DE60024967T2

DE60024967T2 - Chaperonin 10 und beta-interferon therapie für multiple sklerose

Info

Publication number: DE60024967T2
Application number: DE60024967T
Authority: DE
Inventors: Halle Coorparoo Brisbane MORTON; Alice Mitchelton Brisbane CAVANAGH
Original assignee: University of Queensland UQ
Current assignee: University of Queensland UQ
Priority date: 1999-01-20
Filing date: 2000-01-20
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2020-01-21
Also published as: AU771867B2; PT1150703E; WO2000043033A1; KR20020002376A; JP2002535286A; AUPP823999A0; DE60024967D1; CA2361081C; EP1150703B1; CA2361081A1; JP4691257B2; ES2255484T3; KR100694011B1; EP1150703A4; ATE313332T1; DK1150703T3; AU2527100A; US20090214473A1; EP1150703A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Behandlung von multipler Sklerose unter Anwendung einer Kombinationstherapie mit cpn10 und β-Interferon. Diese Erfindung betrifft außerdem eine pharmazeutische Zusammensetzung und ein Set, die cpn10 und β-Interferon umfassen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Multiple Sklerose (MS) ist die häufigste Autoimmunerkrankung des Nervensystems, an der in den Vereinigten Staaten etwa 1 von 250.000 Personen leidet. Klinisch gesehen ist MS durch eine verstreute Demyelinierung des Zentralnervensystems (ZNS) gekennzeichnet, die zu Schwäche, Parästhesien, Sensibilitätsverlust und im Allgemeinen verringerter Kontrolle über neuromuskuläre Funktionen führt.
Interferon-β (IFN-β)
IFN-β ist ein antivirales und antineoplastisches Zytokin, das von Fibroblasten als Reaktion auf virale Stimulation produziert wird. Es dient als Immunsystemmodulator und stellt die einzige Behandlung dar, die zu einer wesentlichen Veränderung des natürlichen Verlaufs von MS in einem angemessen kontrollierten klinischen Versuch geführt hat (The IF-β Multiple Sclerosis Study Group, Neurology 43, 655–61 (1993)). Aus dieser Studie war jedoch ersichtlich, dass zwar die hohe Dosis IF-β (Injektionen von 8 Millionen internationalen Einheiten (MIU) jeden zweiten Tag) gut vertragen wurde und sich positiv auf den Verlauf von MS mit Rückfällen und Remissionen auswirkte, aber nur teilweise wirksam war. Die Patienten erlitten weiterhin Exazerbationen, wenn auch weniger häufig und mit relativ geringer klinischer Schwere. Diese Dosis konnte jedoch nicht erhöht werden, da eine frühe Pilotstudie zeigte, dass die Verabreichung von höheren Dosen (16 MIU) dreimal pro Woche zu unakzeptabler Toxizität führten. Nach der Verabreichung der beiden Dosen (1,6 und 8 MIU), die im oben genannten klinischen Versuch verwendet wurden, war die Inzidenz von erkennbaren Nebenwirkungen gering.
Die häufigste Laboranomalität in Zusammenhang mit einer IFN-β-Behandlung war Lymphopenie, die nicht mit signifikanten Änderungen der Gesamtanzahl an weißen Blutkörperchen zusammenhängt. Weitere auftretende Nebenwirkungen waren influenzaähnliche Symptome und Reaktionen an der Injektionsstelle. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass IFN-β die Proliferation von mitogenstimulierten mononukleären Zellen des peripheren Bluts sowohl bei MS-Patienten als auch bei gesunden Individuen effektiv hemmen kann. Diese antipraliferative Wirkung wurde auf eine verringerte IL-2R-Expression zurückgeführt (Rudick et al., Neurology 43, 2080–8 (1993)).
Es wurden umfassende Studien an Laborratten und -mäusen durchgeführt, um die Wirkung von IFN-β als Behandlung von experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) zu untersuchen. EAE ist das beste derzeit verfügbare Tiermodell für MS, und es handelt sich dabei um eine CD4⁺-T-Zellen-vermittelte inflammatorische Demyelinierungserkrankung des ZNS in Nagetieren (Pettinelli & McFarlin, J. Immunol. 127, 1420–3 (1981)). EAE kann durch Inokulation von anfälligen Tiere mit ZNS-Antigenen (basisches Myelinprotein, Myelin-Proteolipidprotein, Myelin-Oligodendrozytenglykoprotein) und Adjuvantien induziert werden. Die Entwicklung von Anzeichen von EAE hängt mit der Infiltration des Nervensystems durch T-Lymphozyten und Makrophagen zusammen (Raine, Lab. Invest. 50, 608–35 (1984)). Während einer spontanen Erholung von EAE nimmt die Anzahl an inflammatorischen Zellen im Nervensystem ab (McCombe et al., J. Neurol. Sci. 113, 177–86 (1992)), teilweise aufgrund der Apoptose von T-Lymphozyten und Makrophagen im Zentralnervensystem (Tabi et al. Eur. J. Immunol. 24, 2609–17 (1994); McCombe et al., J. Neurol. Sci. 139, 1–6 (1996)). Eine Genesung von EAE hängt auch mit der Produktion von herabregulierenden Zytokinen, wie z.B. IL-10 und TGF-β, zusammen (Kennedy et al., J. Immunol. 149, 2496–2505 (1992)).
In Studien von Ruuls et al., J. Immunol. 157, 5721–31 (1996) wurde EAE in Ratten durch Inokulation mit einem synthetischen MBP-Peptid, Reste 63–88, induziert. Eine Behandlung dieser Ratten mit rekombinantem Ratten-IFN-β (3 × 10⁵ U/Tag s.c.) von Tag 8 bis Tag 17 nach der Inokulation schützte diese Tiere vollständig vor einer Erkrankung während der Behandlungsdauer. Mit der Einstellung der Behandlung entwickelten die meisten Tiere jedoch einen ausgedehnten und remittierenden Krankheitsverlauf mit stark erhöhter Schwere. Wenn die Behandlung bis zum Tag 26 fortgesetzt wurde, erlitten die Tiere keinen Rückfall nach Beendigung der Behandlung. Diese Ergebnissen lassen darauf schließen, dass eine Beendigung der Behandlung während der Erholungsphase von EAE mit einem raschen Ausbruch einer ernsten paralytischen Erkrankung zusammenhängt.
Eines der charakteristischen Merkmale von EAE ist ein progressiver Gewichtsverlust während der klinischen Phase der Erkrankung, die rasch umgekehrt wird, wenn die Tiere genesen (Ruuls et al., w.o. (1996)). Eine Behandlung mit IFN-β von Tag 8 bis Tag 26 hemmte den Gewichtsverlust im Vergleich zur Kontrollgruppe. Nach der Behandlung wiesen jedoch alle Tiere eine Wachstumsverzögerung auf, die etwa 25 Tage nach der Inokulation erkennbar wurde. Das Unvermögen, an Gewicht zuzulegen, erwies sich ebenfalls als eine der häufigsten und dosisbeschränkenden Nebenwirkungen bei Patienten während einer IFN-β-Behandlung von verschiedenen Krankheiten.
Unter Verwendung eines Mausmodells für EAE bestimmten Yu et al., J. Neuroimmunol. 64, 91–100 (1996) die Wirkung einer Behandlung mit Maus-IFN-β auf den Verlauf von EAE in (SWR × SJL)F₁-Mäusen, gefolgt von einer Immunisierung mit dem immundominanten Myelin-Proteolipidprotein-(PLP-)Peptid p139–151. Es zeigte sich eine deutliche Verringerung des mittleren neurologischen Defizits, eine signifikante Verzögerung des Exazerbationsbeginns und der Exazerbationsgeschwindigkeit und eine Verringerung an DTH. Eine IFN-β-Behandlung führte zu einer langfristigen Verbesserung des mittleren klinischen Werts und zu einer klaren histopathologischen Besserung und Verzögerung des Fortschreitens der Behinderung. In vitro hemmte IFN-β die Proliferation von determinantengeprimten Lymphknotenzellen auf dosisabhängige Weise. Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass eine klare histopathologische Besserung in den IFN-β-behandelten Mäusen erkennbar war, dass die Besserung aber weit von einer Heilung entfernt war. Eine ähnlich signifikante aber bescheidene langfristige therapeutische Wirkung auf die Schwere und Inzidenz von ZSN-Entzündungen wurde in Bezug MS-Patienten beschrieben (IFN-β Multiple Sclerosis Study Group (1993)).
Früher Schwangerschaftsfaktor (EPF)
EPF wurde das erste Mal in Morton et al., Nature 249, 459–60 (1974) und Morton et al., Proc. R. Soc. Lond. 193, 413–9 (1976) beschrieben.
EPF tritt innerhalb von 6–24 h nach der Befruchtung im mütterlichen Serum auf, ist in allen untersuchten Spezies zumindest während der ersten Hälfte der Schwangerschaft vorhanden und entscheidend für ein anhaltendes embryonales Wachstum und Überleben (Morton et al., Current Topics in Developmental Biology 23, 73–92 (1987)); Athanasas-Platsis et al., J. Reprod. Fert. 87, 495–502 (1989); Athanasas-Platsis et al., J. Reprod. Fert. 92, 443–51 (1991)). Der EPF ist auch ein autokriner Überlebensfaktor für Tumorzellen (Quinn et al., Clin. Exp. Immunol. 80, 100–8 (1990); Quinn & Morton, Cancer Immunol. Immunother. 34, 265–71 (1992)) und für die Regeneration von Leberzellen nach einer partiellen Hepatektomie (Quinn et al., Hepatology 20, 1294–302 (1994)). Wie viele andere Wachstumsfaktoren ist EPF in Blutplättchen vorhanden, was vermuten lässt, dass er eine physiologische Rolle bei der Wundheilung spielt (Cavanagh & Morton, Eur. J. Biochem. 222, 551–60 (1994)).
EPF weist außerdem immunmodulatorische Eigenschaften auf. Dies wurde zum ersten Mal vorgeschlagen, als sich zeigte, dass EPF in der Lage ist, die Rosetteninhibitionseigenschaften eines immunsuppressiven Antilymphozytenserums (Morton et al., w.o. (1974); Morton et al., w.o. (1976)) und von Anti-CD4-Antikörpern, nicht aber Anti-CD8-Antikörpern, (Morton et al., Pregnancy Proteins, 391–405 Hrsg. B. Grud zinskas, B. Teisner, M. Seppala, Academic Press, Sydney (1982)) zu verstärken. Weitere Studien zeigten, dass EPF die Reaktion der Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ (DTH) auf Trinitrochlorbenzol (TNCB) in Mäusen supprimieren kann (Noonan et al., Nature 278, 649–51 (1979), mitogeninduzierte Lymphozytenproliferation supprimieren kann (Athansas-Platsis, PhD Thesis, The University of Queensland (1993)) und die IFN-γ-Produktion durch EPF-bindende T-Zellen supprimieren kann. Die immunsuppressive Wirkung von EPF wird durch die sequenzielle Induktion von Suppressorfaktoren und/oder Lymphokinen vermittelt. EPF bindet an CD4+-T-Zellen, die sequenziell zwei genetisch eingeschränkte Suppressorfaktoren, EPF-S₁ und EPF-S₂, freisetzen (Rolfe et al., Clin. Exp. Immunol. 73, 219–25 (1988); Rolfe et al., Immunol. Cell Biol. 67, 205–8 (1989)). Während EPF in seiner Wirkung weder durch die Spezies noch durch den Stamm eingeschränkt ist, ist die EPF-S₁-Aktivität auf die I-Region des Maus-MHC und HLA-DR in Menschen eingeschränkt, während die EPF-S₂-Wirkung auf die Igh-Region begrenzt ist.
Chaperonin 10
Eine Aminosäuresequenzierung von EPF, der aus menschlichen Blutplättchen gereinigt worden war (Cavanagh & Morton, w.o. (1994)), zeigte, dass er gemeinsame Aminosäuresequenzen mit Chaperonin 10 (cpn10), einem Mitglied der Hitzeschockfamilie von Proteinen, aufweist (Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3394–8 (1992)). EPF und cpn10 scheinen somit Homologe zu sein. Cphn10 ist in verschiedenen Organismen von Bakterien bis zum Menschen vorhanden. Die Struktur von cpn10 ist unter verschiedenen Säugetierspezies sehr ähnlich, zwischen Bakterien und Säugetieren jedoch weniger. Cpn10 ist in Mitochondrien vorhanden, wo es eine Rolle bei der Proteinfaltung spielt (Ellis & van der Vies, Annu. Rev. Biochem. 60, 321–47 (1991)), und wie andere Hitzeschockproteine wird zelluläres cpn10 während eines zellulären Stresses hinaufreguliert.
Wie EPF ist cpn10 aktiv in Rosetteninhibitionstests und weist eine immunsuppressive Aktivität auf, wie durch eine Verlängerung der Lebensfähigkeit von allogenen Hauttransplantaten in Ratten belegt wurde. In Bezug auf EAE wird auf die Internationale Veröffentlichung Nr. WO95/15338 verwiesen, worin nachgewiesen wurde, dass cpn10 den Ausbruch von EAE verzögert und die klinischen Merkmale der Krankheit in Rattenmodellen modifiziert.
Somit ist aus der Literatur ersichtlich, dass sowohl cpn10 als auch IFN-β immunsuppressiv sind.
ZIEL DER ERFINDUNG
In nachfolgenden Experimenten verglichen die Erfinder cpn10 und IFN-β in Bezug auf die Behandlung von EAE in Mäusen und machten die überraschende Entdeckung, dass cpn10 und IFN-β über verschiedene Mechanismen wirken. Als Ergebnis dieser Entdeckung wurde nun erkannt, dass cpn10 und IFN-β zusammenwirken können, um eine verbesserte Behandlung von EAE bereitzustellen. Daraus lässt sich folgern, dass cpn10 und IFN-β zusammenwirken können, um einen verbesserte Behandlung von MS in Menschen zu ermöglichen.
Deshalb besteht ein Ziel der Erfindung in der Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von multipler Sklerose (MS) und ihre Verwendung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein erster Aspekt der Erfindung ist in Anspruch 1 dargelegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Erfindung verwendet, um einen Rückfall von MS zu unterbinden.
In einem zweiten Aspekt wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von MS bereitgestellt, die eine pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β und ein(en) pharmazeutisch annehmbaren/s Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
In einem dritten Aspekt wird ein Set bereitgestellt, das eine pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β und ein(en) pharmazeutisch annehmbaren/s Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Vorzugsweise liegt das IFN-β in dehydratisierter Form vor, die bei Verwendung durch den/das pharmazeutisch annehmbare(n) Träger oder Verdünnungsmittel rehydratisiert wird.
In einer Ausführungsform liegt das cpn10 in dehydratisierter Form vor und wird bei Verwendung durch den/das pharmazeutisch annehmbare(n) Träger oder Verdünnungsmittel rehydratisiert.
In einer weiteren Ausführungsform liegt das cpn10 in Form von Tabletten oder Kapseln vor.
Gemäß den oben genannten Aspekten umfasst die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 5–60 mg cpn10.
Noch bevorzugter umfasst die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 10–30 mg cpn10.
Vorzugsweise umfasst die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 1–10 MIU IFN-β.
Noch bevorzugter umfasst die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 4–6 MIU IFN-β.
In der gesamten Beschreibung und in den nachfolgenden Ansprüchen schließen die Begriffe „umfasst" und „umfassen" die Grenzen mit ein, sodass eine angeführte ganze Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen eine oder mehrere nicht angeführte ganze Zahl oder Gruppen von ganzen Zahlen einschließen kann.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN UND TABELLEN
1 EAE-Ratten intraperitoneal verabreichtes rekombinantes cpn10, beginnend mit dem Tag der Inokulation mit MBP. Die Werte stellen Mittelwerte ± mittlerer Standardfehler (SEM) dar. Eine cpn10-Behandlung verringerte den Gesamtwert der Behinderung deutlich (p = 0,001; Mann-Whitney-Rangsummentest, Sigma Stat 2.0, Jandel Scientific).
2 EAE-Ratten oral verabreichtes rekombinantes cpn10, beginnend mit dem Tag der Inokulation mit MBP. Die Werte stellen Mittelwerte ± mittlerer Standardfehler (SEM) dar. Eine cpn 10-Behandlung verringerte den Gesamtwert der Behinderung deutlich (p = 0,005; Mann-Whitney-Rangsummentest, Sigma Stat 2.0, Jandel Scientific).
3 EAE-Ratten intraperitoneal (i/p) oder oral (O/F) verabreichtes rekombinantes cpn10 pGEX, beginnend mit dem Tag der Inokulation mit MBP. Die Werte stellen den % Gewichtsverlust pro Gruppe dar (verglichen mit dem Gewicht am Tag 10).
4 Reaktion der Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ (DTH) auf MBP in Ratten, denen rekombinantes cpn10 intraperitoneal (ip) oder oral verabreicht worden war oder die mit einem Kontrollvehikel behandelt wurden, beginnend mit dem Tag der Inokulation mit MBP. Vier Gruppen von Ratten (n = 4 pro Gruppe) wurde am Tag 0 MBP inokuliert, und von Tag 0 bis 16 erhielten sie täglich cpn10 (50 μg/Ratte) durch orale Fütterung (O/F; Gruppe 2) oder ip (Gruppe 3) oder Vehikel alleine ip (Gruppen 1 und 4). Am Tag 15 wurde die Ohrdicke beider Ohren der Ratten gemessen, dann wurden in den Gruppen 2–4 20 μg MBP in 10 μl Kochsalzlösung in den Ansatz beider Ohren injiziert. Gruppe 1 wurde eine Kochsalzlösung injiziert. Nach 24 h wurden wieder beide Ohren gemessen und die Schwellung der Ohren durch Subtraktion bestimmt. *** p < 0,001; ** p = 0,003 verglichen mit Gruppe 4 (Student-t-Test).
5 Wirkung von Ratten (n = 3) täglich i.p. oder oral verabreichtem rekombinantem cpn10, beginnend mit dem Tag der Inokulation mit MBP (Tag 0), auf die Leukozytengesamtzahl und das Leukozytendifferentialbild. Die Zahlen (angegeben mit Standardabweichungen) wurden am Tag 16 erhalten.
6 Suppression von MBP-stimulierter Lymphozytenproliferation in vitro durch rekombinantes cpn10. Die Lymphozyten wurden gewonnen, indem Lymphknoten von Ratten 10 Tage nach einer Inokulation mit MBP drainiert wurden. Verdünnungen von cpn10 wurden hergestellt, um bestimmte Endkonzentrationen auf der Platte zu erhalten, und 100 μl in Dreifachansätzen abgegeben. Zu jedem Well wurden 50 μl gewaschene Lymphozyten (4 × 10⁶/ml) und 50 μl MBP (80 μg/ml) zugesetzt. Kontrollwells enthielten entweder: a) Zellen mit MBP, kein cpn10 oder b) Zellen ohne MBP, kein cpn10. Die Platten wurden 72 h lang inkubiert und während der letzten 18 h mit 0,5 μCi [Methyl-³H]-Thymidin gepulst. Die Proliferation wurde durch die Messung inkorporierter Radioaktivität (cpn + Standardabweichungen) in Zellen, die mit oder ohne cpn10 inkubiert worden waren, bestimmt. *** p < 0,001; ** p = 0,005 (Student-t-Test).
7 Verringerung des mittleren Behinderungswerts von EAE in SJL-Mäusen, die mit rekombinantem cpn10 behandelt wurden, im Vergleich zu Mäusen, die mit einem Vehikel alleine behandelt wurden. EAE wurde in Mäusen (n = 10 pro Gruppe) mit einem PLP-Peptid p139–151 induziert, und cpn10 (10 μg/Maus/48 h oder 2,5 μg/Maus/48 h) oder Vehikel alleine wurden von Tag 0 bis Tag 20 ip verabreicht. Vom Tag 8 an wurden klinische Anzeigen täglich überwacht, und die Gesamtbehinderung jeder Maus wurde aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind als mittlerer Behinderungswert/Gruppe ausgedrückt.
8 Mittlerer Behinderungswert von PLP-EAE in SJL/J-Mäusen (± SEM), die mit a) rekombinantem cph10 (rcpn10) oder rcpn10 + IFN-β oder b) IFN-β oder rpcn10 + IFN-β behandelt wurden im Vergleich zu Mäusen, die mit einem Vehikel alleine behandelt wurden. EAE wurde durch Inokulation mit einem PLP-Peptid am Tag 0 induziert, und die Mäuse (n = 10/Gruppe) erhielten a) rcpn10 (2,5 μg/Maus) ip jeden zweiten Tag von Tag 0 bis Tag 20 oder b) IFN-β (5 × 10³ Einheiten/Maus) sc jeden zweiten Tag von Tag 10 bis Tag 20 oder eine Kombination aus beiden. Kontrollmäuse erhielten nur Vehikel. Von Tag 8 bis Tag 60 wurden klinische Symptome täglich überwacht, und der mittlere Behinderungswert jeder Gruppe wurde aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind als mittlerer Behinderungswert pro Gruppe ausgedrückt.
9 Mittlerer Gesamtbehinderungswert (±SEM) von PLP-EAE in SJL/J-Mäusen, die mit rekombinantem cpn10, IFN-β oder einer Kombination aus beiden behandelt wurden, während des ersten Ausbruchs und einer Rückfallperiode. EAE wurde durch Inokulation mit einem PLP-Peptid am Tag 0 induziert, und die Mäuse wurden mit rcpn10 ip (2,5 μg/Maus jeden zweiten Tag von Tag 0 bis Tag 20), IFN-β sc (5.000 Einheiten/Maus jeden zweiten Tag von Tag 10 bis Tag 20) oder einer Kombination von beiden behandelt. Kontrollmäuse erhielten nur Vehikel. Klinische Symptome wurden von Tag 8 bis Tag 21 und von Tag 22 bis Tag 60 überwacht. Eine Kombinationsbehandlung mit rcpn10 und IFN-β supprimierte die Entwicklung einer Behinderung während des ersten Ausbruchs im Vergleich zur Kontrollgruppe (*p = 0,050) deutlich, wie auch rcpn10 oder rcpn10 + IFN-β während der Rückfallperiode (**p = 0,030, ***p = 0,014).
10 Schnitte des Sakralmarks von (A) einer Kontrollmaus und (B) einer Maus, die mit rekombinantem cpn10 behandelt worden war (2,5 μg/Maus, ip jeden zweiten Tag von Tag 0 bis Tag 20), die am Tag 14 entnommen wurden. In der Kontrollmaus (A) waren eine Entzündung (großer Pfeil) und auffallende Demyelinierungsbereiche (kleine Pfeile) vieler Fasern zu erkennen. IN der cpn10-behandelten Maus (B) war eine Entzündung (großer Pfeil) in den subpialen Regionen vorhanden, mit wenig erkennbarer Demyelinierung.
11 Suppression von MBP-stimulierter Lymphozytenproliferation in vitro durch rcpn10, synthetisches cpn10 (scpn10) und IFN-β. Lymphozyten wurden gewonnen, indem Lymphknoten von Ratten 10 Tage nach einer Inokulation mit MBP drainiert und mit MVP (20 μg/ml) und rcpn10, scpn10 und IFN-β in den angeführten Konzentrationen inkubiert (2 × 10⁵ Zellen) wurden. Kontrollwells enthielten entweder: a) Zellen mit MBP, kein cpn10 oder b) Zellen ohne MBP, kein cpn10. Die Platten wurden 3 Tage lang inkubiert und während der letzten 18 h mit 0,5 μCi [Methyl-³H]-thymidin gepulst. Die Proliferation wurde durch in die Zellen inkorporierte Radioaktivität bewertet und als Stimulationsindex (Mittel der Wells mit MBP/Mittel der Wells ohne MBP; Standardabweichungen sind angegeben) ausgedrückt. Die Ergebnisse in Wells mit cpn10 oder IFN-β wurden mit jenen in Wells ohne cpn10 oder IFN-β verglichen. ***p < 0,001, *p = 0,05 (Student-t-Test).
12 Aktivität von IFN-β, synthetischem cpn10 (scpn10) und rekombinantem cpn10 (rcpn10) im Rosetteninhibitionstest. Cpn10-Präparate (50 μg(ml) und IFN-β (0,5 μg/ml) wurden 10fach verdünnt und der Rosetteninhibitionstiter jeder Verdünnung wurde bestimmt. Die Grenzdosis (log der reziproken Probenverdünnung; Standardabweichung ist angegeben) wurde als höchste Verdünnung einer Probe bestimmt, die im Test zu einem positiven Ergebnis führt.
TABELLE 1
Liste von IFN-β-Präparaten, die derzeit bei der Behandlung von MS eingesetzt werden. sc = subkutane Injektion; im = intramuskuläre Injektion.
TABELLE 2
Eine Behandlung mit rekombinantem cpn10 verringert den mittleren klinischen Gesamtwert von MBP-EAE in Lewis-Ratten. Die Ratten wurden in einem hinteren Fußballen am Tag 0 mit MBP inokuliert. Cpn10 oder Vehikel alleine wurden in den angegebenen Zeitintervallen intraperitoneal (ip) oder oral (7 Ratten pro Gruppe) verabreicht, beginnend mit Tag 0 bis Tag 17. Klinische Symptome wurden täglich von Tag 10 bis Tag 20 aufgezeichnet (siehe Verfahren), und die Untersuchung dieser Gruppen wurde bis Tag 35 fortgesetzt (mit * angezeigt) und der mittlere klinische Wert pro Ratte wurde für jede Gruppe bestimmt. Der mittlere klinische Gesamtwert pro Ratte in der Testgruppe wurde mit dem mittleren klinischen Gesamtwert pro Ratte in der Gruppe verglichen, die in einem gleichzeitigen Test nur das Vehikel erhielten (Mann-Whitney-Rangsummentest).
TABELLE 3
Eine Behandlung mit rcpn10 verringert den Gesamtbehinderungswert von PLP-EAE in SJL/J-Mäusen. EAE wurde in SJL/J-Mäusen mit einem PLP-Peptid 139–151 induziert (Greer et al., J. Immunol. 156, 171–179 (1996). Mäuse (10 pro Gruppe) wurden mit rcpn10 oder einem Vehikel behandelt und von Tag 8 bis Tag 42 oder Tag 60 klinisch bewertet. Die Ergebnisse wurde als mittlerer Gesamtbehinderungswert/Maus über den Untersuchungszeitraum der rcpn10-Behandlungsgruppe aufgezeichnet und mit denen der Gruppe verglichen, die nur das gleichzeitig getestete Vehikel erhielten (Mann-Whitney-Rangsummentest).
TABELLE 4
Kombinationsbehandlung mit rekombinantem cpn10 (rcpn10) und IFN-β verringerte den klinischen Gesamtwert von PLP-EAE in SJL/J-Mäsuen. EAE wurde in SJL/J-Mäusen mit einem PLP-Peptid 139–151 induziert. Mäuse (n = 10 pro Gruppe) wurden mit rcpn10, IFN-β oder beidem zusammen oder mit einem Vehikel alleine behandelt, wie oben beschrieben wurde. Die Mäuse wurden von Tag 8 bis Tag 60, von Tag 8 bis Tag 21 und von Tag 22 bis Tag 60 klinisch beurteilt. Die Ergebnisse wurden als mittlere klinische Gesamtwerte pro Maus in jeder Gruppe über den Untersuchungszeitraum aufgezeichnet. Die Ergebnisse in den rcpn10-, IFN-β- und rcpn-10 + IFN-β-Behandlungsgruppen wurden mit jenen der Gruppe verglichen, die nur das gleichzeitig getestet Vehikel erhielten (Mann-Whitney-Rangsummentest).
TABELLE 5
Prävention von antigeninduziertem anaphylaktischem Tod in SJL/J-Mäusen. EAE wurde in 4 Gruppen von SJL/J-Mäsuen mit einem PLP-Peptid 139–151 am Tag 0 induziert. Am Tag 0 erhielten die Gruppen 1 und 2 2,5 μg cpn10 pro Maus/48 h ip, während die Gruppen 3 und 4 nur Vehikel erhielten. Am Tag 10 erhielten Gruppe 1 und Gruppe 3 0,5 × 10⁴ Einheiten Maus-IFN-β in PBS/0,1% BSA, und Gruppe 2 und Gruppe 4 erhielten PBS/BSA. Von Tag 8 an wurden die Mäuse täglich gewogen und auf klinische Symptome von EAE untersucht. Die Daten geben die Anzahl an Mäusen in jeder Gruppe an, die 8 bis 12 Tage nach Beginn der Behandlung mit IFN-β in PBS/0,1% BSA oder PBS/BSA alleine starben, und zwar als Anteil der gesamten Mäuse in den jeweiligen Gruppen. Ein statistischer Vergleich der Todesrate zwischen den Gruppen 1 und 2 einerseits und den Gruppen 3 und 4 andererseits unter Verwendung der Chi-Quadrat-Analyse ergab einen p-Wert < 0,02.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie erkennbar ist geht die vorliegende Erfindung zumindest teilweise aus der Entdeckung der Erfinder hervor, dass cpn10 und IFN-β über verschiedene Mechanismen wirken und gemeinsam EAE-Symptome bei Mäusen und Ratten lindern. Im Speziellen wies eine Kombinationsbehandlung mit IFN-β und cpn10 eine deutlich stärkere Fähigkeit auf, einen EAE-Rückfall nach Beendigung einer Behandlung zu verhindern. Demgemäß hat diese Entdeckung Auswirkungen auf die Behandlung von MS bei Menschen, da EAE das beste experimentelle Tiermodell für menschliche MS ist.
In diesem Zusammenhang ist die Verabreichung von IFN-β eine allgemein bekannte Behandlungsmöglichkeit von MS, führt aber zu Nebenwirkungen, insbesondere bei höheren Dosen von IFN-β. Somit stellt die vorliegende Erfindung eine Kombinationstherapie bereit, worin cpn10 und IFN-β Krankheitssymptome stärker lindern als IFN-β alleine, wodurch die Notwendigkeit aufgehoben wird, IFN-β in Dosen zu verabreichen, die zu Nebenwirkungen führen. Außerdem sollte darauf hingewiesen werden, dass IFN-β solche eine unabdingbare Behandlung für MS geworden ist, dass eine Kombinationstherapie unter Verwendung von cpn10 und IFN-β äußerst attraktiv ist, da Patienten ihre IFN-β-Behandlung nicht absetzen müssen oder diese mit geringerer Wahrscheinlichkeit eines MS-Rückfalls absetzen können.
Ein erster Aspekt der Erfindung ist in Anspruch 1 dargelegt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Erfindung verwendet, um einen Rückfall von MS zu unterbinden.
„MS-Rückfall" bezieht sich hierin auf das Wiederauftreten von MS-Symptomen nach der Erholung von einem ersten Ausbruch. Ein MS-Rückfall kann beispielsweise vorkommen, wenn eine Person die IFN-β-Therapie absetzt oder die Menge an IFN-β aufgrund des Risikos oder Auftretens von Nebenwirkungen verringert wird. Das Verfahren der Erfindung kann einen MS-Rückfall verhindern, indem das Wiederauftreten von MS-Symptomen verzögert wird oder die Schwere der Symptome verringert wird.
Eine „pharmazeutisch wirksame Menge" bezieht sich hierin auf eine Menge eines Medikaments oder Arzneimittels, beispielsweise cpn10 und IFN-β, die bei Verabreichung an ein Individuum Krankheitssymptome bei diesem Individuum verhindert, lindert, verringert oder auslöscht und/oder die Schwere oder Dauer der Krankheitssymptome verringert. Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung auch die Verabreichung von cpn10 und IFN-β in Mengen umfasst, bei denen cpn10 oder IFN-β allein nicht wirksam oder suboptimal wären, in Kombination aber pharmazeutisch wirksam sind.
Vorzugsweise umfasst die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 5–60 mg cpn10.
Noch bevorzugter umfasst die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 10–30 mg cpn10.
Vorzugsweise umfasst die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 1–10 Millionen internationale Einheiten (MIU) IFN-β.
Noch bevorzugter umfasst die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 4–6 MIU IFN-β.
Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden erkennen, dass die oben genannten pharmazeutisch wirksamen Mengen in Bezug auf eine repräsentative Person mit 70 kg berechnet wurden. Demgemäß können die Dosen je nach Körpergewicht, Alter, Geschlecht, allgemeinem Gesundheitszustand und körperlicher Verfassung der Person und anderen Behandlungen, denen die Person unterzogen wird, variieren. Außerdem hängt die Menge an cpn10 und IFN-β, die verabreicht wird, mit der Häufigkeit und der zeitlichen Einteilung der Verabreichungen zusammen.
In diesem Zusammenhang wird davon ausgegangen, dass die Häufigkeit und zeitliche Einteilung der Verabreichungen von cpn10 und IFN-β variieren kann. Demgemäß ist klar, dass der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung zwei Behandlungsmodi umfasst:

(i) eine Kombinationsbehandlung mit IFN-β und cpn10, worin die beiden zu unterschiedlichen Zeitpunkten und/oder mit unterschiedlicher Häufigkeit verabreicht werden; und
(ii) Behandlungen, bei denen IFN-β und cpn10 gemeinsam verabreicht werden.

Vorzugsweise wird cpn10 täglich verabreicht, obwohl auch eine Verabreichung auf weniger häufiger Basis (z.B. zwei- oder dreimal wöchentlich) möglich ist.
Wie nachstehend erläutert wird IFN-β üblicherweise einmal wöchentlich oder dreimal wöchentlich verabreicht, je nach IFN-β-Quelle. Solche Verabreichungshäufigkeiten können aufrecht erhalten werden, egal wie oft cpn10 verabreicht wird. Vorzugsweise werden IFN-β und cpn10 jedoch täglich gemeinsam verabreicht. Letzterer Verabreichungsmodus ist vor allem dann geeignet, wenn cpn10 und IFN-β in der genannten pharmazeutischen Zusammensetzung zur subkutanen oder intramuskulären Injektion kombiniert sind.
In einer Ausführungsform ist IFN-β durch subkutane oder intramuskuläre Injektion zu verabreichen.
Cpn10 wird vorzugsweise in gereinigter rekombinanter synthetischer Form bereitgestellt. Alternativ dazu kann cpn10 durch chemische Synthese hergestellt werden. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung werden jedoch verstehen, dass die chemische Synthese aufgrund der Größe von cpn10 eine weniger bevorzugte Option ist.
Hierfür geeignete cpn10-Nucleotid- und -Aminosäuresequenzen sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt, der Einfachheit halber seien Fachleute aber auf die folgenden Säugetier-cpn10-Sequenzen verwiesen:

(i) Human-cpn10 (NCBI Entrez Zugangsnr. UO7550; Chem et al., Biochim. Acta 1219, 189–190 (1994));
(ii) Maus-cpn10 (NCBI Entrez Zugangsnr. UO9659; Dickson et al., J. Biol. Chem. 269, 26858–864 (1994)); und
(iii) Ratten-cpn10 (NCBI Entrez Zugangsnr. X71429; Ryan et al., FEBS Lett. 337, 152–156 (1994)).

Ein Beispiel für die Herstellung und Reinigung von rekombinantem synthetischem cpn10 unter Verwendung des pGEX-Systems ist nachstehend angeführt. Ein weite rer geeigneter Ansatz für die Produktion von rekombinantem synthetischem cpn10 könnte die Verwendung von eukaryotischen Expressionssystemen, wie z.B. Hefe- oder Baculovirus-Expressionssystemen, sein. Die potentiellen Vorteile solcher Systeme gegenüber bakterieller Expression sind, dass cpn10 in einer eukaryotischen Zelle und ohne modifizierten N-Terminus produziert würde. So könnte größere spezifische Aktivität und verbesserte Stabilität erreicht werden. Beispiele für Verfahren, die zur rekombinanten Proteinexpression geeignet sind, finden sich in den Kapiteln 5–7 in CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE (Coligan et al. (Hrsg.); John Wiley & Sons Inc. (1995–99)).
Derzeit werden bei der klinischen Behandlung von MS drei IFN-β-Quellen eingesetzt. Diese sind zusammen mit anderen relevanten Informationen in TABELLE 1 angeführt.
Betaseron (oder Betaferon) wird beispielsweise üblicherweise von Schering in dehydratisierter Form zusammen mit Dextrose und Humanserumalbumin als Träger oder Verdünnungsmittel bereitgestellt. Auch 0,54% NaCl sind enthalten, um als wässriger Träger oder Verdünner zu wirken, der das dehydratisierte IFN-β/Dextrose/Humanserumalbumin vor der Injektion rehydratisiert.
Geeigneterweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünner.
„Pharmazeutisch annehmbarer Träger oder Verdünner" bezieht sich auf einen festen oder flüssigen Füllstoff, ein solches Verdünnungsmittel oder eine solche Einkapselungssubstanz, die bei systemischer Verabreichung sicher eingesetzt werden können. Der oben genannte 0,54% NaCl umfassende wässrige Träger oder Verdünner, der dehydratisiertes IFN-β/Dextrose/Humanserumalbumin rehydratisiert, ist ein Beispiel dafür. Weitere Beispiele für Träger, die besonders für IFN-β geeignet sind, sind in den US-Patenten Nr. 4.992.271 und 2.643.566 angeführt.
Je nach Verabreichungsweg können verschiedene pharmazeutisch annehmbare Träger, die auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind, verwendet werden. Diese Träger können aus einer Gruppe ausgewählt werden, die Zucker, Stärken, Cellulose und Derivate davon, Malz, Gelatine, Talk, Calciumsulfat, pflanzliche Öle, synthetische Öle, Polyole, Alginsäure, phosphatgepufferte Lösungen, Emulgatoren, isotonische Kochsalzlösung und pyogenfreies Wasser umfasst.
Dosierungsformen umfassen Tabletten, Dispersionen, Suspensionen, Injektionen, Lösungen, Sirups, Pastillen, Kapseln, Zäpfchen, Aerosole, transdermale Pflaster und dergleichen. Diese Dosierungsformen können auch Vorrichtungen zur kontrollierten Abgabe oder andere Implantatformen umfassen, die auf diese Weise wirken. Eine kontrollierte Abgabe des therapeutischen Wirkstoffs kann erzielt werden, indem dieser beispielsweise mit hydrophoben Polymeren, einschließlich Acrylharze, Wachse, höherer aliphatischer Alkohole, Polymilchsäure und Polyglykolsäure und bestimmter Cellulosederivate, wie z.B. Hydroxypropylmethylcellulose, beschichtet wird. Außerdem kann die kontrollierte Abgabe erreicht werden, indem andere Polymermatrizes, Liposomen und/oder Mikrokügelchen verwendet werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die zur oralen Verabreichung oder Verabreichung durch Injektion geeignet sind, könne als diskrete Einheiten, wie z.B. Kapseln, Säckchen oder Tabletten, als Pulver oder Granulat oder als Lösung oder Suspension in einer wässrigen Flüssigkeit, einer nichtwässrigen Flüssigkeit, einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder einer Wasser-in-Öl-Emulsion vorliegen. Solche Zusammensetzungen können durch ein beliebiges pharmazeutisches Verfahren hergestellt werden, aber alle Verfahren umfassen den Schritt des Zusammenbringens von cpn10 und/oder IFN-β mit dem Träger. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen hergestellt, indem das cpn10 und/oder IFN-β gleichmäßig und gründlich mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beidem vermischt und dann, wenn erforderlich, das Produkt in die gewünschte Form gebracht wird.
Auch Träger, die eine pulmonale Verabreichung unterstützen, wie z.B. nasopharyngeale Sprays und Inhalatoren, wie sie auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt sind, sind eingeschlossen.
Somit wird auch ein Set zur Behandlung von MS bereitgestellt. In solch einem Fall können IFN-β und cpn10 in dehydratisierter Form zusammen mit dem Träger oder Verdünner bereitgestellt sein und beide vor der Injektion rehydratisiert werden. Alternativ dazu kann das Set cpn10 in Tabletten- oder Kapselform umfassen, in welchem Fall cpn10 oral verabreicht wird, während IFN-β im Träger oder Verdünner zur Verabreichung durch Injektion rehydratisiert wird.
Im Zusammenhang mit diesem Set sind auch Nadeln, Spritzen, Inhalatoren, Aerosoldosen und dergleichen vorgesehen, um die Verabreichung von pharmazeutisch wirksamen Mengen von cpn10 und IFN-β zu unterstützen.
Zum besseren Verständnis der Erfindung seien Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung auf die folgenden nichteinschränkenden Beispiele verwiesen.
BEISPIEL 1
Allgemeine Materialien
1.1 Tiere
Lewis-Rattenweibchen (JC-Stamm) im Alter von 8–10 Wochen wurden vom Central Animal Breeding House, The University of Queensland, Australien bezogen. SJL/J-Mäuseweibchen im Alter von 8 bis 12 Wochen wurden vom Animal Resource Centre, Western Australia bezogen. Reife Quackenbush-Auszuchtmäuseweibchen wurden vom Central Animal Breeding House bezogen.
Alle Tiere wurden in temperatur-(22–26°C) und lichtkontrollierten (12 h Licht, 12 h Dunkelheit) kontinuierlich mit Maus/Ratten-Pellets und Wasser versorgt. Vor den chirurgischen Eingriffen wurden die Ratten (mittlere Gewicht 170 g) mit einem intraperi tonealen anästhetischen Gemisch (0,2 ml) aus 10 ml Ketamin (100 mg/ml), 6,2 ml Xylazin (20 mg/ml), 0,8 ml Atropin (600 μg/ml) und 10 ml Kochsalzlösung (0,9% Gew./Vol.) betäubt. Alle Untersuchen an Tieren wurden gemäß den Richtlinien des Australian National Health and Medical Research Committee und den ethischen Grundsätzen des The University of Queensland Animal Experimentation Ethics Committee durchgeführt.
1.2 Rekombinantes cpn10 (rcpn10)
Rekombinantes menschliches cpn10 wurde unter Verwendung des Plasmid-pGEX-2T-Bakterienexpressionssystems hergestellt (Amersham Phamacia Biotech, Uppsala, Schweden), wie in der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 95/15338 beschrieben wurde, die durch Verweis hierin aufgenommen ist. Kurz gesagt wurde das Glutation-S-Transferase-Fusionsprotein unter Verwendung eines Chargenverfahrens mit Glutathion-Sepharose-4B-Gel (Amersham Pharmacia Biotech) aus dem Zelllysat gewonnen, cpn10 wurde durch Thrombin gespalten [0,05 M Tris-HCl pH 8,0/0,15 M NaCl/2,5 mM CaCl₂-Puffer, 1000 Einheiten Thrombin (Sigma T6884; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA); Puffer 1] und im Überstand gewonnen (Probe 1). Das Gel wurde dann mit einem salzreichen Puffer (0,05 M Tris-HCl pH 8,2/2 M NaCl; Puffer 2) gewaschen (Probe 2). Zur Verwendung im Lymphozytenproliferationstest (siehe unten) wurde cpn10 auf einer Resource-RPC-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) gereinigt; ein Blinddurchlauf wurde als Kontrollpräparat verwendet. Die Proteinkonzentration des Überstands (cpn10-Probe 1) und der salzreichen Waschlösung (cpn10-Probe 2) wurden durch das Verfahren gemäß Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265–75 (1951) geschätzt. Die Reinheit der Präparate wurde durch SDS-PAGE unter Verwendung von 15% Tris-Tricin-Gelen bestimmt (Schagger & von Jagow, Analytical Biochem. 166, 368–79 (1987)). Die Konzentration von cpn10 wurde durch eine Doppel-Antikörper-Sandwich-ELISA bestimmt, und die Bioaktivität wurde im Rosetteninhibitionstest bestimmt (Cavanagh & Morton, Today's Life Sciences 8, 24–7 (1996)). Die Aminosäuresequenz von cpn10, das unter Verwendung des pGEX-2T-Expressionssystems hergestellt wurde, ist identisch mit menschlichem cpn10 mit einem zusätzlichen G-S-M am N-Terminus, und das Molekül ist nicht acetyliert.
1.3 Chemisch synthetisiertes cpn10
Synthetisches cpn10 (scpn10) wurde durch Festphasen-Stufenverfahren in N-terminal acetylierter Form hergestellt (Love et al., In: New Methods for the Study of Biomolecular Complexes, Vol. 510, S. 171–9, Series C: Mathematical and Physical Sciences, Ens, Standing & Chernushevich, Hrsg., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Niederlande).
1.4 Rekombinantes IFN-β
Rekombinantes Maus-IFN-β (Calbiochem-Novabiochem Corp., La Jolla, CA, USA) wurde in PBS mit 0,1% Gew./Vol. BSA bei 48,8 μg Protein (4,5 × 10⁵ Einheiten) pro ml bereitgestellt. Rekombinantes Ratten-IFN-β (0,1 mg/1 × 10⁵ Einheiten; BioSource International, Camarillo, CA, USA) wurde im Lymphozytenproliferationstest getestet. Ratten-IFN-β wurde in 1,0 ml destilliertem Wasser gelöst und in Aliquoten bei –70°C gefroren und nur einmal aufgetaut. Das Vehikel alleine bestand aus PBS mit 0,1% Gew./Vol. BSA (PBS/BSA; Sigma Nr. 9418).
1.5 Myelin-Protolipidprotein (PLP)
Das enzephalitogene PLP-Peptid, Reste 139–151 (HCLGKWLGHPDKF; Greer et al., J. Immunol. 156, 371–9 (1996)) wurde durch Festphasen-Stufenverfahren synthetisiert und durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die Reinheit wurde durch Elektrospray-Massenspektrometrie bestimmt (≥ 90% rein).
BEISPIEL 2
In-vivo-Experimente mit cpn10
2.1 Induktion von EAE und klinische Bewertung
Ein basisches Myelinprotein (MBP) wurde durch das Verfahren gemäß Deibler et al., Prep. Biochem. 2, 139–165 aus Meerschweinchengehirnen hergestellt. MBP in 0,9% NaCl Gew./Vol. (Kochsalzlösung) wurde in einem gleichen Volumen inkomplettem Freundschem Adjuvans mit 4 mg/ml Mycobacterium butyricum emulgiert. Unter Betäubung wurden die Ratten am Tag 0 an einem hinteren Fußballen mit 0,1 ml Emul sion (50 μg MBP/Ratte) inokuliert. Von Tag 10 an wurden die Ratten täglich gewogen und klinische Symptome wurden überwacht; der Grad der Schwäche des Schwanzes, der Hinterbeine und der Vorderbeine wurde separat auf einer Skala von 0 (keine Schwäche) bis 4 (totale Paralyse) eingetragen, wie sie von Pender, J. Neurol. Sci. 75, 317–28 (1986) beschrieben wurde. An jedem Untersuchungstag wurde die Gesamtbehinderung jeder Ratte aufgezeichnet, wobei die Ergebnisse als mittlerer Behinderungswert/Gruppe ausgedrückt wurden. Die Ratten hatten sich normalerweise am Tag 20 von der Krankheit erholt, obwohl in manchen Fällen in den Wochen nach der Genesung ein Rückfall zu beobachten war.
2.2 Behandlung von EAE mit cpn10
Die Ratten wurden mit cpn10 oder einem geeigneten Kontrollvehikel behandelt, beginnend mit dem Tag der Inokulation und bis Tag 17, wobei die Dosen von 1 μg bis 50 μg variierten und alle 24 oder 48 h (siehe Tabelle 2) verabreicht wurden. Die cpn10-Probe 1 oder der Puffer 1 wurden den Ratten ohne weitere Behandlung verabreicht. Die cpn10-Probe 2 oder der Puffer 2 wurden nach dem Zusatz von 1% normalem Rattenserum über Nacht in PBS dialysiert, bevor sie verabreicht wurden. Cpn10 wurde entweder intraperitoneal (ip) oder oral mit einer gekrümmten Futternadel (O/F, orale Fütterung) verabreicht, und das Gewicht und die klinischen Werte der einzelnen Ratten wurden bis zum Tag 20 aufgezeichnet. Ratten, die 50 μg/24 h erhielten, wurde bis zum Tag 35 untersucht.
Die Behandlung von EAE mit cpn10, entweder intraperitoneal oder oral, führte zu einer dosisabhängigen Verringerung der Behinderung und des Gewichtsverlust zwischen Tag 10 und 20 (Tabelle 2). In der Gruppe von Ratten, die 50 μg/Tag erhielten, bestand kein Unterschied in der Gesamtverringerung der Behinderung zwischen Ratten, die cpn10 i.p. erhielten, und jenen, die es oral erhielten (1 und 2). In keiner dieser Gruppen trat ein Rückfall auf, im Vergleich zu einem seltenen Rückfall in der Kontrollgruppe. Die erwartete Verringerung des Gewichtsverlusts im Vergleich zur Kontrollgruppe trat ebenfalls ein (3). Sobald die Ratten in die Genesungsphase eintraten, entsprach ihre Gewichtszunahme der der Kontrollmäuse (3).
Bei den getesteten cpn10-Dosen waren die Tiere nicht vollständig gegen klinische Symptome von EAE geschützt, aufgrund der begrenzten Versorgung mit cpn10 war es aber nicht möglich, höhere Dosen zu testen. Es wurde auch in Betracht gezogen, dass dieses Molekül augrund der Änderung seines N-Terminus, der die Bindung an Serumträgerproteine beeinflusst, nicht ideal ist. Die hohe Dosis führte aber zu einer signifikanten Verringerung der klinischen Wert und des Gewichtsverlusts. Bei den cpn10-behandelten Mäusen traten bis zur Beendigung der Behandlung am Tag 17 keine Rückfälle auf, und es zeigten sich keine langfristigen Auswirkungen auf die Gewichtszunahme. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu jenen, die nach einer Behandlung von Ratten mit IFN-β erhalten wurden (Ruuls et al., w.o. (1996)).
2.3 Hemmung der DTH-Reaktion auf MBP bei cpn10-behandelte Ratten
Ratten wurden mit MBP inokuliert und dann in vier Gruppen mit 4 Ratten/Gruppe geteilt. Gruppe 1 und 4 erhielten nur Vehikel, Gruppe 2 und 3 cpn10 (50 μg/Ratte/24 h) oral bzw. intraperitoneal von Tag 0 bis Tag 16. Am Tag 15 wurde die Ohrdicke beider Ohren der Ratten mithilfe einer Schraublehre (Mitutoyo) gemessen, dann wurden in den Gruppen 2 bis 4 20 μg MBP in 10 μl Kochsalzlösung am Ansatz beider Ohren injiziert. Ratten der Gruppe 1 erhielten nur eine Kochsalzlösung. Nach 24 h wurden erneut beide Ohren gemessen, und eine Schwellung der Ohren wurde durch Subtraktion bestimmt.
Eine beträchtliche Schwellung der Ohren wurde bei Ratten der Gruppe 4 beobachtet, die ein Kontrollvehikel erhalten hatten und mit MBP provoziert worden waren (4). Eine deutlich geringere Schwellung trat bei den Ratten auf, die von der MBP-Provokation eine entweder orale (Gruppe 2) oder intraperitoneale (Gruppe 3) Behandlung mit cpn10 durchlaufen hatten. Ratten der Gruppe 1 mit dem Kontrollvehikel und einer Kochsalzlösung-Provokation wiesen keinen Unterschied in der Ohrdicke auf. Visuell war dieser Unterschied sehr markant, da bei Ratten der Gruppe 4 ein beträchtlicher entzündeter roter Bereich am Ansatz der Ohren zu erkennen war, was in Gruppe 2 und 3 nicht der Fall war. Zwischen den Gruppen 1–3 gab es keine signifi kanten Unterschiede in der Schwellung der Ohren. In Doppelversuchen wurden ähnliche Ergebnisse erzielt.
Diese Ergebnisse bestätigen, dass cpn10 wie IFN-β die Th1-Immunantwort supprimiert, und zeigen, dass cpn10 in diesem Zusammenhang bei oraler Verabreichung genauso wirksam ist wie i.p. verabreichtes cpn10.
2.4 Leukozytengesamtzahl und Leukozytendifferentialbild
Am Tag 16 der Behandlung von EAE-Ratten mit einem Vehikel alleine oder cpn10 (50 μg/Ratte/24 h), ip oder oral (n = 3/Gruppe) wurden zur Leukozytenzählung am Schwanz Blutproben in EDTA abgenommen, und für das Differentialbild wurden Wright-Giemsa-gefärbte Blutausstriche hergestellt.
Die Ergebnisse sind 5 zu sehen. Es besteht kein signifikanter Unterschied in der Leukozytengesamtzahl, Lymphozytenzahl oder Neutrophilenzahl zwischen den drei Gruppen. In Doppelversuchen wurden ähnliche Ergebnisse erhalten.
Zusammen mit jenen Ergebnissen, dass die tägliche Verabreichung von 50 μg cpn10 an Ratten ihre Gewichtszunahme während des Genesungszeitraums nicht beeinflusst, lassen diese Ergebnisse darauf schließen, dass cpn10 keine sehr offensichtlichen Nebenwirkungen aufweist. Dies ist wieder ein Merkmal, das es nicht mit IFN-β teilt. Bei Menschen kann eine IFN-β-Behandlung eine deutliche Lymphopenie auslösen, und bei Mäusen fanden Soos et al., J. Immunol. 155, 2747–53 (1995) eine 31,7%ige Verringerung der Lymphozytenzahl 12 h nach der Injektion von IFN-β (10⁵ U/Injektion).
BEISPIEL 3
In-vitro-Experimente mit cpn10
3.1 Wirkungen von cpn10 auf die Proliferation von Lymphknotenzellen als Reaktion auf MBP
Am Tag 10 nach einer Inokulation wurden 2 Ratten betäubt, durch eine Herzpunktion ausbluten gelassen, und der popliteale Lymphknoten, der für die inokulierte Gliedmaße zuständig ist, wurde unter sterilen Bedingungen aus jeder Ratte entnommen. Die Lymphkoten wurde fein gehackt und in RPMI1640 (ICN, Costa Mesa, CA, USA) mit 2 mM L-Glutamin, 25 mM HEPES, 50 μM 2-Mercaptoethanol, 1 mM Na-Pyruvat, 50 μg/ml Gentamycin, 1% hitzeinaktiviertes Lewis-Rattenserum (Inkubationsmedium) suspendiert. Nach Entfernung von Bruchstücken wurden die suspendierten Lymphozyten gepoolt und 2 × gewaschen, und die Zellkonzentration wurde auf 4 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Vor der Untersuchung im Proliferationstest wurde HPLC-gereinigtes cpn10 48 h lang (mit 1% normalem Rattenserum) gegen PBS dialysiert, dann in ein Inkubationsmedium auf eine NAP-5-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) aufgegeben und durch Passieren durch eine Millex-GV4 0.22 μm Filter Unit (Millipore, Bedford, MA, USA) filtersterilisiert. Ein Kotrollmedium (Blinddurchlauf von HPLC) wurde gleichermaßen behandelt. Die Konzentration von cpn10 in den filtrierten Präparaten wurde in einem Doppel-Antikörper-Sandwich-ELISA bestätigt.
100-μg/ml- (10,0 μM) bis 20-ng/ml- (2,0 nM) Verdünnungen von cpn10 wurden in einem Inkubationsmedium hergestellt (siehe 6), und 100 μl jeder Verdünnung wurden dreifach in 96-Well-Platten mit flachem boden (Nunclon^TMΔ MicroWell Plates, Nunc, Roskilde, Dänemark) gegeben. MBP (50 μl, 80 μg/ml Inkubationsmedium) und die hergestellte Lymphknotenzellsuspension (50 μl; 4 × 10⁶ Zellen/ml) wurden zu jedem Well zugesetzt. Kontrollwells (jeweils 6 Wells) enthielten entweder (a) Zellen mit MBP, aber kein cpn10, oder (b) Zellen ohne MBP und ohne cpn10. Die Platten wurden in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37°C, 5% CO₂ 72 h lang inkubiert. Während der letzten 18 h wurde jeder Well mit 0,5 μCi [Methyl-³H]-thymidin (Amersham Pharmacia Biotech) gepulst, und die inkorporierte Radioaktivität wurde auf einem Szintillationszähler (EG&G Wallac, Turku, Finnland) gemessen. Die in den Wells mit cpn10 inkorporierte Radioaktivität wurde mit der in Wells ohne cpn10 verglichen. Parallele Platten wurden zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen hergestellt. Nach 72 h Inkubation wurde das überstehende Medium entfernt, und die Zellen wurden in 0,1% Gew./Vol. Trypanblau in PBS (20 μl) resuspendiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurden durch Trypanblauausschluss beurteilt.
Cpn10 supprimierte die MBP-induzierte Proliferation von Lymphozyten auf dosisabhängige Weise (6). Somit kann cpn10 MBP-reaktive T-Zellen herabregulieren, wie es auch IFN-β tut (van der Meide et al., J. Neurimmunol. 84, 14–23 (1998)).
3.2 Rosetteninhibitionstest
Cpn10 und rekombinantes Ratten-IFN-β (BioSource International, Camarillo, CA, USA) wurden im Rosetteninhibitionstest auf Aktivität getestet, wobei das schon beschriebene Verfahren eingesetzt wurde (Morton et al., w.o. (1996); Cavanagh & Morton, w.o. (1996)). Lösungen wurden hergestellt, die 1) 1,0 μg cpn10 in 0,5 ml PBS/0,01% BSA Gew./Vol. (PBS/0,01% BSA) und 2) 1,0 μg rIFN-β in 0,5 ml PBS/0,01% BSA enthielten, und dann in ausgeglichene Hank-Salzlösung/0,01% BSA (HBSS/0,01% BSA) auf einer NAP-5-Säule gegeben (Endkonzentration cpn10 und IFN-β; 1,0 μg/ml). Die Proben wurden 10fach in HBSS/0,01% BSA von 10^–5 auf 10^–5 verdünnt, und der Rosetteninhibitionstiter (RIT) jeder Verdünnung wurde bestimmt. Der cpn-10-Titer (log der reziproken Probenverdünnung) wurde als stärkste Verdünnung einer Probe aufgezeichnet, die im Test zu einem positiven Ergebnis führte.
Die cpn10-Probe (1,0 μg/ml) ergab einen Titer von 10^–12 im Test, während die IFN-β-Probe bei keiner Konzentration Aktivität aufwies.
Cpn10 bindet an Th1-Zellen, wodurch genetisch eingeschränkte Suppressorfaktoren freigesetzt werden, die im Rosetteninhibitionstest aktiv sind. Diese Ergebnisse zei gen, dass sich der Mechanismus, durch den IFN-β die Th1-Immunantwort supprimiert, von dem von cpn10 unterscheidet.
Im Rattenmodell haben die Ergebnisse gezeigt, dass eine Behandlung mit cpn10:

(i) die Behinderung und den Gewichtsverlust von Tieren mit EAE verringert;
(ii) die DTH-Reaktion in vivo supprimiert; und
(iii) die Aktivität von enzephalitogenen (MBP-reaktiven) Zellen in vitro herabreguliert.

Wie IFN-β supprimiert cpn10 somit die Th1-Reaktion. Die Mittel, durch welche diese Reaktion herabreguliert wird, scheinen sich jedoch zu unterscheiden.
Cpn10 ist im Rosetteninhibitionstest aktiv, was ein Maß für seine Fähigkeit darstellt, spezifische genetisch eingeschränkte Suppressorfaktoren von CD4+-T-Zellen freizusetzen. IFN-β weist in diesem Test keine Aktivität auf.
Die Verabreichung von cpn10 an Ratten wirkt sich nicht auf die Lymphozytengesamtzahl aus, während Soos et al., w.o. (1995) gezeigt haben, dass IFN-β-behandelte Mäuse eine deutliche Lymphopenie entwickeln. Dies wurde auch bei Patienten beobachtet, die eine IFN-β-Behandlung durchliefen. Anders als bei einer Behandlung mit IFN-β hat eine Behandlung mit cpn10 keine langfristige Auswirkung auf das Wohlbefinden der Ratten, wie durch die Gewichtszunahme nach der Behandlung gezeigt wurde.
Diese Ergebnisse haben gezeigt, dass die Wirkungsmechanismen von IFN-β und cpn10 unterschiedlich sind, obwohl beide die Th1-Immunantwort supprimieren können, und dass sie dabei die Symptome von EAE modifizieren. Ein Mausmodell von EAE wurde entwickelt, um zu bestimmen, ob eine komplementäre Therapie mit IFN-β und cpn10 bei der Behandlung von EAE erreicht werden kann.
BEISPIEL 4
EAE-Induktion bei Mäusen
EAE wurde in SJL/J-Mäusen durch sc Injektion in die Flanke mit 100 μg PLP p139–151 und 400 μg Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) in einer Emulsion von Wasser und komplettem Freundschem Adjuvans (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; Greer et al., w.o. (1996)) induziert. Jeder Maus wurden außerdem am Tag 0 und am Tag 3 iv 0,3 μg Pertussis-Toxin (Bordetella pertussis, List Biological Laboratories, Inc., CA, USA) in 0,3 ml 0,9% Gew./Vol. NaCl (Kochsalzlösung) injiziert. Von tag 8 an wurden die Mäuse täglich klinisch wie folgt beurteilt: 0 = keine Krankheit; 1 = geringere Spannkraft im Schwanz und etwas schwerfälliger Gang; 2 = Schwanzatonie und/oder mittel schwerfälliger Gang und/oder geringe Aufrichtfähigkeit; 3 = Schwäche der Gliedmaßen; 4 = Lähmung der Gliedmaßen; 5 = moribunder Zustand. Die Mäuse wurden bis Tag 42 oder Tag 60 untersucht (siehe Tabelle 3). An jedem Untersuchungstag wurde der mittlere Behinderungswert/Maus jeder Behandlungsgruppe bestimmt.
Die der gesamte mittlere Behinderungswert/Maus/Gruppe über den gesamten Behandlungszeitraum wurde berechnet. Dieser Wert wurde auch als mittlerer Gesamtbehinderungswert beim ersten Ausbruch (Tag 8 bis Tag 21) und während des Genesungszeitraums (Tag 22 bis Tag 42 oder Tag 60; siehe Tabelle 4) ausgedrückt, die während des Untersuchungszeitraums zu beobachten waren. In beiden Gruppen von Mäusen (Experimente Nr. 4 und Nr. 5, siehe Tabelle 3) wurde der Untersuchungszeitraum von 60 Tagen auf 68 Tage verlängert, und der mittlere Gesamtbehinderungswert für Tag 61 bis Tag 68 wurde ebenfalls aufgezeichnet.
BEISPIEL 5
Wirkung einer cpn10-Therapie auf EAE in Mäusen
Gruppen von Mäusen (n = 10/Gruppe) wurden mit rekombinantem cpn10 (rcpn10 = in Dosen von 2,5 μg, 5 μg, 10 μg oder 20 μg/Maus behandelt, die jeden zweiten Tag ip verabreicht wurden. Die Behandlung begann am Tag der Inokulation (Tag 0) oder zum Zeitpunkt des Ausbruchs der Krankheit (Tag 8) und wurde bis zum Tag 18 oder 20 fortgesetzt (siehe Tabelle 3). Der Untersuchungszeitraum ist in Tabelle 3 dargestellt. Im Hinblick auf die unterschiedlichen Dosierungen wurde der mittlere Gesamtbehinderungswert in der Gruppe, die rcpn10 erhielt, mit dem der Gruppe verglichen, die in einem gleichzeitigen Test nur Vehikel erhielt (Mann-Whitney-Rangsummentest, Sigma Stat 2.0, Jandel Scientific).
Nach der Inokulation mit einem PLP-Peptid 139–151 entwickelten die Mäuse (10/Gruppe) eine chronische Rückfallform von EAE. Klinische Symptome traten zwischen Tag 8 und Tag 10 auf, erreichtem an den Tagen 14 bis 16 ihren Höhepunkt, und nahmen ab Tag 21 wieder ab (8A). Die Mäuse erholten sich vollständig, und erlitten danach weitere Episoden einer klinischen Erkrankung. Eine Behandlung mit 2,5 μg, 5 μg oder 10 μg rcpn10 jeden zweiten Tag von Tag 0 bis Tag 18 oder Tag 20 supprimierte die Gesamtbehinderung im Vergleich zur Gruppe, die nur Vehikel erhielt, deutlich über den gesamten Untersuchungszeitraum (Tabelle 3). Während 20 μg rcpn10/Dosis zu einer Suppression der Krankheit führten, unterschieden sich die Ergebnisse nicht stark von jenen in der Gruppe, die nur Vehikel erhielten (Tabelle 3). Auch die Tatsache, ob die Behandlung zum Zeitpunkt des Ausbruchs der Krankheit (Tag 8) oder zum Zeitpunkt der Inokulation (Tag 0; Tabelle 3) begonnen wurde, brachte keine Unterschiede in der Reaktion der Behandlungsgruppen. Nach Tag 60 entwickelten die Mäuse in den rcpn10-behandelten Gruppen klinische Symptome von EAE mit einem mittleren Gesamtbehinderungswert von Tag 61 bis Tag 68, der sich nicht signifikant von der der Gruppe von Mäusen unterschied, die nur Vehikel erhielten (Daten nicht angeführt).
BEISPIEL 6
Kombinationstherapie mit IFN-β und cpn10
Um zu bestimmen, ob rcpn10 und IFN-β bei der Suppression von klinischen Symptomen von EAE zusammenwirken, wurden Gruppen von Mäusen mit rcpn10 und IFN-β separat und gemeinsam behandelt (8A und 8B). Suboptimale Dosen von rcpn10 und IFN-β wurde ausgewählt, sodass eine kooperative Wirkung, falls vorhanden, leicht erkannt werden konnte. Vier Gruppen von Mäusen (n = 10/Gruppe) wurden getestet. Am Tag der Inokulation erhielten die Gruppen 2 und 4 ip jeden zweiten Tag von Tag 0 bis Tag 20 2,5 μg rcpn10, und die Gruppen 1 und 3 erhielten Vehikel. IFN-β wurde auf 10⁵ Einheiten/ml in einer Kochsalzlösung verdünnt, und die Mäuse der Gruppen 3 und 4 erhielten 5.000 Einheiten (0,5 μg; Yu et al., w.o. (1996) sc in 50 μl Kochsalzlösung jeden zweiten Tag von Tag 10 bis Tag 20. Die Mäuse der Gruppen 1 und 2 erhielten 50 μl 0,1% BSA in PBS, ¼ in einer Kochsalzlösung verdünnt. Am Tag 18 und am Tag 29 erhielten alle Mäuse eine Behandlung mit Antihistamin (Pyrilamin, Sigma-Aldrich), 10 μg/g Körpergewicht ip (Jose et al., J. Exp. Med. 179, 881–887), um eine Anaphylaxie aufgrund der Verabreichung des BSA-Trägers zu verhindern, der in den IFN-β- und den Kontrollvehikelpräparaten vorhanden ist. Die Mäuse wurden täglich bis Tag 60 wie oben beschrieben untersucht, und die Ergebnisse der Gruppen, die cpn10, IFN-β, cph10 + IFN-β erhielten wurden mit jenen der Gruppe verglichen, die nur Vehikel erhielt (Mann-Whitney-Rangsummentest). Dieses Experiment wurde zweifach durchgeführt.
Die Behandlung von EAE-Mäusen mit 2,5 μg rcpn10 jeden zweiten Tag von Tag 0 bis Tag 20 supprimierte den mittleren Gesamtbehinderungswert während des Untersuchungszeitraums von Tag 8 bis Tag 60 im Vergleich zu Mäusen, die nur Vehikel erhielten (8A, Tabelle 4). Angesichts dieser Ergebnisse verglichen die Erfindung die Wirksamkeit von rcpn10 und IFN-β, da IFN-β eine allgemein bekannte Behandlung von MS darstellt und außerdem Aktivität gegen EAE aufweist (Yu et al., w.o. (1996)). Die Verabreichung von 5.000 Einheiten IFN-β jeden zweiten Tag von Tag 10 bis Tag 20 führte im gleichen Untersuchungszeitraum zu keiner signifikanten Sup pression (8B, Tabelle 4). Bei gemeinsamer Verabreichung führten rcpn10 und IFN-β jedoch im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einer noch stärkeren Suppression als eines der Reagenzien alleine (8A, 8B, Tabelle 4). Die supprimierende Wirkung auf die Behinderung war während der Genesungsphase (Tag 22 bis Tag 60) noch deutlicher erkennbar als beim ersten Ausbruch (Tag 8 bis Tag 21). Während weder eine cpn10- noch eine IFN-β-Behandlung alleine zu einer signifikanten Suppression während des ersten Ausbruchs führte, war die Kombinationsbehandlung wirksam (9, Tabelle 4). Während des Genesungszeitraums war die Suppression des mittleren Gesamtbehinderungswerts im Vergleich zur Kontrollgruppe aufgrund der Kombinationstherapie stärker (Tabelle 4). In Doppelversuchen wurden ähnliche Ergebnisse erzielt (Daten nicht angeführt).
In Vorversuchen (Daten nicht angeführt) starben etwa 50% der Mäuse innerhalb der ersten 10 bis 12 Tage (d.h. Tag 20–Tag 22) nach der sc Zufuhr von BSA entweder im IFN-β-Präparat oder im Kontrollvehikel. Dies wurde auf einen anaphylaktischen Schock aufgrund einer Sensitivierung gegenüber BSA zurückgeführt. In den oben angeführten Experimenten wurden die Mäuse am Tag 18 und am Tag 20 mit Antihistamin behandelt (Jose et al., w.o. (1994)) und es traten keine Todesfälle mehr auf.
BEISPIEL 7
Histologie von mit rekombinantem cpn10 oder einem Vehikel behandelten Mäusen
Am Tag 14 nach einer Inokulation wurden zwei Mäuse der Gruppe, die jeden zweiten Tag 2,5 μg rekombinantes cpn10/Maus ip erhalten hatten, und zwei der Gruppe, die nur Vehikel erhalten hatten, betäubt und mit Kanovskys Fixiermittel perfundiert (McCombe et al., w.o. (1992)). Die für die Perfusion aus den einzelnen Gruppen ausgewählten Mäuse wiesen einen Behinderungswert auf, der für das Mittel der Gruppe an diesem Tag repräsentativ war. Rückenmark wurde entnommen und in Epox 8112 eingebettet, und halbdünne Schnitte des Hals- (C5), Brust- (T6), Lenden- (L4) und Sakralmark (S2) und die Cauda equina wurden mit Toluidinblau gefärbt. Die Schnitte wurden auf Hinweise auf Entzündungen und Demyelinierungen untersucht.
Schnitte von mehreren Abschnitten des Rückenmarks von einer Kontrollmaus und einer rcpn10-behandelten Maus sind in 10 zu sehen. In der Kontrollmaus ist eine Entzündung in den subpialen Regionen und perivaskulären Regionen zu erkennen. Es gab Indizien für eine Demyelinierung, die im Sakral- und Lendenmark stärker war als im Halsmark. Bei der rcpn10-behandelten Maus traten weniger Entzündungen, vor allem im Parenchym, und weniger Demyelinierung auf.
BEISPIEL 8
Proliferation von Lymphknotenzellen in vitro als Reaktion auf MBP
Die Aktivität von IFN-β, rekombinantem cpn10 und chemisch synthetisiertem cpn10 (scpn10) wurde in einem In-vitro-Lmyphozytenproliferationstest bestimmt. Vor der Verwendung wurden rcpn10 (200 μg/ml) und scpn10 (100 μg/ml) mit 1% autologem Rattenserum 3 Tage lang gegen eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; 0,05 M Natriumphosphatpuffer pH 7,4/0,15 M Natriumchlorid) dialysiert, in ein Inkubationsmedium (RPMI1640 mit 2 mM L-Glutamin, 25 mM HEPES, 50 μM 2-Mercaptoethanol, 1 mM Na-Pyruvat, 50 μg/ml Gentamycin, 1% hitzeinaktiviertes autologes Rattenserum) auf einer NAP-5-Säule (Amersham Pharmacia Biotech) transferiert und durch Passieren durch eine Millex-GV4 0.22 μm Filter Unit (Millipore, Bedford, MA, USA) sterilfiltriert. Ein Kotrollmedium wurde gleichermaßen behandelt. MBP-EAE wurde in Lewis-Ratten durch Inokulation mit MBP induziert. Am Tag 10 wurden aus 2 Ratten die poplitealen Lymphknoten, die für die inokulierte Gliedmaße zuständig waren, entfernt, und eine Zellsuspension (4 × 10⁶/ml) in einem Inkubationsmedium wurde hergestellt. Die Lymphknotenzellen (2 × 10⁵/Well) wurden dreifach in 96-Well-Platten mit flachem Boden in Gegenwart von MBP (20 μg/ml Endkonzentration) und IFN-β oder cpn10 in Endkonzentrationen im Bereich von 0,1–50 μg/ml getestet, wie in 11 angeführt ist. Kontrollwells (jeweils 6 Wells) enthielten (a) Zellen mit MBP, aber keinem cpn10, und (b) Zellen ohne MBP und ohne cpn10. Die Platten wurden 72 h lang bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert. Während der letzten 18 h wurde jeder Well mit 0,5 μCi [Methyl-³H]-thymidin (Amersham Pharmacia Biotech) gepulst, und die inkorporierte Radioaktivität wurde gemessen. Die Ergebnisse wurden als Stimulationsindex ausgedrückt, d.h. als Mittel der Wells mit MBP/Mittel der Wells ohne MBP. Der Stimulationsindex mit verschiedenen Verdünnungen von cpn10 wurde mit dem Stimulationsindex ohne cpn10 verglichen (Student-t-Test).
Nach 72 h in Kultur supprimierten rcpn10, scpn10 und IFN-β alle eine MBP-induzierte Proliferation von Lymphknotenzellen von MBP-EAE-Ratten (11). IFN-β war am stärksten und hemmte 50% der Zellproliferation bei einer Konzentration von 1,9 μg/ml (96 mM), im Vergleich zu 11 μg/ml scpn10 (1,1 μM) und 28 μg/ml rcpn10 (2,8 μM), die notwendig sind, um diesen Grad an Hemmung zu erreichen.
BEISPIEL 9
Rosetteninhibitionstest, Bioassay für cpn10
Scpn10, rcpn10 und IFN-β wurden im Rosetteninhibitionstest, dem Bioassay für cpn10, auf ihre Aktivität getestet (Cavanagh & Morton, w.o. (1996)). Rcpn10 und scpn10 (50 μg) wurden 10fach in einer ausgeglichenen Hank-Salzlösung/0,01% BSA (HBSS/BSA) von 10^–5 auf 10^–15 verdünnt. IFN-β (0,5 μg/ml) wurde 10fach in HBSS/BSA auf 10^–13 verdünnt. Der Rosettenihibitionstiter (RIT) der einzelnen Lösungen wurde unter Verwendung von Milzzellen von Quackenbush-Mäusen bestimmt. Die Grenzdosis (log der reziproken Probenverdünnung) wurde als höchste Verdünnung einer Probe aufgezeichnet, die im Test zu einem positiven Ergebnis führt.
In diesen Experimenten verhielten sich rcpn10 und scpn10 im Rosetteninhibitionstest (12) identisch. IFN-β wies im Gegensatz dazu in diesem Test bei keiner Konzentration Aktivität auf.
BEISPIEL 10
Verhinderung von antigeninduziertem anaphylaktischem Tod bei Mäusen durch cpn10
Im Hinblick auf die in Beispiel 6 erläuterten Experimente wurde der Tod von Mäusen, der auf einen anscheinend anaphylaktischen Schock zurückzuführen war, weiter untersucht. Vier Gruppen von Mäusen wurden mit PLP p139–151 inokuliert. Am Tag 0 erhielten zwei Gruppen cpn10 und zwei Gruppen ein Kontrollvehikel. Am Tag 10 erhielt eine Maus jeder cpn10-Gruppe IFN-β oder PBS/BSA, während eine jeder Kontrollvehikelgruppe IFN-β oder PBS/BSA erhielt.
Wie in Tabelle 5 angeführt starben zwischen Tag 8 und Tag 12 nach Beginn der Injektionen von IFN-β in PBS/BSA oder PBS/BSA 4/9 und 6/10 Mäusen in der Gruppe die BSA, aber kein cpn10 erhalten hatte, während in der Gruppe, die BSA und cpn10 erhalten hatten, 3/10 und 0/9 Mäusen starben. Es wird davon ausgegangen, dass diese Mäuse an einer Anaphylaxie aufgrund der Verabreichung eines BSA-Trägerproteins starben. So wurde der Schluss gezogen, dass die Mäuse, die cpn10 erhielten, gegen einen durch Immunisierung mit BSA verursachten anaphylaktischen Schock geschützt waren, während IFN-β diesen Schutz nicht bereitstellte. Außerdem traten an der Verabreichungsstelle weniger Entzündungen auf, wenn cpn10 verabreicht wurde.
BEISPIEL 11
Allgemeine Diskussion
Die hier angeführten Ergebnisse zeigten, dass cpn10 klinische Symptome von mit einem Mylein-Protolipidprotein induzierter EAE in SJL/J-Mäusen supprimierte. Dieses Modell ist eine chronische Rückfallform von EAE, die den klinischen Verlauf von MS bei Menschen nachahmt. Patienten mit MS weisen erhöhte T-Zell-Reaktionen auf PLP-Peptide auf (Greer et al., Brain 120, 1447–60 (1997)), was vermuten lässt; dass mit PLP induzierte EAE ein gutes Modell für MS darstellt. Die wirksamsten Do sen zur Suppression der Behinderung während des Untersuchungszeitraums waren 5 μg und 10 μg jeden zweiten Tag. Höhere Dosen waren weniger wirksam. Eine ähnliche Verringerung der Wirksamkeit bei höheren Dosen wurde vorher in einer Studie beobachtet, die zeigte, dass cpn10 bei lokaler Verabreichung an der Transplantatstelle die Überlebensdauer von allogenen Hauttransplantaten bei Ratten verlängern kann. Die suppressive Wirkung von cpn10 bei den EAE-Mäusen war während der Rückfallperiode stärker als während des ersten Ausbruchs. Der Grund für die stärkere Suppression der Behinderung während der Rückfallperiode als beim ersten Ausbruch könnte sein, dass cpn10 natürliche Suppressormechanismen verstärkt, die während dieser Periode aktiv sind, oder dass Rückfälle eine andere Pathophysiologie aufweisen als die erste Episode. In späteren Episoden von chronischer EAE könnte die Immunantwort auf andere Antigenen übergegriffen und Antikörperreaktionen verstärkt haben, sodass sich die Pathogenese späterer Episoden von der vom ersten Ausbruch unterscheidet. Diese Studie zeigte außerdem, dass cpn10 und IFN-β bei der Suppression von EAE zusammenwirken. Die Verabreichung von cpn10 und IFN-β zusammen führte zu einer stärkeren Suppression der Behinderung als die einer der beiden Substanzen alleine. Dies war zwar in der Rückfallperiode der Krankheit am deutlichsten erkennbar, aber cpn10 und IFN-β wirkten immer bei der Suppression einer Erkrankung zusammen, und es konnten keine antagonistischen Wirkungen nachgewiesen werden.
Cpn10 und IFN-β reagierten im Rosetteninhibitionstest und im Lymphozytenproliferationstest unterschiedlich, was vermuten lässt, dass sich ihre Wirkungsmechanismen unterscheiden. Der Rosetteninhibitionstest ist der Test, bei dem EPF entdeckt wurde (Morton et al., w.o. (1976)), und er ist immer noch der Bioassay für EPF und cpn10. Die Wirkung von EPF im Rosetteninhibitonstest wird bei Mäusen und Menschen durch Lymphokine, EPF-S₁ und EPF-S₂, vermittelt, die nacheinander induziert werden, nachdem EPF an CD4+-T-Zellen gebunden wurde (Rolfe et al., w.o. (1988); Rolfe et al., w.o. (1989)). Diese Lymphokine wurden als Suppressorfaktoren bezeichnet, weil sie in der Lage sind, die Reaktion der Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ zu supprimieren (Rolfe et al., w.o. (1988)). Sie sind in ihrer Aktivität genetisch eingeschränkt. Die Einschränkung von EPF-S₁ (Mr 14–18.000) wurde der I-Region des Maus-H2 und HLA-DR bei Menschen zugeordnet, während die von EPF-S₂ (Mr ~55.000) der Igh-Region zugeordnet wurde (Rolfe et al., w.o. (1988); Rolfe et al., w.o. (1989); Rolfe et al., w.o. (1995)). Die Suppression von klinischen Symptomen nach einer Behandlung mit rcpn10 blieb bis zum Tag 60 aufrecht, auch wenn die Behandlung nach dem ersten Ausbruch beendet wurde. Das lässt auf die Induktion von langfristiger suppressiver Aktivität schließen. IFN-β ist im Rosetteninhibitionstest nicht aktiv, was zeigt, dass es nicht den gleichen Suppressor-Induktor-Pfad bei der Herabregulierung von Lymphozytenaktivität nutzt.
IFN-β ist in seiner Fähigkeit, die Proliferation von MBP-aktivierten Lymphozyten in vitro als Reaktion auf MBP zu supprimieren, deutlich stärker aktiv als cpn10. Sowohl IFN-β (Arnason, Neurology 43, 641–643 (1993)) als auch cpn10 supprimieren die IFN-γ-Produktion durch aktivierte T-Zellen. IFN-β hemmt die IFN-γ-Sekretion, erhöhte defektive Suppressoraktivität in MS-Patienten und hemmt die durch IFN-γ auf der Oberfläche von antigenpräsentierenden Zellen induzierte Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)Antigenexpression (The IFNB Multiple Sclerosis Study Group, Neurology 43, 655–661 (1993)). Cpn10 bindet an Subpopulationen von CD4+-Zellen, CD8+-Zellen und Monozyten. Die Bindung von cpn10 an eine Sunpopulation von aktivierten CD4+-T-Zellen führt zur Suppression der IFN-γ-Produktion. Die Art, wie cpn10 immunmodulatorische Wirkungen induziert und wie diese mit seiner Fähigkeit zusammenhängen, eine Behinderung bei EAE zu supprimieren, müssen noch bestimmt werden.
Diese Studien haben gezeigt, dass cpn10 chronische EAE supprimieren kann und die Fähigkeit von IFN-β, klinische Symptome von EAE bei Mäusen zu supprimieren, verstärken kann. Entscheidend ist, dass die unterschiedlichen Wirkungsmechanismen von cpn10 und IFN-β, die durch die Erfinder aufgedeckt wurden, neue Möglichkeiten in Bezug auf diese Wirkstoffe als kooperative Behandlungen für EAE und MS eröffnet haben. Wenn cpn10 und IFN-β über ähnliche immunsuppressive Mechanismen wirkten, wie in der Literatur tatsächlich vorgeschlagen wurde, dann könnte im EAE-Modell keine kooperative oder synergistische Wirkung auftreten. Die hierin dargelegten unterschiedlichen Wirkungsmechanismen und EAE-Daten haben im Gegenteil eine Erklärung für die Behauptung geliefert, dass cpn10 und IFN-β eine nützliche Kombinationstherapie für MS bei Menschen bieten werden.
IFN-β wird weitgehend als krankheitsmodifizierende Behandlung für multiple Sklerose (MS) bei Menschen eingesetzt. Es reduziert die klinische Rückfallrate, verzögert den Ausbruch eines anhaltenden Fortschreitens der Behinderung und verringert die Anzahl an neuen MRI-Läsionen bei Patienten mit multipler Sklerose mit Rückfällen und Remissionen (European Study Group on Interferonβ-1b, Lancet 352, 1491–1497 (1998)). Manche Patienten durchleben jedoch ein anhaltendes Fortschreiten der Behinderung innerhalb von 2 Jahren nach Beginn der Behandlung, was vermuten lässt, dass die Wirksamkeit von IFN-β im Hinblick auf eine Kombination von IFN-β mit anderen, viel versprechenden Therapien noch genauer untersucht werden muss.
Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die hierin dargelegten Ergebnisse an Tiermodellen darauf hinweisen, dass cpn10 ein möglicher Kandidat zur Verwendung in Kombination mit IFN-β bei der Behandlung von MS bei Menschen ist. Erstens scheint cpn10 mit IFN-β bei der Reduktion von EAE/MS-Symptomen zu synergieren. Zweitens lässt eine deutliche Verringerung an EAE-Rückfällen nach Beendigung der Kombinationsbehandlung mit cpn10 und IFN-β darauf schließen, dass es sich hierbei um eine geeignete Behandlungsmethode handelt, wenn die IFN-β-Verabreichungen aufgrund ihrer Nebenwirkungen temporär ausgesetzt wird. Und drittens scheint cpn10 die Wahrscheinlichkeit von anaphylaktischen Reaktionen auf Trägerproteinantigene (wie z.B. BSA) zu verringern, die typischerweise bei IFN-β enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen auftreten.
Natürlich kann die hierin im Detail beschriebene Erfindung von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung Modifikationen und Variationen unterzogen werden, wobei solche Modifikationen und Variationen dennoch in den Schutzumfangs der hierin dargelegten Erfindung fallen.
TABELLEN TABELLE 1
TABELLE 2
TABELLE 3
TABELLE 4
TABELLE 5

Claims

Verwendung von Chaperonin 10 (cpn10) und β-Interferon (IFN-β) bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von multipler Sklerose (MS).
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament zur Behandlung zur Unterbindung eines Rückfalls von MS verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin IFN-β und cpn10 gemeinsam zu verabreichen sind.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin IFN-β und cpn10 getrennt voneinander zu verabreichen sind.
Verwendung nach Anspruch 3, worin IFN-β und cpn10 mittels Injektion zu verabreichen sind.
Verwendung nach Anspruch 4, worin das cpn10 oral zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 4 oder Anspruch 6, worin das IFN-β mittels Injektion zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Medikament 5–60 mg cpn10 umfasst.
Verwendung nach Anspruch 8, worin das Medikament 10–30 mg cpn10 umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Medikament 1–10 MIU (Million Internationale Einheiten) IFN-β umfasst.
Verwendung nach Anspruch 10, worin das Medikament 4–6 MIU IFN-β umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von MS, worin die Zusammensetzung eine pharmazeutisch wirksame Menge Chaperonin 10 (cpn10) und β-Interferon (IFN-β) und einen) pharmazeutisch annehmbaren/s Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 5–60 mg cpn10 umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, worin die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 10–30 mg cpn10 umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 1–10 MIU IFN-β umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 15, worin die pharmazeutisch wirksame Menge an cpn10 und IFN-β 4–6 MIU INF-β umfasst.
Set, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von Chaperonin 10 (cpn10) und β-Interferon (IFN-β) und ein(en) pharmazeutisch annehmbaren/s Träger oder Verdünnungsmittel.
Set nach Anspruch 17, worin das IFN-β in dehydratisierter Form vorliegt und bei Verwendung durch den/das pharmazeutisch annehmbare(n) Träger oder Verdünnungsmittel rehydratisiert wird.
Set nach Anspruch 18, worin das cpn10 in dehydratisierter Form vorliegt und bei Verwendung durch den/das pharmazeutisch annehmbare(n) Träger oder Verdünnungsmittel rehydratisiert wird.
Set nach Anspruch 17 oder Anspruch 18, worin das cpn10 in Form von Tabletten oder Kapseln vorliegt.
Set nach Anspruch 17, worin die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 5–60 mg cpn10 umfasst.
Set nach Anspruch 21, worin die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 10–30 mg cpn10 umfasst.
Set nach Anspruch 17, worin die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 1–10 MIU IFN-β umfasst.
Set nach Anspruch 23, worin die pharmazeutisch wirksame Menge von cpn10 und IFN-β 4–6 MIU IFN-β umfasst.
Produkt, das Chaperonin 10 (cpn10) und β-Interferon (IFN-β) in Form eines Kombinationspräparats zur gleichzeitigen, separaten oder sequenziellen Verwendung bei der Behandlung von multipler Sklerose (MS) enthält.