen, wie morphologisch charakterisiert.
  • Das zyklische Auftreten von somatischen Zellen steht in umgekehrter Beziehung zu den quantitativen Veränderungen bei Bakterien in der Milch. Die Zunahme somatischer Zellen (primär Phagozytenzellen) entspricht einer Abnahme der Bakterienzahl in der Milch. Umgekehrt steigt die Bakterienzahl schließlich an, wenn die Zahl der somatischen Zellen abnimmt, und läßt die Infektion wieder auftreten, Figur 1 A, B, C und D. Es ist auch bekannt, daß dieses zyklische Ansteigen und Abnehmen von Infektionen während der Antwort durch Wirte auf verschiedene andere Krankheitszustände, wie akute und chronische Atmungs- und Harnwegssystem- Infektionen, Infektionen des gastrointestinalen Systems, chronischen entzündlichen Darmerkrankungen, Infektionen der Haut, Autoimmunkrankheiten (rheumatoider Arthritis, Multipler Sklerose, systemischem Lupus Erythematodis usw.), entzündlichen Antworten auf Parasiten-Infektionen und Antworten auf Tumoren (insbesondere Lymphome, Leukämien, Melanome und andere feste Tumoren) auftritt.
    • Beispiel 2 Qualitative Veränderungen in Phagozytenzellen
  • Milchproben aus infizierten Drüsen werden gesammelt, und die somatischen Zellen werden in ein Pellet überführt und gezählt. Diese Zellen werden ausgiebig gewaschen und dann mit einer Lösung von Lysostaphin behandelt, um Staphylococcus aureus zu entfernen, der an der Oberfläche haftet, aber nicht phagozytiert ist. Die Phagozytenzellen werden dann durch wiederholtes Gefrieren-Auftauen in einer Wasserlösung lysiert. Die lysierte Lösung wird dann auf einer Blut-Agarplatte 18 Stunden bei 37ºC plattiert, und lebensfähige ß-hämolytische Kolonien werden quantitativ als Maß für innerlich lebensfähigen Staphylococcus aureus bestimmt. Da die Zahl der somatischen Zellen im Pellet, die lysiert ist, bekannt ist, kann die Häufigkeit von Phagozytenzellen mit einem lebensfähigen inneren Staphylococcus aureus quantitativ bestimmt werden, d.h. die mißlungenen Versuche des intrazellulären Abtötens.
  • Die Häufigkeit, mit der Zellen identifiziert werden, die lebensfähige Pathogene beherbergen oder darin versagen, pathologische Zellen abzutöten, d.h. mißlungene Abtötungsversuche, verändert sich während der Infektion, siehe Tabelle I. Diese Schwankung in der Effizienz des Abtötens von intrazellulärem Staphylococcus aureus ist so hoch wie ein Faktor von 10000. Zellen, die das Pathogen nicht effizient "abtöten", tragen zu der Reinfektion des Wirts bei, indem sie dieselben vor therapeutischen Mitteln (Antibiotika usw.) schützen, die die Wirtszellen nicht durchdringen können. Diese ineffizienten Zellen sterben und setzen ihre lebensfähigen Pathogene oder pathologischen Zelltargets frei. Es sind diese Zellen, die die Targets der Phagozyten-aktivierenden Mittel zur Therapie sind. Verfahren oder Substanzen, die Phagozytenzellen zu deren optimaler biologischer funktioneller Kapazität aktivieren, wie durch hierin beschriebene Verfahren gemessen, und dies zum geeigneten Zeitpunkt, maximieren dadurch die Effizienz und minimieren die Freisetzung oder das Entkommen von Pathogenen oder pathologischen Zellen und optimieren die therapeutische Wirksamkeit. Zusätzlich kann eine überschüssige und unzeitgemäße Aktivierung zu einer Suppression der biologischen Aktivität führen. Eine ungeeignet angesetzte Therapie kann in der Tat den normalen Wirtsabwehrmechanismus behindern. Während qualitative und/oder quantitative Veränderungen bei Phagozyten beschrieben worden sind, gestattet die Tatsache, daß diese Fluktuationen koordiniert, synchron und definierbar sind, die Identifizierung von geeigneten Therapien und Therapie-Schemata. TABELLE I INTRAZELLULÄRE ABTÖTUNG VON STAPHYLOCOCCUS AUREUS Tag/Quelle Somatische Zellen Zahl der Zellen/ml (x 10&sup4;) Externer s. aureus CFU/ml (x 10¹) Relative Wirksamkeit Zahl der Zellen/CFU (x 10&sup4;)
  • ¹ LV = linkes vorderes Viertel der Euterdrüse; LH = linkes hintere Viertel der Euterdrüse; RV = rechtes verderes Viertel der Euterdrüse; RH = rechtes hinteres Viertel der Euterdrüse.
  • ² Die relativer Wirksamkeit der Abtötung von Staphylococcus aureus durch verschiedene Populationen von PMNs aus einer infizierten Drüse. Dies wird berechnet, indem man die Zahl der Zellen berechnet, die lysiert werden muß, um einen lebensfähigen Staphylococcus aureus nachzuweisen. Je geringer die Zahl ist, desto weniger wirksam waren die Zellen bei der Beseitigung des Staphylococcus aureus.
    • Beispiel 3 Chemoattraktive Wirkungen
  • Eine Anzahl von Chemoattraktoren (Verbindungen und/oder biologische Mittel, die direkt oder indirekt eine spezifische Wanderung von Zellen zu einem höheren, dieselben enthaltenden Konzentrationsgradienten verursachen), welche oft bei Pathogenen oder erkrankten Zellen endogen sind, induzieren ein Einströmen von Phagozytenzellen, wenn sie lokal oder systemisch verabreicht werden. Dieses Einströmen von Phagozytenzellen ahmt teilweise das normale zyklische Einströmen von Phagozytenzellen in ein infiziertes Gebiet nach. Durch den Zitzenkanal werden in normale Pathogen-"freie"-Euterdrüsen verschiedene bekannte Chemoattraktoren infundiert. Die Dosis dieser Chemoattraktoren wird auch variiert, und das Einströmen von Zellen in die Euterdrüse wird überwacht, indem man die Zahl der somatischen Zellen in Milch bestimmt, die zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung gesammelt wird. Die Zahl der somatischen Zellen wird mit einem Coulter-Zählers (Modell ZM & C256 Channelyzer, Coulter Electronics, Northwell Dr., Luton Beds, England) bestimmt. Die Zahl der Zellen nach der Infusion + die Zahl der Zellen vor der Infusion ergibt ein relatives Maß des Stimulationsgrades durch den Chemoattraktor, ausgedrückt als Stimulationsindex.
  • Die meisten der potentiellen Chemoattraktoren verursachen ein signifikantes Einströmen von Phagozytenzellen in die Euterdrüse, Figur 2. Jedoch bestimmt die Dosis der Verabreichung dieser Chemoattraktoren nicht nur den Stimulationsgrad, sondern auch den Zeitpunkt für ein Maximum der Antwort und/oder die Langlebigkeit der erhöhten Zahl der Phagozytenzellen, Figur 3. Deshalb wird die chemoattraktive Therapie durch Veränderung der Dosis (0,1 ug bis 100 mg oder bis zu 100% an aktiver Verbindung, wie Zymosan-aktiviertes Kuhserum (ZACS), werden bevorzugt) zum Hervorrufen einer spezifischen maximalen Antwort und Dauer bestimmt, damit eine Koordination mit dem zyklischen Krankheitsstadium vorhanden ist.
    • Beispiel 4 Testen der Chemoattraktoren
  • Wie bei einer normalen zyklischen Antwort auf einen Krankheitszustand sind Phagozytenzellen, die durch verschiedene Chemoattraktoren induziert werden, qualitativ verschieden. Zellen, die durch chemoattraktive Mittel induziert werden, wie sie in Beispiel 3 bereitgestellt werden, werden unter Verwendung eines Coulter-Zählers und Channelyzer (Modell ZM & C256 Channelyzer, Coulter Electronics, Northwell Dr., Luton Beds, England) bezüglich ihres mittleren Zelldurchmessers ausgewertet. Das Mittel des Zelldurchmessers beim Maximum der somatischen Zellpopulation aus 3 - 4 einzeln behandelten Drüsen wird 8, 24, 36, 48 und 72 Stunden nach der Behandlung berechnet, Figur 4. Einige Chemoattraktoren (beispielsweise Lipopolysaccharid und Zymosan-aktivierte Rindersera) rufen differenzielle Veränderungen im Zelldurchmesser über die Zeit hervor, während andere keine Wirkung aufweisen (beispielsweise Protein A) und der mittlere Zelldurchmesser relativ konstant bleibt. Diese koordinierten Veränderungen in der Zellgröße sagen auch das Ausmaß der Aktivierung dieser Phagozytenzellen voraus. Die gleichen Dosen, die merkliche qualitative Veränderungen bei Phagozytose und Aktivierung hervorrufen, rufen einen ähnlichen quantitativen Einstrom von Phagozytenzellen hervor. Veränderungen im Zelldurchmesser beim Maximum der Population, die einen mehr als 10% größeren Maximum-Durchmesser als bei nicht-stimulierten Kontrollzellen-Populationen über einen Zeitraum von 12 - 72 Stunden nach der Infusion in das Euter beinhalten, können eine geeignete Aktivierung von Zellen anzeigen.
    • Beispiel 5 Klassen von Phagozyten-aktivierenden Verbindungen
  • Wie in Beispiel 4 dargestellt, wird in normale Euterdrüsen Lipopolysaccharid, LPS, oder Zymosan-aktiviertes Kuhserum, ZACS, infundiert. Dosen im Bereich von 0,5 bis 50 ug bei LPS und 10 ml von 1%- igem bis 100%igem ZACS werden bevorzugt. Die biologische Aktivität der Phagozytose wird durch Messen der Fähigkeit von induzierten oder nichtinduzierten Zellen, fluoreszierend gemachten 2u-Perlen zu phagozytieren, bewertet. Der Prozentsatz an Zellen, der Perlen phagozytiert, sowie die mittlere Zahl der von jeder Zelle phagozytierten Perlen wird durch Durchflußzytometrie (EPICS 753, Coulter Electronics, Hialeah, FL) quantitativ bestimmt, Figur 5.
  • Zellen von nicht-induzierten Drüsen oder Drüsen, die mit 1 ug Lipopolysaccharid oder 10 ml Zymosan-aktivierten Rindersera induziert worden sind, werden 24 Stunden nach der Infusion auf ihre Fähigkeit getestet, fluoreszierend gemachte Perlen zu phagozytieren. Obwohl die quantitative Induktion durch diese beiden Chemoattraktoren ähnlich ist, weist die Lipopolysaccharid-induzierte Population einen größeren Prozentsatz an Zellen, die Perlen phagozytieren, 45% gegenüber 30%, sowie einen höheren Prozentsatz an Zellen auf, die mehr als eine Perle phagozytieren, 21 - 28% gegenüber 15 - 16%, Tabelle II. TABELLE II PHAGOZYTOSE VON FLUORESZIERENDEN PERLEN DURCH RINDER-PMNs % PHAGOZYTOSE DER GESAMTPOPULATION Zahl der aufgenommenen Perlen Zellen-Quelle ingesamt Normal (unstimuliert) 10 ml Zymosanaktiviertes Serum
  • ¹ Die gesamt Population wurde zuerst durch den Computer torgestueuert, um nur die Zellen, polymorphonukleäre Zellen (PMNs), zu berücksichtigen, die die richtige Große aufwiesen (Vorwärtswinkel-Lichtstreuung, FALS, und innere Zellstruktur (90º Lichtstreung)). Deshalb wurde die quantitative Bestimmung der Phagozytose (Aufnahme von fluoreszierenden Perlen) an lebensfähigen PMNs gemessen.
  • Ein Bereich der Aufnahme von fluoreszierenden Perlen mit 10% bis 100% Phagozytose oberhalb von Kontrollniveaus hat eine wirksame therapeutische Behandlung der Erkrankung zur Folge. Zusätzlich beinhaltet eine geeignete Aktivierung auch die Zunahme der Zahl der pro Zelle aufgenommenen fluoreszierenden Perlen auf soviel wie das 1,5 - 4-fache. Lipopolysaccharid ist ein Beispiel einer Phagozytenzellen-aktivierenden Verbindung, die ein quantitatives Einströmen von Zellen (größer als die 10 - 20-fache Zunahme an somatischen Zellen in der Milch gegenüber unbehandelten normalen Kontrollvierteln) induziert und gleichzeitig auch die Zellen aktiviert, wohingegen die Zymosan-aktivierte Rindersera ein Einströmen von Phagozytenzellen (mehr als die 10 - 20-fache Zunahme an somatischen Zellen in der Milch gegenüber unbehandelten normalen Kontrollvierteln) in die Drüse induziert, ohne diese signifikant zu aktivieren.
  • Eine Zusammenfassung von repräsentativen Beispielen für Chemoattraktoren wird auf ähnliche Weise für die Zeit des maximalen Einströmens und der maximalen Phagozytose-Aktivierung analysiert, Tabelle III.
  • Es gibt zwei verschiedene Klassen. Die Klasse I sagt Verbindungen vorher, die als Chemoattraktoren und Chemoaktivatoren (Verbindungen, die die biologische Aktivität von Zellen steigern, bei Phagozytenzellen insbesondere die Aufnahme und Beseitigung von fremdem Material) wirken. Die Klasse II schließt Verbindungen ein, die primär als Chemoattraktoren bei minimaler oder keiner Aktivierung wirken. Die Dosis jeder Klasse von Chemoattraktoren steuert den Zeitpunkt für die maximale Antwort und die Dauer der Antwort. Die bevorzugte Dosis beträgt bei Lipopolysaccharid (LPS), Enterotoxin B, Protein A 0,5-50 ug; Zymosan-aktivierten Kuhseren, ZACS, F127 Pluronic 10-50 ul einer 1-50%-igen Lösung; Austern-Glykogen 5- 200 mg; Lipid A von LPS 1-50 ug; und Polysaccharid von LPS 1-10 ug. Falls die Therapie bei einem Krankheitsstadium das Einströmen von Zellen sowie eine Aktivierung erfordern sollte, stellen Repräsentanten der Chemoattraktoren der Klasse I die beste therapeutische Wahl dar. Die Dosis steuert das Ausmaß und die Länge der Antwort, die für die zyklische Infektion optimiert werden soll, wie in Beispiel 3.
    • Beispiel 6 Therapeutische Wirksamkeit von Klassen von Phagozyten-aktivierenden Verbindungen
  • Wie in Beispiel 4 dargestellt, werden Repräsentanten von beiden Klassen von Chemoattraktoren/Chemoaktivatoren verwendet, um chronische bakterielle Infektionen zu behandeln. Die Wirksamkeit der Therapie wird TABELEE III ZUSAMMENFASSUNG DER EIGENSCHAFTEN VON CHEMOATTRAKTOREN QUANTITATIVE (SCC)¹ Chemoattaktor Konzentration QUALITATIVE² Phagozytose Klasse Lipopolysaccharid (LPS) Enterotoxin B Protein A Zymosan Austern-Glykogen Lipid A von LPS Polysaccharid von LPS ¹ SSC: Zahl der somatischen Zellen im Vergleich zu unbehandeltem Viertel. ² Relative Phagozytose von fluoreszierend gemachten Perlen im Vergleich zu Kontrollen.
  • durch die Heilungen und/oder die Länge der Zeit vorhergesagt, über die die Infektion beseitigt verbleibt, Tabelle IV. Die Verbindungen der Klasse I sind bei diesem therapeutischen Schema die wirksamsten, Figur 5.
    • Beispiel 7 Quantitative zelluläre Antwort auf ein Phagozyten-aktivierendes Zytokin
  • Wie in den Beispielen 3 und 4 wird das Zytokin r-BoIL-2 in die Euterdrüse von nicht-infiziertem Milchvieh infundiert. Die Zahl der somatischen Zellen wird alle 8 - 16 Stunden nach der Infusion überwacht, und der Stimulationsindex wird, wie in Beispiel 3 beschrieben, berechnet. Rekombinantes Rinder-IL-2 verursacht ein sofortiges (8 - 16 Stunden) und dramatisches Einströmen (soviel wie das 3000-fache gegenüber Kontrollspiegeln) von primären polymorphonukleären Zellen (> 90% durch Morphologie und Expression von zellulärem Differenzierungsantigen). Eine zweite Welle zellulärer Infiltration in die Euterdrüse findet 36 - 72 Stunden nach der Verabreichung statt. Das Maß des quantitativen zellulären Einstroms steht ungefähr mit der Dosis an verabreichtem r- BoIL-2 in Beziehung, Figur 6.
  • Diese massive Infiltration von polymorphonukleären Zellen, ein Zelltyp, von dem nicht bekannt ist, daß er spezifische Rezeptoren für das Zytokin IL-2 exprimiert, ist neu und unerwartet.
    • Beispiel 8 Qualitative zelluläre Antworten auf Phagozyten-aktivierendes Zytokin
  • Somatische Zellen, mehr als 90% polymorphonukleäre Zellen, aus Tieren mit Mastitis werden bezüglich ihrer Fähigkeit bewertet, fluoreszierende 2 um-Latex-Perlen nach einer einzigen Infusion von rekombinantem Rinder-Interleukin-2, r-BoIL-2, zu phagozytieren. Zellen aus der Einzelverabreichung von 2 mg r-BoIL-2 werden mit Perlen 16, 24, 40 und 64 Stunden nach der Infusion inkubiert. Zellen von Tieren, denen 2 mg r-BoIL-2 dreimal in 24- oder 48-stündigen Abständen verabreicht worden waren, werden 16 und 40 Stunden nach der letzten Verabreichung auf Phagozyten-Aktivität getestet. Die Proben werden dann analysiert, und die Phagozytose wird durch Durchflußzytometrie quantitativ bestimmt.
  • Infizierte Euterviertel werden mit r-BoIL-2 zu 2, 10 und 30 mg in 10 ml sterilem PBS behandelt. Proben vor der Behandlung werden gesammelt, um die Phagozyten-Aktivität auszuwerten und eine Grundlinie zu erstellen. Proben nach der Behandlung werden in regelmäßigen Abständen bis zu sieben (7) Tagen gesammelt, und ihre phagozytische Fähigkeit und die intrazelluläre Abtötung werden wie beschrieben bestimmt. Ein Minimum eines 10%igen Anstiegs bei der Phagozytose wird in allen geeignet TABELLE IV CHEMOATTRAKTOR-/CHEMOAKTIVATOR-THERAPIE VON CHRONISCHEN INFEKTIONENBehandlung Zahl der Euterdrüsen % Heilungen % ansprechende Tiere Zahl der freien Milchabnahmen +/- SEM¹
  • ¹ Zahl bedeutet die gemittelten Male von Staphylococcus aureus-freien Milchabnahmen +/- Standardfehler des Mittels, SEM.
  • ² Die Behandlung verwendete 1 ug LPS in einem Gesamtvolumen von 10 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, die in dreitätigen Abständen in die infizierte Euterdrüse infundierte wurden.
  • ³ Prozentsatz der behandelten Drüsen, die eine bakteriologische Beseitigung der Infektion bei mindestens einer Milchabnahme nach der Therapie zeigten.
  • &sup4; Die Behandlung verwendete 10 ml (100%iges) Zymosan-aktiviertes Kuhserum, ZACS, die an drei aufeinanderfolgenden Tagen in das infizierte Gebiet infundiert wurden.
  • behandelten Vierteln beobachtet. In Figur 7 zeigt die einzige Dosis von 2 mg r-BoIL-2 64 Stunden nach der anfänglichen Infusion eine 3,5-fache Zunahme bei der Phagozyten-Aktivität von Zellen. Zusätzlich wird auch ein Ansteigen der durchschnittlichen Zahl von aufgenommenen Perlen pro Zelle als Maß einer gesteigerten biologischen Aktivität beobachtet, Figur 8.
  • Die Fähigkeit von somatischen Milchzellen aus Drüsen mit Mastitis, Latexperlen zu phagozytieren, wird bei Proben gemessen, die 16 und 40 Stunden nach der letzten Verabreichung von r-BoIL-2 (entweder eine Dosis von 2 mg oder von 10 mg wird bevorzugt) gesammelt wurden. Das r-BoIL-2 wird dreimal in 24- oder 48-stündigen Abständen verabreicht. In Figur 9 wird der Gesamtprozentsatz der polymorphonukleären Zellen, die Perlen phagozytierten, mit den zwei Therapieplänen mit der 2 mg-Dosis verglichen.
  • Eine 3- bis 4-fache Verstärkung der phagozytischen Fähigkeit wird bei diesen Behandlungen beobachtet. Ähnlich wird als Indikator für zelluläre Aktivierung nach der Infusion von 2 mg r-BoIL-2 eine signifikante Veränderung in der Zahl der Zellen beobachtet, die 2 oder mehr Perlen aufnehmen, Figur 10.
    • Beispiel 9
  • Wie in Beispiel 4 und 8 dargestellt, wird r-BoIL-2 in die Euterdrüse infundiert, um chronische bakterielle Infektionen zu behandeln. Die Wirksamkeit der Therapie wird durch Heilungen und/oder die Länge der Zeit vorhergesagt, über die die Infektion beseitigt verbleibt. Wie in Beispiel 7 und 8 dargestellt, reihen die quantitativen und qualitativen Veränderungen, die durch r-BoIL-2 induziert werden, dieses Zytokin in die Verbindungen des Typs der Klasse I ein, und es wird von ihnen vorhergesagt, daß sie ein wirksames Therapeutikum sind, wie in Tabelle V dargestellt.
  • Wie in Beispiel 8 werden infizierte Euterdrüsen durch eine Infusion von r-BoIL-2 in das Euter behandelt (bevorzugte Dosis 2 - 40 mg, die dreimal in 24- bis 48-stündigen Abständen verabreicht wird). Die Milch wird an 14 aufeinanderfolgenden Tagen morgens gesammelt und auf die Anwesenheit von Staphylococcus aureus überpruft (b-hämolytische Kolonien auf Blut-Agarplatten). Euterviertel mit irgendwelchen Milchproben, die frei von Staphylococcus aureus sind, reagieren auf die Therapie. Euterviertel, die 14 Tage frei von Staphylococcus aureus sind, sind geheilt. Die r-BoIL-2-Therapie verursacht quantitative und qualitative Veränderungen in der Phagozytenzellen-Funktion und ist deshalb als therapeutisches Mittel wirksam, Tabelle V. TABELLE V ZYTOKIN-THERAPIE VON CHRONISCHEN S. AUREUS-INFEKTIONEN Behandlung Zahl der Euterdrüsen % Heilungen % ansprechende Tiere Zahl der freien Milchabnahmen +/- SD¹
  • ¹ Zahl bedeutet das Mittel von Staphylococcus aureus-freien Milchabnahmen +/- Standardabweichung, SD.
  • ² Die Behandlung verwendete 2 oder 10 mg r-BoIL-2 in einem Gesamtvolumen von 10 ml Phosphat- gepufferter Kochsalzlösung, die dreimal in 24stündigen Abständen in die infizierte Euterdrüse infundierte wurden.
  • ³ Prozentsatz der behandelten Drüsen, die eine bakteriologische Beseitigung der Infektion bei mindestens einer Milchabnahme nach der Behandlung zeigten.
  • &sup4; Die Behandlung verwendete 2 oder 10 mg r-BoIL-2 in einem Gesamtvolumen von 10 ml Phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die dreimal in 48stündigen Abständen in die infizierte Euterdrüse infundiert wurden.
    • Beispiel 10 Gesteigerte Wirksamkeit von mukolytischen Proteinen und Antibiotika mit Chemaktivatoren
  • Viertel mit Mastitis werden mit Chemoattraktoren und/oder bakteriziden Mitteln behandelt, beispielsweise dem mukolytischen Enzym Lysostaphin oder einem Antibiotikum. Das Lysostaphin stammt aus einer rekombinanten Quelle und wird nach drei aufeinanderfolgenden Milchabnahmen am Nachmittag mit einer Dosis von 100 mg als Infusion in das Euter aus Vierteln von Milchvieh verabreicht, die mit S. aureus infiziert sind. Ähnlich kann ein Antibiotikum mit Dosen im Bereich von 1 ug bis 200 mg verabreicht werden, 200 mg Natriumcephapirin in Kochsalzlösung als Infusion in den Euter nach drei aufeinanderfolgenden Milchabnahmen am Nachmittag werden bevorzugt. Der Chemoattraktor, LPS (1 ug x 3) als Repräsentant von Chemoattraktoren/Chemoaktivatoren vom Typ der Klasse I und ZACS (100%ig, 10 ml x 3) als Repräsentant von Chemoattraktoren vom Typ der Klasse II werden verwendet. Die Kombination des bakteriziden Enzyms Lysostaphin und des Chemoattraktors der Klasse II verbessert die therapeutische Wirksamkeit von Lysostaphin allein nicht und kann sogar dessen Wirksamkeit behindern (37,5% Heilungen gegenüber 12,5% Heilungen), Tabelle VI. Im Gegensatz dazu steigert der Chemoattraktor/Chemoaktivator LPS der Klasse I die Zahl der Heilungen von 19,4% auf 33,3%. Die Kombination des Chemoattraktors/Chemoaktivators der Klasse I mit Antibiotikum und einem bakteriziden Enzym steigert die Heilungen von 19,4% auf 50%. TABELLE VI KOMBINATIONSTHERAPIE MIT LYSOSTAPHIN UND CHEMOAKTIVATOR DER KLASSE I (ZACS) Behandlung Viertel % Heilungen (Zahl) Zahl der freien Milchabnahmen ± SD¹ Lysostaphin
  • ¹ Zahl bedeutet die gemittelten Male von S. aureus-freien Milchabnahmen +/- Standardabweichung, SD.
  • ² Die Behandlung verwendet 10 ml Zymosan-aktiviertes Kuhserum, ZACS, die bei drei aufeinanderfolgenden Morgen-Milchabnahmen infundiert wurden. Diese Dosis ruft innerhalb von 24-72 Stunden einen signifikanten quantitativen Einstrom somatischer Zellen in normalen Tieren hervor.
  • ³ Die Behandlung verwendet 100 mg rekombinantes Lysostaphin, die bei drei aufeinanderfolgenden Nachmittag-Milchabnahmen infundiert wurden.
  • &sup4; bei der Kombinationstherapie mit Zymosan (10 ml) und rekombinantem Lysostaphin (100 mg) wird Zymosan bei drei aufeinanderfolgenden Morgen-Milchabnahmen infundiert, während rekombinantes Lysostaphin bei drei aufeinanderfolgenden Nachmittag-Milchabnahmen infundiert wird. TABELLE VII THERAPEUTISCHE SYNERGIE VON BAKTERIZIDEN MITTELN UND CHEMOAKTIVATOREN Behandlung Zahl der Viertel % Heilungen (Zahl) Freie Milchabnahmen ± SD¹ Lysostaphin&sub2; (Kochsalzlösung)² Lysostaphin + LPS³ Lysostaphin/Cephapirin + LPS Penicillin (Kochsalzlösung) Cephapirin (Kochsalzlösung)
  • ¹ Zahl bedeutet die gemittelten Male von S. aureus-freien Milchabnahmen +/- Standardabweichung, SD.
  • ² Die Behandlung verwendete 100 mg rekombinantes Lysostaphin, die bei drei aufeinanderfolgenden Nachmittag-Milchabnahmen infundiert wurden.
  • ³ Die Behandlung verwendet 1 ug Lipopolysaccharid, LPS, das bei drei aufeinanderfolgenden Morgen-Milchabnahmen infundiert wurde. Diese Dosis ruft innerhalb von 24-72 Stunden einen signifikanten quantitativen Einstrom somatischer Zellen in normalen Drüsen hervor.
  • &sup4; Bei der Kombinationstherapie mit LPS (10 ml) und rekombinantem Lysostaphin (100 mg) wird LPS bei drei aufeinanderfolgenden Morgen-Milchabnahmen infundiert, während rekombinantes Lysostaphin bei drei aufeinanderfolgenden Nachmittag-Milchabnahmen infundiert wird.

Claims (2)

1. Verwendung von Lipopolysaccharid oder Interleukin-2 oder Lipopolysaccharid in Verbindung mit Lysostaphin oder Cephapirin als Phagozyten-aktivierendes Mittel für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhütung einer Staphylococcus aureus-Infektion bei Kühen, worin besagtes Phagozytenaktivierendes Mittel eine verstärkte und anhaltende Aktivierung von Phagozyten-Zellen hervorruft.
2. Verwendung nach Anspruch 1, bei der die Staphylococcus aureus-Infektion Mastitis ist.
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