USO DE (3- (2-ETILFENIL) -5-METOXIFENIL) -1H- [1,2,4] -TRIAZOL PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES
Campo de la invención La presente invención se refiere a un método para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, las cuales son tratadas de manera efectiva mediante la administración del compuesta (3 - (2 -etilfenil) - 5 -metoxifenil ) - 1H- [1,2,4] - triazol . Antecedentes de la invención La esclerosis múltiple (MS, por sus siglas en inglés) es una enfermedad desmielinante , inflamatoria del sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés) que se piensa es mediada por un ataque autoinmune dirigido contra antígenos de mielina del CNS. En base a modelos animales, así como también en datos reunidos de análisis de leucocitos y tej idc^ jie_pacieji^s„.con„ considera qué reside "dentro denlas células T que expresan el receptor de células T aß (TCR, por sus siglas en inglés) , con actividad encefalitógena dependiente de la expresión de un perfil de citocina característico de un fenotipo del tipo Thl : interferon-gamma (IFNy, por sus siglas en inglés), linfotocina (LT, por sus siglas e inglés) y factor de necrosis tumoral -alfa (TNFa, por sus siglas en inglés). Las células T que expresan un perfil de citocina del tipo Th2 (IL-4, IL-5 y IL-13) o las citocinas regulatorias , tal como
REF: 159420 el factor de crecimiento transformante-beta (TGFP , por sus siglas en inglés) e IL-10, interfieren con este proceso al bloquear la adquisición del fenotipo Thl y/o al bloquear los objetivos corriente abajo de las citocinas efectoras, tal como la activación de mac ófagos . La naturaleza crítica del perfil de citocina de las células T ß reactivas hacia los antígenos para la expresión de enfermedades da origen a la cuestión en cuanto a la naturaleza del proceso de reconocimiento de antígenos que da por resultado la adquisición de estos perfiles de citocina específicos. Aunque se ha sabido durante algún tiempo que la presencia de adyuvantes y la ruta de presentación de antígenos son determinantes importantes de la actividad encefalitógena en animales, el saber como estos procesos definen la naturaleza de la respuesta inmune adquirida, así como también la _j:ontribuci0n__d^ · - leucocitos no- específicas. " de" "áhtígenos , han comenzado solo recientemente a entrar en el punto central más definido con un reconocimiento expansible de las diferentes poblaciones de células que funcionan en la interfaz entre la respuesta inmune innata y adquirida. La respuesta inmune innata funciona como una primera línea de defensa contra un amplio rango de infecciones y agentes tóxicos. Históricamente, esta respuesta ha sido atribuida a células con actividad fagocítica, tales como los macrófagos y las células polimorfonucleares , y/o actividad citotóxica potente, tal como células asesinas naturales (células NK, por sus siglas en inglés) , mastocitos y eosinófilos. La actividad de estas diferentes poblaciones de células es ayudada e inducida por una variedad de diferentes moléculas solubles conocidas colectivamente como proteínas de fase aguda, tales como los interferones, componentes específicos de la cascada de complementos y citocinas, que sirven para mejorar la actividad fagocítica y citotóxica, así como también conducen a la acumulación de estas células en sitios de una lesión del tejido. Si estas primeras líneas de defensa son rotas, entonces resulta la activación de la respuesta inmune adaptable, lo que conduce a la formación de una respuesta inmune específica que puede exhibir cualquiera de una variedad de diferentes
adquirida es una 'propiedad exclusiva de los linfocitos. Sin embargo, más recientemente se ha reconocido que las subpoblaciones menores de linfocitos también pueden funcionar como parte de la respuesta inmune innata. Aunque es probable que el papel funcional, completo de estos subconj untos especializados de linfocitos permanezca entendido pobremente, el interés actual en estos se ha enfocado en su papel en la definición del medio ambiente de las citocinas en sitios de una lesión del tejido, que influyen en la naturaleza de la respuesta inmune adaptable que se genera. De esta manera, muchos de estos estudios se han enfocado en el papel del IFNy e IL-12 en la definición de un perfil de citocina del tipo Thl e IL-4, un perfil de citocina del tipo Th2. Las subpoblaciones de los tres grupos principales de linfocitos, células T aß, células T ?d y células B, se encuentran probablemente dentro de esta categoría. Estas poblaciones de linfocitos están caracterizadas por el uso de complejos de receptores de antígenos altamente conservados, la expresión de receptores de reconocimiento de patrones adicionales, tales como miembros de la familia de receptores similares a Toll y receptores detectados normalmente en las células NK y la liberación rápida de altos niveles de citocinas y quimiocinas después de la interacción con ligandos específicos. _^élulas_ ?_.?d : _.]^s_célul_as^T--que-expresan~el-^receptor de -células " T -?d "(TC ) "* constitu'yén una población menor de la población de células T circulantes, totales. En común con las células T aß, las células T ?d expresan un TCR reordenado, pero los mecanismos involucrados en la adquisición de la diversidad de TCR, así como también la naturaleza de los antígenos reconocidos, son claramente diferentes (Chien Y.H. y colaboradores, Annu. Rev. I munol . 1996;14 : 511-32) . El análisis de las distribuciones de longitud de CDR3 , así como también los estudios de cristalografía, han sugerido una similitud estructural más grande del TCR ?d con los genes de cadenas pesadas de inmunoglobulina, lo que conduce a un soporte adicional a la conclusión que la naturaleza molecular del reconocimiento de antígenos por las células T ?d es fundamentalmente . diferente de aquel utilizado por las células T aß. Las células T ?d también difieren de las células T aß en que la mayoría de células T ?d coexpresan receptores encontrados en las células asesinas naturales (NK-R) (Battistini L. y colaboradores; J. Immünol . 1997; 159:3723- 30) . Se ha mostrado que la expresión de estos receptores en células T modula varias funciones de células T que incluyen la citotoxicidad, liberación de citocinas y migración de células trans endoteliales . {Reyburn H. y colaboradores, Immunol . Rev. 1997; 155 : 119-25) . Estos datos indican que la regulación de la función de células T ?d es probable que sea
aß,- que -involucra la "activación (o inhibición) por medio de la señalización a través de tanto el TCR como el NK-R. Se ha sugerido que el NK-R funciona como moléculas co-estimuladoras que son intensamente sensibles a cambios en la expresión en la superficie celular de MHC modulada por la infección o al estado de activación de las células (Reyburn H. y colaboradores, ibid.) . En adultos saludables, la mayoría de células T ?d expresa un TCR que utiliza los segmentos del gen Vy9V62. Se piensa que la expansión de esta población específica de células T ?d es debido a la respuesta a antígenos bacterianos no proteínicos, tales como derivados de pirenil-pirofosfato y otros componentes de las paredes de células bacterianas, sin la restricción de MHC clásica {Salerno A. y colaboradores, Crit. Rev. Inmuno1. 1998; 18 : 327-57) . La respuesta a estos tipos de antígenos se ha encontrado que es críticamente dependiente del uso de residuos de lisina codificados por la línea germinal en el segmento Jyl.2 (Miyagawa F.1 y colaboradores, J. Inmuno1. 2001; 167:6773-6779). De esta manera, aunque la respuesta a los antígenos de fosfato puede ser de naturaleza policlonal, los elementos conservados son utilizados por las células responsivas. Las secuencias conservadas del receptor de células T ?d se han observado en células y/o tejidos aislados de pacientes con MS, lo que
- Las- células T~ ?d comparten muchas características en común con las células PTCR+NK-T, que incluyen la expresión de receptores de NK, expresión constitutiva de IL-2rp, el uso de secuencias de TCR altamente conservadas y restricción, al menos para algunos subconjuntos , por las moléculas CD1 (Spada F. M. y colaboradores, J. Exp. ed. 2000; 191 : 937-48) . Esto sugeriría que algunas células T ?d pueden proporcionar un enlace similar entre la respuesta inmune innata y adquirida (Poccia F. y colaboradores, Iitwnunol . Today 1998;19:253-6).
Consistente con este concepto es que se ha mostrado que la activación de células T ?d2+ con antígenos de fosfato conduce a la liberación rápida de grandes cantidades de tanto citocinas como quimiocinas (Poccia F. y colaboradores, J. 5 Immunol . 1997; 159:6009-17; - Cipriani B. y colaboradores, Blood 2000;95:39-47). Interesantemente, existen datos acumulativos que sugieren que el uso de la región V puede implicar subconjuntos específicos de células T ?d en la mediación de las respuestas del tipo Thl o Th2 — con células 0 V62 + que muestran una propensión por el subtipo Thl y células ?d1 + una propensión por el tipo Th2. De esta manera, por ejemplo, se ha mostrado que las células T ?d en las lesiones de MS expresan predominantemente un fenotipo de ?d2 (Battistini L. y colaboradores, Mol. Med. 1995; 1:554-62) y que las 5 células ?d2 en la sangre periférica de pacientes con MS
Libero G. , Springer Semin. Immunopathol . 2000; 22:219-38) . Los estudios que han examinado un papel potencial 0 de las células T ?d en las enfermedades desmielinantes soportan adicionalmente la conclusión que aunque las células T ?d muestran evidencia de activación en pacientes con MS o síndrome Guillain Barré (GBS) , existen diferencias en las propiedades fenotípicas y funcionales de estas células en las 5 dos enfermedades. En particular, los datos indican que en pacientes con MS, el subconjunto VÓ2 es activado y que en estas células pueden ser inducidas para secretar altos niveles de citocinas proinflamatorias . Una vez activadas por medio del CTR, las células T ?d también pueden funcionar como células NK, que responden en forma ya sea positiva o negativa a los objetivos de células NK (Battistini L. y colaboradores; J. Im unol . 1997; 159:3723-30); De Libero G. , Microbes Infect. 1999; 1:263-7). Además, en pacientes de MS con enfermedad activa, el porcentaje de células T V52+ circulantes que coexpresan NKRP1A (el homologo humano de NK1.1) se ha descubierto que es significantemente incrementado en comparación con donadores saludables. Cuando las células T V52+ y V6l+ se clasificaron de pacientes con MS y voluntarios saludables y se clonaron, todos los clones de ?d2+ expresaron NKRP1A. NKRP1A fue
NKRP1A por IL-12 en clones de V6l+. En ensayos de migración transendotelial , los clones de ?d2+ NKRP1A+ · migraron de manera más efectiva que los clones de VÓ1+ y este potencial de migración fue mejorado después del cultivo con IL-12. La migración fue inhibida fuertemente por F(ab')2 del anticuerpo anti-NKRPlA, lo que sugiere que este receptor para lecitinas comunes está involucrado en el proceso de migración de células transendotelial. También se ha mostrado que en PBMC aislado recientemente de pacientes con MS, la población migrada fue enriquecida en células V62+ NKRP1A+. De esta manera, la expresión de NKRP1A en células VÓ2+ está asociada con una capacidad incrementada para migrar a través del endotelio vascular, una actividad que puede ser sobreregulada por la IL-12 presente en el microambiente (Poggi A. y colaboradores , J. Immunol. 1999; 162: 4349-54) . Tomados conjuntamente, estos datos sugieren que las células T ?d podrían ser reclutadas rápidamente en sitios de la inflación en el CNS donde estas podrían contribuir significantemente al balance de citocinas/quimiocinas de la lesión, como se ha demostrado en EAE (Spahn T.W. y colaboradores, Eur. J. Immunol. 1999; 29: 4060-71; Rajan A.J. y colaboradores, 2000; 164 : 2120-30) . Por consiguiente, la disponibilidad de un compuesto que tenga propiedades inmunomoduladoras en la respuesta inmune innajza de_ las ._.células^-T—?d+-- -efectoras~~seríT~dé~'~grán beneficio para sujetos "en necesidad del mismo. Descripción detallada de la invención Ahora se ha descubierto que un compuesto de la clase de moléculas 3, 5-diaril-s-triazoles, más precisamente (3-(2-etilfenil) 5-metoxifenil) -1H- [1, 2, 4] -triazol posteriormente también llamado ST1959) trata de manera eficiente las enfermedades autoinmunes. También se ha descubierto que el compuesto de acuerdo con la presente invención inhibe la respuesta efectora de células T ?d por medio de un mecanismo no citotóxico.
Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es un método para el tratamiento de un sujeto afectado por una enfermedad autoinmune que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de (3- (2- etilfenil) - 5-metoxifenil ) -1H- [1, 2,4] -triazol . · En particular, de acuerdo con el método de la presente invención, el sujeto está afectado por una enfermedad autoinmune, tal como esclerosis múltiple, lupus erimatoso sistémico, artritis reuatoide (RA, por sus siglas en inglés) . En otro aspecto de la presente invención, un objetivo adicional de la presente invención es un método para inhibir las células T ?d en un sujeto en necesidad del mismo, el método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de (3- (2-etilfenil) -5-metoxifenil) -1H- [1,2,4] -triazol. En una modalidad preferida de la presente invención, el sujeto es un mamfero,_más_preferib^ [1 , 2 , 4] -triazol se describió en la patente norteamericana No. 4,379,155, expedida el 5 de abril de 1983, como parte de una gran familia de 1 , 2 , 4-triazoles con actividad anti- fertilidad. Este compuesto se estudió completamente como un agente anti- fertilidad [Galliani y colaboradores, Pharm. Dyn, 5, 55-61 (1982) ) . Posteriormente, la patente norteamericana No. 6,323,230, asignada a Geange Ltd, expedida el 27 de noviembre de 2001, describe una gran familia de derivados aromáticos, heterocíclicos de nitrógeno que son útiles para el tratamiento tópico de enfermedades de tejidos epiteliales, en particular, psoriasis, dermatitis atópica, colitis ulcerativa y enfermedad de Crohn y las rutas de administración son epicutánea, oral y rectal. De acuerdo con la descripción de la patente norteamericana No. 6,323,230, mencionada anteriormente, la ruta oral debe entenderse como una formulación oral que es adecuada para el suministro del compuesto específicamente en el sitio de acción, específicamente en la mucosa epitelial del intestino delgado. De hecho, la ruta oral, cuando se considera para la actividad anti-fertilidad, original, no es la elección correcta con respecto a la inyección parenteral (Galliani y colaboradores, Pharm. Dyn, 5, 55-61' (1982) ) , debido a un efecto de primer paso hepático, rápido y extensivo que conduce a la formación de metabolitos
La misma referencia enseña que el compuesto de acuerdo con la presente invención no retiene actividad hormonal o anti- hormonal o linfolítica, inhibe la formación de anticuerpos contra antígenos corpusculares (eritrocitos de carnero) cuando se administra después de los agentes, no ejerce una selección selectiva sobre los linfocitos B y/o T. El perfil inmunológico del compuesto se describió en Mistrello G. y colaboradores, Immunopharmacology, volumen 10, 1985, 163-169.
En esta referencia, el compuesto de la presente invención mostró que era inactivo en el tratamiento de la artritis. El compuesto de la presente invención tiene actividad inhibitoria sobre las células T ?d, por lo tanto, es útil en el tratamiento de enfermedades, las cuales son tratadas de manera efectiva por medio de la administración de un compuesto que inhibe las células T ?d. La administración del compuesto de la presente invención se hace por medio de composiciones farmacéuticas, convencionales, por ejemplo, como se describe en las patentes norteamericanas Nos. 4,379,155 y 6,323,230 mencionadas anteriormente. La ruta de administración preferida, aunque no exclusiva, es la ruta subcutánea. Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención.
Se obtuvieron muestras de sangre de 18 voluntarios saludables y de 18 pacientes con MS clínicamente activa en la fase de recaída o en el primer episodio de la enfermedad, con exploración del cerebro de formación de imágenes de resonancia magnética anormal; ninguno había recibido un tratamiento inmunosupresivo durante al menos 3 meses antes de entrar al estudio. Los pacientes y los 18 donadores saludables fueron iguales en cuanto al sexo y la edad.
Las células mononucleares de sangre periférica y de la espina dorsal fueron aisladas de sangre con heparina por medio de Ficoll -Hypaque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y fueron cultivadas a 1.5 x 106 célulad/ml en medio completo (RPMI 1640, PCS inactivado térmicamente al 10% v/v, L- Glutamina 2 mM, 10 U/ml de penicilina/estreptomicina) . Las PBMC de los donadores de control y pacientes con MS se estimularon in vi tro durante 9 días en presencia de isopentenil -pirofosfato 30 µ? (IPP; Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) y 50 U/ml de rIL-2 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) . Después de 3 días de cultivo, el volumen correspondiente al sobrenadante de medio cultivo fue reemplazado por el medio completo con rIL-2. La expansión de células T Vy9V62+ después de 6 días de cultivo se determinó por medio del análisis citométrico utilizando la tinción
dividiendo el número absoluto de células T ?d2+ en cultivos estimulados por el número absoluto de células T V62 + en cultivos no estimulados. La producción de citocina fue detectada por el análisis citométrico del flujo como se describió previamente. Las PBMC de humano se estimularon durante 6 horas con IPP (100 µ? Sigma-Aldrich) y/o 100 U/ml de rIL-2 (Boehringer Mannheim) . Se adicionó Brefeldin A (10 g/ml) 1 hora después de la estimulación para bloquear el transporte intracelular que permite la acumulación de citocinas en el aparato de Golgi . Las células se lavaron dos veces en PBS, BSA al 1% y azida de sodio al 0.1% y se tiñeron con mAbs específicos para los Ags de membrana descritos anteriormente durante 15 minutos a 4°C. Las - muestras luego se fijaron en paraformadehído al 1% durante 10 minutos a 4°C, se incubaron con mAb anti-IFN diluido en PBS lx, BSA al 1% y saponina al 0.5%. Las células se lavaron finalmente dos veces en PBS lx, BSA al 1%, saponina al 0.1% y se adquirieron en un dispositivo FACScan (BD Biosciences) . El control para la tinción no específica se supervisó con mAbs acoplados al isotipo y la tinción no específica se dedujo siempre. Los niveles de IFN-? se determinaron por un ensayo ELISA interpuesto, estándar como se describiera previamente.
- - pharMingen - Se- util'izaron "placas de ELISA de unión de proteína mejorada (Nunc axisorb; Nunc Maxi Corp., Roskilde, Dinamarca) . Una característica preferiblemente única del TCR ?d9?d2 es su capacidad para reconocer los fosfoantígenos no peptídicos tanto de origen natural como sintéticos. Estos antígenos se pueden encontrar en microorganismos patógenos, tales como Plasmodium, Francisella y Mycobacterium . Uno de estos es el isopentenil -pirofosfato (IPP), una molécula de 246 -Da que tiene una cadena de isoprenilo de cinco átomos de carbono y un radical de pirofosfato. Después de la activación de estos compuestos, las células ?d9?d2 se expanden y secretan rápidamente citocinas proinflamatorias tales como TNF-cc e IFN-? y adquieren actividad citotóxica potente, lo que implica a estas células como mediadores importantes de la inflación en sitios de reconocimiento de Ag. Se sabe que IPP estimula exclusivamente la proliferación del subconjunto de células T ?d2??9 y también induce la producción de citocinas en la misma población de células T ?d. Para determinar si el compuesto (3 - (2 -etilfenil) -5-metoxifenil) -1H- [1,2,4] -triazol inhibe la expansión de células T ?d2 después de la estimulación de IPP, las PBMCs aisladas recientemente de donadores saludables o pacientes con MS se cultivaron ya sea con IL-2, IL-2 + IPP o IL-2 + IPP + (3- (2-etilfenil) -5-metoxifenil ) - 1H-_[.1 ,_2 ,_4j jLriazol _(30^_µ?~?::60—µ?)~?.-3?~=-??a1'???'~ el -análisis- Gitométrico ~dé~"Flujcf el día 6 después de la estimulación para determinar el porcentaje de células presentes en el cultivo que expresaron el producto del gen ?d2. El compuesto de la presente invención inhibió de manera eficiente, de una manera de respuesta a la dosis, la expansión de células T ?d2+ cuando se cultivaron junto con IPP (figura 1, cuyo título es "El Compuesto ST1959 Inhibe la Expansión Mediada por IPP de Células T ?d2 " ) . Los porcentajes de inhibición de la expansión fueron 39% y 38%, respectivamente, cuando el compuesto se utilizó en la concentración de 30 µ? en células aisladas de pacientes con MS o de individuos saludables. Se observó una diferencia en la inhibición causada por (3- (2-etilfenil) -5-metoxifenil) -1H- [1 , 2 , 4 ] -triazol a una concentración más alta (60 µ ) en los dos grupos estudiados, se encontró una inhibición del 71% en células aisladas de pacientes con MS contra 88% en células de individuos saludables. Para determinar si el compuesto de la presente invención fue tóxico para las células T ?d2 , las células no fijas se tiñeron con PI para valorar la integridad de la membrana celular y se analizaron por medio de la citometría de flujo. En células cultivadas durante 6 dias con IL-2 solo 5.96% de células fueron PI +, mientras que las células sometidas a. prueba con IPP+ IL-2 mostraron 9.66% de células
?I+ -fueron- respectivamente *15% "y 17.65% (figura 2, cuyo título es "El Compuesto ST1959 no Induce la Apoptosis en las Células T ?d2") . El poco incremento de células muertas PI+ en los cultivos donde se adicionó el compuesto (3- (2-etilfenil) -5-metoxifenil) -1H- [1, 2, 4] -triazol en comparación con aquel con IPP solo demuestra que este compuesto conduce a una fuerte inhibición de la expansión de células T ?d2 después de la estimulación con IPP (56% de inhibición a 30 µ? y '91% de inhibición a 60 µ?) por medio de un mecanismo no citotóxico (figura 2) .
Para determinar si el compuesto (3- (2 -etilfenil ) -5- metoxifenil ) -1H- [1 , 2 , 4] -triazol inhibió la liberación de mediadores pro- inflamatorios por células T V52 activadas con Ags de fosfato, las PBMCs fueron activadas con IPP (30 µ?) en presencia o ausencia del compuesto a 30 µ y 60 µ? y la liberación de IFN-? se determinó por medio del ensayo ELISA 24 horas después de la estimulación. La presencia del compuesto en el medio inhibió potentemente la liberación de IFN-? de estas células de una manera dependiente de la dosis (55% y 65% de inhibición donde el compuesto se adicionó a 30 µ? en las células aisladas de MS y donadores saludables respectivamente, 74% y 82% de inhibición cuando se adicionó el compuesto a 60 µ? en las células aisladas de MS y donadores saludables, respectivamente - figura 3, cuyo título es "El Compuesto ST1959 Inhibe la Liberación de IFNy en
metoxifenil) -1H- [1 , 2 , 4] -triazol se sometió a prueba sobre la inducción de células T ?d2 + IFN-? + células después de la estimulación durante 6 horas con IPP) . Estos datos muestran que el compuesto de la invención determina una reducción neta de una manera dependiente de la dosis del número de células T V52+ que producen IFN-? después de la estimulación con IPP. El compuesto (3- (2 -etilfenil ) -5-metoxifenil) -1H- [1 , 2 , 4 ] -triazol utilizado a una concentración de 30 µ? conduce a la inhibición de 50% y 25% de las células V62+ IFN- ?+ inducidas por IPP en células aisladas de donadores saludables y pacientes con MS, respectivamente. Por el contrario, el nivel de inhibición encontrado con 60 µ? del compuesto fue similar para los dos grupos de pacientes: 93% de inhibición de las células ?d2+ IFN-y+ inducidas por IPP en células aisladas de donadores saludables y 92% en células aisladas de pacientes con MS (figura 4, cuyo título es "El Compuesto ST1959 Inhibe las Células T ?d2 que Producen IFNy") . El compuesto (3- (2-etilfenil) -5-metoxifenil) -1H- [1 , 2 , 4] -triazol tiene efectos inhibitorios sobre células T ?d de tanto pacientes con MS como pacientes saludables. En todas las situaciones sometidas a prueba existe una ligera - pero significante - diferencia en los efectos inhibitorios explotados en células derivadas de pacientes con MS en
efectiva en sujetos saludables. Poggi, A. y colaboradores, J. Immunol . 162:4349 han descrito previamente que las células T ?d en pacientes con MS son más activadas que aquellas derivadas de individuos saludables, ya que estas expresan moléculas las cuales son críticas para la interacción con el endotelio y de esta manera pueden migrar rápidamente en el •tejido inflamado amplificando la respuesta inflamatoria que es subyacente a la desmielinación y, consecuentemente, la disfunción neurológica. Es concebible que la inhibición de una célula pre-activada es más ardua que aquella de una población restante, puesto que requiere la conclusión de mecanismos celulares que ya han sido iniciados. No obstante, en la mayoría de ensayos, la inhibición de la función de células T ?d en pacientes con MS alcanzó 60-70%. Dada la distribución amplia de Ags reconocidos por estas células T Vy9V62+ y la rapidez con la cual las citocinas pro-inflamatorias, tales como IFN-? y TNF-a, y las quimiocinas, tales como ???-?a y ???-?ß, son producidas por todas las vías que parecen diferir de las células T aß, estas células podrían jugar un papel importante en la transición de la respuesta inmune innata a la respuesta inmune adquirida por la propensión de las reacciones hacia una respuesta del tipo Thl . Esto sugeriría que en los sitios de reconocimiento de Ag, el compuesto (3- (2 -etilfenil) -5-
implicaciones amplias para la activación de respuestas inmunes tanto innatas como adquiridas . Ejemplo 2 Lupus Los ratones MRL/lpr (hembra) de aproximadamente 6 semanas de edad se obtuvieron de Jackson (EUA) . Estos ratones desarrollaron espontáneamente una patología similar a Lupus alrededor de la semana 8. La administración de ST1959 se inició en la 6- semana y se realizó s.c. dos veces/semana 2.5 mg/kg en 0.1 mi de aceite de ajonjolí. Un grupo tratado y un grupo de control (aceite de ajonjolí) se incluyeron en el estudio (12 ratones/grupo) . Una vez a la semana, el daño renal se supervisó al detectar -la proteinuria y leucocitos urinarios. Los datos reportados en la figura 5a (cuyo título es "El Compuesto ST1959 Controla el Daño Renal y Mejora la Supervivencia en un Modelo de Ratones LES") representan el promedio del % de animales con proteínas urinarias más alto que 100 mg/dl en los dos grupos. La figura 5b indica el registro de leucocitos urinarios (puntuación 0-3) . Todas las determinaciones se realizaron por medio del uso de Multistix 10SG (UK) . La figura 5c muestra que el % de supervivencia de los dos grupos e indica un retardo en el comienzo de la mortalidad para los animales tratados con ST1959 en
ST1959 no afectó el peso corporal de los animales tratados como se muestra en la figura 5d lo que sugiere, de esta manera, una falta de toxicidad. Ejemplo 3 Artritis Inducida por Colágeno Los ratones DBA/1J se obtuvieron de Charles Rivers (Italia) . La inducción de artritis se realizó por medio de la administración, en el día 0 y +21, de 100 µ?/ratón i.d. de emulsiones compuestas de volúmenes iguales de adyuvante de Freund completo + 2 mg/ml de M. tuberculosis y 4 mg/ml de colágeno tipo II de bovino. Los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de estudio (8 ratones/grupo) que incluyen: tratado o.s. con ST1959, tratado o.s. con ciclosporina (CSA) , vehículo (aceite de ajonjolí) . Los ratones falsos se trataron con emulsión que carece de colágeno y no recibieron administraciones adicionales. Los compuestos se administraron 3 veces/semana s.c u o.s en 0.1 mi de aceite de ajonjolí iniciando desde el día 0 o el día +21. Las puntuaciones de inflación y anqui-losis fueron entre 0-3 para cada miembro. Como se muestra en las figuras 6a y 6b (cuyo título es "El Compuesto ST1959 Mejora el RA") , el tratamiento s.c. con ST1959 redujo significantemente tanto la inflamación (6a) como la anquilosis (6b) . Por el contrario,
con ciclosporina, en una dosis muy alta (100 mg/kg) se incluyó como el control positivo. Ejemplo 4 Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE) Las ratas Lewis hembra (7 semanas de edad) se adquirieron de Harían. La inducción de EAE se realizó al inyectar en cada almohadilla de la pata posterior 100 µg/200 µ?/rata de Proteína Básica de Mielina (MBP , por sus siglas en inglés) emulsionada en adyuvante de Freund incompleto (200 µ?/rata) que contenía Tuberculosis Microbacterium atenuada térmicamente (Mt) H34Ra, 350 µ9/200 µ?/rata (Hoban C. J. , Exp. Cpin. Ther. Patents, 8,7, 831-854, 1998; Ledeen R. W. y colaboradores, Neurochemical Research, 23, 3, 277-289, 1998; Nagai H. y colaboradores, Gen. Pharmac, 30, 2, 161-166, 1998; Sommer N. y colaboradores, Nature Medicine, 1, 3, 1995; Simmonds S. y colaboradores, Immunology Methods Manual, Academic Press Ltd, 1997). Después de la prueba encefalitógena, los ratones se observaron diariamente y se registraron las manifestaciones clínicas de EAE en una escala que varía de 0 a 6, como sigue: 0: sin signos clínicos; 1: cola flácida; 2: parálisis parcial de las patas posteriores; 3: parálisis completa de las patas posteriores; 4: parálisis de las patas delanteras. Las ratas se asignaron aleatoriamente a grupos de
subcutánea en aceite de ajonjolí 0.25, 0.50, 1.58 o 5.00 mg/5 ml/kg) . El compuesto ST1959 se administró diariamente desde de los días 3 a 22 después de la inmunización. Los animales de control mostraron signos clínicos de EAE monofásico desde 10 días después de al inmunización y recuperación completa después de 22 días; el compuesto ST1959 redujo la gravedad, incidencia y comienzo de la enfermedad (figuras 7 y 8, cuyo título es "ENCEFALOMIELITIS AUTOINMUNE, EXPERIMENTAL") en cuatro dosis diferentes. Ejemplo 5 Uveítis Autoinmune Experimental (EAU) Las ratas Le is macho (ratas de 7 semanas de edad) se adquirieron de Harían. La inducción de EAU se realizó al inyectar en cada almohadilla de la pata posterior, 125 µ9/20 µ?/rata de antígeno retinal de humano sintético S-Ag emulsionado en adyuvante de Freund incompleto (200 µ?/rata) que contenía Microbacterium Tuberculosis atenuado térmicamente (Mt) H34Ra (800 µg 200 µ?/rata) . Las ratas recibieron la toxina Bordetella Pertusis (1 µg/300 µ?/rata en PBS) en la vena de la cola inmediatamente después de la inmunización (Barton K y colaboradores, Eye, 8, 60-65, 1994; Forrester J.V. y colaboradores, Chem. Imraunol. Basel, Karger, 73, 159-185, 1999; Smith J. R. y colaboradores, Immunology and Cell
Después de la prueba encefalitógena, los ratones se observaron diariamente y se registraron las manifestaciones clínicas de EAU como sigue: Sin signos clínicos: o Hiperemia del Iris : Baja: 1 Suave : 2 Grave : 3 Hipopión : Bajo: 1 Suave : 2 Grave : 3 Puntuación clínica, acumulativa, máxima para ambos ojos: 12 Las ratas se asignaron aleatoriamente a grupos de estudio que incluían: control (emulsión + S-Ag) , falso (emulsión) , tratado (emulsión + S-Ag + ST1959 por vía subcutánea en aceite de ajonjolí 0.50 mg/5 ml/kg) . El compuesto ST1959 se administró diariamente desde los días 3 a 22 después de al inmunización. Los animales de control mostraron signos clínicos de EAU desde 10 días después de la inmunización y un mejoramiento, pero no una recuperación completa, después de
enfermedad a- 0-.50 mg/5 ml/kg (figura 9, cuyo título es
"UVEITIS AUTOINMUNE, EXPERIMENTAL") . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere .