JP2005529904A - 自己免疫疾患の治療のための（３−（２−エチルフェニル）−５−メトキシフェニル）−１ｈ−［１，２，４］−トリアゾールの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、自己免疫疾患、特に、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスおよび関節リウマチを患う対象の治療方法を開示し、該方法は、該対象に有効量の３−（２−エチルフェニル）−５−メトキシ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾールを投与することを含む。本発明はさらに必要とする対象においてγδＴ細胞を阻害する方法を開示し、該方法は、該対象に有効量の上記化合物を投与することを含む。

Description

本発明は自己免疫疾患の治療方法に関し、該疾患は化合物（３−（２−エチルフェニル）−５−メトキシフェニル）−１Ｈ−［１，２，４］−トリアゾールの投与により有効に治療される。

多発性硬化症（ＭＳ）は中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性脱髄性疾患であり、ＣＮＳミエリン抗原に対する自己免疫攻撃によって媒介されていると考えられている。動物モデル、およびＭＳ患者からの白血球および組織の分析から収集したデータに基づき、抗原特異性はαβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞に帰すると考えられ、脳炎誘発性活性はＴｈ１−型表現型の特徴であるサイトカインプロフィール（インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）、リンホトキシン（ＬＴ）および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα））の発現に依存すると考えられている。Ｔｈ２−型サイトカインプロフィール（ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３）または調節性サイトカイン（例えば、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦβ）およびＩＬ−１０）を発現するＴ細胞はこのプロセスに、Ｔｈ１−表現型の獲得の阻害および／またはエフェクターサイトカインの下流の標的の阻害（例えばマクロファージの活性化）によって干渉すると考えられている。

疾患の発現に対する抗原−反応性αβＴ細胞のサイトカインプロフィールの重要な性質により、これら特異的サイトカインプロフィールの獲得に至る抗原認識プロセスの性質に対する疑問が持ち上がった。従来からアジュバントの存在および抗原提示経路が動物における脳炎誘発性活性の重要な決定因子であることは知られていたが、どのようにしてかかるプロセスが後天性免疫応答の性質を形成しているか、そしてその他の非抗原−特異的白血球集団の寄与については、最近になって注目され始めたばかりであり、生得的（自然）および後天的（獲得）免疫応答の間のインターフェースにおいて機能する様々なＴ細胞集団が認識されつつある。

生得的免疫応答は広範な感染性および毒性物質に対する防御の最前線として機能する。歴史的に、この応答は食作用活性を有する細胞、例えば、マクロファージおよび多形核細胞、および／または強力な細胞毒性活性を有する細胞、例えば、ナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)、肥満細胞および好酸球に帰するものであった。これらの様々な細胞集団の活性は集合的に急性期タンパク質として知られている多数の様々な可溶性分子によって助けられている。かかるタンパク質としては例えば、インターフェロン、補体カスケードの特異的成分およびサイトカインが挙げられ、食作用および細胞毒性活性の促進に役立っており、組織傷害部位にかかる細胞を蓄積させるのにも役立っている。もしこれらの防御の最前線が破られると、その後に適応免疫応答の活性化が起こり、これによって様々な特徴を示す特異的免疫応答の形成が導かれる。この後天的免疫応答の生成はリンパ球のもっぱらの性質である。

しかし最近では、小数のリンパ球の亜集団が生得的免疫応答の一部としても機能することが認識されるようになった。これらの特別のリンパ球のサブセットの完全な機能的役割はいまだにあまり理解されていないようであるが、現在ではこれらについての関心は、生成する適応免疫応答の性質に影響を与える、組織傷害部位におけるサイトカイン環境の決定におけるそれらの役割に向けられている。したがって、これらの研究の多くは、ＩＦＮγおよびＩＬ−１２のＴｈ１−型サイトカインプロフィールの決定における役割およびＩＬ−４のＴｈ２−型サイトカインプロフィールの決定における役割に注目している。リンパ球の３つの主要な群のすべての亜集団、即ち、αβＴ細胞、γδＴ細胞およびＢ細胞は、このカテゴリーに属するようである。これらリンパ球集団は、高度に保存された抗原受容体複合体の使用、さらなるパターン−認識受容体、例えば、Ｔｏｌｌ−様受容体ファミリーのメンバーまたは通常はＮＫ細胞において検出される受容体の発現、高レベルのサイトカインおよびケモカインの迅速な放出、次いで特異的リガンドとの相互作用によって特徴づけられる。

γδＴ細胞: γδＴ細胞受容体 (ＴＣＲ)を発現するＴ細胞はすべての循環するＴ細胞集団のうちの小さい集団を構成する。αβＴ細胞と同様に、γδＴ細胞は再編成されたＴＣＲを発現するが、ＴＣＲ多様性の獲得に関与するメカニズムおよび認識される抗原の性質は明らかに異なる(Chien Y.H. et al. Annu. Rev. Immunol. 1996;14:511-32 )。ＣＤＲ３の長さの分布の分析、および結晶学的研究により、γδＴＣＲの免疫グロブリン重鎖遺伝子に対するより大きな構造的類似性が示唆され、γδＴ細胞による抗原認識の分子特性は根本的にαβＴ細胞に用いられるものと異なるという結論がさらに支持されるようになった。ほとんどのγδＴ細胞はナチュラルキラー細胞にみられる受容体(ＮＫ−Ｒ)を共発現している点でもγδＴ細胞はαβＴ細胞と異なる(Battistini L. et al.; J. Immunol. 1997;159:3723-30)。Ｔ細胞におけるこれら受容体の発現はいくつかのＴ細胞機能を調節することが示された。かかる機能には、細胞毒性、サイトカイン放出および経内皮細胞遊走が含まれる(Reyburn H. et al.、Immunol. Rev. 1997;155:119-25)。これらのデータは、γδＴ細胞機能の制御はほとんどのαβＴ細胞でみられるものと異なっており、ＴＣＲとＮＫ−Ｒの両方によるシグナル伝達による活性化（または阻害）を伴うようであるということを示す。ＮＫ−Ｒは感染により調節されるＭＨＣの細胞表面発現の変化または細胞の活性化状態に精巧に応答する共刺激分子として機能することが示唆された(Reyburn H. et al.、前掲)。

健康な成人において大多数のγδＴ細胞はＶγ９Ｖδ２遺伝子セグメントを利用するＴＣＲを発現する。γδＴ細胞のこの特異的集団の増殖は、非タンパク質細菌性抗原（例えばピレニル（pyrenil）-ピロリン酸誘導体およびその他の細菌細胞壁の成分）に対する応答によるものであり、古典的なＭＨＣ-拘束を伴わないと考えられている(Salerno A. et al.、Crit. Rev. Immunol. 1998;18:327-57) )。かかるタイプの抗原に対する応答は、Ｊγ１．２セグメントの生殖系列にコードされるリジン残基の使用に決定的に依存することが見いだされた(Miyagawa F. et al.、J. Immunol. 2001;167:6773-6779)。したがって、リン酸抗原に対する応答はポリクローナルの性質であるが、保存されている成分は応答細胞によって使用される。γδＴ細胞受容体の保存配列はＭＳを患う患者から単離された細胞および／または組織においてみられており、共通の抗原に対する応答が示唆される。

γδＴ細胞はαβＴＣＲ＋ＮＫ−Ｔ細胞と共通の多くの特性を共有し、かかる特性には、ＮＫ受容体の発現、ＩＬ−２ｒβの構成的発現、高度に保存されたＴＣＲ配列の利用および少なくともいくつかのサブセットについてのＣＤ１分子による拘束が含まれる(Spada F.M. et al.、J. Exp. ed. 2000;191:937-48)。これによりγδＴ細胞のなかには生得的および後天的免疫応答の間の類似のリンクを提供するものがあり得るということが示唆される(Poccia F. et al.、Immunol. Today 1998;19:253-6)。かかる知見と一致して、Ｖδ２＋Ｔ細胞のリン酸抗原による活性化が多量のサイトカインおよびケモカインの迅速な放出を導くことが示された(Poccia F. et al.、J. Immunol. 1997;159:6009-17; Cipriani B. et al.、Blood 2000;95:39-47)。興味深いことに、Ｖ領域の使用が、Ｔｈ１またはＴｈ２−型応答の媒介において、γδＴ細胞の特異的サブセットに関係する可能性を示唆するデータが蓄積しつつあり、ここでＶδ２＋細胞がＴｈ１−型傾向を示しＶδ１＋細胞がＴｈ２−型傾向を示す。したがって例えば、ＭＳ傷害においてγδＴ細胞は主にＶδ２表現型を発現することが示され(Battistini L. et al.、Mol. Med. 1995;1:554-62)また、ＭＳを患う患者の末梢血におけるＶδ２細胞は活性化の証拠を示すことが示された。しかしＣＳＦにおいてはＶδ１細胞は優勢なγδＴ細胞集団である(De Libero G.、Springer Semin. Immunopathol. 2000;22:219-38)。

脱髄性疾患におけるγδＴ細胞の潜在的な役割を調べた研究によると、さらにγδＴ細胞はＭＳまたはギランバレー症候群（ＧＢＳ）のいずれかを患う患者において活性化の証拠を示すが、これら２つの疾患においてかかる細胞は表現型および機能的特性において異なるという結論が支持される。特に、データによるとＭＳを患う患者においてＶδ２サブセットが活性化され、かかる細胞は高レベルの炎症誘発性サイトカインを分泌するよう誘導されうることが示される。

ＴＣＲを介して一度活性化されると、γδＴ細胞は陽性または陰性の様式にてＮＫ細胞標的に対して応答してＮＫ細胞としても機能し得る(Battistini L. et al.、J. Immunol. 1997;159:3723-30; De Libero G. Microbes Infect. 1999;1:263-7)。さらに、活動性の疾患を患うＭＳ患者においては、ＮＫＲＰ１Ａ(ＮＫ１．１のヒトホモログ）を共発現する循環Ｖδ２＋Ｔ細胞のパーセンテージが健康なドナーと比較して有意に上昇することが判明した。Ｖδ２＋およびＶδ１＋Ｔ細胞をＭＳ患者および健康なボランティアから集め、クローン化すると、すべてのＶδ２＋クローンがＮＫＲＰ１Ａを発現した。ＮＫＲＰ１ＡはＩＬ−１２と培養することによりＶδ２＋細胞上で強く上方制御されたが、ＩＬ−１２によるＮＫＲＰ１Ａの上方制御はＶδ１＋クローンではみられなかった。経内皮遊走アッセイにおいて、Ｖδ２＋ＮＫＲＰ１Ａ＋クローンはＶδ１＋クローンよりもより効率的に遊走し、この遊走能はＩＬ−１２との培養により増強された。遊走は抗-ＮＫＲＰ１Ａ抗体のF(ab')2によって強く阻害され、この共通のレクチンに対する受容体は経内皮細胞遊走プロセスに関与していることが示唆された。ＭＳ患者から新たに単離したＰＢＭＣにおいて、遊走集団においてＶδ２＋ＮＫＲＰ１Ａ＋細胞密度が上昇していたことも示された。したがってＶδ２＋細胞におけるＮＫＲＰ１Ａの発現は、血管内皮を横切る遊走能の上昇に関連しており、ＩＬ−１２によって上方制御されうる活性は微小環境に存在する(Poggi A. et al.、J. Immunol. 1999;162:4349-54)。これらのデータは、ＥＡＥにおいて示されたように、γδＴ細胞はＣＮＳにおける炎症部位に迅速に補充され得、そこで傷害部でのサイトカイン/ケモカインバランスに有意に寄与することができることを示唆する(Spahn T.W. et al、Eur. J. Immunol. 1999;29:4060-71; Rajan A.J. e al.、J. Immunol. 2000;164:2120-30)。

したがって、エフェクターγδ＋Ｔ細胞の生得的免疫応答の免疫調節性を有する化合物によってそれを必要とする対象に多大な利益がもたらされうる。

（発明の概要）
このたび、３，５−ジアリール−ｓ−トリアゾールのクラスの分子の化合物、より具体的には（３−（２−エチルフェニル）−５−メトキシフェニル）−１Ｈ−［１，２，４］−トリアゾール（以下ＳＴ１９５９とも称する）により有効に自己免疫疾患が治療されることが見いだされた。本発明による化合物はまた、非細胞毒性機構によってγδＴ細胞エフェクター応答を阻害することも見いだされた。

したがって本発明の目的は、自己免疫疾患を患う対象の治療方法であって、該対象に有効量の（３−（２−エチルフェニル）−５−メトキシフェニル）−１Ｈ−［１，２，４］−トリアゾールを投与することを含む方法である。

特に、本発明の方法によると、該対象は自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ（ＲＡ）を患うものである。

本発明の別の態様において、本発明のさらなる目的は、必要とする対象においてγδＴ細胞を阻害する方法であり、該方法は、該対象に有効量の（３−（２−エチルフェニル）−５−メトキシフェニル）−１Ｈ−［１，２，４］−トリアゾールを投与することを含む。

本発明の好適な態様において、該対象は哺乳類、より好ましくはヒトである。

（３−（２−エチルフェニル）−５−メトキシフェニル）−１Ｈ−［１，２，４］−トリアゾールは、抗−授精活性を有する１，２，４−トリアゾールの大きなファミリーの一部として１９８３年４月１５日発行の米国特許第４３７９１５５号に記載されている。この化合物は抗−授精剤としてよく研究されている(Galliani et al Pharm. Dyn. 5、55-61 (1982))。その後、Geange Ltd に譲渡された、２００１年１１月２７日発行の米国特許第６３２３２３０号には、上皮組織疾患、特に、乾癬、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎およびクローン病の局所治療に有用な窒素複素環芳香族誘導体の大きなファミリーが開示されており、その投与経路は、皮膚上、経口および直腸である。米国特許第６３２３２３０号に記載の開示によると、経口経路は作用部位、即ち小腸の上皮粘膜に特異的に化合物を送達するのに好適な経口製剤であると理解されたい。実際、経口経路は、元来の抗-授精活性について考慮すると非経口注射とくらべて良好な選択ではない(Galliani et al Pharm. Dyn. 5、55-61 (1982))。というのは、迅速かつ強力な肝臓の初回通過効果により不活性な代謝産物が形成するからである(Assandri A. et al. Drug Interactions、IV、237-261 (1982); Assandri A. et al. Xenobiotica 14、429-433 (1984))。同文献は、本発明による化合物はホルモンまたは抗-ホルモンあるいはリンパ溶解（lympholytic）活性を保持せず、薬剤の後に投与した際、血球抗原 (ラム赤血球)に対する抗体形成を阻害し、リンパ球Ｂおよび／またはＴに選択的作用を発揮しないと教示する。この化合物の免疫学的プロフィールはMistrello G. et al.、Immunopharmacology、vol. 10、1985、163-169に記載されている。この文献において、本発明の化合物は関節炎の治療において不活性であると示されている。

本発明の化合物はγδＴ細胞に対する阻害活性を有しており、それゆえγδＴ細胞を阻害する化合物の投与によって有効に治療される疾患の治療に有用である。

本発明の化合物の投与は従来からの医薬組成物の手段によって行うことができ、例えば、上記米国特許第４３７９１５５号および米国特許第６３２３２３０号に開示されている。好ましい投与経路は、限定的なものではないが、皮下経路である。

以下の実施例により本発明をさらに説明する。

多発性硬化症
血液サンプルを18名の健康なボランティアおよび異常な核磁気共鳴画像脳スキャンを示す18名の再発状態または初発状態の臨床的に活動性のＭＳ患者から得た;試験前少なくとも3ヶ月間はいずれも免疫抑制治療を受けなかったものであった。患者および18名の健康なドナーは性別と年齢が同じものとした。

末梢血および臍帯血単核細胞を、フィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque (Pharmacia Biotech、Uppsala、Sweden)）によってヘパリン処理した血液から単離し、完全培地 (RPMI 1640、10% v/v 熱不活化 FCS、2 mM L-グルタミン、10 U/ml ペニシリン/ストレプトマイシン)中、 1.5 x 10⁶ 細胞/mlにて培養した。対照ドナーまたはMS患者からのPBMCをインビトロで9日間、30μMのイソペンチルピロリン酸(IPP; Sigma-Aldrich、St． Louis、MO)および50 U/mlのrIL-2 (Boehringer Mannheim、Mannheim、Germany)の存在下で刺激した。培養の3日後、培養上清の半分に対応する体積をrIL-2を含む完全培地と交換した。培養の6日後のVγ9Vδ2+T細胞の増殖を、それぞれPEまたはFITCに結合した抗-CD3および抗-TCR-Vδ2mAbによる二重染色を用いてサイトメトリー分析によって測定した。Vδ2増殖インデックスを、刺激した培養中のVδ2+ T細胞の絶対数を刺激していない培養中のVδ2+ T細胞の絶対数で割ることにより算出した。

サイトカイン産生を以前に記載されているようにしてフローサイトメトリー分析によって検出した。ヒトPBMCを6時間IPP (100 μM、Sigma-Aldrich) および/または 100 U/mlのrIL-2 (Boehringer Mannheim)によって刺激した。ブレフェルディンA（Brefeldin A）(10μg/ml)を刺激の１時間後に添加して、細胞内輸送を阻害しゴルジ体にサイトカインを蓄積させた。細胞をPBS、1% BSA、および0.1% アジ化ナトリウムで2回洗浄し、上記の膜Agに特異的なmAbを用いて15分間4℃で染色した。サンプルを次いで1% パラホルムアルデヒドで10分間4℃で固定し、1x PBS、1% BSA、および0.5%サポニン中に希釈した抗-IFN- mAbとともにインキュベートした。細胞を最後に1x PBS、1% BSA、0.1% サポニンで２回洗浄しFACScan (BD Biosciences)にかけた。非特異的染色についての対照を、アイソタイプ適合（isotype-matched）mAbを用いてモニターし、非特異的染色を常に差し引いた。

IFN-γレベルを以前に記載されているような標準的サンドイッチELISAによって測定した。抗体および標準はPharMingenから購入した。強化（Enhanced）タンパク質結合ELISA プレート(Nunc Maxisorb; Nunc Maxi Corp.、Roskilde、Denmark)を用いた。

Vγ9Vδ2TCRの比較的ユニークな特徴は、それが天然および合成の両方の非ペプチドリン酸抗原を認識する能力である。かかる抗原は病原性微生物、例えば、プラスモジウム（Plasmodium）、フランシセア（Francisella）、およびマイコバクテリウム（Mycobacterium）にみられる。これらの１つはイソペンチルピロリン酸(IPP)という246-Daの分子であり、五炭素のイソプレン鎖およびピロリン酸部分を有する。これら化合物による活性化の後、Vγ9Vδ2細胞は増殖して迅速に炎症誘発性サイトカイン、例えば、TNF-αおよびIFN-γを分泌し、強力な細胞毒性活性を獲得する。これは、これら細胞がAg 認識部位の炎症の重要なメディエーターであることを意味する。IPPはもっぱらVγ2Vδ9Ｔ細胞サブセットの増殖を刺激し、同γδＴ細胞集団におけるサイトカイン産生も誘発することが知られている。(3-(2-エチルフェニル)-5-メトキシフェニル)-1H-[1,2,4]-トリアゾールが、IPP刺激後にVδ2T細胞増殖を阻害するか否かを調べるために、健康なドナーまたはMS患者から新たに単離したPBMCを、IL-2、IL-2 + IPP、またはIL-2 + IPP + (3-(2-エチルフェニル)-5-メトキシフェニル)-1H-[1,2,4]-トリアゾール (30 μMまたは60μM)とともに培養し、刺激の6日後にフローサイトメトリー分析を行って、培養におけるVδ2遺伝子産物を発現する細胞のパーセンテージを測定した。本発明の化合物はIPPとともに培養した場合Vδ2+ T細胞の増殖を用量依存的に効果的に阻害した(図1)。化合物をMS患者または健康な個体から単離した細胞において30μMの濃度にて用いた場合、増殖の阻害のパーセンテージはそれぞれ39%および38%であった。2つの試験群において高濃度(60 μM)の(3-(2-エチルフェニル)-5-メトキシフェニル)-1H-[1,2,4]-トリアゾールによって引き起こされる阻害に差異がみられ、MS患者から単離した細胞においては阻害は71%であるのに対し、健康な個体からの細胞においては88%であった。

本発明の化合物がVδ2T細胞にとって毒性であるか否かを調べるために、固定していない細胞をPIで染色し、細胞膜統合性を評価し、フローサイトメトリーで分析した。IL-2のみとともに6日間培養した細胞では、5,96%の細胞がPI +であったが、IPP+ IL-2で攻撃した細胞はPI + 細胞が9,66%であった。ST1958 (30μMまたは60μM)を添加した場合、PI + 細胞はそれぞれ15%および17,65%であった(図2)。(3-(2-エチルフェニル)-5-メトキシフェニル)-1H-[1,2,4]-トリアゾールを添加した培養におけるPI+ 死細胞のIPPのみと比べてのわずかな上昇は、この化合物がIPP刺激の後、非細胞毒性機構によるVδ2 T細胞増殖の強い阻害を導くことを示す(30μMにおいて56%阻害、60μMにおいて91%阻害)(図2)。

(3-(2-エチルフェニル)-5-メトキシフェニル)-1H-[1,2,4]-トリアゾールがリン酸 Agによって活性化されたVδ2 T細胞による炎症誘発性メディエーターの放出を阻害するか否かを調べるために、PBMCを30μMおよび60μMの化合物の存在下または不在下でIPP(30μM)によって活性化し、IFN-γの放出を刺激の24時間後にELISAによって測定した。培地中の化合物の存在は、これらの細胞からのIFN-γの放出を用量依存的に強く阻害した(MSおよび健康なドナーから単離した細胞に30μMの化合物を添加した場合、それぞれ55%および65%の阻害；MSおよび健康なドナーから単離した細胞に60μMの化合物を添加した場合、それぞれ74%および82%の阻害-図3)。

(3-(2-エチルフェニル)-5-メトキシフェニル)-1H-[1,2,4]-トリアゾールのVδ2+ IFN-γ + 細胞の誘導に対する効果を試験した(IPP による6時間の刺激の後のT細胞)。これらのデータは、本発明の化合物がIPPによる刺激の後にIFN-γ産生Vδ2+ T細胞数の用量依存的な正味の減少を規定することを示す。

30μMの濃度で用いた(3-(2-エチルフェニル)-5-メトキシフェニル)-1H-[1,2,4]-トリアゾールは、健康なドナーおよびMS患者から単離した細胞においてIPPによって誘導されるVδ2+ IFN-γ + 細胞のそれぞれ50%および25%の阻害を導いた。一方、60μMの化合物によってみられた阻害のレベルは２群の患者について同様であった: 健康なドナーから単離された細胞においてIPPにより誘導されたVδ2+ IFN-γ + 細胞の93%の阻害およびMS患者から単離された細胞において92%の阻害(図4)。

(3-(2-エチルフェニル)-5-メトキシフェニル)-1H-[1,2,4]-トリアゾールは、MS患者および健康な個体の両方からのγδT細胞に対して阻害効果を有する。試験したすべての状態においてMS患者からの細胞と健康な個体からの細胞とを比較して、わずかな-しかし有意な- 阻害効果の差があり、即ち、γδT細胞機能の阻害は健康な対象においてより有効であった。Poggi、A. et al．、J． Immunol. 162:4349は以前に、MS患者におけるγδT細胞は、それらが内皮との相互作用に必須の分子を発現しており、炎症組織において容易に遊走でき、脱髄、そしてその結果の神経機能障害の基礎をなす炎症応答を増幅するため、健康な個体からのものと比べてより活性化されることを記載している。すでに活性化された細胞の阻害は、静止集団の阻害と比べてより困難であると考えられる。というのは、すでに活性化された細胞の阻害には、すでに開始している細胞機能を止める必要があるからである。にもかかわらず、ほとんどのアッセイにおいて、MS患者におけるγδT細胞機能の阻害は60-70%に達した。これらVγ9Vδ2+ T細胞によって認識されるAgの分布が広範であり、炎症誘発性サイトカイン、例えば、IFN-γおよびTNF-α、およびケモカイン、例えば、MIP-1αおよびMIP-1βが、αβT細胞からとは異なると思われる経路を介して産生される速度が速いことから、これら細胞は、Th1−型応答に対する反応に偏ることにより、生得的免疫応答から後天的免疫応答への変化において重要な役割を果たしている可能性がある。これによってAg認識部位において、(3-(2-エチルフェニル)-5-メトキシフェニル)-1H-[1,2,4]-トリアゾールが効果的にγδT細胞活性化を阻害することが示唆され、これは生得的および後天的免疫応答の両方の活性化に広い意味を有する可能性がある。

狼瘡
約6週齡のマウスMRL/lpr (雌性)をJackson (USA)から得た。これらマウスは自然に狼瘡様の症状を約8週目に生じる。ST1959投与を6週目に開始し、皮下注射を週2回、0.1 mlのごま油中2.5 mg/kgにて行った。1群の被験群および1群の対照群(ごま油)を実験に含めた(12マウス/群)。週に１回、腎障害をタンパク尿および尿中白血球を検出することによりモニターした。図5aに報告するデータは2群において、尿中タンパク質が100 mg/dlを超える動物の平均%を表す。パネルbは尿中白血球スコア(スコア0-3)を示す。すべての測定は、Multistix 10SG (UK)を用いておこなった。パネルcは2群における生存率の%を示し、そして、対照群と比較したST1959処置動物の死亡の開始の遅延およびより高い総生存率を示す（ST1959処置動物群60％および対照群25%）。ST1959の投与は、パネルdに示すように被験動物の体重に影響を及ぼさず、したがって、毒性がないことが示唆される。

コラーゲン誘導性関節炎
マウスDBA/1JをCharles Rivers (Italy)から得た。関節炎の誘導は、0日目および21日目に、等容量のフロイント完全アジュバント＋2 mg/mlの結核菌（M. tubercolosis）および4 mg/mlのウシII型コラーゲンから構成される乳濁液を100μl/マウスを皮内に投与することにより行った。マウスを無作為に以下を含む試験群に分けた(8マウス/群):ST1959経口投与（o.s.）被験群、シクロスポリン(CSA)経口投与（o.s.）被験群、媒体群(ごま油)。偽群のマウスはコラーゲンを含まない乳濁液で処置し、さらなる投与を施さなかった。0日目または21日目から開始して0.1 mlのごま油中の化合物を週に3回皮下投与（s.c.）または経口投与（o.s.）した。炎症および間接強直（anchilosis）のスコアは各肢について0-3とした。図6に示すように、ST1959皮下投与（s.c.）処置により炎症 (6a)と間接強直(6b)の両方が有意に減少した。一方、経口投与では治療効果はみられなかった。ST1959の皮下投与（s.c.）用量はそのLD₅₀の1/1500であった。高用量(100 mg/kg)のシクロスポリン処置を陽性対照として含めた。

実験的自己免疫脊髄脳炎(EAE)
雌性ルイス（Lewis）ラット(7週齢)をHarlanから購入した。EAEの誘導は、各後足蹠に熱殺傷結核菌（Mycobacterium Tuberculosis (Mt)）H34Ra、350μg/200μl/ラットを含有するフロイント不完全アジュバント (200μl/ラット)に乳濁した100μg/200μl/ラットのミエリン塩基性タンパク質(MBP)を注入することにより行った(Hoban C. J.、Exp. Opin. Ther. Patents、8、7、831-854、1998; Ledeen R. W. et al.、Neurochemical Research、23、3、277-289、1998; Nagai H. et al.、Gen. Pharmac.、30、2、161-166、1998; Sommer N. et al.、Nature Medicine、1、3、1995; Simmonds S. et al.、Immunology Methods Manual、Academic Press Ltd、1997)。

脳炎誘発性攻撃の後、マウスを毎日観察し、EAEの臨床徴候を以下の0から6のスケールにてスコア付けした:
0:臨床徴候無し;
1:尾の弛緩性;
2:後肢の部分的麻痺;
3:後肢の完全麻痺;
4:前肢の麻痺。

ラットを無作為に以下を含む試験群に分けた:対照群(乳濁液 + MBP)、偽群(乳濁液)、被験群(乳濁液+ MBP + ST1959 ごま油中皮下、0.25、0.50、1.58または5.00 mg/5 ml/kg)。ST1959を免疫化の3日後から22日後まで毎日投与した。

対照動物は免疫化の10日後から単相性EAEの臨床徴候を示し、22日後には完全に回復した;ST1959は、疾患の重篤度、出現率および発症を4種類の用量において減少させた(図7、8)。

実験的自己免疫ブドウ膜炎(EAU)
雄性ルイス（ラット7週齡)をHarlanから購入した。EAUの誘導は、各後足蹠に、熱殺傷結核菌（Mycobacterium Tuberculosis ）(Mt) H34Ra (800μg/200μl/ラット)を含有するフロイント不完全アジュバント (200 μl/ラット)に乳濁された125μg/200μl/ラットの合成ヒトレチナール抗原S-Agを注入することにより行った。ラットに百日咳菌（Bordetella Pertussis）毒素(PBS中1μg/300μl/ラット)を免疫化の直後にその尾静脈に与えた (Barton K. et al.、Eye、8、60-65、1994; Forrester J. V. et al.、Chem. Immunol. Basel、Karger、73、159-185、1999; Smith J. R. et al.、Immunology and Cell Biology、76、497-512、1998; Zamir E. et al.、Free Radical Biology & Medicine、27 (1-2)、7-15、1999)。

脳炎誘発性攻撃の後、マウスを毎日観察し、EAUの臨床徴候を以下のようにスコア付けした:
臨床徴候無し: 0
虹彩充血:
低度:1
中程度:2
重度:3
前房蓄膿:
低度:1
中程度:2
重度:3
両眼についての最大累積臨床スコア:12。

ラットを無作為に以下を含む試験群に分けた: 対照群(乳濁液+ S-Ag)、偽群(乳濁液)、被験群(乳濁液+ S-Ag + ST1959 ごま油乳皮下0.50 mg/5 ml/kg)。ST1959は免疫化の3日後から22日後まで毎日投与した。

対照動物は免疫化の10日目からEAUの臨床徴候を示し、20日後には寛解したが完全には回復しなかった; ST1959は0.50 mg/5 ml/kgにて疾患の重篤度を低下させた(図9)。

（原文に記載無し）

Claims (8)

1. （３−（２−エチルフェニル）−５−メトキシフェニル）−１Ｈ−［１，２，４］−トリアゾールの自己免疫疾患の治療薬の調製のための使用。
2. 該疾患が多発性硬化症である、請求項１の使用。
3. 該疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項１の使用。
4. 該疾患が関節リウマチである、請求項１の使用。
5. 該疾患がブドウ膜炎である、請求項１の使用。
6. （３−（２−エチルフェニル）−５−メトキシフェニル）−１Ｈ−［１，２，４］−トリアゾールのγδＴ細胞の阻害薬の調製のための使用。
7. 該治療薬が哺乳類のためのものである、請求項１−６のいずれかの使用。
8. 該哺乳類がヒトである請求項７の使用。
   

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