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Diese
Erfindung betrifft die Verwendung von (3-(2-Ethylphenyl)-5-methoxyphenyl)-1H-[1,2,4]-triazol
zur Erzeugung eines Medikamentes für die Behandlung von spezifischen
Autoimmunerkrankungen.
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Hintergrund der Erfindung
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Multiple
Sklerose (MS) ist eine entzündliche Demyelinierungserkrankung
des zentralen Nervensystems (ZNS), die vermutlich durch eine Autoimmunattacke
mediiert wird, die gegen CNS-Myelinantigene gerichtet ist. Auf der
Basis von Tiermodellen ebenso wie Daten, die aufgrund von Analysen
von Leukozyten und Geweben von Patienten mit MS gewonnen wurden,
wird überlegt,
daß die
Antigenspezifität
innerhalb von T-Zellen vorhanden ist, die den αβ-T-Zellrezeptor (TCR) exprimieren,
wobei die encephalitogene Aktivität von der Expression eines
Cytokinprofils abhängt,
das für
einen Th1-Typ-Phänotypen
charakteristisch ist: Interferon-gamma (IFNγ), Lymphotoxin (LT) und Tumornekrosefaktor-alpha (TNFα). T-Zellen,
die ein Th2-Typ-Cytokinprofil (IL-4, Il-5 und Il-13) exprimieren,
oder Regulationscytokine wie transformierender Wachstumsfaktor-beta
(TGFβ) und
IL-10, interferieren vermutlich mit diesem Prozeß durch Blockade der Akquisition
des Th1-Phänotypen und/oder
durch Blockade der Untertargets (downstream targets) von Effektorcytokinen
wie die Aktivierung von Makrophagen.
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Die
kritische Natur des Cytokinprofils der antigenreaktiven αβ-T-Zellen für die Erkrankungsexpression
führt zu
der Frage bezüglich
der Natur des Antigenerkennungsprozesses, der zu der Akquisition dieser
spezifischen Cytokinprofile führt.
Obwohl seit einiger Zeit bekannt ist, daß das Vorhandensein von Adjuvantien
und die Route der Antigenpräsentation wichtige
Determinantien der encephalitogenen Aktivität in Tieren sind, wurde der
Frage, wie diese Verfahren die Natur der erworbenen Immunantwort
formen, ebenso wie der Beitrag von anderen nicht-antigenspezifischen
Leukozytenpopulationen erst seit einiger Zeit näher beachtet mit einer expandierenden Erkennung
der verschiedenen Zellpopulationen, die an der Grenzfläche zwischen
der angeborenen und erworbenen Immunantwort funktionieren.
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Die
angeborene Immunantwort funktioniert als eine erste Linie der Abwehr
gegenüber
einem großen
Bereich von infektiösen
und toxischen Mitteln. Historisch wurde diese Antwort Zellen mit
phagozytischer Aktivität
zugeschrieben, wie Makrophagen und polymorphonuklearen Zellen und/oder
starker cytotoxischer Aktivität,
wie natürlichen
Killerzellen (NK-Zellen), Mastzellen und Eosinophilen. Die Aktivität dieser
unterschiedlichen Zellpopulationen wird unterstützt und begünstigt durch eine Anzahl von
verschiedenen löslichen
Molekülen,
die kollektiv als akute Phasenproteine bekannt sind, wie die Interferone,
spezifische Komponenten der Komplementärkaskade und Cytokine, die
zur Verstärkung
der phagozytischen und cytotoxischen Aktivität dienen, und ebenso zur Akkumulation
dieser Zellen an Stellen der Gewebeschädigung führen. Wenn diese ersten Linien
der Abwehr gebrochen werden, folgt dann die Aktivierung der adaptiven
Immunantwort, was zur Bildung einer spezifischen Immunantwort führt, die
irgendeine von einer Vielzahl von unterschiedlichen Charakteristiken
entfalten kann. Die Erzeugung dieser erworbenen Immunantwort ist
eine exklusive Eigenschaft von Lymphozyten.
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Vor
kurzem wurde jedoch erkannt, daß geringe
Subpopulationen von Lymphozyten ebenfalls als Teil der angeborenen
Immunantwort fungieren können.
Obwohl es wahrscheinlich ist, daß die vollständige funktionelle
Rolle dieser spezialisierten Subsets von Lymphozyten kaum verstanden
wird, hat sich das gegenwärtige
Interesse für
diese auf ihre Rolle bei der Definition des Cytokin-Milieus an Stellen
der Gewebeschädigung
fokussiert, die die Natur der adaptiven Immunantwort, die erzeugt
wird, beeinflußt. Somit
haben sich viele dieser Studien auf die Rolle von IFNγ und IL-12
bei der Definition eines Th1-Typ-Cytokinprofils und IL-4 eines Th2-Typ-Cytokinprofils fokussiert.
Subpopulationen von all diesen drei Hauptgruppen von Lymphozyten, αβ-T-Zellen, γδ-T-Zellen
und B-Zellen fallen vermutlich in diese Kategorie. Dies Lymphozytenpopulationen
sind durch die Verwendung eines hochkonservierten Antigenrezeptorkomplexes,
die Expression von zusätzlichen
Mustererkennungsrezeptoren wie Mitgliedern der Toll-artigen Rezeptorfamilie
oder Rezeptoren, die normalerweise auf NK-Zellen ermittelt werden,
und die schnelle Freisetzung von hohen Gehalten an Cytokinen und
Chemokinen nach der Wechselwirkung mit spezifischen Liganden charakterisiert.
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γδ-T-Zellen:
T-Zellen, die den γδ-T-Zellrezeptor
(TCR) exprimieren, machen eine geringe Population der insgesamt
zirkulierenden T-Zellpopulationen aus. Gemeinsam mit αβ-T-Zellen
exprimieren γδ-T-Zellen
einen umge lagerten TCR, aber der bei der Akquisition der TCR-Diversität involvierte
Mechanismus ebenso wie die Natur der erkannten Antigene sind deutlich
verschieden (Y. H. Chien et al., Annu. Rev. Immunol. 1996; 14: 511–32). Die
Analyse der CDR3-Längenverteilungen,
ebenso wie kristallographische Studien haben eine größere strukturelle Ähnlichkeit
des γδ-TCR für Immunglobulin
schwere Kettengene nahegelegt, was weiterhin zu der Schlußfolgerung
führte,
daß die
molekulare Natur der Antigenerkennung durch γδ-T-Zellen fundamentell von der
verschieden sind, die durch αβ-T-Zellen
verwendet werden. γδ-T-Zellen
unterscheiden sich ebenfalls von αβ-T-Zellen
darin, daß die
meisten γδ-T-Zellen
Rezeptoren co-exprimieren, die auf natürlichen Killerzellen (NK-R)
gefunden werden (L. Battistini et al.; J. Immunol. 1997: 159: 3723–30). Die Expression
dieser Rezeptoren auf T-Zellen moduliert erwiesenermaßen mehrere
T-Zellfunktionen einschließlich
Cytotoxizität,
Cytokinfreisetzung und Transendothelialzellmigration (H. Reyburn
et al., Immunol Rev. 1997; 155: 119–25). Diese Daten zeigen an,
daß die
Regulierung der γδ-T-Zellfunktion
wahrscheinlich von der verschieden ist, die in den meisten αβ-T-Zellen
gefunden wird, wobei die Aktivierung (oder Inhibition) durch Signalgebung
durch beide, TCR und NK-R involviert ist. Es wurde nahegelegt, daß NK-R-Funktionen
als Co-Stimulationsmoleküle, die
ausschließlich
auf Änderungen
in der Zelloberflächenexpression
von MHC, die durch Infektion moduliert werden, oder auf den Aktivierungszustand
der Zellen antworten (H. Reyburn et al., ibid).
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Bei
gesunden Erwachsenen exprimiert die Hauptzahl der γδ-T-Zellen
ein TCR, der die Vγ9Vδ2-Gensegmente
verwendet. Die Expansion dieser spezifischen Population der γδ-T-Zellen
erfolgt vermutlich aufgrund einer Antwort auf bakterielle Nicht-Protein-Antigene
wie Pyrenil-Pyrophosphat-Derivate und andere Komponenten der bakteriellen
Zellwände
ohne klassische MHC-Beschränkung
(Salerno A. et al., Crit. Rev. Immunol. 1998: 18: 327–57). Es
wurde festgestellt, daß die
Antwort auf diese Arten von Antigenen kritisch von der Verwendung
von Germlin-codierten Lysin-Resten in dem Jγ1.2-Segement abhängt (Miyagawa
F. et al., J. Immunol. 2001; 167: 6773–6779). Obwohl die Antwort auf
Phosphatantigene somit polyklonaler Natur sein kann, werden konservierte
Elemente durch die antwortenden Zellen verwendet. Konservierte Sequenzen
des γδ-T-Zellrezeptors
wurden in Zellen und/oder Geweben, die von Patienten mit MS isoliert sind,
beobachtet, was eine Antwort auf ein allgemeines Antigen nahelegt.
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γδ-T-Zellen
haben viele Merkmale mit den αβTCR+NK-T-Zellen
gemeinsam, einschließlich
der Expression von NK-Rezeptoren, konstitutiven Expression von IL-2rβ, Verwendung
von hochkonservierten TCR-Sequenzen und Beschränkung, zumindest für einige
Subsets, durch CD1-Moleküle
(Spada F. M. et al., J. Exp. ed. 2000; 191: 937–48). Dies würde nahelegen,
daß einige γδ-T-Zellen eine ähnliche Bindung
zwischen angeborener und erworbener Immunantwort zur Verfügung stellen
können
(Poccia F. et al., Immunol. Today 1998; 19: 253–6). Konsistent mit einer solchen
Beobachtung ist, daß gezeigt
wurde, daß die
Aktivierung von Vδ2+-T-Zellen
mit Phosphatantigenen zur schnellen Freisetzung von großen Mengen
sowohl von Cytokinen als auch Chemokinen führt (Poccia F. et al., J. Immunol.
1997; 159-6009-17; Cipriani B. et al., Blood 2000; 95: 39–47). Interessanterweise
sind Akkumulationsdaten, die nahelegen, daß die V-Bereich-Verwendung spezifische
Subsets von γδ-T-Zellen
beim Mediieren von Th1- oder Th2-Typ-Antworten implizieren können, wobei
Vδ2+-Zellen
eine Th1-Typ-Tendenz und Vδ1+-Zellen
eine Th2-Typ-Tendenz
zeigen. Beispielsweise wurde so gezeigt, daß γδ-T-Zellen in MS-Läsionen einen prädominanten
Vδ2-Phänotyp exprimieren
(Battistini L. et al., Mol. Med. 1995; 1: 554–62) und daß Vδ2-Zellen im peripheren Blut
von Patienten mit MS einen Beweis der Aktivierung zeigen. Bei CSF
sind jedoch Vδ1-Zellen
die hauptsächliche γδ-T-Zellpopulation
(De Libero G., Springer Semin. Immunopathol. 2000; 22: 219–38).
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Studien,
die eine starke Rolle für
die γδ-T-Zellen
bei demyelinierenden Erkrankungen untersuchten, bestätigen weiterhin
die Schlußfolgerung,
daß, obwohl γδ-T-Zellen
den Beweis der Aktivierung bei Patienten mit MS oder dem Guillain
Barrè-Syndrom
(GBS) zeigen, Unterschiede in den phänotypischen und funktionalen
Eigenschaften dieser Zellen in den beiden Erkrankungen existieren.
Insbesondere zeigen die Daten, daß bei Patienten mit MS das
Vδ2-Subset
aktiviert ist und diese Zellen zum Absondern hoher Gehalte von Proentzündungscytokinen
induziert werden können.
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Einmal über TCR
aktiviert, können γδ-T-Zellen
ebenfalls als NK-Zellen fungieren, wobei entweder auf positive oder
negative Weise auf NK-Zelltargets geantwortet wird (L. Battistini,
et al., J. Immunol. 1997; 159: 3723–30; De Libero G., Microbes
Infect. 1999:, 1: 263–7).
Bei MS-Patienten
mit aktiver Erkrankung wurde festgestellt, daß der Prozentsatz der zirkulierenden
Vδ2+-T-Zellen,
die NKRP1A (menschliches Homolog von NK1.1) co-exprimieren, signifikant
im Vergleich zu gesunden Donoren erhöht sind. Wenn Vδ2+ und Vδ1+ T-Zellen
von MS-Patienten und gesunden Freiwilligen sortiert und geklont
wurden, exprimierten alle Vδ2+-Klone
NKRP1A. NKRP1A wurde stark auf Vδ2+-Zellen
durch Kultur mit IL-12 aufreguliert, während keine Aufregulation von
NKRP1A durch IL-12 bei Vδ1+-Klonen
bemerkt wurde. Bei Transendothelialmigrationsversuchen migrierten
Vδ2+ NKRP1A+-Klone effektiver
als Vδ1+-Klone
und das Migrationspotential wurde nach Kultur mit IL-12 verstärkt. Die
Migration wurde stark inhibiert durch F(ab')2 eines Anti-NKRP1A-Antikörpers, was
nahelegt, daß dieser
Rezeptor für
allgemeine Lectine in dem transendothelialen Zellmigrationsprozeß involviert
ist. Es wurde ebenfalls gezeigt, daß bei frisch isoliertem PBMC
von MS-Patienten die migrierte Population an Vδ2p NKRP1A+-Zellen angereichert
war. Somit ist die Expression von NKRP1A auf Vδ2+-Zellen mit einer erhöhten Fähigkeit
zum Migrieren entlang dem vaskulären
Endothelium assoziiert, eine Aktivität, die durch IL-12, das in
der Mikroumgebung vorhanden ist, aufreguliert werden kann (Poggi
A. et al., J. Immunol. 1999; 162: 4349–54). Zusammengenommen legen
diese Daten nahe, daß γδ-T-Zellen
schnell an Stellen der Entzündung
im CNS rekrutiert werden konnten, wo sie signifikant zu dem Cytokin/Chemokin-Gleichgewicht
der Läsion
beitragen konnten, wie in EAE demonstriert wurde (Spahn T. W. et
al., Eur. J. Immunol. 1999; 29: 4060–71; Rajan A. J. et al., J.
Immunol. 2000; 164: 2120–30).
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Demzufolge
würde die
Verfügbarkeit
einer Verbindung mit Immunmodulationseigenschaft auf die angeborene
Immunantwort von Effektor-γδ+-T-Zellen von großem Vorteil
für Subjekte sein,
die dieses benötigen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Es
wurde nun gefunden, daß eine
Verbindung der 3,5-Diaryl-s-triazol-Klasse von Molekülen, mehr spezifisch (3-(2-Ethylphenyl)-5-methoxyphenyl)-1H-[1,2,4]-triazol
(nachfolgend auch ST1959 bezeichnet) effizient spezifische Autoimmunkrankheiten
behandelt. Es wurde ebenfalls festgestellt, daß die Verbindung gemäß dieser
Erfindung die γδ-T-Zelleffektorantwort
durch einen nicht-cytotoxischen Mechanismus inhibiert.
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Ein
Verfahren zur Behandlung eines Subjektes, das durch eine Autoimmunerkrankung
beeinträchtigt
ist, umfassend die Verabreichung einer effektiven Menge von (3-(2-Ethylphenyl)-5-methoxyphenyl)-1H-[1,2,4]-triazol
an das Subjekt, wird angegeben.
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Insbesondere
ist das Subjekt durch eine Autoimmunerkrankung beeinträchtigt wie
multiple Sklerose, Lupus erythematosus sistemicus, rheumatoide Arthritis
(RA).
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In
einem bevorzugten Merkmal dieser Erfindung ist das Subjekt ein Säuger, mehr
bevorzugt ein Mensch.
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(3-(2-Ethylphenyl)-5-methoxyphenyl)-1H-[1,2,4]-triazol
wird in
US 4,379,155 ,
erteilt am 5. April 1983, als Teil einer großen Familie von 1,2,4-Triazolen
mit Antifertilitätsaktivität beschrieben. Diese
Verbindung wurde sorgfältig
als Antifertilitätsmittel
untersucht (Galliani et al., Pharm., Dyn. 5, 55–61 (1982). Später offenbart
US 6,323,230 , übertragen
auf Geange Ltd., erteilt am 27. November 2001, eine große Familie
von Stickstoff-heterocyclischen, aromatischen Derivaten, die für die topische Behandlung
der Epithelialgewebeerkrankungen nützlich sind, insbesondere Psoriasis,
atopische Dermatitis, ulzerative Kolitis und Crohn-Erkrankung, und die
Verabreichungsrouten sind epikutan, oral und rektal. Entsprechend
der Offenbarung des erwähnten
US 6,323,230 wird die orale
Route als orale Formulierung verstanden, die zum Verabreichen der
Verbindung spezifisch an der Wirkungsstelle geeignet ist, nämlich an
der Epithelialmucosae des Dünndarms. Tatsächlich ist
die orale Route, wenn sie für
die ursprüngliche
Antifertilitätsaktivität berücksichtigt
wird, nicht die richtige Wahl im Hinblick auf die parenterale Injektion
(Galliani et al., Pharm. Dyn. 5, 55–61 (1982)) aufgrund eines
schnellen und extensiven hepatischen ersten Durchlaufeffektes, der
zur Bildung von inaktiven Metaboliten führt (Assandri A. et al., Drug
Interactions, IV, 237–261
(1982); Assandri A. et al., Xenobiotica 14, 429–433 (1984)). Die gleiche Referenz
lehrt, daß die
Verbindung gemäß dieser
Erfindung keine hormonelle oder antihormonelle oder lympholytische
Aktivität
beibehält,
die Antikörperbildung
gegenüber
corpuscularen Antigenen (ram-Erythrozyten) inhibiert, wenn sie nach
den Mitteln verabreicht wird, keine selektive Wirkung auf Lymphozyten B
und/oder T ausübt.
Das immunologische Profil der Erfindung wurde in Mistrello G. et
al., Immunopharmacology, Bd. 10, 1985, 163–169 beschrieben. In dieser
Referenz erwies sich die Verbindung dieser Erfindung als inaktiv
bei der Behandlung von Arthritis.
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Die
Verabreichung der Verbindung dieser Erfindung erfolgt mit Hilfe
von konventionellen pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie beispielsweise in
den erwähnten
US 4,379,155 und
US 6,323,230 offenbart.
Die bevorzugte Verabreichungsroute ist, obwohl nicht exklusiv, die
subkutane.
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Die
folgenden Beispiele erläutern
diese Erfindung weiterhin.
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Beispiel 1
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Multiple Sklerose
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Blutproben
wurden von 18 gesunden Freiwilligen und 18 Patienten mit klinisch
aktivem MS in der Rückfallphase
oder in der ersten Episode der Erkrankung mit abnormalen Gehirnscan
durch magnetische Resonanzbildgebung erhalten; keiner hatte eine
immununterdrückende
Behandlung für
zumindest 3 Monate vor Beginn der Studie erhalten. Die Patienten und
18 gesunde Donoren wurden bezüglich
Geschlecht und Alter abgestimmt.
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Periphere
und Nabelschnurblut monoklonale Zellen wurden von heparinisiertem
Blut durch Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden)
isoliert und bei 1,5 × 106 Zellen/ml in vollständigem Medium (RPMI 1640, 10%
V/V, wärmeinaktiviertes
FCS, 2 mM, L-Glutamin, 10 U/ml Penicillin/Streptomycin) kultiviert.
PBMC von Kontrolldonoren oder MS-Patienten
wurden in vitro 9 Tage in der Gegenwart von 30 μM Isopentenylpyrophosphat (IPP,
Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) und 50 U/ml rIL-2 (Boehringer Mannheim,
Mannheim, Deutschland) stimuliert. Nach 3-tägiger Kultur wurde das Volumen,
das dem halben Kulturüberstand
entsprach, durch komplettes Medium mit rIL-2 ersetzt. Die Expansion
der Vγ9Vδ2+-T-Zellen
nach 6 Tagen der Kultur wurde durch cytometrische Analyse unter
Verwendung der Doppelfärbung
mit Anti-CD3- und Anti-TCR-Vδ2 mAbs,
gekuppelt an PE bzw. FITC, bestimmt. Der Vδ2-Expansionsindex wurde berechnet,
indem die Absolutzahl der Vδ2+-T-Zellen
in stimulierten Kulturen durch die Absolutzahl von Vδ2+-T-Zellen
in nicht-stimulierten Kulturen dividiert wurde.
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Die
Cytokinproduktion wurde durch fließcytometrische Analyse wie
zuvor beschrieben ermittelt. Menschliches PBMC wurde 6 h mit IPP
(100 μM,
Sigma-Aldrich) und/oder 100 U/ml rIL-2 (Boehringer Mannheim) stimuliert.
Brefeldin A (10 μg/ml)
wurde 1 h nach der Stimulierung zum Blockieren des intrazellulären Transportes,
der die Cytokinakkumulation in Golgi ermöglicht, gegeben. Zellen wurden
zweimal in PBS, 1% BSA und 0,1% Natriumazid gewaschen und mit mAbs,
das für
die oben beschriebene Membran-Ags
spezifisch ist, 15 min bei 4°C
gefärbt.
Proben wurden dann in 1% Paraformaldehyd 10 min bei 4°C fixiert,
mit anti-IFN-mAb, verdünnt
in 1 × PBS,
1% BSA und 0,5% Saponin, fixiert. Die Zellen wurden schließlich zweimal
in 1 × PBS,
1% BSA, 0,1% Saponin gewaschen und auf einem FACScan (BD Bioscience)
gewonnen. Die Kontrolle für
nicht-spezifisches Färben
wurde mit Isotyp-passenden mAbs aufgezeichnet und das nicht-spezifische
Färben
wurde immer subtrahiert.
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IFN-γ-Gehalte
wurden durch ein Standard-Sandwich-ELISA wie zuvor beschrieben bestimmt.
Antikörper
und Standards wurden von PharMingen erworben. Verstärkte Protein-Bindungs-ELISA-Platten
(Nunc Maxisorb; Nunc Maxi Corp., Roskilde, Dänemark) wurden verwendet.
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Ein
ziemlich einzigartiges Merkmal von Vγ9Vδ2 TCR ist die Fähigkeit,
sowohl natürlich
auftretende als auch synthetische nicht-peptidische Phosphoantigene
zu erkennen. Diese Antigene können
in pathogenetischen Mikroorganismen wie Plasmodium, Francisella
und Mycobacterium gefunden werden. Eines von diesen ist Isopentenylpyrophosphat
(IPP), ein 246-Da- Molekül, das eine
5-Kohlenstoff-Isoprenyl-Kette und einen Pyrophosphat-Anteil aufweist.
Nach der Aktivierung durch diese Verbindungen expandieren Vγ9Vδ2 Zellen
und sekretieren Proentzündungscytokine
wie TNF-α und
IFN-γ schnell
und erwerben eine starke cytotoxische Aktivität, was diese Zellen als wichtige
Mediatoren der Entzündung
an Stellen der Ag-Erkennung impliziert. Es ist bekannt, daß IPP exklusiv
die Proliferation des Vδ2Vγ9-T-Zellsubsets stimuliert
und ebenfalls die Cytokinproduktion in der gleichen γδ-T-Zellpopulation
induziert. Zur Bestimmung, ob (3-(2-Ethylphenyl)-5-methoxyphenyl)-1H-[1,2,4]-triazol
die Vδ2-T-Zellexpansion
nach der IPP-Stimulierung inhibiert, wurden frisch isolierte PBMC
von gesunden Donoren oder MS-Patienten entweder mit IL-2, IL-2 + IPP
oder IL-2 + Ipp + (3-(2-Ethylphenyl)-5-methoxyphenyl)-1H-[1,2,4]-triazol
(30 μM oder
60 μM) kultiviert
und die fließcytometrische
Analyse wurde am Tag 6 nach der Stimulierung durchgeführt, zur
Bestimmung des Prozentsatzes der Zellen, die in der Kultur vorhanden
sind, die das Vδ2-Genprodukt
exprimieren. Die Verbindung dieser Erfindung inhibierte effizient
in einer Dosisantwortart die Expansion der Vδ2+T-Zellen bei Kultivierung
zusammen mit IPP (1). Die Prozentsätze der
Inhibition der Expansion waren 39% bzw. 38%, wenn die Verbindung
bei einer Konzentration von 30 μm
in Zellen verwendet wurde, die von MS-Patienten oder gesunden Individuen
isoliert wurden. Ein Unterschied wurde bei der Inhibition, verursacht
durch (3-(2-Ethylphenyl)-5-methoxyphenyl)-1H-[1,2,4]-triazol,
bei einer höheren Konzentration
(60 μM)
in den beiden untersuchten Gruppen beobachtet, 71% Inhibition wurde
in Zellen festgestellt, die von MS-Patienten isoliert wurden, gegenüber 88%
in Zellen von gesunden Individuen.
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Zur
Bestimmung, ob die Verbindung dieser Erfindung toxisch für die Vδ2-T-Zellen
war, wurden nicht-fixierte Zellen mit PI gefärbt, zur Untersuchung der Zellmembranintegrität, und wurden
durch Fließcytometrie
analysiert. In Zellen, die 6 Tage mit IL-2 alleine kultiviert waren,
waren 5,96% Zellen PI+, während
Zellen, die IPP+ IL-2 ausgesetzt waren, 9,66% PI+-Zellen zeigten.
Wenn St1958 (30 μM
oder 60 μM) zugegeben
wurde, waren die PI+-Zellen 15% bzw. 17,65% (2). Die
geringe Erhöhung
von PI+ toten Zellen in den Kulturen, bei denen (3-(2-Ethylphenyl)-5-methoxyphenyl)-1H-[1,2,4]-triazol
zugegeben wurde, im Vergleich zu der mit IPP alleine demonstriert,
daß diese
Verbindung zu einer robusten Inhibition der Vδ2-T-Zellexpansion nach IPP-Stimulierung (56%
Inhibition bei 30 μM
und 91% Inhibition bei 60 μM)
durch einen nicht-cytotoxischen Mechanismus führt (2).
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Zur
Bestimmung, ob (3-(2-Ethylphenyl)-5-methoxyphenyl)-1H-[1,2,4]-triazol die Freisetzung
von Proentzündungsmediatoren
durch VS2-T-Zellen, aktiviert mit Phosphat Ags, inhibierte, wurden
PBMCs mit IPP (30 μM)
in der Gegenwart oder Abwesenheit der Verbindung bei 30 μM und 60 μM aktiviert,
und die Freisetzung von IFN-γ wurde durch
ELISA 24 h nach Stimulierung untersucht. Das Vorhandensein der Verbindung
in dem Medium inhibierte stark die Freisetzung von IFN-γ von diesen
Zellen in einer dosisabhängigen
Art (55% und 65% Inhibition, wenn die Verbindung mit 30 μM in die
Zellen, die von MS bzw. gesunden Donoren isoliert waren, gegeben
wurde; 74% und 82% Inhibition, wenn die Verbindung mit 60 μM zu den
Zellen gegeben wurde, die von MS bzw. gesunden Donoren isoliert
waren; 3).
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Die
Wirkung von (3-(2-Ethylphenyl)-5-methoxyphenyl)-1H-[1,2,4]-triazol wurde auf
die Induktion von Vδ2+
IFN-γ+-Zellen
T-Zellen nach Stimulierung für
6 h mit IPP getestet. Diese Daten zeigen, daß die Verbindung der Erfindung
auf dosisabhängige
Art eine Nettoreduktion der Zahl von Vδ2+-T-Zellen, die IFN-γ produzieren,
nach Stimulierung mit IPP bestimmt.
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(3-(2-Ethylphenyl)-5-methoxyphenyl)-1H-[1,2,4]-triazol,
verwendet bei einer Konzentration von 30 μm führt zu Inhibitionen von 50%
und 25% der Vδ2+
IFN-γ+-Zellen,
induziert durch IPP in Zellen, die von gesunden Donoren bzw. MS-Patienten
isoliert waren. Im Gegensatz dazu war das Inhibitionsausmaß, das mit
60 μM der
Verbindung festgestellt wurde, für
die beiden Gruppen von Patienten ähnlich: 93% Inhibition der
Vδ2+ IFN-γ+ Zellen,
induziert durch IPP in Zellen, isoliert von gesunden Donoren und
92% in Zellen, isoliert von MS-Patienten (4).
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(3-(2-Ethylphenyl)-5-methoxyphenyl)-1H-[1,2,4]-triazol
hat Inhibitionswirkungen auf γδ-T-Zellen
sowohl von MS-Patienten als auch gesunden Individuen. In allen untersuchten
Situationen gibt einen leichten aber signifikanten Unterschied bei den
Inhibitionswirkungen, die auf Zellen entfaltet werden, die von MS-Patienten
stammen, im Vergleich zu jenen, die von gesunden Individuen stammen,
daß die
Inhibition von γδ-T-Zellfunktionen
effektiver bei gesunden Subjekten ist. Poggi A. et al., J. Immunol., 162:
4349 haben zuvor beschrieben, daß γδ-T-Zellen in MS-Patienten mehr
aktiviert sind als diejenigen, die von gesunden Individuen stammten,
weil sie Moleküle
exprimieren, die kritisch für
die Interaktion mit Endothelium sind, und somit schnell in entzündetes Gewebe
migrieren können,
das die Entzündungsantwort
amplifiziert, was der Demyelinierung und folglich der neurologischen
Disfunktion unterliegt. Es ist denkbar, daß die Inhibition einer präaktivierten Zelle
schwerer ist als von einer ruhenden Population, weil dies das Abschalten
von zellulären
Mechanismen erfordert, die bereits initiiert worden sind. Dennoch
erreichte in den meisten Versuchen die Inhibition der γδ-T-Zellfunktion
bei MS-Patienten 60 bis 70%. Angesichts der großen Verbreitung der Ags, die durch
diese Vγ9Vδ2+-T-Zellen
erkannt werden, und der Geschwindigkeit, mit der Proentzündungscytokine
wie IFN-γ und
TNF-α und
Chemokine wie MIP-1α und
MIP-1β durch
Wege erzeugt werden, die von αβ-T-Zellen
verschieden zu sein scheinen, könnten diese
Zellen eine wichtige Rolle beim Übergang
von der angeborenen zur erworbenen Immunantwort durch Beeinflussen
der Reaktionen in Richtung einer Th1-Typ-Antwort spielen. Dies würde nahelegen, daß an Stellen
der Ag-Erkennung (3-(2-Ethylphenyl)-5-methoxyphenyl)-1H-[1,2,4]-triazol
effektiv die γδ-T-Zellaktivierung
inhibieren könnte,
was breite Implikationen für
die Aktivierung sowohl der angeborenen als auch der erworbenen Immunantwort
haben könnte.
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Beispiel 2
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Lupus
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MRL/lpr-Mäuse (weiblich)
mit etwa 6 Wochen wurden von Jackson (USA) erhalten. Diese Mäuse entwickelten
spontan eine lupusartige Pathologie etwa in der 8. Woche. Die ST1959-Verabreichung
begann bei der 6. Woche und wurde s.c. zweimal pro Woche 2,5 mg/kg
in 0,1 ml Sesamöl
durchgeführt.
Eine Gruppe der behandelten und eine Gruppe der Kontrolle (Sesamöl) waren
in der Studie (12 Mäuse/Gruppe)
enthalten. Einmal pro Woche wurde die renale Schädigung durch Ermitteln von
Proteinuria und Harn-Leukozyten aufgezeichnet. Die in 5a aufgezeichneten Daten repräsentieren
den Durchschnitt des Prozentsatzes der Tiere mit Harn-Proteinen
von mehr als 100 mg/dl in den beiden Gruppen. Panel b zeigt die
Bewertung der Harn-Leukozyten (Bewertung 0–3) an. Alle Bestimmungen wurden
durch die Verwendung von Multistix 10SG (UK) durchgeführt. Panel
c zeigt den Überlebensprozentsatz
der beiden Gruppen und eine Verzögerung des
Beginns der Mortalität
für die
mit ST1959 behandelten Tiere im Vergleich zur Kontrollgruppe und
eine höhere
Gesamtüberlebensrate
mit 60 bzw. 25% an. Die Verabreichung von ST1959 beeinflußte nicht
das Körpergewicht
der behandelten Tiere, wie in Panel d gezeigt ist, wodurch ein Mangel
an Toxizität
nahegelegt wird.
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Beispiel 3
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Collagen-induzierte Arthritis
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DBA/IJ-Mäuse wurden
von Charles River (Italien) erhalten. Die Induktion der Arthritis
wurde durch Verabreichung am Tag 0 und +21 von 100 μl/Maus i.d.
von Emulsionen, die sich aus einem gleichen Volumen an Complete
Freund-Adjuvant + 2 mg/ml M. tubercolosis und 4 mg/ml Rinderserum
Typ II Collagen zusammensetzten, durchgeführt. Mäuse wurden statistisch den
Studiengruppen (8 Mäuse/Gruppe)
zugeführt,
einschließlich:
ST1959 o.s. behandelt, Cyclosporin (CSA) o.s. behandelt, Vehikel (Sesamöl). Imitations-Mäuse wurden mit Emulsion, die
das Collagen nicht enthielten, behandelt und erhielten keine weitere
Verabreichung. Die Verbindungen wurden 3-mal pro Woche s.c. oder
o.s. in 0,1 ml Sesamöl
beginnend mit Tag 0 oder Tag +21 verabreicht. Die Bewertungen der
Entzündung
und der Anchilose waren zwischen 0–3 für jedes Glied. Wie in 6 gezeigt
ist, reduzierte die ST1959 s.c.-Behandlung signifikant sowohl die
Entzündungen
(6a) als auch die Anchilose (6b). Im Gegensatz dazu erzeugte die
orale Verabreichung keine therapeutische Wirkung. Die s.c.-Dosis
von ST1959 war 1/1500 seines LD50. Die Cyclosporin-Behandlung
war bei sehr hoher Dosis (100 mg/kg) als positive Kontrolle enthalten.
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Beispiel 4
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Experimentelle Autoimmunencephalomyelitis
(EAE)
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Weibliche
Lewis-Ratten (7 Wochen alt) wurden von Harlan gekauft. Die Induktion
von EAE wurde durch Injizieren von 100 μg/200 μl/Ratte Myelin Basic Protein
(MBP), emulgiert in unvollständigem Freund's Adjunvans (200 μl/Ratte),
umfassend wärmegetötetes Mycobacterium
tuberculosis (Mt) H34Ra, 350 μg/250 μl/Ratte in
jede hintere Pfote (Hoban C. J., Exp. Opin. Ther. Patents, 8, 7,
831–854, 1998;
Ledeen R. W. et al., Neurochemical Research, 23,3, 277–289, 1998;
Nagai H. et al., Gen. Pharmac., 30, 2, 161–166, 1998; Sommer N. et al.,
Nature Medicine, 1, 3, 1995; Simmonds S. et al., Immunology Methods
Manual, Academic Press Ltd., 1997) durchgeführt.
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Nach
der encephalitogenen Aussetzung wurden die Mäuse täglich beobachtet und klinische Manifestationen
von EAE wurden auf einer Skala im Bereich von 0 bis 6 wie folgt
ausgewertet:
0: keine klinischen Anzeichen, 1: schlaffer Schwanz, 2:
teilweise Paralyse der Hinterpfote; 3: vollständige Paralyse der Hinterpfote;
4: Paralyse der Vorderpfote.
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Ratten
wurden statistisch den Studiengruppen zugewiesen, einschließlich: Kontrolle
(Emulsion + MBP), Imitation (Emulsion), behandelt (Emulsion + MBP
+ ST1959 subkutan in Sesamöl
0,25, 0,50, 1,58 oder 5,00 mg/5 ml/kg). St1959 wurde täglich vom
Tag 3 bis 22 nach Immunisierung verabreicht.
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Die
Kontrolltiere zeigten klinische Anzeichen von monophasischer EAE
10 Tage nach der Immunisierung und die vollständige Wiedergewinnung nach 22
Tagen; ST1959 reduzierte die Ernstheit, die Häufigkeit und den Beginn der
Erkrankung (7, 8) bei vier
unterschiedlichen Dosen.
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Beispiel 5
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Experimentelle Autoimmun-Uveitis
(EAU)
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Männliche
Lewis-Ratten (7 Wochen alt) wurden von Harlan gekauft. Die Induktion
von EAU wurde durchgeführt,
indem in jede Hinterpfote 125 μl/200 μl/Ratte synthetisches
menschliches retinales Antigen S-Ag, emulgiert in unvollständigem Freund-Adjuvans
(200 μl/Ratte),
umfassend wärmegetötetes Mycobacterium
tuberculosis (Mt) H34Ra (800 μg
200 μl/Ratte).
injiziert wurde. Die Ratten erhielten Bordetella Pertussis Toxin
(1 μg/300 μl/Ratte in
PBS) in die Schwanzvene unmittelbar nach Immunisierung (Barton K.
et al., Eye, 8, 60–65,
1994; Forrester J. V. et al., Chem. Immunol. Basel, Karger, 73,
159–185,
1989; Smith J. R. et al., Immunology und Cell Biology, 76, 497–512, 1998;
Zamir E. et al., Free Radical Biology & Medicine, 27 (1–2), 7–15, 1999).
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Nach
der encephalitogenen Aussetzung wurden die Ratten täglich beobachtet
und klinische Manifestationen von EAU wurden wie folgt bewertet:
Keine
klinischen Anzeichen: 0
Iris-Hyperämie:
Niedrig: 1
Mild:
2
Stark: 3
Hypopyon:
Niedrig: 1
Mild: 2
Stark:
3
Maximale kumulative klinische Bewertung für beide Augen: 12
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Ratten
wurden statistisch den Studiengruppen zugewiesen, einschließlich: Kontrolle
(Emulsion + S-Ag), Imitation (Emulsion), behandelt (Emulsion + S-Ag
+ ST1959 subkutan in Sesamöl
0,50 mg/ml/kg). ST1959 wurde täglich
vom Tag 3 bis 22 nach Immunisierung verabreicht.
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Kontrolltiere
zeigten klinische Anzeichen von EAU 10 Tage nach der Immunisierung
und eine Verbesserung, aber keine vollständige Wiedergewinnung nach
20 Tagen; ST1959 reduzierte die Ernstheit der Erkrankung bei 0,50
mg/5 ml/kg (9).