JP4691257B2 - シャペロニン１０及びβ−インターフェロンによる多発性硬化症の治療方法 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は、ｃｐｎ１０とβ−インターフェロンの組み合わせ治療を用いた多発性硬化症の治療方法に関する。本発明は、ｃｐｎ１０とβ−インターフェロンとを備えた医薬組成物とキットにも関する。
【０００２】
（発明の背景）
多発性硬化症（ＭＳ）は、神経系に関する最も一般的な自己免疫疾患であり、米国ではおよそ２５０，０００人中１人が罹患している。臨床上、ＭＳは、衰弱、感覚異常、感覚喪失、及び神経と筋肉の機能に対する一般的な調節の低減に至る、中枢神経系（ＣＮＳ）の散在する髄鞘脱落によって特徴付けられる。
【０００３】
インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）
ＩＦＮ−βはウイルス刺激に応答して繊維芽細胞により生産される、抗ウイルス性かつ抗腫瘍性のサイトカインである。ＩＦＮ−βは免疫系モジュレーターとして作用し、適切に制御された臨床試験におけるＭＳの自然な進展を実質的に変更する唯一の治療剤である（Ｔｈｅ ＩＦＮ−β Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、１９９３年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４３：６５５−６１）。しかしながら、その研究から、多用量のＩＦＮ−β（一日おきに８百万国際単位（ＭＩＵ）注射）は、大きな耐性があると共にＭＳの再発・緩解の経過に有効な影響を有するが、部分的にしか有効でないことが明らかとなった。その患者は、割合は下がり臨床上の重症度も比較的軽いが、症状の再燃を有し続けた。しかし、上記の用量は、初期の予備的試験によると、用量（１６ＭＩＵ）を週に３回投与すると許容できない毒性を生じることが見出されたため、増大させることはできなかった。上述に引用した制御臨床試験で２つの用量（１．６と８ＭＩＵ）を投与した後の、目立った副作用の発生は低かった。
【０００４】
ＩＦＮ−β治療に関連する研究所での最も一般的な異常は、総白血球細胞数の有意な変化を伴わないリンパ球減少であった。他の目立った副作用は、インフルエンザ様の症状と注射部位での反応であった。インビトロ研究によると、ＩＦＮ−βは患者と健常者の両方に由来する分裂促進因子刺激による末梢血単核細胞の増殖を有効に抑制することが示されている。この増殖抑制効果は、ＩＬ−２Ｒ発現の減小と関連していた（ルディック（Ｒｕｄｉｃｋ）ら、１９９３年、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、４３：２０８０−７）。
【０００５】
実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の治療剤としてのＩＦＮ−βの有効性を調べるために、実験ラットとマウスについて詳細な研究が行われている。ＥＡＥはＭＳの最も有効な動物モデルであり、齧歯類におけるＣＮＳのＣＤ４⁺Ｔ細胞媒介性の炎症性髄鞘脱落疾患である（ペッチネリ（Ｐｅｔｔｉｎｅｌｌｉ）とマクファーリン（ＭｃＦａｒｌｉｎ）、１９８１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：１４２０−３）。ＥＡＥは感受性のある動物にＣＮＳ抗原（ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質）とアジュバントとを接種することにより誘発することが可能である。ＥＡＥの徴候の進展は、Ｔリンパ球とマクロファージによる神経系の浸潤に関連する（レイン（Ｒａｉｎｅ）、１９８４年、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５０：６０８−３５）。ＥＡＥからの自発的回復の間、神経系の炎症性細胞の数は減小する（マコーメ（ＭｃＣｏｍｂｅら、１９９２年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ、１１３：１７７−８６）。その理由の一部は、中枢神経系のＴリンパ球とマクロファージのプログラム死（アポトーシス）による（タビ（Ｔａｂｉ）ら、１９９４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２６０９−１７；マコーメら、１９９６年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ、１３９：１−６）ＥＡＥからの回復は、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β等のダウンレギュレートな（免疫系の刺激に対する反応を抑制する）サイトカインの生産にも関連する（ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２４９６−２５０５）。
【０００６】
リュール（Ｒｕｕｌ）ら、１９９６年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：５７２１−３１）の研究では、合成ＭＢＰペプチドの６３−８８残基を接種することにより、ＬｅｗｉｓラットでＥＡＥが誘発された。接種後８日から１７日まで組換えラットＩＦＮ−β（３×１０⁵Ｕ／日、皮下）で治療することにより、動物は治療期間の間疾患から完全に保護された。しかし、治療を休止すると、大部分の動物は、重症度が大きく高まり、長引く緩解疾患経過を発展させた。治療が２６日まで続けられた場合、動物は治療が中止された後でも再発しなかった。以上の結果から、ＥＡＥの回復期間中の治療の休止は、重症の麻痺性疾患の急速な開始と関連するように思われる。
【０００７】
ＥＡＥの特徴の１つは、疾患の臨床期の間の漸進的な体重減少である。これは動物が回復すると急速に元に戻る（リュールら、１９９６年、前掲）。ＩＦＮ−βによる８日から２６日までの治療は、コントロール群と比較した場合に、体重減小を抑制した。しかしながら、接種の約２５日目に明らかになったことであるが、治療後すべての動物は成長遅延を示した。種々の疾患のためのＩＦＮ−β治療の間の、患者に関する最も一般的かつ用量制限的な副作用の一つとして、体重増加の欠如も観察された。
【０００８】
ＥＡＥのマウスモデルを用いて、ユ（Ｙｕ）ら、１９９６年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．６４：９１−１００は、ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）の免疫優勢ペプチドｐ１３９−１５１による免疫化後の（ＳＷＲ×ＳＪＬ）Ｆ₁マウスにおけるＥＡＥの経過に対するマウスＩＦＮ−βによる治療の影響を決定した。マウスは、平均神経学的欠損の顕著な減小と、再燃の開始時期及び開始速度の有意な遅延と、ＤＴＨの減小とを示した。ＩＦＮ−β治療は、平均臨床スコアの長期改善と、明瞭な組織病理の改善と、障害への進行の遅延とを生じた。インビトロにおいて、ＩＦＮ−βは、決定基感作リンパ節細胞の増殖を用量依存的な様式で抑制した。結論として、上記著者らは、ＩＦＮ−β治療したマウスでは明瞭な組織病理の改善が存在するが、該改善は治癒からはほど遠いことを示した。ＣＮＳ炎症の重症度と発症についての同様に重要ではあるが最も穏和な長期間治療効果がＭＳ患者に関して説明されている（ＩＦＮ−β Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ、１９９３年）。
【０００９】
初期妊娠因子（ＥＰＦ）
ＥＰＦはモートン（Ｍｏｒｔｏｎ）ら、１９７４年、Ｎａｔｕｒｅ、２４９：４５９−６０及びモートンら、１９７６年、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．１９３：４１３−９に最初に記述された。
【００１０】
ＥＰＦは受精して６−２４時間以内の母親の血清に現れ、研究したすべての種において妊娠の少なくとも最初の半分の期間中存在し、続く胚の成長と生存に必須である（モートンら、１９８７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２３：７３−９２；アタナサス−プラッシス（Ａｔｈａｎａｓａｓ−Ｐｌａｔｓｉｓ）ら、１９８９年、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８７：４９５−５０２；アタナサス−プラッシスら、１９９１年、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．９２：４４３−５１）。またＥＰＦは、腫瘍細胞（クイン（Ｑｕｉｎｎ）ら、１９９０年、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８０：１００−８；クインとモートン、１９９２年、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：２６５−７１）のためと、部分的肝切除後の肝細胞再生（クインら、１９９４年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０：１２９４−３０２）のための、自己分泌生存因子でもある。他の多くの成長因子と同様、ＥＰＦは血小板に存在しており、これはＥＰＦが創傷治癒に関して生理学的役割を有し得ることを示唆している（キャバナ（Ｃａｖａｎａｇｈ）とモートン、１９９４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２２：５５１−６０）。
【００１１】
ＥＰＦは免疫調節特性も有する。これが最初に提唱されたのは、ＥＰＦが、免疫抑制性の抗リンパ球血清（モートンら、１９７４、前掲、モートンら、１９７６、前掲）と、抗ＣＤ８抗体ではなく抗ＣＤ４抗体（モートンら、１９８２、Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，編 Ｂ．Ｇｒｕｄｚｉｎｓｋａｓ，Ｂ．Ｔｅｉｓｎｅｒ，Ｍ．Ｓｅｐｐａｌａ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｙｎｅｙ、３９１−４０５）との、ロゼット（バラ飾り形構造）抑制特性を増強することができることが示されたときである。さらなる研究により、ＥＰＦがマウスにおけるトリニトロクロロベンゼン（ＴＮＣＢ）に対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を抑制し（ノーナン（Ｎｏｏｎａｎ）ら、１９７９年、Ｎａｔｕｒｅ ２７８：６４９−５１）、分裂促進因子によって誘導されたリンパ球増殖を抑制し（アタナサス−プラッシス、１９９３年、ＰｈＤ論文、クイーンズランド大学）、ＥＰＦ結合Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの生産を抑制することが示された。ＥＰＦの免疫抑制作用は、抑制因子及び／又はリンホカインの逐次誘導に媒介される。ＥＰＦはＣＤ４⁺Ｔ細胞に結合し、遺伝子により制限された２つの抑制因子であるＥＰＦ−Ｓ₁とＥＰＦ−Ｓ₂を逐次放出する（ロルフェ（Ｒｏｌｆｅ）ら、１９８８年、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７３：２１９−２５；ロルフェら、１９８９年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６７：２０５−８）。ＥＰＦの作用は種によって制限されも系統によって制限されもせず、ＥＰＦ−Ｓ₁活性はマウスＭＨＣのＩ領域とヒトのＨＬＡ−ＤＲに制限されるが、ＥＰＦ−Ｓ₂作用はＩｇｈ領域に局在化する。
【００１２】
シャペロニン１０
ヒト血小板から精製したＥＰＦのアミノ酸の配列決定により（キャバナとモートン、１９９４年、前掲）、ＥＰＦは熱ショックタンパク質ファミリーのメンバーであるシャペロニン１０（ｃｐｎ１０）とアミノ酸配列を共有していることが示された（ハルトマン（Ｈａｒｔｍａｎ）ら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９：３３９４−８）。従って、ＥＰＦとｃｐｎ１０は同族体であると考えられる。ｃｐｎ１０は細菌からヒトまで様々な生物に存在する。ｃｐｎ１０の構造は哺乳類の種間で大いに保存されているが、細菌と哺乳類間ではあまり保存されてない。ｃｐｎ１０はミトコンドリアに存在し、そこでタンパク質の折り畳みの役割を果たし（エリス（Ｅｌｌｉｓ）とファンデルフィース（ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｉｅｓ）、１９９１年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：３２１−４７）他の熱ショックタンパク質と同様、細胞ｃｐｎ１０は細胞ストレスの間アップレギュレートされる。
【００１３】
ＥＰＦと同様、ｃｐｎ１０はロゼット抑制検定において活性であり、ラットの同種皮膚移植片の生存能力の延長によって証明されるような免疫抑制活性を示す。ＥＡＥに関して、国際出願出願公開第ＷＯ９５／１５３３８号を参照すると、ｃｐｎ１０はＥＡＥの開始を遅らせると共に、ラットモデルでの該疾患の臨床上の特徴を改変することが示された。従って、ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βは共に免疫抑制性であることが上記文献から明らかである。
【００１４】
（発明の目的）
続く実験において、本願発明者は、マウスのＥＡＥの治療に関してｃｐｎ１０とＩＦＮ−βを比較し、ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βが異なる機構を介して作用するという驚くべき発見をした。この発見の結果、ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βは互いに協同作用して、ＥＡＥの治療を改善することが認められている。従って、連想されるのは、ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βが協同作用して、ヒトのＭＳの治療を改善することである。
【００１５】
従って、本発明の目的は、多発性硬化症（ＭＳ）を治療するための方法及び医薬組成物を提供することにある。
【００１６】
（発明の概要）
第１態様において、本発明は、ある個体に医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βを投与する工程から成る、ＭＳの治療方法にある。
【００１７】
好ましい実施形態において、本発明の方法はＭＳの再発予防のために使用される。
第２態様において、医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βと、医薬として許容される担体又は希釈液とを含むＭＳ治療用の医薬組成物が提供される。
【００１８】
第３態様において、医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βを、医薬として許容される担体又は希釈液と共に備えたキットが提供される。
好ましくは、前記ＩＦＮ−βは脱水した形をしており、使用の際に、前記医薬として許容される担体又は希釈液によって再水和される。
【００１９】
１実施形態において、前記ｃｐｎ１０は脱水した形をしており、使用の際に、前記医薬として許容される担体又は希釈液によって再水和される。
別の実施形態において、前記ｃｐｎ１０は錠剤又はカプセルの形をしている。
【００２０】
上述の態様によれば、好ましくは医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βは、５−６０ｍｇのｃｐｎ１０を含む。
より好ましくは、医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βは、１０−３０ｍｇのｃｐｎ１０を含む。
【００２１】
好ましくは、医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βは、１−１０ＭＩＵのＩＦＮ−βを含む。
より好ましくは、医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βは、４−６ＭＩＵのＩＦＮ−βを含む。
【００２２】
明細書とそれに続く請求の範囲を通じて、「含む・含有する・備える」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ，ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ，ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、限定的ではなく包括的に使用しており、示したある１つの整数又は複数の整数の群は、１または複数の示していない整数又は複数の整数の群を含み得る。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βが異なる機構を介して−マウスとラットのＥＡＥ症状を協同作用的に軽減するという本願発明者による発見から本発明が少なくとも一部端を発していることは理解されるであろう。特に、ＩＦＮ−βとｃｐｎ１０の組み合わせによる治療は、治療の休止後のＥＡＥ再発を予防する能力を顕著に改善することを示した。従って、ＥＡＥはヒトＭＳの最良の実験動物モデルであるため、上記発見は、ヒトのＭＳの治療に関する。これに関して、ＩＦＮ−βの投与はＭＳのよく知られている治療方法であるが、特に多用量のＩＦＮ−βでは副作用が生じる。従って、本発明はｃｐｎ１０とＩＦＮ−βがＩＦＮ−βのみよりも疾患の徴候をより大きく軽減し、それによって副作用を生じる濃度でＩＦＮ−βを投与する必要性を減らすという、組み合わせ療法を提供する。ＩＦＮ−βがＭＳの治療に不可欠となっているため、ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βを用いた組み合わせ療法は、患者がＩＦＮ−β治療から外れる必要がない点で、又は患者がＭＳ再発の可能性を減らしつつＩＦＮ−β治療から外れてもよいという点で、極めて魅力的である。
【００２４】
従って、第１態様において、本発明は医薬として有効量のｃｐｎ１０とＩＦＮ−βの投与によるＭＳの治療方法を提供する。
好ましい実施形態では、本発明の方法を用いてＭＳの再発が予防される。
本明細書に使用する場合「ＭＳの再発」とは、初期攻撃からの回復後にＭＳの徴候が再び起こることである。ＭＳの再発は、例えば、個体がＩＦＮ−β療法から外れたときや、副作用の危険性又は発現のためにＩＦＮ−βの量を減らしたときに起こり得る。本発明の方法は、ＭＳの徴候の再発を遅らせることができる点又は該徴候の重症度が低減される点で、ＭＳの再発を防止することが可能である。
【００２５】
「医薬として有効量の」は、個体に投与した時に、該個体の疾患の徴候を予防、軽減、低減又は除去し、及び／又は該疾患の徴候の重症度又は持続時間を低減する、薬物又は薬剤（例えばｃｐｎ１０とＩＦＮ−β）の量を意味する。本発明はｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βが単独では無効であるか最適状態に及ばないが、組み合わせると医薬として有効であるような量でのｃｐｎ１０とＩＦＮ−βの投与を意図している。
【００２６】
好ましくは、医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βは、５−６０ｍｇのｃｐｎ１０を含む。
より好ましくは、医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βは、１０−３０ｍｇのｃｐｎ１０を含む。
【００２７】
好ましくは、医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βは、１−１０百万国際単位（ＭＩＵ）のＩＦＮ−βを含む。
より好ましくは、医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βは、４−６ＭＩＵのＩＦＮ−βを含む。
【００２８】
熟練者には、上述の医薬として有効量が、一般に７０ｋｇの個体に関して計算されたものであることが理解されるであろう。従って、用量は体重、年齢、性別、個体の身体全体の健康と適応度（ｆｉｔｎｅｓｓ）、及び個体が受けている他の治療によって変わり得る。さらに、ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βの投与量は投与回数と投与のタイミングに互いに依存する。
【００２９】
これに関して、ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βの投与回数と投与のタイミングは、変わる可能性があるものと想定する。従って、本発明の範囲内で想到される治療様式は以下の２つがあることが明らかである。
【００３０】
（ｉ）ＩＦＮ−βとｃｐｎ１０の各々が異なる時期に及び／又は異なる回数で投与される、ＩＦＮ−βとｃｐｎ１０の組み合わせ治療方法。
（ｉｉ）ＩＦＮ−βとｃｐｎ１０が同時に投与される治療方法。
好ましくは、ｃｐｎ１０は毎日投与される。ただし、それよりも少ない回数に基づく投与も可能ではある（例えば週に２回又は３回）。
【００３１】
以下に論じるが、ＩＦＮ−βの供給源によるが、ＩＦＮ−βは通常、週に１回又は週に３回投与される。そのような投与回数は、ｃｐｎ１０がいかに頻繁に投与されようが、維持され得る。しかしながら、ＩＦＮ−βとｃｐｎ１０は同時に毎日投与することが好ましい。この後者の投与様式は、ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βが皮下又は筋内注射用の前記医薬組成物に組み合わされた場合に、特に適している。
【００３２】
１実施形態において、ＩＦＮ−βは皮下又は筋内注射により投与され、ｃｐｎ１０は注射又は経口投与される。
好ましくは、ｃｐｎ１０は錠剤又はカプセルの形式等で経口投与される。
別の実施形態において、ＩＦＮ−βとｃｐｎ１０は筋内又は皮下注射により同時に投与される。
【００３３】
ｃｐｎ１０は好ましくは精製した組換え合成型で与えられる。代わりに、ｃｐｎ１０は化学合成により製造することも可能である。しかし、熟練者には、ｃｐｎ１０の大きさが化学合成をあまり好ましくない選択にしていることが理解されよう。
【００３４】
これに関して、適当なｃｐｎ１０ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が当該技術分野においてよく知られている。ただし、熟練者は便宜上、以下の哺乳類のｃｐｎ１０配列を参照する。
【００３５】
（ｉ）ヒトｃｐｎ１０（ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ アクセッション番号ＵＯ７５５０；チェン（Ｃｈｅｎ）ら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１２１９：１８９−１９０）；
【００３６】
（ｉｉ）マウスｃｐｎ１０（ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ アクセッション番号Ｕ０９６５９；ディックソン（Ｄｉｃｋｓｏｎ）ら、１９９４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２６８５８−８６４）；
【００３７】
（ｉｉｉ）ラットｃｐｎ１０（ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ アクセッション番号Ｘ７１４２９；ライアン（Ｒｙａｎ）ら、１９９４年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ ３３７：１５２−１５６）；
【００３８】
上記文献は参照により本明細書に組み込まれる。
ｐＧＥＸシステムを用いた組換え合成ｃｐｎ１０の生産と精製に関する実施例を以下に与える。別の有効な方法は、組換え合成ｃｐｎ１０の生産に酵母やバキュロウイルス発現系等の真核生物発現系を使用することである。細菌での発現に対するそのような系の有利な点は、ｃｐｎ１０が真核生物細胞で生産されＮ末端の修飾がないことである。これによって比活性が大きくなると共に安定性が増大する。組換えタンパク質の発現に有効な方法の例は、「タンパク質の科学における最新プロトコル（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ）（コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）ら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．、１９９５−９９年）の５〜７章に見られるが、該文献も参照により本明細書に組み込まれる。
【００３９】
現在、ＭＳの臨床治療に使用されるＩＦＮ−βには３つの供給源がある。それらを他の関連情報と合わせて表１に列挙する。
Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（又はＢｅｔａｆｅｒｏｎ）は、例えば、担体又は希釈液としてデキストロース及びヒト血清アルブミンと共に脱水した形でＳｃｈｅｒｉｎｇ社により通常供給される。水溶性担体又は希釈液として作用し、脱水ＩＦＮ−β／デキストロース／ヒト血清アルブミンを注射の前に再水和する０．５４％ＮａＣｌも含まれる。
【００４０】
適当な場合、医薬組成物は医薬として許容される担体又は希釈液である。
「医薬として許容される担体又は希釈液」とは、全身性投与に安全に使用することができる固体又は液体の充填剤、希釈液又はカプセル物質を意味する。脱水ＩＦＮ−β／デキストロース／ヒト血清アルブミンを再水和する上述の０．５４％ＮａＣｌ水溶性担体又は希釈液は、一例である。ＩＦＮ−βに適した他の担体の例が米国特許第４，９９２，２７１号と第５，６４３，５６６号に提供されており、これらは参照により本願に組み込まれる。
【００４１】
投与の特定経路によって、当該技術分野においてよく知られている種々の医薬として許容される担体を使用することが可能である。そのような担体は、糖類、デンプン、セルロースとその誘導体、麦芽、ゼラチン、滑石、硫酸カルシウム、植物油、人工油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等浸透圧塩水、及び発熱物質を含まない水から選択し得る。
【００４２】
投与形式は、錠剤、分散液、懸濁液、注射液、溶液、シロップ、トローチ、カプセル、座薬、エーロゾル、経皮パッチ等が含まれる。そのような投与形式には、徐放装置又はそのように作用するよう改変された他の形式のインプラントも含まれ得る。治療剤の徐放は、例えばアクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸又はポリグリコール酸を始めとする疎水性ポリマーとヒドロキシプロピルメチルセルロース等の特定のセルロース誘導体により治療剤をコーティングすることにより行うことができる。さらに、徐放は、
【００４３】
他のポリマーマトリックス、リポソーム、及び／又はマイクロスフェアを使用することによっても行うことができる。
経口投与又は注射による投与に適した本発明の医薬組成物は、カプセル、におい袋又は錠剤等の別々のユニットとして、粉末又は顆粒として、若しくは溶液又は水性液体、非水性液体、水中油滴エマルション又は油中水滴液体エマルジョンの懸濁液として、与えられる。そのような組成物は薬剤術のいかなる方法によっても調製することが可能であるが、すべての方法は、ｃｐｎ１０及び／又はＩＦＮ−βを担体と関連付ける工程を含む。一般に、組成物はｃｐｎ１０及び／又はＩＦＮ−βを液体担体又は細分した固体担体もしくはその両方と均質かつ十分に混合し、必要に応じて精製品を所望の体裁に成形することにより調製される。
【００４４】
鼻咽腔スプレーや吸入器を介する等の肺への投与を支援する担体も当該技術分野においてよく知られているものとして想到される。
従ってＭＳの治療用のキットが想到されることは明白である。そのような場合、ＩＦＮ−βとｃｐｎ１０は担体又は希釈液と共に脱水した形で与えられ、注射の前に再水和される。代わりに、キットは錠剤又はカプセル形式のｃｐｎ１０を備えてもよく、その場合、ｃｐｎ１０は経口投与であるのに対して、ＩＦＮ−βは注射で投与するために担体又は希釈液に再水和される。
【００４５】
前記キットに関して想到されるのは、医薬として有効量のｃｐｎ１０とＩＦＮ−βの投与を支援するための、針、シリンジ、吸入器、エーロゾルキャニスタ等である。
【００４６】
本発明をより詳しく理解するために、熟練者は以下の本発明を限定しない実施例を参照する。
実施例１
一般的材料
１．１ 動物
クイーンズランド大学の中央動物飼育ハウス（Ｃｅｎｔｒａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｈｏｕｓｅ，Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ）から８〜１０週齢の雌ルイスラット（ＪＣ系）を得た。オーストラリア西部の動物資源センター（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｗｅｓｔｅｒｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から８〜１２週齢の雌ＳＪＬ／Ｊマウスを得た。中央動物飼育ハウスから異系交配した成熟雌クワッケンブッシュ（Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ）マウスを得た。
【００４７】
すべての動物を、温度（２２〜２６℃）及び光（１２時間明、１２時間暗）制御室内でマウス／ラット用ペレット剤及び水の連続供給下に維持した。手術前に、ラット（平均体重１７０ｇ）を、１０ｍｌのケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）、６．２ｍｌのキシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ）、０．８ｍｌのアトロピン（６００μｇ／ｍｌ）及び１０ｍｌの食塩水溶液（０．９％ｗ／ｖ）を含む腹腔内麻酔剤混合物（０．２ｍｌ）で麻酔した。動物のすべての研究は、クイーンズランド大学の動物実験倫理委員会（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）から倫理的承認を得てオーストラリア国健康及び医学研究委員会（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｒａｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）のガイドラインに沿って実施した。
【００４８】
１．２ 組換えｃｐｎ１０（ｒｃｐｎ１０）
国際公開ＷＯ９５／１５３３８号（本明細書に文献援用される）に記載のように、プラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ細菌発現系（アマーシャム ファルマシア バイオテク社、スウェーデン ウプサラ所在（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））を用いて、組換えヒトｃｐｎ１０を調製した。手短に言えば、バッチ法を用い、グルタチオン−セファロース４Ｂゲル（アマーシャム ファルマシア バイオテク社）により細胞溶解物からグルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ融合タンパク質を回収し、ｃｐｎ１０をトロンビンで切断し［０．０５Ｍ トリス−ＨＣＬ、ｐＨ８．０／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／２．５ｍＭ ＣａＣｌ₂緩衝液、１０００単位のトロンビン）（Ｓｉｇｍａ Ｔ６８８４；シグマ アルドリッチ社、米国ミズーリ州セントルイス所在（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））；緩衝液１］、上清中で回収した（試料１）。次いで、ゲルを高塩濃度の緩衝液（０．０５Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０／２Ｍ ＮａＣｌ；緩衝液２）で洗浄した（試料２）。リンパ球増殖アッセイ（以下参照）にかけるために、ｃｐｎ１０をＲｅｓｏｕｒｃｅ ＲＰＣカラム（アマーシャム ファルマシア バイオテク社）上で精製した。コントロール標本としてブランクランを用いた。上清（ｃｐｎ１０ 試料１）及び高塩濃度洗浄物（ｃｐｎ１０ 試料２）のタンパク質濃度は、Ｌｏｗｒｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第１９３巻：２６５−７５ページ，１９５１年の方法に従って推定した。これらの標本の純度は、１５％トリス−トリシンゲル（Ｓｃｈａｇｇｅｒ ＆ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１６６巻；３６８−７９ページ，１９８７年）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。ｃｐｎ１０の濃度は、二抗体サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定し、生物活性は、ロゼット抑制試験（Ｃａｖａｎａｇｈ ＆ Ｍｏｒｔｏｎ，Ｔｏｄａｙ’ｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第８巻：２４−７ページ，１９９６年）で決定した。ｐＧＥＸ−２Ｔ発現系を用いて調製したｃｐｎ１０のアミノ酸配列は、Ｎ末端に追加のＧ−Ｓ−Ｍを有するヒトｃｐｎ１０と同一であり、この分子はアセチル化されていない。
【００４９】
１．３ 化学合成ｃｐｎ１０
段階的固相法によりＮ末端アセチル化型の合成ｃｐｎ１０（ｓｃｐｎ１０）を調製した（Ｌｏｖｅら，Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，第５１０巻，Ｓｅｒｉｅｓ Ｃ：Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｅｎｓ，Ｓｔａｎｄｉｎｇ ＆ Ｃｈｅｍｕｓｈｅｖｉｃｈ編，ＮＡＴＯ ＡＳＩ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１７１−９ページ，１９９８年）。
【００５０】
１．４ 組換えＩＦＮ−β
組換えマウスＩＦＮ−β（カルバイオケム−ノババイオケム社、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））を、０．１％ｗ／ｖＢＳＡを含むＰＢＳ中に、１ｍｌ当たり４８．４μｇタンパク質（４．５×１０⁵単位）で加えた。組換えラットＩＦＮ−β（０．１ｍｇ／１×１０⁵単位；バイオソース インターナショナル社、米国カリフォルニア州カマリロ所在（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）をリンパ球増殖アッセイで試験した。ラットＩＦＮ−βを１．０ｍｌの蒸留水に溶解させ、−７０℃でアリコートにして凍結し、１回だけ融解した。賦形剤だけのものは、ＰＢＳと０．１％ｗ／ｖのＢＳＡ（ＰＢＳ／ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ＃９４１８）から構成されるものであった。
【００５１】
１．５ ミエリンプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）
脳炎誘発性タンパク質ＰＬＰペプチドの残基１３９−１５１（ＨＣＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ；Ｇｒｅｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第１５６巻：３７１−９ページ，１９９６年）を段階的固相法で合成し、逆相ＨＰＬＣで精製した。エレクトロスプレーマススペクトロメトリーにより純度を決定した（≧９０％純粋）。
【００５２】
実施例２
ｃｐｎ１０を用いたインビボ実験
２．１ ＥＡＥの誘発及び臨床的評価
Ｄｅｉｂｌｅｒら，Ｐｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第２巻：１３９−１６５ページ，１９７２年の方法に従って、モルモットの脳からミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を調製した。０．９％のＮａＣｌｗ／ｖ（塩類溶液）中のＭＢＰを、４ｍｇ／ｍｌの牛酪菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）を含む等量の不完全フロイントアジュバント中で乳化した。０日目、麻酔下に、ラットの１本の足の裏の肉球に０．１ｍｌのエマルション（５０μｇ／ラット）を接種した。１０日目から、ラットを毎日計量し、臨床的徴候を監視した。尾、後脚及び前脚の衰弱度を別々に、Ｐｅｎｄｅｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｏ．，第７５巻：３１７−２８ページ，１９８６年によって記載されているように、０（衰弱なし）〜４（完全麻痺）までのスケールで採点した。各検査日に、各ラットの総障害を記録し、結果を平均障害スコア／群として表した。ラットは、通常、２０日目までに障害から回復したが、回復後数週間で再発が観察されるケースもあった。
【００５３】
２．２ ｃｐｎ１０によるＥＡＥの治療
接種日から１７日目まで、１μｇ〜５０μｇの範囲の用量のｃｐｎ１０又は適切な対照賦形剤を２４時間又は４８時間毎に投与してラットを治療した（表２参照）。ラットに、さらなる治療をせずに、ｃｐｎ１０試料１又は緩衝液１を投与した。ｃｐｎ１０試料２又は緩衝液２に１％正常ラット血清を添加した後、投与前に一晩ＰＢＳ中で透析した。ｃｐｎ１０を腹腔内（ｉｐ）投与するか、又は湾曲した給餌針を用いて経口投与（Ｏ／Ｆ、経口給餌）し、各ラットの体重及び臨床スコアを２０日目まで記録した。５０μｇ／２４時間を与えたラットは３５日目まで調べた。
【００５４】
ＥＡＥラットをｃｐｎ１０の腹腔内又は経口投与により治療すると、１０日目〜２０日目の間に障害及び体重減少が用量依存的に軽減された（表２）。５０μｇ／日を与えたラット群において、ｃｐｎ１０を腹腔内又は経口投与したラットでは障害の総体的な減少に差がなかった（図１及び図２）。これらの群のどちらにも再発は観察されなかったのに比べ、対照群では低レベルの再発が観察された。対照群と比べて、予測された体重減少の軽減が見られた（図３）。ラットがいったん回復期に入ってしまうと、体重の増加は対照マウスのものと一致した（図３）。
【００５５】
試験したｃｐｎ１０の用量では、動物は、ＥＡＥの臨床的徴候から完全には保護されなかったが、それ以上の用量の試験は、ｃｐｎ１０の供給が限られていたために不可能であった。また、この分子は、Ｎ末端に、血清担体タンパク質との結合に干渉する変異があるために理想的ではないと考えられた。しかし、高用量を用いると、臨床的スコア及び体重減少には有意な軽減が示された。治療を中止した１７日目には、ｃｐｎ１０で治療したマウスに再発は観察されず、体重増加に及ぼす長期的作用はなかった。これらの結果は、ＩＦＮ−βでラットを治療した後に観察された結果（Ｒｕｕｌｓら，１９９６年、前掲）とは対照的である。
【００５６】
２．３ ｃｐｎ１０で治療したラットはＭＢＰに対するＤＴＨ反応の阻害を示した
ラットにＭＢＰを接種してから、４匹ずつの４つの群に分けた。０日目から１６日目まで、群１及び群４には賦形剤だけを与え、群２と群３にはｃｐｎ１０（５０μｇ／ラット／２４時間）をそれぞれ経口及び腹腔内投与した。１５日目に、エンジニアのマイクロメーター（ミツトヨ社（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ））を用いてラットの両耳の厚さを測定し、次いで群２〜群４の両耳の付け根に１０μｌの塩水中２０μｇのＭＢＰを注射した。群１のラットには塩類溶液だけを与えた。２４時間後、再び両耳を測定し、引き算して耳の膨脹度を決定した。
【００５７】
ＭＢＰで攻撃し、対照賦形剤を与えた群４のラットには実質的な耳の膨脹が観察された（図４）。ＭＢＰ攻撃の前に、ｃｐｎ１０の経口投与による治療（群２）又は腹腔内投与による治療（群３）を受けたラットには、極く軽度の膨脹しか発生しなかった。対照賦形剤で治療し、塩類溶液で攻撃した群１のラットでは、耳の厚さに差がなかった。群４のラットには耳の付け根の周囲に重度の炎症を起こした赤い領域があったが、群２及び群３ではそれが目につかなかったので、視覚的にはこの差は極めて顕著であった。群１〜３の間には耳の膨脹度に有意な差がなかった。二重反復実験で同様な結果が得られた。
【００５８】
これらの結果は、ｃｐｎ１０が、ＩＦＮ−βと同様にＴｈ１免疫応答を抑制することを立証するものであり、この点に関して、経口投与したｃｐｎ１０も、腹腔内投与したｃｐｎ１０と同様に有効であることを示している。
【００５９】
２．４ 白血球（ＷＢＣ）の合計数及び百分率数
賦形剤だけ又はｃｐｎ１０（５０μｇ／ラット／２４時間）の腹腔内投与もしくは経口投与によるＥＡＥラット（ｎ＝３／群）の治療後１６日目に、ＷＢＣ数を得るために尾から血液試料を採取してＥＤＴＡに入れ、百分率数を得るためにライト・ギムザ染色した血液塗沫標本を調製した。
【００６０】
結果が表５に示されている。３つの群間で、合計ＷＢＣ数、リンパ球数又は好中球数に有意な差はなかった。二重反復実験で同様な結果が得られた。
これらの知見は、ラットに毎日５０μｇのｃｐｎ１０を投与しても回復期中のラットの体重増加に影響を与えないことを示す知見と合わせて、ｃｐｎ１０には極めて明白な副作用はないことを示唆している。再び繰り返すが、これはＩＦＮ−βにはない特性である。ヒトでは、ＩＦＮ−β治療は著しいリンパ球減少症を引き起こすことがあり、マウスでは、Ｓｏｏｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５５巻：２７４７−５３ページ，１９９５年により、ＩＦＮ−β（１０⁵Ｕ／注射）の注射後１２時間でリンパ球数が３１．７％減少することが確認された。
【００６１】
実施例３
ｃｐｎ１０を用いたインビトロ実験
３．１ ＭＢＰに応答したリンパ節細胞の増殖に対するｃｐｎ１０の効果
接種後１０日目に、ラット２匹を麻酔、心臓穿刺して採血し、無菌条件下に各ラットの接種した四肢に排膿する膝窩リンパ節を除去した。リンパ節を細かく切断し、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ Ｎａ−ピルベート、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１％熱失活ルイスラット血清（培養培地）を含むＲＰＭ１６４０（ＩＣＮ社、米国カリフォルニア州コスタメサ所在（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ，ＵＳＡ））に懸濁した。破片を除去した後、懸濁されたリンパ球をプールし、２回洗浄して、細胞濃度を４×１０⁶細胞／ｍｌに調整した。増殖アッセイで試験する前に、ＨＰＬＣで精製したｃｐｎ１０を４８時間（１％正常ラット血清と共に）ＰＢＳに透析し、次いで、ＮＡＰ−５カラム（アマーシャム ファルマシア バイオテク社）上の培養培地に移し、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ４ ０．２２μｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（ミリポア社，米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在（Ｍｉｐｐｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ））を通過させてフィルター滅菌した。対照培地（ＨＰＬＣからのブランクラン）も同様に治療した。フィルターを通した標本中のｃｐｎ１０の濃度を二抗体サンドイッチＥＬＩＳＡで確認した。
【００６２】
１００μｇ／ｍｌ（１０．０μＭ）〜２０ｎｇ／ｍｌ（２．０ｎＭ）の培養培地（図６参照）中でｃｐｎ１０の希釈物を調製し、各希釈物から１００μｌずつを、９６ウエル平底プレート（Ｎｕｎｃｉｏｎ^TMΔＭｉｃｒｏＷｅｌｌ Ｐｌａｔｅｓ，ヌンク社、デンマーク ロスキルデ所在（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒａｋ））中に三部に分配した。ＭＢＰ（５０μｌ、８０μｇ／ｍｌ培養培地）及び調製したリンパ節懸濁液（５０μｌ；４×１０⁶細胞／ｍｌ）を各ウエルに添加した。コントロールウエル（各６ウエル）には、（ａ）ＭＢＰを含むがｃｐｎ１０は含まない細胞か、（ｂ）ＭＢＰもｃｐｎ１０も含まない細胞を入れた。プレートを加湿雰囲気下に３７℃、５％ＣＯ₂で７２時間培養した。最後の１８時間の間に、各ウエルに０．５μＣｉ［メチル−³Ｈ］チミジン（アマーシャム ファルマシア バイオテク社）を間欠的に加え、シンチレーションカウンター（ＥＧ＆Ｇ ウォラック社、フィンランド ターク所在（ＥＧ＆Ｇ Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ））で含まれている放射能を測定した。ｃｐｎ１０を含むウエルに含まれていた放射能はｃｐｎ１０を含まないウエルのものと同等であった。細胞の生存力を評価するためにパラレルプレートを用意した。７２時間培養した後、培地上清を除去し、細胞をＰＢＳ（２０μｌ）中０．１％ｗ／ｖのトリパンブルーに再懸濁した。トリパンブルー排除試験により細胞の生存力を評価した。
【００６３】
ｃｐｎ１０は、リンパ球のＭＢＰ誘発性増殖を用量依存的に抑制した（図６）。したがって、ｃｐｎ１０は、ＩＦＮ−βと同じ様に、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞をダウンレギュレ−トすることができる（ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｉｄｅら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．，第８４巻：１４−２３ページ，１９９８年）。
【００６４】
３．２ ロゼット抑制試験
先に記載の方法（Ｍｏｒｔｏｎら，１９７６年，前掲；Ｃａｖａｎａｇｈ ＆ Ｍｏｒｔｏｎ，１９９６年，前掲）を用い、ロゼット抑制試験で、ｃｐｎ１０及びラット組換えＩＦＮ−β（バイオソース インターナショナル社、米国カリフォルニア州カマリロ所在）を活性について試験した。（１）０．５ｍｌのＰＢＳ／０．０１％ＢＳＡｗ／ｖ（ＰＢＳ／０．０１％ＢＳＡ）中１．０μｇのｃｐｎ１０及び（２）０．５ｍｌのＰＢＳ／０．０１％ＢＳＡ中１．０μｇのｒＩＦＮ−βを含む溶液を調製し、次いで、ＮＡＰ−５カラム上のハンクスの平衡塩溶液／０．０１％ＢＳＡ（ＨＢＳＳ／０．０１％ＢＳＡ）中に移した（ｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βの最終濃度；１．０μｇ／ｍｌ）。試料をＨＢＳＳ／０．０１％ＢＳＡ中で１０^-5から１０^-15まで１０倍希釈し、各希釈物のロゼット抑制力価（ＲＩＴ）を決定した。このアッセイで正の結果を生じる試料の最高希釈度としてｃｐｎ１０力価（対数逆数試料希釈度）を記録した。
【００６５】
このアッセイでは、ｃｐｎ１０試料（１．０μｇ／ｍｌ）が１０^-12の力価を示したのに対し、ＩＦＮ−β試料はいずれの濃度においても活性を示さなかった。
【００６６】
ｃｐｎ１０はＴｈ１細胞に結合し、ロゼット抑制試験では活性である遺伝子制限サプレッサー因子を放出する。これらの結果は、ＩＦＮ−βがＴｈ１免疫応答を抑制する機構がｃｐｎ１０のものとは異なることを示している。
【００６７】
ラットモデルでの結果は、ｃｐｎ１０による治療が
（ｉ） ＥＡＥを有する動物の障害及び体重減少を軽減し；
（ｉｉ） インビボでＤＴＨ反応を抑制し；かつ
（ｉｉｉ）インビトロで起脳炎（ＭＢＰ反応性）細胞の活性をダウンレギュレートすることを示した。
したがって、ｃｐｎ１０はＩＦＮ−βと同じ様にＴｈ１応答を抑制するであろう。しかし、この応答をダウンレギュレートする手段は異なるものと思われる。
【００６８】
ｃｐｎ１０は、ＣＤ４＋Ｔ細胞から特異的遺伝子制限サプレッサー因子を放出するｃｐｎ１０の能力の測度であるロゼット抑制試験においては活性である。ＩＦＮ−βはこのアッセイで活性を示さない。
【００６９】
ラットにｃｐｎ１０を投与しても合計リンパ球数には影響を与えないが、Ｓｏｏｓら，１９９５年，前掲は、ＩＦＮ−βで治療したマウスが、顕著なリンパ球減少症を発症することを示した。これは、ＩＦＮ−β治療を受けている患者でも観察された。ＩＦＮ−β治療とは異なり、ｃｐｎ１０による治療は、治療後の体重増加によって評価されるように、ラットの良好な生活状態に及ぼす長期的な作用は全くない。
【００７０】
これらの結果は、ＩＦＮ−βとｃｐｎ１０の作用様式は異なるが、どちらもＴｈ１免疫応答を抑制し、そうすることにより、ＥＡＥの症状を変え得ることを示している。ＥＡＥのマウスモデルは、ＥＡＥの治療におけるＩＦＮ−βとｃｐｎ１０の相補的な組合せ療法を実施し得るかどうかを決定するために開発された。
【００７１】
実施例４
マウスにおけるＥＡＥの誘発
水と完全フロイントアジュバントとからなるエマルション（シグマ アルドリッチ社、米国ミズーリ州セントルイス所在；Ｇｒｅｅｒら，１９９６年，前掲）中１００μｇのＰＬＰ ｐ１３９−１５１及び４００μｇの結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａ（ディフコ ラボラトリーズ、米国ミシガン州デトロイト所在（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ））を側腹部に皮下注射してＳＪＬ／ＪマウスにＥＡＥを誘発させた。０日目と３日目に、各マウスに、０．３ｍｌの０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ（食塩水溶液）中０．３μｇの百日咳毒素（（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、リスト バイオロジカル ラボラトリーズ社、米国カリフォルニア州所在（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．ＣＡ，ＵＳＡ））をさらに静脈内注射した。８日目から毎日、マウスを以下のように臨床的に評価した：０＝障害なし；１＝尾の緊張の低下及びわずかにぎこちない歩行；２＝尾の無緊張及び／又は中程度のぎこちない歩行及び／又は直立能力低下；３＝四肢の衰弱；４＝四肢麻痺；５＝瀕死状態。マウスを４２日目又は６０日目まで調べた（表３参照）。各検査日に、各治療群の平均障害スコア／マウスを測定した。
【００７２】
検査期間全体にわたって、合計平均障害スコア／マウス／群を計算した。この値は、初回攻撃時（８日目〜２１日目）及び検査期間内に発生した再発期中（２２日目〜４２日目又は６０日目；表４参照）の合計平均障害スコアとしても表した。２つの群のマウス（実験４及び５、表３参照）では、実験期間を６０日目から６８日目まで延長し、６１日目から６８日目までの合計平均障害スコアを記録した。
【００７３】
実施例５
ｃｐｎ１０治療がマウスのＥＡＥに及ぼす効果
複数の群のマウス（ｎ＝１０／群）を、１日おきに腹腔内投与した２．５μｇ、５μｇ又は２０μｇ／マウスの用量の組換えｃｐｎ１０（ｒｃｐｎ１０）で治療した。接種日（０日目）又は障害発症時（８日目）に治療を開始し、１８日目又は２０日目まで継続した（表３参照）。検査期間は表３に示されている。異なる用量の治療方式を用い、ｒｃｐｎ１０を与えた群の合計平均障害スコアと、賦形剤だけを与えて同時に試験した群のものとを比較した（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ ｔｅｓｔ，Ｓｉｇｍａ Ｓｔａｔ ２．０，Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【００７４】
ＰＬＰペプチド１３９−１５１を接種した後、マウス（１０匹／群）は慢性再発型ＥＡＥを発症した。臨床的徴候の発生は、８日目〜１０日目に現れ、１４日目〜１６日目でピークに達し、２１日目までに減少した（図８Ａ）。マウスは不完全回復を経験し、その後、さらなる臨床的障害エピソードを有していた。０日目〜１８日目又は２０日目まで１日おきに２．５μｇ、５μｇ又は１０μｇのｒｃｐｎ１０で治療すると、賦形剤だけを与えた群に比べて、検査期間全体にわたって総障害が有意に抑制された（表３）。２０μｇのｒｃｐｎ１０／用量でも障害の抑制が生じたが、結果は賦形剤を与えた群のものと有意には異なっていなかった（表３）。接種時（０日目；表３）ではなく、障害発生時（８日目）に治療を開始した場合、治療群間に応答の差は観察されなかった。６０日目以降では、ｒｃｐｎ１０で治療した群のマウスにＥＡＥの臨床的兆候が発生し、６１日目から６８日目までの合計平均障害スコアは賦形剤のみを与えたマウス群のものと有意には異なっていなかった（データは示さず）。
【００７５】
実施例６
ＩＦＮ−βとｃｐｎ１０の組合せ療法
ＥＡＥの臨床的徴候の抑制にｒｃｐｎ１０とＩＦＮ−βが協同作用するかどうかを確認するために、ｒｃｐｎ１０とＩＦＮ−βとを別々及び一緒に用いてマウス群を治療した（図８Ａ及び図８Ｂ）。協同作用が存在する場合にそれを容易に観察し得るように次善用量のｒｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βを選択した。４つの群のマウス（ｎ＝１０／群）を試験した。接種日に、群２と群４には０日目から２０日目まで１日おきに２．５μｇのｒｃｐｎ１０を腹腔内投与し、群１と群３には賦形剤を投与した。ＩＦＮ−βを塩類溶液中１０⁵単位／ｍｌに希釈し、群３と群４のマウスには、１０日目から２０日目まで１日おきに５０μｌの塩類溶液中５，０００単位（０．５μｇ；Ｙｕら，１９９６年，前掲）を皮下注射した。群１と群２のマウスには、塩類溶液に１／４希釈した、ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ５０μｌを投与した。ＩＦＮ−β製剤及び賦形剤製剤中に存在するＢＳＡ担体の投与によるアナフィラキシーを予防するために、１８日目と２０日目に、すべてのマウスを、体重１ｇ当たり１０μｇの抗ヒスタミン（ピリラミン、シグマ−アルドリッチ社）の腹腔内投与により治療した（Ｊｏｓｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，第１７９巻：８８１−８８７ページ，１９９４年）。６０日目まで上述のように毎日マウスを調べ、ｃｐｎ１０、ＩＦＮ−β、ｃｐｎ１０＋ＩＦＮ−βを与えた群の結果と、賦形剤だけを与えた群の結果とを比較した（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ ｔｅｓｔ）。この実験を二重反復した。
【００７６】
ＥＡＥマウスを０日目から２０日目まで１日おきに２．５μｇのｒｃｐｎ１０で治療すると、賦形剤だけを与えたマウスと比べて、８日目から６０日目までの検査期間中の合計平均障害スコアが抑制された（図８Ａ、表４）。これらの結果に鑑み、本発明者らは、ＩＦＮ−βがＭＳの周知療法であり、かつＥＡＥに対して活性を示す（Ｙｕら，１９９６年，前掲）ことを前提として、ｒｃｐｎ１０とＩＦＮ−βの効力を比較した。１０日目から２０日目まで１日おきに５，０００単位のＩＦＮ−βを投与したが、同検査期間中に有意な抑制は生じなかった（図８Ｂ、表４）。しかし、ｒｃｐｎ１０とＩＦＮ−βとを組合せ投与すると、対照群と比較して、試薬を別々に投与したときよりも大きな抑制が生じた（図８Ａ、図８Ｂ、表４）。障害に及ぼす抑制効果は、初回攻撃中（８日目〜２１日目）よりも、再発期中（２２日目〜６０日目）の方が明らかであった。ｃｐｎ１０だけで治療してもＩＦＮ−βだけで治療しても初回攻撃中に有意な抑制は生じなかったが、組合せ治療は有効であった（図９、表４）。組合せ治療を用いることにより、再発期中の合計平均障害スコアの抑制は対照群と比べて強化された（表４）。二重反復実験で類似の結果が得られた（データは示さず）。
【００７７】
予備実験（データは示さず）中、ＩＦＮ−β製剤又は対照賦形剤中のＢＳＡを皮下投与した後、１０日〜１２日の間に（すなわち、２０日目から２２日目までに）約５０％のマウスが死亡した。これは、ＢＳＡに対する感作によるアナフィラキシーショックによるものと考えられた。上記実験では、１８日目と２０日目にマウスを抗ヒスタミンで治療（Ｊｏｓｅら，１９９４年，前掲）すると、それ以上の死亡は発生しなかった。
【００７８】
実施例７
組換えｃｐｎ１０又は賦形剤で治療したマウスの組織学
接種後１４日目に、２．５μｇの組換えｃｐｎ１０／マウスを１日おきに腹腔内投与した群からのマウス２匹と、賦形剤だけを与えた群からのマウス２匹を麻酔し、カルノフスキー固定液（ＭｃＣｏｍｂｅら，１９９２年，前掲）を潅流させた。各群から潅流のために選択されたマウスは、その日の群の平均を表す障害スコアを有していた。脊髄を取り出し、Ｅｐｏｘ８１１２に包埋し、頚部（Ｃ５）、胸郭（Ｔ６）、腰部（Ｌ４）及び仙椎（Ｓ２）骨髄ならびに馬尾からの半薄型の切片をトルイジンブルーで染色した。切片を炎症及び脱髄の徴候について調べた。
【００７９】
対照マウス及びｒｃｐｎ１０で治療したマウス由来の多重レベルの骨髄切片が図１０に示されている。コントロールマウスの場合、実質内の軟膜下領域及び血管周囲領域に炎症が見られる。脱髄の徴候があり、頚部骨髄より仙椎及び腰部骨髄の方が重度であった。ｒｃｐｎ１０で治療したマウスでは、特に実質に炎症が少なく、脱髄も少ないことが分る。
【００８０】
実施例８
ＭＢＰに応答したインビトロリンパ節細胞の増殖
インビトロリンパ球増殖アッセイで、ＩＦＮ−β、組換えｃｐｎ１０及び化学合成ｃｐｎ１０の活性を決定した。１％自己ラット血清を含むｒｃｐｎ１０（２００μｇ／ｍｌ）及びｓｃｐｎ１０（１００μｇ／ｍｌ）を、使用前に３日間、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ；０．０５Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４／０．１５Ｍ 塩化ナトリウム）に透析し、ＮＡＰ−５カラム（アマーシャム ファルマシア バイオテク社）上の培養培地（２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン、１％熱失活自己ラット血清を含むＲＰＭ１６４０）中に移し、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ４ ０．２２μｍ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（ミリポア社、米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在）を通過させてフィルター滅菌した。対照賦形剤も同様に治療した。ルイスラットにＭＢＰを接種してＭＢＰ−ＥＡＥを誘発させた。１０日目に、２匹のラットの接種した四肢に排膿する膝窩リンパ節を取り出し、培養培地中で細胞懸濁液（４×１０⁶／ｍｌ）を調製した。図１１に示されているように、ＭＢＰ（２０μｇ／ｍｌの最終濃度）及び０．１〜５０μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度のＩＦＮ−β又はｃｐｎ１０の存在下に、９６ウエル平底プレート中でリンパ節細胞（２×１０⁵／ウエル）を三部にして試験した。対照ウエル（各６ウエル）には、（ａ）ＭＢＰは含むがｃｐｎ１０は含まない細胞と、（ｂ）ＭＢＰもｃｐｎ１０も含まない細胞を入れた。プレートを３７℃、５％ＣＯ₂下に７２時間培養した。最後の１８時間の間に、各ウエルに０．５μＣｉ［メチル−³Ｈ］チミジン（アマーシャム ファルマシア バイオテク社）を間欠的に加え、含まれている放射能を測定した。結果を、刺激率、すなわち、ＭＢＰを含むウエルの平均／ＭＢＰを含まないウエルの平均として表した。種々の希釈度のｃｐｎ１０を含む場合の刺激率と、ｃｐｎ１０を含まない場合の刺激率とを比較した（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）。
【００８１】
７２時間の培養後に、ｒｃｐｎ１０、ｓｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βはすべてＭＢＰ−ＥＡＥラット由来のリンパ節細胞のＭＢＰ誘発性増殖を抑制した（図１１）。ＩＦＮ−βが最も効力があり、１．９μｇ／ｍｌ（９６ｎＭ）の濃度で細胞増殖を５０％阻害したのに比べ、このレベルの阻害を達成するのに、ｓｃｐｎ１０では１１μｇ／ｍｌ（１．１μＭ）、ｒｃｐｎ１０では２８μｇ／ｍｌ（２．８μＭ）の濃度であった。
【００８２】
実施例９
ｃｐｎ１０用バイオアッセイであるロゼット抑制試験
ｃｐｎ１０用のバイオアッセイであるロゼット抑制試験、（Ｃａｖａｎａｇｈ ＆ Ｍｏｒｔｏｎ，１９９６年，前掲）で、ｓｃｐｎ１０、ｒｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βを活性について試験した。ｒｃｐｎ１０とｓｃｐｎ１０（５０μｇ）は、ハンクスの平衡塩類溶液／０．０１％ＢＳＡ（ＨＢＳＳ／ＢＳＡ）中で１０^-5から１０^-15まで１０倍希釈した。ＩＦＮ−β（０．５μｇ／ｍｌ）は、ＨＢＳＳ／ＢＳＡ中で１０^-13まで１０倍希釈した。クワッケンブッシュマウス由来の脾臓細胞を用いて、各希釈物のロゼット抑制力価（ＲＩＴ）を測定した。このアッセイで正の結果を得るための試料の最高希釈度として限界用量（対数逆数試料希釈度）を記録した。
【００８３】
これらの実験において、ｒｃｐｎ１０及びｓｃｐｎ１０は、ロゼット抑制試験において全く同一の反応を示した（図１２）。これとは対照的に、ＩＦＮ−βは、このアッセイでは、どの濃度においても活性を有していなかった。
【００８４】
実施例１０
ｃｐｎ１０はマウスの抗原誘発性アナフィラキシー死を予防する
実施例６に記載の実験に鑑み、アナフィラキシーショックであると思われるものに起因するマウスの死をさらに調査した。４つの群のマウスにＰＬＰ ｐ１３９−１５１を接種した。０日目に、２つの群にはｃｐｎ１０を与え、２つの群にはコントロール賦形剤を与えた。１０日目に、各ｃｐｎ１０群の１つにＩＦＮ−β又はＰＢＳ／ＢＳＡを与え、各コントロール群の１つにＩＦＮ−β又はＰＢＳ／ＢＳＡを与えた。
【００８５】
表５に示されているように、ＰＢＳ／ＢＳＡ中のＩＦＮ−β注射又はＰＢＳ／ＢＳＡ注射を開始してから８日目〜１２日目の間に、ＢＳＡは与えたがｃｐｎ１０は与えなかった群では４／９及び６／１０のマウスが死亡したが、ＢＳＡとｃｐｎ１０とを与えた群では３／１０及び０／９のマウスが死亡した。これらのマウスは、ＢＳＡ担体タンパク質の投与によるアナフィラキシーのために死亡したものと考えられる。結論として、ｃｐｎ１０を投与されたマウスは、ＢＳＡに対する免疫感作によって引き起こされるアナフィラキシーショックから保護されたのに対し、ＩＦＮ−βはこの保護を与えなかった。また、ｃｐｎ１０を投与したときの投与部位の炎症も少なかった。
【００８６】
実施例１１
総括
上記実施例に示された結果から、ｃｐｎ１０がＳＪＬ／Ｊマウスにおいてミエリンプロテオリピドタンパク質によって誘発されるＥＡＥの臨床的徴候を抑制することが示された。このモデルは、ヒトのＭＳの臨床的経過によく似た慢性の再発型ＥＡＥである。ＭＳに罹患している患者は、ＰＬＰペプチドに対するＴ細胞応答を強化した（Ｇｒｅｅｒら，Ｂｒａｉｎ，第１２０巻：１４４７−６０ページ，１９９７年）が、これはさらに、ＰＬＰによって誘発されたＥＡＥがＭＳの良いモデルであることも示唆している。実験期間中、障害の抑制に最も有効な用量は、１日おきに投与された５μｇ及び１０μｇであった。用量をこれより高くすると効力が低下した。高用量での同様な効力低下が、先に、ラットにおいて、移植部位に局所的にｃｐｎ１０を投与すると同種異系皮膚移植の生存時間を延長し得ることを示す研究で観察されている。ＥＡＥマウスにおけるｃｐｎ１０の抑制効果は、初回攻撃時よりも再発期の方がより明らかであった。障害の抑制が初回攻撃時より再発期に強力になる理由は、ｃｐｎ１０がこの期間に活性である天然サプレッサー機構を高めるか、又は再発が初回エピソードとは病態生理学的に異なるからかも知れない。慢性ＥＡＥの後期エピソード中、他の抗原に対しても免疫応答が広がって抗体応答が強化され、その結果、後期エピソードの病因論が初回攻撃のものとは異なるのかも知れない。この研究でも、ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βがそれらの能力を協同作用させてＥＡＥを抑制することが示された。ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βを一緒に投与すると、どちらかを単独で投与するよりも強力に障害を抑制する。これは、障害の再発期に特に明白であったが、いつでも、ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βとはそれらの能力を協同作用させて障害を抑制したし、アンタゴニスト作用は観察されなかった。
【００８７】
ロゼット抑制試験において、ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βとは異なる反応を示し、リンパ球増殖アッセイは、それらが作用機構を異にすることを示唆している。ロゼット抑制試験は、ＥＰＦが最初に発見されたアッセイであり（Ｍｏｒｔｏｎら，１９７６年，前掲）、依然としてＥＰＦ及びｃｐｎ１０用のバイオアッセイである。ロゼット抑制試験におけるＥＰＦの作用は、リンフォカイン、ＥＰＦ−Ｓ₁及びＥＰＦ−Ｓ₂によって仲介され、ＥＦＰがマウスやヒトのＣＤ４＋細胞に結合した後で順次誘発される（Ｒｏｌｆｅら，１９８８年，前掲；Ｒｏｌｆｅら，１９８９年，前掲）。これらのリンフォカインは、遅延型過敏症反応を抑制する能力のためにサプレッサー因子と称された（Ｒｏｌｆｅら，１９８８年，前掲）。リンフォカインはその能力が遺伝子制限されている。ＥＰＦ−Ｓ₁（Ｍｒ １４−１８，０００）の制限は、ネズミＨ−２のＩ領域及びヒトのＨＬＡ−ＤＲにマッピングされているが、ＥＰＦ−Ｓ₂（Ｍｒ −５５，０００）の制限は、Ｉｇｈ領域に局在している（Ｒｏｌｆｅら，１９８８年，前掲；Ｒｏｌｆｅら，１９８９年，前掲；Ｒｏｌｆｅら，１９９５年，前掲）。ｒｃｐｎ１０で治療した後の臨床的徴候の抑制は、初回攻撃後に治療を中止したにもかかわらず、６０日目まで維持された。これは、長期抑制型活性の誘発を示唆している。ＩＦＮ−βはロゼット抑制試験においては活性ではなく、これは、ＩＦＮ−βがリンパ球活性のダウンレギュレーションに同じサプレッサー−インデューサー経路を使っていないことを示している。
【００８８】
ＩＦＮ−βは、ＭＢＰに応答したインビトロＭＢＰ活性化リンパ球の増殖を抑制する能力においてはｃｐｎ１０よりかなり活性が高い。ＩＦＮ−β（Ａｒｎａｓｏｎ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，第４３巻：６４１−６４３ページ，１９９３年）もｃｐｎ１０も共に活性化Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生を抑制する。ＩＦＮ−βはＩＦＮ−γの分泌を阻害し、ＭＳ患者の欠陥サプレッサー活性を高め、抗原提示細胞表面でＩＦＮ−γにより誘発されるクラスＩＩ主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原の発現を阻害する（Ｔｈｅ ＩＦＮＢ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，第４３巻：６５５−６６１ページ，１９９３年）。ｃｐｎ１０は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞及び単核細胞の亜集団に結合する。ｃｐｎ１０が活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団に結合すると、ＩＦＮ−β集団の抑制が生じる。ｃｐｎ１０が免疫調節作用を誘発させる手段及びこれがどのようにｄｐｎ１０のＥＡＥにおける障害抑制能力に関連するかは未だ解明されていない。
【００８９】
これらの研究により、ｃｐｎ１０が慢性ＥＡＥを抑制し得、かつマウスのＥＡＥの臨床的徴候を抑制するＩＦＮ−βの能力を高め得ることが示された。本発明者らによって解明されたｃｐｎ１０とＩＦＮ−βの作用の異なる機構が、これらの作用物質に、ＥＡＥ及びＭＳの協同療法としての新たな前途を開いたことは極めて重大である。確かに文献によって示唆されたように、もしｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βが類似の免疫抑制機構を介して作用するならば、ＥＡＥモデルで観察し得る協同的又は相乗作用的効果は存在し得ないであろう。それに対し、本明細書に呈示されているｃｐｎ１０とＩＦＮ−βの異なる作用機構及びＥＡＥデータは、ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βがヒトのＭＳの有用な組合せ療法となるという提案について論理的な根拠を提供している。
【００９０】
ＩＦＮ−βはヒトの多発性硬化症のための疾病改変療法として広範囲に用いられている。ＩＦＮ−βは臨床的再発速度を低下させ、障害の持続性進行の発生時期を遅らせ、かつ再発性−寛解性多発性硬化症に罹患している患者の新規なＭＲＩ病変の数を低減させる（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎβ−１ｂ，Ｌａｎｃｅｔ，第３５２巻：１４９１−１４９７ページ，１９９８年）。しかし、患者によっては、治療を開始してから２年以内に障害の持続性進行を経験するものもあり、これは、ＩＦＮ−βの効力をＩＦＮ−βの効力と合わせた他の可能性のある療法と同時に調査する研究がさらに必要であることを示唆している。
【００９１】
要約すると、本明細書に呈示した動物モデルの結果は、ｃｐｎ１０がヒトＭＳの治療にＩＦＮ−βと組合わせて使用するための有力な候補であることを示唆している。第１に、ｃｐｎ１０は、ＥＡＥ／ＭＳ症状の誘発においてＩＦＮ−βと相乗作用するようである。第２に、ｃｐｎ１０とＩＦＮ−βの組合せ療法の中止後にＥＡＥの再発が著しく減少することは、万が一副作用のために一時的にＩＦＮ−βの投与を中止するようなことがあっても、この組合せ療法が有用な治療法となり得ることを示唆している。第３に、ｃｐｎ１０は、典型的にはＩＦＮ−βを含む医薬組成物中に存在する（ＢＳＡなどの）担体タンパク質抗原に対するアナフィラキシー反応の可能性を低減させるようである。
【００９２】
本明細書に詳細に説明されている発明は、当業者による改変及び変更が可能であるが、そのような改変及び変更は本明細書に記載されている発明の広範な精神及び範囲内に包含される。
【００９３】
（表の簡単な説明）
表１
ＭＳの治療に現在使用されているＩＦＮ−β調製品のリスト。ｓｃ＝皮下注射、ｉｍ＝筋内注射。
表２
組換えｃｐｎ１０による治療は、ＬｅｗｉｓラットにおけるＭＢＰ−ＥＡＥの平均総臨床スコアを下げる。０日目にラットの１つの後足の肉球にＭＢＰを接種した。ｃｐｎ１０又は賦形剤のみを、０日目から始まる１７日目まで、示した時間間隔で、腹腔内（ｉｐ）又は経口投与した（１群当たりラット７匹）。臨床上の徴候を１０日目から２０日日まで毎日記録し（方法の箇所を参考）、表中の群の試験を３５日目まで続け（^*で示す）、１ラット当たりの平均臨床スコアを各群について決定した。試験群の１ラット当たりの平均総臨床スコアを、同時に試験した賦形剤のみを受けた群の１ラット当たりの平均総臨床スコアと比較した（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔ）。
【００９４】
表３
ｒｃｐｎ１０による治療は、ＳＪＬ／ＪマウスにおけるＰＬＰ−ＥＡＥの総ＥＡＥ障害スコアを下げる。ＥＡＥはＰＬＰペプチド１３９−１５１によりＳＪＬ／Ｊマウスで誘発させた（グリアー（Ｇｒｅｅｒ）ら、１９９６年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：１７１−１７９）。マウス（１群当たりｎ＝１０）は、ｒｃｐｎ１０又は賦形剤で治療し、８日目から４２日目又は６０日目まで臨床的に評価した。結果は、同時に試験した賦形剤のみを受けた群と比較したｒｃｐｎ１０治療群における、試験期間にわたる総平均障害スコア／マウスとして記録した（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ ｔｅｓｔ）。
【００９５】
表４
組換えｃｐｎ１０（ｒｃｐｎ１０）とＩＦＮ−βの組み合わせ治療は、ＳＪＬ／ＪマウスにおけるＰＬＰ−ＥＡＥの総臨床スコアを下げる。ＥＡＥはＰＬＰペプチド１３９−１５１によりＳＪＬ／Ｊマウスで誘発させた。マウス（１群当たりｎ＝１０）は、ｒｃｐｎ１０、ＩＦＮ−β、又は両方の組み合わせ、若しくは賦形剤のみで上述のように治療した。マウスを８日目から６０日目まで、８日目から２１日目まで、及び２２日目から６０日目まで臨床的に評価した。結果は、試験期間にわたる各群の１マウス当たりの総平均臨床スコアとして記録した。ｒｃｐｎ１０、ＩＦＮ−β、及びｒｃｐｎ１０＋ＩＦＮ−βで治療した群の結果を、同時に試験した賦形剤のみを受けた群の結果と比較した（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔ）。
【００９６】
表５
ＳＪＬ／Ｊマウスにおける抗原誘導アナフィラキシー死の予防。０日目にＥＡＥをＰＬＰペプチド１３９−１５１により４群のＳＪＬ／Ｊマウスに誘発させた。０日目に、群１と群２は２．５μｇのｃｐｎ１０／マウス／４８時間腹腔内投与を受け、群３と群４は賦形剤のみを受けた。１０日目に、群１と群３は０．５×１０⁴単位のマウスＩＦＮ−β（ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡに溶解）を受け、群２と群４はＰＢＳ／ＢＳＡを受けた。８日目から、マウスの体重を測定し、ＥＡＥの臨床上の徴候を毎日調べた。データは、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡに溶解させたＩＦＮ−β又はＰＢＳ／ＢＳＡのみによる治療を開始した後８〜１２日目に死亡した各群のマウスの数を、各群のマウス総数の分数として示す。群１と群２対群３と群４の死亡率を統計比較すると、カイ二乗分析を用いたｐ値が＜０．０２であることが明らかとなった。
【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＢＰの接種日に開始した、ＥＡＥラットへの組換えｃｐｎ１０の腹腔内投与。値は平均障害平均標準誤差（ＳＥＭ）を示す。ｃｐｎ１０治療により、総障害スコアは有意に減小した（ｐ＝０．００１；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔ、Ｓｉｇｍａ Ｓｔａｔ２．０、Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【図２】ＭＢＰの接種日に開始した、ＥＡＥラットへの組換えｃｐｎ１０の経口投与。値は平均障害平均標準誤差（ＳＥＭ）を示す。ｃｐｎ１０治療により、総障害スコアは有意に減小した（ｐ＝０．００５；Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｒａｎｋ Ｓｕｍ Ｔｅｓｔ、Ｓｉｇｍａ Ｓｔａｔ２．０、Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
【図３】ＭＢＰの接種日に開始した、ＥＡＥラットへの組換えｃｐｎ１０ ｐＧＥＸの腹腔内（ｉ／ｐ）又は経口（Ｏ／Ｆ）投与。値は１群当たりの体重減少（％）を示す（１０日目の体重と比較）。
【図４】ＭＢＰの接種日にラットへ組換えｃｐｎ１０を腹腔内又は経口投与するか、若しくはラットをコントロール賦形剤で治療した、該ラットにおけるＭＢＰに対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応。４群のラット（１群当たりｎ＝４）を０日目にＭＢＰで接種し、０日目から１６日目まで毎日経口投与（Ｏ／Ｆ、群２）又は腹腔内投与（３群）によりｃｐｎ１０（５０μｇ／ラット）を受けさせるか、又は腹腔内により賦形剤のみ（１群と４群）を受けさせた。１５日目に、ラットの両耳の耳の厚さを測定し、群２〜４の両耳の底部に１０μｌ食塩水に溶解した２０μｇＭＢＰを注入した。群１には食塩水を注射した。２４時間後、再び両耳を測定し、引き算により耳の膨張を測定した。群４と比較して^***ｐ＜０．００１；^**ｐ＜０．００３であった（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）。
【図５】ＭＢＰの接種日（０日目）に開始した、ラット（ｎ＝３）への組換えｃｐｎ１０の毎日の腹腔内投与又は経口投与が、白血球総数及び差に及ぼす影響。計数は（標準偏差で示す）１６日目に得た。
【図６】インビトロにおける組換えｃｐｎ１０によるＭＢＰ刺激由来のリンパ球増殖の抑制。リンパ球はＭＢＰの接種後に１０日目にラットの排膿リンパ節から回収した。ｃｐｎ１０の希釈液は、プレートで最終濃度を与えるように調製され、１００μｌを三つ組に分配した。各ウェルに５０μｌの洗浄したリンパ球（４×１０⁶／ｍｌ）と５０μｌのＭＢＰ（８０μｇ／ｍｌ）とを加えた。コントロールウェルは、：ａ）ＭＢＰを有するがｃｐｎ１０は有さない細胞、又はｂ）ＭＢＰを有さずｃｐｎ１０も有さない細胞、のいずれかを含んでいた。プレートを７２時間インキュベートし、最後の１８時間の間は０．５μＣｉ［メチル−³Ｈ］チミジンを適用した。ｃｐｎ１０が有るか無い状態でインキュベートした細胞に取り込まれた放射能（ｃｐｍ＋標準偏差）を測定することにより、増殖を評価した。^***ｐ＜０．００１；^**ｐ＝０．００５であった（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）。
【図７】賦形剤のみで治療したマウスと比較した、組換えｃｐｎ１０で治療したＳＪＬマウスにおけるＥＡＥの平均障害スコアの減小。ＥＡＥは、ＰＬＰペプチドｐ１３９−１５１によりマウス（１群当たりｎ＝１０）で誘発させ、ｃｐｎ１０（１０μｇ／マウス／４８時間又は２．５μｇ／マウス／４８時間）又は賦形剤のみを０日から２０日まで腹腔内投与した。８日目から、臨床上の徴候を毎日監視し、各マウスの総障害を記録した。結果を、平均障害スコア／群として示す。
【図８】賦形剤のみで治療したマウスと比較した、ａ．組換えｃｐｎ１０（ｒｃｐｎ１０）又はｒｃｐｎ１０＋ＩＦＮ−β、ｂ．ＩＦＮ−β又はｒｃｐｎ１０＋ＩＦＮ−βで治療した、ＳＪＬ／ＪマウスにおけるＰＬＰ−ＥＡＥの平均障害スコア（±平均標準誤差）。ＥＡＥは、ＰＬＰペプチドを０日目に接種することにより誘発させた。マウス（ｎ＝１０／群）はａ．０日目から２０日目まで一日おきに腹腔内にｒｃｐｎ１０（２．５μｇ／マウス）、ｂ．１０日目から２０日目まで一日おきに皮下にＩＦＮ−β（５×１０³単位／マウス）、又は両方の組み合わせを受けた。コントロールマウスは賦形剤のみを受けた。８日目から６０日目まで、臨床上の徴候を毎日監視し、各群の平均障害スコアを記録した。結果を平均障害スコア／群として示す。
【図９】初期攻撃と再発期間の間に組換えｃｐｎ１０、ＩＦＮ−β又は両方の組み合わせで治療した、ＳＪＬ／ＪマウスにおけるＰＬＰ−ＥＡＥの総平均障害スコア（±平均標準誤差）。ＥＡＥは、ＰＬＰペプチドを０日目に接種することにより誘発させた。マウスは、ｒｃｐｎ１０腹腔内（０日目から２０日目まで一日おきに２．５μｇ／マウス）、ＩＦＮ−β皮下（１０日目から２０日目まで一日おきに５，０００単位／マウス）、又は両方の組み合わせで治療した。コントロールマウスは賦形剤のみを受けた。臨床上の徴候を８日目から２１日目までと２２日目から６０日目まで監視した。ｒｃｐｎ１０とＩＦＮ−βの組み合わせ治療により、初期攻撃の間、コントロール群と比較して障害が有意に抑制された（^*ｐ＝０．０５０）、再発期間の間でもｒｃｐｎ１０又はｒｃｐｎ１０＋ＩＦＮ−βによってコントロール群と比較して障害が有意に抑制された（^**ｐ＝０．０３０、^***ｐ＝０．０１４）。
【図１０】１４日目にサンプル採取した、（Ａ）コントロールマウスと（Ｂ）組換えｃｐｎ１０（０日目から２０日目まで一日おきに２．５μｇ／マウス、腹腔内）で治療したマウスの仙骨脊髄の切片。コントロールマウス（Ａ）では、多くの繊維に炎症（大きな矢印）と髄鞘脱落（小さな矢印）の顕著な領域が存在した。ｃｐｎ１０治療マウス（Ｂ）では、軟膜下領域に炎症（大きな矢印）が観察されたが、髄鞘脱落の証拠は殆ど無かった。
【図１１】インビトロにおけるｒｃｐｎ１０、合成ｃｐｎ１０（ｓｃｐｎ１０）及びＩＦＮ−βによるＭＢＰ刺激由来のリンパ球増殖の抑制。リンパ球はＭＢＰの接種１０日後にラットの排膿リンパ節より回収し、（２×１０⁵細胞）を、ＭＢＰ（２０μｇ／ｍｌ）及びｒｃｐｎ１０、ｓｃｐｎ１０、ＩＦＮ−βと、示した濃度でインキュベートした。コントロールウェルは、ａ）ＭＢＰを有するがｃｐｎ１０はない細胞、又はｂ）ＭＢＰを有さずｃｐｎ１０もない細胞、のいずれかを含んでいた。プレートを３日間インキュベートし、最後の１８時間は０．５μＣｉ［メチル−³Ｈ］チミジンを適用した。細胞に取り込まれた放射能によって増殖を評価し、刺激率として示した（ＭＢＰを有するウェルの平均／ＭＢＰを有しないウェルの平均；標準偏差を示す）。ｃｐｎ１０又はＩＦＮ−βを有するウェルの結果を、ｃｐｎ１０又はＩＦＮ−βを有しないウェルの結果と比較した。^***ｐ＜０．００１；^*ｐ＝０．０５であった（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）。
【図１２】ロゼット抑制試験におけるＩＦＮ−β、合成ｃｐｎ１０（ｓｃｐｎ１０）と組換えｃｐｎ１０（ｒｃｐｎ１０）の活性。ｃｐｎ１０調製物（５０μｇ／ｍｌ）とＩＦＮ−β（０５μｇ／ｍｌ）は１０倍に希釈し、各希釈液のロゼット抑制力価を決定した。限界用量（対数逆数試料希釈度、標準偏差を示す）を、測定に陽性の結果を与えるサンプルの最も高い希釈度として記録した。

Claims (27)

1. 多発性硬化症（ＭＳ）を治療するための医薬組成物を製造するための方法であって、医薬として有効量のシャペロニン１０（ｃｐｎ１０）及びインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）と医薬として許容される担体又は希釈液とを配合する工程を備える、前記方法。
2. 前記多発性硬化症（ＭＳ）の治療がＭＳの再発予防のための治療である請求項１に記載の方法。
3. 前記ＩＦＮ−βは単独で投与された時はＭＳの治療に有効ではない請求項１または２に記載の方法。
4. ＩＦＮ−βとｃｐｎ１０が同時に投与されるように前記医薬組成物が構成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. ＩＦＮ−βとｃｐｎ１０が別々に投与されるように前記医薬組成物が構成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記医薬組成物は注射の形態である、請求項４に記載の方法。
7. ｃｐｎ１０が経口投与されるように前記医薬組成物が構成される、請求項５に記載の方法。
8. ＩＦＮ−βが注射により投与されるように前記医薬組成物が構成される、請求項５又は請求項７に記載の方法。
9. 医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βが５−６０ｍｇのｃｐｎ１０を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
10. 医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βが１０−３０ｍｇのｃｐｎ１０を含む、請求項９に記載の方法。
11. 医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βが１−１０の百万国際単位（ＭＩＵ）のＩＦＮ−βを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
12. 医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βが４−６ＭＩＵのＩＦＮ−βを含む、請求項１１に記載の方法。
13. ＭＳを治療するための医薬組成物であって、医薬として有効量のシャペロニン１０（ｃｐｎ１０）及びインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）と医薬として許容される担体又は希釈液とを含む医薬組成物。
14. 前記ＩＦＮ−βは単独で投与された時はＭＳの治療に有効ではない請求項１３に記載の組成物。
15. 医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βが５−６０ｍｇのｃｐｎ１０を含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
16. 医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βが１０−３０ｍｇのｃｐｎ１０を含む、請求項１５に記載の組成物。
17. 医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βが１−１０ＭＩＵのＩＦＮ−βを含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
18. 医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βが４−６ＭＩＵのＩＦＮ−βを含む、請求項１７に記載の組成物。
19. 医薬として有効量のシャペロニン１０（ｃｐｎ１０）及びインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）と医薬として許容される担体又は希釈液とを備えた多発性硬化症（ＭＳ）の治療用のキット。
20. 前記キットは、単独で投与された時はＭＳの治療に有効ではない量のＩＦＮ−βを含む請求項１９に記載のキット。
21. 前記ＩＦＮ−βは脱水した形をしており、使用の際に前記医薬として許容される担体又は希釈液によって再水和される、請求項１９または２０に記載のキット。
22. 前記ｃｐｎ１０は脱水した形をしており、使用の際に、前記医薬として許容される担体又は希釈液によって再水和される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のキット。
23. 前記ｃｐｎ１０は錠剤又はカプセルの形をしている、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のキット。
24. 医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βが５−６０ｍｇのｃｐｎ１０を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のキット。
25. 医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βが１０−３０ｍｇのｃｐｎ１０を含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のキット。
26. 医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βが１−１０ＭＩＵのＩＦＮ−βを含む、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のキット。
27. 医薬として有効量のｃｐｎ１０及びＩＦＮ−βが４−６ＭＩＵのＩＦＮ−βを含む、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載のキット。

Images