JP4804626B2 - 免疫レギュレータ - Google Patents
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Description
本発明は、免疫学の分野に関し、さらにとりわけ、アレルギー、自己免疫疾患、移植関連疾患および炎症疾患などの免疫仲介障害の分野に関する。
【0002】
免疫系は、炎症性物質、微生物侵襲、または傷害に脅かされたときにサイトカインや他の液性因子を産生して宿主を防御する。ほとんどの場合、この複雑な防御ネットワークは正常な恒常性をうまく復帰させるが、しかしある場合には液性因子が実際に宿主に害毒を及ぼしうる。アナフィラキシーショック、自己免疫疾患、および免疫複合体障害を含む、免疫疾患および免疫系由来の傷害の例のいくつかについて、広く調査されている。
【0003】
液性および細胞性免疫学、分子生物学および病理学における最近の進歩は、自己免疫は免疫仲介疾患の一部であるとする現在の考え方に影響を与えている。これらの進歩は、抗体、B細胞とT細胞の多様性、先天性の(単球、マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、γδ T細胞、補体、急性期蛋白、など)および後天性の(TおよびB細胞と抗体)または細胞性および液性免疫応答の形成ならびにそれらの相互依存性、(自己)寛容誘導および免疫学的応答が自己抗原的成分に対して起こる理由についての基本的な点における本願発明者らの理解を深めた。
【0004】
1900年から、免疫学のセントラルドグマは、免疫系は通常は自己に応答しないというものだった。しかしながら、最近ではかつて考えられていたほど自己免疫応答は珍しくなく、また全ての自己免疫応答が有害ではないこといくつかの応答には通常の免疫応答を調節するために、明確な役割を果たしているものもあることが明らかとなった。たとえば、主要組織適合抗原複合体(MHC)によってコードされる細胞表面抗原や自己イディオタイプに対する抗イディオタイプ応答の認識のようなある形の自己免疫応答は、多様性および健全な免疫系の正常な機能に重要で、事実、必須である。
【0005】
見かけ上は、チェックと均衡との複雑な系が種々の免疫系細胞のサブセット(すなわちT細胞)の間で維持されていて、それによって個体に外来の侵入物に対抗できる免疫系を提供している。この意味において、自己免疫は免疫系において調節する役割を果たしている。
【0006】
しかしながら、現在ではまた、異常な自己免疫応答は多くのヒトや動物の疾患の、ときに最初の原因となり、別の場合では二次的な寄与をするものとなると認識されている。自己免疫疾患のタイプは頻繁に重複し、複数の自己免疫障害が同一の個体、自己免疫内分泌異常を持つ個体でおこる傾向がある。自己免疫症候群は、リンパ性過形成、悪性リンパ球または血漿細胞増殖およびγ−グロブリン不全症、選択的Ig不全と補体系不全のような免疫不全障害によって仲介されうる。
【0007】
全身性エリテマトーシス、糖尿病、リウマチ性関節炎、産後甲状腺機能減退、自己免疫性血小板減少症、(判読不明)のような自己免疫疾患は、たとえば広く分布する自己抗原的決定因子に対する、あるいは器官または組織特異的抗原に対して起こる自己免疫応答で特徴づけられる。これらの疾患は、ただ一つの抗原性標的に対して、または多くの自己抗原に対して、異常な免疫応答を引き起こしうる。多くの例において、自己免疫応答が修飾されていない自己抗原またはウイルス、微生物抗原とハプテン類のような多種の何らかの物質に修飾(または類似)された自己抗原に対して起こるかは明らかでない。
【0008】
さまざまな自己免疫不全についての根源と病原を説明する統一された見解はいまだ成立していない。実験動物における研究から、自己免疫疾患は、個体同士で異なる遺伝子的および免疫学的な幅広い異常が原因となりえ、また多くの付加的な外因性(ウィルス、細菌)または内因性(ホルモン、サイトカイン、異常遺伝子)促進因子の存在または非存在に依存して、生涯の早期または後期に発現しうるとする概念を支持している。
【0009】
主な自己免疫疾患を寄せ付けない同様なチェックと均衡とには、アレルギー(喘息)、セプシスや敗血性ショックのような急性炎症疾患、慢性炎症疾患(すなわちリウマチ性疾患、シューグレン症候群、多発性硬化症)、移植関連免疫応答(移植片対宿主疾患、輸血後血小板減少症)、そして反応性抗原が(少なくとも最初は)自己抗原ではないであろうが、しかしそこで前記抗原に対する免疫応答が原則的に個体にとって望ましくなく、有害であるような他の多くの疾患などの免疫仲介障害が含まれる。セプシスは免疫伝達物質における症候群であり、たとえば微生物感染、傷害または他の因子により誘発され、恒常性の異常、器官損傷や結局は致死的なショックを引き起こす急性炎症状態を誘発する。セプシスは重篤な感染への全身的反応に関係している。セプシス症患者は通常、発熱、心拍増加、頻呼吸、白血球増加および感染の局在部位を示す。血液や感染部位からの微生物培養は頻繁に、しかし例外なく陽性である。この症候群が低血圧または多臓器機能不全(MOSF)に至ったとき、この状態をセプシスまたは敗血性ショックと呼ぶ。最初は、微生物が感染病巣で増殖する。微生物は血流に侵入することが出来、結果血液培養陽性となったり、局所的に増殖し、さまざまな物質を血流に放出しうる。このような物質は、病理学的に2つの基本的なカテゴリーに分類される。内毒素と外毒素である。内毒素は典型的にはブドウ球菌のタイコ酸抗原のような微生物の構成要素からなり、またはグラム陰性菌のLPSのような内毒素である。外毒素(たとえば毒性ショック症候群毒素−1、ブドウ球菌エンテロトキシンA,B,またはC)は微生物により合成され直接放出される。
【0010】
その名前から示唆されるように、これらのタイプの細菌毒素は共に病原性を持ち、血漿タンパク質前駆体または細胞(単球/マクロファージ、内皮細胞、中性球、T細胞、および他のもの)からの大量の内因性の宿主由来免疫伝達物質の放出を刺激する。
【0011】
実際、一般的に組織と器官の損傷を引き起こすこれらの免疫伝達物質はセプシスや敗血性ショックに関係する。これらの作用のいくつかは、伝達物質に直接誘導される器官損傷をくい止めるものもある。しかしながら、ショック関連性器官機能不全の一部はおそらく伝達物質仲介の脈管異常に起因し、全身性と局所性の血流異常という結果となり、抵抗性の低血圧またはMOSFを引き起こす(Bennett et al.)。
【0012】
非肥満糖尿病(NOD)マウスは自己免疫疾患、この場合血中グルコース濃度上昇(高血糖)が主要な医学的特徴であるインスリン依存性糖尿病(IDDM)のモデルである。前記血中グルコース濃度の上昇は膵臓ランゲルハンス島のインスリン産生β細胞の自己免疫的破壊が原因であるとされている(Bach et al.1991, Atkinson et al. 1994)。これは、CD4+およびCD8+Tリンパ球、Bリンパ球、マクロファージと樹状細胞のヘテロ集団の混合によって構成されるこの小島(インスリン炎)を取り囲み、透過する巨大な細胞の浸潤を伴う(O'Reilly et al.1991)。
【0013】
NODマウスはβ細胞に対する自己免疫がIDDM発達の最初の段階であるモデルを表している。糖尿形成はヒトの疾患としては特定のMHCクラスII遺伝子と複数の関係のない遺伝子座の間の階乗的な相互作用によって成立する。さらに、NODマウスは遺伝と環境、また初期と二次的な自己免疫間の重大な相互作用をきれいに示し、その臨床的兆候はたとえばさまざまな外的要因に依存し、最も重要なのはNODマウスが飼われる環境の微生物量である。
【0014】
NODマウスにおける自己免疫に関しては、ほとんどの抗原特異的抗体およびT細胞応答はこれらの抗原が糖尿患者で自己抗原として検出された後に測定された。NOD糖尿病におけるこれらの自己抗原の役割の理解は、さらに病原性自己抗原と付帯現象としての自己免疫とを区別することにつながるだろう。
【0015】
一般的に、Tリンパ球は免疫仲介疾患工程の開始に中心的役割を果たす。(Sempe et al. 1991, Miyazaki et al. 1985, Harada et al. 1986, Makino et al. 1986)。CD4+T細胞は少なくともTh1とTh2の2つの主要なサブセットに分けられる。活性化したTh1細胞はIFN−γとTNF−αを分泌し、一方Th2細胞はIL−4、IL−5およびIL−10を産生する。Th1細胞は有効な細胞性免疫の形成に大きく関与しているのに対し、Th2細胞は酸性球と肥満細胞の活性化およびIgE産生を含んだ液性と粘液性の免疫とアレルギーの形成に役立っている(Abbas et al. 1996)。多くの研究がマウスとヒトの糖尿病とTh1表現型分化とを関係づけている(Liblau et al.1995,Katz et al.1995)。一方、Th2T細胞は比較的無害であると示されている。Th2T細胞は実際は防御的であることを疑う人もいる。katz et alは、CD4+T細胞がナイーブなレシピエントを糖尿に変化させる能力はTCRそれ自体によって認識される抗原特異性ではなく、T細胞応答の表現型の性質に存在することを示した。強く分極したTh1細胞が新生NODマウスに疾患を起こすが、一方Th2T細胞は、活性化され糖尿形成性のTh1T細胞集団と同じTCRを持つにも関わらずそれを起こさない。さらに、Th2T細胞を10倍以上同時に移入しても、Th2T細胞はTh1誘導性糖尿病を好転させることができない。
【0016】
セプシスまたは敗血性ショックの発生率は1930年代から増加しており、最近の全ての証拠は、この増加は続くであろうことを示唆している。この発生の増加の理由は数多い。すなわち血管内カテーテルのような侵入性器具の利用の増加、癌と移植に対する細胞傷害性、免疫抑制性薬物療法の広範な利用、セプシスを起こしやすい癌や糖尿病患者の寿命の延長、および抗生物質耐性菌の感染の増加である。セプシスまたは敗血性ショックは集中強化治療室における最も多い死因であり、合衆国の死因の第13位である。この疾患の正確な発生数は、報告されないため知られていないが、しかしながら、合衆国での年間の概算では400,000人がセプシスを発症し、200,000人の敗血性ショックの患者がおり、この疾患で100,000人が死亡している。
【0017】
グラム陰性およびグラム陽性菌のようなさまざまな微生物は、真菌類を含め、セプシスや敗血性ショックの原因となりうる。ある種のウイルスやリケッチアは同様の症候群を形成させうる。グラム陽性菌と比べ、グラム陰性菌はセプシスや敗血性ショックをある程度形成させやすいようである。どの部位に感染してもセプシスや敗血性ショックの原因となりうる。セプシスの頻度の高い原因は、腎炎、肺炎、腹膜炎、胆管炎、小胞炎、または髄膜炎である。これらの感染の多くは「院内(Nosocomial)」であり、他の医学的問題で入院している患者に起こる。正常な宿主防御を持つ患者では、ほとんどの患者で感染部位を同定できる。しかしながら、好中球減少症の患者では、おそらく小さく、医学的に現れない皮膚や腸の感染が適当な好中球の循環のない血流への侵入を引き起こすために、背端酢患者の半数以下で臨床的な感染部位を発見できない。明らかに、このような危険を持つ患者においてセプシスまたは敗血性ショックから守る必要がある。
【0018】
最近、セプシスの患者を最も治療が効果的な臨床的病態の初期に特定することにかなりの努力が向けられている。定義は器官機能不全(循環器、呼吸器、腎臓、肝臓、中枢神経系、血液、または代謝の異常)の証拠を伴った感染への全身性反応(発熱、心拍増加、頻呼吸、白血球増加)の兆候を含む。もっとも最新の定義では全身性炎症反応症候群(SIRS)という語句を用い、セプシスは感染によってだけでなく、外傷や膵炎のような非感染性の不全によっても引き金となりうる生体の免疫学的に仲介される炎症反応であることを強調している(全身性炎症反応(SIRS)、セプシスおよび敗血性ショックについての関係はCrit. Care Med. 20:864, 1992を参照のこと;セプシスと敗血性ショックの病原的事象の順序についての総説はN. Engl. J. Med. 328:1471, 1993を参照のこと)。
【0019】
毒性ショック症候群毒素(TSST−1)とは、臨床的に関連のある内毒素を指し、毒性ショック症候群の患者の90%以上で原因物質として特定されている(毒性ショックはスーパー抗原性外毒素が原因のセプシスまたは敗血性ショックと定義されている)。スーパー抗原は「通常」の抗原とはMHC分子に提示される前に細胞内でのプロセッシングが必要でない点で異なっている。代わりにそれらはTCRの外部の半保存領域に結合し、MHCクラスII分子上に提示された自己抗原の誤った「認識」の原因となる(Perkins et al, Huber et al. 1993)。これはT細胞とAPC両方の「誤った」活性化を起こし、増殖、エフェクター機能とサイトカイン分泌の活性化を引き起こす。スーパー抗原のT細胞のポリクローナルな活性化のために、大量の炎症性サイトカイン放出のための全身性の広範なショックが引き起こされる(Huber et al. 1993, Miethke et al. 1992)。
【0020】
セプシスに関与する炎症性サイトカインは類似している。これらの免疫伝達分子は腫瘍壊死因子(TNF)、インターフェロンγ(IFN−γ)、窒素酸化物(NOx)とインターロイキン1(IL−1)であり、微生物毒素への応答として単球、マクロファージや他のリ白血球によって大量に放出される(Bennett et al. Gutierrez-Ramos et al. 1997)。TNFや他の内因性伝達分子の放出は、さまざまな器官へのリンパ球浸潤と炎症のみならず発熱、白血球減少、血小板減少、血流力学変化、散発性の血管内凝固といった、全てが最終的に致死的となるセプシスの病理生理学的反応を引き起こしうる。TNFはまた内皮細胞に接着受容体(セレクチン類)を発現させる原因となり、白血球を活性化して炎症部位への接着、伸展そして移動のために内皮細胞表面に接着することを助けるこれらの受容体へのリガンドを発現させる(Bennett et al.)。セプシスや敗血性ショックの特定の動物モデルでは、モノクローナル抗体により接着段階を阻害すると組織傷害を防ぎ生存率を改善した。
【0021】
自己免疫疾患と急性および慢性炎症疾患両方でのこれらの発見は、活性化したTh−サブ集団間のバランスを調節している細胞の存在の仮定に同意する。そのような調節T細胞集団の反応性の変化によって誘導されるこのバランスでの可能性のある不釣り合いは、結果としてあるきわめて重要なサイトカインの欠損または過剰産生となる免疫仲介を引き起こしうる(O'Garra et al.1997)。これらのTh−サブ集団は免疫応答の薬理学的調節に関する可能性のある標的である。
【0022】
一般的に、免疫仲介障害は処置するのが難しい。よく、コルチコステロイドでの処置などの幅広く活性のある薬剤が適用され、または多くの局面で処置された個体に対して有害であろう他の広く活性のある坑炎症剤が適用される。
【0023】
一般的に免疫系の抑制と均衡を調節し、免疫仲介障害を処置するためのよりよく、より特異的な可能性についての必要性が存在する。
【0024】
本発明は特に免疫レギュレータ(IR)、免疫仲介障害の処置のための医薬組成物、免疫仲介障害を処置するための医薬組成物および方法を準備する場合のIRの使用を提供する。本明細書で記述したような免疫仲介障害には、I型またはII型糖尿病、リウマチ病、シェーグレン症候群、多発性硬化症などの慢性炎症疾病、移植片対宿主疾病、輸血後血小板減少、慢性移植拒絶、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、喘息、アレルギーおよび慢性自己免疫疾患などの移植関連免疫応答、(超)急性移植拒絶、敗血性ショックおよび急性自己免疫疾患などの急性炎症疾病が含まれる。自己免疫疾患は一般的に未知の原因の疾患の集合である。これらの疾病のほとんどにおいて、自己反応性抗体および/または自己反応性Tリンパ球の産生が発見できる。自己免疫応答はまた、ウイルスまたは細菌感染の発現として起こる可能性もあり、またたとえばB型肝炎ウイルス感染による破壊性肝炎のような重篤な組織障害となりうる。
【0025】
自己免疫疾患は、応答が最初に特定の器官に局在する抗原に対するのか、あるいは広い範囲の抗原に対するのかどちらかに依存して、器官特異的または非器官特異的として区分され得る。自己免疫疾患の処置の現在の主流は免疫抑制および/または(組織障害のために)ホルモン置換のような生命組成物の置換である。しかしながらステロイドまたは細胞増殖抑制性薬のような免疫抑制性薬剤は明らかな副作用を持っており、その適用を制限している。ここで、より特異的な免疫調節薬の使用が自己免疫疾患および他の炎症の処置において本発明によって提供される。たとえばTh1/Th2比を調節すること、樹状細胞の分化を調整することによる以下に記述するような免疫調節特性、低副作用プロフィール、初期臨床観察などを基準にすると、これらの製剤が自己免疫疾患などの免疫仲介炎症の患者の処置にとても有用であることが示される。
【0026】
免疫疾患の非限定的なリストには、橋本甲状腺炎、原発性 (mysxoedema) 浮腫甲状腺中毒、悪性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、アジソン病、早期閉経、インスリン依存性糖尿病、スティッフマン症候群、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、男性不妊症、天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫溶解性貧血、突発性血小板減少性紫斑病、突発性血小板減少、原発性胆汁性肝硬変、活性慢性肝炎、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ様関節炎、皮膚真菌症、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、円板状エリテマトーデス、および全身性エリテマトーデスが含まれる。
【0027】
1つの実施形態において、本発明はTh1細胞レベルをダウンレギュレートするおよび/またはTh2細胞レベルをアップレギュレートすること、または動物内でのその相対比に影響を与えることが可能な免疫レギュレータであって、尿、または血清、乳清、胎盤抽出物、細胞または組織などの体性産生物の他の供給源から入手可能な前記免疫レギュレータを提供する。本明細書で入手可能なものは、直接的にまたは間接的に前記供給源から前記IRを入手することに言及しており、IRはたとえば化学合成を介してまたは天然の動物または植物供給源から入手される。
【0028】
好ましい実施形態において、本発明は疾患動物(たとえばヒト)でのリンパ球サブセット集団の相対比および/またはサイトカイン活性を調節し、好ましくはこれらのリンパ球サブセット集団はTh1またはTh2集団からなる。一般的に、抗原提示細胞(APC)によって主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスII分子上に提示された関連抗原性ペプチドの刺激によって天然CD4+ヘルパーT細胞(Th)は機能的に成熟エフェクター細胞に分化する。産生されるサイトカインの特徴的な組を基準にすると、Th細胞は一般に少なくとも2つの異なるサブ集団、もっぱらインターロイキン−2(IL−2)、インターフェロン−ガンマ(IFN−γ)およびリンホトキシンを産生するTh1細胞と、一方IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−13を産生するTh2細胞に分けられる。これらのTh1およびTh2サブセットはサイトカイン産生特性においてこれらの分極化したサブセット中、両極をなすものであることがはっきりしており、個々のTh細胞は同等のサイトカイン遺伝子発現よりも差異を示す。これらのサブセットは関連ペプチドによるIL−2、IL−4、IL−5およびIFN−γを含むサイトカインの列を産生しているTh0細胞への誘引の後、共通のTh前駆体細胞(Thp)から分化する。これらの活性化Th0細胞は、それらの微小環境の細胞性およびサイトカイン組成物に基づいてTh1またはTh2へその後分極化する。マクロファージのサブセットに加え、樹状細胞の様々なサブセットのような抗原提示細胞はTh1またはTh2サブセット分化へのこの分極を広く決定する。Th1−TH2サブセットは、主にIFN−γおよびIL−10を介してそれぞれのサイトカイン産生特性を交差調節することが明らかであり、この概念から、これらの2つのサブセット間のバランスの障害は結果として異なる臨床的発現になるであろうことが合理的に解釈される[5]。IL−12は、Th1サブセット分極化を促進している優性因子であり、樹状細胞およびマクロファージがIL−12を産生する。さらに、IL−12はT細胞およびナチュラルキラー(NK)細胞によるIFN−γ産生を誘導する。最近、IL−18がTh1分化を誘導するためにIL−12と相乗的に作用することが報告された。Th2細胞の分極化はT細胞または好塩基球および肥満細胞によって産生されるIL−4の存在に非常に依存する。APC−由来IL−6はまた分化しているTh細胞で少量のIL−4を誘導することも示された。IL−10およびAPC−由来プロスタグランジンE2(PGE2)はIL−12の産生およびTh1起爆を阻害する。
【0029】
Th1−Th2変化はTh1細胞の機能と細胞仲介免疫(炎症応答、遅延型過敏症、および細胞傷害性)との相互関係およびTh2細胞と体液性免疫との相互作用を明らかにするのに有用であった。一般的に、感染性疾患の間で、細胞内細菌、真菌および原生動物への抵抗性は、好結果のTh1応答を行うことに関連する。Th1応答はまた、関節炎、大腸炎、および他の炎症状態のような病理にも関連しうる。蠕虫などの細胞外病原体に対する効果的な保護は主としてTh2応答を必要とし、増強された体液性免疫は結果として、特異的な抗体の産生による病原体の好結果の中和となる可能性がある。
【0030】
さらに他の好ましい実施形態において、本発明は樹状細胞の分化を調整することのできる免疫レギュレータを提供する。Th1対Th2型細胞の選択的副産物は、前駆体Th細胞と、そのMHCクラスII分子との結合での関連ペプチドを運んでいる抗原提示細胞(APC)との相互作用に依存する。APCによって放出され、樹状細胞と適切なT細胞レセプターを持つT細胞との間の最初の相互作用の間に存在するサイトカインはTh1対Th2サブセットへの分化を駆動する。最近、DC(脊髄性対リンパ性)に対する2つの異なる前駆体がヒトで記述された。骨髄性前駆体からのDC1の選択的分化がCD40リガンドまたは内毒素での刺激後に起こり、結果としてIL−12の高産生となった。リンパ性前駆体はCD40リガンド刺激後のDC2細胞への成長を促し、IL−1、IL−6およびIL−10を産生した。これらのサイトカインは活性化Th細胞の分化を駆動する第1の重要物である。IL−4はIL−10の存在によって強く増強されるTh2型細胞の成長に必要であり、一方Th1型細胞への選択的分化はIL−12の存在にもっぱら影響される。DC1はIL−12の産生で特徴づけられるので、これらは、最初にTh1型細胞の成長を誘導し、一方DC2はIL−10を産生し選択的に外因性IL−4の存在下でのTh2分化を促進する。本明細書で、本発明によって提供されたようなIRはDC活性および分化を調節しまたは調整でき、したがってTh1および/またはTh2細胞の選択的分化と活性化とを可能にすることが示されている。
【0031】
1つの実施形態において、本発明は哺乳動物絨毛性ゴナドトロピン製剤から入手可能な活性成分であり、非肥満糖尿病(NOD)マウスから入手した脾臓細胞を刺激できる前記活性成分を含むか、またはたとえばDC活性かおよび分化を調整し調節を可能にする、または、たとえば前記刺激された脾臓細胞が、前記脾臓細胞で再構成させたNOD−重篤−複合−免疫不全マウスでの糖尿病の始まりを遅延させることのできる、あるいは前記活性成分が非肥満糖尿病(NOD)マウスから入手した脾臓細胞のガンマ−インターフェロン産生を阻害できる、または前記活性成分が非肥満糖尿病(NOD)マウスから入手した脾臓細胞のインターロイキン−4産生を刺激できるような本明細書での詳細な記述で示したような糖尿病または慢性移植拒絶などの慢性炎症の場合、Th1および/またはTh2細胞の選択的分化と活性化とを可能にするような前記活性化合物に機能的に関連した活性成分を含む免疫レギュレータを提供する。
【0032】
他の実施形態において、本発明は哺乳動物絨毛性ゴナドトロピン製剤から入手可能な活性成分であり、たとえば前記活性成分がショックと共に一般的にみられるような組織不全の後または間にASATまたは他の関連する血漿酵素レベルを減少させることが可能であるような本明細書での詳細な記述で示したように、ショックまたは(超)急性移植拒絶と共にみられるような、急性炎症の場合、たとえばDCの活性化および分化を調節し調整することを可能にする、またはTh1および/またはTh2細胞の選択的分化と活性化とを可能にするような、敗血性ショックを誘導するリポポリサッカライドに対してマウスを保護することが可能な前記活性成分を含む免疫レギュレータを提供する。
【0033】
1つの実施形態において、本発明による前記免疫レギュレータは、詳述した記述でさらに詳しく述べるように、ゲル浸透クロマトグラフィー内で決定されたような58〜15キロダルトンの明白な分子量で溶出した分画に存在している活性成分を含み、そこでは関連する、阻害するまたは相乗作用する成分もまた見つかった。他の実施形態では、本発明は詳述した記述でさらに詳しく述べるように、前記活性成分がゲル浸透クロマトグラフィーで決定したように15キロダルトンよりも小さい明白な分子量で溶出する分画に存在する免疫レギュレータを提供し、たとえば前記活性成分はゲル浸透クロマトグラフィーで決定したように<1キロダルトンの明白な分子量で溶出された分画に存在する。本発明による前記免疫レギュレータは尿より簡単に入手できるけれども、たとえば前記哺乳動物絨毛性ゴナドトロピン製剤が尿、またはゴナドトロピンを含む血清、細胞または組織のような他の供給源から得られるような場合も適切である。前記供給源からはまた、たとえばTh1および/またはTh2細胞活性を調節でき、および/または樹状細胞分化を調整できる本発明による免疫レギュレータも提供される。
【0034】
好ましくは、本発明で提供されたような免疫レギュレータは、妊娠哺乳類、好ましくはヒトから入手可能であり、たとえば妊娠メス馬の血清中で発見された妊娠メス血清ゴナドトロピン(PMSG)(IR−S)、または妊娠しているマウスの子宮より抽出された妊娠マウス子宮抽出物(PMUE)(IR−UE)、または妊娠女性の血液または尿で発見されたヒト絨毛ゴナドトロピン(hCGまたはHCG)のような(胎盤)ゴナドトロピンを含むように調製した薬理学的製剤から入手可能である。本発明によって提供されたようなIRは、たとえば妊娠の第1トリメスターの尿(IR−U)および商業的hCG製剤(IR−P)が免疫調節効果を有しているので、ゴナドトロピンに関連できるかあるいは関連できないかであろう。とりわけ、IRは自己免疫および急性、慢性炎症疾患を阻害または調節できる。TNFおよびIFN−ガンマはセプシスまたは敗血性ショックなどの急性炎症疾患に、また自己免疫および慢性炎症疾患に薬理学的に関連する。IRはT細胞サブセットを調節する能力を有しており、TNFおよびIFN−ガンマを阻害するので、IRはセプシスまたは敗血性ショック(急性炎症疾患)のような免疫仲介障害、および全身性エリテマトーデス、糖尿病、リウマチ様関節炎、分娩後甲状腺機能不全、自己免疫貧血およびアレルギーや慢性炎症疾患(すなわちリウマチ病、シェーグレン症候群、多発性硬化症)および移植関連免疫応答のような他の疾病などの自己免疫疾患または慢性炎症疾患を、処置し、抑制し、防止するのに使用できる。本願発明者らの結果はたとえばIRが内毒素によってまたは外毒素によって引き起こされたセプシスまたは敗血性ショックを阻害することを示す。本発明によって提供されたようなIRは、急性炎症疾患と同様に免疫仲介自己免疫疾患、慢性炎症疾患を抑制するかまたは阻止する。
【0035】
本発明はアレルギー、自己免疫疾患、移植関連疾患、急性または慢性炎症疾患などの免疫仲介障害を処置するための医薬組成物を提供し、および/またはたとえば活性成分を含むリンパ球作用を刺激し、または調節するための免疫レギュレータ(IR)を提供し、前記活性成分は20週齢メス非肥満糖尿病(NOD)マウスより入手した脾臓細胞を刺激でき、前記刺激された脾臓細胞は前記脾臓細胞で8週齢時に再構築されたNOD−重篤−複合−免疫欠失(NOD.scid)マウスでの糖尿病の始まりを遅延し、またはそれに機能的に関連した活性成分を含む。
【0036】
1つの実施形態において、本発明は前記活性成分が20週齢メス非肥満糖尿病(NOD)マウスから入手した脾臓細胞のガンマ−インターフェロン産生を阻害し、またはインターロイキン−4を刺激することができるような医薬組成物または免疫レギュレータを提供する。hCGおよびPMSGのようなゴナドトロピンの臨床的品質の製剤が長い間、小胞増殖または排卵刺激が望ましい状態での再産生不全の処置を助けるために使用されてきた。前記製剤は一般的に血清または尿から入手し、また精製および相対的活性の度合いが、血清または尿中の最初の濃度に依存し、そして使用した調製の様々な方法に依存してしばしば変化する。
【0037】
特定の実施形態において、本発明は哺乳動物CG製剤より入手可能な活性成分であって、非肥満糖尿病(NOD)マウスから入手した脾臓細胞を刺激できるような前記活性成分を含むか、またはたとえば前記刺激された脾臓細胞が前期脾臓細胞で再構築したNOD−重篤−複合−免疫欠失マウスでの糖尿病の始まりを遅延できるような前記活性成分と機能的に関連する活性成分を含む免疫レギュレータを提供する。
【0038】
本発明はまた、前記活性成分が非肥満糖尿病(NOD)マウスから入手したガンマ−インターフェロン産生物を阻害できるような免疫レギュレータも提供する。本発明はまた前記活性成分が非肥満糖尿病(NOD)マウスから入手した脾臓細胞のインターロイキン−4産生を刺激することができるような免疫調整剤も提供する。
【0039】
たとえば妊娠の第1トリメスターの尿中(IR−U)および商業的なhCG製剤中(IR−P)で存在するようなhCG存在または非存在で本発明によって提供されたような免疫レギュレータ(IR)は免疫調節効果を持つ。とりわけIRは自己免疫および急性、慢性炎症疾患を阻害または調節できる。TNFおよびIFN−ガンマは病理学的に、セプシスまたは敗血性ショックのような急性炎症疾患に関連し、また自己免疫および慢性炎症疾患にも関連する。IRはT−細胞サブセットを調節する能力およびTNFおよびIFN−ガンマを抑制する能力があるので、IRはセプシスまたは敗血性ショック(急性炎症疾患)のような免疫仲介障害、および全身性エリテマトーデス、糖尿病、リウマチ様関節炎、分娩後甲状腺機能不全、自己免疫貧血およびアレルギーや慢性炎症疾患(すなわちリウマチ病、シェーグレン症候群、多発性硬化症)および移植関連免疫応答のような他の疾病などの自己免疫疾患または慢性炎症疾患を、処置し、抑制し、防止するのに使用できる。本願発明者らの結果はたとえばIRが内毒素によってまたは外毒素によって引き起こされたセプシスまたは敗血性ショックを阻害することを示す。本発明によって提供されたようなIRは、急性炎症疾患と同様に免疫仲介自己免疫疾患、慢性炎症疾患を抑制するかまたは阻止する。
【0040】
不確かな観察および実験室での研究は、hCGが坑カポージ肉腫および坑ヒト免疫不全ウイルス効果を有するであろうことをすでに示唆している(Treatment Issues, July/August 1995,ページ15)。hCG製剤はin vitroで免疫不全患者およびマウスにてカポージ肉腫(KS)上で直接のアポトーシス(細胞傷害性)効果を有し、免疫不全患者での前造血効果を有することが観察され(Lunardi-Iskandar et al.,Nature 375,64-68; Gill et al., New.Eng.J.Med.335, 1261-1269, 1996;米国特許第5677275号)、ヒトおよび類人猿免疫不全ウイルス(HIVおよびSIV)における直接の抑制性抗ウイルス効果を有することが観察された(Lunardi-Iskandar e t al., Nature Med.4,428-434,1998,米国特許第5700781号)。前記細胞傷害性および抗ウイルス効果はまた、臨床的品質のhCG製剤中に存在する未知のhCG仲介因子(HAF)に起因してきた。しかしながら、商業的なhCG製剤(CG-10、Steris Profasi、Pregnyl、Choragen、Serono Profasi、APLなど)は様々な効果を有している。これらのいくつかの解析(AIDS,11:1333-1340,1997)はたとえばただいくつか(CG-10、Steri s Profasiなど)がKS−殺傷性であり、一方他(Pregnyl、Choragen、Serono Profasi)はそうではないことを示している。第二に、(αまたはβ)hCGの組換え体サブユニットは殺傷するが、もとの状態の組換え体hCHはそうではない。殺傷効果はまたリンパ球でもみられたことも見いだされた。KSの治療は最近その抗腫瘍効果のためにベータ−hCGを使用することに向けられ(Eur.J.Med Res,21:155-158,1997)、尿から単離されたベータ−コア断片がKS細胞において最も高いアポトーシス活性を有していることが報告された(AIDS,11:713-721,1997)。最近、Gallo et al.はヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)の臨床品質未精製製剤の坑カポージ肉腫、坑HIV、坑SIVおよび明確な造血効果を報告した(Lunardi-Iskandar et al.,1995, Gill et al. 1996, Lunardi-Iskandar et al.,1998)。これらの先行研究と対照的に、hCG製剤の抗腫瘍および抗ウイルス活性は、その精製されたサブユニットまたはその主要な分解産生物、β−コアを含む野生型hCGヘテロダイマーによらず、代わりにまだ同定されていないhCG仲介因子(HAF)としてその中の活性部位残基によることが主張されている。本当の因子が何であろうと、さまざまなhCG製剤内のこれらの未同定の因子は、腫瘍細胞における直接の細胞傷害性効果に加えて、選択的なアポトーシスの誘導を通して抗腫瘍活性を有する。さらに、単核細胞での腫瘍の浸潤がないことから、抗腫瘍効果が免疫仲介応答のためであり得ないと仮定している。
【0041】
さらに、報告された臨床品質のhCGの前造血効果はHIVに感染したヒトでの臨床研究で注目され(Lunardi-Iskandar et al.1998)、造血効果は間接的であり、CD4+細胞の救出によって引き起こり、さもなくばhCGの坑HIV活性を介してHIVによって殺される。
【0042】
本発明はhCG製剤またはその誘導された断片より入手可能な、免疫仲介障害の処置のための免疫レギュレータまたは医薬組成物を提供する。前記免疫レギュレータの効果には、細胞傷害性または抗ウイルス効果の代わりに(末梢リンパ球、胸腺細胞または脾臓細胞で発見されるような)リンパ球集団における刺激効果が含まれる。本発明は、妊娠哺乳動物から入手可能な少なくとも1つの免疫レギュレータでの処理を動物に行うことを含む免疫仲介障害を処置する方法を提供する。前記処置は直接的であり、たとえば処置は前記個体に、本発明で提供したような免疫レギュレータを含むhCGまたはPMSG製剤のような医薬組成物を与えることを含んでよい。またたとえば尿または血清または(母親起源または胎児起源の)胎盤または他の組織または細胞からサンプリングすることで、そして(たとえばゲル浸透クロマトグラフィーなどの)本技術分野で公知の分別技術によって前記尿または血清または組織または細胞から前記活性成分を含む前記免疫レギュレータを調製することで、そして記述したようにNODマウスまたはその脾臓細胞を刺激することによってその活性成分を試験することで、妊娠動物から由来する分画または分画群で前記医薬組成物を提供することもできる。とりわけ、胎児は潜在的に、敵対する免疫攻撃を引き起こすことなく本質的に子宮内の外来の組織として発達する、その母親との胎児免疫学的葛藤から生き延びなければならないので、前記製剤または成分が好ましく妊娠動物より由来する。したがって、この「同種移植片(allog raft)」拒絶を防ぐために、母親および胎児間の免疫学的相互作用が、母親のリンパ球への胎児抗原の浸透の欠如を介してか、母親リンパ球の機能的「抑制(suppression)」を介してかのいずれかですぐに抑制されなければならない。胎児抗原が提示された場合、母親の免疫応答はほとんど有害でない、抗体仲介Tヘルパー2(Th2)型へ偏るであろう。このことは、妊娠女性が症例ではない極度の感染に感受性になることを示唆する。妊娠中のメス個体はその感染への抵抗性を保持しまたは増加させさえする。さらに、前記個体は通常オス個体と比べて免疫疾患、特に自己免疫疾患に、より感受性になる一方で、妊娠中これらの疾患に、より抵抗がある。
【0043】
本発明はまた、リンパ球のin vitro刺激および前記刺激されたリンパ球を医薬組成物として免疫仲介障害についての動物の処置のために前記動物に移入させるための方法を提供する。本発明の特定の実施形態において、医薬組成物が本発明によって提供された免疫レギュレータでin vitroで刺激したリンパ球を含んで提供される。
【0044】
本発明の好ましい実施形態において、前記障害には糖尿病、さらに急性、慢性炎症などの他の免疫仲介障害が含まれ、処置され得る。他の好ましい実施形態においては、前記障害にはセプシスまたは敗血性ショックが含まれる。本発明は動物に対する処置の方法を提供し、好ましくは前記動物はヒトである。
【0045】
特定の実施形態において、本発明によって提供された方法はさらに、Th1またはTh2細胞、またはTh3またはTh8細胞、または他のエフェクターまたは調節T細胞集団を含むサブセット集団のような前記動物でのリンパ球サブセット集団の相対比および/またはサイトカイン活性化またはサイトカイン発現またはマーカー発現を調節することを含む。
【0046】
本発明はまた本発明による方法での使用のための免疫レギュレータおよび好ましくはアレルギー、(全身性エリテマトーデスまたはリウマチ様関節炎などの)自己免疫疾患、移植関連疾患、(敗血性またはアナフィラキシーショック、または急性または超急性移植拒絶などの)急性および(アテローム性動脈硬化症、糖尿病、多発性硬化症または慢性移植拒絶などの)慢性炎症疾患を含む群より選択した免疫仲介障害の処置のための医薬組成物を作るための、好ましくは妊娠哺乳動物より入手可能な前記免疫レギュレータの使用を提供する。さらに、本発明は、前記免疫仲介障害が喘息または寄生虫性疾患などのアレルギーを含むような本発明による使用、または前記免疫仲介障害が、ウイルスまたは細菌などの感染物に対して示された過度の強力な免疫応答を含むような本発明による使用を提供する。しばしばこれらの疾患のほとんどで、自己反応性抗体および/または自己反応性Tリンパ球の産生が、あまりに強い免疫応答の一部分を展開し、または担っているとみることができる。このことは、たとえば、IgE産生が過度に強くまたは疾患がTh2依存である寄生虫性疾患でみられ、器官に有害であり、またTBCまたはハンセン病のような(微)細菌感染でもみられる。自己免疫応答はまた、たとえばB型肝炎ウイルス感染による破壊的肝炎のようにウイルスまたは細菌感染の顕在化としてあらわれ得、結果として深刻な組織損害となり得、またはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)感染でもみられる。前記過度に強い免疫応答は本発明によって提供されたような免疫レギュレータで溝において続く。本発明によって提供されるようなまた他の使用は血管疾患の処置に関連し、そこでは細胞および組織に対するラジカル障害(ラジカルに起因する障害)が本発明によるIRで処置することで防止されまたは回復し、またIRは直接的または間接的に坑オキシダントとして働く。たとえば、I型糖尿病の病因の決定事象はインスリン産生膵臓ベータ細胞の破壊である。ベータ細胞量の進行性減少が慢性自己免疫応答の結果であるという強い証拠が存在する。この過程中、島浸潤免疫細胞、島微小内皮細胞およびベータ細胞それ自身が細胞傷害性伝達物質を放出できる。サイトカインおよび特に一酸化窒素(NO)は強力なベータ細胞毒性エフェクター分子である。反応性ラジカルNOは、主に広がったDNA鎖の破壊の誘導を介してその有害な効果を仲介し、酸素などの他のラジカルはTh1およびTh2細胞のようなリンパ球のサブ集団へのその効果を介して仲介する。この最初の損傷はベータ細胞の死で終了する連鎖事象を引き起こし、免疫応答の混乱を引き起こす。
【0047】
さらに、本発明による免疫レギュレータは細胞−細胞間相互作用、または細胞応答、とりわけ、たとえば先天性または後天性免疫系の相互作用の調節に関連した免疫学的特質の細胞の相互作用または応答を誘導または支配するラジカルを調節することができる。理論によって結びつけようとするわけではないが、免疫系には2つの部分、すなわち先天性(非特異的)および後天性(特異的)系があり、両方とも細胞性および体液性成分を有する。先天性免疫系の細胞性成分の例は単球、マクロファージ、顆粒球、NK細胞、肥満細胞、gd T細胞などであり、一方体液性成分の例はリソザイム、補体、急性期タンパク質およびマンノース結合レクチン(MBL)である。後天性免疫系の主要な細胞性成分はTおよびB細胞であり、一方体液性成分は抗体である。後天性系は感染およびより多い多細胞器官での過剰な存在の除去におけるその特異性、有効性ゆえに最も研究されてきた。先天性系はしばしば原始的なものであると見なされ、「単純である(unsophisticated)」と考えられる。しかしながら、先天性系は存続しているだけではなく、もっとも基礎的な免疫攻撃のひとつ、すなわち胎生にて重大な役割を果たし得る。先天性系はリンパ球に対する主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスIおよびII分子と関連した抗原の処理および提示によって免疫応答をはじめさせる。全応答はしばしば、先天性免疫系との相互作用を介して表面分子またはサイトカインを共刺激的に産生する(内毒素のような)アジュバントを必要とする。このことは抗原の生物学的重要性を決定し、この情報を後天性系に伝達する。よってこれは後天性系に応答するかどうかを指示する。よってこれらの2つの大きな免疫系の部分は、互いに影響するだけでなく、少なくともたとえばサイトカインおよび共刺激分子などを介して細胞レベルでは互いに調節する。
【0048】
これらの2つの系が別々にまたは組み合わせで関与するような多くの生理学状態および免疫病理学がある。たとえば妊娠において母親の先天性免疫系がさらに刺激されるということが明らかにされ、あるいはII型糖尿病が慢性過活動先天性免疫系の疾患であるということが提案されてきた。他の例としてはリステリア症での先天性免疫系の関与がある。後天性免疫系での調節不全が全身性のまたは器官特異的な自己免疫、アレルギー、喘息などのような免役疾患を引き起こす可能性もあるが、しかし妊娠の維持および「同種移植片」拒絶の防止で重要な役割も果たすことができる。
【0049】
上述したように、後天性系は感染を除去する時点の特異性、有用性のため、およびより多い多細胞器官での過剰な存在のためによく研究されてきている。その調節もまたよく研究されてきた。たとえば、サイトカイン微小環境が免疫応答の間のTh1またはTh2細胞型へのTヘルパー細胞分化で鍵となる役割を果たしていることがよく知られている。IL−12はTh1分化を誘導し、一方IL−4はTh2分化を誘導する。最近樹状細胞のサブセット(DC1、DC2)がTh1細胞かTh2細胞のどちらかの分化を決定する異なるサイトカイン微小環境を提供することも示されてきた。さらに、成熟T細胞応答からの負のフィードバックループがまた、好ましい樹状細胞サブセットの生存を調節し、したがって選択的に延長されたTh1またはTh2応答を阻害する。さらに、Th1応答の発達が、IL−4によって直接的に、そして先天性免疫応答によって刺激されたマクロファージによるIL−12およびインターフェロン−g−誘導因子(IGIF)の産生を阻害するIL−10によって間接的に拮抗されうる。増殖および分化するのにIL−4に依存しているTh2細胞は、アレルギー性およびアトピー性顕示に関わり、さらにIL−4およびIL−10のそれらの産生を介して寛容での役割を果たすことが示唆されている。とりわけ、Th1からTh2への変換が器官特異的自己免疫病状の発達を防止でき、妊娠の維持に必要であったことが示唆されてきた。最近異なるサブセットの調節T細胞がTh1およびTh2応答両方の原因となり、また免疫病状の発達を防止するということが明らかになってきた。これらの調節T細胞の多くの共通の特徴の1つは、その機能が少なくとも部分的にTGF−ベータの作用によることであり、このことはIL−10が優先的にTh1のみを抑制する一方で、Th1およびTh2分化両方を阻害するTGF−ベータの能力によって続くであろう。
【0050】
Th1対Th2型細胞の選択的成長は前駆体Th細胞のそのMHCクラスII分子と結合する関連ペプチドを運んでいる抗原提示細胞(APC)との相互作用に依存する。APCによって放出され、樹状細胞と適切なT細胞レセプターを持つT細胞間の最初の相互作用の間存在するサイトカインは、Th1対Th2サブセットへの分化を駆動する。最近、DC(脊髄性対リンパ性)に対する2つの異なる前駆体がヒトで記述された。骨髄性前駆体からのDC1の選択的分化がCD40リガンドまたは内毒素での刺激後におこり、結果としてIL−12の高産生となった。リンパ性前駆体はCD40リガンド刺激後のDC2細胞への成長を促し、IL−1、IL−6およびIL−10を産生した。これらのサイトカインは活性化Th細胞の分化を駆動する第1の重要物である。IL−4はIL−10の存在によって強く増強されるTh2型細胞の成長に必要であり、一方Th1型細胞への選択的分化はIL−12の存在にかなり影響される。DC1はIL−12の産生で特徴づけられるので、これらは、最初にTh1型細胞の成長を誘導し、一方DC2はIL−10を産生し選択的に内因性IL−4の存在下でのTH2分化を促進する。
【0051】
特定の実施様態において、前記免疫レギュレータには臨床的品質のhCGまたはPMSG調製品またはその誘導された断片が含まれる。たとえば、本発明は糖尿病の処置のための医薬組成物を準備するための、hCG調製品またはそれと機能的に同等の調製品の使用を提供する。また他の例では、本発明はセプシスまたは敗血性ショックの処置と防止のための医薬組成物の準備のための、hCG調製品またはそれと機能的に同等の調製品の使用を提供する。たとえば、本発明は前記処置にたとえば処置した個体におけるTh1および/またはTh2のようなリンパ球のサブセット集団の相対比および/またはサイトカイン活性化を調節することが含まれるような本発明による使用を提供する。
【0052】
本発明はさらに、候補免疫レギュレータ分画の治療的効果を決定することを含む免疫レギュレータの選択のための方法を提供する。例示のため実験モデルとして有用なNODマウスのような糖尿病の兆候を示す傾向にある動物に尿分画またはそれより誘導された分画を与えることで、そして本質的に前記動物での糖尿病の発達を決定することで、そこでそのような免疫調節分画または活性成分が選択されまたは同定されるような方法が得られる。また他の実施様態において、本発明はLPSまたは他の毒素の影響を受けたことがあるマウスのような敗血性ショックの兆候を示す傾向にある動物に尿分画またはそれより誘導された分画を与え、前記動物での敗血性ショックの発達を測定することで免疫レギュレータの治療的効果を決定することを含む免疫レギュレータを選択するための方法を提供する。好ましくは本発明による方法は、前記治療効果がさらに前記動物でのリンパ球サブセット集団の相対比および/またはサイトカイン活性を決定することで測定されるか、または前記治療的効果がさらに前記動物での酵素レベルを決定することまたはたとえば本明細書で詳細に記述して示したような本技術分野で公知の他の臨床的パラメータを測定することで測定されるのが好ましい。
【0053】
理論によって結びつけるつもりはないが、本発明者らの結果は、本発明によって提供されたようなIRはin vivo(BALB/c、NOD)およびin vitroでのTh1/Th2バランスを調節できることを示している。NODのような優性Th1発現系モデルにおいて、他のものの中で(TR−Pおよびその分画のような)IRはIFN−ガンマ産生をダウンレギュレートし(in vivo/in vitro)、IL−4産生とは対照的にIL−10およびTGF−ベータ産生を促進し、このことはIRによるTh3およびTh1のような調節細胞の誘導を示している。これらの調節細胞は免疫および炎症疾病および免疫寛容でのIRの臨床的効果において役割を果たしている可能性がある。本発明者らはまた、IRおよびその分画が、別々にIFN−ガンマ産生の阻害を和らげるようには見えない分画IR−P3およびrhCGを除いて、in virtoおよびin vivoでIFN−ガンマの産生を阻害できることを示した。IR−P3とrhCGの組合せはより強いIFN−ガンマの阻害を与える。このことはこれらのモデルでの少なくともそのIFN−ガンマ阻害について、rhCGに対するIR−P3の必要性を暗示している。これはまたin vivoでの処置NODマウスから入手した坑CD3刺激脾臓細胞に対して、またはTh2表現系へのTヘルパー細胞の分極に対して暗示している。
【0054】
さらに、IR−P、その分画(IR−P1、IR−P2、IR−P3)およびrhCGとの組合せでのIR−P3はすべてB細胞のIgG2aへのクラススイッチを阻害でき、一方IR−P2およびrhCGはなんの阻害の緩和も与えなかった。IFN−ガンマ産生および分化における本発明者らの結果は、IgG2a阻害に対してIR−P3が最大の結果を与えるためにはrhCGは必要ないことを本発明者らはみたのであるが、IR−Pと比較したときR−P3のみでは最大の効果を持たなかったことを示した。しかしながらIR−P3の影響下でのIL−10の産生の増加はIR−P1のそれより少なかった。このことは、IL−10、hCGの最大産生に対して、それらの分解産生物またはIR−P3との組合せでのIR−P1でのまだ未知のサブ分画が必要であることを示唆している。IR−P3のみはすでにIL−10産生を促進できることから、IgG2aの産生を阻害するために他の分画または成分は必要ない。
【0055】
本発明者らはまた本発明によって提供されたようなIRがBALB/c動物モデルにおいて(in vitroでおよびex vivoで)IFN−ガンマ産生とIL−10、TGF−ベータ、IL−4およびIL−6の促進を阻害できることを示した。したがって、少なくともこれらのサイトカインがIRによる免疫応答の調節で、および調節細胞の誘導に関与することが明らかである。著しく、IRはNODとは対照的にBALB/cマウスで(ex vivoで)坑CD3刺激脾臓細胞の増殖を促進する。このことは自己免疫疾患モデルであるNODと明確な免疫病状のない動物モデルであるBALB/cの違いを反映している可能性がある。両方(NOD/BALB/c)の動物モデルにおいて、IRは脾臓のLPS刺激増殖を促進する(in vitroおよびex vivo)。
【0056】
NODおよびBALB/cマウスでの本発明者らのDC実験は、IRがただT細胞応答を調節するだけでなく、DCの成熟化および機能を調節できることを示している。専門的な抗原提示細胞(APC)として機能するDCは、免疫寛容において重要な役割を果たす。アロ−MLR中のIRでのC57B/6 DCの処理はT細胞増殖をダウンレギュレートすることができる。このことはIRがまた寛容の状態の誘導を促進することができることを示す。これらのデータを基に、本発明者らは、IRで処置したレシピエント(BALB/c)へのMHCと非MHCの非両立性皮膚(C57BL/6)移植を行った。本発明者らのデータは、対照群において同種移植片(皮膚)は15日以内に完全に拒絶され、一方3回IRで処置したレシピエントマウスの皮膚移植片は21日後に拒絶された。したがってIRは移植片拒絶を遅延することができる。本発明にて提供されたようなIRは免疫疾患に対する多くの動物モデルにおける免疫病状を阻害することができる。IRは(糖尿病に対する)NODモデル、および(MSに対する)EAEモデルでの免疫病状および臨床的症状を阻害し、同種移植片拒絶を阻害し、SZT−誘導糖尿病を遅延させる。本発明者らのデータはまたIRは異なる細胞集団において効果を持つことを示している。IRはT細胞に影響を与え、したがってTh1/Th2バランスを調節し、言い換えるとただT細胞を調節するだけでなくAPC区画における影響を持つような調節細胞を誘導する。さらに、IRはAPC区画を直接的に調節でき、先天性および後天性免疫応答に影響を与えることができる。そのように行うことにより、IRはただ後天的免疫系の不均衡にも起因する疾患に影響を及ぼすことができるだけでなく、先天性免疫系または両方の系の不均衡に起因する疾患に影響を及ぼすことができる。たとえば、II型糖尿病の原因におけるサイトカインと先天性免疫系の役割が重要でありそうである。最近遺伝的に、さもなければ先に処理した対象での加齢および栄養過多のような未知の因子がマクロファージのような細胞からのサイトカインの分泌の増加、さらにはアテローム性動脈硬化症プラークからのサイトカイン分泌を引き起こすことが示唆された。サイトカインによって誘導される急性期応答には(VLDLトリグリセリドを上昇させ、HDLコレステロールを低下させる)異常脂血症およびフィブリノーゲンのようなアテローム性動脈硬化症への他のリスク因子が含まれる。サイトカインはまた、膵臓ベータ細胞(インスリン分泌の改善に貢献)、脂肪組織(レプチン放出の刺激)および脳、刺激コルチコトロピン放出ホルモン、ACTHおよびしたがってコルチゾール分泌においても働く。後者は中枢神経肥満、高血圧およびインスリン抵抗性に寄与する可能性がある。インスリン抵抗性のさらなる原因は、サイトカインTNF−アルファであり、これはインスリンレセプターのチロシンキナーゼ活性を阻害する。微小血管または巨大血管合併症のないII型糖尿病患者は高い急性期応答を持ち、しかし組織合併症はII型糖尿病でさらにストレス反応物を増加させる。アテローム性動脈硬化症であり糖尿病ではない対象において、「血液病学的ストレス症候群(haematological stress syndrom)」が多年間認められ、フィブリノーゲン、血液粘性増加および血小板数と活性の増加のような高急性期反応物をふくむ。内皮細胞、平滑筋細胞およびアテローム性動脈硬化症プラークのマクロファージによって産生されたサイトカインがアテローム性動脈硬化症でみられる急性期応答に寄与しうる。樹立した急性期タンパク質またはフィブリノーゲン、血清アミロイドA、PAI−1、Lp(a)リポタンパク質およびVLDLトリグリセリドなどの心臓血管疾患に対する推定リスク因子に加えて、前炎症サイトカインが糖尿病合併症部位で、または内皮、平滑筋細胞およびマクロファージ上で働くことによってアテローム性動脈硬化症を悪化させうる糖尿病工程それ自身によって産生された。したがって、おそらくサイトカインおよびアテローム性動脈硬化症を含む正のフィードバックがあり、おそらく糖尿病での動脈性疾患の加速を止める。プラークはサイトカインを産生し、これはさらにアテローム性動脈硬化症の工程を局部的に悪化させ、しかしまた急性期タンパク質の循環の増加を引き起こし、これらの多くがそれ自身アテローム性動脈硬化症のリスク因子である。
【0057】
手短に記すと、サイトカインおよび先天性免疫系はII型糖尿病およびアテローム性動脈硬化症の機能上の変化で中心的な役割を担う。IRはそのような応答を調製する能力を持つので、これはII型糖尿病およびアテローム性動脈硬化症およびその合併症に有用でもある。さらにIRは、活性酸素種(ROS)が重要な役割を果たしているHD−STZモデルにおける糖尿病のような疾患の誘導を遅延させることができ、したがってIRはまた直接的または間接的に坑オキシダントとして作用でき、またこのことが糖尿病および関連疾病の処置と防止に有用である理由である。さらに、本発明は本発明による方法によって選択された免疫レギュレータ、そのような選択された免疫レギュレータを含む医薬組成物を提供し、免疫仲介障害の処置のための医薬組成物の調製のための前記方法を提供する。生体活性IRを含む分画を液体クロマトグラフィーによって均質に精製した。MALDI−TOF(マトリックス補助レーザー質量脱着/イオン化−飛行時間)を用いてデータベーススクリーニングと組み合わせた質量分析計での直接の解析により、IRまたは多重分子複合体でのその断片の特性化ができる。核磁気共鳴分光学がIR中の水素原子への結合の型およびIRの分子構造の情報を提供する。赤外および近紫外分光はIRの構造的決定を補助する。MALDI−TOFおよびNMR解析は分離、そして必要であれば生体活性IRの二次的配列決定および合成を補足する。化学的変異挿入をIRの化学的組成物を変異させるように行い、バイオセンサーシステムのような好ましい検出系での定量的および定性的結合解析を行うことで、レセプター/アクセプターでの相互作用部位の正確なマッピングが可能である。
【0058】
化学的、遺伝的修飾によるIRの誘導体を、IRまたはIR含有混合物の活性を実証する上記方法またはアッセイで、生物活性について再び試験した。さらに、本発明はIRのレセプターの存在の立証を提供する。(妊娠)尿の様々な分画、商業的hCG調製品またはその断片、組換え体hCGまたはその断片に公知の量のIRを打ち込んだ。混合物をゲル浸透クロマトグラフィーにて解析し、加えたたIRとフリーのIRのない言及した試料と比較した。IRピークのより大きい分子量分画へのシフトは、レセプター/アクセプターの存在を示唆している。(IRをレセプター/アクセプターより置換した後の)IR活性についての分画を解析することはシフトしたIRピークを含むこの溶出プロフィールを検証した。シフトしたIR活性を含む分画から、レセプター/アクセプターを液体クロマトグラフィーで精製し、置換によってIRの機能を検証した。さらにIRをヨウ素で処理し、第1トリメスター妊娠尿の分画、商業的hCG調製品またはその断片および混合物へ打ち込み、還元および非還元下SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)のような好ましい検出系で評価した。このようなゲルのブロットをSTORM技術を用いて定量的蛍光体イメージング解析のような系で解析した。IRをアフィニティークロマトグラフィーの方法によって結合している部分を単離することができる化学的架橋または担体タンパク質の使用によって、たとえばアフィジェル(Affigel)に固定化した。引き続く溶出で精製されたレセプター/アクセプター分子が得られる。このレセプター/アクセプターを可溶性または膜結合形態での細胞外および細胞内供給源より単離し、活性化したバイオセンサー表面に固定化した。ついで様々な濃度のIRをこのセンサー表面でプローブし、結果の結合プロフィールより結合速度定数および解離速度定数を決定し、親和定数を計算した。IRおよびレセプター/アクセプターの異なる混合物のプローブ化によって、結合エピトープの特性の情報を得るためにエピトープマッピングを評価した。非疾病状態下およびIRの活性に関連ある様々な免疫および関連障害の間での細胞発現および組織分布を査定するために、膜結合形態でのIRレセプターの検出を可能にするために(たとえば蛍光および放射活性)標識化した。標識化IRを用い、利用可能な精製したレセプターを得ることで、モノクローナル抗体および他の特異的試薬を可溶性IRレセプターの測定のための定量的免疫アッセイの目的に添って生成した。組換え体DNA技術をIR産生原核生物および真核生物発現系をつくるのに使用した。レセプター/アクセプターでの相互作用部位の正確な同定を可能にしている結合プロフィールの変化を持つIR変異体の作製のために部位特異的変異導入を使用した。遺伝子のクローニングに際し、IRの構成性のおよび誘導可能な発現を持つトランスジェニックマウスおよびIR遺伝子欠損マウスをバイオテクノロジーおよび遺伝子治療の領域へ踏み込むことを可能にするよう作成した。
【0059】
精製したIRをモノクローナル抗体および/または他の特異的薬剤を産生するために使用し、したがってIR特異的定量性免疫アッセイの設計が可能である。また単鎖Fv断片を、多量の異なる特異性からなるレパートリーを含むファージライブラリーを使用したファージディスプレイ技術を用いることで単離した。
本発明はさらに、それによって本発明を限定することなしに詳細な記述によって説明される。
【0060】
詳細な記述
免疫レギュレータ(IR)
第1トリメスターの妊娠尿からのIR−Uの精製(方法1)
第1トリメスターの妊娠尿(2リットル)を健常志願者から瓶に集め、2日以内に実験室に配送されるまで冷蔵した。配送された日に、1リットル当り1gのアジ化ナトリウムを加え、水酸化ナトリウムによってpHを7.2〜7.4に調整し、室温(RT)にて1時間沈殿させた。上清の75%を静かに他に移し、沈殿物に近い残りの部分を遠心(40℃、25000rpmにて10分)して沈殿物を除き、残りの上清に加えた。0.45(m、ミニタンで)(ミリポア)の横断濾過によって上清を濾過した。続いて、10kDaで切り捨てるYMディオポア・メンブレンを備えたアミコン限外濾過装置で濾過物(2リットル)を濃縮した。最終容量(250ml)を10リットルのミリQ水で2回透析した。つぎに10kDa切り捨てのアミコン限外濾過にて試料をさらに最終容量3mlまで濃縮した。
【0061】
ゲル透過
スーパーデックス75ゲル透過カラムを備えたファルマシアFPLCシステムを用いて、処理した尿試料(IR−U)および市販のhCG製剤(IR−P)(プレグニル、オルガノン、オッス、NL)を分析した。操作条件はこの文書の他のところに示す。
【0062】
第1トリメスターの妊娠尿からのIR−Uの精製(方法2)
第1トリメスターの妊娠尿から低分子量分画を精製するために、50mMの重炭酸アンモニウムの中でFDC(登録商標)G25を備えたFPLCシステムにて、50mlの尿を直接脱塩した。用いた操作条件を以下に示す。
【0063】
【表1】
【0064】
第1トリメスターの妊娠尿からのIR−Uの精製(方法3)
方法1および2から得たIR−U(第1トリメスターの尿)を分析するために、本願発明者らは、50mMの重炭酸アンモニウム中で、アルテックのミクロスフェアサイズ排除(GPC)カラム60Aまたは300A(250x4.6mm)を備えたシマズのHPLCシステムも用いた。両カラムの分離範囲はそれぞれ、2,800〜250および1,200,000〜7,500ダルトンであった。分離できる試料容量は10〜50mlであった。流速は25分間で0.3ml/分であった。外部分子量標準を用いて、カラムの溶出部位を補正した。用いたマーカーは、アプロチニン(6,500Da)、チトクロームC(12、400)、炭酸脱水酵素(29,000)、アルブミン(66,000)およびブルーデキストラン(2,000,000)であった。
【0065】
IRのさらに異なった2つのhCG製剤を分析するために、IR−P(プレグニル、オルガノン、オッス、オランダ)およびIR−A(APL、ウエイス エールスト、米国フィラデルフィア)を用いた。2つの方法によってIR−Pをさらに分離した。スーパーデックス75ゲル透過カラム(HR5/30)(ファルマシア、スウェーデン)を備えたファルマシアFPLCシステムを用いて、IR−Pを分析した。カラム操作緩衝液には、50mMの重炭酸アンモニウムを用いた。このカラムの分離範囲は、球状タンパク質については100,000〜3,000Daの範囲である。処理試料容量は1mlであり、流速は45分間で0.5ml/分である。さらにミクロスフェアGPC60A(250x4.6mm)も用いた。このカラムは、サイズによって除くクロマトグラフィによってタンパク質、ペプチドおよびその他の水溶性巨大分子を分離する。このカラムの分離範囲は、28,000〜250ダルトンだった。3つの選択された領域に分画され、分子量が見かけ上>10kDaで溶出したIR−P1、見かけの分子量10kDa〜1kDaで溶出したIR−P2、および見かけの分子量が<1kDaで溶出したものである。
【0066】
第1トリメスターの妊娠尿における低分子量分画(IR−U/LMDF)および市販のhCG製剤(プレグニル、APL)由来のIRの精製:方法4
手順 方法3によって第1トリメスターの妊娠尿および市販のhCG製剤から得た低分子量分画(<2kDa)を凍結乾燥して、さらにバイオ−ゲルP−2カラム(96x1.5cm)上でゲル濾過クロマトグラフィによって分析した。分画(13〜17mg)を二重蒸留した水(8〜12ml)に懸濁した。物質は完全には溶解しなかった。遠心分離(シグマ201、3000rpmにて10分)によって沈殿物(8〜11mg)を上清から分離した。バイオ−ゲルP−2カラム上でのゲル濾過クロマトグラフィによって上清(6〜8ml)を分画した。流速15ml/分にて水でカラムから溶出させた。LKB2142差動屈折計およびLKBユービコードSII(206nm)にて溶出を監視した。ファルマシアFrac100フラクション・コレクタによって分画(20分)を回収した。確かな分画をプールして凍結乾燥した。さらに抗ショック活性についてこのような分画を調べた。
【0067】
ゲル透過: スーパーデックス75ゲル透過カラムを備えたファルマシアFPLCシステムを用いて、処理した尿試料(IR−U)および市販のhCG製剤(IR−P)(プレグニル;オルガノン;オッス、NL)を分析した。用いた操作条件を以下に示す。
【0068】
【表2】
【0069】
陰イオン交換クロマトグラフィ: 重なり合った分画をさらに分離するために、1mlのモノQHR5/5FPLC陰イオン交換クロマトグラフィを用いた。操作条件を以下に示し、緩衝液の組合せは、緩衝液Aとして10mMのPBS、pH7.3および緩衝液Bとして1MのNaClを含有するPBSから成っていた。
【0070】
【表3】
【0071】
IR−UおよびIR−Pのさらなる処理: 尿試料中に存在するタンパク質種の間の共有結合を減らすために、本願発明者らは、尿(IR−U)およびhCG製剤(IR−P)試料を100℃にて60mMの2−メルカプトエタノールで3分間処理した。それに続いて、処理したIR−UおよびIR−P試料を同一条件でスーパーデックス75カラムにかけた。
【0072】
IR−UのFPLC分画の活性測定: 1.4に分割してOD280nmにて尿分画のタンパク質濃度を測定した。100(gに相当する5000IU/mlのプレグニルhCG製剤を用いて、この値からhCG単位の量を算出した。
【0073】
IRを精製するおよび/または単離するための別の方法には、たとえば、PBSを用いたFPLCシステムにおけるスーパーデックス75カラムによるゲル濾過で、解像度を高め、それは疎水性相互作用を乱すためのエタノールと共に、またはそれを用いずに行い、必要に応じて後で陽イオン交換を行うことが含まれている。試料は還元型でも非還元型でも分析することができる。もう1つの方法には、その他の成分から炭水化物成分を上手く分離するためのレクチン・アフィニティカラムが含まれ、そのために溶出物をさらにゲル濾過にかける。もちろん、当該技術で既知の方法によって合成または組換え(ポリ)ペプチド配列を得る、および(合成)抗体、すなわち、ファージに由来した抗体を選択してさらにIRを選択することも可能である。
【0074】
自己免疫疾患の実験: 非肥満型糖尿病(NOD)マウスは自己免疫疾患のモデルであり、この場合はインスリン依存性の糖尿病(IDDM)となり、その主な臨床症状は血中グルコース濃度の上昇(高血糖)である。膵臓のランゲルハンス島においてインスリンを産生するβ細胞が免疫反応の仲介によって壊されることによって血中グルコース濃度の上昇が起きる(Bach et al. 1991, Atkinson et al. 1994)。この破壊には、CD4+およびCD8+Tリンパ球、Bリンパ球、マクロファージおよび樹状細胞から構成される不均一な集団による膵島周囲および膵島の中への(膵島炎)大量の細胞浸潤が伴っている(O'Reilly et al. 199 1)。このようなマウスで糖尿病の発症を検知する最も早い信頼できる方法は、血液中のグルコース濃度を調べることである。
【0075】
NODマウスは、β細胞に対する自己免疫がIDDM発生の最初の出来事であるというモデルである。一般に、疾患過程を惹起するにはTリンパ球が中心的な役割を演じている(Sempe et al. 1991, Miyazaki et al. 1985, Harada et al. 1986, Makino et al. 1986)。糖尿病形成には、ヒトの疾患と同様に、独特なMHCクラスII遺伝子と複数の連関していない遺伝子座との複合因子の相互作用が仲介している。さらに、NODマウスでは遺伝と環境の重大な相互関係が見事に立証されている。住環境の清潔度の差異によって、環境因子が糖尿病を仲介する遺伝子の作用にいかに影響し得るのかが説明されている(Elias et al. 1994)。
【0076】
NODマウスで記録されている自己免疫に関しては、抗原特異的抗体およびT細胞反応のほとんどは、糖尿病個体の自己抗体としてこのような抗原が検出された後に研究されている。NODマウスにおいてこのような自己抗原が演じている役割を理解することは、一義的な病原自己抗原と随伴現象である自己免疫とを区別できる可能性がある。さらに、IDDM患者は遺伝的にも、病原的にも不均一であることを念頭に置くべきである。
【0077】
長期にわたる典型的なNODの膵臓の組織検査によれば、3〜4週齢で血管周囲に浸潤細胞が認められるが、6〜7週齢では膵島は典型的には依然としてきれいである。浸潤細胞は膵島を取り囲む、または一方の極に集積して膵島に達する。10週齢から12週齢の間に浸潤細胞は膵島に浸透し、膵島はリンパ球によって腫脹する。上述したように、住環境および微生物的および環境因子における差異が糖尿病感受性遺伝子の浸透度に影響を与え得る。
【0078】
本願発明者らの掌中では典型的には14〜17週齢でNODマウスは糖尿病になる。しかしながら、これは研究室毎に異なっている(平均14〜19週齢)(Elias et al. 1994)。
【0079】
CD4+T細胞は少なくとも2つの主なサブセットTh1およびTh2に分離することができる。活性化されたTh1はIFN−γおよびTNF−αを分泌し、一方Th2細胞は、IL−4、IL−5およびIL−10を産生する。Th1細胞は効果的な細胞性免疫の誘導に決定的に関与しているが、Th2は、好酸球および肥満細胞の活性化およびIgEの産生を含む液性および粘膜免疫およびアレルギーの誘導に役立っている(Abbas et al. 1996)。数多くの研究によって今やマウスおよびヒトの糖尿病とTh1表現型の発生とが関連付けられている(Liblau et al. 1995, Katz et al. 1995)。
【0080】
Th2T細胞は相対的に無害であることが判っている。実際Th2T細胞は防御的であると推測する者もいる。しかし、Katzらは、TCR自体によって認識される抗原特異性を有さないが、T細胞応答の表現型的性質を有する、ナイーブなレシピエントに、CD4+T細胞が糖尿病を移入させる能力を有することを明らかにした。NOD新生児マウスに疾患を移入させたのはTh1T細胞に強く偏っていて、Th2T細胞は、糖尿病を起こすTh1T細胞集団と同一のTCRを有し、活性化されているにもかかわらず、疾患を移入させることはなかった。さらに、Th1とTh2とを共に移入した場合、Th2細胞を10倍多く移入してもTh1が誘導した糖尿病をTh2T細胞が改善することはなかった(Pakala et al. 1997)。
【0081】
Th1に分極したT細胞は、新生児NODマウスに疾患を移入することができるが、Th2に分極したT細胞はそれができず、Th1に分極したT細胞およびTh2分極したT細胞の両方では、NOD.scidマウスおよび免疫を抑制した受入者に疾患を移入することができる。NOD.scid受入マウスにおけるTh2が仲介する糖尿病は、長い糖尿病前期間があり、全体的な発症率は低かった。その上、Th2による糖尿病病変は独特であり、新生児であれ、NOD.scidマウスであれ、自然発症の糖尿病またはTh1誘導の糖尿病で見られる病変とは、全く異なっている(Pakala et al. 1997)。
【0082】
さらに、IFN−γは糖尿病に関わっており(ヒトと同様にNODにおいても)抗IFN−γは糖尿病を妨害する;病気の状態で膵島にはIFN−γ+細胞が存在し、抗原特異的Th1クローンが糖尿病の発症を加速する(Pakala et al. 1997, O'Garra et al. 1997)。しかも、Th2だけで新生児NODに膵島炎を起こすが、免疫抑制されたNOD.scidでは糖尿病を誘導する能力を有し、また抗IL−10によって疾患は阻害されるが、抗IL−4では阻害されない(Pakala et al. 1997)。このことは非Th2調節性T細胞が正常マウスには存在するが、免疫不全マウスではそのようなものは存在しないことを示唆している。このような結果は、活性化されたTh亜集団の間の均衡を調節する細胞の存在を強調している。そのような調節性T細胞集団の改変された反応性によってこの均衡が乱されることによって免疫仲介性の疾患が起き、特定の極めて重要なサイトカインの欠如や過剰産生を招く可能性がある(O'Garra et al. 1997)。
【0083】
自己免疫疾患の中には、特に慢性関節リウマチ(RA)のようなTh1が仲介する疾患では(Grossman et al. 1997, Russel et al. 1997, Buyon et al. 1998, Hintzen et al. 1997)、妊娠期間中緩解する可能性のあるものがある。その上、妊娠が上手く行くことはTh2型の現象である(Raghupath et al. 1997)。本願発明者らは、NODマウスにおける糖尿病の発生および管内モデルにおいてhCG製剤とそのプレグニル分画(オルガノン、Oss)について調べた。
【0084】
驚くべきことに本願発明者らは、15週齢のNODマウスにhCG製剤を週3回1ヵ月間腹腔内投与することによって、糖尿病の発症を遅らせる、または阻止することができるのを見い出した。さらに、このような処理をしたNODマウスの脾細胞を分画せずにNOD.scidマウスに移入することによってNOD.scidにおける糖尿病の進行を遅らせる、または防ぐことができるが、処理していないマウスの脾細胞ではそのようなことはできない。この抗糖尿病効果はhCGではなくて妊娠女性から得ることが可能な分画に存在する。
【0085】
マウス NODマウスは本願発明者らの施設で、特定病原体未感染条件にて飼育された。本願発明者らのコロニーでは、糖尿病の自然発症は、15週齢のメスで85%である。NOD.scidも本願発明者らの施設で、特定病原体未感染条件にて飼育された。NODから糖尿病誘発細胞を8週齢のNOD.scidに移入すると22日後に糖尿病を発症する。
【0086】
糖尿病 アボット・メディセンス・プレジションQ.I.D.糖質計を用いて静脈血の測定を行うことによって糖尿病を評価し、また糖尿を監視した(Gluketur試験;ベーリンガーマンハイム、マンハイム、ドイツ)。2回連続してグルコース測定値が13.75mmol/l(250mg/dl)より高い場合に動物は糖尿病であると見なされた。糖尿病の発症は、最初に連続して高い数値だった日付とした。>33mmol/lの高血糖が持続する場合は、長期化した不快感を避けるために動物を屠殺した。
【0087】
免疫組織化学 CO2によってマウスを窒息死させた。膵臓全体を切除し、凍結切片を作るためにOCTコンパウンド(ティッシュ−テック)中で急速凍結した。5−(mの凍結切片を作成し、風乾して使用するまで−20℃にて保管した。ホルマリン固定した切片についてキシレンとアルコールとにて脱パラフィンを行い、一般形態観察のためにヘマトキシリンとエオシンとで染色した。次いで、2工程プロトコールを用いてインスリンに関する免疫組織化学的検索を行った。内因性ペルオキシターゼ活性をブロックし、インスリンに対するウサギ抗血清と共にスライドをインキュベートした(カリフォルニア州、カーペンテリア、ダコ社、5%のマウス正常血清中で1:500にて30分)。洗浄工程の後、 西洋ワサビのペルオキシダーゼを結合した抗ウサギIg(ダコ社、5%のNMSにて1:500で30分)と反応させ、アミノ−エチル−カルバゾール(AEC、ピアース)にて10分間で発色し、クリスタルマウントに包埋した。
【0088】
生体内の抗糖尿病効果:PBS(n=4)、300IUのプレグニル(n=4)、または600IUのプレグニル(n=4)を週3回4週間にわたって15週齢のNODマウスに腹腔内投与し、上述のように糖尿病を評価した。4週間後処置を止め、PBS群および600IUのプレグニル群を1週間後に屠殺した。300IUのプレグニル群は、28週齢になるまで生存させた。脾細胞の移入。600IUのプレグニル投与NODおよびPBS投与対照NODから脾臓を切除し、未分画脾細胞を回収した。細胞をPBSで2回洗浄し、20x106個の細胞を8週齢のNOD.scidマウスに腹腔内投与で移入した。
【0089】
移入実験:
9週齢のNODマウスから未分画脾細胞を回収し、10%のFBSを添加したRPMIの中で管内にて300IU/mlのIR−P、100mg/mlのIR−U3−5またはIR−U/LMDFと共に、被覆した抗CD3(145−2C11;25mg/ml)およびIL−2で刺激した。次いで5%CO2、37℃にて48時間プレートをインキュベートした。48時間後、細胞をPBSにて2回洗浄し、20x106個の細胞を8週齢のNOD.scidマウスに腹腔内投与によって移入した。
【0090】
管内の再刺激:平底96穴プレートにて、20週齢のNODマウスから得た未分画脾細胞(1x106個)を10%のFBSを加えたRPMI中で、LPS(E.coli、10(g/ml)または被覆した抗CD3(145−2c11、25g/ml)と共に、様々な用量のhCG−プレグニル(50、100、300、600、800IU/ml)、分画1〜2(200g/ml)、分画3〜5(200g/ml)、ヒト組換えhCG、α−hCG、およびβ−hCG(それぞれ200g/ml)を加えて刺激した。抗CD3を被覆したウエルにはIL−2(40IU/ml)を加えた。5%CO2、37℃にて48時間プレートをインキュベートした。48時間のインキュベートの後、サイトカインの分析のために培養上清を回収した。
【0091】
CD4+T細胞を20週齢のNODマウスの未分画脾細胞から単離し、様々な条件で上述のように抗CD3で刺激した。このような細胞にはIL−2(40IU/ml)および抗CD28(10(g/ml)を加えた。48時間のインキュベートの後、サイトカインを分析するために培養上清を回収した。
【0092】
CD4+細胞がTh1またはTh2サイトカインエフェクター細胞に分化する可能性におけるIRの影響を調べるために、IRの存在下または非存在下におけるThの分極アッセイを行った。CD4+細胞を精製するための原料として、8週齢のメスNODから得た未分画非細胞を用いた。B細胞、NK細胞、単球/マクロファージおよび顆粒球に特異的な抗体と共に補体を用いた除去による負の選抜によって、脾臓から精製CD4+T細胞を得た。CD11b、B220、CD8およびCD40に対するビオチン化モノクローナル抗体のカクテルおよび、その後にストレプトアビジン結合微小ビーズ(ミルテニー・バイオテック、Bergisch Gladbachドイツ)とインキュベートし、磁気活性化細胞分画装置を用いて細胞をさらに精製した。実験に用いたCD4+細胞はフローサイトメトリーで確定したように常に90〜95%精製されていた。最初の刺激については、精製したCD4+T細胞を平底96穴プレートにて(米国、イリノイ州、ネーパービル、ナルジ ヌンク社)1x105個/ウエルにて培養し、プレートに結合した抗CD3(145−2C11、25mg/ml)、抗CD28、およびIL−2(50U/ml)と共に刺激した。Th1細胞の分化については、抗IL−4モノクローナル抗体(11B11、10mg/ml)およびIL−12(10ng/ml)を培養に加えた。Th2の感作は、IL−4(35ng/ml)および抗IFN−γモノクローナル抗体(XMG 1.2、5mg/ml)で行った。さらに、Th1およびTh2を感作する条件では、阻止抗体、抗IL−10(10mg/ml)、抗TGFb(10mg/ml)、およびVitD3(10mg/ml)の存在下または非存在下における300IUのIR−Pおよび100mg/mlのIR−U/LMDFで行った。未感作の培養には抗CD3、抗CD28およびIL2だけが含有された。用量はすべて予備実験で最適化したものであった。4日間の培養の後、細胞を3回洗浄し、新しく抗CD3を被覆した96穴プレートに移し、IL−2(50U/ml)と抗CD28(10mg/ml)との存在下で再刺激した。48時間後、培養上清を回収し、Th1対Th2の分極を読み取るものとして、ELISAによってIL−4、IFN−γおよびIL−10の産生を測定した。
【0093】
生体外でのNODにおけるサイトカイン実験
げっ歯類では、抗体産生におけるIgMからIgGなどのクラスへのスイッチは主としてサイトカインが仲介するT細胞の制御下にあると思われる。優勢なTh1への分極は、大量のIFN−ガンマ産生の影響下、IgM産生からIgG2aへのB細胞のクラススイッチを仲介するが、Th2への分極はB細胞においてIgG1産生へのアイソタイプスイッチを誘導する。本願発明者らは、8〜10週齢のNODマウスに、PBS(n=5)、またはIR−Pおよびその分画IR−P1、IR−P2、IR−P3、または組換えhCG(rhCG)およびIR−P3との併用でのrhCGをそれぞれ200mg3日間腹腔内投与した。未分画非細胞を全群から分離し、LPSまたは被覆した抗CD3で上述のように刺激した。様々な時点でサイトカインおよび増殖を以下のように測定した。すなわち抗CD3刺激の増殖(t=12、24、48時間)、抗CD3刺激のIFN−ガンマ(t=24、30、48時間)、LPS刺激のIgG2a産生(t=7日)である。Th1への分極におけるIR処理の効果を調べるために、本願発明者らは、CD4+細胞を単離し、上述のようにTh1分極アッセイを行った。
【0094】
BALB/cにおける実験
その有益な臨床効果からIRの免疫調節活性を分離するために、本願発明者らは健康なBALB/cマウスに300IUのIR−Pまたは100mg/mlのIR−U/LMDF(n=5)を腹腔内投与した。この系統は一般に、Th2に由来する免疫応答による刺激に反応すると考えられている。IRによる4日間の刺激の後、上述したようなThの分極について対照およびIR−P処理マウスから得た精製CD4+脾細胞を分析した。脾臓APCによって産生されるサイトカインのレベルにおけるIR−Pの影響を調べるために、対照とIR−P処理BALB/cマウスから得た脾細胞を管内にてLPS(E.coli026:B6;10mg/ml、米国ミシガン州デトロイト、ディフコ・ラボラトリーズ)で刺激した。48時間のインキュベートの後、サイトカイン分析(IL−12p70、 IL−6)のために培養上清を回収した。
【0095】
IL−10ノックアウトマウス実験
IL−10遺伝子を遺伝子ターゲットされたマウス(IL−10ノックアウト)におけるIR−Pの影響を生体内で調べるために、本願発明者らはそのようなマウス(n=2)に連続4日間、1日当り300IUのIR−Pを腹腔内投与した。 処理の4日後、脾細胞とリンパ節の細胞を回収し、LPSおよび抗CD3に応答して増殖する能力を調べた。さらに、対照およびIR−P処理マウスからCD4+細胞を精製し、上述のようなTh分極の能力を分析した。
【0096】
NODの骨髄細胞浮遊液
骨髄(BM)に由来する樹状細胞(DC)におけるIR−Pが誘導する効果を調べるために、9週齢のメスNODマウス(n=2)の骨髄を分離し、20ng/mlのGM−CSF(2.0x105個/ml)と共に6日間インキュベートし、7日目に300IU/mlのIR−Pまたは100mg/mlのIR−U(IR−U、IR−U−F3−5(スーパーデックス75に由来する)、またはIR−U/LMDF(FDC−由来))と共にさらに24時間インキュベートした。手短に言えば、大腿骨および脛骨から筋肉と腱を外し、DBSS−FCSを用いて乳鉢で砕いた。22ゲージの針を介して2mlの注射筒に吸引することによって単一細胞の浮遊液を得、その後ナイロンフィルター(網目サイズはそれぞれ100および30mm、オランダ、アムステルダム、ポリモンPES、カーベル)にて細胞浮遊液を2回こした。さらに、DCの成熟にIRが影響を与えるのかどうかを知るために、NODマウスのBMも直接GM−CSFおよびIRと共に7日間培養した。8日目に以下のマーカーの発現についてフローサイトメーターにて細胞を分析した。すなわちCD1d、CD11c、CD14、CD31、CD40、CD43、CD80、CD86、CD95、ER−MP20、ER−MP58、F4/80、E−cad、MHC II、MHC I、RB6 8C5である。9週齢のメスBALB/cマウス(n=3)からのBM細胞でも同様の実験を行った。
【0097】
同種混合リンパ球反応(MLR):
移植の拒絶におけるIRの免疫抑制活性を調べるために、本願発明者らは同種MLRを行った。9週齢のメスBALB/cマウス(n=3)のBM細胞を上述のように分離し、(組換えマウス)rmGM−CSF(20ng/ml)およびIR(IR−P 300IU/ml、IR−U 300mg/m、IR−U3−5 300mg/ml、IR−U/LMDF 300mg/ml)で7日間処理した。7日後生じたDCを放射線処理(2,000ラド)、9週齢のメスC57BL/Lyから分離したCD3+脾細胞と共に培養した。このようなCD3+細胞とDC細胞とを様々な比で培養し、[3H]TdRの取り込み(培養の最後の16時間に0.5mCi/ウエル)によってT細胞の増殖を測定した。
【0098】
サイトカインのELISA:IL−4は捕捉抗体としてモノクローナル抗IL−4抗体(11B11)を用いて検出し、ビオチン結合ラット抗マウスIL−4モノクローナル抗体(BVD6 24G2.3)で明らかにした。IFN−γは捕捉抗体としてモノクローナル抗IFN−γ抗体(XMG1.2)を用いて検出し、またビオチン結合ラット抗マウスIFNγモノクローナル抗体(R46A2)で明らかにした。両者ともに検出にはABTS基質を用いた。
【0099】
IL−6、IL−10、IL−4およびIFN−gについてサイトカイン特異的捕捉抗体をPBSで希釈して(それぞれ、20F3およびSXC−1は1mg/ml、11B11およびXNG1.2は5mg/ml)、平底マイクロプレート(米国、オックスナード、ベクトン・ディッキンソン、96穴、ファルコン3912、マイクロテストIIフレキシブル・アッセイプレート)を4℃にて18時間被覆した。被覆後、プレートを洗浄(PBS、0.1%BSA、0.05%ツイーン20)し、1%BSAを添加したPBSで室温にて1時間ブロックした。洗浄した後、試料および標準液を加え、室温にて少なくとも4時間インキュベートを継続した。その後、ビオチン化した検出抗体(32C11(IL−6)およびR46A2(IFNγ)は1mg/ml、2A5.1(IL−10)およびBVD6.24G2(IL−4)は0.1mg/ml)を加え、4℃にて一晩インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ(1/1500希釈、米国、ペンシルベニア州、ウエストグローブ、ジャクソン・イムノリサーチ)を加えた。1時間後、プレートを洗浄し、2,2’−アジノ−ビス−3−エチルベンソ−チアゾリン−6−スルホン酸(ABTS,1mg/ml、米国、ミズーリ州、セントルイス)を用いて反応を視覚化した。タイターテック・マルチスキャン(米国、レッドウッドシティ、フローラボ)を用いて414nmにて光学密度を測定した。IL−12p70、TNF−aおよびTGF−bについては、市販のELISAキットによって製造者が提供しているプロトコールに従って測定した。
【0100】
敗血症または敗血症性ショックに関する実験:
敗血症または敗血症性ショックを調べるには3つの一般的なマウスモデルがある。すなわち高用量のLPS、D−ガラクトサミンの感作と併用した低用量LPSおよびD−ガラクトサミンと併用した低用量のスーパー抗原である。
【0101】
敗血症または敗血症性ショックを調べるために用いられる最初のモデルの1つには、腹膜腔間にかなり大量のLPS(300〜1200(gの間)を投与することが含まれていた。マウスは細菌毒素には完全に抵抗性でもこの高用量には屈する。マウスにおける高用量のLPSはヒトでの低用量に相関することが示唆されている(Mietheke at al.)。ヒトにおける敗血症または敗血症性ショックの70%は、グラム陰性細菌の内毒素によって引き起こされ、30%はグラム陽性細菌から放出される外毒素によって起きる。グラム陰性細菌の細胞膜に結びついた従来の内毒素、独特のリポ多糖類は、敗血症または敗血症性ショックの病因カスケードの最も共通したイニシエータを意味している。内毒素分子は、抗原性や構造上多様な一連のオリゴ糖類でできた外核、グラム陰性細菌の間で共通の類似性を持つオリゴ糖類の内核、および細菌種に高度に保存されている核脂質Aから成っている。脂質Aが内毒素の毒性を示す多くの特性に関与している。LPSのような内毒素の全身性の影響は、内毒素感受性のマクロファージを養子移入すると内毒素抵抗性であったマウスが毒素に感受性になるので、主としてマクロファージが仲介すると思われる(Freudenberg et al. 1986)。
【0102】
内毒素による敗血症または敗血症性ショックのさらによく用いられるモデルは、ガラクトサミンで同時に処理(D−Gal感作)した後、低用量のLPSにBALB/cマウスが感受性になることを上手く利用している。このD−Gal処理によって動物はLPSの毒性効果に劇的に感受性となり、ナノグラム量で野生型動物が6〜7時間で致死となるような毒性を肝臓に誘発することができる。この内毒素の全身性の効果には主としてマクロファージが介在していると思われる(Gutierrez-Ramos et al. 1997)。敗血症を生じるのは特定の伝達物質がさらに重要であることは疑いもないが、おそらく相互作用し、促進し、互いに阻害しあう多数の生物および宿主に由来する伝達物質が敗血症または敗血症性ショックの病因に関与している。
.LPS、TNFおよびその他の伝達物質に対する反応において、内皮細胞およびマクロファージは、強力な血管拡張物質、内皮由来血管弛緩因子(EDRF)を放出することができ、それは最近、酸化窒素であることが同定された。この分子は、平滑筋の弛緩および強力な血管拡張を起こす。酸化窒素シンターゼの競合阻害剤によって酸化窒素の産生を阻害すると、内毒素ショックに陥った動物の血圧が上昇するという結果を招く。このことは、酸化窒素が敗血症による低血圧に部分的に関与することを示唆している。酸化窒素の阻害によって血圧が回復することはないが、そのような阻害によって組織の血流が低下する可能性がある(Bennett et al.)。
【0103】
内毒素はまた、通常、補体活性化第2経路を介して補体カスケードを活性化することができる。これはアナフィラトキシンC3aおよびC5aの放出を招き、それらは血管を拡張し、血管透過性を高め、血小板を凝集し、好中球を活性化し、凝集することができる。このような補体に由来する伝達物質は、敗血症または敗血症性ショックに関連する微細血管の異常に部分的に関与している。さらに内毒素は、第XII因子(ハーゲマン因子)、カリクレインおよびキニノゲンの活性化を介したブラジキニンの放出を招く。ブラジキニンも血管拡張剤であり、血圧降下物質である。LPSによる第XII因子の活性化によって、内因(マクロファージおよび内皮細胞が放出する組織因子を介して)および外因の凝固経路の活性化が導かれる。これは凝固因子の消費およびDICを招く。TNFも外因経路を活性化し、このような凝固の異常に寄与している可能性がある。
【0104】
アラキドン酸カスケードの様々な代謝によって血管拡張(プロスタサイクリン)、血管収縮(トロンボキサン)、血小板の凝集、または好中球の活性化が起きることも知られている。実験動物では、シクロオキシゲナーゼまたはトロンボキサン・シンターゼを阻害することによって内毒素ショックを防御してきた。敗血症の患者では、高レベルのトロンボキサンB2(TBX2)および6−ケトプロスタグランジンF1(プロスタサイクリン代謝の最終産物)が存在する。数多くのサイトカインは内皮細胞または白血球からこのようなアラキドン酸代謝物の放出を起こすことができる。
【0105】
同様のやり方で、内毒素ショックモデルD−Gal感作BALB/cマウスを低用量のTSST−1またはSEBで処理する。このようなスーパー抗原は、T細胞の大きな集団の増殖および活性化を刺激する。実際、このようなスーパー抗原で誘導されたT細胞の活性化は、ほとんどポリクローン性T細胞の活性化と見なされ、特異的なVベータファミリーを発現しているT細胞はすべて、TCR/MHCII/およびスーパー抗原による抗原非特異的結合を介して活性化される(図14)。
【0106】
D−ガラクトサミンは、肝臓を標的とする転写阻害剤であることが判っており、急性期タンパク質の合成を妨害する。実際このような急性期タンパク質は肝臓がTNFαを解毒する/失活させるのに役立っていると考えられている。実際、低用量内毒素モデルまたは外毒素モデルにおけるD−ガラクトサミン処理には、TNFα仲介肝臓アポトーシスが伴っている。D−ガラクトサミン単独による処理では肝臓のアポトーシスは起きず、このような臓器を損傷する作用は、低用量の両モデルでは抗TNFα抗体によって中和することができる(Gutierrez-Ramos et al. 1997)。
【0107】
敗血症および敗血症性ショックの実験に用いたマウス:8〜12週齢のメスBALB/cおよびSJLマウスを全実験に用いた。欧州実験動物科学協会(FELASA)、動物の健康に関するワーキンググループの報告(Laboratory Animals 28:1-24, 1994)に記載されたプロトコールに従って、特定病原体未感染条件下、本願発明者らの施設で動物を飼育した。
【0108】
注射用プロトコール:毒性ショック(TSST−1およびD−ガラクトサミン)(n=6)。
【0109】
外毒素モデル用には、100μlの滅菌食塩水(9%)に溶解した20mgのD−ガラクトサミンを、Balb/cマウスの腹腔内に注射した。次いでそれらに、100μlの滅菌食塩水に溶解した4μgのTSST−1を、各肩甲骨の下約0.5cmの2ヵ所に皮下注射した。対照群には、 D−ガラクトサミンを用いずに4μgのTSST−1を皮下注射するか、またはD−ガラクトサミンのみを用いて処理した。また、D−ガラクトサミンで感作されたBalb/cマウスの一群は、TSST−1処理前の3日間にわたり、700IUのIR−Pを用いて腹腔内に前処理した。
【0110】
LPSモデル(n=6)
内毒素モデル用には、Balb/cおよびSJLマウスを、600μgのLPSを用いて腹腔内に処理した。対照群はPBSのみを用いて腹腔内に処理した。IR−Pの効果を検査するため、本願発明者らはBalb/cおよびSJLマウスに、700IUを用いて3日間前処理し、次いで600μgのLPSを用いて注射した。さらにまた、Balb/cマウスの一群に、IR−U分画(IR−U1、IR−U2、IR−U3〜5)を各々200μgの同一用量を用いて3日間にわたり腹腔内に前処理し、次いで600μgのLPSを注射した。低分子量分画を検査するため、本願発明者らはIR−U/LMDF(IR−U5(<10Kdal>分画も含む)、IR−P3(方法3によって入手された)、IR−AならびにIR−A3(方法3によって入手された)、および方法4によって入手されるたそれらの分画について、抗ショック活性を検査した。加えて、本願発明者らはペプチドカラムからの3つの分画(F1〜3)の抗ショック活性についても調べた(方法は本文書の他の箇所に示されている)。また、本願発明者らはBalb/cマウスを、LPSの注射の1および2時間後に、各々700IUのIR−Pを用いて2回腹腔内に処理した。
【0111】
疾病の半定量的測定:以下の測定基準を用いてマウスの疾病レベルを採点した。
1 毛皮からの浸出あり、正常なマウスとの行動の差異は検出されず。
2 毛皮からの浸出あり、寄せ合い反射あり、刺激(ケージの軽打等)に対し反応、取扱い時は健康なマウスと同様に活動的。
3 ケージの軽打に対して遅い反応、取扱い時は無抵抗または従順だが、新しい環境に単独で置かれた場合の好奇心は残存。
4 好奇心の欠如、刺激に対しごくわずかに反応するかまたは無反応、全く不動。
5 呼吸困難、仰臥位にされた後の自動復元は不能または遅鈍(瀕死、犠牲にされた)。
【0112】
WBCおよび血小板のカウント: TSST−1モデルからは、24時間の時点において、一群当り無作為に選ばれた2匹のマウスから、100μlの血液を尾部出血法を用いて入手した。EDTAチューブに全血を集め、自動化された血液学分析器にて分析した。
【0113】
ショックについてのデータ
動物および処理:ハーラン(Harlan)から入手した8〜10週齢のメスのBalb/cマウスを本研究に使用した。動物を殺し、肝臓および脾臓を以下に示したように切除し、さらなる研究用とした。マウスの取扱いならびに実験方法は、動物の保護および使用に関する米国実験動物保護認定協会ガイドライン(American Association of Accreditaion of Laboratory Animal Care guidlines for animal care and use)に従って行なった。
【0114】
注射のプロトコール: 大腸菌からのLPS(シグマケミカル社(Sigma Chemica Co))を、150mg/kgにて腹腔内に投与し、高用量LPSショックモデル用とした。IRの効果を検査するべく、マウスにIR−P(プレグニル(Pregnyl);オルガノン(Organon);オランダ、オス(Oss) )およびその分画であるIR−P1、IR−P2、IR−P3、およびIR−A3(APL;ワイイス・アイヤスト(Wyeth Ayerst)、米国ペンシルベニア州、フィラデルフィア)の各々200mgの同一用量を用い、3日間にわたり(t=−3、t=−2、t=−1)腹腔内に前処理し、次いでLPSをt=0において注射した。またマウスの一群には、LPS注射の1および2時間後の2回にわたり、各々IR−Pまたはデキサメタゾンを用いて腹腔内に処理した。
【0115】
血液検査:各群の血液を、各時点(t=−72時間、−1時間、および48時間)において、3匹のマウスの尾部出血により回収し、白血球、血小板、血漿酵素LDH、ALAT、およびASATの慣例的な測定用としてプールした。次にマウスを犠牲にし、肝臓および脾臓を切除し、以下に示したように研究した。
【0116】
移植モデル:
動物および処理:IR−Pが同種移植片を保護することが可能かどうかを決定するべく、本願発明者らはBALB/cマウス(n=5)に、腹腔内に1日当り600I.U.のIR−Pか、あるいはPBSを用いて、2日間にわたり処理した。3日目に、C57BL/6ドナーの尾部の皮膚を、IR−PまたはPBSで処理したBALB/cレシピエントの背側胸部に、ビリンガムおよびメダワー(Billingham and Medawar)の方法の変法を用いて移植した。移植片は、ドナーの生存可能な皮膚/毛髪が検出されない場合に拒絶されたとみなした。移植の後、IR−Pで前処理されたBALB/cレシピエントには、さらなる2日間の処理を行なった。
【0117】
EAEモデル(MS)
EAEの誘導。8〜12週齢のメスのSJLマウス(n=5)を、50ml(0.5mg/ml)のPLP−ペプチドを用いて4ヵ所の異なる場所に免疫化した(t=0)。24時間後、1010個の百日咳菌を尾部に、i.v.(静脈内)に注射した。続いて、72時間後に(t=3)、百日咳菌によりマウスを再度免疫化した。7日目よりマウスを秤量し、毎日EAEの臨床徴候を以下のように0〜5の段階に等級づけた。
【0118】
EAEの等級 症状
0 徴候なし
0.5 不全麻痺または部分的な尾部の麻痺
1 完全な尾部の麻痺
2 不全対麻痺;四肢の弱まりおよび尾部の麻痺
2.5 部分的な四肢の麻痺
3 完全な後肢または前肢の麻痺
3.5 対麻痺
4 四肢の麻痺
5 死亡
【0119】
IR処理:一群のマウスにはまた8日目から1日当り600I.U.のIR−Pを週3回、腹腔内に2週間にわたって処理し、対照群には同じ体積のPBSを用いて処理した。
【0120】
ストレプトゾトシンモデル:
ストレプトゾトシンの注射。多様な用量のストレプトゾトシン(MD−STZ)モデル用には、25mg/kgのSTZ(シグマ)をクエン酸緩衝液(pH4.2)に溶解し、可溶化後5分以内に、先に記述したように腹腔内に注射した。6〜9週齢のオスのマウスに、連続して5日間(実験の1日目から5日目まで)注射した。連続5日間のSTZの後、IR−P(600I.U.を腹腔内に)(n=5)またはクエン酸緩衝液(n=5)を用い、週4回、3週間にわたってマウスを処理した。高用量のストレプトゾトシン(HD−STZ)モデル用には、ストレプトゾトシン(160mg/kg)の単回の腹腔内投与により、マウスに高血糖症を誘導した。対照群のマウスは、相応する体積のクエン酸緩衝液のみを受けた。
【0121】
結果
hCG分画の製剤および特徴づけ。1または2バイアルの工業用等級のhCG−プレグニル(5,000IU/バイアル)溶液のゲル濾過を、セファデックス(Sephdex)75カラム(HR5/30)(ファルマシア(Pharmacia)、スウェーデン)を装備したファルマシアFPLCシステムにおいて行なった。処理試料容量は1mlであった。流速は、以後の45分間は0.5ml/分であった。高い乳糖含有量を有する工業用等級のhCG溶液の粘性のため、0.2ml/分の流速を1分間実行した。hCGの比較的精製されたプレグニル製剤には、hCGおよびごく少量のhCGコアフラグメントが存在しており、それらの位置を内部のサイズマーカーとして使用した。hCGはゲル濾過において78kDaの分子として溶出され、hCGのβ−コアは19kDaの分子として溶出された。1〜5の分画が集められ、分画1〜2はhCGを含んでおり、分画5はhCG(コアフラグメントなし)を含んでいた。分画1〜2および分画3〜5の抗糖尿病効果について、20週齢のNODの全脾臓細胞を管内で処理し、かつそれらをNOD.scidに移植することによって検査した。この方法により、ヒトの組換えhCG、α−hCG、およびβ−hCG(シグマ(Sigma)、米国ミズーリ州、セントルイス)についても検査した。
【0122】
IR−UおよびIR−Pのゲル浸透:図15は、未希釈のIR−U試料の50μlのFPLCクロマトグラムを表している。流出緩衝液はPBSであった。クロマトグラムは、70、37、15、および10kDaに4つの主要なピークを示した。これらのピークを同定するべく、IR−P(プレグニル)の500μlの試料(5000IUを含んでいる)を、同様の流出条件下に同一のカラムに適用した。得られたプロフィール(図16)もまたこれらの4つのピークを示したが、その比率は異なっていた。ピーク分画2は(α/β)ヘテロダイマーhCG(37kDa)を表わし、一方分画3は個々の鎖か、これらの鎖かまたはβ−コアの残存鎖のホモダイマー、および他の分子(15〜30kDa)を表す。これらの結果から本願発明者らは、最初の3半期の尿が同一の4つの主要なタンパク質を含んでおり、それらは予期されたように工業用のhCG製剤にも存在していると結論した。本願発明者らはこれらを(IR−P1、IR−P2、IR−P3〜5(プールされた))、(IR−U1、IR−U2、IR−U3〜5(プールされた))と名付けた。分画5はタンパク質を含まないか、または10kDaより小さい分子量のタンパク質を含む。さらに、重複している分画2および3は、IR−Uと同様にIR−Pにも見られ、これによりこれらの分画中に共有結合によって結合しているタンパク質種が存在することが示唆された。
【0123】
陰イオン交換クロマトグラフィーならびにIR−UおよびIR−Pのさらなる処理:
重複している分画2および3のさらなる分離を、1mlのMONO Q HR5/5陰イオン交換カラムにおいて行なった。図17は、PBSにて1:20に希釈された50μlのIR−Uのクロマトグラムを表す。二つの主要なタンパク質ピークが43%および55%の緩衝液Bにおいて溶出されたが、分離はされず、これらのタンパク質間の共有結合が示唆される。50%緩衝液Bを用いて保持する不連続溶出勾配を用いても、これらのピークが分離する結果にはならなかった(データは示さず)。したがって本願発明者らは、尿試料中に存在するタンパク質種の共有結合のため、さらなる精製にはイオン交換クロマトグラフィーが使用できないことを結論づけた。
【0124】
IR−U試料中に存在する主要なタンパク質種の間に推定される共有結合を減じるべく、本願発明者らは60mMの2−メルカプトエタノールを用いて100℃にて3分間試料を処理し、次いで試料を同等の条件下にセファデックス75カラムに適用した。図18は、ピーク1(70kDa)が残存しており(図15〜17も参照のこと)、分画2(hCGを表す、37kDa)はほとんど消失し、低分子(<10kDa)の二つの新たなピークを生じる結果となったことを示している。ピーク3は残存し、したがって単離されたベータ−コアおよび単量体タンパク質を過剰に含むようである。ピーク4(10kDa)はもまた還元処理により消失した。
【0125】
同様の還元処理をIR−Pの試料(プレグニル)に適用した。同様に処理されたIR−U試料のプロフィールと同じように、hCG(図19)はピーク2の減少、ピーク3の増加を示し、一方新たなタンパク質ピークがピーク1と2の間に現われた。さらに、破壊産物のピーク(<10kDa)の増加も明らかであった。
【0126】
移入実験:
全脾臓細胞を9週齢のNODから回収し、10%FBSを追加したRPMI+中の管内において、300IU/mlのIR−P、100mg/mlのIR−U3〜5またはIR−U/LMDFと共に、被覆された抗CD3(145−2cll;25mg/ml)およびIL−2(50U/ml)を用いて刺激した。次いでプレートを、空気中5%CO2下に、37℃にて48時間インキュベートした。48時間後、細胞をPBSにて2回洗浄し、20x106細胞を8週齢のNOD.scidマウスに腹腔内に移入した。
【0127】
生体内におけるIRの抗糖尿病効果:4匹の15週齢のメスのNODマウス(n=4)を、PBS,300IUのプレグニル、または600IUのプレグニルを用い、週3回、4週間にわたって腹腔内に処理した。処理の後、PBSの群の全てのマウスは糖尿病であり(血糖>33mmol/l)、体重が減少し、不具合の様子であったが、一方300IUのプレグニル、および600IUのプレグニルの群では疾病のないままであった。それらの血糖値は6mmol/lを超えることはなく、非常に健康そうに見えた(図1および3)。膵臓における浸潤の可能性およびインタクトなインスリン産生細胞を評価するべく、PBSおよび600IUのプレグニル群のマウスを処理後に殺し、全膵臓を除去してインスリンの免疫組織化学用とした。PBS群からの膵臓の切片は、多くの浸潤中の細胞を示し、これらの細胞は島へ侵入した。またPBS群の膵臓には、多数のBリンパ球およびTリンパ球が存在していた。この発見は、本願発明者らによる他の、CD4+細胞数の選択的な減少に起因する脾臓のCD8/CD4細胞の比の上昇、およびこれらのマウスの脾臓におけるBリンパ球数の減少という所見(データは示さず)と一致する。600IUのプレグニル群のマウスでは、膵臓に浸潤はなく、さらに驚いたことに、多数のインスリンを産生している新しい島が見られた。また、膵臓におけるBリンパ球およびTリンパ球の数も減少しており、それは正常なレベルのCD8/CD4比およびこれらのマウスの脾臓におけるBリンパ球数と一致した。300IUのプレグニル群からのマウスは、28週齢まで生存し続けた。それらは健康的に見え、体重の減少はなく、血糖値は8mmol/lを超えなかった(図1および3)。インスリンの存在についての免疫組織化学も行なった。膵臓には浸潤している細胞はまだ存在しており、インスリンを産生しているいくつかの島もあった。これらのマウスは、600IUのプレグニル群と共に、4週間にわたってプレグニルで処理し、20週から28週までは処理しないままであった。
【0128】
処理済みおよび未処理のNDOマウスの脾臓細胞が、NDO.scidに糖尿病を誘導する能力を保持しているかどうかを決定するため、本願発明者らはPBSおよび600IUプレグニル群からの脾臓細胞をNDO.scid マウスに移入した。移入の22日後では、PBSのNDO.scid群は糖尿病に関して陽性であり、1週間以内に33mmol/lを超える血糖値に達したが、一方600IUプレグニル群からの脾臓細胞を受けたNDO.scid マウスは正常のままであった(血糖<7mmol/l )。移入の7週間後では、 PBS群は非常に不具合のようであった(図2)が、600IUプレグニルのNDO.scid群はなお9mmol/l より低い血糖値を有しており、健康のままであった。この時点で両群からのマウスを殺した。
【0129】
管内での再刺激。NODにおいては疾病の経過をとおして、高レベルのINF−γ、IL−1、およびTNF−aが報告されており、このサイトカインのプロフィールがTh1のサブセットの選択的活性化に一致するという理由から、本願発明者らは管内において、20週齢のメスのNODマウスからの全脾臓細胞および精製されたCD4+によるサイトカイン産生に及ぼす、プレグニルの影響を調べた。抗糖尿病効果がhCGまたはそのサブユニットの一つか、あるいは用いた製剤に含まれていた他の因子にあるのかを判断するべく、本願発明者らはプレグニルからゲル浸透クロマトグラフィー(図12)によって入手された異なる分画、およびヒトの組換えhCGとそのサブユニットの、サイトカイン産生に対する効果についても検査した。またこれらの分画の効果を、再構成されたNOD.scidマウスにおける血糖値について生体内でも調べた。
【0130】
本願発明者らは、50〜600IU/mlのプレグニル、F3〜5(58〜15kDa)を用いて処理したマウスから入手された脾臓細胞による、IFN−γ産生の強力な、またヒトの組換えβCGを用いた弱い阻害を観察した。800IU/mlのプレグニルを用いて処理されたマウスからの脾臓細胞では、IFN−γの産生には中程度の増加があったにすぎない。同様なパターンが、IL−4産生の分析時にも観察された(図5)。さらに、300〜600IU/mlのプレグニルを用いて処理されたマウスからの刺激された脾臓細胞においては、IL−1およびTNF−aの著しい阻害が、付随しておこるIL−6およびIL−10産生の刺激と共に観察された(データは示さず)。
【0131】
さらに、移入実験は、F3〜5または600IUのプレグニルを用いて処理された20週齢のNODマウスの全脾臓細胞が、PBSで処理されたNOD細胞の再構成に比較して、NOD.scidにおける糖尿病の発症を遅延または予防することさえ可能であることを示した(図7)。しかしながら、F1〜2(80〜70kDa)を用いても、NOD.scidマウスにおける糖尿病の発症に対して何ら有意の効果は観察されなかった。プレグニルがTh2型マウスに対して効果を有するかどうかを調べるべく、本願発明者らはBALB/cマウス(n=5)に300IUのプレグニルを腹腔内に用いて4日間にわたり、またPBS(n=5)を用いて処理した。脾臓よりCD4+細胞を単離した後、本願発明者らはそれらを抗CD3/IL−2を用いて48時間にわたり刺激し、さらに上清を集めてIFN−γおよびIL−4サイトカインの測定用とした。また本願発明者らは、異なる用量のプレグニルを用いてCD4+細胞を処理した。続いて上清を集め、サイトカイン分析用とした。著しいIFN−γの阻害と、付随したIL−4の刺激とが、抗CD3/IL−2だけを用いて刺激されたCD4+細胞に見出され(Th1−>Th2)、一方その逆が、異なる用量のプレグニルを用いて管内で処理されたCD4+細胞に見られた(Th2−>Th1)。
【0132】
IR−U/LMDFの抗糖尿病活性
IR−U/LMDF(<5kDa)の抗糖尿病活性を検査するべく、本願発明者らは、この分画を用い、またPBSを用いて(対照)、糖尿病誘発性細胞を管内において処理した。これらの細胞をNOD.scidマウスに移入すると、IR−U/LMDF処理された細胞を用いて再構成されたNOD.scidマウスでは、対照群(n=3)に比較して糖尿病の発症が遅延されたことを示した。
【0133】
CD4+細胞が、Th1サイトカイン産生エフェクター細胞に分化するための潜在能力を測定するべく、IRの存在または非存在下にThの分極分析を行なった。本願発明者らはまた、組換えhCG(rhCG)およびベータ−hCGも、このThの分極分析で調べた。Th1表現型に向けて分極しているCD4+に対するIFN−ガンマの強力な阻害が、IR−PおよびIR−U/LMDFを用いて見出された(図28)。組換えベータ−hCGについて観察された産生には、IFN−ガンマの中程度の阻害だけがあり、組換えhCGでは何ら影響が見られなかった(図28)。
【0134】
IR−P3がその完全な活性を働かせるために、hCG等の付加的な因子を必要とするかどうかを決定するべく、本願発明者らはまたIR−P、その分画であるIR−P3、rhCG、およびrhCGと組合されたIR−3を用いてNODマウスを処理し、次いでTh1の分極を行なった。図64は、IR−PがTh1分極分析におけるIFN−ガンマ産生を阻害し、それによりTh1細胞の増殖をTh1分極の条件下に阻害したことを示している。IR−P3およびrhCGを単独に用いるとTh1分極の中程度の阻害が見られ、一方IR−P3とrhCGとの組合せによりTh1細胞の増殖は完全に阻止された(図64)。
【0135】
また本願発明者らは、これらのIR処理されたマウスからの脾臓細胞を、抗CD3を用いて刺激し、異なる時点においてIFN−ガンマおよびIL−10の産生を測定した。図65は、IR−Pおよび、その分画であるIR−P1およびIR−P2を用いた生体内での処理が、管内における抗CD3に刺激されたIFN−ガンマ産生を阻害し、一方、中程度のIFN−ガンマ産生の増加がrhCGおよびIR−P3を用いて検出されたことを示している。さらに、 rhCGと組合わされたIR−P3分画は、IFN−ガンマ産生を阻害することが可能であった(図65)。また本願発明者らは、抗CD3によって刺激されたIL−10産生(t=48)を、これらの生体内で処理されたマウスの脾細胞において測定した。図(図67)は、全ての分画(IR−P、IR−P1、IR−P2、IR−P3)がIL−10の産生を増加することが可能であったことを示す。
【0136】
IRおよびその分画が抗CD3による脾細胞の増殖を管内において促進するので、IRを用いた生体内の処理が、抗CD3に刺激された管内の増殖に及ぼす影響を知るべく、本願発明者らはまた、これらのIR処理されたマウスから異なる時点(t=12、24、48時間)において入手された脾細胞の、CD3に刺激される増殖を測定した。図(66)は、抗CD3が、IR−P処理されたNODマウスからの脾細胞を刺激したこと、またIR−P1が管内における低い増殖能を有することをを示している。さらに、IR−P3およびrhCGで処理されたマウスからの脾細胞は、PBS処理された対照マウス(CTL)に比較して、高い増殖能を示したが、一方rhCGと組合わさたIR−P3は、IR−Pと同様の増殖の減少を引起こした。IR−P2で処理されたNODマウスからの脾細胞の、抗CD3に刺激された増殖には、中程度の効果が見られた。
【0137】
上述のように、優位のTh1分極は、IFN−ガンマの大量産生の影響下に、B細胞のIgMからIgG2産生への切替えを引起こす。したがって、本願発明者らは、IR処理されたNODマウスから入手された、LPSに刺激された脾細胞におけるIgG2の産生も測定した。図68はIR−P、IR−P1、およびIR−P3処理された、LPS刺激された脾細胞が、管内において、より少ないIgG2aを産生したのに対し、IR−P2ではIgG2aの中程度の阻害が見られたことを示す。さらに、重ねてrhCG処理はIgG2aの産生を減じることはできず、一方IR−P3との組合わせではそれが可能であった(図68)。
【0138】
GM−CSF刺激NODの骨髄細胞:
骨髄からの樹状細胞(DC)の成熟に及ぼすIRの影響を測定するべく、本願発明者らは8週齢のNODマウスからの骨髄細胞を、GM−CSFの存在下に7日間培養した。このような条件下では、骨髄からのDCの増殖は90%よりも多い。 本願発明者らが、GM−CSFおよびIR−Pの存在下にDCを7日間同時培養した場合には、本願発明者らは、IRで処理された全てのDCが、GM−CSFだけで処理された対照のDCよりも未成熟であることを観察した。このことは、細胞表面マーカーCDld、ER−MP58、F4/80、CD14の減少と、CD43、CD95、CD31、およびE−cadの増加から結論された(図29)。さらに、表面マーカーER−MP20/LY6C、MHCIおよびIIには何ら変化が観察されなかった(図29)。
【0139】
これに対し、GM−CSFを用いてDCを6日間培養し、7日目に300IU/mlのIR−P(図30)または100mg/mlのIR−U/LMDF(図31)と共にさらに24時間同時培養すると、DCはより成熟し、APCのように、よりよく機能することができた。このことは、 CDld、CD40、CD80、CD86、CD95、F4/80、CD11c、およびMHCII細胞表面マーカーの増加から結論された(図30および図31)。
【0140】
BALB/cの分極分析
IRがTh2表現型マウスに対しても効果をもつかどうかを調べるため、本願発明者らはIR−PおよびIR−U/LMDFをBALB/cマウスにおいて調べた。IR処理の後、本願発明者らは分極分析法においてCD4+T細胞を単離した。分極分析により、IR−PおよびIR−U/LMDFで処理されたマウスからのCD4+T細胞は、より低いIFN−ガンマ産生能を有するが(図32および図33)、一方これらの細胞は、PBS処理マウスからの細胞に比較して、より多くのIL−4を産生した(図34および図35)。このことは、生体内でのIR処理により、T細胞がTh2表現型に向けてさらにシフトされたことを示唆している。PBS処理および異なる用量のIR−Pで処理されたIR−PマウスからのCD4+T細胞は、IFN−ガンマの増加(図36)およびIL−4産生の減少(図37)を示しており、このことはTh1表現型へ向けたシフトを示唆している。Th2表現型に向けたCD4+T細胞のシフトが、IL−10またはTGF−ベータ依存性であるかどうかを決定するべく、本願発明者らはまたIR−P処理マウスからのCD4+T細胞の分極分析に、抗IL−10および抗TGF−ベータを添加した。このことは、IR−P処理マウス細胞のTh1の分極条件下ではIFN−ガンマ産生の、またTh2の分極条件下では、抗IL−10の添加に支持されるIL−4産生の増加を引起こしており(図38および図39)、このことはIR−PによるTh1/Th2分極におけるIL−10の関与を示唆している。さらに、抗TGF−ベータの管内の処理では、Th1およびTh2の分極条件におけるIL−4およびIFN−ガンマの産生には、対照とIR−P処理群との間に大きい差異が見られなかった(図40および図41)。このことは、IR処理に起因してIL−10およびTGF−ベータが関与することを証明している。さらに、IR−U/LMDFからの精製されたCD4+細胞は、対照のマウスからの細胞よりも多くのTGF−ベータを産生する(図43)。抗IL−10または抗IL−6が両培養物に添加されると、対照群のマウスからのCD4+細胞は、IR−U/LMDF処理された群よりも多くのTGF−ベータを産生する。このことは、TGF−ベータ産生におけるIL−6およびIL−10の関与を示唆している。このことは、IR処理マウスからの、LPS刺激された脾臓細胞が、対照マウスと比較して高いレベルのIL−6を産生することを示す本願発明者らのデータ(図45)と一致する。
【0141】
UVBを照射されたマウスの脾臓細胞もまた、より多くのIL−10を産生し、Th1サイトカイニンの抑制を誘導する。これらのマウスからの脾臓細胞のLPSおよび抗CD3による刺激は、それらの増殖能が低いことを示した。また本願発明者らは、UVBおよびIRで処理されたBALB/cマウスからの脾臓細胞の、LPSと抗CD3とに刺激される増殖を比較した。 LPSおよび抗CD3に誘導される増殖の減少が、UVB処理されたBALB/cマウスからの脾細胞の培養後に観察され(図46および図47)、IRまたは、IRもしくはUVB照射処理により組合わされた処理では、LPSおよび抗CD3に刺激される増殖が増加した(図46および図47)。
【0142】
IL−10ノックアウトマウスの結果:
LPSおよび抗CD3に刺激された増殖におけるこのような変化が、IL−10依存性であるかどうかを決定するべく、本願発明者らはIL−10ノックアウトマウスにIR−PまたはUVB処理を行なった。UVB照射およびIR−P処理されたBALB/cマウスを比較した場合、抗CD3で刺激された脾臓細胞においては何ら増殖パターンの変化は見られず(図47)、一方抗CD3で刺激されたリンパ節細胞においては、両群のUVB照射されたBALB/cに比較して逆の増殖パターンが観察された(図49)。このことは、UVB処理後の抗CD3刺激による増殖の減少または、脾臓細胞のIR−P処理後の増殖の増加が完全にIL−10依存性ではないが、一方抗CD3刺激されたリンパ節細胞についてはこのことが正しいことを示している。LPS刺激された脾臓細胞の増殖を48時間後に評価した場合、本願発明者らは、対照群に比較してUVBおよびIR−P処理された群における増殖の増加を観察したが(図51)、一方72時間増殖の時点では、両群に増殖の減少が観察された(図50)。
【0143】
生体内におけるUVBまたはIR−P処理の、細胞マーカーCD4、CD8、B220、M5/114について陽性の細胞のパーセントに及ぼす影響を測定するべく、本願発明者らはリンパ節細胞および脾臓細胞についてフローサイトメトリー分析を行なった。IR−P処理されたIL−10ノックアウトマウスのリンパ節では、B220およびM5/114陽性細胞の減少と、CD4およびCD8陽性細胞の増殖とが観察され(図52)、一方脾臓においては、CD4、CD8、B220、およびM5/114陽性細胞の増加が観察された(図53)。UVB処理群では、CD8陽性細胞の増加と、CD4、 B220、およびM5/114陽性細胞の減少がリンパ節に見られたが(図52)、CD8陽性細胞の中程度の増加を除き、脾臓細胞では何ら細胞マーカーの変化は観察されなかった(図53)。
【0144】
GM−CSF刺激骨髄細胞の結果:
骨髄の樹状細胞(DC)の成熟度に対するIRの影響を測定するべく、本願発明者らはBALB/cマウスからの骨髄細胞を、GM−CSFの存在下に7日間培養した。この方法では、骨髄からのDCの増殖は90%よりも多い。本願発明者らがこれらのDCを、GM−CSFおよびIR(IR−P、IR−U、IR−U3〜5、IR−U/LMDF)の存在下に7日間にわたって同時培養したところ、IRで処理されたDCは全て、GM−CSFだけで処理された対照DCよりも未成熟であることを観察した。このことは、細胞表面マーカーCDld、CD40、CD80、CD86、ER−MP58、F4/80、E−cad、およびMHCIIの減少から結論された(図54)。さらに、CD95には中程度の増加が観察された(図54)。対照的に、DCをGM−CSFと共に6日間培養し、7日目に300IU/mlのIR−P、または100mg/mlのIR−U(IR−U、IR−U3〜5、またはIR−U/LMDF)をさらなる24時間にわたり補足した場合には、それらはさらに成熟し、APCのように、よりよく機能することができた。このことは、CDld、CD14、CD40、CD80、CD86、CD95、ER−MP58、F4/80、RB6 8C5、E−cad、およびMHCII細胞表面マーカーの増加から結論された(図55)。
【0145】
アロ−MLRの結果
IRの免疫抑制活性を、たとえば移植目的のために検査するべく、本願発明者らはまた、9週齢のメスのBALB/cからのBM細胞を用いて、前述のようにアロ−MLK(混合リンパ球反応)を行ない、GM−CSF(20ng/ml)およびIR(IR−P、300IU/ml;IR−U、300mg/ml;IR−U3〜5、300mg/ml;IR−U/LMDF、300mg/ml)と共に7日間培養した。7日後、これらのDC細胞を照射し(2,000ラド)、9週齢のメスのC57BL/Lyから単離された脾臓のCD3+細胞と、種々の割合にて同時培養した。培養の最後の16時間の[3H]TdRの取込みにより、T細胞の増殖を測定した。増殖のデータは、IR処理されたDCが、調べた全てのDC対T細胞比において、増殖を阻害することが可能であることを示している(図56)。
【0146】
IR−U/LMDF、IR−P3、IR−A3のアンチショック活性:
精製法2によって得られたIRの低分子分画(IR−U/LMDF)はまたアンチショック活性を有しており(図57)、この分画で処理されたマウスは生き残った。また本願発明者らは、superdex@peputideから入手された3つの全ての分画、IR−P3、およびIR−A3の、アンチショック活性について調べた。この活性のスクリーニング法は、本文書の他の場所に述べらている。本願発明者らの結果は、superdex@peputideから入手された3つの全ての分画およびIR−P3がアンチショック活性を有しており、一方IR−A3は低ないし中程度の活性を有していたことを示した(データは示さず)。
【0147】
方法3による精製
図100は、IR−P試料のマクロスフェア(macrosphere)GPC 60Åのクロマトグラムを示す。
【0148】
3つの選ばれた領域すなわち、見かけ上10kDaより大きい分子量で溶出するIR−P1、見かけ上10kDa〜1kDaの間の分子量で溶出するIR−P2、および見かけ上1kDaより小さい分子量で溶出するIR−P3が分画された。これらの全ての活性は、少なくともアンチショック活性について検査され、それらは全てアンチショック活性を有していた(本文書の他の場所に示されておいる)。
【0149】
図101は、IR−PおよびIR−A試料のマクロスフェア(macrosphere)GPC 60Åのクロマトグラムを示す(500IUの各試料を同一の注入体積にて注射した)。この結果は、IR−P試料中のIR−P3分画に比較して、IR−A分画が多量のIR−A3分画を含むことを示した。本願発明者らは、同量のIR−AおよびIR−P分画について、それらのアンチショック活性を調べた。その結果は、IR−Pに比較して、IR−Aが低ないし中程度のアンチショック活性を有していたことを示した(データは示さず)。
【0150】
方法4による精製:
妊産婦から、その妊娠の第1トリメスターを通じてプールされた尿を入手した。FPLCシステムにおけるFDCカラム上で脱塩し、50mMの重炭酸アンモニウムを溶出緩衝液として用いた後、プールされた低分子分画(LMFD;<5kDa)を凍結乾燥した。当該LMDF試料(13〜17mg)を懸濁し、溶出に水を用いてバイオゲル(Bio-Gel)P−2にかけた。溶出プロフィールは8つの異なるピークに分離され、プールされた分画について、LPSに誘導される敗血症性ショックにおける生物活性を検査した(方法は本文書の他の場所に述べられている)。LPSショックの阻害を基盤とすれば、この活性は分画Ic(“?”)、II、III、VI、およびVIIに局在していた。これらのピークは、40〜45ml(ピークIc「?」)、45〜50ml(ピークIII)、60〜65ml(ピークVI)、および65〜70ml(ピークVII)の間の溶出体積を含む(図97)。
【0151】
IR−P(プレグニル)試料をマクロスフェア(Macrosphere)GPC 60Åカラムにかけ、重炭酸アンモニウムを用いて溶出した。3番目のピーク分画(図100)(IR−P3)をプールし、バイオゲルP−2カラムにかけ、水を用いていくつかのピークに溶出した。LPSショックモデルにおける活性の検査により、当該活性が7〜9時間の溶出の間に位置する分画に局在することが示された(図98)。
【0152】
IR−A(APL)試料をマクロスフェア(Macrosphere)GPC 60Åカラムにかけ、重炭酸アンモニウムを用いて溶出した。3番目のピーク分画(IR−A3)をプールし、バイオゲルP−2カラムにかけ、水を用いていくつかに溶出した。LPSショックモデルにおける活性を検査することにより、当該活性がピーク2、3、および7に局在することが示された。これらのピークは105〜115ml(ピーク2)、115〜120ml(ピーク3)、および160〜180ml(ピーク7)の間の溶出体積を含んでいた(図99)。
【0153】
生体内におけるIRの抗敗血症または敗血症性ショック効果
生存曲線:本実験からの最も著しい結果は、TSST−1およびD−Gal処理に先立ってIR−Pを処理された動物のもの、対、そうでなかったもの、の間のはっきり分かれた差である(図20.)。このことは、本生存実験から得られた生存曲線において明らかである。D−ガラクトサミン感作と組合わされた4μg用量のTSST−1は、32時間までに100%致死であり、TSST−1への露出に先立ってIRを用いて前処理された動物は、致死量の毒性ショックの影響のために死ぬことはなかった。
【0154】
LPS処理されたBalb/cマウスおよびSJLマウスは、LPSに対して異なる感受性を示した。600μgのLPSは、BalbcおよびSJLにおいて各々48時間および36時間までに100%致死であるが、一方IRで前処理されたBalb/cおよびSJLマウスは生き残った。また本願発明者らは、IR−U分画、すなわちIR−U1、IR−U2、IR−U3、およびIR−U3〜5(プールされた)を用いてBalb/cマウスを前処理し、次いでLPSで処理した。これらの実験は、IR−U1およびIR−U2で前処理されたマウスは48時間までに重い病気になったことを示し、それらはLPS群と共に殺された。しかしながらIR−U3〜5で処理されたマウスは生き残った。
【0155】
Balb/cマウスの一群に、LPSの注射の後、700IUのIR−Pを用いて2回処理した。対照群のマウス(LPSのみ)は、その厳しい病気のため48時間の時点で殺された。IR−P処理された生き残りのマウスは、2匹(2/6)を除き、60時間の時点で殺された。
【0156】
疾病の動態:目に見える病気の兆候は、全ての実験動物において明らかであるが、この病気の動態と、明らかな厳しさとは、有意に異なっていた。すなわちIR−Pで前処理されたBalb/cマウス群は、IR−U3〜5で前処理されたマウスに加えて、TSST−1外毒素モデルにおいても(図21)、またLPS内毒素モデルにおいても、疾病レベル2を超えなかった、というように。LPSモデルにおける、IR−Pで前処理されたSJLマウスおよびIR−Pで後処理されたBalb/cマウスは、疾病レベル3を超えなかった。両モデルにおける全てのマウスは、疾病レベル5を超えた時点で殺された。
【0157】
TSST−1におけるショックに誘導される体重の減少: IRの前処理はまた、毒性ショックの生存体の体重減少を有意に誘導する結果となった。本実験からの体重減少のデータは、同等の疾病動態が続いた別の実験からのもの(データは示さず)と結びつけられたが、IRによる前処理のない4μgのTSST−1&D−Gal群の2匹が生存するという結果に終わった(図12.)。
【0158】
この体重減少のデータを、2標本T検定(ミニタブ(Minitab)統計学ソフトウェア、バージョン11.21を使用)を用いて統計学的に分析すると、低いn数にもかかわらず、32および48時間において、体重減少における有意差(P(HO:μ1=μ2)<0.05)が観察され、nが増加すると、有意性がより高くなりそうであることが示される。
【0159】
2標本T検定および信頼区間
32時間における体重減少に関する2標本T
(群1=TSST−1&D−Gal;群2=IR前処理を伴うT&D)
群 平均 標準偏差 標準誤差 平均
1 4 4.75 1.79 0.89
2 6 1.28 2.22 0.91
【0160】
μ1〜μ2の95%CI(信頼区間):(0.45, 6.48)
T検定 μ1=μ2(vs not=): T=2.72 P=0.030 DF=7
【0161】
48時間における体重減少に関する2標本T
(群1=TSST−1&D−Gal;群2=IR前処理を伴うT&D)
群 数 平均 標準偏差 標準誤差 平均
1 3 10.05 2.25 1.3
2 6 3.49 4.41 1.8
【0162】
μ1〜μ2の95%CI:(1.1, 12.0)
T検定 μ1=μ2(vs not=):T=2.95 P=0.026 DF=6
【0163】
WBC(白血球)および血小板の計数:血中の白血球レベル(図23)は、標準マウス(バー#1)およびIR−Pで前処理されたマウス(バー#3)において数えられたWBCカウントに対し、TSST−1およびD−Gal単独の処理では(バー#2)有意に高かった。このことは、予想されたように、致死の毒性ショックを罹患しているマウスにおける、より高いレベルの免疫活性化を示している。IR−P群においてはまだ正常なレベルのWBCが存在しており、このような発見はまた、この群が目に見える厳しい疾病の兆候を示さないため、本願発明者らの他の結果と一致する。
【0164】
血小板のカウント(図24)は、TSST−1 D−Gal処理されたマウスにおいても減じられた。上昇した血小板のカウントは、IR−P処理されたマウスにおいて見られた。
【0165】
移植結果:
移植研究の主要な目的は、同種移植の拒絶反応を抑制するための、そしてさらにより良く、アロ特定の寛容を引き起こすための方法の開発である。この目的のために、動物モデルが広く使用され、そして、皮膚の同種移植の拒絶反応が、妨げるのに最も難しいものの一つであるかも知れないことが明らかになってきた。
【0166】
もしアロ反応性が免疫反応抑制剤により抑制されないならば、MHC―異移植片損失は避けられない。現在、免疫反応抑制のプロトコルは多数の免疫反応抑制剤の組み合わせの使用に基づき、それは、潜在的に拒絶過程の異なった段階を妨げるもので、抗原認識、T細胞サイトカイン産生、サイトカイン活性およびT細胞増殖、マクロファージ、NK細胞および細胞障害性T細胞を含む。試験的設定で、多くの薬剤およびモノクローナル抗体(mAb)が、その免疫反応抑制潜在能力を評価されてきている。これらの中でミゾリビン、RS―61443、15―デオキシスペルグアリン、ブレキナーナトリウムおよびLFA―1,ICAM―1,CD3,CD4およびIL−2Rに対するmAbがある。T細胞、マクロファージおよびNK細胞のような多くの細胞型により産生されるサイトカインは、拒絶過程に影響するかも知れない。移植片拒絶でのそれらの主要な役割の故に、それらが生産するCD4+T細胞およびサイトカインは、同種移植片の拒絶および許容において広く研究されてきた。CD4+Tリンパ球は、そのサイトカイン産生パターンに基づいて、少なくともTh1およびTh2細胞の2つのサブセットに細分できる。Th1細胞はIL―2、IFN―ガンマおよびTNF―ベータを生成するが、遅延型過敏性(DTH)反応および細胞の細胞障害性において役割を果たし、一方Th2細胞はIL―4、IL5,IL―6およびIL―10を産生し、B細胞分化および抗体生成の有効に刺激する。これらの2つのThサブセットはお互いに増殖および機能を調節できる。IFN―ガンマはTh2細胞増殖を阻害し、そしてIL―4効果に拮抗し、IL―10はTh1サイトカイン産生を阻害する。これらの2つのサブセットをまた調節できる調節T細胞の存在に対する徴候がある。移植片拒絶はTh1細胞によって仲介されると思われており、そのことが、DTHおよびCTL活性を刺激するかも知れない。一方では、アロ反応性のTh1細胞の抑制は、移植片許容につながるかも知れない。
【0167】
免疫反応抑制は炎症誘発性のサイトカインを、抗サイトカインmAbまたは溶解性サイトカイン受容体の供給により中和することで達成される。あるいは、T細胞の一つのThサブセットへの分化の「ゆがみ」はサイトカイン環境を変化させることにより達成される。たとえば、IFN―ガンマ(Th1,NK細胞)およびIL―12(マクロファージ、B細胞)がTh1細胞分化を促進し、IL―4(Th2)がTh2細胞の発達を向上する。抗サイトカインmAbまたはサイトカインによって生体内サイトカイン環境を変えることが同様な効果を持つかも知れない。さらにTh3およびTr1のような、かつDC1およびDC2のような調節細胞の誘発は、また移植の拒絶を減じ、かつ移植片の寛容を引き起こす。
【0168】
結果: BALB/cレシピエントのIR―Pによる治療は、未治療の対照群に比べてC57BL/6皮膚移植生存を延長した。IR―P治療のレシピエントが移植後22日間まで移植片を延長することができたのに対し(図96)、対照レシピエントは12日間の間に皮膚移植片を拒絶した(図95)。図95および96は、1つのIR―P治療によるそのような延長された移植片(19日に撮られた写真)および対照マウスからの拒絶された移植片を示す。
【0169】
EAE結果:
PBSで治療されたマウスは、最初の3週間の間ただ体重が減っただけであった(図77)。全実験中に、疾病に耐性を存続した一匹のマウスを除いて、これらのマウスは、全て少なくとも2匹のEAE臨床治療の徴候があり、そして、より長い疾病の持続期間を示した(図78)。IR治療のマウス群中、実験中観察された体重減少はより少なく(図79)、かつ2匹のマウスが実験中疾病にかからなかった。この群の病気のマウスは最大の臨床得点が2であり、そして疾病の持続期間は短く、PBS治療群よりもEAEの症状からより早く回復した(図80)。
【0170】
ショックの結果
IR治療のマウスはLPS誘起のショックに耐性がある。すなわちIR治療のマウスに対する高用量のLPS治療の効果を測定するために、BALB/cマウス(n=30)がLPSで腹腔内注射され、生存は5日間評価された。PBS治療のBALB/cマウスは、高用量のLPS注射後1日〜2日の間ショックに屈し、5日目にはただ10%のマウスのみ生存した。対照的に、IR―PもしくはそのIR―P1またはIR―P3分画で治療されたマウスは5日目に100%生存した(P<0.001)(図58)、一方、IR―P2、IR―Aおよびデキサメサゾン治療のマウスは約70%の生存を実証した(図58)。
血液検査:ショックでのLPSに対する全身の反応の主な症状は、器官における重症の炎症であり、器官不全または器官系機能不全につながり、最初は肝臓で起こる。したがって、本願発明者らはWBCおよび血小板と同様に、ALAT、ASAT、LDH1のような酵素を測定した。図59はIR―A、IR―PおよびそのIR―P1、IR―P3分画で、全血小板数が正常範囲(100〜300×109/ml)で、一方対照ではIR―P2およびデキサメサゾン治療のマウスで、全血小板数が正常範囲より低いことを示す。図60〜図62は、IR―A、IR―PまたはそのIR―P1、IR―P2またはIR―P3分画で治療されたマウスが、対照およびデキサメサゾン治療のマウスと比べて、血漿中で比較的低いレベルのALAT、LDH1およびASAT酵素を有することを示す。これらの酵素は、器官の損傷によって、ショックの間血液中により高い濃度で存在した。これらの結果は本願発明者らの生存結果と一致する(図58)。加えて、ショックの間、その炎症の場所の転移により、血液中に低い数のWBCが見いだされた。図63の本願発明者らの結果は、IR―A、IR―Pおよびその分画で治療されたマウスは、対照およびデキサメサゾン治療のマウスよりもt=48時間でWBCの適度の正常レベルを持ち、IR治療マウスにおいてより弱い炎症の反応を示唆する。
【0171】
生体外NOD/LTJ結果:
図64は、rhCGとの組合せでIR―PまたはIR―P3で治療された、NODマウスから分離されたCD4+細胞でのTh1分極アッセイにおけるIFN−ガンマ産生の阻害を示し、一方、rhCGおよびIR―P3単独によるTh1分極で適度な阻害が見いだされた。これは、rhCGがTh1サブセットを最大に阻害するので、IR―P3分画がrhCGを必要とすることを示唆する。
【0172】
図65はPBS治療のマウスと比べて、rhCGと組合せてIR―P、IR―P1、IR―P2またはIR―P3で治療されたNODマウスから得られた、抗CD3刺激脾臓細胞におけるIFN−ガンマ産生の阻害を示す。rhCGおよびIR―P3は、単独では組合せた場合と同じ効果を持たない。これは、IR―P3分画が、rhCGのIFN−ガンマ阻害の理由でrhCGを必要とすることを再び示唆する。
【0173】
図66は、rhCGと組合せてIR―P、その分画、rhCGまたはIR―P3で治療されたNODマウスから得られた脾臓細胞の異なる時点(t=12,24,48時)での抗CD3刺激増殖を示す。再び結果は、前のIFN−ガンマ阻害(図65)と一致する。ここで、IR―P3分画はまた、生体内治療されたNODマウスからの脾臓細胞の抗CD3誘起増殖に対する阻害効果の理由で、rhCGを必要とする。
【0174】
図67は、IR―Pおよびその分画が、PBS治療のマウスと比べて、治療NODマウスからの抗CD3刺激脾臓細胞のIL―10産生を促進することを示す。
【0175】
図68は、IgG2a産生が、NODマウスのIR―P2またはrhCGによる生体内治療により阻害されないことを示し、一方、IR―P、IR―P1、IR―P3およびrhCGと組合せたIR―P3がIgG2a産生を阻害することを示す。rhCGと組合せたIR―P3はIR―Pと同じ特性を有するので、この組合せが、また妊娠の誘発、IVF、流産の予防または関連した問題のために使用されると考えられる。
【0176】
STZモデル
糖尿病Iの病因の決定的なことは、インスリン産生膵臓ベータ細胞の破壊である。ベータ細胞塊の進行する減少は、慢性の自己免疫反応の結果であるという強い証拠がある。この過程の間、ランゲルハンス島内侵入免疫細胞、ランゲルハンス島内毛細血管内皮の細胞およびベータ細胞そのものが、細胞障害性の伝達物質を放出することができる。サイトカイン、および特に窒素酸化物(NO)は、ベータ細胞に影響を及ぼす有毒なエフェクター分子である。反応性のNOラジカルは、主に、広範囲のDNAストランド切断誘発を介して、その有害な効果を仲介する。この初期の損傷はおそらく一連の出来事を引き起こし、それはベータ細胞の死で終わる。
【0177】
げっ歯動物に引き起こされる、ベータ細胞毒ストレプトゾトシン(SZ)による糖尿病は、膵臓のベータ細胞の破壊に関係する機構を研究するために、動物モデルとして広範囲に渡って用いられる。SZはグルコース輸送体GLUT―2を介して膵臓ベータ細胞により利用される。この薬剤は細胞内で分解し、そしてアルキル化またはNOの生成のいずれかによってDNAに損傷を起こす。DNAストランド破壊の出現は、大量の細胞核の酵素ポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼ(PARP)の活性化につながり、それはNAD+を基質として大量の(ADP−リボース)ポリマーを合成する。PARP活性化の結果として、NAD+の細胞性の濃度はそこで非常に低いレベルまで減じ、それで、細胞に十分なエネルギーを起こす能力がなくなると考えられ、そして最後には細胞を死に導く。
【0178】
反応性のラジカルはまた、腎障害、閉塞性腎障害、急性および慢性の腎性同種移植片の拒絶反応、(SLE、関節リウマチ、糖尿病、MSのような)自己免疫性疾患、AIDS、血管形成に関する疾患、アテローム性動脈硬化症、血栓症およびII型真性糖尿病のような多くの疾患の病因において重要な役割を果たす。たとえば、最近増加したDNA塩基への酸化損傷が、II型真性糖尿病の患者に見られ、それが病因および糖尿病の合併症に寄与する。本願発明者らは、IRがまたSTZ誘発糖尿病の誘発を遅らせる能力を有するかどうか、そしてまた細胞反応性ラジカル形成および防御への効果を有するかどうかを試験した。
【0179】
HD―STZモデルにおいて、糖尿病の誘発は、PARPの誘発活性化による膵臓の細胞組織の、ベータ細胞への直接の効果による。結果として、NAD+の減少および細胞に十分なエネルギーを起こす能力がなくなることが、最後には細胞を死に導く。このことは、どの免疫の成分もこの過程に含まれないことを示唆する。比較すると、MD―STZモデルには、強い免疫成分が存在する。図69および図70は、IR―P治療が両方のモデルにおいて、糖尿病の誘発を遅らせられることを示す。この遅れの背後の機構はおそらく異なる性質のものである。
【0180】
ヒトの研究
免疫系は、多種多様の多数の微生物に応答するにもかかわらず、そしてその自己抗原への不断の暴露にもかかわらず、平衡状態を保つ顕著な能力を持つ。外から侵入した抗原に生産的な応答をした後に、免疫系は休息の状態に戻り、それでリンパ球の数と機能状態は、おおよそ予備免疫のレベルにリセットされる。この過程は恒常性と呼ばれ、そしてそれは免疫系を新しい抗原性の挑戦に効果的に応答させる。生成的なリンパ系器官から新しく移出するものが、常在の細胞とともに「スペース」と競合するように、予備免疫のリンパ球分集団のサイズおよびレパートリーは、また綿密に制御される。
【0181】
自己抗原を認識する能力のある受容体を伴うリンパ球は、常に生成され、しかし正常な個々は、その自己の抗原に応答しない状態を維持し、これは自己寛容と呼ばれる。
【0182】
自己免疫疾患において、免疫系が不適切に「自己」を認識し、それが、病理の体液および/または細胞の免疫反応につながる。正常な、非自己免疫状態において、自己反応性リンパ球が、削除されるかまたは末梢の自己リガンドに非応答とされる。潜在的に自己反応性の細胞の集団は実証できるが、それらがリガンドへ自己免疫反応を起こすようにはみえない。もし、T細胞受容体(TCR)相互作用が退化され、T細胞はリガンド(1、2)の相違により活性化できるならば、自己免疫疾患の状況は、これらの自己反応性の細胞が分子模倣を介して活性化されることで明らかになる。適当な条件下で自己反応T細胞の活性化が、サイトカインの誘発および特定の同時刺激分子(たとえば、CD80/CD86およびCD40)の上方制御により促進され、自己免疫につながるという証拠がある。
【0183】
免疫系が、自己組織を非自己と間違え、そして不適当な攻撃を組み込む
とき、結果は自己免疫疾患となる。多くの自己免疫疾患がある。いくつかの例は、ウェゲナー肉芽腫症、多発性硬化症、1型真性糖尿病、および関節リウマチである。更に、感染症もまた免疫疾患の誘発につながる免疫応答を誘発でき、一方、感染症そのものは宿主には危険ではない。たとえば、結核での結核菌の役割であり、そこで免疫系が結核菌に積極的に反応し、炎症性の病気となり自己の免疫反応による組織破壊となる。同様なことが、また、たとえばらい菌に対しても事実である。
【0184】
自己免疫疾患は異なる方法で体にそれぞれ影響することができる。たとえば、自己免疫反応は、多発性硬化症では脳に、そしてクローン病では内臓に向けられる。他のシェーグレン病および全身性ループスエリテマトーデス(ループス;SLE)のような自己免疫疾患では、影響された組織や器官は同じ病気で個々の間で変化するかも知れない。多くの自己免疫疾患はまれである。集団的に、しかしながら、それらは西洋社会で多くの人々をひどく苦しめる。
【0185】
多くの自己免疫疾患が男性よりも女性において、より一般的である。性的二型性は自己免疫疾患の広範囲をカバーし、器官特異(グレーブス病のような)から一般化されたSLEまでを範囲とする。MSでは、メス―オス優勢近似で2:1〜3:1である。MSおよび他の自己免疫疾患での性の偏りの理由は、明らかでないが、多くは感染症への免疫応答での性関連相違としての要素、性ステロイド効果および性連鎖の遺伝要素を含む。MS、シェーングレン、SLE、およびRAは異なる疾患で、病因論においておそらく異なることが認められる。
【0186】
しかしながら、共通に関連することは、女性におけるこれらの疾患の圧倒的な罹患率である。これらの疾患のそれぞれが自己免疫であり、性ホルモンおよび性別の効果が同様かも知れないことの考慮は、これらの疾患の比較を有用にする。自己免疫疾患は女性を特に労働年齢および出産可能な年齢に襲う。しかしながら、これらの臨床経過は、妊娠中は驚くほど厳しさが減るか、またはまさに寛解がみられる。
【0187】
妊娠中、女性は、細胞仲介の免疫の弱化(Th1応答)および体液免疫の或る成分の強化(Th2応答)と一致する免疫的な変化を受ける。妊娠中の母体系による、このTh2が偏った類似の応答は、一時的な免疫抑制または免疫調節の状態を導入し、これが胎児への母の拒絶応答の抑制となり、しかし母の感染への耐性を維持またはまさに増加する。加えて、いくつかの自己免疫疾患への減少した罹患率、特にTh1細胞仲介の免疫疾患がまた観測されてきた。たとえば、関節リウマチ(顕著にTh1細胞が仲介する自己免疫疾患)の女性のおよそ77%が、妊娠中症状の一時的な寛解を経験し、それは大多数の場合第1トリメスターから現れる。したがって、Th1細胞仲介の自己免疫疾患における妊娠中の臨床の改善は、おそらく初期妊娠中の生理的な免疫変化に関係するはずである。
【0188】
本願発明者らのIRはNODおよびEAEのような動物モデルにおける自己免疫疾患の発生を阻害できるので、本願発明者らは免疫疾患の数人の患者を治療した。全患者は、手に負えない疾患のために、インフォームドコンセントの後に治療された。
【0189】
患者1:ウェゲナー肉芽腫症
ウェゲナー肉芽腫症は、男性および女性の両方に影響を与える自己免疫血管性の疾患であり、中年の人により一般的であるが、どの年齢の人にも影響を与える。初期の症状は、慢性で進行性の炎症を伴う上部および下部の気道に関係する。炎症は組織または皮膚における塊または肉芽腫を形成するかも知れない。それは血管の一般的な炎症(血管炎)および腎臓の炎症(糸状腎炎)に進行するかも知れない。腎臓に関係しない、限られた形の疾患が起こるかも知れない。
【0190】
血管炎は小さいおよび中くらいのサイズの血管壁における自己免疫反応の結果である。慢性の血管炎は、血管の中で狭小化を起こし、そして組織への血液の流れの障害という結果となる。この状態は組織に損傷を起こすかも知れない(壊死)。
【0191】
自己免疫疾患は、これらの反応が、自己反応抗原の産生によって体自身の細胞および組織に対して不可解に生じるとき起こる。ウェゲナー肉芽腫症で、抗原は或る白血球の細胞質中の成分に進む。ウェゲナー肉芽腫症の原因は知られていない。疾患は感染症の過程に類似しているが、原因となる物質は単離されていない。患者の大多数に抗好中球細胞質抗体(ANCA)が見いだされ、そのレベルは疾患の活性度に関連するように見える。ウェゲナー肉芽腫症は、特にヨーロッパや有色人種(アフリカ人、南アメリカ人、アジア人)には、極めてまれな疾患である。患者の実際の数は知られていないが、おおよその見積もりで、年間100万人のアメリカ人当たり新しく2例、またはアメリカ合衆国で毎年約500の診断された実例である。疾患はどの年齢でも起きるが、人生の4番目または5番目の十年間にそのピークがある。
【0192】
男性および女性に同様に影響する。
患者の85%が19才より上である。
【0193】
患者の平均年齢は41才である(最新の年齢範囲は5〜91才である)。
全患者の97%が白人系、2%が黒人および1%が他の人種である。
【0194】
ウェゲナー肉芽腫症の症状、およびこれらの症状の厳しさは一人の患者と別の患者で異なるが、ほとんどの患者が最初に上部気道に症状を認める。疾患の共通の症状は、しつこい鼻漏(鼻水の出る鼻)、または他の、標準の治療では効き目を示さずそして進行して悪化する、風邪の様な症状である。
【0195】
鼻漏は、副鼻腔洞ドレナージの結果であり、そして呼吸器の障害や痛みを引き起こせる。病訴は、鼻からの漏出、副鼻腔炎、鼻膜潰瘍および外皮形成、聴力の問題を伴う耳の炎症、咳、喀血および胸膜炎(肺の内面の炎症)を含む。他の初期の症状は、熱、疲労、倦怠感(不快感)、食欲減退、体重減少、関節痛、寝汗、尿の色の変化、脱力感を含む。ほとんどのウェゲナー肉芽腫症の患者は、上記の全ての症状を経験するわけではなく、疾患の厳しさはそれぞれの患者で異なる。ときどき副鼻腔中の微生物感染からの結果として、熱はしばしば出る。患者の三分の一は、疾患の発症において症状がないかも知れない。
【0196】
臨床検査はウェゲナー肉芽腫症に対して明確なものではなく、ただ患者が炎症疾患を持つことを示唆する。血液検査はしばしば貧血(低い赤血球数)および他の血液中の変化を示す。胸部X線および腎臓生検は、ウェゲナー肉芽腫症診断に使用される手段として重要である。効果のある治療にとって早期診断は重要である。無症候の患者は、ANCA血液検査ならびに副鼻腔および肺のCTスキャンにより診断される。ウェゲナー肉芽腫症の診断をするのに、平均で5〜15ヶ月かかる。全診断の40%が3ヶ月以内に行われ、10%が5〜15年以内に行われる。
【0197】
他の診断手段は次の通りである。
赤血球沈降速度は一般的に上昇する。
【0198】
完全な血液数はしばしば貧血、上昇した白血球数、上昇した血小板数を示す。
尿検査はしばしば腎臓関与のスクリーニング検査として考慮される。
【0199】
24時間の尿の堆積が、或る患者に腎臓機能の評価するために用いられる。
c―ANCAは特徴的であり、プロテイナーゼー3抗体を測定する。
【0200】
IR−Pによる患者1の初期治療結果
患者は、手に負えない疾患のために、インフォームドコンセントの後に治療された。
【0201】
診断:副鼻腔に関する組織病理学に基づくウェゲナー肉芽腫症およびcANCA試験。
実例:5年間再発性のウェゲナー肉芽腫症と知られた34才の男性患者。この患者は高用量のステロイド、シクロスポリン(5mg/kg)およびシクロフォスファミド(1−2mg/kg)の治療を受けた。1998年7月に進行性の疾患のために、IR(プレグニル)の治療を毎日5000I.U,s.c.受けた。
【0202】
図81はIR治療の前、患者は高い投与量のステロイドの故に免疫不全であったことを示す。IR治療の後Tリンパ球(CD4,CD8)のレベルは増加し、B細胞を除き正常範囲であった。本願発明者らはまたIR治療中かから得られた、LPSおよびPMA/Ca刺激PBMC中のサイトカインを測定した。本願発明者らは、LPS刺激PBMCが治療中TNF−アルファ、IL―10およびIL―12をより多く産生し(図82a)、一方、PMA/Ca刺激PBMCはより少なくIFN−ガンマを産生すること(図82b)を観測した。それでここで、本願発明者らは、IR治療は抗炎症サイトカイン(IL―10、TNF)の産生を増し、一方炎症サイトカイン(IFN−ガンマ)の産生を減じることを示す。これは本願発明者らの治療の3ヶ月間、副鼻腔に関する炎症活性により測定された通り、更なる進行は観測されず、臨床観察と一致する。これらの結果はIR−Pの有益な効果を示唆する。
【0203】
患者2:多発性筋炎
定義:全身性結合的組織疾患で、T細胞仲介の筋線維の破壊を起こす炎症を通して起こる。これらの症候群の、他の可能性のある原因は、補体活性、感染、薬剤、ストレス、ワクチンを含む。それは人々にどの年齢にも影響するが、ほとんど一般に50〜70才の間の人々、または5〜15才の間の子供に起こる。それは男性よりも女性に2倍影響する。筋衰弱が突然に、または週または月に渡ってゆっくりと起こる。頭の上に腕を上げること、座る位置からの起立、または階段を上ることが難しくなるだろう。声が、喉頭の衰弱により影響されるだろう。関節痛、心臓の炎症、そして肺の(肺)疾患が起こる。皮膚筋炎と呼ばれる同様な状態が、暗く赤い発疹が、顔、首、肩、胸上部、および背に現れるとき明らかである。悪性腫瘍がこの疾患と関係する。多発性筋炎の出現率は、10,000人の人々について5人である。
【0204】
患者2:診断:全身性硬化症/多発性筋炎 重複(組織病理学に基づいた)。 実例:50才の女性で2年間、活性多発性筋炎構成要素を伴う全身性硬化症にかかっている。彼女はダプソン、ステロイド、メトトレキセートおよびシクロスポリンで治療された。クレアチン燐酸により測定された、手に負えない筋炎の故に、3ヶ月間プレドンゾン、ジルテックおよびプレグニル5000I.U.,s.c.の組合せで治療された。治療中、CPKレベルは1100から750に下がった。これは疾患活性における減少を反映する。
【0205】
図83はIR−P治療のために、リンパ球、T細胞(CD4、CD8)およびB細胞の数が減少することを示し、これは、治療による機能亢進免疫系の下方制御を示す。これは本願発明者らのサイトカインのデータ(図86)と一致し、このデータはLPS刺激IL―12およびTNFアルファのPBMCによる阻害を示す。更に、治療中IL―10産生での増加があり、これは抗炎症サイトカインである(図86)。加えて、上昇したCPKおよび肝臓酵素(ASAT、ALAT)が、また減少した(図84および85)。これは全ては疾患の活性での減少を反映する。
【0206】
患者3:真性糖尿病(I型)
真性糖尿病は、グルコースおよび他のエネルギー産生燃料の減じられた代謝に特徴のある慢性疾患であり、加えて血管性および神経障害性の合併症が遅れて発現する。真性糖尿病は、高血糖症を伴う顕著な病原性の機構を共通の特徴として含む疾患の群からなる。原因にかかわらず、疾患はインスリン欠乏に関係し、それは、共存インスリン耐性の含有量の点でみたときに、全部、部分的、または相対的であろう。インスリンの欠乏は、糖尿病、そして高血糖症につながる代謝の混乱において、主な役割を果たし、その結果疾患の合併症において鍵となる役割を果たす。アメリカ合衆国で真性糖尿病は、医者と接する患者に対して最も一般的な理由の四番目であり、早発の障害および死亡率の主な原因である。それは労働年齢の人々の間で、失明、最後の段階での腎臓疾患、そして非外傷性の肢切断の主な原因である。それは、心臓、脳、および末梢神経の疾病率および死亡率の危険を増す。明るい面では、最近のデータは、疾病のほとんどの衰弱させる合併症が、高血糖症および心血管の危険要素の前向きな治療により妨げられるかまたは遅らせられることを示す。
【0207】
インスリン依存真性糖尿病(IDDM)は、臨床的に規定された糖尿病の型の一つであり、顕著に子供および若年成人に発現するが、全ての年齢群に現れるだろう。主なIDDMへの遺伝的感受性は、HLA複合体に染色体6上でつながる。これらの遺伝的背景は、ベータ細胞破壊につながる免疫仲介過程を開始するために、環境因子(おそらく或るウイルス、食物および気候)と相互に作用する。一方、非インスリン依存糖尿病(NIDDM)は、臨床的に規定された別の糖尿病の型であるが、糖尿病の最も一般的な形である。NIDDMの罹患率は、母集団によって非常に変化する。最も大きな割合はピマインディアンに見いだされる。この形の糖尿病に寄与すると認められる主な環境因子は、肥満症および身体活動である。NIDDMは、全ての母集団で強い家族性集合体を示し、明らかに遺伝的感受性および環境因子間の相互作用の結果である。NIDDMが発現する前に、インスリン濃度は、糖血症および肥満症の程度に対して高く、インスリン耐性の存在を反映する。インスリン耐性が悪くなると、グルコースレベルは増加し、グルコース不耐性の出現を伴い、最後に、インスリン応答がインスリン耐性を補えないとき、NIDDMの出現を伴う。
【0208】
本願発明者らの予備のマウスデータは、IRがTh1表現型サイトカインをTh2表現型にシフトする能力を持ち、そしてIRはまたNODマウスで糖尿病を阻害でき、本願発明者らは、それがまた糖尿病のような人免疫疾患に積極的な臨床効果を持つべきであるとみなした。
【0209】
患者3:診断:真性糖尿病I型
実例:患者は21才の男性で3ヶ月前から真性糖尿病にかかっている。彼はインスリン(アクトラピッドおよびインスラタード)で治療された。抗―島細胞抗体の高いレベルが彼の血液にあった。彼はプレグニル5000I.U.s.c.で3ヶ月治療された。彼の治療の間インスリンは図87に示すように、減少した正常血糖を維持する必要がある。プレグニルの中止後、彼のインスリンは再び上昇する必要がある(図87)。この新しく真性糖尿病を発症した患者において、インスリンはIR―Pの治療中、有意に下がる必要があり、そしてまたグルコース調節の改善が見いだされ、これは、IR―P治療中グリコシル化HbAlcレベル(図87)での減少およびLPS刺激PBMCにより産生された(図88)炎症サイトカイン(IL12、TNFアルファ、IFN−ガンマ)での減少により支持される。更に、IL―10の増加(抗炎症サイトカイン)が、また治療中観測された(図88)。これらすべては、島細胞機能の改善および、最終的には、またより良いグルコース制御を示唆する。
【0210】
多発性硬化症と関連状態(管内データ)
多発性硬化症(MS)は未知の原因の疾患であり、臨床的には特徴的な症状、兆候および進行によって、病理学的には散乱した炎症領域および脳、視神経および脊髄の髄鞘脱落によって定義される。MSの最初の症状は、もっとも一般的には15歳から50歳の間で現れる。
【0211】
MSの原因は未知であるが、しかし病因には免疫仲介炎症髄鞘脱落が含まれることが広く信じられている。MSの脳の病理学的試験では、リンパ球および単球による免疫病理学的過程脈管周囲浸潤、病巣での細胞によるクラスIIMHC抗原発現、活性化した免疫細胞によって分泌されたリンホカインおよびモノカインの顕著な特徴および感染の明白な証拠の欠失を示す。
【0212】
自己免疫病原についてのさらなる証拠には、(1)MS患者の血液および脳脊髄液(CSF)での免疫学的異常、著しい選択的鞘内液免疫活性化、リンパ球サブセット異常、および血中およびCFS中の高頻度の活性化リンパ球、(2)MSと特定のMHCクラスIIアロタイプ間の結合、(3)MS患者の、免疫抑制剤で改善される傾向にあり、免疫応答を刺激するインターフェロン−ガンマ処置で悪化する免疫調節に対する臨床的応答、(4)MSおよび実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)、すなわち炎症髄鞘脱落の再発性症状発現が、ミエリン基礎タンパク質またはプロテオリピドタンパク質を感受性動物に接種することで誘導できるような動物モデルの間の著しい相同性が含まれる。
【0213】
疫学的研究は、MSの病理学での環境および遺伝的因子を提案している。疾患の一定ではない地理的分布および様々な時点−原因の流行は、環境因子を提示してきたが、しかしながら、過去30年間にわたる真剣な研究では、感染原因を確立し得なかった。移動研究は、青年期より前での定義されていない環境因子の暴露がMSの引き続く発達に必要であることを示した。遺伝的影響は、二卵性双生児と比較した一卵性での過剰な一致、家族でのMSの集積化、リスクの人種変動およびクラスIIMHCアロタイプとの関連によってよく確立されている。カフカス人では、HLAクラスIIハプロタイプDR15、DQ6、Dw2がMSのリスクの増加に関連して強くそして一定に現れる。
【0214】
免疫学的、疫学的、および遺伝的な証拠は、遺伝的に感受性の個体の幼児期の間の環境因子への暴露(おそらく任意の多くの共通ウイルス)が結局免疫仲介炎症髄鞘脱落を引き起こす可能性があるという考えを支持する。遺伝的な、環境のそして免疫学的な因子と、環境の引き金の特性の間の正確な相互作用は解決すべきままである。本願発明者らはMS患者よりPBMCを単離し、これらをLPSまたはPMA/Caで刺激した。24時間培養後、サイトカイン分析のために上清を回収した(TGF−ベータ、IL−10、IFN−ガンマ)。
【0215】
MS患者1(管内):IR−Pで処理したLPS刺激PBMCでTGF−ベータおよびIL−10の産生の増加があった(図HおよびI)。PMA/Caによって刺激し、IR−Pによって処理した培養でのTGF−ベータおよびIL−10産生に違いは観察されず(図89および90)、一方IR−PはPMA/Ca刺激PBMCでのIFN−ガンマの産生を阻害した(図91)。
【0216】
MS患者2(管内):患者2より入手したPBMCは、TPA/Ca刺激のみと比較してIR−Pで処理した培養においてTGF−ベータおよびIFN−ガンマの産生の減少を示し、一方IR−P処理はLPS刺激TGF−ベータ産生を増加させた(図92および93)。IL−10産生はLPSおよびTPA/Ca刺激培養両方でIR−Pによって阻害された(図94)。
【0217】
管内でのMS患者からのPBMCによる抗炎症サイトカインの産生におけるIR−Pの刺激効果と、炎症サイトカインの産生における阻害効果は、EAEが誘導されるSJLマウスのIR−P処理の有益な臨床効果と関連がある(本文章の他の部分を参照のこと)。
【0218】
ヒト気管支上皮細胞株BEAS 2B(喘息管内データ)
気管炎症によって特徴づけられる疾患は集団の実質的な割合に影響を及ぼす。これらの疾病には喘息および慢性閉塞性肺疾患(COPD)が含まれる。欧州連合においては、COPDと喘息とは、肺炎とともに死因の第3位である。刺激物、感染薬剤および炎症伝達物質への応答でのサイトカインと成長因子との産生は、急性および慢性気管炎症の開始、永続および阻害に重要な役割を演じる。
【0219】
気管炎症は気管の炎症細胞および内在細胞より放出される様々な伝達物質およびサイトカインの過剰な産生と活性化に関連する。ここで上皮は炎症の伝達物質の主要な標的であるだけでなく、それ自身炎症過程への活性のある関連物であることが明らかである。気管支上皮細胞は化学誘引物質の放出を介して気管へ炎症細胞を補充することができ、細胞接着分子の発現を介して上皮を横切る炎症細胞移動を管理でき、そしてサイトカイン、ケモカイン、アラキドン酸代謝産物ならびに弛緩因子および収縮因子などの伝達物質の放出を介して他の細胞の炎症活性を調節できる。
【0220】
気管支上皮細胞は受動的バリアを形成するだけでなく、免疫応答に活発な役割を担ってもいる。これらは炎症促進または抗炎症のいずれかで働くであろう様々な伝達物質を産生できる。さらに、気管支上皮細胞は多くの異なる細胞型に対する接着分子を発現してよく、したがってそれらの漸増に貢献する。
【0221】
気管に存在する炎症細胞から産生されるTNF−アルファはRANTESおよびIL−6のような他の炎症サイトカインおよびケモカインを誘発させることができる。また抗炎症サイトカインの産生をダウンレギュレートでき、したがって上皮細胞の保護機能に損害を与えうる。グルココルチコイドは、IL−6、RANTES、IL−4を含む、喘息に関連するほとんどのサイトカインおよびケモカインの転写を阻害する。この阻害は少なくとも特にグルココルチコイドの治療的効果に対して反応性である。
【0222】
本願発明者らの結果(図71〜図73)は、これらの発見と一致し、デキサメタゾンがBEAS 2B細胞株でのIL−6およびRANTES産生を誘導するTNF−アルファを阻害できることを示している。さらに、デキサメタゾンは抗炎症TGF−ベータサイトカインのダウンレギュレーションを誘導するTNF−アルファを回復させることができ、一方IR−PはTGF−ベータ産生を回復させるだけでなく、この抗炎症サイトカインをさらに増進させる(図73)。さらに、デキサメタゾンおよびIR−Pは両方ともRANTESの産生を誘導するIFN−ガンマを抑制できる(図74)。
【0223】
TNF−アルファはまた、そこで炎症細胞を補充する上皮細胞の表面上にHLA−DRおよびICAM−1などの細胞接着マーカーを誘導できる。この場合、上皮細胞はまた抗原提示細胞(APC)としても機能できる。本願発明者らの結果は、デキサメタゾンとIR−P両方がHLA−DRおよびICAM−1の発現を誘導するTNF−アルファをダウンレギュレートできたことを示している(図75および76)。これらの結果はIR−Pがまたアレルギー、喘息および特定の寄生虫性疾患のようなTh2−型サイトカイン表現型によって特徴づけられる疾患の臨床的進行に影響を与える能力を有することを示している。
【0224】
考察
ノノース糖尿病(NOD)マウスはもともとヒトIDDM患者に対する免疫病理学および臨床症状との明らかな類似性を持つインスリン依存糖尿病を進展させる。結果として、NODマウスは、IDDMの潜在する免疫生物学およびそれを制御する複雑な遺伝学を研究するための貴重なツールとなってきた。これらの研究を通して、本願発明者らは現在、糖尿病がTh1/Th2サブセットの比の不釣り合いおよびその結果インスリン産生β細胞の破壊に起因することを知っている。この破壊はIFN−γ、TNF−α/βおよびIL−1のような前炎症サイトカインを産生するβ−細胞抗原特異的CD4+ T細胞によっておこる。研究数の増加が現在糖尿病を(マウスおよびヒトの)Th1類似細胞の選択的分化と関連させている。
【0225】
対照的に、妊娠は選択的Th2現象であると考えられており、驚くべきことに妊娠中、多くの免疫仲介疾患の厳しさが減少してみられた。対照的にGallo et al.は、第一トリミスター妊娠で存在するhCG仲介因子(HAF)が抗腫瘍(および抗ウイルス)効果をもち、これはおそらく腫瘍細胞上での直接的な細胞傷害性効果によって、しかしこれらの著者によると免疫仲介応答によってではなく行われる。
【0226】
ここで本願発明者らは、たとえば(第一トリメスター)妊娠の尿から入手可能な免疫レギュレータは、妊娠中の上述した免疫異常に影響を与えるだけでなく、NODマウスでの糖尿病の発展にも影響を及ぼす。
【0227】
本願発明者らの結果はたとえば第一トリメスター妊娠の尿からの部分的に精製したhCG調製品であるPregnylは、たとえば4週間の間1週間に3回のみ処置した場合に15週齢NODで、糖尿病の開始を遅延できることを示めす。さらに、これらの転送にて処置したマウスから単離した脾臓細胞はまた、免疫無防備状態NOD.scidマウスでの糖尿病の開始を遅延させる可能性がある。本願発明者らはこの坑糖尿病活性がhCGそれ自身、そのサブユニット、β−コア(β−hCGの天然に壊れた産生物)に、または同定されていない因子(HAF)に存在しているかどうかを査定するためにPregnyl調製品を分別した。Pregnylは入手可能な最も精製されたhCG調製品の1つであり、少量のβ−コア断片のみを含むということが充分わかっている。本願発明者らはほとんどの坑糖尿病活性がhCGのない分画に存在することを発見した。さらに本願発明者らはヒト組換え体α−hCGおよびβ−hCGも何の効果を持たないことを示した。しかしながら、本願発明者らはhCGが糖尿病および他の免疫仲介疾患での他の因子と相乗作用を示すことができる可能性を無視していない。
【0228】
NODマウスの膵臓でのインスリンおよび浸潤の存在の免疫組織学的解析は、600 IU Pregnylで処置したNODマウスが明らかな浸潤を示してはいなかったことを明らかにした。さらに、新規インスリン小島が膵臓でみられ、これはこの処置によって誘導された可能性のある再生工程を示している。以前に言及したように、通常9週齢時に浸潤している細胞が小島に浸透し、この小島がリンパ球で膨張する。本願発明者らの実験において、NODマウスは15週齢であって、PBS処置対照マウスはその時その膵臓で多くの浸潤細胞をもち、ほとんどがインスリン産生細胞ではない。さらに、PBS処置マウスではまたその脾臓においてCD8/CD4の比が上昇し、その膵臓で多くのT細胞を持つ。本願発明者らの処置したマウスはその脾臓で正常のCD8/CD4比を持ち、その膵臓で浸潤は見つからないので、CD8/CD4比の上昇は、膵臓内へのCD4+の選択的増加によるものであった。IFN−γおよびTNF−αはTリンパ球の増加に関与する(Rosenberg et al. 1998)。
【0229】
本願発明者らの結果は、NODマウスの600 IU Pregnylによる4週間の処置が、その他の炎症のおこった膵臓の形態および機能に劇的な効果を持つことを示す。さらに本研究者らの300 IU Pregnyl NODマウスは処置なしで28週齢まで生存し、糖尿病のないままであった。600 IU Pregnyl NODマウスをまたシェーグレン病のような一般化された自己免疫疾患の症状について試験したが、みられなかった。
【0230】
NODの全脾臓細胞および精製したCD4+細胞を用いた本願発明者らのin vitroでの試験はin vivoデータと一致した。in vitroでPregnyl、F3−5によって処置し、より小さな範囲ヒト組換え体β−hCGで処置したNODマウスからの脾臓細胞によって放出されたIFN−γ、IL−1およびTNF−α放出の明らかな阻害があった(データは示していない)。IL−4産生の増加も観察され、この処置でのTh1のTh2型応答への変動を示している。800 IU Pregnyl以上の投与量は反対の結果を引き起こし、多量のhCGそれ自身の存在によるのであろう。
【0231】
免疫系は明らかに糖尿病の開始に関与する。Pregnylでの処置は免疫系に影響を及ぼし、したがってNODマウスでの疾患活性を減少させうる。Pregnylの有用な臨床効果からその免疫調節活性を分離するために、本願発明者らは健康なBALB/cマウスを処置した。この種は一般的にTh2駆動免疫応答での刺激に応答すると考えられている。本願発明者らの結果は、Pregnyl処置BALB/cマウスから得た精製したCD4+ T細胞がさらにTh2傾斜を表すことを示唆している。in vitroでのPregnylで刺激したとき、同じ細胞はIFN−γ産生の増加とIL−4産生の減少を示した。このことはPregnylがin vivo対in vitroでの処置において異なる調節T細胞サブセットに影響を与えることを意味する。本願発明者らはin vivoでの処理が、TGF−βの選択的産生およびIL−10のより低いか全くない産生によって特徴づけられるおそらくCD4+ Tr1細胞の集団の成長を刺激する。これらのCD4+ Tr1細胞が、Th1細胞の活性を選択的に阻害するために、Th1駆動疾患含有糖尿病およびMSの異なるモデルでみられ(O’Garra et al.1997)、したがって疾患のひどさをも減少させる。in vitroでPregnylで刺激したPregnyl処置BALB/cマウスからのCD4+T細胞による同じことがTh2細胞の減少にともなったTh1細胞の増加を示した。これはIL−10の高産生およびTGF−βの低産生によって特徴づけられるCD4+ Th3細胞の好ましい刺激と一致する。これらの調節細胞はTh1細胞によるIFN−γ産生の抑制およびTh2型細胞の成長のインヒビターである。NOD.scidマウスにおいてTh2細胞の安定した増加が、少ない深刻な高血糖および膵臓小島での浸潤の異なる特性の原因であることも示されてきた。
【0232】
300 IU Pregnyl処置NODの本願発明者らの結果と本願発明者らの再形成されたNOD.scidマウスは、PBS−処置NODと比較したときにとりわけNOD.scidにおいて、血中グルコースの同様のゆっくりした増加を示し、異なる浸潤特性を示した。NODマウスにおいてPregnylの活性はTh1およびTh2細胞両方を阻害しているTh3細胞の誘導でよく仲介されうる。これらのTh3細胞は本当に少なくとも引き延ばされた期間疾病活性を抑制してよい。機能的T細胞を持たないNOD.scidマウスにおいて、Pregnyl処置脾臓細胞での再形成はTr1細胞の選択的誘導で調節され、したがってTh1サブセットのみを阻害する。引き延ばされた期間の後、糖尿病誘発性Th2細胞の安定した成長が、糖尿病のあまり深刻ではない形態の遅い開始の原因である。同様に、本願発明者らのF1−2ではなくF3−5が上で論議した現象を示し、hCGが観察された影響の原因にはなり得ないことを示している。このF3−5は主として自己免疫糖尿病の開始での免疫応答における決定的な効果の方へ向かっており、この疾病および他の免疫仲介障害の免疫治療に対する活性成分である。
【0233】
さらに、Pregnylおよび機能的にそれと同等の免疫レギュレータはインスリン非依存性糖尿病(NIDDM)で効果的である。NIDDM患者での本質的な問題はインスリン抵抗性および肥満であり、THF−(アルファ)が肥満およびNIDDMのインスリン抵抗性の原因であることが示された(Miles et al.1997, Solomon et al.1997, Pfeiffer et al.1997, Hotamisligil et al.1994, Argiles et al.1994)。TNF−アルファによって誘導されたこのインスリン抵抗性は、おそらくその有用な作用を血液の遊離脂肪酸(FFA)濃縮を誘導するTNF−アルファの低下によって、および/または筋肉内のインスリンレセプター自己リン酸化へ遠位の細胞内部分でのグルコース取り込みの刺激によって行うような、PioglitazoneおよびMetforminなどの最近発展した薬で、および遺伝子工学的に作製したヒト坑−TNF−アルファ抗体(CDP571)(Solomon et al.1997, Ofei et al.1996)で逆転されうる。さらに、網膜障害の存在(Pfeiffer et al.1997)(糖尿病の遅延合併症のひとつ)が特に血漿TNF−アルファの上昇を仲介し、性依存性である(Pfeiffer et al.1997)。TNF−アルファの増加は男性NIDDMでおこるがしかし女性のNIDDMではおこらず、網膜障害および神経障害、腎障害または微小血管障害のような他の合併症の発達に参加しうる(Pfeiffer et al.1997)。Pregnylおよび分画3−5が免疫調整潜在力を持ち、特にTNF−アルファを直接的または間接的に阻害する。Pregnylおよびその断片3−5はまたNIDDM患者で有用な効果を持つ。さらに、女性での糖尿病合併症の発生が低いことは、女性ホルモンの関連を示す。セプシスまたは敗血性ショックで示される鍵となる病因サイトカインは、セプシスまたは敗血性ショックおよび悪疫質を含む種々の炎症状態および他の深刻な疾患に関連する病態生理で鍵となる役割を占める免疫学的な伝達物質TNFαである。TNFがT細胞によって(たとえばスーパー抗原[内毒素]を介したT細胞活性化によって)、または内毒素を介したマクロファージによって産生されたとき、それは攻撃有機体を疎隔し拒絶するであろう炎症反応を仲介する。感染が広がった場合、循環系への多量のTNFの引き続く放出は破壊的であり、器官系に損害を与え、致死ショックの状態を引き起こす。これらの毒性効果は宿主細胞におけるTNFの直接的な作用によっておよびIL−1、IFN−ガンマを含む他の内因性免疫学的伝達物質のカスケードとの相互作用によっておこる。
【0234】
このことはD−ガラクトサミンで感作し、TNFαで処置したマウスでの症状のようなショックの誘導およびTSST−1およびD−ガラクトサミン処置に続く坑TNFα mAbsの同時注入後の疾病の致死および視覚的兆候両方の阻害によって示された。低投与量の内毒素モデルにおいて、および外毒素モデルにおいて、D−ガラクトサミン処置は、肝臓にショック誘導に続いて存在する高レベルのTNFαを緩和させる急性期タンパク質の転写を阻害するために必要である。これらの急性期タンパク質の欠損はネズミ肝細胞のTNFα仲介アポトーシス誘導への感受性の増加を導く。このアポトーシスおよびTNFαの炎症効果を中和する能力がないことは死を導く。
【0235】
本願発明者らはたとえば妊娠の第1トリメスターの尿(IR−U)で、および商業的なhCG調製品(IR−P)で存在しているhCGを持つまたはもたない因子(IR)が免疫調整効果を持つことを示してきた。とりわけこれらは自己免疫および炎症疾患を阻害する潜在力を持つ。TNFおよびIFN−ガンマが病理学的にセプシスまたは敗血性ショックに、およびまた自己免疫および炎症疾患に関与することから、IRはまたショックのような急性炎症状態でTNFおよびIFN−ガンマを阻害する能力を持つ。本願発明者らの結果はIRが、LPSで(内毒素モデル)またはTSST−1で(外毒素モデル)処置したBALB/cまたはSJLでのセプシスまたは敗血性ショックを阻害することを示す。IRは慢性炎症疾患を阻害する効力を持つだけでなく、ショックのような急性炎症疾患も抑制できる。さらに本願発明者らはまた、IRでの処置後でさえもショックを阻害することを示す。さらに、本願発明者らのIR断片データはほとんどの坑ショック活性が、主にhCGの個々の鎖、それらの鎖のホモダイマーまたはベータ−コア残余鎖、これらの鎖の分解産生物および他の分子(>30 kDa)を含むIR−(U/P)3−5[pooled]で残っていることを示している。本願発明者らはまた同一の断片IR−U/P3−5がNODマウスモデルで坑糖尿病効果を持つことを示した。したがって内毒素および外毒素モデルはNODマウスおよびNOD.scidマウスでの坑糖尿病活性の決定のための高速読み出しモデルとして役に立つ。内毒素および外毒素モデルの助けによって、本願発明者らは48時間以内のIR断片での坑糖尿病活性について調査できる。
【0236】
したがって、Pregnylおよびその分画3−5のようなIRは調節T細胞サブセットに影響を与えることで免疫系を調節することによって自己免疫糖尿病を抑制する高い潜在力を持つ。本願発明者らのNODおよびBALB/cデータは、これらがT細胞サブセットバランス(Th1−>Th2/Th2−>Th1)を元に戻す潜在力を持つことを示す。したがって、Pregnylおよびその断片3−5は、リウマチ様関節炎(RA)、多発性硬化症(MS)、NIDDM、全身性エリテマトーデス(SLE)などのTh1サイトカインが優位な疾患、Th2サイトカイン応答が優位なアレルギーおよび喘息のような移植モデルおよび疾患の様な免疫仲介疾患のひどさを調節するのにも効果的である。(MSに対するEAE−モデル、NIDDMに対するBB−ラット、RAに対するフィッシュ−ラットおよびMLR−モデル、アレルギーに対するOVA−モデル、SLEに対するMLR/lprおよびBXSBモデルのような)これらの疾患の動物モデル、KK−Ay−マウス、GKラット、ウィスター脂肪ラット、fa/faラットは他のものの中で他の免疫調節疾患のモデルを提供する。
【図面の簡単な説明】
【図1】 4週間PBSで処置された15週齢NOD(非肥満性糖尿病)マウスが17週齢で糖尿病になり(>13.75 mmol/l)、また1週間内にそれらマウスは血糖値が30 mmol/lより上になったが、一方、300 IUプレグニールで治療されたNODマウスは、19週齢で治療が停止されても、殺傷される(28週齢で)まで非糖尿病のままであったことを示している。その場合血糖値は、8 mmol/lよりも低いままであった。
【図2】 PBS処置NODマウス(図3)から脾臓細胞を受け入れて再構成されたNOD SCID(重篤複合免疫不全)マウスが転移の22日後に糖尿病になり、一方、600 IUプレグニール治療NODにより再構成されたNOD SCIDマウスは、それらマウスが殺傷される(転移後8週)まで非糖尿病状態のままであったことを示している。
【図3】 4週間PBSで処置された15週齢NODマウスが17週で糖尿病(>13.75 mmol/l)になり、また1週間内でそれらマウスは30 mmol/lより上になったが、600 IUプレグニールによって治療されたNODマウスは、それらマウスがPBS群と一緒に殺傷される(21週齢で)まで非糖尿病のままであったことが示されている。300 IUプレグニールで治療された15週齢NODマウスはそれらマウスが殺傷される(28週齢で)まで、その治療が19週齢で停止されても、非糖尿病状態のままであった。その場合血糖値は、8 mmol/l以下のままであった。
【図4】 20週齢雌NODから脾臓細胞が分離され、また、抗CD3とIL−2の存在下で48時間異なる条件で培養された(「−」培地のみ、「+」には抗CD3,50,100,300,600,800 IU/mlプレグニール、F1−2、F3−5、rh−hCG、rh−α−hCG、rh−β−hCG [各200μg/ml])。48時間後INF−(サイトカインELISA法が実施された。その結果から、INF−(プレグニール(50〜600 IU/ml)とhCGを含んでいない分画3〜5(F3〜5)の用量依存性阻害があることが示されている。hCG自体の効果を示唆する800 IU/mlプレグニールを加えたINF−gにおいて増加がある。IL−4に対する効果は、hCG、ヒト組換え(rh)hCG、rh−α−hCGを含有する分画1〜2(F1〜2)に関してはみられなかった。rh−β−hCGに関しては、INF−g値で多少減少がみられる。
【図5】 20週齢雌NODから脾臓細胞が分離され、また、抗CD3とIL−2の存在下で48時間異なる条件で培養された(「−」培地のみ、「+」には抗CD3,50,100,300,600,800 IU/mlプレグニール、F1−2、F3−5、rh−hCG、rh−α−hCG、rh−β−hCG[各200μg/ml])。48時間後IL−4サイトカインELISA法が実施された。その結果から、IL−4(プレグニール(50〜600 IU/ml))とhCGを含んでいない分画3〜5(F3〜5)の用量依存性増加があることが示されている。hCG自体の効果を示唆する800 IU/mlプレグニールを加えたIL−4では減少している。INF−gに対する効果は、hCG、ヒト組換え(rh)hCG、rh−α−hCG rh−β−hCGを含有する分画1〜2(F1〜2)に関してはみられなかった。
【図6】 20週齢雌NODからCD4 T細胞が分離され、また、抗CD3とIL−2、抗CD28の存在下で48時間異なる条件で培養された(「−」培地のみ、「+」には抗CD3,50,100,300,600,800 IU/mlプレグニール、F1−2、F3−5、rh−hCG、rh−α−hCG、rh−β−hCG[各200μg/ml])。48時間後INF−γサイトカインELISA法が実施された。その結果から、プレグニール(50〜300 IU/ml)を加えたINF−γとhCGを含んでいない分画3〜5(F3〜5)の用量依存性阻害があることが示されている。hCG自体の効果を示唆する600〜800 IU/mlプレグニールを加えたINF−γでは増加している。INF−gに対する効果は、hCG、ヒト組換え(rh)hCG、rh−α−hCGを含有する分画1〜2(F1〜2)に関してはみられなかった。rh−β−hCGに関しては、INF−γ値で多少減少がみられる。
【図7】 48時間PBS、600 IUプレグニール、分画1〜2(F1〜2)、分画3〜5(F3〜5)あるいはヒト組換えβ−hCG(b−hCG)で処置された20週齢の雌の脾臓細胞の転移実験、またその後に8週齢NOD SCIDマウス(n=3)が示されている。転移の22日後に、PBS処置されたNODの脾臓を受け入れたNOD SCIDマウスが糖尿病になった。F1〜2とb−hCGを受け入れたNOD SCIDマウスがそれぞれ4と5週間後に糖尿病になり、一方、600 IUプレグニールとF3〜5を受け入れたNOD SCIDマウスは約6週間非糖尿病のままであったが、その後にすべてのマウスが殺傷された。それはプレグニールとF3〜5には最大抗糖尿病効果があることを示している。たいていのhCGを含有しているF1〜2はこれらのマウスにおける糖尿病の発生に対する効果を有していないため、抗糖尿病効果はhCGそれ自体には効果がないことは明白である。組換えヒトβ−hCGには多少抗糖尿病の効果がある。
【図8】〜【図11】 プレグニールがTh2タイプマウスに対しても効果を有しているかどうかを試験するために、われわれは、BALB/cマウス(n=5)を4日間300 IUプレグニール腹腔内投与により治療し、またPBS(n=5)により処置した。脾臓からCD4+細胞を分離した後、われわれはそれらを、48時間抗CD3/IL−2により刺激し、その上澄みをIFN−γ(図8)とIL−4(図9)サイトカインの測定のために回収した。われわれはまた、CD4+細胞を、プレグニールの異なる投与量で処置した。その後に、その上澄みはINF‐g ELISA(図10)法による分析のために回収された。図8は、300 IUプレグニールによるin vivo処置がINF‐gを抑制し、また、もう一方では、IL‐4の産生を増加させていることを示している。これは、Th‐2表現型に向かってさらにシフトされることを暗に示している。異なるプレグニールの投与量によりin vitroで再び処置された同じ細胞が、INF‐gにおいては増加(図10)を、またTh‐1表現型に向かってのシフトを示唆するIL‐4においては減少(図11)を示している。これはすべて、プレグニールとF3〜5が調節T細胞サブセット(Th3,Tr1)に対して効果を有していることを暗に示している。
【図12】カラム
Superdex 75時間 10/30;FPLCシステム(Pharmacia)
合計容量Vt=25ml;ボイドボリュームV0=8.7ml;フロー率1ml/分;緩衝液;緩衝液 10mM
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.3;室温カラム効率=38,000N/m
選択率KAV=1.737〜0.2782log(r2=0.982)、MW=分子質量
分離{類}範囲:球状タンパク質に関して3,000〜100,000ダールトン
サンプル
プレグニール(オレガノン、ロット番号:168558、有効期限:28.11.99)
サンプル容量=0.5 ml=2,000単位;感度0.1AUFS
クロマトグラム
ピーク1=分画1〜2:Ve=14.7〜15.1ml;KAV=0.37〜0.39
ピーク2=分画3〜5:Ve=15.38〜17.99ml;
KAV=0.41〜0.57
KAV=(Ve−V0)/(Vt−V0)
ピーク1は、分離開始後、14.7〜15.1mlの間の容量で溶離する。これは70,000〜80,000ダールトン分子質量に対応する。これは分画には部分的にhCGの二量体形態が含まれている(J.E. Griffin, S.R. Ojeda編「内分泌生理学テキスト」第2版、199頁、オックスフォード大学出版部、オックスフォード、1992年刊(“Textbook of Endocrine Physiology, Second edition, J.E. Griffin, S.R. Ojeda(Ed.)Oxford University Press, Oxford, 1992, pp.199”))。ピーク2は、15.38〜17.99mlの間の容量で溶離し、これは1500〜58,000ダールトンの間の容量に対応する。この分画には部分的にβ-サブユニット(MW=22,00ダールトン)、hCGとそのほかの分解産物、不明の分子がまだ含まれている。これらの計算はこのカラムの上述の選択を基礎とした。
【図13】 敗血症あるいは敗血症ショックの3つ異なるモデルにおいて作動している提案メカニズム。A)は高用量エンドドキシンモデル。B)は低用量エンドトキシンである。C)はTSST‐1/SEBである。高および低用量エンドトキシン(a,b)においては、エンドトキシン(LPS)の全身的な効果はマクロファージにより大部分は仲介されているが、一方、エキソトキシンモデル(C)においては、超抗原(TSST−1/SEB)はT細胞により仲介される。TNF、IFNならびにICE(IL−1αおよびβ)の両方の場合で、敗血症ショックの病因で重要な役割を果している。
【図14】 超抗原により誘導されるT細胞活性は、特異的V−βファミリーを表現しているT細胞はすべて、TCR/MHCII/と超抗原の非抗原特異的結合により活性化されるという点で、ポリクローナルT細胞活性化とみなすことができる。
【図15】 非希釈IR−Uサンプルの50μlのFPLCクロマトグラム。
【図16】 非希釈IR−Pサンプルの50μlのFPLCクロマトグラム。
【図17】 図15から分画2と3をさらに分離。
【図18】 2−メルカプトエタノール処理された50μl IR−UサンプルのFPLCクロマトグラム。
【図19】 2−メルカプトエタノール処理された50μl IR−PサンプルのFPLCクロマトグラム。
【図20】 TSST−1とD−Gal処置の前にIR−Pにより処置された動物と、処置されていなかった動物との間の生存率において、はっきりとした差はみつかっていない。
【図21】 IR−P前処置Balb/cマウスは、TSST−1エキソトキシンモデルにおける疾患レベル2を超えないが、一方、D−Gal−TSST−1群は疾患レベル5を越え、殺傷された。
【図22】 IR前処置はまた、中毒性ショックの生存動物の体重減少の低下という結果になった。
【図23】 この数字は、致死中毒性ショック(棒グラフ2)に罹っているマウスにおける免疫活性が高い値であることを示している。正常Balb/cマウス(棒グラフ1)に比較すると、IR−P群(棒グラフ3)ではWBCに関してはまだ正常値である。
【図24】 この数字は、正常Balb/cマウス(棒グラフ1)に比較すると、TSST−1群(棒グラフ2)において血小板数での多少の減少を示している。血小板数はIR−P処置群Balb/cマウス(棒グラフ3)において非常に高値がみられた。
【図25】 この数字は、第1トリメスター妊娠尿サンプル(IR−U)のFDC G25クロマトグラムを示している。分画IR−U/HMDF(高分子量脱塩カラム分画)は5kDaよりも明らかに大きい分子量を有し、一方、IR−U/LMDF(低分量脱塩カラム分画)は5kDaよりも小さい分子量を明らかに有する。
【図26】 この数字は、IR−U/LMDFサンプルのSuperdex 75 GPCクロマトグラムを示す。得られたプロフィールは、その割合は異なっていたが、少なくとも5ピークを示した。
【図27】 Superdexペプチド、PC3.2/30を装備されているPharmacia Biotech SMARTシステムにおいては低分子量分画(IR−U/LMDF)を示している。運転用緩衝液に関しては、40mMトリス、5 mM MgCl2+150 mM NaClは使用され、またフロー率は75分間50 ml/分であり、また単一のものは214と254 nm波長で分析された。回収された1〜3分画があった(LMDF1〜3)。シトクロームCとGly16は内部サイズマーカーとして使用された。ピーク1、2、3はそれぞれ約1.3kDa、1.15kDa、400Daで溶離された。
【図28】 この図は、CD4+細胞のTh1表現型に分極するCD4+細胞に対し、IR−PおよびIR−U/LMDFではIFN−ガンマ産生に強い阻害があることを示す(in vivo)。組換えベータ−hCGではIFN−ガンマ産生の弱い阻害だけが観察され、組換えhCGでは、対照(MED)と比べて、効果は見られなかった。
【図29】〜【図31】 IRはまたDCの成熟に関して効果を有しており、NODマウス由来のBMもまた7日間GM−CSFとIRとともに直接共同培養された。8日目に、すべての細胞が以下のマーカーの発現についてフローサイトメーターにより分析された。すなわち、CD1d、CD11c、CD14、CD31、CD43、CD80、CD95、ER−MP20、ER−MP58、F4/80、E−cad、MHC II、MHC I、RB6、8C5である。
われわれは、IRにより処置されたすべてのDCは、GM−CSFのみにより処置された対照DCよりも成熟してはいなかった。細胞表面マーカーCD1d、ER−MP58、F4/80、CD14における減少、CD43、CD95、CD31、E−cadにおける増加から結論付けられた。さらに、細胞表面マーカーER−MP20/LY6C、MHC IとIIでは何の変化も観察されなかった(図29)。図30と31は、DCが、6日間GM−CSFとともに培養され、また7日目に追加して24時間300IU/ml IR−P(図30)あるいはIR−U/LMDFの100mg/ml(図31)とともに共同培養されたとき、DCはさらに成熟され、またAPCとしてよりよく機能することができた。これは、CD1d、CD40、CD80、CD86、CD95、F4/80、CD11c、MHC II細胞表面マーカーにおける増加から結論付けられた(図30と31)。
【図32】 Balb/cマウスにおけるIR−P処置により、CD4+細胞がTh2表現型にシフトすることを示す。これは、対照(CTL)グループと比べて、IFN−ガンマ産生の阻害によって示される。
【図33】 Th1サブセットのダウンレギュレーションを示唆するPBS処置マウスに比較して、IR−U/LMDFで処置されたBALB/cマウスの精製CD4+細胞はTh1分極測定においてはIFN−γをより少なく産生することを示している。
【図34】 Balb/cマウスにおけるIR−P処置により、CD4+細胞は、Th2表現型にシフトすることを示す。このことは、対照(CTL)マウスと比べて、IL−4産生の増加によって示される。
【図35】 IR−U/LMDFにより処置されたBALB/cマウスの精製CD4+細胞は、Th2サブセットのアップレギュレーションを示唆するPBS処置されたマウスに比較すると、Th2分極測定においてより多くIL−4を産生することを示す。
【図36】 異なる量のIR−P(in vitro)によって処置されたPBSおよびIR−Pマウス(in vivo)からのCD4+T細胞は、IFN−ガンマ産生の増加を示すことを示しており、このことは、Th1表現型へのシフトを示唆する(図37も参照)。
【図37】 異なる量のIR−P(in vitro)によって処置されたPBSおよびIR−Pマウス(in vivo)からのCD4+T細胞は、IL−4産生の減少を示すことを示しており、このことは、Th1表現型へのシフトを示唆する(図36も参照)。
【図38】〜【図41】 Th2表現型に向かうCD4+T細胞のシフトがIL−10あるいはTGF−β依存性であるかどうかを判定するために、われわれはまた、IR−P処置マウス由来のCD4+T細胞の分極測定において、抗IL10と抗TGF−βを付け加えた。図38は、Th1分極条件におけるIR−PグループのIFN−ガンマ産生の増加を示す。これは、Th2サブセットへのIR−Pの効果の促進が、少なくともIL−10依存性であることを示す(詳細は本文を参照)。図39は、Th2分極条件における、IL−4産生の増加が、対照(CTL)グループおよびIR−Pグループにおける抗−IL10in vi tro処置において見られることを示している。このことは、Th1/Th2分極におけるIL−10の関与を示唆している(詳細は本文を参照)。一方、大きな差異は、対照とIR−P処置群の間の抗TGF−β in vitro処置を伴うTh2とTh1分極条件(図40と41)におけるIL−4とIFN−γ産生においてはみられなかった。
【図43】〜【図45】 図43、44a、bと45は、IR−U/LMDF由来の精製CD4+細胞は対照マウス由来の細胞よりもTFG−βをより多く産生することを示している。抗IL−10あるいは抗IL−6が両方の培養培地に加えられたとき、対照群マウス由来のCD4+細胞IR−U/LMDF処置群よりもTGF−βをより多く産生することを示している。これは、TGF−β産生におけるIL−6とIL−10の関与を示唆している。これは、対照マウス群に比較すると、IR処置マウス由来のLPS刺激脾臓細胞はIL−6の高い値(図45)を産み出すことを示しているわれわれのデータと一致している。
【図46】,【図47】 UVB処置BALB/cマウス由来の脾臓細胞の培養後、LPSと抗CD3誘導増殖の減少が観察され、一方、IRあるいは組み合わせたIRまたはUVB照射処置がLPSと抗CD3刺激増殖を増加させた(図46と47)。
【0249】
【図48】、【図49】 LPSと抗CD3刺激増殖におけるこの変化がIL−10依存性であるかどうかを判定するため、われわれはIR−PあるいはUVBにより、IL−10ノックアウトマウスを処置した。増殖パターンにおける変化は、UVB照射とIR−P処置BALB/cマウスが比較されたときには(図47)、抗CD3刺激脾臓細胞においてはみられらなかったが、一方、両群のUVB照射BALB/cと比較すると、増殖における逆のパターンが抗CD3刺激リンパ節細胞においては観察された(図49)。これは、UVB処置後の抗CD3刺激増殖の減少、あるいは脾臓細胞のIR−P処置後の増殖の増加は、完全にIL−10依存性ではなく、一方、これは抗CD3刺激リンパ節細胞に関しては真実であることを示している。
【図50】,【図51】 48時間で脾臓細胞のLPS刺激増殖を示しており、われわれは、対照群に比較すると、UVBとIR‐P処置群における増殖の増加を観察し(図51)、一方、増殖における増加が増殖に関して72時間で両方の群で観察された(図50)。
【図52】,【図53】 B220とM/114陽性細胞の減少、ならびにCD4とCD8陽性細胞の増加がIR‐P‐処置IL‐10ノックアウトマウス(図52)のリンパ節において観察され、一方、CD4、CD8、B220とM5/114陽性細胞の増加が脾臓において観察された(図53)。UVB処置群において、CD8陽性細胞の増加とCD4、B220、M5/114陽性細胞の増加が脾臓において観察された(図53)。UVB処置群においては、CD8陽性細胞の増加とCD4、B220、M5/114陽性細胞がリンパ節においてみられ(図52)、一方、CD8陽性細胞の軽度増加以外に細胞マーカーの変化が脾臓細胞の間で観察された(図53)。
【図54】,【図55】 BALB/cマウス由来のDCは、7日間、GM−CSFとIR(IR−P、IR−U、IR−U3-5、IR−U/LMDF)の存在下で共同培養される場合は、われわれはIRにより処置されたすべてのDCが、GM−CSFのみにより処置された対照DCよりも成熟していなかったことを観察している。これは細胞表面マーカーCD1d、CD40、CD80、CD86、ER−MP58、F4/80、E−cad、MHC IIの増加から結論付けられた(図54)。さらに、CD95の軽度増加が観察された(図54)。対照的に、6日間DCがGM−CSFとともに培養され、また7日目にその培養培地が追加の24時間の間、300 IU/ml IR−Pあるいは100mg/ml IR−U(IR−U、IR−U3−5、IR−U/LMDF)を補給された場合には、それらDCはより成熟し、またAPCとしてよりよく機能することができた。これは細胞表面マーカーCD1d、CD40、CD80、CD86、ER−MP58、F4/80、E−cad、MHC IIの増加から結論付けられた(図54)。
【図56】 図56はアロMLRを示す。増殖データは、全DCのなかのIR処置DC対T細胞の割合により増殖を抑制することができることを示している(図56)。
【図57】 IR−U/LMDF分画の抗ショック活性を示す。試験活性の方法はこの出願のなかの他所で説明されている。
【図58】 IR処置マウスにおけるLPS高投与処置の効果を測定。LPS(150mg/kg)をBalb/cマウス(n=30)に腹膜内注射し、生存率を5日間にわたり毎日評価。PBS処置Balb/cマウスは、高投与量のLPSの注射の後、1〜2日の間にショック死し、5日目に生存していたのはわずか10%だけであった。対照的に、IR−P,IR−P1およびIR−P3で処置されたマウスは100%、5日目でも生存していた(P<0.001)が、IR−P2、IR−Aおよびデキサメタゾン処置のマウスは約70%の生存率を示した。
【図59】 IR−A,IR−PおよびそのフラクションIR−P1,IR−P3は全て正常範囲内(100−300×109)の血小板数を有するが、対照、IR−P2処置およびデキサメタゾン処置のマウスは正常範囲以下の血小板数を有する。
【図60】〜【図62】 IR−A,IR−PならびにそのフラクションIR−P1,IR−P2およびIR−P3で処置されたマウスは、対照およびデキサメタゾン処置マウスと比べて、血漿中に存在するALT,LDH1およびASAT酵素のレベルが比較的低い。これらの酵素は、臓器損傷のために、ショック時に血液中に高濃度で存在し、したがって、この結果は我々の生存率の結果と一致する(図58)。
【図63】 IR−A,IR−Pおよびそのフラクションで処置されたマウスは、48時間後の時点で、対照およびデキサメタゾン処置マウスよりも、中程度〜正常のWBCレベルであり、IR処置マウスにおいては炎症反応がより低いことを示唆している。
【図64】 IR−P処置およびIR−P3と組合せたrhCG処置のNODマウスから単離されたCD4+細胞のTh1分極アセイにおけるIFNガンマ産生の阻害を示し、中低度の阻害がrhCGとIR−P3によるTh1分極においてのみ見られる。このことは、IR−P3と組合せたrhCG処置のNODマウスが、Th1産生の強い阻害を示すことを示している。これは、IR−P3フラクションは、Th1サブセットを最大限抑制するためにrhCGを必要とすることを示唆している。
【図65】 PBS処置マウスに比較すると、IR−P、IR−P1、IR−P2、あるいはrhCGとIR−P3と組み合わせてそれらにより治療されたNODマウスから得られる抗CD3刺激脾臓細胞においてIFN−γの阻害を示している。rhCGとIR−P3単独では、組み合わせたものと同じ効果を有していなかった。これは、IR−P3分画が、そのIFN−γ阻害のためにはrhCGを必要とすることを再び示唆している。
【図66】 rhCGと組み合わせたIR−P、その分画、rhCGあるいはIR−P3により処置されたNODマウスから得られる脾臓細胞の異なる時点(t=12、24、48時間)で抗CD3刺激増殖を示している。再び、その結果は前出のIFN−γ阻害と一致している(図65)。ここで、IR−P3分画はまた、in vivo処置されたNODマウスから脾臓細胞の抗CD3誘導増殖についてその阻害効果にはrhCGを必要とした。
【図67】 IR−Pおよびそのフラクションが、PBS処置マウスとに比べて、処置されたNODマウスからの抗CD3刺激脾臓細胞のIL−10産生を促進することを示している。
【図68】 IgG2a産生は、IR−P2およびrhCGINVIVO処置によって阻害されないが、IR−P,IR−P1,IR−P3およびIR−P3と組合せたrhCGはIgG2a産生を抑制する。
【図69】,【図70】 IR−P処置は、HD−STZモデルならびにMD−STZモデルの双方において糖尿病の誘発を遅延し得ることを示す。この遅延の背後にあるメカニズムはおそらく異なった性質のものである。
【図71】〜【図74】 BEAS 2B細胞系統の結果:デキサメタゾンはBEAS 2B細胞系統におけるTNF−α誘導IL−6とRANTES産生を阻害することができることを示している。IR−Pはまた、TNF−α誘導炎症サイトカインの産生を阻害することができる。さらに、デキサメタゾンは、抗炎症TGF−βサイトカインのTGF−α誘導ダウンレギュレーションを回復させることができ、一方、IR−PはTGF−β産生を回復させるだけではなく、またさらにこの抗炎症サイトカインを促進する(図75)。さらに、デキサメタゾンとIR−Pは両方ともRANTESのIFN−γ誘導産生を阻害することができた(図74)。
【図75】,【図76】 BEAS 2B細胞系統のフローサイトメトリー分析:結果は、デキサメタゾンとIR−P両方とも、HLA−DRとICAM−1のTNF−α誘導発現をダウンレギュレートすることができた。
【図77】〜【図80】 EAEモデルの結果;PBS処置マウスは最初の3週間で体重を減らしただけであった(図77)。実験全期間疾患に対する抵抗が残っていた1匹のマウスを除いて、これらのマウスは、少なくとも2およびより長い疾患期間EAEの臨床徴候をすべて有していた(図78)。IR処置マウス群においては、実験期間中に観察された体重減少はより少ないものであって(図79)、また2匹のマウスは実験期間中は疾患には罹らなかった。この群の中で疾患に罹ったマウスは、最大臨床スコア2を有し、また、短い疾患期間を有していたが、PBS処置群よりもEAE症候群から早く回復した(図80)。
【図81】〜【図82】 図81は、IR処置前は、患者はステロイド剤の高投与量のために免疫無防備状態になっていた。IR処置後、Tリンパ球(CD4、CD8)の値が増加し、またB細胞以外は正常範囲内にあった。われわれはまた、IR処置期間に患者から得られたLPSとPMA/Ca刺激PBMCのサイトカインを測定した。われわれは、治療期間中にLPS刺激PBMCによりTNF−α、IL−10とIL−12がより多く産生され(図82a)、一方、PMA/Ca刺激PBMCはより少ないIFN−γを産生した(図82b)。
【図83】〜【図86】 図83は、IR−P治療のため、リンパ球、T細胞(CD4、CD8)、B細胞の数が減少し、それがその治療による過剰活性化免疫システムのダウンレギュレーションの表示であることを示している。これはまた、PBMCによりLPS刺激IL−12とTNF−αの阻害を示すわれわれのサイトカインのデータと一致している。さらに、その治療期間中にIL−10産生の増加があったが、それは抗炎症サイトカインである(図86)。さらに、上昇CPKと肝酵素(ASAT、ALAT)はまた減少した(図84と86)。これはすべて、疾患活性の減少を反映している。
【図87】,【図88】 図87と88は、糖尿病患者のIR−P治療の期間中に、正常血糖を維持するために必要なインスリンが図87に示されているように、減少したことを示している。プレグニールの停止後、その男性患者のインスリン必要量は再び上昇した(図87)。糖尿病の新たな発症を伴ったこの患者では、インスリンの必要量がIR−Pによる治療期間中に有意に下降し、また、ブドウ糖コントロールの改善もまた見出され、IR−P治療(図87)期間中にグリコシル化HbA1c値の減少、またLPS刺激PBMCにより産生された炎症性サイトカイン(IL12、TNF−α、IFN−γ)の減少により支持された。さらに、IL−10(抗炎症性サイトカイン)の増加もまた治療期間中に観察された(図83)。これはすべて、膵島細胞機能と最終的により良いブドウ糖調節の改善を示唆している。
【図89】〜【図91】 MS(多発性硬化症)患者1(in vitro):IR−Pにより処置されたLPS刺激PBMCにおけるTGF−βとIL−10の産生における増加があった(図HとI)。TGF−βとIL−10産生においては、PMA/Caにより刺激された培養培地と、IR−Pにより処置された培養培地では差異はなく(図89と90)、一方、IR−PはPMA/Ca刺激PBMCにおけるIFN−γの産生を阻害した(図91)。
【図92】〜【図94】 MS(多発性硬化症)患者2(in vitro):患者2から得られたPBMCは、TPA/Ca刺激のみと比較すると、IR−Pにより処置された培養培地におけるTGF−βとIFN−γの産生減少を示し、一方、IR−P処置は、LPS刺激TGF−β産生を増加させる(図92と93)。IL−10産生は、LPSとTPA/Ca刺激培養培地の両方でIR−Pにより阻害された(図94)。
【図95】,【図96】 非治療対照群と比較すると、BALB/c受容者のIR−Pによる治療は、C57BL/6皮膚移植生存を延長した。対照受容者は、12日間内に皮膚移植を拒絶し(図95)、一方、IR−P治療受容者は、移植後22日までその皮膚移植を延長することができた(図96)。図95と96は、IR−P治療とその対照マウスからの移植の拒絶のため、こうした1つの延期された移植を示している(写真は19日目に撮られた)。
【図97】 IR−U/LMDF Bio−Gel P−2クロマトグラムを示している。
【図98】 IR−P3 Bio−Gel P−2クロマトグラムを示している。
【図99】 IR−A3 Bio−Gel P−2クロマトグラムを示している。
【図100】 IR−Pサンプルの巨球GPC60Åクロマトグラムを示している。3つの選択領域が分画化された。>10kDaの分子量で明らかに溶離されたIR−P1、10kDa〜1kDaの間の分子量で明らかに溶離されるIR−P2、<1kDaの分子量で溶離されるIR−P3である。これらすべての活性は少なくとも抗ショック活性に関して試験された(詳細はテキストを参照)。
【図101】 IR−PとIR−Aサンプルの巨球GPC60Åクロマトグラムを示している(各サンプルの500 IUは同じ注射量で注射された)。その結果は、IR−PサンプルにおけるIR−P3分画に比較すると、大量のIR−A3分画がIR−Aには含まれている。我々は、それらの抗ショック活性に関してIR−AとIR−Pの同量を試験した。その結果は、IR−Pに比較して低から軽度の抗ショック活性をIR−Aが有することを明らかにした(結果は示さず)。
【図102】 精製方法1、2、3、4(詳細についてはテキストを参照)のフロー図を示している。
Claims (25)
- 免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための免疫レギュレータの使用であって、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求められる、1キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離され、T細胞に影響を与えてTh1細胞レベルをダウンレギュレートするおよび/またはTh2細胞レベルをアップレギュレートすることによってTh1/Th2バランスを調節することができる、妊娠している哺乳動物の尿から得られる免疫レギュレータの使用。
- 前記妊娠している哺乳動物の尿が妊娠初期の尿であることを特徴とする請求項1に記載の免疫レギュレータの使用。
- 前記哺乳動物はヒトであることを特徴とする請求項2に記載の免疫レギュレータの使用。
- 免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための免疫レギュレータの使用であって、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求められる、1キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離される、妊娠している哺乳動物の尿から得られる免疫レギュレータであって、免疫調節効果を有する哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤から得られる活性成分を含み、前記活性成分は非肥満性糖尿病(NOD)マウスから得られる脾臓細胞を刺激することができ、前記活性成分が非肥満性糖尿病(NOD)マウスから得られる脾臓細胞のγ‐インターフェロン産生を阻害することができることを特徴とする免疫レギュレータの使用。
- 免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための免疫レギュレータの使用であって、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求められる、1キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離される、妊娠している哺乳動物の尿から得られる免疫レギュレータであって、免疫調節効果を有する哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤から得られる活性成分を含み、前記活性成分は非肥満性糖尿病(NOD)マウスから得られる脾臓細胞を刺激することができ、前記成分が非肥満性糖尿病(NOD)マウスから得られる脾臓細胞のインターロイキン−4産生を刺激することができることを特徴とする免疫レギュレータの使用。
- 前記成分が非肥満性糖尿病(NOD)マウスから得られる脾臓細胞のインターロイキン−4産生を刺激することができることを特徴とする請求項4に記載の免疫レギュレータの使用。
- 免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための免疫レギュレータの使用であって、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求められる、1キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離される、妊娠している哺乳動物の尿から得られる免疫レギュレータであって、免疫調節効果を有する哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤から得られる活性成分を含み、前記活性成分は非肥満性糖尿病(NOD)マウスから得られる脾臓細胞を刺激することができ、前記活性成分は臓器不全の後または臓器不全の間にASAT血漿値を減少することができることを特徴とする免疫レギュレータの使用。
- 前記活性成分は臓器不全の後または臓器不全の間にASAT血漿値を減少することができることを特徴とする請求項4〜6のいずれか1項に記載の免疫レギュレータの使用。
- 免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための免疫レギュレータの使用であって、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求められる、1キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離される、妊娠している哺乳動物の尿から得られる免疫レギュレータであって、免疫調節効果を有する哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤から得られる活性成分を含み、前記活性成分はリポ多糖誘導敗血症ショックに対してマウスを保護することができ、前記活性成分が非肥満性糖尿病(NOD)マウスから得られる脾臓細胞のγ‐インターフェロン産生を阻害することができることを特徴とする免疫レギュレータの使用。
- 免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための免疫レギュレータの使用であって、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求められる、1キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離される、妊娠している哺乳動物の尿から得られる免疫レギュレータであって、免疫調節効果を有する哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤から得られる活性成分を含み、前記活性成分はリポ多糖誘導敗血症ショックに対してマウスを保護することができ、前記成分が非肥満性糖尿病(NOD)マウスから得られる脾臓細胞のインターロイキン−4産生を刺激することができることを特徴とする免疫レギュレータの使用。
- 前記成分が非肥満性糖尿病(NOD)マウスから得られる脾臓細胞のインターロイキン−4産生を刺激することができることを特徴とする請求項9に記載の免疫レギュレータの使用。
- 免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための免疫レギュレータの使用であって、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求められる、1キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離される、妊娠している哺乳動物の尿から得られる免疫レギュレータであって、免疫調節効果を有する哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤から得られる活性成分を含み、前記活性成分はリポ多糖誘導敗血症ショックに対してマウスを保護することができ、前記活性成分は臓器不全の後または臓器不全の間にASAT血漿値を減少することができることを特徴とする免疫レギュレータの使用。
- 前記活性成分は臓器不全の後または臓器不全の間にASAT血漿値を減少することができることを特徴とする請求項9〜11のいずれか1項に記載の免疫レギュレータの使用。
- 前記哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤が妊娠している哺乳動物の尿から誘導されることを特徴とする請求項4〜13のいずれか1項に記載の免疫レギュレータの使用。
- T細胞に影響を与えてTh1細胞レベルをダウンレギュレートするおよび/またはTh2細胞レベルをアップレギュレートすることによって、Th1/Th2バランスを調節することができる請求項4〜14のいずれか1項に記載の免疫レギュレータの使用。
- リンパ性前駆体に対する脊髄性前駆体からの選択的分化によって樹状細胞分化を調節することができる請求項4〜15のいずれか1項に記載の免疫レギュレータの使用。
- 前記刺激脾臓細胞が、前記脾臓細胞によって再構成されているNOD‐重篤合併免疫欠損マウスにおける糖尿病の発症を遅延させることができることを特徴とする請求項4〜16のいずれか1項に記載の免疫レギュレータの使用。
- 前記免疫仲介不全症が、糖尿病、多発性硬化症、または慢性移植拒絶反応の慢性炎症を含むことを特徴とする請求項1〜17のいずれか1項に記載の使用。
- 前記免疫仲介不全症が、敗血症、アナフィラキシーショックまたは急性または超急性拒絶反応の急性炎症を含むことを特徴とする請求項1〜17のいずれか1項に記載の使用。
- 前記免疫仲介不全症が、全身性エリテマトーデス、または慢性関節リウマチの自己免疫疾患を含むことを特徴とする請求項1〜17のいずれか1項に記載の使用。
- 前記免疫仲介不全症が、喘息または寄生生物疾患のアレルギーを含むことを特徴とする請求項1〜17のいずれか1項に記載の使用。
- 前記免疫仲介不全症が、ウイルスまたは細菌の感染病原体に対して向けられる過敏な免疫応答を含むことを特徴とする請求項1〜17のいずれか1項に記載の使用。
- 前記治療が、治療される個人におけるリンパ球サブセット集団の、細胞レベルのダウンレギュレートおよび/またはアップレギュレートによる相対的割合の調節および/または、相対的割合に関連した、サイトカインの産生特性によるサイトカイン活性の調節を含むことを特徴とする請求項1〜22のいずれか1項に記載の使用。
- 前記集団がTh1またはTh2細胞を含むことを特徴とする請求項23に記載の使用。
- 前記免疫レギュレータがhCG製剤またはhCG製剤から誘導された分画を含むことを特徴とする請求項1〜24のいずれか1項に記載の使用。
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