JP2002535243A - 免疫レギュレータ - Google Patents

免疫レギュレータ

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、免疫学の分野に関し、より詳細には、アレルギー、自己免疫疾患、移植関連疾患および炎症疾患などの免疫仲介障害の分野に関する。本発明は、特に、免疫レギュレータ(IR)、免疫仲介障害治療のための医薬組成物調製におけるIRの使用、医薬組成物、および免疫仲介障害治療の方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 本発明は、免疫学の分野に関し、さらにとりわけ、アレルギー、自己免疫疾患
、移植関連疾患および炎症疾患などの免疫仲介障害の分野に関する。
【0002】 免疫系は、炎症性物質、微生物侵襲、または傷害に脅かされたときにサイトカ
インや他の液性因子を産生して宿主を防御する。ほとんどの場合、この複雑な防
御ネットワークは正常な恒常性をうまく復帰させるが、しかしある場合には液性
因子が実際に宿主に害毒を及ぼしうる。アナフィラキシーショック、自己免疫疾
患、および免疫複合体障害を含む、免疫疾患および免疫系由来の傷害の例のいく
つかについて、広く調査されている。
【0003】 液性および細胞性免疫学、分子生物学および病理学における最近の進歩は、自
己免疫は免疫仲介疾患の一部であるとする現在の考え方に影響を与えている。こ
れらの進歩は、抗体、B細胞とT細胞の多様性、先天性の(単球、マクロファー
ジ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、γδ T細胞、補体、急性期蛋
白、など)および後天性の(TおよびB細胞と抗体)または細胞性および液性免
疫応答の形成ならびにそれらの相互依存性、(自己)寛容誘導および免疫学的応
答が自己抗原的成分に対して起こる理由についての基本的な点における本願発明
者らの理解を深めた。
【0004】 1900年から、免疫学のセントラルドグマは、免疫系は通常は自己に応答し
ないというものだった。しかしながら、最近ではかつて考えられていたほど自己
免疫応答は珍しくなく、また全ての自己免疫応答が有害ではないこといくつかの
応答には通常の免疫応答を調節するために、明確な役割を果たしているものもあ
ることが明らかとなった。たとえば、主要組織適合抗原複合体(MHC)によっ
てコードされる細胞表面抗原や自己イディオタイプに対する抗イディオタイプ応
答の認識のようなある形の自己免疫応答は、多様性および健全な免疫系の正常な
機能に重要で、事実、必須である。
【0005】 見かけ上は、チェックと均衡との複雑な系が種々の免疫系細胞のサブセット(
すなわちT細胞)の間で維持されていて、それによって個体に外来の侵入物に対
抗できる免疫系を提供している。この意味において、自己免疫は免疫系において
調節する役割を果たしている。
【0006】 しかしながら、現在ではまた、異常な自己免疫応答は多くのヒトや動物の疾患
の、ときに最初の原因となり、別の場合では二次的な寄与をするものとなると認
識されている。自己免疫疾患のタイプは頻繁に重複し、複数の自己免疫障害が同
一の個体、自己免疫内分泌異常を持つ個体でおこる傾向がある。自己免疫症候群
は、リンパ性過形成、悪性リンパ球または血漿細胞増殖およびγ−グロブリン不
全症、選択的Ig不全と補体系不全のような免疫不全障害によって仲介されうる
【0007】 全身性エリテマトーシス、糖尿病、リウマチ性関節炎、産後甲状腺機能減退、
自己免疫性血小板減少症、(判読不明)のような自己免疫疾患は、たとえば広く
分布する自己抗原的決定因子に対する、あるいは器官または組織特異的抗原に対
して起こる自己免疫応答で特徴づけられる。これらの疾患は、ただ一つの抗原性
標的に対して、または多くの自己抗原に対して、異常な免疫応答を引き起こしう
る。多くの例において、自己免疫応答が修飾されていない自己抗原またはウイル
ス、微生物抗原とハプテン類のような多種の何らかの物質に修飾(または類似)
された自己抗原に対して起こるかは明らかでない。
【0008】 さまざまな自己免疫不全についての根源と病原を説明する統一された見解はい
まだ成立していない。実験動物における研究から、自己免疫疾患は、個体同士で
異なる遺伝子的および免疫学的な幅広い異常が原因となりえ、また多くの付加的
な外因性(ウィルス、細菌)または内因性(ホルモン、サイトカイン、異常遺伝
子)促進因子の存在または非存在に依存して、生涯の早期または後期に発現しう
るとする概念を支持している。
【0009】 主な自己免疫疾患を寄せ付けない同様なチェックと均衡とには、アレルギー(
喘息)、セプシスや敗血性ショックのような急性炎症疾患、慢性炎症疾患(すな
わちリウマチ性疾患、シューグレン症候群、多発性硬化症)、移植関連免疫応答
(移植片対宿主疾患、輸血後血小板減少症)、そして反応性抗原が(少なくとも
最初は)自己抗原ではないであろうが、しかしそこで前記抗原に対する免疫応答
が原則的に個体にとって望ましくなく、有害であるような他の多くの疾患などの
免疫仲介障害が含まれる。セプシスは免疫伝達物質における症候群であり、たと
えば微生物感染、傷害または他の因子により誘発され、恒常性の異常、器官損傷
や結局は致死的なショックを引き起こす急性炎症状態を誘発する。セプシスは重
篤な感染への全身的反応に関係している。セプシス症患者は通常、発熱、心拍増
加、頻呼吸、白血球増加および感染の局在部位を示す。血液や感染部位からの微
生物培養は頻繁に、しかし例外なく陽性である。この症候群が低血圧または多臓
器機能不全(MOSF)に至ったとき、この状態をセプシスまたは敗血性ショッ
クと呼ぶ。最初は、微生物が感染病巣で増殖する。微生物は血流に侵入すること
が出来、結果血液培養陽性となったり、局所的に増殖し、さまざまな物質を血流
に放出しうる。このような物質は、病理学的に2つの基本的なカテゴリーに分類
される。内毒素と外毒素である。内毒素は典型的にはブドウ球菌のタイコ酸抗原
のような微生物の構成要素からなり、またはグラム陰性菌のLPSのような内毒
素である。外毒素(たとえば毒性ショック症候群毒素−1、ブドウ球菌エンテロ
トキシンA,B,またはC)は微生物により合成され直接放出される。
【0010】 その名前から示唆されるように、これらのタイプの細菌毒素は共に病原性を持
ち、血漿タンパク質前駆体または細胞(単球/マクロファージ、内皮細胞、中性
球、T細胞、および他のもの)からの大量の内因性の宿主由来免疫伝達物質の放
出を刺激する。
【0011】 実際、一般的に組織と器官の損傷を引き起こすこれらの免疫伝達物質はセプシ
スや敗血性ショックに関係する。これらの作用のいくつかは、伝達物質に直接誘
導される器官損傷をくい止めるものもある。しかしながら、ショック関連性器官
機能不全の一部はおそらく伝達物質仲介の脈管異常に起因し、全身性と局所性の
血流異常という結果となり、抵抗性の低血圧またはMOSFを引き起こす(Benne
tt et al.)。
【0012】 非肥満糖尿病(NOD)マウスは自己免疫疾患、この場合血中グルコース濃度
上昇(高血糖)が主要な医学的特徴であるインスリン依存性糖尿病(IDDM)
のモデルである。前記血中グルコース濃度の上昇は膵臓ランゲルハンス島のイン
スリン産生β細胞の自己免疫的破壊が原因であるとされている(Bach et al.1991
, Atkinson et al. 1994)。これは、CD4+およびCD8+Tリンパ球、Bリ
ンパ球、マクロファージと樹状細胞のヘテロ集団の混合によって構成されるこの
小島(インスリン炎)を取り囲み、透過する巨大な細胞の浸潤を伴う(O'Reilly et
al.1991)。
【0013】 NODマウスはβ細胞に対する自己免疫がIDDM発達の最初の段階であるモ
デルを表している。糖尿形成はヒトの疾患としては特定のMHCクラスII遺伝
子と複数の関係のない遺伝子座の間の階乗的な相互作用によって成立する。さら
に、NODマウスは遺伝と環境、また初期と二次的な自己免疫間の重大な相互作
用をきれいに示し、その臨床的兆候はたとえばさまざまな外的要因に依存し、最
も重要なのはNODマウスが飼われる環境の微生物量である。
【0014】 NODマウスにおける自己免疫に関しては、ほとんどの抗原特異的抗体および
T細胞応答はこれらの抗原が糖尿患者で自己抗原として検出された後に測定され
た。NOD糖尿病におけるこれらの自己抗原の役割の理解は、さらに病原性自己
抗原と付帯現象としての自己免疫とを区別することにつながるだろう。
【0015】 一般的に、Tリンパ球は免疫仲介疾患工程の開始に中心的役割を果たす。(Sem
pe et al. 1991, Miyazaki et al. 1985, Harada et al. 1986, Makino et al.
1986)。CD4+T細胞は少なくともTh1とTh2の2つの主要なサブセット
に分けられる。活性化したTh1細胞はIFN−γとTNF−αを分泌し、一方
Th2細胞はIL−4、IL−5およびIL−10を産生する。Th1細胞は有
効な細胞性免疫の形成に大きく関与しているのに対し、Th2細胞は酸性球と肥
満細胞の活性化およびIgE産生を含んだ液性と粘液性の免疫とアレルギーの形
成に役立っている(Abbas et al. 1996)。多くの研究がマウスとヒトの糖尿病と
Th1表現型分化とを関係づけている(Liblau et al.1995,Katz et al.1995)。
一方、Th2T細胞は比較的無害であると示されている。Th2T細胞は実際は
防御的であることを疑う人もいる。katz et alは、CD4+T細胞がナイーブな
レシピエントを糖尿に変化させる能力はTCRそれ自体によって認識される抗原
特異性ではなく、T細胞応答の表現型の性質に存在することを示した。強く分極
したTh1細胞が新生NODマウスに疾患を起こすが、一方Th2T細胞は、活
性化され糖尿形成性のTh1T細胞集団と同じTCRを持つにも関わらずそれを
起こさない。さらに、Th2T細胞を10倍以上同時に移入しても、Th2T細
胞はTh1誘導性糖尿病を好転させることができない。
【0016】 セプシスまたは敗血性ショックの発生率は1930年代から増加しており、最
近の全ての証拠は、この増加は続くであろうことを示唆している。この発生の増
加の理由は数多い。すなわち血管内カテーテルのような侵入性器具の利用の増加
、癌と移植に対する細胞傷害性、免疫抑制性薬物療法の広範な利用、セプシスを
起こしやすい癌や糖尿病患者の寿命の延長、および抗生物質耐性菌の感染の増加
である。セプシスまたは敗血性ショックは集中強化治療室における最も多い死因
であり、合衆国の死因の第13位である。この疾患の正確な発生数は、報告され
ないため知られていないが、しかしながら、合衆国での年間の概算では400,
000人がセプシスを発症し、200,000人の敗血性ショックの患者がおり
、この疾患で100,000人が死亡している。
【0017】 グラム陰性およびグラム陽性菌のようなさまざまな微生物は、真菌類を含め、
セプシスや敗血性ショックの原因となりうる。ある種のウイルスやリケッチアは
同様の症候群を形成させうる。グラム陽性菌と比べ、グラム陰性菌はセプシスや
敗血性ショックをある程度形成させやすいようである。どの部位に感染してもセ
プシスや敗血性ショックの原因となりうる。セプシスの頻度の高い原因は、腎炎
、肺炎、腹膜炎、胆管炎、小胞炎、または髄膜炎である。これらの感染の多くは
「院内(Nosocomial)」であり、他の医学的問題で入院している患者に起こる。
正常な宿主防御を持つ患者では、ほとんどの患者で感染部位を同定できる。しか
しながら、好中球減少症の患者では、おそらく小さく、医学的に現れない皮膚や
腸の感染が適当な好中球の循環のない血流への侵入を引き起こすために、背端酢
患者の半数以下で臨床的な感染部位を発見できない。明らかに、このような危険
を持つ患者においてセプシスまたは敗血性ショックから守る必要がある。
【0018】 最近、セプシスの患者を最も治療が効果的な臨床的病態の初期に特定すること
にかなりの努力が向けられている。定義は器官機能不全(循環器、呼吸器、腎臓
、肝臓、中枢神経系、血液、または代謝の異常)の証拠を伴った感染への全身性
反応(発熱、心拍増加、頻呼吸、白血球増加)の兆候を含む。もっとも最新の定
義では全身性炎症反応症候群(SIRS)という語句を用い、セプシスは感染に
よってだけでなく、外傷や膵炎のような非感染性の不全によっても引き金となり
うる生体の免疫学的に仲介される炎症反応であることを強調している(全身性炎
症反応(SIRS)、セプシスおよび敗血性ショックについての関係はCrit. Ca
re Med. 20:864, 1992を参照のこと;セプシスと敗血性ショックの病原的事象
の順序についての総説はN. Engl. J. Med. 328:1471, 1993を参照のこと)。
【0019】 毒性ショック症候群毒素(TSST−1)とは、臨床的に関連のある内毒素を
指し、毒性ショック症候群の患者の90%以上で原因物質として特定されている
(毒性ショックはスーパー抗原性外毒素が原因のセプシスまたは敗血性ショック
と定義されている)。スーパー抗原は「通常」の抗原とはMHC分子に提示され
る前に細胞内でのプロセッシングが必要でない点で異なっている。代わりにそれ
らはTCRの外部の半保存領域に結合し、MHCクラスII分子上に提示された
自己抗原の誤った「認識」の原因となる(Perkins et al, Huber et al. 1993)。
これはT細胞とAPC両方の「誤った」活性化を起こし、増殖、エフェクター機
能とサイトカイン分泌の活性化を引き起こす。スーパー抗原のT細胞のポリクロ
ーナルな活性化のために、大量の炎症性サイトカイン放出のための全身性の広範
なショックが引き起こされる(Huber et al. 1993, Miethke et al. 1992)。
【0020】 セプシスに関与する炎症性サイトカインは類似している。これらの免疫伝達分
子は腫瘍壊死因子(TNF)、インターフェロンγ(IFN−γ)、窒素酸化物
(NOx)とインターロイキン1(IL−1)であり、微生物毒素への応答とし
て単球、マクロファージや他のリ白血球によって大量に放出される(Bennett et
al. Gutierrez-Ramos et al. 1997)。TNFや他の内因性伝達分子の放出は、さ
まざまな器官へのリンパ球浸潤と炎症のみならず発熱、白血球減少、血小板減少
、血流力学変化、散発性の血管内凝固といった、全てが最終的に致死的となるセ
プシスの病理生理学的反応を引き起こしうる。TNFはまた内皮細胞に接着受容
体(セレクチン類)を発現させる原因となり、白血球を活性化して炎症部位への
接着、伸展そして移動のために内皮細胞表面に接着することを助けるこれらの受
容体へのリガンドを発現させる(Bennett et al.)。セプシスや敗血性ショック
の特定の動物モデルでは、モノクローナル抗体により接着段階を阻害すると組織
傷害を防ぎ生存率を改善した。
【0021】 自己免疫疾患と急性および慢性炎症疾患両方でのこれらの発見は、活性化した
Th−サブ集団間のバランスを調節している細胞の存在の仮定に同意する。その
ような調節T細胞集団の反応性の変化によって誘導されるこのバランスでの可能
性のある不釣り合いは、結果としてあるきわめて重要なサイトカインの欠損また
は過剰産生となる免疫仲介を引き起こしうる(O'Garra et al.1997)。これらの
Th−サブ集団は免疫応答の薬理学的調節に関する可能性のある標的である。
【0022】 一般的に、免疫仲介障害は処置するのが難しい。よく、コルチコステロイドで
の処置などの幅広く活性のある薬剤が適用され、または多くの局面で処置された
個体に対して有害であろう他の広く活性のある坑炎症剤が適用される。
【0023】 一般的に免疫系の抑制と均衡を調節し、免疫仲介障害を処置するためのよりよ
く、より特異的な可能性についての必要性が存在する。
【0024】 本発明は特に免疫レギュレータ(IR)、免疫仲介障害の処置のための医薬組
成物、免疫仲介障害を処置するための医薬組成物および方法を準備する場合のI
Rの使用を提供する。本明細書で記述したような免疫仲介障害には、I型または
II型糖尿病、リウマチ病、シェーグレン症候群、多発性硬化症などの慢性炎症
疾病、移植片対宿主疾病、輸血後血小板減少、慢性移植拒絶、子癇前症、アテロ
ーム性動脈硬化症、喘息、アレルギーおよび慢性自己免疫疾患などの移植関連免
疫応答、(超)急性移植拒絶、敗血性ショックおよび急性自己免疫疾患などの急
性炎症疾病が含まれる。自己免疫疾患は一般的に未知の原因の疾患の集合である
。これらの疾病のほとんどにおいて、自己反応性抗体および/または自己反応性
Tリンパ球の産生が発見できる。自己免疫応答はまた、ウイルスまたは細菌感染
の発現として起こる可能性もあり、またたとえばB型肝炎ウイルス感染による破
壊性肝炎のような重篤な組織障害となりうる。
【0025】 自己免疫疾患は、応答が最初に特定の器官に局在する抗原に対するのか、ある
いは広い範囲の抗原に対するのかどちらかに依存して、器官特異的または非器官
特異的として区分され得る。自己免疫疾患の処置の現在の主流は免疫抑制および
/または(組織障害のために)ホルモン置換のような生命組成物の置換である。
しかしながらステロイドまたは細胞増殖抑制性薬のような免疫抑制性薬剤は明ら
かな副作用を持っており、その適用を制限している。ここで、より特異的な免疫
調節薬の使用が自己免疫疾患および他の炎症の処置において本発明によって提供
される。たとえばTh1/Th2比を調節すること、樹状細胞の分化を調整する
ことによる以下に記述するような免疫調節特性、低副作用プロフィール、初期臨
床観察などを基準にすると、これらの製剤が自己免疫疾患などの免疫仲介炎症の
患者の処置にとても有用であることが示される。
【0026】 免疫疾患の非限定的なリストには、橋本甲状腺炎、原発性 (mysxoedema) 浮
腫甲状腺中毒、悪性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、アジソン病、早期閉経、インス
リン依存性糖尿病、スティッフマン症候群、グッドパスチャー症候群、重症筋無
力症、男性不妊症、天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因ブドウ膜炎、多
発性硬化症、自己免疫溶解性貧血、突発性血小板減少性紫斑病、突発性血小板減
少、原発性胆汁性肝硬変、活性慢性肝炎、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェー
グレン症候群、リウマチ様関節炎、皮膚真菌症、多発性筋炎、強皮症、混合結合
組織病、円板状エリテマトーデス、および全身性エリテマトーデスが含まれる。
【0027】 1つの実施形態において、本発明はTh1細胞レベルをダウンレギュレートす
るおよび/またはTh2細胞レベルをアップレギュレートすること、または動物
内でのその相対比に影響を与えることが可能な免疫レギュレータであって、尿、
または血清、乳清、胎盤抽出物、細胞または組織などの体性産生物の他の供給源
から入手可能な前記免疫レギュレータを提供する。本明細書で入手可能なものは
、直接的にまたは間接的に前記供給源から前記IRを入手することに言及してお
り、IRはたとえば化学合成を介してまたは天然の動物または植物供給源から入
手される。
【0028】 好ましい実施形態において、本発明は疾患動物(たとえばヒト)でのリンパ球
サブセット集団の相対比および/またはサイトカイン活性を調節し、好ましくは
これらのリンパ球サブセット集団はTh1またはTh2集団からなる。一般的に
、抗原提示細胞(APC)によって主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラス
II分子上に提示された関連抗原性ペプチドの刺激によって天然CD4+ヘルパ
ーT細胞(Th)は機能的に成熟エフェクター細胞に分化する。産生されるサイ
トカインの特徴的な組を基準にすると、Th細胞は一般に少なくとも2つの異な
るサブ集団、もっぱらインターロイキン−2(IL−2)、インターフェロン−
ガンマ(IFN−γ)およびリンホトキシンを産生するTh1細胞と、一方IL
−4、IL−5、IL−6、IL−10、IL−13を産生するTh2細胞に分
けられる。これらのTh1およびTh2サブセットはサイトカイン産生特性にお
いてこれらの分極化したサブセット中、両極をなすものであることがはっきりし
ており、個々のTh細胞は同等のサイトカイン遺伝子発現よりも差異を示す。こ
れらのサブセットは関連ペプチドによるIL−2、IL−4、IL−5およびI
FN−γを含むサイトカインの列を産生しているTh0細胞への誘引の後、共通
のTh前駆体細胞(Thp)から分化する。これらの活性化Th0細胞は、それ
らの微小環境の細胞性およびサイトカイン組成物に基づいてTh1またはTh2
へその後分極化する。マクロファージのサブセットに加え、樹状細胞の様々なサ
ブセットのような抗原提示細胞はTh1またはTh2サブセット分化へのこの分
極を広く決定する。Th1−TH2サブセットは、主にIFN−γおよびIL−
10を介してそれぞれのサイトカイン産生特性を交差調節することが明らかであ
り、この概念から、これらの2つのサブセット間のバランスの障害は結果として
異なる臨床的発現になるであろうことが合理的に解釈される[5]。IL−12
は、Th1サブセット分極化を促進している優性因子であり、樹状細胞およびマ
クロファージがIL−12を産生する。さらに、IL−12はT細胞およびナチ
ュラルキラー(NK)細胞によるIFN−γ産生を誘導する。最近、IL−18
がTh1分化を誘導するためにIL−12と相乗的に作用することが報告された
。Th2細胞の分極化はT細胞または好塩基球および肥満細胞によって産生され
るIL−4の存在に非常に依存する。APC−由来IL−6はまた分化している
Th細胞で少量のIL−4を誘導することも示された。IL−10およびAPC
−由来プロスタグランジンE2(PGE2)はIL−12の産生およびTh1起爆
を阻害する。
【0029】 Th1−Th2変化はTh1細胞の機能と細胞仲介免疫(炎症応答、遅延型過
敏症、および細胞傷害性)との相互関係およびTh2細胞と体液性免疫との相互
作用を明らかにするのに有用であった。一般的に、感染性疾患の間で、細胞内細
菌、真菌および原生動物への抵抗性は、好結果のTh1応答を行うことに関連す
る。Th1応答はまた、関節炎、大腸炎、および他の炎症状態のような病理にも
関連しうる。蠕虫などの細胞外病原体に対する効果的な保護は主としてTh2応
答を必要とし、増強された体液性免疫は結果として、特異的な抗体の産生による
病原体の好結果の中和となる可能性がある。
【0030】 さらに他の好ましい実施形態において、本発明は樹状細胞の分化を調整するこ
とのできる免疫レギュレータを提供する。Th1対Th2型細胞の選択的副産物
は、前駆体Th細胞と、そのMHCクラスII分子との結合での関連ペプチドを
運んでいる抗原提示細胞(APC)との相互作用に依存する。APCによって放
出され、樹状細胞と適切なT細胞レセプターを持つT細胞との間の最初の相互作
用の間に存在するサイトカインはTh1対Th2サブセットへの分化を駆動する
。最近、DC(脊髄性対リンパ性)に対する2つの異なる前駆体がヒトで記述さ
れた。骨髄性前駆体からのDC1の選択的分化がCD40リガンドまたは内毒素
での刺激後に起こり、結果としてIL−12の高産生となった。リンパ性前駆体
はCD40リガンド刺激後のDC2細胞への成長を促し、IL−1、IL−6お
よびIL−10を産生した。これらのサイトカインは活性化Th細胞の分化を駆
動する第1の重要物である。IL−4はIL−10の存在によって強く増強され
るTh2型細胞の成長に必要であり、一方Th1型細胞への選択的分化はIL−
12の存在にもっぱら影響される。DC1はIL−12の産生で特徴づけられる
ので、これらは、最初にTh1型細胞の成長を誘導し、一方DC2はIL−10
を産生し選択的に外因性IL−4の存在下でのTh2分化を促進する。本明細書
で、本発明によって提供されたようなIRはDC活性および分化を調節しまたは
調整でき、したがってTh1および/またはTh2細胞の選択的分化と活性化と
を可能にすることが示されている。
【0031】 1つの実施形態において、本発明は哺乳動物絨毛性ゴナドトロピン製剤から入
手可能な活性成分であり、非肥満糖尿病(NOD)マウスから入手した脾臓細胞
を刺激できる前記活性成分を含むか、またはたとえばDC活性かおよび分化を調
整し調節を可能にする、または、たとえば前記刺激された脾臓細胞が、前記脾臓
細胞で再構成させたNOD−重篤−複合−免疫不全マウスでの糖尿病の始まりを
遅延させることのできる、あるいは前記活性成分が非肥満糖尿病(NOD)マウ
スから入手した脾臓細胞のガンマ−インターフェロン産生を阻害できる、または
前記活性成分が非肥満糖尿病(NOD)マウスから入手した脾臓細胞のインター
ロイキン−4産生を刺激できるような本明細書での詳細な記述で示したような糖
尿病または慢性移植拒絶などの慢性炎症の場合、Th1および/またはTh2細
胞の選択的分化と活性化とを可能にするような前記活性化合物に機能的に関連し
た活性成分を含む免疫レギュレータを提供する。
【0032】 他の実施形態において、本発明は哺乳動物絨毛性ゴナドトロピン製剤から入手
可能な活性成分であり、たとえば前記活性成分がショックと共に一般的にみられ
るような組織不全の後または間にASATまたは他の関連する血漿酵素レベルを
減少させることが可能であるような本明細書での詳細な記述で示したように、シ
ョックまたは(超)急性移植拒絶と共にみられるような、急性炎症の場合、たと
えばDCの活性化および分化を調節し調整することを可能にする、またはTh1
および/またはTh2細胞の選択的分化と活性化とを可能にするような、敗血性
ショックを誘導するリポポリサッカライドに対してマウスを保護することが可能
な前記活性成分を含む免疫レギュレータを提供する。
【0033】 1つの実施形態において、本発明による前記免疫レギュレータは、詳述した記
述でさらに詳しく述べるように、ゲル浸透クロマトグラフィー内で決定されたよ
うな58〜15キロダルトンの明白な分子量で溶出した分画に存在している活性
成分を含み、そこでは関連する、阻害するまたは相乗作用する成分もまた見つか
った。他の実施形態では、本発明は詳述した記述でさらに詳しく述べるように、
前記活性成分がゲル浸透クロマトグラフィーで決定したように15キロダルトン
よりも小さい明白な分子量で溶出する分画に存在する免疫レギュレータを提供し
、たとえば前記活性成分はゲル浸透クロマトグラフィーで決定したように<1キ
ロダルトンの明白な分子量で溶出された分画に存在する。本発明による前記免疫
レギュレータは尿より簡単に入手できるけれども、たとえば前記哺乳動物絨毛性
ゴナドトロピン製剤が尿、またはゴナドトロピンを含む血清、細胞または組織の
ような他の供給源から得られるような場合も適切である。前記供給源からはまた
、たとえばTh1および/またはTh2細胞活性を調節でき、および/または樹
状細胞分化を調整できる本発明による免疫レギュレータも提供される。
【0034】 好ましくは、本発明で提供されたような免疫レギュレータは、妊娠哺乳類、好
ましくはヒトから入手可能であり、たとえば妊娠メス馬の血清中で発見された妊
娠メス血清ゴナドトロピン(PMSG)(IR−S)、または妊娠しているマウ
スの子宮より抽出された妊娠マウス子宮抽出物(PMUE)(IR−UE)、ま
たは妊娠女性の血液または尿で発見されたヒト絨毛ゴナドトロピン(hCGまた
はHCG)のような(胎盤)ゴナドトロピンを含むように調製した薬理学的製剤
から入手可能である。本発明によって提供されたようなIRは、たとえば妊娠の
第1トリメスターの尿(IR−U)および商業的hCG製剤(IR−P)が免疫
調節効果を有しているので、ゴナドトロピンに関連できるかあるいは関連できな
いかであろう。とりわけ、IRは自己免疫および急性、慢性炎症疾患を阻害また
は調節できる。TNFおよびIFN−ガンマはセプシスまたは敗血性ショックな
どの急性炎症疾患に、また自己免疫および慢性炎症疾患に薬理学的に関連する。
IRはT細胞サブセットを調節する能力を有しており、TNFおよびIFN−ガ
ンマを阻害するので、IRはセプシスまたは敗血性ショック(急性炎症疾患)の
ような免疫仲介障害、および全身性エリテマトーデス、糖尿病、リウマチ様関節
炎、分娩後甲状腺機能不全、自己免疫貧血およびアレルギーや慢性炎症疾患(す
なわちリウマチ病、シェーグレン症候群、多発性硬化症)および移植関連免疫応
答のような他の疾病などの自己免疫疾患または慢性炎症疾患を、処置し、抑制し
、防止するのに使用できる。本願発明者らの結果はたとえばIRが内毒素によっ
てまたは外毒素によって引き起こされたセプシスまたは敗血性ショックを阻害す
ることを示す。本発明によって提供されたようなIRは、急性炎症疾患と同様に
免疫仲介自己免疫疾患、慢性炎症疾患を抑制するかまたは阻止する。
【0035】 本発明はアレルギー、自己免疫疾患、移植関連疾患、急性または慢性炎症疾患
などの免疫仲介障害を処置するための医薬組成物を提供し、および/またはたと
えば活性成分を含むリンパ球作用を刺激し、または調節するための免疫レギュレ
ータ(IR)を提供し、前記活性成分は20週齢メス非肥満糖尿病(NOD)マ
ウスより入手した脾臓細胞を刺激でき、前記刺激された脾臓細胞は前記脾臓細胞
で8週齢時に再構築されたNOD−重篤−複合−免疫欠失(NOD.scid)
マウスでの糖尿病の始まりを遅延し、またはそれに機能的に関連した活性成分を
含む。
【0036】 1つの実施形態において、本発明は前記活性成分が20週齢メス非肥満糖尿病
(NOD)マウスから入手した脾臓細胞のガンマ−インターフェロン産生を阻害
し、またはインターロイキン−4を刺激することができるような医薬組成物また
は免疫レギュレータを提供する。hCGおよびPMSGのようなゴナドトロピン
の臨床的品質の製剤が長い間、小胞増殖または排卵刺激が望ましい状態での再産
生不全の処置を助けるために使用されてきた。前記製剤は一般的に血清または尿
から入手し、また精製および相対的活性の度合いが、血清または尿中の最初の濃
度に依存し、そして使用した調製の様々な方法に依存してしばしば変化する。
【0037】 特定の実施形態において、本発明は哺乳動物CG製剤より入手可能な活性成分
であって、非肥満糖尿病(NOD)マウスから入手した脾臓細胞を刺激できるよ
うな前記活性成分を含むか、またはたとえば前記刺激された脾臓細胞が前期脾臓
細胞で再構築したNOD−重篤−複合−免疫欠失マウスでの糖尿病の始まりを遅
延できるような前記活性成分と機能的に関連する活性成分を含む免疫レギュレー
タを提供する。
【0038】 本発明はまた、前記活性成分が非肥満糖尿病(NOD)マウスから入手したガ
ンマ−インターフェロン産生物を阻害できるような免疫レギュレータも提供する
。本発明はまた前記活性成分が非肥満糖尿病(NOD)マウスから入手した脾臓
細胞のインターロイキン−4産生を刺激することができるような免疫調整剤も提
供する。
【0039】 たとえば妊娠の第1トリメスターの尿中(IR−U)および商業的なhCG製
剤中(IR−P)で存在するようなhCG存在または非存在で本発明によって提
供されたような免疫レギュレータ(IR)は免疫調節効果を持つ。とりわけIR
は自己免疫および急性、慢性炎症疾患を阻害または調節できる。TNFおよびI
FN−ガンマは病理学的に、セプシスまたは敗血性ショックのような急性炎症疾
患に関連し、また自己免疫および慢性炎症疾患にも関連する。IRはT−細胞サ
ブセットを調節する能力およびTNFおよびIFN−ガンマを抑制する能力があ
るので、IRはセプシスまたは敗血性ショック(急性炎症疾患)のような免疫仲
介障害、および全身性エリテマトーデス、糖尿病、リウマチ様関節炎、分娩後甲
状腺機能不全、自己免疫貧血およびアレルギーや慢性炎症疾患(すなわちリウマ
チ病、シェーグレン症候群、多発性硬化症)および移植関連免疫応答のような他
の疾病などの自己免疫疾患または慢性炎症疾患を、処置し、抑制し、防止するの
に使用できる。本願発明者らの結果はたとえばIRが内毒素によってまたは外毒
素によって引き起こされたセプシスまたは敗血性ショックを阻害することを示す
。本発明によって提供されたようなIRは、急性炎症疾患と同様に免疫仲介自己
免疫疾患、慢性炎症疾患を抑制するかまたは阻止する。
【0040】 不確かな観察および実験室での研究は、hCGが坑カポージ肉腫および坑ヒト
免疫不全ウイルス効果を有するであろうことをすでに示唆している(Treatment
Issues, July/August 1995,ページ15)。hCG製剤はin vitroで免疫
不全患者およびマウスにてカポージ肉腫(KS)上で直接のアポトーシス(細胞
傷害性)効果を有し、免疫不全患者での前造血効果を有することが観察され(Lu
nardi-Iskandar et al.,Nature 375,64-68; Gill et al., New.Eng.J.Med.335,
1261-1269, 1996;米国特許第5677275号)、ヒトおよび類人猿免疫不全
ウイルス(HIVおよびSIV)における直接の抑制性抗ウイルス効果を有する
ことが観察された(Lunardi-Iskandar e t al., Nature Med.4,428-434,1998,
米国特許第5700781号)。前記細胞傷害性および抗ウイルス効果はまた、
臨床的品質のhCG製剤中に存在する未知のhCG仲介因子(HAF)に起因し
てきた。しかしながら、商業的なhCG製剤(CG-10、Steris Profasi、Pregnyl
、Choragen、Serono Profasi、APLなど)は様々な効果を有している。これらの
いくつかの解析(AIDS,11:1333-1340,1997)はたとえばただいくつか(CG-10
、Steri s Profasiなど)がKS−殺傷性であり、一方他(Pregnyl、Choragen、
Serono Profasi)はそうではないことを示している。第二に、(αまたはβ)h
CGの組換え体サブユニットは殺傷するが、もとの状態の組換え体hCHはそう
ではない。殺傷効果はまたリンパ球でもみられたことも見いだされた。KSの治
療は最近その抗腫瘍効果のためにベータ−hCGを使用することに向けられ(Eu
r.J.Med Res,21:155-158,1997)、尿から単離されたベータ−コア断片がKS細
胞において最も高いアポトーシス活性を有していることが報告された(AIDS,11:
713-721,1997)。最近、Gallo et al.はヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)の
臨床品質未精製製剤の坑カポージ肉腫、坑HIV、坑SIVおよび明確な造血効
果を報告した(Lunardi-Iskandar et al.,1995, Gill et al. 1996, Lunardi-Is
kandar et al.,1998)。これらの先行研究と対照的に、hCG製剤の抗腫瘍およ
び抗ウイルス活性は、その精製されたサブユニットまたはその主要な分解産生物
、β−コアを含む野生型hCGヘテロダイマーによらず、代わりにまだ同定され
ていないhCG仲介因子(HAF)としてその中の活性部位残基によることが主
張されている。本当の因子が何であろうと、さまざまなhCG製剤内のこれらの
未同定の因子は、腫瘍細胞における直接の細胞傷害性効果に加えて、選択的なア
ポトーシスの誘導を通して抗腫瘍活性を有する。さらに、単核細胞での腫瘍の浸
潤がないことから、抗腫瘍効果が免疫仲介応答のためであり得ないと仮定してい
る。
【0041】 さらに、報告された臨床品質のhCGの前造血効果はHIVに感染したヒトで
の臨床研究で注目され(Lunardi-Iskandar et al.1998)、造血効果は間接的で
あり、CD4+細胞の救出によって引き起こり、さもなくばhCGの坑HIV活
性を介してHIVによって殺される。
【0042】 本発明はhCG製剤またはその誘導された断片より入手可能な、免疫仲介障害
の処置のための免疫レギュレータまたは医薬組成物を提供する。前記免疫レギュ
レータの効果には、細胞傷害性または抗ウイルス効果の代わりに(末梢リンパ球
、胸腺細胞または脾臓細胞で発見されるような)リンパ球集団における刺激効果
が含まれる。本発明は、妊娠哺乳動物から入手可能な少なくとも1つの免疫レギ
ュレータでの処理を動物に行うことを含む免疫仲介障害を処置する方法を提供す
る。前記処置は直接的であり、たとえば処置は前記個体に、本発明で提供したよ
うな免疫レギュレータを含むhCGまたはPMSG製剤のような医薬組成物を与
えることを含んでよい。またたとえば尿または血清または(母親起源または胎児
起源の)胎盤または他の組織または細胞からサンプリングすることで、そして(
たとえばゲル浸透クロマトグラフィーなどの)本技術分野で公知の分別技術によ
って前記尿または血清または組織または細胞から前記活性成分を含む前記免疫レ
ギュレータを調製することで、そして記述したようにNODマウスまたはその脾
臓細胞を刺激することによってその活性成分を試験することで、妊娠動物から由
来する分画または分画群で前記医薬組成物を提供することもできる。とりわけ、
胎児は潜在的に、敵対する免疫攻撃を引き起こすことなく本質的に子宮内の外来
の組織として発達する、その母親との胎児免疫学的葛藤から生き延びなければな
らないので、前記製剤または成分が好ましく妊娠動物より由来する。したがって
、この「同種移植片(allog raft)」拒絶を防ぐために、母親および胎児間の免
疫学的相互作用が、母親のリンパ球への胎児抗原の浸透の欠如を介してか、母親
リンパ球の機能的「抑制(suppression)」を介してかのいずれかですぐに抑制
されなければならない。胎児抗原が提示された場合、母親の免疫応答はほとんど
有害でない、抗体仲介Tヘルパー2(Th2)型へ偏るであろう。このことは、
妊娠女性が症例ではない極度の感染に感受性になることを示唆する。妊娠中のメ
ス個体はその感染への抵抗性を保持しまたは増加させさえする。さらに、前記個
体は通常オス個体と比べて免疫疾患、特に自己免疫疾患に、より感受性になる一
方で、妊娠中これらの疾患に、より抵抗がある。
【0043】 本発明はまた、リンパ球のin vitro刺激および前記刺激されたリンパ
球を医薬組成物として免疫仲介障害についての動物の処置のために前記動物に移
入させるための方法を提供する。本発明の特定の実施形態において、医薬組成物
が本発明によって提供された免疫レギュレータでin vitroで刺激したリ
ンパ球を含んで提供される。
【0044】 本発明の好ましい実施形態において、前記障害には糖尿病、さらに急性、慢性
炎症などの他の免疫仲介障害が含まれ、処置され得る。他の好ましい実施形態に
おいては、前記障害にはセプシスまたは敗血性ショックが含まれる。本発明は動
物に対する処置の方法を提供し、好ましくは前記動物はヒトである。
【0045】 特定の実施形態において、本発明によって提供された方法はさらに、Th1ま
たはTh2細胞、またはTh3またはTh8細胞、または他のエフェクターまた
は調節T細胞集団を含むサブセット集団のような前記動物でのリンパ球サブセッ
ト集団の相対比および/またはサイトカイン活性化またはサイトカイン発現また
はマーカー発現を調節することを含む。
【0046】 本発明はまた本発明による方法での使用のための免疫レギュレータおよび好ま
しくはアレルギー、(全身性エリテマトーデスまたはリウマチ様関節炎などの)
自己免疫疾患、移植関連疾患、(敗血性またはアナフィラキシーショック、また
は急性または超急性移植拒絶などの)急性および(アテローム性動脈硬化症、糖
尿病、多発性硬化症または慢性移植拒絶などの)慢性炎症疾患を含む群より選択
した免疫仲介障害の処置のための医薬組成物を作るための、好ましくは妊娠哺乳
動物より入手可能な前記免疫レギュレータの使用を提供する。さらに、本発明は
、前記免疫仲介障害が喘息または寄生虫性疾患などのアレルギーを含むような本
発明による使用、または前記免疫仲介障害が、ウイルスまたは細菌などの感染物
に対して示された過度の強力な免疫応答を含むような本発明による使用を提供す
る。しばしばこれらの疾患のほとんどで、自己反応性抗体および/または自己反
応性Tリンパ球の産生が、あまりに強い免疫応答の一部分を展開し、または担っ
ているとみることができる。このことは、たとえば、IgE産生が過度に強くま
たは疾患がTh2依存である寄生虫性疾患でみられ、器官に有害であり、またT
BCまたはハンセン病のような(微)細菌感染でもみられる。自己免疫応答はま
た、たとえばB型肝炎ウイルス感染による破壊的肝炎のようにウイルスまたは細
菌感染の顕在化としてあらわれ得、結果として深刻な組織損害となり得、または
リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)感染でもみられる。前記過度に強い
免疫応答は本発明によって提供されたような免疫レギュレータで溝において続く
。本発明によって提供されるようなまた他の使用は血管疾患の処置に関連し、そ
こでは細胞および組織に対するラジカル障害(ラジカルに起因する障害)が本発
明によるIRで処置することで防止されまたは回復し、またIRは直接的または
間接的に坑オキシダントとして働く。たとえば、I型糖尿病の病因の決定事象は
インスリン産生膵臓ベータ細胞の破壊である。ベータ細胞量の進行性減少が慢性
自己免疫応答の結果であるという強い証拠が存在する。この過程中、島浸潤免疫
細胞、島微小内皮細胞およびベータ細胞それ自身が細胞傷害性伝達物質を放出で
きる。サイトカインおよび特に一酸化窒素(NO)は強力なベータ細胞毒性エフ
ェクター分子である。反応性ラジカルNOは、主に広がったDNA鎖の破壊の誘
導を介してその有害な効果を仲介し、酸素などの他のラジカルはTh1およびT
h2細胞のようなリンパ球のサブ集団へのその効果を介して仲介する。この最初
の損傷はベータ細胞の死で終了する連鎖事象を引き起こし、免疫応答の混乱を引
き起こす。
【0047】 さらに、本発明による免疫レギュレータは細胞−細胞間相互作用、または細胞
応答、とりわけ、たとえば先天性または後天性免疫系の相互作用の調節に関連し
た免疫学的特質の細胞の相互作用または応答を誘導または支配するラジカルを調
節することができる。理論によって結びつけようとするわけではないが、免疫系
には2つの部分、すなわち先天性(非特異的)および後天性(特異的)系があり
、両方とも細胞性および体液性成分を有する。先天性免疫系の細胞性成分の例は
単球、マクロファージ、顆粒球、NK細胞、肥満細胞、gd T細胞などであり
、一方体液性成分の例はリソザイム、補体、急性期タンパク質およびマンノース
結合レクチン(MBL)である。後天性免疫系の主要な細胞性成分はTおよびB
細胞であり、一方体液性成分は抗体である。後天性系は感染およびより多い多細
胞器官での過剰な存在の除去におけるその特異性、有効性ゆえに最も研究されて
きた。先天性系はしばしば原始的なものであると見なされ、「単純である(unso
phisticated)」と考えられる。しかしながら、先天性系は存続しているだけで
はなく、もっとも基礎的な免疫攻撃のひとつ、すなわち胎生にて重大な役割を果
たし得る。先天性系はリンパ球に対する主要組織適合遺伝子複合体(MHC)ク
ラスIおよびII分子と関連した抗原の処理および提示によって免疫応答をはじ
めさせる。全応答はしばしば、先天性免疫系との相互作用を介して表面分子また
はサイトカインを共刺激的に産生する(内毒素のような)アジュバントを必要と
する。このことは抗原の生物学的重要性を決定し、この情報を後天性系に伝達す
る。よってこれは後天性系に応答するかどうかを指示する。よってこれらの2つ
の大きな免疫系の部分は、互いに影響するだけでなく、少なくともたとえばサイ
トカインおよび共刺激分子などを介して細胞レベルでは互いに調節する。
【0048】 これらの2つの系が別々にまたは組み合わせで関与するような多くの生理学状
態および免疫病理学がある。たとえば妊娠において母親の先天性免疫系がさらに
刺激されるということが明らかにされ、あるいはII型糖尿病が慢性過活動先天
性免疫系の疾患であるということが提案されてきた。他の例としてはリステリア
症での先天性免疫系の関与がある。後天性免疫系での調節不全が全身性のまたは
器官特異的な自己免疫、アレルギー、喘息などのような免役疾患を引き起こす可
能性もあるが、しかし妊娠の維持および「同種移植片」拒絶の防止で重要な役割
も果たすことができる。
【0049】 上述したように、後天性系は感染を除去する時点の特異性、有用性のため、お
よびより多い多細胞器官での過剰な存在のためによく研究されてきている。その
調節もまたよく研究されてきた。たとえば、サイトカイン微小環境が免疫応答の
間のTh1またはTh2細胞型へのTヘルパー細胞分化で鍵となる役割を果たし
ていることがよく知られている。IL−12はTh1分化を誘導し、一方IL−
4はTh2分化を誘導する。最近樹状細胞のサブセット(DC1、DC2)がT
h1細胞かTh2細胞のどちらかの分化を決定する異なるサイトカイン微小環境
を提供することも示されてきた。さらに、成熟T細胞応答からの負のフィードバ
ックループがまた、好ましい樹状細胞サブセットの生存を調節し、したがって選
択的に延長されたTh1またはTh2応答を阻害する。さらに、Th1応答の発
達が、IL−4によって直接的に、そして先天性免疫応答によって刺激されたマ
クロファージによるIL−12およびインターフェロン−g−誘導因子(IGI
F)の産生を阻害するIL−10によって間接的に拮抗されうる。増殖および分
化するのにIL−4に依存しているTh2細胞は、アレルギー性およびアトピー
性顕示に関わり、さらにIL−4およびIL−10のそれらの産生を介して寛容
での役割を果たすことが示唆されている。とりわけ、Th1からTh2への変換
が器官特異的自己免疫病状の発達を防止でき、妊娠の維持に必要であったことが
示唆されてきた。最近異なるサブセットの調節T細胞がTh1およびTh2応答
両方の原因となり、また免疫病状の発達を防止するということが明らかになって
きた。これらの調節T細胞の多くの共通の特徴の1つは、その機能が少なくとも
部分的にTGF−ベータの作用によることであり、このことはIL−10が優先
的にTh1のみを抑制する一方で、Th1およびTh2分化両方を阻害するTG
F−ベータの能力によって続くであろう。
【0050】 Th1対Th2型細胞の選択的成長は前駆体Th細胞のそのMHCクラスII
分子と結合する関連ペプチドを運んでいる抗原提示細胞(APC)との相互作用
に依存する。APCによって放出され、樹状細胞と適切なT細胞レセプターを持
つT細胞間の最初の相互作用の間存在するサイトカインは、Th1対Th2サブ
セットへの分化を駆動する。最近、DC(脊髄性対リンパ性)に対する2つの異
なる前駆体がヒトで記述された。骨髄性前駆体からのDC1の選択的分化がCD
40リガンドまたは内毒素での刺激後におこり、結果としてIL−12の高産生
となった。リンパ性前駆体はCD40リガンド刺激後のDC2細胞への成長を促
し、IL−1、IL−6およびIL−10を産生した。これらのサイトカインは
活性化Th細胞の分化を駆動する第1の重要物である。IL−4はIL−10の
存在によって強く増強されるTh2型細胞の成長に必要であり、一方Th1型細
胞への選択的分化はIL−12の存在にかなり影響される。DC1はIL−12
の産生で特徴づけられるので、これらは、最初にTh1型細胞の成長を誘導し、
一方DC2はIL−10を産生し選択的に内因性IL−4の存在下でのTH2分
化を促進する。
【0051】 特定の実施様態において、前記免疫レギュレータには臨床的品質のhCGまた
はPMSG調製品またはその誘導された断片が含まれる。たとえば、本発明は糖
尿病の処置のための医薬組成物を準備するための、hCG調製品またはそれと機
能的に同等の調製品の使用を提供する。また他の例では、本発明はセプシスまた
は敗血性ショックの処置と防止のための医薬組成物の準備のための、hCG調製
品またはそれと機能的に同等の調製品の使用を提供する。たとえば、本発明は前
記処置にたとえば処置した個体におけるTh1および/またはTh2のようなリ
ンパ球のサブセット集団の相対比および/またはサイトカイン活性化を調節する
ことが含まれるような本発明による使用を提供する。
【0052】 本発明はさらに、候補免疫レギュレータ分画の治療的効果を決定することを含
む免疫レギュレータの選択のための方法を提供する。例示のため実験モデルとし
て有用なNODマウスのような糖尿病の兆候を示す傾向にある動物に尿分画また
はそれより誘導された分画を与えることで、そして本質的に前記動物での糖尿病
の発達を決定することで、そこでそのような免疫調節分画または活性成分が選択
されまたは同定されるような方法が得られる。また他の実施様態において、本発
明はLPSまたは他の毒素の影響を受けたことがあるマウスのような敗血性ショ
ックの兆候を示す傾向にある動物に尿分画またはそれより誘導された分画を与え
、前記動物での敗血性ショックの発達を測定することで免疫レギュレータの治療
的効果を決定することを含む免疫レギュレータを選択するための方法を提供する
。好ましくは本発明による方法は、前記治療効果がさらに前記動物でのリンパ球
サブセット集団の相対比および/またはサイトカイン活性を決定することで測定
されるか、または前記治療的効果がさらに前記動物での酵素レベルを決定するこ
とまたはたとえば本明細書で詳細に記述して示したような本技術分野で公知の他
の臨床的パラメータを測定することで測定されるのが好ましい。
【0053】 理論によって結びつけるつもりはないが、本発明者らの結果は、本発明によっ
て提供されたようなIRはin vivo(BALB/c、NOD)およびin
vitroでのTh1/Th2バランスを調節できることを示している。NO
Dのような優性Th1発現系モデルにおいて、他のものの中で(TR−Pおよび
その分画のような)IRはIFN−ガンマ産生をダウンレギュレートし(in
vivo/in vitro)、IL−4産生とは対照的にIL−10およびT
GF−ベータ産生を促進し、このことはIRによるTh3およびTh1のような
調節細胞の誘導を示している。これらの調節細胞は免疫および炎症疾病および免
疫寛容でのIRの臨床的効果において役割を果たしている可能性がある。本発明
者らはまた、IRおよびその分画が、別々にIFN−ガンマ産生の阻害を和らげ
るようには見えない分画IR−P3およびrhCGを除いて、in virto
およびin vivoでIFN−ガンマの産生を阻害できることを示した。IR
−P3とrhCGの組合せはより強いIFN−ガンマの阻害を与える。このこと
はこれらのモデルでの少なくともそのIFN−ガンマ阻害について、rhCGに
対するIR−P3の必要性を暗示している。これはまたin vivoでの処置
NODマウスから入手した坑CD3刺激脾臓細胞に対して、またはTh2表現系
へのTヘルパー細胞の分極に対して暗示している。
【0054】 さらに、IR−P、その分画(IR−P1、IR−P2、IR−P3)および
rhCGとの組合せでのIR−P3はすべてB細胞のIgG2aへのクラススイ
ッチを阻害でき、一方IR−P2およびrhCGはなんの阻害の緩和も与えなか
った。IFN−ガンマ産生および分化における本発明者らの結果は、IgG2a
阻害に対してIR−P3が最大の結果を与えるためにはrhCGは必要ないこと
を本発明者らはみたのであるが、IR−Pと比較したときR−P3のみでは最大
の効果を持たなかったことを示した。しかしながらIR−P3の影響下でのIL
−10の産生の増加はIR−P1のそれより少なかった。このことは、IL−1
0、hCGの最大産生に対して、それらの分解産生物またはIR−P3との組合
せでのIR−P1でのまだ未知のサブ分画が必要であることを示唆している。I
R−P3のみはすでにIL−10産生を促進できることから、IgG2aの産生
を阻害するために他の分画または成分は必要ない。
【0055】 本発明者らはまた本発明によって提供されたようなIRがBALB/c動物モ
デルにおいて(in vitroでおよびex vivoで)IFN−ガンマ産
生とIL−10、TGF−ベータ、IL−4およびIL−6の促進を阻害できる
ことを示した。したがって、少なくともこれらのサイトカインがIRによる免疫
応答の調節で、および調節細胞の誘導に関与することが明らかである。著しく、
IRはNODとは対照的にBALB/cマウスで(ex vivoで)坑CD3
刺激脾臓細胞の増殖を促進する。このことは自己免疫疾患モデルであるNODと
明確な免疫病状のない動物モデルであるBALB/cの違いを反映している可能
性がある。両方(NOD/BALB/c)の動物モデルにおいて、IRは脾臓の
LPS刺激増殖を促進する(in vitroおよびex vivo)。
【0056】 NODおよびBALB/cマウスでの本発明者らのDC実験は、IRがただT
細胞応答を調節するだけでなく、DCの成熟化および機能を調節できることを示
している。専門的な抗原提示細胞(APC)として機能するDCは、免疫寛容に
おいて重要な役割を果たす。アロ−MLR中のIRでのC57B/6 DCの処
理はT細胞増殖をダウンレギュレートすることができる。このことはIRがまた
寛容の状態の誘導を促進することができることを示す。これらのデータを基に、
本発明者らは、IRで処置したレシピエント(BALB/c)へのMHCと非M
HCの非両立性皮膚(C57BL/6)移植を行った。本発明者らのデータは、
対照群において同種移植片(皮膚)は15日以内に完全に拒絶され、一方3回I
Rで処置したレシピエントマウスの皮膚移植片は21日後に拒絶された。したが
ってIRは移植片拒絶を遅延することができる。本発明にて提供されたようなI
Rは免疫疾患に対する多くの動物モデルにおける免疫病状を阻害することができ
る。IRは(糖尿病に対する)NODモデル、および(MSに対する)EAEモ
デルでの免疫病状および臨床的症状を阻害し、同種移植片拒絶を阻害し、SZT
−誘導糖尿病を遅延させる。本発明者らのデータはまたIRは異なる細胞集団に
おいて効果を持つことを示している。IRはT細胞に影響を与え、したがってT
h1/Th2バランスを調節し、言い換えるとただT細胞を調節するだけでなく
APC区画における影響を持つような調節細胞を誘導する。さらに、IRはAP
C区画を直接的に調節でき、先天性および後天性免疫応答に影響を与えることが
できる。そのように行うことにより、IRはただ後天的免疫系の不均衡にも起因
する疾患に影響を及ぼすことができるだけでなく、先天性免疫系または両方の系
の不均衡に起因する疾患に影響を及ぼすことができる。たとえば、II型糖尿病
の原因におけるサイトカインと先天性免疫系の役割が重要でありそうである。最
近遺伝的に、さもなければ先に処理した対象での加齢および栄養過多のような未
知の因子がマクロファージのような細胞からのサイトカインの分泌の増加、さら
にはアテローム性動脈硬化症プラークからのサイトカイン分泌を引き起こすこと
が示唆された。サイトカインによって誘導される急性期応答には(VLDLトリ
グリセリドを上昇させ、HDLコレステロールを低下させる)異常脂血症および
フィブリノーゲンのようなアテローム性動脈硬化症への他のリスク因子が含まれ
る。サイトカインはまた、膵臓ベータ細胞(インスリン分泌の改善に貢献)、脂
肪組織(レプチン放出の刺激)および脳、刺激コルチコトロピン放出ホルモン、
ACTHおよびしたがってコルチゾール分泌においても働く。後者は中枢神経肥
満、高血圧およびインスリン抵抗性に寄与する可能性がある。インスリン抵抗性
のさらなる原因は、サイトカインTNF−アルファであり、これはインスリンレ
セプターのチロシンキナーゼ活性を阻害する。微小血管または巨大血管合併症の
ないII型糖尿病患者は高い急性期応答を持ち、しかし組織合併症はII型糖尿
病でさらにストレス反応物を増加させる。アテローム性動脈硬化症であり糖尿病
ではない対象において、「血液病学的ストレス症候群(haematological stress
syndrom)」が多年間認められ、フィブリノーゲン、血液粘性増加および血小板
数と活性の増加のような高急性期反応物をふくむ。内皮細胞、平滑筋細胞および
アテローム性動脈硬化症プラークのマクロファージによって産生されたサイトカ
インがアテローム性動脈硬化症でみられる急性期応答に寄与しうる。樹立した急
性期タンパク質またはフィブリノーゲン、血清アミロイドA、PAI−1、Lp
(a)リポタンパク質およびVLDLトリグリセリドなどの心臓血管疾患に対す
る推定リスク因子に加えて、前炎症サイトカインが糖尿病合併症部位で、または
内皮、平滑筋細胞およびマクロファージ上で働くことによってアテローム性動脈
硬化症を悪化させうる糖尿病工程それ自身によって産生された。したがって、お
そらくサイトカインおよびアテローム性動脈硬化症を含む正のフィードバックが
あり、おそらく糖尿病での動脈性疾患の加速を止める。プラークはサイトカイン
を産生し、これはさらにアテローム性動脈硬化症の工程を局部的に悪化させ、し
かしまた急性期タンパク質の循環の増加を引き起こし、これらの多くがそれ自身
アテローム性動脈硬化症のリスク因子である。
【0057】 手短に記すと、サイトカインおよび先天性免疫系はII型糖尿病およびアテロ
ーム性動脈硬化症の機能上の変化で中心的な役割を担う。IRはそのような応答
を調製する能力を持つので、これはII型糖尿病およびアテローム性動脈硬化症
およびその合併症に有用でもある。さらにIRは、活性酸素種(ROS)が重要
な役割を果たしているHD−STZモデルにおける糖尿病のような疾患の誘導を
遅延させることができ、したがってIRはまた直接的または間接的に坑オキシダ
ントとして作用でき、またこのことが糖尿病および関連疾病の処置と防止に有用
である理由である。さらに、本発明は本発明による方法によって選択された免疫
レギュレータ、そのような選択された免疫レギュレータを含む医薬組成物を提供
し、免疫仲介障害の処置のための医薬組成物の調製のための前記方法を提供する
。生体活性IRを含む分画を液体クロマトグラフィーによって均質に精製した。
MALDI−TOF(マトリックス補助レーザー質量脱着/イオン化−飛行時間
)を用いてデータベーススクリーニングと組み合わせた質量分析計での直接の解
析により、IRまたは多重分子複合体でのその断片の特性化ができる。核磁気共
鳴分光学がIR中の水素原子への結合の型およびIRの分子構造の情報を提供す
る。赤外および近紫外分光はIRの構造的決定を補助する。MALDI−TOF
およびNMR解析は分離、そして必要であれば生体活性IRの二次的配列決定お
よび合成を補足する。化学的変異挿入をIRの化学的組成物を変異させるように
行い、バイオセンサーシステムのような好ましい検出系での定量的および定性的
結合解析を行うことで、レセプター/アクセプターでの相互作用部位の正確なマ
ッピングが可能である。
【0058】 化学的、遺伝的修飾によるIRの誘導体を、IRまたはIR含有混合物の活性
を実証する上記方法またはアッセイで、生物活性について再び試験した。さらに
、本発明はIRのレセプターの存在の立証を提供する。(妊娠)尿の様々な分画
、商業的hCG調製品またはその断片、組換え体hCGまたはその断片に公知の
量のIRを打ち込んだ。混合物をゲル浸透クロマトグラフィーにて解析し、加え
たたIRとフリーのIRのない言及した試料と比較した。IRピークのより大き
い分子量分画へのシフトは、レセプター/アクセプターの存在を示唆している。
(IRをレセプター/アクセプターより置換した後の)IR活性についての分画
を解析することはシフトしたIRピークを含むこの溶出プロフィールを検証した
。シフトしたIR活性を含む分画から、レセプター/アクセプターを液体クロマ
トグラフィーで精製し、置換によってIRの機能を検証した。さらにIRをヨウ
素で処理し、第1トリメスター妊娠尿の分画、商業的hCG調製品またはその断
片および混合物へ打ち込み、還元および非還元下SDS−PAGE(ドデシル硫
酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)のような好ましい検出系で評
価した。このようなゲルのブロットをSTORM技術を用いて定量的蛍光体イメ
ージング解析のような系で解析した。IRをアフィニティークロマトグラフィー
の方法によって結合している部分を単離することができる化学的架橋または担体
タンパク質の使用によって、たとえばアフィジェル(Affigel)に固定化した。
引き続く溶出で精製されたレセプター/アクセプター分子が得られる。このレセ
プター/アクセプターを可溶性または膜結合形態での細胞外および細胞内供給源
より単離し、活性化したバイオセンサー表面に固定化した。ついで様々な濃度の
IRをこのセンサー表面でプローブし、結果の結合プロフィールより結合速度定
数および解離速度定数を決定し、親和定数を計算した。IRおよびレセプター/
アクセプターの異なる混合物のプローブ化によって、結合エピトープの特性の情
報を得るためにエピトープマッピングを評価した。非疾病状態下およびIRの活
性に関連ある様々な免疫および関連障害の間での細胞発現および組織分布を査定
するために、膜結合形態でのIRレセプターの検出を可能にするために(たとえ
ば蛍光および放射活性)標識化した。標識化IRを用い、利用可能な精製したレ
セプターを得ることで、モノクローナル抗体および他の特異的試薬を可溶性IR
レセプターの測定のための定量的免疫アッセイの目的に添って生成した。組換え
体DNA技術をIR産生原核生物および真核生物発現系をつくるのに使用した。
レセプター/アクセプターでの相互作用部位の正確な同定を可能にしている結合
プロフィールの変化を持つIR変異体の作製のために部位特異的変異導入を使用
した。遺伝子のクローニングに際し、IRの構成性のおよび誘導可能な発現を持
つトランスジェニックマウスおよびIR遺伝子欠損マウスをバイオテクノロジー
および遺伝子治療の領域へ踏み込むことを可能にするよう作成した。
【0059】 精製したIRをモノクローナル抗体および/または他の特異的薬剤を産生する
ために使用し、したがってIR特異的定量性免疫アッセイの設計が可能である。
また単鎖Fv断片を、多量の異なる特異性からなるレパートリーを含むファージ
ライブラリーを使用したファージディスプレイ技術を用いることで単離した。 本発明はさらに、それによって本発明を限定することなしに詳細な記述によって
説明される。
【0060】 詳細な記述 免疫レギュレータ(IR) 第1トリメスターの妊娠尿からのIR−Uの精製(方法1) 第1トリメスターの妊娠尿(2リットル)を健常志願者から瓶に集め、2日以
内に実験室に配送されるまで冷蔵した。配送された日に、1リットル当り1gの
アジ化ナトリウムを加え、水酸化ナトリウムによってpHを7.2〜7.4に調
整し、室温(RT)にて1時間沈殿させた。上清の75%を静かに他に移し、沈
殿物に近い残りの部分を遠心(40℃、25000rpmにて10分)して沈殿
物を除き、残りの上清に加えた。0.45(m、ミニタンで)(ミリポア)の横
断濾過によって上清を濾過した。続いて、10kDaで切り捨てるYMディオポ
ア・メンブレンを備えたアミコン限外濾過装置で濾過物(2リットル)を濃縮し
た。最終容量(250ml)を10リットルのミリQ水で2回透析した。つぎに
10kDa切り捨てのアミコン限外濾過にて試料をさらに最終容量3mlまで濃
縮した。
【0061】 ゲル透過 スーパーデックス75ゲル透過カラムを備えたファルマシアFPLCシステム
を用いて、処理した尿試料(IR−U)および市販のhCG製剤(IR−P)(
プレグニル、オルガノン、オッス、NL)を分析した。操作条件はこの文書の他
のところに示す。
【0062】 第1トリメスターの妊娠尿からのIR−Uの精製(方法2) 第1トリメスターの妊娠尿から低分子量分画を精製するために、50mMの重
炭酸アンモニウムの中でFDC(登録商標)G25を備えたFPLCシステムに
て、50mlの尿を直接脱塩した。用いた操作条件を以下に示す。
【0063】
【表1】
【0064】 第1トリメスターの妊娠尿からのIR−Uの精製(方法3) 方法1および2から得たIR−U(第1トリメスターの尿)を分析するために
、本願発明者らは、50mMの重炭酸アンモニウム中で、アルテックのミクロス
フェアサイズ排除(GPC)カラム60Aまたは300A(250x4.6mm
)を備えたシマズのHPLCシステムも用いた。両カラムの分離範囲はそれぞれ
、2,800〜250および1,200,000〜7,500ダルトンであった
。分離できる試料容量は10〜50mlであった。流速は25分間で0.3ml
/分であった。外部分子量標準を用いて、カラムの溶出部位を補正した。用いた
マーカーは、アプロチニン(6,500Da)、チトクロームC(12、400
)、炭酸脱水酵素(29,000)、アルブミン(66,000)およびブルー
デキストラン(2,000,000)であった。
【0065】 IRのさらに異なった2つのhCG製剤を分析するために、IR−P(プレグ
ニル、オルガノン、オッス、オランダ)およびIR−A(APL、ウエイス エ
ールスト、米国フィラデルフィア)を用いた。2つの方法によってIR−Pをさ
らに分離した。スーパーデックス75ゲル透過カラム(HR5/30)(ファル
マシア、スウェーデン)を備えたファルマシアFPLCシステムを用いて、IR
−Pを分析した。カラム操作緩衝液には、50mMの重炭酸アンモニウムを用い
た。このカラムの分離範囲は、球状タンパク質については100,000〜3,
000Daの範囲である。処理試料容量は1mlであり、流速は45分間で0.
5ml/分である。さらにミクロスフェアGPC60A(250x4.6mm)
も用いた。このカラムは、サイズによって除くクロマトグラフィによってタンパ
ク質、ペプチドおよびその他の水溶性巨大分子を分離する。このカラムの分離範
囲は、28,000〜250ダルトンだった。3つの選択された領域に分画され
、分子量が見かけ上>10kDaで溶出したIR−P1、見かけの分子量10k
Da〜1kDaで溶出したIR−P2、および見かけの分子量が<1kDaで溶
出したものである。
【0066】 第1トリメスターの妊娠尿における低分子量分画(IR−U/LMDF)およ
び市販のhCG製剤(プレグニル、APL)由来のIRの精製:方法4 手順 方法3によって第1トリメスターの妊娠尿および市販のhCG製剤から
得た低分子量分画(<2kDa)を凍結乾燥して、さらにバイオ−ゲルP−2カ
ラム(96x1.5cm)上でゲル濾過クロマトグラフィによって分析した。分
画(13〜17mg)を二重蒸留した水(8〜12ml)に懸濁した。物質は完
全には溶解しなかった。遠心分離(シグマ201、3000rpmにて10分)
によって沈殿物(8〜11mg)を上清から分離した。バイオ−ゲルP−2カラ
ム上でのゲル濾過クロマトグラフィによって上清(6〜8ml)を分画した。流
速15ml/分にて水でカラムから溶出させた。LKB2142差動屈折計およ
びLKBユービコードSII(206nm)にて溶出を監視した。ファルマシア
Frac100フラクション・コレクタによって分画(20分)を回収した。確
かな分画をプールして凍結乾燥した。さらに抗ショック活性についてこのような
分画を調べた。
【0067】 ゲル透過: スーパーデックス75ゲル透過カラムを備えたファルマシアFP
LCシステムを用いて、処理した尿試料(IR−U)および市販のhCG製剤(
IR−P)(プレグニル;オルガノン;オッス、NL)を分析した。用いた操作
条件を以下に示す。
【0068】
【表2】
【0069】 陰イオン交換クロマトグラフィ: 重なり合った分画をさらに分離するために
、1mlのモノQHR5/5FPLC陰イオン交換クロマトグラフィを用いた。
操作条件を以下に示し、緩衝液の組合せは、緩衝液Aとして10mMのPBS、
pH7.3および緩衝液Bとして1MのNaClを含有するPBSから成ってい
た。
【0070】
【表3】
【0071】 IR−UおよびIR−Pのさらなる処理: 尿試料中に存在するタンパク質種
の間の共有結合を減らすために、本願発明者らは、尿(IR−U)およびhCG
製剤(IR−P)試料を100℃にて60mMの2−メルカプトエタノールで3
分間処理した。それに続いて、処理したIR−UおよびIR−P試料を同一条件
でスーパーデックス75カラムにかけた。
【0072】 IR−UのFPLC分画の活性測定: 1.4に分割してOD280nmにて
尿分画のタンパク質濃度を測定した。100(gに相当する5000IU/ml
のプレグニルhCG製剤を用いて、この値からhCG単位の量を算出した。
【0073】 IRを精製するおよび/または単離するための別の方法には、たとえば、PB
Sを用いたFPLCシステムにおけるスーパーデックス75カラムによるゲル濾
過で、解像度を高め、それは疎水性相互作用を乱すためのエタノールと共に、ま
たはそれを用いずに行い、必要に応じて後で陽イオン交換を行うことが含まれて
いる。試料は還元型でも非還元型でも分析することができる。もう1つの方法に
は、その他の成分から炭水化物成分を上手く分離するためのレクチン・アフィニ
ティカラムが含まれ、そのために溶出物をさらにゲル濾過にかける。もちろん、
当該技術で既知の方法によって合成または組換え(ポリ)ペプチド配列を得る、
および(合成)抗体、すなわち、ファージに由来した抗体を選択してさらにIR
を選択することも可能である。
【0074】 自己免疫疾患の実験: 非肥満型糖尿病(NOD)マウスは自己免疫疾患のモ
デルであり、この場合はインスリン依存性の糖尿病(IDDM)となり、その主
な臨床症状は血中グルコース濃度の上昇(高血糖)である。膵臓のランゲルハン
ス島においてインスリンを産生するβ細胞が免疫反応の仲介によって壊されるこ
とによって血中グルコース濃度の上昇が起きる(Bach et al. 1991, Atkinson e
t al. 1994)。この破壊には、CD4+およびCD8+Tリンパ球、Bリンパ球
、マクロファージおよび樹状細胞から構成される不均一な集団による膵島周囲お
よび膵島の中への(膵島炎)大量の細胞浸潤が伴っている(O'Reilly et al. 19
9 1)。このようなマウスで糖尿病の発症を検知する最も早い信頼できる方法は、
血液中のグルコース濃度を調べることである。
【0075】 NODマウスは、β細胞に対する自己免疫がIDDM発生の最初の出来事であ
るというモデルである。一般に、疾患過程を惹起するにはTリンパ球が中心的な
役割を演じている(Sempe et al. 1991, Miyazaki et al. 1985, Harada et al.
1986, Makino et al. 1986)。糖尿病形成には、ヒトの疾患と同様に、独特なM
HCクラスII遺伝子と複数の連関していない遺伝子座との複合因子の相互作用
が仲介している。さらに、NODマウスでは遺伝と環境の重大な相互関係が見事
に立証されている。住環境の清潔度の差異によって、環境因子が糖尿病を仲介す
る遺伝子の作用にいかに影響し得るのかが説明されている(Elias et al. 1994)
【0076】 NODマウスで記録されている自己免疫に関しては、抗原特異的抗体およびT
細胞反応のほとんどは、糖尿病個体の自己抗体としてこのような抗原が検出され
た後に研究されている。NODマウスにおいてこのような自己抗原が演じている
役割を理解することは、一義的な病原自己抗原と随伴現象である自己免疫とを区
別できる可能性がある。さらに、IDDM患者は遺伝的にも、病原的にも不均一
であることを念頭に置くべきである。
【0077】 長期にわたる典型的なNODの膵臓の組織検査によれば、3〜4週齢で血管周
囲に浸潤細胞が認められるが、6〜7週齢では膵島は典型的には依然としてきれ
いである。浸潤細胞は膵島を取り囲む、または一方の極に集積して膵島に達する
。10週齢から12週齢の間に浸潤細胞は膵島に浸透し、膵島はリンパ球によっ
て腫脹する。上述したように、住環境および微生物的および環境因子における差
異が糖尿病感受性遺伝子の浸透度に影響を与え得る。
【0078】 本願発明者らの掌中では典型的には14〜17週齢でNODマウスは糖尿病に
なる。しかしながら、これは研究室毎に異なっている(平均14〜19週齢)(E
lias et al. 1994)。
【0079】 CD4+T細胞は少なくとも2つの主なサブセットTh1およびTh2に分離
することができる。活性化されたTh1はIFN−γおよびTNF−αを分泌し
、一方Th2細胞は、IL−4、IL−5およびIL−10を産生する。Th1
細胞は効果的な細胞性免疫の誘導に決定的に関与しているが、Th2は、好酸球
および肥満細胞の活性化およびIgEの産生を含む液性および粘膜免疫およびア
レルギーの誘導に役立っている(Abbas et al. 1996)。数多くの研究によって今
やマウスおよびヒトの糖尿病とTh1表現型の発生とが関連付けられている(Lib
lau et al. 1995, Katz et al. 1995)。
【0080】 Th2T細胞は相対的に無害であることが判っている。実際Th2T細胞は防
御的であると推測する者もいる。しかし、Katzらは、TCR自体によって認
識される抗原特異性を有さないが、T細胞応答の表現型的性質を有する、ナイー
ブなレシピエントに、CD4+T細胞が糖尿病を移入させる能力を有することを
明らかにした。NOD新生児マウスに疾患を移入させたのはTh1T細胞に強く
偏っていて、Th2T細胞は、糖尿病を起こすTh1T細胞集団と同一のTCR
を有し、活性化されているにもかかわらず、疾患を移入させることはなかった。
さらに、Th1とTh2とを共に移入した場合、Th2細胞を10倍多く移入し
てもTh1が誘導した糖尿病をTh2T細胞が改善することはなかった(Pakala
et al. 1997)。
【0081】 Th1に分極したT細胞は、新生児NODマウスに疾患を移入することができ
るが、Th2に分極したT細胞はそれができず、Th1に分極したT細胞および
Th2分極したT細胞の両方では、NOD.scidマウスおよび免疫を抑制し
た受入者に疾患を移入することができる。NOD.scid受入マウスにおける
Th2が仲介する糖尿病は、長い糖尿病前期間があり、全体的な発症率は低かっ
た。その上、Th2による糖尿病病変は独特であり、新生児であれ、NOD.s
cidマウスであれ、自然発症の糖尿病またはTh1誘導の糖尿病で見られる病
変とは、全く異なっている(Pakala et al. 1997)。
【0082】 さらに、IFN−γは糖尿病に関わっており(ヒトと同様にNODにおいても
)抗IFN−γは糖尿病を妨害する;病気の状態で膵島にはIFN−γ+細胞が
存在し、抗原特異的Th1クローンが糖尿病の発症を加速する(Pakala et al. 1
997, O'Garra et al. 1997)。しかも、Th2だけで新生児NODに膵島炎を起
こすが、免疫抑制されたNOD.scidでは糖尿病を誘導する能力を有し、ま
た抗IL−10によって疾患は阻害されるが、抗IL−4では阻害されない(Pak
ala et al. 1997)。このことは非Th2調節性T細胞が正常マウスには存在する
が、免疫不全マウスではそのようなものは存在しないことを示唆している。この
ような結果は、活性化されたTh亜集団の間の均衡を調節する細胞の存在を強調
している。そのような調節性T細胞集団の改変された反応性によってこの均衡が
乱されることによって免疫仲介性の疾患が起き、特定の極めて重要なサイトカイ
ンの欠如や過剰産生を招く可能性がある(O'Garra et al. 1997)。
【0083】 自己免疫疾患の中には、特に慢性関節リウマチ(RA)のようなTh1が仲介
する疾患では(Grossman et al. 1997, Russel et al. 1997, Buyon et al. 199
8, Hintzen et al. 1997)、妊娠期間中緩解する可能性のあるものがある。その
上、妊娠が上手く行くことはTh2型の現象である(Raghupath et al. 1997)。
本願発明者らは、NODマウスにおける糖尿病の発生および管内モデルにおいて
hCG製剤とそのプレグニル分画(オルガノン、Oss)について調べた。
【0084】 驚くべきことに本願発明者らは、15週齢のNODマウスにhCG製剤を週3
回1ヵ月間腹腔内投与することによって、糖尿病の発症を遅らせる、または阻止
することができるのを見い出した。さらに、このような処理をしたNODマウス
の脾細胞を分画せずにNOD.scidマウスに移入することによってNOD.
scidにおける糖尿病の進行を遅らせる、または防ぐことができるが、処理し
ていないマウスの脾細胞ではそのようなことはできない。この抗糖尿病効果はh
CGではなくて妊娠女性から得ることが可能な分画に存在する。
【0085】 マウス NODマウスは本願発明者らの施設で、特定病原体未感染条件にて飼
育された。本願発明者らのコロニーでは、糖尿病の自然発症は、15週齢のメス
で85%である。NOD.scidも本願発明者らの施設で、特定病原体未感染
条件にて飼育された。NODから糖尿病誘発細胞を8週齢のNOD.scidに
移入すると22日後に糖尿病を発症する。
【0086】 糖尿病 アボット・メディセンス・プレジションQ.I.D.糖質計を用いて
静脈血の測定を行うことによって糖尿病を評価し、また糖尿を監視した(Gluket
ur試験;ベーリンガーマンハイム、マンハイム、ドイツ)。2回連続してグルコ
ース測定値が13.75mmol/l(250mg/dl)より高い場合に動物
は糖尿病であると見なされた。糖尿病の発症は、最初に連続して高い数値だった
日付とした。>33mmol/lの高血糖が持続する場合は、長期化した不快感
を避けるために動物を屠殺した。
【0087】 免疫組織化学 CO2によってマウスを窒息死させた。膵臓全体を切除し、凍
結切片を作るためにOCTコンパウンド(ティッシュ−テック)中で急速凍結し
た。5−(mの凍結切片を作成し、風乾して使用するまで−20℃にて保管した
。ホルマリン固定した切片についてキシレンとアルコールとにて脱パラフィンを
行い、一般形態観察のためにヘマトキシリンとエオシンとで染色した。次いで、
2工程プロトコールを用いてインスリンに関する免疫組織化学的検索を行った。
内因性ペルオキシターゼ活性をブロックし、インスリンに対するウサギ抗血清と
共にスライドをインキュベートした(カリフォルニア州、カーペンテリア、ダコ
社、5%のマウス正常血清中で1:500にて30分)。洗浄工程の後、 西洋
ワサビのペルオキシダーゼを結合した抗ウサギIg(ダコ社、5%のNMSにて
1:500で30分)と反応させ、アミノ−エチル−カルバゾール(AEC、ピ
アース)にて10分間で発色し、クリスタルマウントに包埋した。
【0088】 生体内の抗糖尿病効果: PBS(n=4)、300IUのプレグニル(n=
4)、または600IUのプレグニル(n=4)を週3回4週間にわたって15
週齢のNODマウスに腹腔内投与し、上述のように糖尿病を評価した。4週間後
処置を止め、PBS群および600IUのプレグニル群を1週間後に屠殺した。
300IUのプレグニル群は、28週齢になるまで生存させた。脾細胞の移入。
600IUのプレグニル投与NODおよびPBS投与対照NODから脾臓を切除
し、未分画脾細胞を回収した。細胞をPBSで2回洗浄し、20x106個の細
胞を8週齢のNOD.scidマウスに腹腔内投与で移入した。
【0089】 移入実験: 9週齢のNODマウスから未分画脾細胞を回収し、10%のFBSを添加した
RPMIの中で管内にて300IU/mlのIR−P、100mg/mlのIR
−U3−5またはIR−U/LMDFと共に、被覆した抗CD3(145−2C
11;25mg/ml)およびIL−2で刺激した。次いで5%CO2、37℃
にて48時間プレートをインキュベートした。48時間後、細胞をPBSにて2
回洗浄し、20x106個の細胞を8週齢のNOD.scidマウスに腹腔内投
与によって移入した。
【0090】 管内の再刺激: 平底96穴プレートにて、20週齢のNODマウスから得た
未分画脾細胞(1x106個)を10%のFBSを加えたRPMI中で、LPS
(E.coli、10(g/ml)または被覆した抗CD3(145−2c11
、25g/ml)と共に、様々な用量のhCG−プレグニル(50、100、3
00、600、800IU/ml)、分画1〜2(200g/ml)、分画3〜
5(200g/ml)、ヒト組換えhCG、α−hCG、およびβ−hCG(そ
れぞれ200g/ml)を加えて刺激した。抗CD3を被覆したウエルにはIL
−2(40IU/ml)を加えた。5%CO2、37℃にて48時間プレートを
インキュベートした。48時間のインキュベートの後、サイトカインの分析のた
めに培養上清を回収した。
【0091】 CD4+T細胞を20週齢のNODマウスの未分画脾細胞から単離し、様々な
条件で上述のように抗CD3で刺激した。このような細胞にはIL−2(40I
U/ml)および抗CD28(10(g/ml)を加えた。48時間のインキュ
ベートの後、サイトカインを分析するために培養上清を回収した。
【0092】 CD4+細胞がTh1またはTh2サイトカインエフェクター細胞に分化する
可能性におけるIRの影響を調べるために、IRの存在下または非存在下におけ
るThの分極アッセイを行った。CD4+細胞を精製するための原料として、8
週齢のメスNODから得た未分画非細胞を用いた。B細胞、NK細胞、単球/マ
クロファージおよび顆粒球に特異的な抗体と共に補体を用いた除去による負の選
抜によって、脾臓から精製CD4+T細胞を得た。CD11b、B220、CD
8およびCD40に対するビオチン化モノクローナル抗体のカクテルおよび、そ
の後にストレプトアビジン結合微小ビーズ(ミルテニー・バイオテック、Bergis
ch Gladbachドイツ)とインキュベートし、磁気活性化細胞分画装置を用いて細
胞をさらに精製した。実験に用いたCD4+細胞はフローサイトメトリーで確定
したように常に90〜95%精製されていた。最初の刺激については、精製した
CD4+T細胞を平底96穴プレートにて(米国、イリノイ州、ネーパービル、
ナルジ ヌンク社)1x105個/ウエルにて培養し、プレートに結合した抗C
D3(145−2C11、25mg/ml)、抗CD28、およびIL−2(5
0U/ml)と共に刺激した。Th1細胞の分化については、抗IL−4モノク
ローナル抗体(11B11、10mg/ml)およびIL−12(10ng/m
l)を培養に加えた。Th2の感作は、IL−4(35ng/ml)および抗I
FN−γモノクローナル抗体(XMG 1.2、5mg/ml)で行った。さら
に、Th1およびTh2を感作する条件では、阻止抗体、抗IL−10(10m
g/ml)、抗TGFb(10mg/ml)、およびVitD3(10mg/m
l)の存在下または非存在下における300IUのIR−Pおよび100mg/
mlのIR−U/LMDFで行った。未感作の培養には抗CD3、抗CD28お
よびIL2だけが含有された。用量はすべて予備実験で最適化したものであった
。4日間の培養の後、細胞を3回洗浄し、新しく抗CD3を被覆した96穴プレ
ートに移し、IL−2(50U/ml)と抗CD28(10mg/ml)との存
在下で再刺激した。48時間後、培養上清を回収し、Th1対Th2の分極を読
み取るものとして、ELISAによってIL−4、IFN−γおよびIL−10
の産生を測定した。
【0093】 生体外でのNODにおけるサイトカイン実験 げっ歯類では、抗体産生におけるIgMからIgGなどのクラスへのスイッチ
は主としてサイトカインが仲介するT細胞の制御下にあると思われる。優勢なT
h1への分極は、大量のIFN−ガンマ産生の影響下、IgM産生からIgG2
aへのB細胞のクラススイッチを仲介するが、Th2への分極はB細胞において
IgG1産生へのアイソタイプスイッチを誘導する。本願発明者らは、8〜10
週齢のNODマウスに、PBS(n=5)、またはIR−Pおよびその分画IR
−P1、IR−P2、IR−P3、または組換えhCG(rhCG)およびIR
−P3との併用でのrhCGをそれぞれ200mg3日間腹腔内投与した。未分
画非細胞を全群から分離し、LPSまたは被覆した抗CD3で上述のように刺激
した。様々な時点でサイトカインおよび増殖を以下のように測定した。すなわち
抗CD3刺激の増殖(t=12、24、48時間)、抗CD3刺激のIFN−ガ
ンマ(t=24、30、48時間)、LPS刺激のIgG2a産生(t=7日)
である。Th1への分極におけるIR処理の効果を調べるために、本願発明者ら
は、CD4+細胞を単離し、上述のようにTh1分極アッセイを行った。
【0094】 BALB/cにおける実験 その有益な臨床効果からIRの免疫調節活性を分離するために、本願発明者ら
は健康なBALB/cマウスに300IUのIR−Pまたは100mg/mlの
IR−U/LMDF(n=5)を腹腔内投与した。この系統は一般に、Th2に
由来する免疫応答による刺激に反応すると考えられている。IRによる4日間の
刺激の後、上述したようなThの分極について対照およびIR−P処理マウスか
ら得た精製CD4+脾細胞を分析した。脾臓APCによって産生されるサイトカ
インのレベルにおけるIR−Pの影響を調べるために、対照とIR−P処理BA
LB/cマウスから得た脾細胞を管内にてLPS(E.coli026:B6;
10mg/ml、米国ミシガン州デトロイト、ディフコ・ラボラトリーズ)で刺
激した。48時間のインキュベートの後、サイトカイン分析(IL−12p70
、 IL−6)のために培養上清を回収した。
【0095】 IL−10ノックアウトマウス実験 IL−10遺伝子を遺伝子ターゲットされたマウス(IL−10ノックアウト
)におけるIR−Pの影響を生体内で調べるために、本願発明者らはそのような
マウス(n=2)に連続4日間、1日当り300IUのIR−Pを腹腔内投与し
た。 処理の4日後、脾細胞とリンパ節の細胞を回収し、LPSおよび抗CD3
に応答して増殖する能力を調べた。さらに、対照およびIR−P処理マウスから
CD4+細胞を精製し、上述のようなTh分極の能力を分析した。
【0096】 NODの骨髄細胞浮遊液 骨髄(BM)に由来する樹状細胞(DC)におけるIR−Pが誘導する効果を
調べるために、9週齢のメスNODマウス(n=2)の骨髄を分離し、20ng
/mlのGM−CSF(2.0x105個/ml)と共に6日間インキュベート
し、7日目に300IU/mlのIR−Pまたは100mg/mlのIR−U(
IR−U、IR−U−F3−5(スーパーデックス75に由来する)、またはI
R−U/LMDF(FDC−由来))と共にさらに24時間インキュベートした
。手短に言えば、大腿骨および脛骨から筋肉と腱を外し、DBSS−FCSを用
いて乳鉢で砕いた。22ゲージの針を介して2mlの注射筒に吸引することによ
って単一細胞の浮遊液を得、その後ナイロンフィルター(網目サイズはそれぞれ
100および30mm、オランダ、アムステルダム、ポリモンPES、カーベル
)にて細胞浮遊液を2回こした。さらに、DCの成熟にIRが影響を与えるのか
どうかを知るために、NODマウスのBMも直接GM−CSFおよびIRと共に
7日間培養した。8日目に以下のマーカーの発現についてフローサイトメーター
にて細胞を分析した。すなわちCD1d、CD11c、CD14、CD31、C
D40、CD43、CD80、CD86、CD95、ER−MP20、ER−M
P58、F4/80、E−cad、MHC II、MHC I、RB6 8C5
である。9週齢のメスBALB/cマウス(n=3)からのBM細胞でも同様の
実験を行った。
【0097】 同種混合リンパ球反応(MLR): 移植の拒絶におけるIRの免疫抑制活性を調べるために、本願発明者らは同種
MLRを行った。9週齢のメスBALB/cマウス(n=3)のBM細胞を上述
のように分離し、(組換えマウス)rmGM−CSF(20ng/ml)および
IR(IR−P 300IU/ml、IR−U 300mg/m、IR−U3−
5 300mg/ml、IR−U/LMDF 300mg/ml)で7日間処理
した。7日後生じたDCを放射線処理(2,000ラド)、9週齢のメスC57
BL/Lyから分離したCD3+脾細胞と共に培養した。このようなCD3+
胞とDC細胞とを様々な比で培養し、[3H]TdRの取り込み(培養の最後の
16時間に0.5mCi/ウエル)によってT細胞の増殖を測定した。
【0098】 サイトカインのELISA: IL−4は捕捉抗体としてモノクローナル抗I
L−4抗体(11B11)を用いて検出し、ビオチン結合ラット抗マウスIL−
4モノクローナル抗体(BVD6 24G2.3)で明らかにした。IFN−γ
は捕捉抗体としてモノクローナル抗IFN−γ抗体(XMG1.2)を用いて検
出し、またビオチン結合ラット抗マウスIFNγモノクローナル抗体(R46A
2)で明らかにした。両者ともに検出にはABTS基質を用いた。
【0099】 IL−6、IL−10、IL−4およびIFN−gについてサイトカイン特異
的捕捉抗体をPBSで希釈して(それぞれ、20F3およびSXC−1は1mg
/ml、11B11およびXNG1.2は5mg/ml)、平底マイクロプレー
ト(米国、オックスナード、ベクトン・ディッキンソン、96穴、ファルコン3
912、マイクロテストIIフレキシブル・アッセイプレート)を4℃にて18
時間被覆した。被覆後、プレートを洗浄(PBS、0.1%BSA、0.05%
ツイーン20)し、1%BSAを添加したPBSで室温にて1時間ブロックした
。洗浄した後、試料および標準液を加え、室温にて少なくとも4時間インキュベ
ートを継続した。その後、ビオチン化した検出抗体(32C11(IL−6)お
よびR46A2(IFNγ)は1mg/ml、2A5.1(IL−10)および
BVD6.24G2(IL−4)は0.1mg/ml)を加え、4℃にて一晩イ
ンキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ(1/15
00希釈、米国、ペンシルベニア州、ウエストグローブ、ジャクソン・イムノリ
サーチ)を加えた。1時間後、プレートを洗浄し、2,2’−アジノ−ビス−3
−エチルベンソ−チアゾリン−6−スルホン酸(ABTS,1mg/ml、米国
、ミズーリ州、セントルイス)を用いて反応を視覚化した。タイターテック・マ
ルチスキャン(米国、レッドウッドシティ、フローラボ)を用いて414nmに
て光学密度を測定した。IL−12p70、TNF−aおよびTGF−bについ
ては、市販のELISAキットによって製造者が提供しているプロトコールに従
って測定した。
【0100】 敗血症または敗血症性ショックに関する実験: 敗血症または敗血症性ショックを調べるには3つの一般的なマウスモデルがあ
る。すなわち高用量のLPS、D−ガラクトサミンの感作と併用した低用量LP
SおよびD−ガラクトサミンと併用した低用量のスーパー抗原である。
【0101】 敗血症または敗血症性ショックを調べるために用いられる最初のモデルの1つ
には、腹膜腔間にかなり大量のLPS(300〜1200(gの間)を投与する
ことが含まれていた。マウスは細菌毒素には完全に抵抗性でもこの高用量には屈
する。マウスにおける高用量のLPSはヒトでの低用量に相関することが示唆さ
れている(Mietheke at al.)。ヒトにおける敗血症または敗血症性ショックの7
0%は、グラム陰性細菌の内毒素によって引き起こされ、30%はグラム陽性細
菌から放出される外毒素によって起きる。グラム陰性細菌の細胞膜に結びついた
従来の内毒素、独特のリポ多糖類は、敗血症または敗血症性ショックの病因カス
ケードの最も共通したイニシエータを意味している。内毒素分子は、抗原性や構
造上多様な一連のオリゴ糖類でできた外核、グラム陰性細菌の間で共通の類似性
を持つオリゴ糖類の内核、および細菌種に高度に保存されている核脂質Aから成
っている。脂質Aが内毒素の毒性を示す多くの特性に関与している。LPSのよ
うな内毒素の全身性の影響は、内毒素感受性のマクロファージを養子移入すると
内毒素抵抗性であったマウスが毒素に感受性になるので、主としてマクロファー
ジが仲介すると思われる(Freudenberg et al. 1986)。
【0102】 内毒素による敗血症または敗血症性ショックのさらによく用いられるモデルは
、ガラクトサミンで同時に処理(D−Gal感作)した後、低用量のLPSにB
ALB/cマウスが感受性になることを上手く利用している。このD−Gal処
理によって動物はLPSの毒性効果に劇的に感受性となり、ナノグラム量で野生
型動物が6〜7時間で致死となるような毒性を肝臓に誘発することができる。こ
の内毒素の全身性の効果には主としてマクロファージが介在していると思われる
(Gutierrez-Ramos et al. 1997)。敗血症を生じるのは特定の伝達物質がさらに
重要であることは疑いもないが、おそらく相互作用し、促進し、互いに阻害しあ
う多数の生物および宿主に由来する伝達物質が敗血症または敗血症性ショックの
病因に関与している。 .LPS、TNFおよびその他の伝達物質に対する反応において、内皮細胞およ
びマクロファージは、強力な血管拡張物質、内皮由来血管弛緩因子(EDRF)
を放出することができ、それは最近、酸化窒素であることが同定された。この分
子は、平滑筋の弛緩および強力な血管拡張を起こす。酸化窒素シンターゼの競合
阻害剤によって酸化窒素の産生を阻害すると、内毒素ショックに陥った動物の血
圧が上昇するという結果を招く。このことは、酸化窒素が敗血症による低血圧に
部分的に関与することを示唆している。酸化窒素の阻害によって血圧が回復する
ことはないが、そのような阻害によって組織の血流が低下する可能性がある(Ben
nett et al.)。
【0103】 内毒素はまた、通常、補体活性化第2経路を介して補体カスケードを活性化す
ることができる。これはアナフィラトキシンC3aおよびC5aの放出を招き、
それらは血管を拡張し、血管透過性を高め、血小板を凝集し、好中球を活性化し
、凝集することができる。このような補体に由来する伝達物質は、敗血症または
敗血症性ショックに関連する微細血管の異常に部分的に関与している。さらに内
毒素は、第XII因子(ハーゲマン因子)、カリクレインおよびキニノゲンの活
性化を介したブラジキニンの放出を招く。ブラジキニンも血管拡張剤であり、血
圧降下物質である。LPSによる第XII因子の活性化によって、内因(マクロ
ファージおよび内皮細胞が放出する組織因子を介して)および外因の凝固経路の
活性化が導かれる。これは凝固因子の消費およびDICを招く。TNFも外因経
路を活性化し、このような凝固の異常に寄与している可能性がある。
【0104】 アラキドン酸カスケードの様々な代謝によって血管拡張(プロスタサイクリン
)、血管収縮(トロンボキサン)、血小板の凝集、または好中球の活性化が起き
ることも知られている。実験動物では、シクロオキシゲナーゼまたはトロンボキ
サン・シンターゼを阻害することによって内毒素ショックを防御してきた。敗血
症の患者では、高レベルのトロンボキサンB2(TBX2)および6−ケトプロ
スタグランジンF1(プロスタサイクリン代謝の最終産物)が存在する。数多く
のサイトカインは内皮細胞または白血球からこのようなアラキドン酸代謝物の放
出を起こすことができる。
【0105】 同様のやり方で、内毒素ショックモデルD−Gal感作BALB/cマウスを
低用量のTSST−1またはSEBで処理する。このようなスーパー抗原は、T
細胞の大きな集団の増殖および活性化を刺激する。実際、このようなスーパー抗
原で誘導されたT細胞の活性化は、ほとんどポリクローン性T細胞の活性化と見
なされ、特異的なVベータファミリーを発現しているT細胞はすべて、TCR/
MHCII/およびスーパー抗原による抗原非特異的結合を介して活性化される
(図14)。
【0106】 D−ガラクトサミンは、肝臓を標的とする転写阻害剤であることが判っており
、急性期タンパク質の合成を妨害する。実際このような急性期タンパク質は肝臓
がTNFαを解毒する/失活させるのに役立っていると考えられている。実際、
低用量内毒素モデルまたは外毒素モデルにおけるD−ガラクトサミン処理には、
TNFα仲介肝臓アポトーシスが伴っている。D−ガラクトサミン単独による処
理では肝臓のアポトーシスは起きず、このような臓器を損傷する作用は、低用量
の両モデルでは抗TNFα抗体によって中和することができる(Gutierrez-Ramos
et al. 1997)。
【0107】 敗血症および敗血症性ショックの実験に用いたマウス:8〜12週齢のメスB
ALB/cおよびSJLマウスを全実験に用いた。欧州実験動物科学協会(FE
LASA)、動物の健康に関するワーキンググループの報告(Laboratory Anima
ls 28:1-24, 1994)に記載されたプロトコールに従って、特定病原体未感染条件
下、本願発明者らの施設で動物を飼育した。
【0108】 注射用プロトコール: 毒性ショック(TSST−1およびD−ガラクトサミ
ン)(n=6)。
【0109】 外毒素モデル用には、100μlの滅菌食塩水(9%)に溶解した20mgの
D−ガラクトサミンを、Balb/cマウスの腹腔内に注射した。次いでそれら
に、100μlの滅菌食塩水に溶解した4μgのTSST−1を、各肩甲骨の下
約0.5cmの2ヵ所に皮下注射した。対照群には、 D−ガラクトサミンを用
いずに4μgのTSST−1を皮下注射するか、またはD−ガラクトサミンのみ
を用いて処理した。また、D−ガラクトサミンで感作されたBalb/cマウス
の一群は、TSST−1処理前の3日間にわたり、700IUのIR−Pを用い
て腹腔内に前処理した。
【0110】 LPSモデル(n=6) 内毒素モデル用には、Balb/cおよびSJLマウスを、600μgのLP
Sを用いて腹腔内に処理した。対照群はPBSのみを用いて腹腔内に処理した。
IR−Pの効果を検査するため、本願発明者らはBalb/cおよびSJLマウ
スに、700IUを用いて3日間前処理し、次いで600μgのLPSを用いて
注射した。さらにまた、Balb/cマウスの一群に、IR−U分画(IR−U
1、IR−U2、IR−U3〜5)を各々200μgの同一用量を用いて3日間
にわたり腹腔内に前処理し、次いで600μgのLPSを注射した。低分子量分
画を検査するため、本願発明者らはIR−U/LMDF(IR−U5(<10K
dal>分画も含む)、IR−P3(方法3によって入手された)、IR−Aな
らびにIR−A3(方法3によって入手された)、および方法4によって入手さ
れるたそれらの分画について、抗ショック活性を検査した。加えて、本願発明者
らはペプチドカラムからの3つの分画(F1〜3)の抗ショック活性についても
調べた(方法は本文書の他の箇所に示されている)。また、本願発明者らはBa
lb/cマウスを、LPSの注射の1および2時間後に、各々700IUのIR
−Pを用いて2回腹腔内に処理した。
【0111】 疾病の半定量的測定: 以下の測定基準を用いてマウスの疾病レベルを採点し
た。 1 毛皮からの浸出あり、正常なマウスとの行動の差異は検出されず。 2 毛皮からの浸出あり、寄せ合い反射あり、刺激(ケージの軽打等)に対し反
応、取扱い時は健康なマウスと同様に活動的。 3 ケージの軽打に対して遅い反応、取扱い時は無抵抗または従順だが、新しい
環境に単独で置かれた場合の好奇心は残存。 4 好奇心の欠如、刺激に対しごくわずかに反応するかまたは無反応、全く不動
。 5 呼吸困難、仰臥位にされた後の自動復元は不能または遅鈍(瀕死、犠牲にさ
れた)。
【0112】 WBCおよび血小板のカウント: TSST−1モデルからは、24時間の時
点において、一群当り無作為に選ばれた2匹のマウスから、100μlの血液を
尾部出血法を用いて入手した。EDTAチューブに全血を集め、自動化された血
液学分析器にて分析した。
【0113】 ショックについてのデータ 動物および処理: ハーラン(Harlan)から入手した8〜10週齢のメスのB
alb/cマウスを本研究に使用した。動物を殺し、肝臓および脾臓を以下に示
したように切除し、さらなる研究用とした。マウスの取扱いならびに実験方法は
、動物の保護および使用に関する米国実験動物保護認定協会ガイドライン(Amer
ican Association of Accreditaion of Laboratory Animal Care guidlines for
animal care and use)に従って行なった。
【0114】 注射のプロトコール: 大腸菌からのLPS(シグマケミカル社(Sigma Che
mica Co))を、150mg/kgにて腹腔内に投与し、高用量LPSショック
モデル用とした。IRの効果を検査するべく、マウスにIR−P(プレグニル(
Pregnyl);オルガノン(Organon);オランダ、オス(Oss) )およびその分画で
あるIR−P1、IR−P2、IR−P3、およびIR−A3(APL;ワイイス
・アイヤスト(Wyeth Ayerst)、米国ペンシルベニア州、フィラデルフィア)の
各々200mgの同一用量を用い、3日間にわたり(t=−3、t=−2、t=
−1)腹腔内に前処理し、次いでLPSをt=0において注射した。またマウス
の一群には、LPS注射の1および2時間後の2回にわたり、各々IR−Pまた
はデキサメタゾンを用いて腹腔内に処理した。
【0115】 血液検査: 各群の血液を、各時点(t=−72時間、−1時間、および48
時間)において、3匹のマウスの尾部出血により回収し、白血球、血小板、血漿
酵素LDH、ALAT、およびASATの慣例的な測定用としてプールした。次
にマウスを犠牲にし、肝臓および脾臓を切除し、以下に示したように研究した。
【0116】 移植モデル: 動物および処理: IR−Pが同種移植片を保護することが可能かどうかを決
定するべく、本願発明者らはBALB/cマウス(n=5)に、腹腔内に1日当
り600I.U.のIR−Pか、あるいはPBSを用いて、2日間にわたり処理
した。3日目に、C57BL/6ドナーの尾部の皮膚を、IR−PまたはPBS
で処理したBALB/cレシピエントの背側胸部に、ビリンガムおよびメダワー
(Billingham and Medawar)の方法の変法を用いて移植した。移植片は、ドナー
の生存可能な皮膚/毛髪が検出されない場合に拒絶されたとみなした。移植の後
、IR−Pで前処理されたBALB/cレシピエントには、さらなる2日間の処
理を行なった。
【0117】 EAEモデル(MS) EAEの誘導。8〜12週齢のメスのSJLマウス(n=5)を、50ml(
0.5mg/ml)のPLP−ペプチドを用いて4ヵ所の異なる場所に免疫化し
た(t=0)。24時間後、1010個の百日咳菌を尾部に、i.v.(静脈内)
に注射した。続いて、72時間後に(t=3)、百日咳菌によりマウスを再度免
疫化した。7日目よりマウスを秤量し、毎日EAEの臨床徴候を以下のように0
〜5の段階に等級づけた。
【0118】 EAEの等級 症状 0 徴候なし 0.5 不全麻痺または部分的な尾部の麻痺 1 完全な尾部の麻痺 2 不全対麻痺;四肢の弱まりおよび尾部の麻痺 2.5 部分的な四肢の麻痺 3 完全な後肢または前肢の麻痺 3.5 対麻痺 4 四肢の麻痺 5 死亡
【0119】 IR処理: 一群のマウスにはまた8日目から1日当り600I.U.のIR
−Pを週3回、腹腔内に2週間にわたって処理し、対照群には同じ体積のPBS
を用いて処理した。
【0120】 ストレプトゾトシンモデル: ストレプトゾトシンの注射。多様な用量のストレプトゾトシン(MD−STZ
)モデル用には、25mg/kgのSTZ(シグマ)をクエン酸緩衝液(pH4
.2)に溶解し、可溶化後5分以内に、先に記述したように腹腔内に注射した。
6〜9週齢のオスのマウスに、連続して5日間(実験の1日目から5日目まで)
注射した。連続5日間のSTZの後、IR−P(600I.U.を腹腔内に)(
n=5)またはクエン酸緩衝液(n=5)を用い、週4回、3週間にわたってマ
ウスを処理した。高用量のストレプトゾトシン(HD−STZ)モデル用には、
ストレプトゾトシン(160mg/kg)の単回の腹腔内投与により、マウスに
高血糖症を誘導した。対照群のマウスは、相応する体積のクエン酸緩衝液のみを
受けた。
【0121】 結果 hCG分画の製剤および特徴づけ。1または2バイアルの工業用等級のhCG
−プレグニル(5,000IU/バイアル)溶液のゲル濾過を、セファデックス
(Sephdex)75カラム(HR5/30)(ファルマシア(Pharmacia)、スウェ
ーデン)を装備したファルマシアFPLCシステムにおいて行なった。処理試料
容量は1mlであった。流速は、以後の45分間は0.5ml/分であった。高
い乳糖含有量を有する工業用等級のhCG溶液の粘性のため、0.2ml/分の
流速を1分間実行した。hCGの比較的精製されたプレグニル製剤には、hCG
およびごく少量のhCGコアフラグメントが存在しており、それらの位置を内部
のサイズマーカーとして使用した。hCGはゲル濾過において78kDaの分子
として溶出され、hCGのβ−コアは19kDaの分子として溶出された。1〜
5の分画が集められ、分画1〜2はhCGを含んでおり、分画5はhCG(コア
フラグメントなし)を含んでいた。分画1〜2および分画3〜5の抗糖尿病効果
について、20週齢のNODの全脾臓細胞を管内で処理し、かつそれらをNOD
.scidに移植することによって検査した。この方法により、ヒトの組換えh
CG、α−hCG、およびβ−hCG(シグマ(Sigma)、米国ミズーリ州、セン
トルイス)についても検査した。
【0122】 IR−UおよびIR−Pのゲル浸透: 図15は、未希釈のIR−U試料の5
0μlのFPLCクロマトグラムを表している。流出緩衝液はPBSであった。
クロマトグラムは、70、37、15、および10kDaに4つの主要なピーク
を示した。これらのピークを同定するべく、IR−P(プレグニル)の500μ
lの試料(5000IUを含んでいる)を、同様の流出条件下に同一のカラムに
適用した。得られたプロフィール(図16)もまたこれらの4つのピークを示し
たが、その比率は異なっていた。ピーク分画2は(α/β)ヘテロダイマーhC
G(37kDa)を表わし、一方分画3は個々の鎖か、これらの鎖かまたはβ−
コアの残存鎖のホモダイマー、および他の分子(15〜30kDa)を表す。こ
れらの結果から本願発明者らは、最初の3半期の尿が同一の4つの主要なタンパ
ク質を含んでおり、それらは予期されたように工業用のhCG製剤にも存在して
いると結論した。本願発明者らはこれらを(IR−P1、IR−P2、IR−P
3〜5(プールされた))、(IR−U1、IR−U2、IR−U3〜5(プー
ルされた))と名付けた。分画5はタンパク質を含まないか、または10kDa
より小さい分子量のタンパク質を含む。さらに、重複している分画2および3は
、IR−Uと同様にIR−Pにも見られ、これによりこれらの分画中に共有結合
によって結合しているタンパク質種が存在することが示唆された。
【0123】 陰イオン交換クロマトグラフィーならびにIR−UおよびIR−Pのさらなる
処理: 重複している分画2および3のさらなる分離を、1mlのMONO Q HR
5/5陰イオン交換カラムにおいて行なった。図17は、PBSにて1:20に
希釈された50μlのIR−Uのクロマトグラムを表す。二つの主要なタンパク
質ピークが43%および55%の緩衝液Bにおいて溶出されたが、分離はされず
、これらのタンパク質間の共有結合が示唆される。50%緩衝液Bを用いて保持
する不連続溶出勾配を用いても、これらのピークが分離する結果にはならなかっ
た(データは示さず)。したがって本願発明者らは、尿試料中に存在するタンパ
ク質種の共有結合のため、さらなる精製にはイオン交換クロマトグラフィーが使
用できないことを結論づけた。
【0124】 IR−U試料中に存在する主要なタンパク質種の間に推定される共有結合を減
じるべく、本願発明者らは60mMの2−メルカプトエタノールを用いて100
℃にて3分間試料を処理し、次いで試料を同等の条件下にセファデックス75カ
ラムに適用した。図18は、ピーク1(70kDa)が残存しており(図15〜
17も参照のこと)、分画2(hCGを表す、37kDa)はほとんど消失し、
低分子(<10kDa)の二つの新たなピークを生じる結果となったことを示し
ている。ピーク3は残存し、したがって単離されたベータ−コアおよび単量体タ
ンパク質を過剰に含むようである。ピーク4(10kDa)はもまた還元処理に
より消失した。
【0125】 同様の還元処理をIR−Pの試料(プレグニル)に適用した。同様に処理され
たIR−U試料のプロフィールと同じように、hCG(図19)はピーク2の減
少、ピーク3の増加を示し、一方新たなタンパク質ピークがピーク1と2の間に
現われた。さらに、破壊産物のピーク(<10kDa)の増加も明らかであった
【0126】 移入実験: 全脾臓細胞を9週齢のNODから回収し、10%FBSを追加したRPMI+
中の管内において、300IU/mlのIR−P、100mg/mlのIR−U
3〜5またはIR−U/LMDFと共に、被覆された抗CD3(145−2cl
l;25mg/ml)およびIL−2(50U/ml)を用いて刺激した。次い
でプレートを、空気中5%CO2下に、37℃にて48時間インキュベートした
。48時間後、細胞をPBSにて2回洗浄し、20x106細胞を8週齢のNOD
.scidマウスに腹腔内に移入した。
【0127】 生体内におけるIRの抗糖尿病効果: 4匹の15週齢のメスのNODマウス
(n=4)を、PBS,300IUのプレグニル、または600IUのプレグニ
ルを用い、週3回、4週間にわたって腹腔内に処理した。処理の後、PBSの群
の全てのマウスは糖尿病であり(血糖>33mmol/l)、体重が減少し、不
具合の様子であったが、一方300IUのプレグニル、および600IUのプレ
グニルの群では疾病のないままであった。それらの血糖値は6mmol/lを超
えることはなく、非常に健康そうに見えた(図1および3)。膵臓における浸潤
の可能性およびインタクトなインスリン産生細胞を評価するべく、PBSおよび
600IUのプレグニル群のマウスを処理後に殺し、全膵臓を除去してインスリ
ンの免疫組織化学用とした。PBS群からの膵臓の切片は、多くの浸潤中の細胞
を示し、これらの細胞は島へ侵入した。またPBS群の膵臓には、多数のBリン
パ球およびTリンパ球が存在していた。この発見は、本願発明者らによる他の、
CD4+細胞数の選択的な減少に起因する脾臓のCD8/CD4細胞の比の上昇
、およびこれらのマウスの脾臓におけるBリンパ球数の減少という所見(データ
は示さず)と一致する。600IUのプレグニル群のマウスでは、膵臓に浸潤は
なく、さらに驚いたことに、多数のインスリンを産生している新しい島が見られ
た。また、膵臓におけるBリンパ球およびTリンパ球の数も減少しており、それ
は正常なレベルのCD8/CD4比およびこれらのマウスの脾臓におけるBリン
パ球数と一致した。300IUのプレグニル群からのマウスは、28週齢まで生
存し続けた。それらは健康的に見え、体重の減少はなく、血糖値は8mmol/
lを超えなかった(図1および3)。インスリンの存在についての免疫組織化学
も行なった。膵臓には浸潤している細胞はまだ存在しており、インスリンを産生
しているいくつかの島もあった。これらのマウスは、600IUのプレグニル群
と共に、4週間にわたってプレグニルで処理し、20週から28週までは処理し
ないままであった。
【0128】 処理済みおよび未処理のNDOマウスの脾臓細胞が、NDO.scidに糖尿
病を誘導する能力を保持しているかどうかを決定するため、本願発明者らはPB
Sおよび600IUプレグニル群からの脾臓細胞をNDO.scid マウスに
移入した。移入の22日後では、PBSのNDO.scid群は糖尿病に関して
陽性であり、1週間以内に33mmol/lを超える血糖値に達したが、一方6
00IUプレグニル群からの脾臓細胞を受けたNDO.scid マウスは正常
のままであった(血糖<7mmol/l )。移入の7週間後では、 PBS群は
非常に不具合のようであった(図2)が、600IUプレグニルのNDO.sc
id群はなお9mmol/l より低い血糖値を有しており、健康のままであっ
た。この時点で両群からのマウスを殺した。
【0129】 管内での再刺激。NODにおいては疾病の経過をとおして、高レベルのINF
−γ、IL−1、およびTNF−aが報告されており、このサイトカインのプロ
フィールがTh1のサブセットの選択的活性化に一致するという理由から、本願
発明者らは管内において、20週齢のメスのNODマウスからの全脾臓細胞およ
び精製されたCD4+によるサイトカイン産生に及ぼす、プレグニルの影響を調
べた。抗糖尿病効果がhCGまたはそのサブユニットの一つか、あるいは用いた
製剤に含まれていた他の因子にあるのかを判断するべく、本願発明者らはプレグ
ニルからゲル浸透クロマトグラフィー(図12)によって入手された異なる分画
、およびヒトの組換えhCGとそのサブユニットの、サイトカイン産生に対する
効果についても検査した。またこれらの分画の効果を、再構成されたNOD.s
cidマウスにおける血糖値について生体内でも調べた。
【0130】 本願発明者らは、50〜600IU/mlのプレグニル、F3〜5(58〜1
5kDa)を用いて処理したマウスから入手された脾臓細胞による、IFN−γ
産生の強力な、またヒトの組換えβCGを用いた弱い阻害を観察した。800I
U/mlのプレグニルを用いて処理されたマウスからの脾臓細胞では、IFN−
γの産生には中程度の増加があったにすぎない。同様なパターンが、IL−4産
生の分析時にも観察された(図5)。さらに、300〜600IU/mlのプレ
グニルを用いて処理されたマウスからの刺激された脾臓細胞においては、IL−
1およびTNF−aの著しい阻害が、付随しておこるIL−6およびIL−10
産生の刺激と共に観察された(データは示さず)。
【0131】 さらに、移入実験は、F3〜5または600IUのプレグニルを用いて処理さ
れた20週齢のNODマウスの全脾臓細胞が、PBSで処理されたNOD細胞の
再構成に比較して、NOD.scidにおける糖尿病の発症を遅延または予防す
ることさえ可能であることを示した(図7)。しかしながら、F1〜2(80〜
70kDa)を用いても、NOD.scidマウスにおける糖尿病の発症に対し
て何ら有意の効果は観察されなかった。プレグニルがTh2型マウスに対して効
果を有するかどうかを調べるべく、本願発明者らはBALB/cマウス(n=5
)に300IUのプレグニルを腹腔内に用いて4日間にわたり、またPBS(n
=5)を用いて処理した。脾臓よりCD4+細胞を単離した後、本願発明者らは
それらを抗CD3/IL−2を用いて48時間にわたり刺激し、さらに上清を集
めてIFN−γおよびIL−4サイトカインの測定用とした。また本願発明者ら
は、異なる用量のプレグニルを用いてCD4+細胞を処理した。続いて上清を集
め、サイトカイン分析用とした。著しいIFN−γの阻害と、付随したIL−4
の刺激とが、抗CD3/IL−2だけを用いて刺激されたCD4+細胞に見出さ
れ(Th1−>Th2)、一方その逆が、異なる用量のプレグニルを用いて管内
で処理されたCD4+細胞に見られた(Th2−>Th1)。
【0132】 IR−U/LMDFの抗糖尿病活性 IR−U/LMDF(<5kDa)の抗糖尿病活性を検査するべく、本願発明
者らは、この分画を用い、またPBSを用いて(対照)、糖尿病誘発性細胞を管
内において処理した。これらの細胞をNOD.scidマウスに移入すると、I
R−U/LMDF処理された細胞を用いて再構成されたNOD.scidマウス
では、対照群(n=3)に比較して糖尿病の発症が遅延されたことを示した。
【0133】 CD4+細胞が、Th1サイトカイン産生エフェクター細胞に分化するための
潜在能力を測定するべく、IRの存在または非存在下にThの分極分析を行なっ
た。本願発明者らはまた、組換えhCG(rhCG)およびベータ−hCGも、
このThの分極分析で調べた。Th1表現型に向けて分極しているCD4+に対
するIFN−ガンマの強力な阻害が、IR−PおよびIR−U/LMDFを用い
て見出された(図28)。組換えベータ−hCGについて観察された産生には、
IFN−ガンマの中程度の阻害だけがあり、組換えhCGでは何ら影響が見られ
なかった(図28)。
【0134】 IR−P3がその完全な活性を働かせるために、hCG等の付加的な因子を必
要とするかどうかを決定するべく、本願発明者らはまたIR−P、その分画であ
るIR−P3、rhCG、およびrhCGと組合されたIR−3を用いてNOD
マウスを処理し、次いでTh1の分極を行なった。図64は、IR−PがTh1
分極分析におけるIFN−ガンマ産生を阻害し、それによりTh1細胞の増殖を
Th1分極の条件下に阻害したことを示している。IR−P3およびrhCGを
単独に用いるとTh1分極の中程度の阻害が見られ、一方IR−P3とrhCG
との組合せによりTh1細胞の増殖は完全に阻止された(図64)。
【0135】 また本願発明者らは、これらのIR処理されたマウスからの脾臓細胞を、抗C
D3を用いて刺激し、異なる時点においてIFN−ガンマおよびIL−10の産
生を測定した。図65は、IR−Pおよび、その分画であるIR−P1およびI
R−P2を用いた生体内での処理が、管内における抗CD3に刺激されたIFN
−ガンマ産生を阻害し、一方、中程度のIFN−ガンマ産生の増加がrhCGお
よびIR−P3を用いて検出されたことを示している。さらに、 rhCGと組
合わされたIR−P3分画は、IFN−ガンマ産生を阻害することが可能であっ
た(図65)。また本願発明者らは、抗CD3によって刺激されたIL−10産
生(t=48)を、これらの生体内で処理されたマウスの脾細胞において測定し
た。図(図67)は、全ての分画(IR−P、IR−P1、IR−P2、IR−
P3)がIL−10の産生を増加することが可能であったことを示す。
【0136】 IRおよびその分画が抗CD3による脾細胞の増殖を管内において促進するの
で、IRを用いた生体内の処理が、抗CD3に刺激された管内の増殖に及ぼす影
響を知るべく、本願発明者らはまた、これらのIR処理されたマウスから異なる
時点(t=12、24、48時間)において入手された脾細胞の、CD3に刺激
される増殖を測定した。図(66)は、抗CD3が、IR−P処理されたNOD
マウスからの脾細胞を刺激したこと、またIR−P1が管内における低い増殖能
を有することをを示している。さらに、IR−P3およびrhCGで処理された
マウスからの脾細胞は、PBS処理された対照マウス(CTL)に比較して、高
い増殖能を示したが、一方rhCGと組合わさたIR−P3は、IR−Pと同様
の増殖の減少を引起こした。IR−P2で処理されたNODマウスからの脾細胞
の、抗CD3に刺激された増殖には、中程度の効果が見られた。
【0137】 上述のように、優位のTh1分極は、IFN−ガンマの大量産生の影響下に、
B細胞のIgMからIgG2産生への切替えを引起こす。したがって、本願発明
者らは、IR処理されたNODマウスから入手された、LPSに刺激された脾細
胞におけるIgG2の産生も測定した。図68はIR−P、IR−P1、および
IR−P3処理された、LPS刺激された脾細胞が、管内において、より少ない
IgG2aを産生したのに対し、IR−P2ではIgG2aの中程度の阻害が見
られたことを示す。さらに、重ねてrhCG処理はIgG2aの産生を減じるこ
とはできず、一方IR−P3との組合わせではそれが可能であった(図68)。
【0138】 GM−CSF刺激NODの骨髄細胞: 骨髄からの樹状細胞(DC)の成熟に及ぼすIRの影響を測定するべく、本願
発明者らは8週齢のNODマウスからの骨髄細胞を、GM−CSFの存在下に7
日間培養した。このような条件下では、骨髄からのDCの増殖は90%よりも多
い。 本願発明者らが、GM−CSFおよびIR−Pの存在下にDCを7日間同
時培養した場合には、本願発明者らは、IRで処理された全てのDCが、GM−
CSFだけで処理された対照のDCよりも未成熟であることを観察した。このこ
とは、細胞表面マーカーCDld、ER−MP58、F4/80、CD14の減
少と、CD43、CD95、CD31、およびE−cadの増加から結論された
(図29)。さらに、表面マーカーER−MP20/LY6C、MHCIおよび
IIには何ら変化が観察されなかった(図29)。
【0139】 これに対し、GM−CSFを用いてDCを6日間培養し、7日目に300IU
/mlのIR−P(図30)または100mg/mlのIR−U/LMDF(図
31)と共にさらに24時間同時培養すると、DCはより成熟し、APCのよう
に、よりよく機能することができた。このことは、 CDld、CD40、CD
80、CD86、CD95、F4/80、CD11c、およびMHCII細胞表
面マーカーの増加から結論された(図30および図31)。
【0140】 BALB/cの分極分析 IRがTh2表現型マウスに対しても効果をもつかどうかを調べるため、本願
発明者らはIR−PおよびIR−U/LMDFをBALB/cマウスにおいて調
べた。IR処理の後、本願発明者らは分極分析法においてCD4+T細胞を単離
した。分極分析により、IR−PおよびIR−U/LMDFで処理されたマウス
からのCD4+T細胞は、より低いIFN−ガンマ産生能を有するが(図32お
よび図33)、一方これらの細胞は、PBS処理マウスからの細胞に比較して、
より多くのIL−4を産生した(図34および図35)。このことは、生体内で
のIR処理により、T細胞がTh2表現型に向けてさらにシフトされたことを示
唆している。PBS処理および異なる用量のIR−Pで処理されたIR−Pマウ
スからのCD4+T細胞は、IFN−ガンマの増加(図36)およびIL−4産
生の減少(図37)を示しており、このことはTh1表現型へ向けたシフトを示
唆している。Th2表現型に向けたCD4+T細胞のシフトが、IL−10また
はTGF−ベータ依存性であるかどうかを決定するべく、本願発明者らはまたI
R−P処理マウスからのCD4+T細胞の分極分析に、抗IL−10および抗T
GF−ベータを添加した。このことは、IR−P処理マウス細胞のTh1の分極
条件下ではIFN−ガンマ産生の、またTh2の分極条件下では、抗IL−10
の添加に支持されるIL−4産生の増加を引起こしており(図38および図39
)、このことはIR−PによるTh1/Th2分極におけるIL−10の関与を
示唆している。さらに、抗TGF−ベータの管内の処理では、Th1およびTh
2の分極条件におけるIL−4およびIFN−ガンマの産生には、対照とIR−
P処理群との間に大きい差異が見られなかった(図40および図41)。このこ
とは、IR処理に起因してIL−10およびTGF−ベータが関与することを証
明している。さらに、IR−U/LMDFからの精製されたCD4+細胞は、対
照のマウスからの細胞よりも多くのTGF−ベータを産生する(図43)。抗I
L−10または抗IL−6が両培養物に添加されると、対照群のマウスからのC
D4+細胞は、IR−U/LMDF処理された群よりも多くのTGF−ベータを
産生する。このことは、TGF−ベータ産生におけるIL−6およびIL−10
の関与を示唆している。このことは、IR処理マウスからの、LPS刺激された
脾臓細胞が、対照マウスと比較して高いレベルのIL−6を産生することを示す
本願発明者らのデータ(図45)と一致する。
【0141】 UVBを照射されたマウスの脾臓細胞もまた、より多くのIL−10を産生し
、Th1サイトカイニンの抑制を誘導する。これらのマウスからの脾臓細胞のL
PSおよび抗CD3による刺激は、それらの増殖能が低いことを示した。また本
願発明者らは、UVBおよびIRで処理されたBALB/cマウスからの脾臓細
胞の、LPSと抗CD3とに刺激される増殖を比較した。 LPSおよび抗CD
3に誘導される増殖の減少が、UVB処理されたBALB/cマウスからの脾細
胞の培養後に観察され(図46および図47)、IRまたは、IRもしくはUV
B照射処理により組合わされた処理では、LPSおよび抗CD3に刺激される増
殖が増加した(図46および図47)。
【0142】 IL−10ノックアウトマウスの結果: LPSおよび抗CD3に刺激された増殖におけるこのような変化が、IL−1
0依存性であるかどうかを決定するべく、本願発明者らはIL−10ノックアウ
トマウスにIR−PまたはUVB処理を行なった。UVB照射およびIR−P処
理されたBALB/cマウスを比較した場合、抗CD3で刺激された脾臓細胞に
おいては何ら増殖パターンの変化は見られず(図47)、一方抗CD3で刺激さ
れたリンパ節細胞においては、両群のUVB照射されたBALB/cに比較して
逆の増殖パターンが観察された(図49)。このことは、UVB処理後の抗CD
3刺激による増殖の減少または、脾臓細胞のIR−P処理後の増殖の増加が完全
にIL−10依存性ではないが、一方抗CD3刺激されたリンパ節細胞について
はこのことが正しいことを示している。LPS刺激された脾臓細胞の増殖を48
時間後に評価した場合、本願発明者らは、対照群に比較してUVBおよびIR−
P処理された群における増殖の増加を観察したが(図51)、一方72時間増殖
の時点では、両群に増殖の減少が観察された(図50)。
【0143】 生体内におけるUVBまたはIR−P処理の、細胞マーカーCD4、CD8、
B220、M5/114について陽性の細胞のパーセントに及ぼす影響を測定す
るべく、本願発明者らはリンパ節細胞および脾臓細胞についてフローサイトメト
リー分析を行なった。IR−P処理されたIL−10ノックアウトマウスのリン
パ節では、B220およびM5/114陽性細胞の減少と、CD4およびCD8
陽性細胞の増殖とが観察され(図52)、一方脾臓においては、CD4、CD8
、B220、およびM5/114陽性細胞の増加が観察された(図53)。UV
B処理群では、CD8陽性細胞の増加と、CD4、 B220、およびM5/1
14陽性細胞の減少がリンパ節に見られたが(図52)、CD8陽性細胞の中程
度の増加を除き、脾臓細胞では何ら細胞マーカーの変化は観察されなかった(図
53)。
【0144】 GM−CSF刺激骨髄細胞の結果: 骨髄の樹状細胞(DC)の成熟度に対するIRの影響を測定するべく、本願発
明者らはBALB/cマウスからの骨髄細胞を、GM−CSFの存在下に7日間
培養した。この方法では、骨髄からのDCの増殖は90%よりも多い。本願発明
者らがこれらのDCを、GM−CSFおよびIR(IR−P、IR−U、IR−
U3〜5、IR−U/LMDF)の存在下に7日間にわたって同時培養したとこ
ろ、IRで処理されたDCは全て、GM−CSFだけで処理された対照DCより
も未成熟であることを観察した。このことは、細胞表面マーカーCDld、CD
40、CD80、CD86、ER−MP58、F4/80、E−cad、および
MHCIIの減少から結論された(図54)。さらに、CD95には中程度の増
加が観察された(図54)。対照的に、DCをGM−CSFと共に6日間培養し
、7日目に300IU/mlのIR−P、または100mg/mlのIR−U(
IR−U、IR−U3〜5、またはIR−U/LMDF)をさらなる24時間に
わたり補足した場合には、それらはさらに成熟し、APCのように、よりよく機
能することができた。このことは、CDld、CD14、CD40、CD80、
CD86、CD95、ER−MP58、F4/80、RB6 8C5、E−ca
d、およびMHCII細胞表面マーカーの増加から結論された(図55)。
【0145】 アロ−MLRの結果 IRの免疫抑制活性を、たとえば移植目的のために検査するべく、本願発明者
らはまた、9週齢のメスのBALB/cからのBM細胞を用いて、前述のように
アロ−MLK(混合リンパ球反応)を行ない、GM−CSF(20ng/ml)
およびIR(IR−P、300IU/ml;IR−U、300mg/ml;IR
−U3〜5、300mg/ml;IR−U/LMDF、300mg/ml)と共
に7日間培養した。7日後、これらのDC細胞を照射し(2,000ラド)、9
週齢のメスのC57BL/Lyから単離された脾臓のCD3+細胞と、種々の割
合にて同時培養した。培養の最後の16時間の[3H]TdRの取込みにより、
T細胞の増殖を測定した。増殖のデータは、IR処理されたDCが、調べた全て
のDC対T細胞比において、増殖を阻害することが可能であることを示している
(図56)。
【0146】 IR−U/LMDF、IR−P3、IR−A3のアンチショック活性: 精製法2によって得られたIRの低分子分画(IR−U/LMDF)はまたア
ンチショック活性を有しており(図57)、この分画で処理されたマウスは生き
残った。また本願発明者らは、superdex@peputideから入手された3つの全ての
分画、IR−P3、およびIR−A3の、アンチショック活性について調べた。
この活性のスクリーニング法は、本文書の他の場所に述べらている。本願発明者
らの結果は、superdex@peputideから入手された3つの全ての分画およびIR−
P3がアンチショック活性を有しており、一方IR−A3は低ないし中程度の活
性を有していたことを示した(データは示さず)。
【0147】 方法3による精製 図100は、IR−P試料のマクロスフェア(macrosphere)GPC 60Åの
クロマトグラムを示す。
【0148】 3つの選ばれた領域すなわち、見かけ上10kDaより大きい分子量で溶出す
るIR−P1、見かけ上10kDa〜1kDaの間の分子量で溶出するIR−P
2、および見かけ上1kDaより小さい分子量で溶出するIR−P3が分画され
た。これらの全ての活性は、少なくともアンチショック活性について検査され、
それらは全てアンチショック活性を有していた(本文書の他の場所に示されてお
いる)。
【0149】 図101は、IR−PおよびIR−A試料のマクロスフェア(macrosphere)G
PC 60Åのクロマトグラムを示す(500IUの各試料を同一の注入体積に
て注射した)。この結果は、IR−P試料中のIR−P3分画に比較して、IR
−A分画が多量のIR−A3分画を含むことを示した。本願発明者らは、同量の
IR−AおよびIR−P分画について、それらのアンチショック活性を調べた。
その結果は、IR−Pに比較して、IR−Aが低ないし中程度のアンチショック
活性を有していたことを示した(データは示さず)。
【0150】 方法4による精製: 妊産婦から、その妊娠の第1トリメスターを通じてプールされた尿を入手した
。FPLCシステムにおけるFDCカラム上で脱塩し、50mMの重炭酸アンモ
ニウムを溶出緩衝液として用いた後、プールされた低分子分画(LMFD;<5
kDa)を凍結乾燥した。当該LMDF試料(13〜17mg)を懸濁し、溶出
に水を用いてバイオゲル(Bio-Gel)P−2にかけた。溶出プロフィールは8つ
の異なるピークに分離され、プールされた分画について、LPSに誘導される敗
血症性ショックにおける生物活性を検査した(方法は本文書の他の場所に述べら
れている)。LPSショックの阻害を基盤とすれば、この活性は分画Ic(“?
”)、II、III、VI、およびVIIに局在していた。これらのピークは、
40〜45ml(ピークIc「?」)、45〜50ml(ピークIII)、60
〜65ml(ピークVI)、および65〜70ml(ピークVII)の間の溶出
体積を含む(図97)。
【0151】 IR−P(プレグニル)試料をマクロスフェア(Macrosphere)GPC 60Å
カラムにかけ、重炭酸アンモニウムを用いて溶出した。3番目のピーク分画(図
100)(IR−P3)をプールし、バイオゲルP−2カラムにかけ、水を用い
ていくつかのピークに溶出した。LPSショックモデルにおける活性の検査によ
り、当該活性が7〜9時間の溶出の間に位置する分画に局在することが示された
(図98)。
【0152】 IR−A(APL)試料をマクロスフェア(Macrosphere)GPC 60Åカラ
ムにかけ、重炭酸アンモニウムを用いて溶出した。3番目のピーク分画(IR−
A3)をプールし、バイオゲルP−2カラムにかけ、水を用いていくつかに溶出
した。LPSショックモデルにおける活性を検査することにより、当該活性がピ
ーク2、3、および7に局在することが示された。これらのピークは105〜1
15ml(ピーク2)、115〜120ml(ピーク3)、および160〜18
0ml(ピーク7)の間の溶出体積を含んでいた(図99)。
【0153】 生体内におけるIRの抗敗血症または敗血症性ショック効果 生存曲線: 本実験からの最も著しい結果は、TSST−1およびD−Gal処
理に先立ってIR−Pを処理された動物のもの、対、そうでなかったもの、の間
のはっきり分かれた差である(図20.)。このことは、本生存実験から得られ
た生存曲線において明らかである。D−ガラクトサミン感作と組合わされた4μ
g用量のTSST−1は、32時間までに100%致死であり、TSST−1へ
の露出に先立ってIRを用いて前処理された動物は、致死量の毒性ショックの影
響のために死ぬことはなかった。
【0154】 LPS処理されたBalb/cマウスおよびSJLマウスは、LPSに対して
異なる感受性を示した。600μgのLPSは、BalbcおよびSJLにおい
て各々48時間および36時間までに100%致死であるが、一方IRで前処理
されたBalb/cおよびSJLマウスは生き残った。また本願発明者らは、I
R−U分画、すなわちIR−U1、IR−U2、IR−U3、およびIR−U3
〜5(プールされた)を用いてBalb/cマウスを前処理し、次いでLPSで
処理した。これらの実験は、IR−U1およびIR−U2で前処理されたマウス
は48時間までに重い病気になったことを示し、それらはLPS群と共に殺され
た。しかしながらIR−U3〜5で処理されたマウスは生き残った。
【0155】 Balb/cマウスの一群に、LPSの注射の後、700IUのIR−Pを
用いて2回処理した。対照群のマウス(LPSのみ)は、その厳しい病気のため
48時間の時点で殺された。IR−P処理された生き残りのマウスは、2匹(2
/6)を除き、60時間の時点で殺された。
【0156】 疾病の動態: 目に見える病気の兆候は、全ての実験動物において明らかであ
るが、この病気の動態と、明らかな厳しさとは、有意に異なっていた。すなわち
IR−Pで前処理されたBalb/cマウス群は、IR−U3〜5で前処理され
たマウスに加えて、TSST−1外毒素モデルにおいても(図21)、またLP
S内毒素モデルにおいても、疾病レベル2を超えなかった、というように。LP
Sモデルにおける、IR−Pで前処理されたSJLマウスおよびIR−Pで後処
理されたBalb/cマウスは、疾病レベル3を超えなかった。両モデルにおけ
る全てのマウスは、疾病レベル5を超えた時点で殺された。
【0157】 TSST−1におけるショックに誘導される体重の減少: IRの前処理はま
た、毒性ショックの生存体の体重減少を有意に誘導する結果となった。本実験か
らの体重減少のデータは、同等の疾病動態が続いた別の実験からのもの(データ
は示さず)と結びつけられたが、IRによる前処理のない4μgのTSST−1
&D−Gal群の2匹が生存するという結果に終わった(図12.)。
【0158】 この体重減少のデータを、2標本T検定(ミニタブ(Minitab)統計学ソフトウ
ェア、バージョン11.21を使用)を用いて統計学的に分析すると、低いn数
にもかかわらず、32および48時間において、体重減少における有意差(P(
HO:μ1=μ2)<0.05)が観察され、nが増加すると、有意性がより高
くなりそうであることが示される。
【0159】 2標本T検定および信頼区間 32時間における体重減少に関する2標本T (群1=TSST−1&D−Gal;群2=IR前処理を伴うT&D) 群 平均 標準偏差 標準誤差 平均 1 4 4.75 1.79 0.89 2 6 1.28 2.22 0.91
【0160】 μ1〜μ2の95%CI(信頼区間):(0.45, 6.48) T検定 μ1=μ2(vs not=): T=2.72 P=0.030 D
F=7
【0161】 48時間における体重減少に関する2標本T (群1=TSST−1&D−Gal;群2=IR前処理を伴うT&D) 群 数 平均 標準偏差 標準誤差 平均 1 3 10.05 2.25 1.3 2 6 3.49 4.41 1.8
【0162】 μ1〜μ2の95%CI:(1.1, 12.0) T検定 μ1=μ2(vs not=): T=2.95 P=0.026 D
F=6
【0163】 WBC(白血球)および血小板の計数: 血中の白血球レベル(図23)は、
標準マウス(バー#1)およびIR−Pで前処理されたマウス(バー#3)にお
いて数えられたWBCカウントに対し、TSST−1およびD−Gal単独の処
理では(バー#2)有意に高かった。このことは、予想されたように、致死の毒
性ショックを罹患しているマウスにおける、より高いレベルの免疫活性化を示し
ている。IR−P群においてはまだ正常なレベルのWBCが存在しており、この
ような発見はまた、この群が目に見える厳しい疾病の兆候を示さないため、本願
発明者らの他の結果と一致する。
【0164】 血小板のカウント(図24)は、TSST−1 D−Gal処理されたマウス
においても減じられた。上昇した血小板のカウントは、IR−P処理されたマウ
スにおいて見られた。
【0165】 移植結果: 移植研究の主要な目的は、同種移植の拒絶反応を抑制するための、そしてさら
により良く、アロ特定の寛容を引き起こすための方法の開発である。この目的の
ために、動物モデルが広く使用され、そして、皮膚の同種移植の拒絶反応が、妨
げるのに最も難しいものの一つであるかも知れないことが明らかになってきた。
【0166】 もしアロ反応性が免疫反応抑制剤により抑制されないならば、MHC―異移植
片損失は避けられない。現在、免疫反応抑制のプロトコルは多数の免疫反応抑制
剤の組み合わせの使用に基づき、それは、潜在的に拒絶過程の異なった段階を妨
げるもので、抗原認識、T細胞サイトカイン産生、サイトカイン活性およびT細
胞増殖、マクロファージ、NK細胞および細胞障害性T細胞を含む。試験的設定
で、多くの薬剤およびモノクローナル抗体(mAb)が、その免疫反応抑制潜在
能力を評価されてきている。これらの中でミゾリビン、RS―61443、15
―デオキシスペルグアリン、ブレキナーナトリウムおよびLFA―1,ICAM
―1,CD3,CD4およびIL−2Rに対するmAbがある。T細胞、マクロ
ファージおよびNK細胞のような多くの細胞型により産生されるサイトカインは
、拒絶過程に影響するかも知れない。移植片拒絶でのそれらの主要な役割の故に
、それらが生産するCD4+T細胞およびサイトカインは、同種移植片の拒絶お
よび許容において広く研究されてきた。CD4+Tリンパ球は、そのサイトカイ
ン産生パターンに基づいて、少なくともTh1およびTh2細胞の2つのサブセ
ットに細分できる。Th1細胞はIL―2、IFN―ガンマおよびTNF―ベー
タを生成するが、遅延型過敏性(DTH)反応および細胞の細胞障害性において
役割を果たし、一方Th2細胞はIL―4、IL5,IL―6およびIL―10
を産生し、B細胞分化および抗体生成の有効に刺激する。これらの2つのThサ
ブセットはお互いに増殖および機能を調節できる。IFN―ガンマはTh2細胞
増殖を阻害し、そしてIL―4効果に拮抗し、IL―10はTh1サイトカイン
産生を阻害する。これらの2つのサブセットをまた調節できる調節T細胞の存在
に対する徴候がある。移植片拒絶はTh1細胞によって仲介されると思われてお
り、そのことが、DTHおよびCTL活性を刺激するかも知れない。一方では、
アロ反応性のTh1細胞の抑制は、移植片許容につながるかも知れない。
【0167】 免疫反応抑制は炎症誘発性のサイトカインを、抗サイトカインmAbまたは溶
解性サイトカイン受容体の供給により中和することで達成される。あるいは、T
細胞の一つのThサブセットへの分化の「ゆがみ」はサイトカイン環境を変化さ
せることにより達成される。たとえば、IFN―ガンマ(Th1,NK細胞)お
よびIL―12(マクロファージ、B細胞)がTh1細胞分化を促進し、IL―
4(Th2)がTh2細胞の発達を向上する。抗サイトカインmAbまたはサイ
トカインによって生体内サイトカイン環境を変えることが同様な効果を持つかも
知れない。さらにTh3およびTr1のような、かつDC1およびDC2のよう
な調節細胞の誘発は、また移植の拒絶を減じ、かつ移植片の寛容を引き起こす。
【0168】 結果: BALB/cレシピエントのIR―Pによる治療は、未治療の対照群
に比べてC57BL/6皮膚移植生存を延長した。IR―P治療のレシピエント
が移植後22日間まで移植片を延長することができたのに対し(図96)、対照
レシピエントは12日間の間に皮膚移植片を拒絶した(図95)。図95および
96は、1つのIR―P治療によるそのような延長された移植片(19日に撮ら
れた写真)および対照マウスからの拒絶された移植片を示す。
【0169】 EAE結果: PBSで治療されたマウスは、最初の3週間の間ただ体重が減っただけであっ
た(図77)。全実験中に、疾病に耐性を存続した一匹のマウスを除いて、これ
らのマウスは、全て少なくとも2匹のEAE臨床治療の徴候があり、そして、よ
り長い疾病の持続期間を示した(図78)。IR治療のマウス群中、実験中観察
された体重減少はより少なく(図79)、かつ2匹のマウスが実験中疾病にかか
らなかった。この群の病気のマウスは最大の臨床得点が2であり、そして疾病の
持続期間は短く、PBS治療群よりもEAEの症状からより早く回復した(図8
0)。
【0170】 ショックの結果 IR治療のマウスはLPS誘起のショックに耐性がある。すなわちIR治療の
マウスに対する高用量のLPS治療の効果を測定するために、BALB/cマウ
ス(n=30)がLPSで腹腔内注射され、生存は5日間評価された。PBS治
療のBALB/cマウスは、高用量のLPS注射後1日〜2日の間ショックに屈
し、5日目にはただ10%のマウスのみ生存した。対照的に、IR―Pもしくは
そのIR―P1またはIR―P3分画で治療されたマウスは5日目に100%生
存した(P<0.001)(図58)、一方、IR―P2、IR―Aおよびデキ
サメサゾン治療のマウスは約70%の生存を実証した(図58)。 血液検査: ショックでのLPSに対する全身の反応の主な症状は、器官におけ
る重症の炎症であり、器官不全または器官系機能不全につながり、最初は肝臓で
起こる。したがって、本願発明者らはWBCおよび血小板と同様に、ALAT、
ASAT、LDH1のような酵素を測定した。図59はIR―A、IR―Pおよ
びそのIR―P1、IR―P3分画で、全血小板数が正常範囲(100〜300
×109/ml)で、一方対照ではIR―P2およびデキサメサゾン治療のマウ
スで、全血小板数が正常範囲より低いことを示す。図60〜図62は、IR―A
、IR―PまたはそのIR―P1、IR―P2またはIR―P3分画で治療され
たマウスが、対照およびデキサメサゾン治療のマウスと比べて、血漿中で比較的
低いレベルのALAT、LDH1およびASAT酵素を有することを示す。これ
らの酵素は、器官の損傷によって、ショックの間血液中により高い濃度で存在し
た。これらの結果は本願発明者らの生存結果と一致する(図58)。加えて、シ
ョックの間、その炎症の場所の転移により、血液中に低い数のWBCが見いださ
れた。図63の本願発明者らの結果は、IR―A、IR―Pおよびその分画で治
療されたマウスは、対照およびデキサメサゾン治療のマウスよりもt=48時間
でWBCの適度の正常レベルを持ち、IR治療マウスにおいてより弱い炎症の反
応を示唆する。
【0171】 生体外NOD/LTJ結果: 図64は、rhCGとの組合せでIR―PまたはIR―P3で治療された、N
ODマウスから分離されたCD4+細胞でのTh1分極アッセイにおけるIFN
−ガンマ産生の阻害を示し、一方、rhCGおよびIR―P3単独によるTh1
分極で適度な阻害が見いだされた。これは、rhCGがTh1サブセットを最大
に阻害するので、IR―P3分画がrhCGを必要とすることを示唆する。
【0172】 図65はPBS治療のマウスと比べて、rhCGと組合せてIR―P、IR―
P1、IR―P2またはIR―P3で治療されたNODマウスから得られた、抗
CD3刺激脾臓細胞におけるIFN−ガンマ産生の阻害を示す。rhCGおよび
IR―P3は、単独では組合せた場合と同じ効果を持たない。これは、IR―P
3分画が、rhCGのIFN−ガンマ阻害の理由でrhCGを必要とすることを
再び示唆する。
【0173】 図66は、rhCGと組合せてIR―P、その分画、rhCGまたはIR―P
3で治療されたNODマウスから得られた脾臓細胞の異なる時点(t=12,2
4,48時)での抗CD3刺激増殖を示す。再び結果は、前のIFN−ガンマ阻
害(図65)と一致する。ここで、IR―P3分画はまた、生体内治療されたN
ODマウスからの脾臓細胞の抗CD3誘起増殖に対する阻害効果の理由で、rh
CGを必要とする。
【0174】 図67は、IR―Pおよびその分画が、PBS治療のマウスと比べて、治療N
ODマウスからの抗CD3刺激脾臓細胞のIL―10産生を促進することを示す
【0175】 図68は、IgG2a産生が、NODマウスのIR―P2またはrhCGによ
る生体内治療により阻害されないことを示し、一方、IR―P、IR―P1、I
R―P3およびrhCGと組合せたIR―P3がIgG2a産生を阻害すること
を示す。rhCGと組合せたIR―P3はIR―Pと同じ特性を有するので、こ
の組合せが、また妊娠の誘発、IVF、流産の予防または関連した問題のために
使用されると考えられる。
【0176】 STZモデル 糖尿病Iの病因の決定的なことは、インスリン産生膵臓ベータ細胞の破壊であ
る。ベータ細胞塊の進行する減少は、慢性の自己免疫反応の結果であるという強
い証拠がある。この過程の間、ランゲルハンス島内侵入免疫細胞、ランゲルハン
ス島内毛細血管内皮の細胞およびベータ細胞そのものが、細胞障害性の伝達物質
を放出することができる。サイトカイン、および特に窒素酸化物(NO)は、ベ
ータ細胞に影響を及ぼす有毒なエフェクター分子である。反応性のNOラジカル
は、主に、広範囲のDNAストランド切断誘発を介して、その有害な効果を仲介
する。この初期の損傷はおそらく一連の出来事を引き起こし、それはベータ細胞
の死で終わる。
【0177】 げっ歯動物に引き起こされる、ベータ細胞毒ストレプトゾトシン(SZ)によ
る糖尿病は、膵臓のベータ細胞の破壊に関係する機構を研究するために、動物モ
デルとして広範囲に渡って用いられる。SZはグルコース輸送体GLUT―2を
介して膵臓ベータ細胞により利用される。この薬剤は細胞内で分解し、そしてア
ルキル化またはNOの生成のいずれかによってDNAに損傷を起こす。DNAス
トランド破壊の出現は、大量の細胞核の酵素ポリ(ADP−リボース)ポリメラ
ーゼ(PARP)の活性化につながり、それはNAD+を基質として大量の(A
DP−リボース)ポリマーを合成する。PARP活性化の結果として、NAD+
の細胞性の濃度はそこで非常に低いレベルまで減じ、それで、細胞に十分なエネ
ルギーを起こす能力がなくなると考えられ、そして最後には細胞を死に導く。
【0178】 反応性のラジカルはまた、腎障害、閉塞性腎障害、急性および慢性の腎性同種
移植片の拒絶反応、(SLE、関節リウマチ、糖尿病、MSのような)自己免疫
性疾患、AIDS、血管形成に関する疾患、アテローム性動脈硬化症、血栓症お
よびII型真性糖尿病のような多くの疾患の病因において重要な役割を果たす。
たとえば、最近増加したDNA塩基への酸化損傷が、II型真性糖尿病の患者に
見られ、それが病因および糖尿病の合併症に寄与する。本願発明者らは、IRが
またSTZ誘発糖尿病の誘発を遅らせる能力を有するかどうか、そしてまた細胞
反応性ラジカル形成および防御への効果を有するかどうかを試験した。
【0179】 HD―STZモデルにおいて、糖尿病の誘発は、PARPの誘発活性化による
膵臓の細胞組織の、ベータ細胞への直接の効果による。結果として、NAD+の
減少および細胞に十分なエネルギーを起こす能力がなくなることが、最後には細
胞を死に導く。このことは、どの免疫の成分もこの過程に含まれないことを示唆
する。比較すると、MD―STZモデルには、強い免疫成分が存在する。図69
および図70は、IR―P治療が両方のモデルにおいて、糖尿病の誘発を遅らせ
られることを示す。この遅れの背後の機構はおそらく異なる性質のものである。
【0180】 ヒトの研究 免疫系は、多種多様の多数の微生物に応答するにもかかわらず、そしてその自
己抗原への不断の暴露にもかかわらず、平衡状態を保つ顕著な能力を持つ。外か
ら侵入した抗原に生産的な応答をした後に、免疫系は休息の状態に戻り、それで
リンパ球の数と機能状態は、おおよそ予備免疫のレベルにリセットされる。この
過程は恒常性と呼ばれ、そしてそれは免疫系を新しい抗原性の挑戦に効果的に応
答させる。生成的なリンパ系器官から新しく移出するものが、常在の細胞ととも
に「スペース」と競合するように、予備免疫のリンパ球分集団のサイズおよびレ
パートリーは、また綿密に制御される。
【0181】 自己抗原を認識する能力のある受容体を伴うリンパ球は、常に生成され、しか
し正常な個々は、その自己の抗原に応答しない状態を維持し、これは自己寛容と
呼ばれる。
【0182】 自己免疫疾患において、免疫系が不適切に「自己」を認識し、それが、病理の
体液および/または細胞の免疫反応につながる。正常な、非自己免疫状態におい
て、自己反応性リンパ球が、削除されるかまたは末梢の自己リガンドに非応答と
される。潜在的に自己反応性の細胞の集団は実証できるが、それらがリガンドへ
自己免疫反応を起こすようにはみえない。もし、T細胞受容体(TCR)相互作
用が退化され、T細胞はリガンド(1、2)の相違により活性化できるならば、
自己免疫疾患の状況は、これらの自己反応性の細胞が分子模倣を介して活性化さ
れることで明らかになる。適当な条件下で自己反応T細胞の活性化が、サイトカ
インの誘発および特定の同時刺激分子(たとえば、CD80/CD86およびC
D40)の上方制御により促進され、自己免疫につながるという証拠がある。
【0183】 免疫系が、自己組織を非自己と間違え、そして不適当な攻撃を組み込む とき、結果は自己免疫疾患となる。多くの自己免疫疾患がある。いくつかの例は
、ウェゲナー肉芽腫症、多発性硬化症、1型真性糖尿病、および関節リウマチで
ある。更に、感染症もまた免疫疾患の誘発につながる免疫応答を誘発でき、一方
、感染症そのものは宿主には危険ではない。たとえば、結核での結核菌の役割で
あり、そこで免疫系が結核菌に積極的に反応し、炎症性の病気となり自己の免疫
反応による組織破壊となる。同様なことが、また、たとえばらい菌に対しても事
実である。
【0184】 自己免疫疾患は異なる方法で体にそれぞれ影響することができる。たとえば、
自己免疫反応は、多発性硬化症では脳に、そしてクローン病では内臓に向けられ
る。他のシェーグレン病および全身性ループスエリテマトーデス(ループス;S
LE)のような自己免疫疾患では、影響された組織や器官は同じ病気で個々の間
で変化するかも知れない。多くの自己免疫疾患はまれである。集団的に、しかし
ながら、それらは西洋社会で多くの人々をひどく苦しめる。
【0185】 多くの自己免疫疾患が男性よりも女性において、より一般的である。性的二型
性は自己免疫疾患の広範囲をカバーし、器官特異(グレーブス病のような)から
一般化されたSLEまでを範囲とする。MSでは、メス―オス優勢近似で2:1
〜3:1である。MSおよび他の自己免疫疾患での性の偏りの理由は、明らかで
ないが、多くは感染症への免疫応答での性関連相違としての要素、性ステロイド
効果および性連鎖の遺伝要素を含む。MS、シェーングレン、SLE、およびR
Aは異なる疾患で、病因論においておそらく異なることが認められる。
【0186】 しかしながら、共通に関連することは、女性におけるこれらの疾患の圧倒的な
罹患率である。これらの疾患のそれぞれが自己免疫であり、性ホルモンおよび性
別の効果が同様かも知れないことの考慮は、これらの疾患の比較を有用にする。
自己免疫疾患は女性を特に労働年齢および出産可能な年齢に襲う。しかしながら
、これらの臨床経過は、妊娠中は驚くほど厳しさが減るか、またはまさに寛解が
みられる。
【0187】 妊娠中、女性は、細胞仲介の免疫の弱化(Th1応答)および体液免疫の或る
成分の強化(Th2応答)と一致する免疫的な変化を受ける。妊娠中の母体系に
よる、このTh2が偏った類似の応答は、一時的な免疫抑制または免疫調節の状
態を導入し、これが胎児への母の拒絶応答の抑制となり、しかし母の感染への耐
性を維持またはまさに増加する。加えて、いくつかの自己免疫疾患への減少した
罹患率、特にTh1細胞仲介の免疫疾患がまた観測されてきた。たとえば、関節
リウマチ(顕著にTh1細胞が仲介する自己免疫疾患)の女性のおよそ77%が
、妊娠中症状の一時的な寛解を経験し、それは大多数の場合第1トリメスターか
ら現れる。したがって、Th1細胞仲介の自己免疫疾患における妊娠中の臨床の
改善は、おそらく初期妊娠中の生理的な免疫変化に関係するはずである。
【0188】 本願発明者らのIRはNODおよびEAEのような動物モデルにおける自己免
疫疾患の発生を阻害できるので、本願発明者らは免疫疾患の数人の患者を治療し
た。全患者は、手に負えない疾患のために、インフォームドコンセントの後に治
療された。
【0189】 患者1:ウェゲナー肉芽腫症 ウェゲナー肉芽腫症は、男性および女性の両方に影響を与える自己免疫血管性の
疾患であり、中年の人により一般的であるが、どの年齢の人にも影響を与える。
初期の症状は、慢性で進行性の炎症を伴う上部および下部の気道に関係する。炎
症は組織または皮膚における塊または肉芽腫を形成するかも知れない。それは血
管の一般的な炎症(血管炎)および腎臓の炎症(糸状腎炎)に進行するかも知れ
ない。腎臓に関係しない、限られた形の疾患が起こるかも知れない。
【0190】 血管炎は小さいおよび中くらいのサイズの血管壁における自己免疫反応の結果
である。慢性の血管炎は、血管の中で狭小化を起こし、そして組織への血液の流
れの障害という結果となる。この状態は組織に損傷を起こすかも知れない(壊死
)。
【0191】 自己免疫疾患は、これらの反応が、自己反応抗原の産生によって体自身の細胞
および組織に対して不可解に生じるとき起こる。ウェゲナー肉芽腫症で、抗原は
或る白血球の細胞質中の成分に進む。ウェゲナー肉芽腫症の原因は知られていな
い。疾患は感染症の過程に類似しているが、原因となる物質は単離されていない
。患者の大多数に抗好中球細胞質抗体(ANCA)が見いだされ、そのレベルは
疾患の活性度に関連するように見える。ウェゲナー肉芽腫症は、特にヨーロッパ
や有色人種(アフリカ人、南アメリカ人、アジア人)には、極めてまれな疾患で
ある。患者の実際の数は知られていないが、おおよその見積もりで、年間100
万人のアメリカ人当たり新しく2例、またはアメリカ合衆国で毎年約500の診
断された実例である。疾患はどの年齢でも起きるが、人生の4番目または5番目
の十年間にそのピークがある。
【0192】 男性および女性に同様に影響する。 患者の85%が19才より上である。
【0193】 患者の平均年齢は41才である(最新の年齢範囲は5〜91才である)。 全患者の97%が白人系、2%が黒人および1%が他の人種である。
【0194】 ウェゲナー肉芽腫症の症状、およびこれらの症状の厳しさは一人の患者と別の
患者で異なるが、ほとんどの患者が最初に上部気道に症状を認める。疾患の共通
の症状は、しつこい鼻漏(鼻水の出る鼻)、または他の、標準の治療では効き目
を示さずそして進行して悪化する、風邪の様な症状である。
【0195】 鼻漏は、副鼻腔洞ドレナージの結果であり、そして呼吸器の障害や痛みを引き
起こせる。病訴は、鼻からの漏出、副鼻腔炎、鼻膜潰瘍および外皮形成、聴力の
問題を伴う耳の炎症、咳、喀血および胸膜炎(肺の内面の炎症)を含む。他の初
期の症状は、熱、疲労、倦怠感(不快感)、食欲減退、体重減少、関節痛、寝汗
、尿の色の変化、脱力感を含む。ほとんどのウェゲナー肉芽腫症の患者は、上記
の全ての症状を経験するわけではなく、疾患の厳しさはそれぞれの患者で異なる
。ときどき副鼻腔中の微生物感染からの結果として、熱はしばしば出る。患者の
三分の一は、疾患の発症において症状がないかも知れない。
【0196】 臨床検査はウェゲナー肉芽腫症に対して明確なものではなく、ただ患者が炎症
疾患を持つことを示唆する。血液検査はしばしば貧血(低い赤血球数)および他
の血液中の変化を示す。胸部X線および腎臓生検は、ウェゲナー肉芽腫症診断に
使用される手段として重要である。効果のある治療にとって早期診断は重要であ
る。無症候の患者は、ANCA血液検査ならびに副鼻腔および肺のCTスキャン
により診断される。ウェゲナー肉芽腫症の診断をするのに、平均で5〜15ヶ月
かかる。全診断の40%が3ヶ月以内に行われ、10%が5〜15年以内に行わ
れる。
【0197】 他の診断手段は次の通りである。 赤血球沈降速度は一般的に上昇する。
【0198】 完全な血液数はしばしば貧血、上昇した白血球数、上昇した血小板数を示す。 尿検査はしばしば腎臓関与のスクリーニング検査として考慮される。
【0199】 24時間の尿の堆積が、或る患者に腎臓機能の評価するために用いられる。 c―ANCAは特徴的であり、プロテイナーゼー3抗体を測定する。
【0200】 IR−Pによる患者1の初期治療結果 患者は、手に負えない疾患のために、インフォームドコンセントの後に治療され
た。
【0201】 診断:副鼻腔に関する組織病理学に基づくウェゲナー肉芽腫症およびcANC
A試験。 実例:5年間再発性のウェゲナー肉芽腫症と知られた34才の男性患者。この患
者は高用量のステロイド、シクロスポリン(5mg/kg)およびシクロフォス
ファミド(1−2mg/kg)の治療を受けた。1998年7月に進行性の疾患
のために、IR(プレグニル)の治療を毎日5000I.U,s.c.受けた。
【0202】 図81はIR治療の前、患者は高い投与量のステロイドの故に免疫不全であっ
たことを示す。IR治療の後Tリンパ球(CD4,CD8)のレベルは増加し、
B細胞を除き正常範囲であった。本願発明者らはまたIR治療中かから得られた
、LPSおよびPMA/Ca刺激PBMC中のサイトカインを測定した。本願発
明者らは、LPS刺激PBMCが治療中TNF−アルファ、IL―10およびI
L―12をより多く産生し(図82a)、一方、PMA/Ca刺激PBMCはよ
り少なくIFN−ガンマを産生すること(図82b)を観測した。それでここで
、本願発明者らは、IR治療は抗炎症サイトカイン(IL―10、TNF)の産
生を増し、一方炎症サイトカイン(IFN−ガンマ)の産生を減じることを示す
。これは本願発明者らの治療の3ヶ月間、副鼻腔に関する炎症活性により測定さ
れた通り、更なる進行は観測されず、臨床観察と一致する。これらの結果はIR
−Pの有益な効果を示唆する。
【0203】 患者2:多発性筋炎 定義:全身性結合的組織疾患で、T細胞仲介の筋線維の破壊を起こす炎症を通し
て起こる。これらの症候群の、他の可能性のある原因は、補体活性、感染、薬剤
、ストレス、ワクチンを含む。それは人々にどの年齢にも影響するが、ほとんど
一般に50〜70才の間の人々、または5〜15才の間の子供に起こる。それは
男性よりも女性に2倍影響する。筋衰弱が突然に、または週または月に渡ってゆ
っくりと起こる。頭の上に腕を上げること、座る位置からの起立、または階段を
上ることが難しくなるだろう。声が、喉頭の衰弱により影響されるだろう。関節
痛、心臓の炎症、そして肺の(肺)疾患が起こる。皮膚筋炎と呼ばれる同様な状
態が、暗く赤い発疹が、顔、首、肩、胸上部、および背に現れるとき明らかであ
る。悪性腫瘍がこの疾患と関係する。多発性筋炎の出現率は、10,000人の
人々について5人である。
【0204】 患者2:診断:全身性硬化症/多発性筋炎 重複(組織病理学に基づいた)。 実例:50才の女性で2年間、活性多発性筋炎構成要素を伴う全身性硬化症に
かかっている。彼女はダプソン、ステロイド、メトトレキセートおよびシクロス
ポリンで治療された。クレアチン燐酸により測定された、手に負えない筋炎の故
に、3ヶ月間プレドンゾン、ジルテックおよびプレグニル5000I.U.,s
.c.の組合せで治療された。治療中、CPKレベルは1100から750に下
がった。これは疾患活性における減少を反映する。
【0205】 図83はIR−P治療のために、リンパ球、T細胞(CD4、CD8)および
B細胞の数が減少することを示し、これは、治療による機能亢進免疫系の下方制
御を示す。これは本願発明者らのサイトカインのデータ(図86)と一致し、こ
のデータはLPS刺激IL―12およびTNFアルファのPBMCによる阻害を
示す。更に、治療中IL―10産生での増加があり、これは抗炎症サイトカイン
である(図86)。加えて、上昇したCPKおよび肝臓酵素(ASAT、ALA
T)が、また減少した(図84および85)。これは全ては疾患の活性での減少
を反映する。
【0206】 患者3:真性糖尿病(I型) 真性糖尿病は、グルコースおよび他のエネルギー産生燃料の減じられた代謝に特
徴のある慢性疾患であり、加えて血管性および神経障害性の合併症が遅れて発現
する。真性糖尿病は、高血糖症を伴う顕著な病原性の機構を共通の特徴として含
む疾患の群からなる。原因にかかわらず、疾患はインスリン欠乏に関係し、それ
は、共存インスリン耐性の含有量の点でみたときに、全部、部分的、または相対
的であろう。インスリンの欠乏は、糖尿病、そして高血糖症につながる代謝の混
乱において、主な役割を果たし、その結果疾患の合併症において鍵となる役割を
果たす。アメリカ合衆国で真性糖尿病は、医者と接する患者に対して最も一般的
な理由の四番目であり、早発の障害および死亡率の主な原因である。それは労働
年齢の人々の間で、失明、最後の段階での腎臓疾患、そして非外傷性の肢切断の
主な原因である。それは、心臓、脳、および末梢神経の疾病率および死亡率の危
険を増す。明るい面では、最近のデータは、疾病のほとんどの衰弱させる合併症
が、高血糖症および心血管の危険要素の前向きな治療により妨げられるかまたは
遅らせられることを示す。
【0207】 インスリン依存真性糖尿病(IDDM)は、臨床的に規定された糖尿病の型の
一つであり、顕著に子供および若年成人に発現するが、全ての年齢群に現れるだ
ろう。主なIDDMへの遺伝的感受性は、HLA複合体に染色体6上でつながる
。これらの遺伝的背景は、ベータ細胞破壊につながる免疫仲介過程を開始するた
めに、環境因子(おそらく或るウイルス、食物および気候)と相互に作用する。
一方、非インスリン依存糖尿病(NIDDM)は、臨床的に規定された別の糖尿
病の型であるが、糖尿病の最も一般的な形である。NIDDMの罹患率は、母集
団によって非常に変化する。最も大きな割合はピマインディアンに見いだされる
。この形の糖尿病に寄与すると認められる主な環境因子は、肥満症および身体活
動である。NIDDMは、全ての母集団で強い家族性集合体を示し、明らかに遺
伝的感受性および環境因子間の相互作用の結果である。NIDDMが発現する前
に、インスリン濃度は、糖血症および肥満症の程度に対して高く、インスリン耐
性の存在を反映する。インスリン耐性が悪くなると、グルコースレベルは増加し
、グルコース不耐性の出現を伴い、最後に、インスリン応答がインスリン耐性を
補えないとき、NIDDMの出現を伴う。
【0208】 本願発明者らの予備のマウスデータは、IRがTh1表現型サイトカインをT
h2表現型にシフトする能力を持ち、そしてIRはまたNODマウスで糖尿病を
阻害でき、本願発明者らは、それがまた糖尿病のような人免疫疾患に積極的な臨
床効果を持つべきであるとみなした。
【0209】 患者3:診断:真性糖尿病I型 実例:患者は21才の男性で3ヶ月前から真性糖尿病にかかっている。彼はイン
スリン(アクトラピッドおよびインスラタード)で治療された。抗―島細胞抗体
の高いレベルが彼の血液にあった。彼はプレグニル5000I.U.s.c.で
3ヶ月治療された。彼の治療の間インスリンは図87に示すように、減少した正
常血糖を維持する必要がある。プレグニルの中止後、彼のインスリンは再び上昇
する必要がある(図87)。この新しく真性糖尿病を発症した患者において、イ
ンスリンはIR―Pの治療中、有意に下がる必要があり、そしてまたグルコース
調節の改善が見いだされ、これは、IR―P治療中グリコシル化HbAlcレベ
ル(図87)での減少およびLPS刺激PBMCにより産生された(図88)炎
症サイトカイン(IL12、TNFアルファ、IFN−ガンマ)での減少により
支持される。更に、IL―10の増加(抗炎症サイトカイン)が、また治療中観
測された(図88)。これらすべては、島細胞機能の改善および、最終的には、
またより良いグルコース制御を示唆する。
【0210】 多発性硬化症と関連状態(管内データ) 多発性硬化症(MS)は未知の原因の疾患であり、臨床的には特徴的な症状、
兆候および進行によって、病理学的には散乱した炎症領域および脳、視神経およ
び脊髄の髄鞘脱落によって定義される。MSの最初の症状は、もっとも一般的に
は15歳から50歳の間で現れる。
【0211】 MSの原因は未知であるが、しかし病因には免疫仲介炎症髄鞘脱落が含まれる
ことが広く信じられている。MSの脳の病理学的試験では、リンパ球および単球
による免疫病理学的過程脈管周囲浸潤、病巣での細胞によるクラスIIMHC抗
原発現、活性化した免疫細胞によって分泌されたリンホカインおよびモノカイン
の顕著な特徴および感染の明白な証拠の欠失を示す。
【0212】 自己免疫病原についてのさらなる証拠には、(1)MS患者の血液および脳脊
髄液(CSF)での免疫学的異常、著しい選択的鞘内液免疫活性化、リンパ球サ
ブセット異常、および血中およびCFS中の高頻度の活性化リンパ球、(2)M
Sと特定のMHCクラスIIアロタイプ間の結合、(3)MS患者の、免疫抑制
剤で改善される傾向にあり、免疫応答を刺激するインターフェロン−ガンマ処置
で悪化する免疫調節に対する臨床的応答、(4)MSおよび実験的自己免疫脳脊
髄炎(EAE)、すなわち炎症髄鞘脱落の再発性症状発現が、ミエリン基礎タン
パク質またはプロテオリピドタンパク質を感受性動物に接種することで誘導でき
るような動物モデルの間の著しい相同性が含まれる。
【0213】 疫学的研究は、MSの病理学での環境および遺伝的因子を提案している。疾患
の一定ではない地理的分布および様々な時点−原因の流行は、環境因子を提示し
てきたが、しかしながら、過去30年間にわたる真剣な研究では、感染原因を確
立し得なかった。移動研究は、青年期より前での定義されていない環境因子の暴
露がMSの引き続く発達に必要であることを示した。遺伝的影響は、二卵性双生
児と比較した一卵性での過剰な一致、家族でのMSの集積化、リスクの人種変動
およびクラスIIMHCアロタイプとの関連によってよく確立されている。カフ
カス人では、HLAクラスIIハプロタイプDR15、DQ6、Dw2がMSの
リスクの増加に関連して強くそして一定に現れる。
【0214】 免疫学的、疫学的、および遺伝的な証拠は、遺伝的に感受性の個体の幼児期の
間の環境因子への暴露(おそらく任意の多くの共通ウイルス)が結局免疫仲介炎
症髄鞘脱落を引き起こす可能性があるという考えを支持する。遺伝的な、環境の
そして免疫学的な因子と、環境の引き金の特性の間の正確な相互作用は解決すべ
きままである。本願発明者らはMS患者よりPBMCを単離し、これらをLPS
またはPMA/Caで刺激した。24時間培養後、サイトカイン分析のために上
清を回収した(TGF−ベータ、IL−10、IFN−ガンマ)。
【0215】 MS患者1(管内): IR−Pで処理したLPS刺激PBMCでTGF−ベ
ータおよびIL−10の産生の増加があった(図HおよびI)。PMA/Caに
よって刺激し、IR−Pによって処理した培養でのTGF−ベータおよびIL−
10産生に違いは観察されず(図89および90)、一方IR−PはPMA/C
a刺激PBMCでのIFN−ガンマの産生を阻害した(図91)。
【0216】 MS患者2(管内): 患者2より入手したPBMCは、TPA/Ca刺激の
みと比較してIR−Pで処理した培養においてTGF−ベータおよびIFN−ガ
ンマの産生の減少を示し、一方IR−P処理はLPS刺激TGF−ベータ産生を
増加させた(図92および93)。IL−10産生はLPSおよびTPA/Ca
刺激培養両方でIR−Pによって阻害された(図94)。
【0217】 管内でのMS患者からのPBMCによる抗炎症サイトカインの産生におけるI
R−Pの刺激効果と、炎症サイトカインの産生における阻害効果は、EAEが誘
導されるSJLマウスのIR−P処理の有益な臨床効果と関連がある(本文章の
他の部分を参照のこと)。
【0218】 ヒト気管支上皮細胞株BEAS 2B(喘息管内データ) 気管炎症によって特徴づけられる疾患は集団の実質的な割合に影響を及ぼす。
これらの疾病には喘息および慢性閉塞性肺疾患(COPD)が含まれる。欧州連
合においては、COPDと喘息とは、肺炎とともに死因の第3位である。刺激物
、感染薬剤および炎症伝達物質への応答でのサイトカインと成長因子との産生は
、急性および慢性気管炎症の開始、永続および阻害に重要な役割を演じる。
【0219】 気管炎症は気管の炎症細胞および内在細胞より放出される様々な伝達物質およ
びサイトカインの過剰な産生と活性化に関連する。ここで上皮は炎症の伝達物質
の主要な標的であるだけでなく、それ自身炎症過程への活性のある関連物である
ことが明らかである。気管支上皮細胞は化学誘引物質の放出を介して気管へ炎症
細胞を補充することができ、細胞接着分子の発現を介して上皮を横切る炎症細胞
移動を管理でき、そしてサイトカイン、ケモカイン、アラキドン酸代謝産物なら
びに弛緩因子および収縮因子などの伝達物質の放出を介して他の細胞の炎症活性
を調節できる。
【0220】 気管支上皮細胞は受動的バリアを形成するだけでなく、免疫応答に活発な役割
を担ってもいる。これらは炎症促進または抗炎症のいずれかで働くであろう様々
な伝達物質を産生できる。さらに、気管支上皮細胞は多くの異なる細胞型に対す
る接着分子を発現してよく、したがってそれらの漸増に貢献する。
【0221】 気管に存在する炎症細胞から産生されるTNF−アルファはRANTESおよ
びIL−6のような他の炎症サイトカインおよびケモカインを誘発させることが
できる。また抗炎症サイトカインの産生をダウンレギュレートでき、したがって
上皮細胞の保護機能に損害を与えうる。グルココルチコイドは、IL−6、RA
NTES、IL−4を含む、喘息に関連するほとんどのサイトカインおよびケモ
カインの転写を阻害する。この阻害は少なくとも特にグルココルチコイドの治療
的効果に対して反応性である。
【0222】 本願発明者らの結果(図71〜図73)は、これらの発見と一致し、デキサメ
タゾンがBEAS 2B細胞株でのIL−6およびRANTES産生を誘導する
TNF−アルファを阻害できることを示している。さらに、デキサメタゾンは抗
炎症TGF−ベータサイトカインのダウンレギュレーションを誘導するTNF−
アルファを回復させることができ、一方IR−PはTGF−ベータ産生を回復さ
せるだけでなく、この抗炎症サイトカインをさらに増進させる(図73)。さら
に、デキサメタゾンおよびIR−Pは両方ともRANTESの産生を誘導するI
FN−ガンマを抑制できる(図74)。
【0223】 TNF−アルファはまた、そこで炎症細胞を補充する上皮細胞の表面上にHL
A−DRおよびICAM−1などの細胞接着マーカーを誘導できる。この場合、
上皮細胞はまた抗原提示細胞(APC)としても機能できる。本願発明者らの結
果は、デキサメタゾンとIR−P両方がHLA−DRおよびICAM−1の発現
を誘導するTNF−アルファをダウンレギュレートできたことを示している(図
75および76)。これらの結果はIR−Pがまたアレルギー、喘息および特定
の寄生虫性疾患のようなTh2−型サイトカイン表現型によって特徴づけられる
疾患の臨床的進行に影響を与える能力を有することを示している。
【0224】 考察 ノノース糖尿病(NOD)マウスはもともとヒトIDDM患者に対する免疫病
理学および臨床症状との明らかな類似性を持つインスリン依存糖尿病を進展させ
る。結果として、NODマウスは、IDDMの潜在する免疫生物学およびそれを
制御する複雑な遺伝学を研究するための貴重なツールとなってきた。これらの研
究を通して、本願発明者らは現在、糖尿病がTh1/Th2サブセットの比の不
釣り合いおよびその結果インスリン産生β細胞の破壊に起因することを知ってい
る。この破壊はIFN−γ、TNF−α/βおよびIL−1のような前炎症サイ
トカインを産生するβ−細胞抗原特異的CD4+ T細胞によっておこる。研究
数の増加が現在糖尿病を(マウスおよびヒトの)Th1類似細胞の選択的分化と
関連させている。
【0225】 対照的に、妊娠は選択的Th2現象であると考えられており、驚くべきことに
妊娠中、多くの免疫仲介疾患の厳しさが減少してみられた。対照的にGallo
et al.は、第一トリミスター妊娠で存在するhCG仲介因子(HAF)
が抗腫瘍(および抗ウイルス)効果をもち、これはおそらく腫瘍細胞上での直接
的な細胞傷害性効果によって、しかしこれらの著者によると免疫仲介応答によっ
てではなく行われる。
【0226】 ここで本願発明者らは、たとえば(第一トリメスター)妊娠の尿から入手可能
な免疫レギュレータは、妊娠中の上述した免疫異常に影響を与えるだけでなく、
NODマウスでの糖尿病の発展にも影響を及ぼす。
【0227】 本願発明者らの結果はたとえば第一トリメスター妊娠の尿からの部分的に精製
したhCG調製品であるPregnylは、たとえば4週間の間1週間に3回の
み処置した場合に15週齢NODで、糖尿病の開始を遅延できることを示めす。
さらに、これらの転送にて処置したマウスから単離した脾臓細胞はまた、免疫無
防備状態NOD.scidマウスでの糖尿病の開始を遅延させる可能性がある。
本願発明者らはこの坑糖尿病活性がhCGそれ自身、そのサブユニット、β−コ
ア(β−hCGの天然に壊れた産生物)に、または同定されていない因子(HA
F)に存在しているかどうかを査定するためにPregnyl調製品を分別した
。Pregnylは入手可能な最も精製されたhCG調製品の1つであり、少量
のβ−コア断片のみを含むということが充分わかっている。本願発明者らはほと
んどの坑糖尿病活性がhCGのない分画に存在することを発見した。さらに本願
発明者らはヒト組換え体α−hCGおよびβ−hCGも何の効果を持たないこと
を示した。しかしながら、本願発明者らはhCGが糖尿病および他の免疫仲介疾
患での他の因子と相乗作用を示すことができる可能性を無視していない。
【0228】 NODマウスの膵臓でのインスリンおよび浸潤の存在の免疫組織学的解析は、
600 IU Pregnylで処置したNODマウスが明らかな浸潤を示して
はいなかったことを明らかにした。さらに、新規インスリン小島が膵臓でみられ
、これはこの処置によって誘導された可能性のある再生工程を示している。以前
に言及したように、通常9週齢時に浸潤している細胞が小島に浸透し、この小島
がリンパ球で膨張する。本願発明者らの実験において、NODマウスは15週齢
であって、PBS処置対照マウスはその時その膵臓で多くの浸潤細胞をもち、ほ
とんどがインスリン産生細胞ではない。さらに、PBS処置マウスではまたその
脾臓においてCD8/CD4の比が上昇し、その膵臓で多くのT細胞を持つ。本
願発明者らの処置したマウスはその脾臓で正常のCD8/CD4比を持ち、その
膵臓で浸潤は見つからないので、CD8/CD4比の上昇は、膵臓内へのCD4
+の選択的増加によるものであった。IFN−γおよびTNF−αはTリンパ球
の増加に関与する(Rosenberg et al. 1998)。
【0229】 本願発明者らの結果は、NODマウスの600 IU Pregnylによる
4週間の処置が、その他の炎症のおこった膵臓の形態および機能に劇的な効果を
持つことを示す。さらに本研究者らの300 IU Pregnyl NODマ
ウスは処置なしで28週齢まで生存し、糖尿病のないままであった。600 I
U Pregnyl NODマウスをまたシェーグレン病のような一般化された
自己免疫疾患の症状について試験したが、みられなかった。
【0230】 NODの全脾臓細胞および精製したCD4+細胞を用いた本願発明者らのin
vitroでの試験はin vivoデータと一致した。in vitroで
Pregnyl、F3−5によって処置し、より小さな範囲ヒト組換え体β−h
CGで処置したNODマウスからの脾臓細胞によって放出されたIFN−γ、I
L−1およびTNF−α放出の明らかな阻害があった(データは示していない)
。IL−4産生の増加も観察され、この処置でのTh1のTh2型応答への変動
を示している。800 IU Pregnyl以上の投与量は反対の結果を引き
起こし、多量のhCGそれ自身の存在によるのであろう。
【0231】 免疫系は明らかに糖尿病の開始に関与する。Pregnylでの処置は免疫系
に影響を及ぼし、したがってNODマウスでの疾患活性を減少させうる。Pre
gnylの有用な臨床効果からその免疫調節活性を分離するために、本願発明者
らは健康なBALB/cマウスを処置した。この種は一般的にTh2駆動免疫応
答での刺激に応答すると考えられている。本願発明者らの結果は、Pregny
l処置BALB/cマウスから得た精製したCD4+ T細胞がさらにTh2傾
斜を表すことを示唆している。in vitroでのPregnylで刺激した
とき、同じ細胞はIFN−γ産生の増加とIL−4産生の減少を示した。このこ
とはPregnylがin vivo対in vitroでの処置において異な
る調節T細胞サブセットに影響を与えることを意味する。本願発明者らはin
vivoでの処理が、TGF−βの選択的産生およびIL−10のより低いか全
くない産生によって特徴づけられるおそらくCD4+ Tr1細胞の集団の成長
を刺激する。これらのCD4+ Tr1細胞が、Th1細胞の活性を選択的に阻
害するために、Th1駆動疾患含有糖尿病およびMSの異なるモデルでみられ(
O’Garra et al.1997)、したがって疾患のひどさをも減少さ
せる。in vitroでPregnylで刺激したPregnyl処置BAL
B/cマウスからのCD4+T細胞による同じことがTh2細胞の減少にともな
ったTh1細胞の増加を示した。これはIL−10の高産生およびTGF−βの
低産生によって特徴づけられるCD4+ Th3細胞の好ましい刺激と一致する
。これらの調節細胞はTh1細胞によるIFN−γ産生の抑制およびTh2型細
胞の成長のインヒビターである。NOD.scidマウスにおいてTh2細胞の
安定した増加が、少ない深刻な高血糖および膵臓小島での浸潤の異なる特性の原
因であることも示されてきた。
【0232】 300 IU Pregnyl処置NODの本願発明者らの結果と本願発明者
らの再形成されたNOD.scidマウスは、PBS−処置NODと比較したと
きにとりわけNOD.scidにおいて、血中グルコースの同様のゆっくりした
増加を示し、異なる浸潤特性を示した。NODマウスにおいてPregnylの
活性はTh1およびTh2細胞両方を阻害しているTh3細胞の誘導でよく仲介
されうる。これらのTh3細胞は本当に少なくとも引き延ばされた期間疾病活性
を抑制してよい。機能的T細胞を持たないNOD.scidマウスにおいて、P
regnyl処置脾臓細胞での再形成はTr1細胞の選択的誘導で調節され、し
たがってTh1サブセットのみを阻害する。引き延ばされた期間の後、糖尿病誘
発性Th2細胞の安定した成長が、糖尿病のあまり深刻ではない形態の遅い開始
の原因である。同様に、本願発明者らのF1−2ではなくF3−5が上で論議し
た現象を示し、hCGが観察された影響の原因にはなり得ないことを示している
。このF3−5は主として自己免疫糖尿病の開始での免疫応答における決定的な
効果の方へ向かっており、この疾病および他の免疫仲介障害の免疫治療に対する
活性成分である。
【0233】 さらに、Pregnylおよび機能的にそれと同等の免疫レギュレータはイン
スリン非依存性糖尿病(NIDDM)で効果的である。NIDDM患者での本質
的な問題はインスリン抵抗性および肥満であり、THF−(アルファ)が肥満お
よびNIDDMのインスリン抵抗性の原因であることが示された(Miles
et al.1997, Solomon et al.1997, Pfei
ffer et al.1997, Hotamisligil et al.
1994, Argiles et al.1994)。TNF−アルファによ
って誘導されたこのインスリン抵抗性は、おそらくその有用な作用を血液の遊離
脂肪酸(FFA)濃縮を誘導するTNF−アルファの低下によって、および/ま
たは筋肉内のインスリンレセプター自己リン酸化へ遠位の細胞内部分でのグルコ
ース取り込みの刺激によって行うような、PioglitazoneおよびMe
tforminなどの最近発展した薬で、および遺伝子工学的に作製したヒト坑
−TNF−アルファ抗体(CDP571)(Solomon et al.19
97, Ofei et al.1996)で逆転されうる。さらに、網膜障害
の存在(Pfeiffer et al.1997)(糖尿病の遅延合併症のひ
とつ)が特に血漿TNF−アルファの上昇を仲介し、性依存性である(Pfei
ffer et al.1997)。TNF−アルファの増加は男性NIDDM
でおこるがしかし女性のNIDDMではおこらず、網膜障害および神経障害、腎
障害または微小血管障害のような他の合併症の発達に参加しうる(Pfeiff
er et al.1997)。Pregnylおよび分画3−5が免疫調整潜
在力を持ち、特にTNF−アルファを直接的または間接的に阻害する。Preg
nylおよびその断片3−5はまたNIDDM患者で有用な効果を持つ。さらに
、女性での糖尿病合併症の発生が低いことは、女性ホルモンの関連を示す。セプ
シスまたは敗血性ショックで示される鍵となる病因サイトカインは、セプシスま
たは敗血性ショックおよび悪疫質を含む種々の炎症状態および他の深刻な疾患に
関連する病態生理で鍵となる役割を占める免疫学的な伝達物質TNFαである。
TNFがT細胞によって(たとえばスーパー抗原[内毒素]を介したT細胞活性
化によって)、または内毒素を介したマクロファージによって産生されたとき、
それは攻撃有機体を疎隔し拒絶するであろう炎症反応を仲介する。感染が広がっ
た場合、循環系への多量のTNFの引き続く放出は破壊的であり、器官系に損害
を与え、致死ショックの状態を引き起こす。これらの毒性効果は宿主細胞におけ
るTNFの直接的な作用によっておよびIL−1、IFN−ガンマを含む他の内
因性免疫学的伝達物質のカスケードとの相互作用によっておこる。
【0234】 このことはD−ガラクトサミンで感作し、TNFαで処置したマウスでの症状
のようなショックの誘導およびTSST−1およびD−ガラクトサミン処置に続
く坑TNFα mAbsの同時注入後の疾病の致死および視覚的兆候両方の阻害
によって示された。低投与量の内毒素モデルにおいて、および外毒素モデルにお
いて、D−ガラクトサミン処置は、肝臓にショック誘導に続いて存在する高レベ
ルのTNFαを緩和させる急性期タンパク質の転写を阻害するために必要である
。これらの急性期タンパク質の欠損はネズミ肝細胞のTNFα仲介アポトーシス
誘導への感受性の増加を導く。このアポトーシスおよびTNFαの炎症効果を中
和する能力がないことは死を導く。
【0235】 本願発明者らはたとえば妊娠の第1トリメスターの尿(IR−U)で、および
商業的なhCG調製品(IR−P)で存在しているhCGを持つまたはもたない
因子(IR)が免疫調整効果を持つことを示してきた。とりわけこれらは自己免
疫および炎症疾患を阻害する潜在力を持つ。TNFおよびIFN−ガンマが病理
学的にセプシスまたは敗血性ショックに、およびまた自己免疫および炎症疾患に
関与することから、IRはまたショックのような急性炎症状態でTNFおよびI
FN−ガンマを阻害する能力を持つ。本願発明者らの結果はIRが、LPSで(
内毒素モデル)またはTSST−1で(外毒素モデル)処置したBALB/cま
たはSJLでのセプシスまたは敗血性ショックを阻害することを示す。IRは慢
性炎症疾患を阻害する効力を持つだけでなく、ショックのような急性炎症疾患も
抑制できる。さらに本願発明者らはまた、IRでの処置後でさえもショックを阻
害することを示す。さらに、本願発明者らのIR断片データはほとんどの坑ショ
ック活性が、主にhCGの個々の鎖、それらの鎖のホモダイマーまたはベータ−
コア残余鎖、これらの鎖の分解産生物および他の分子(>30 kDa)を含む
IR−(U/P)3−5[pooled]で残っていることを示している。本願
発明者らはまた同一の断片IR−U/P3−5がNODマウスモデルで坑糖尿病
効果を持つことを示した。したがって内毒素および外毒素モデルはNODマウス
およびNOD.scidマウスでの坑糖尿病活性の決定のための高速読み出しモ
デルとして役に立つ。内毒素および外毒素モデルの助けによって、本願発明者ら
は48時間以内のIR断片での坑糖尿病活性について調査できる。
【0236】 したがって、Pregnylおよびその分画3−5のようなIRは調節T細胞
サブセットに影響を与えることで免疫系を調節することによって自己免疫糖尿病
を抑制する高い潜在力を持つ。本願発明者らのNODおよびBALB/cデータ
は、これらがT細胞サブセットバランス(Th1−>Th2/Th2−>Th1
)を元に戻す潜在力を持つことを示す。したがって、Pregnylおよびその
断片3−5は、リウマチ様関節炎(RA)、多発性硬化症(MS)、NIDDM
、全身性エリテマトーデス(SLE)などのTh1サイトカインが優位な疾患、
Th2サイトカイン応答が優位なアレルギーおよび喘息のような移植モデルおよ
び疾患の様な免疫仲介疾患のひどさを調節するのにも効果的である。(MSに対
するEAE−モデル、NIDDMに対するBB−ラット、RAに対するフィッシ
ュ−ラットおよびMLR−モデル、アレルギーに対するOVA−モデル、SLE
に対するMLR/lprおよびBXSBモデルのような)これらの疾患の動物モ
デル、KK−Ay−マウス、GKラット、ウィスター脂肪ラット、fa/faラ
ットは他のものの中で他の免疫調節疾患のモデルを提供する。
【図面の簡単な説明】
【図1】 4週間PBSで処置された15週齢NOD(非肥満性糖尿病)マウスが17週
齢で糖尿病になり(>13.75 mmol/l)、また1週間内にそれらマウ
スは血糖値が30 mmol/lより上になったが、一方、300 IUプレグ
ニールで治療されたNODマウスは、19週齢で治療が停止されても、殺傷され
る(28週齢で)まで非糖尿病のままであったことを示している。その場合血糖
値は、8 mmol/lよりも低いままであった。
【図2】 PBS処置NODマウス(図3)から脾臓細胞を受け入れて再構成されたNO
D SCID(重篤複合免疫不全)マウスが転移の22日後に糖尿病になり、一
方、600 IUプレグニール治療NODにより再構成されたNOD SCID
マウスは、それらマウスが殺傷される(転移後8週)まで非糖尿病状態のままで
あったことを示している。
【図3】 4週間PBSで処置された15週齢NODマウスが17週で糖尿病(>13.
75 mmol/l)になり、また1週間内でそれらマウスは30 mmol/
lより上になったが、600 IUプレグニールによって治療されたNODマウ
スは、それらマウスがPBS群と一緒に殺傷される(21週齢で)まで非糖尿病
のままであったことが示されている。300 IUプレグニールで治療された1
5週齢NODマウスはそれらマウスが殺傷される(28週齢で)まで、その治療
が19週齢で停止されても、非糖尿病状態のままであった。その場合血糖値は、
8 mmol/l以下のままであった。
【図4】 20週齢雌NODから脾臓細胞が分離され、また、抗CD3とIL−2の存在
下で48時間異なる条件で培養された(「−」培地のみ、「+」には抗CD3,
50,100,300,600,800 IU/mlプレグニール、F1−2、
F3−5、rh−hCG、rh−α−hCG、rh−β−hCG [各200μg
/ml])。48時間後INF−(サイトカインELISA法が実施された。そ
の結果から、INF−(プレグニール(50〜600 IU/ml)とhCGを
含んでいない分画3〜5(F3〜5)の用量依存性阻害があることが示されてい
る。hCG自体の効果を示唆する800 IU/mlプレグニールを加えたIN
F−gにおいて増加がある。IL−4に対する効果は、hCG、ヒト組換え(r
h)hCG、rh−α−hCGを含有する分画1〜2(F1〜2)に関してはみ
られなかった。rh−β−hCGに関しては、INF−g値で多少減少がみられ
る。
【図5】 20週齢雌NODから脾臓細胞が分離され、また、抗CD3とIL−2の存在
下で48時間異なる条件で培養された(「−」培地のみ、「+」には抗CD3,
50,100,300,600,800 IU/mlプレグニール、F1−2、
F3−5、rh−hCG、rh−α−hCG、rh−β−hCG[各200μg
/ml])。48時間後IL−4サイトカインELISA法が実施された。その
結果から、IL−4(プレグニール(50〜600 IU/ml))とhCGを
含んでいない分画3〜5(F3〜5)の用量依存性増加があることが示されてい
る。hCG自体の効果を示唆する800 IU/mlプレグニールを加えたIL
−4では減少している。INF−gに対する効果は、hCG、ヒト組換え(rh
)hCG、rh−α−hCG rh−β−hCGを含有する分画1〜2(F1〜
2)に関してはみられなかった。
【図6】 20週齢雌NODからCD4 T細胞が分離され、また、抗CD3とIL−2
、抗CD28の存在下で48時間異なる条件で培養された(「−」培地のみ、「+
」には抗CD3,50,100,300,600,800 IU/mlプレグニ
ール、F1−2、F3−5、rh−hCG、rh−α−hCG、rh−β−hC
G[各200μg/ml])。48時間後INF−γサイトカインELISA法が
実施された。その結果から、プレグニール(50〜300 IU/ml)を加え
たINF−γとhCGを含んでいない分画3〜5(F3〜5)の用量依存性阻害
があることが示されている。hCG自体の効果を示唆する600〜800 IU
/mlプレグニールを加えたINF−γでは増加している。INF−gに対する
効果は、hCG、ヒト組換え(rh)hCG、rh−α−hCGを含有する分画
1〜2(F1〜2)に関してはみられなかった。rh−β−hCGに関しては、
INF−γ値で多少減少がみられる。
【図7】 48時間PBS、600 IUプレグニール、分画1〜2(F1〜2)、分画
3〜5(F3〜5)あるいはヒト組換えβ−hCG(b−hCG)で処置された2
0週齢の雌の脾臓細胞の転移実験、またその後に8週齢NOD SCIDマウス
(n=3)が示されている。転移の22日後に、PBS処置されたNODの脾臓
を受け入れたNOD SCIDマウスが糖尿病になった。F1〜2とb−hCG
を受け入れたNOD SCIDマウスがそれぞれ4と5週間後に糖尿病になり、
一方、600 IUプレグニールとF3〜5を受け入れたNOD SCIDマウ
スは約6週間非糖尿病のままであったが、その後にすべてのマウスが殺傷された
。それはプレグニールとF3〜5には最大抗糖尿病効果があることを示している
。たいていのhCGを含有しているF1〜2はこれらのマウスにおける糖尿病の
発生に対する効果を有していないため、抗糖尿病効果はhCGそれ自体には効果
がないことは明白である。組換えヒトβ−hCGには多少抗糖尿病の効果がある
【図8】〜
【図11】 プレグニールがTh2タイプマウスに対しても効果を有しているかどうかを試
験するために、われわれは、BALB/cマウス(n=5)を4日間300 I
Uプレグニール腹腔内投与により治療し、またPBS(n=5)により処置した
。脾臓からCD4+細胞を分離した後、われわれはそれらを、48時間抗CD3
/IL−2により刺激し、その上澄みをIFN−γ(図8)とIL−4(図9)
サイトカインの測定のために回収した。われわれはまた、CD4+細胞を、プレ
グニールの異なる投与量で処置した。その後に、その上澄みはINF‐g EL
ISA(図10)法による分析のために回収された。図8は、300 IUプレグ
ニールによるin vivo処置がINF‐gを抑制し、また、もう一方では、
IL‐4の産生を増加させていることを示している。これは、Th‐2表現型に
向かってさらにシフトされることを暗に示している。異なるプレグニールの投与
量によりin vitroで再び処置された同じ細胞が、INF‐gにおいては
増加(図10)を、またTh‐1表現型に向かってのシフトを示唆するIL‐4
においては減少(図11)を示している。これはすべて、プレグニールとF3〜
5が調節T細胞サブセット(Th3,Tr1)に対して効果を有していることを
暗に示している。
【図12】カラム Superdex 75時間 10/30;FPLCシステム(Pharmacia) 合計容量Vt=25ml;ボイドボリュームV0=8.7ml;フロー率1ml/
分;緩衝液;緩衝液 10mM リン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.3;室温カラム効率=38,000N
/m 選択率KAV=1.737〜0.2782log(r2=0.982)、MW=分
子質量 分離{類}範囲:球状タンパク質に関して3,000〜100,000ダールト
サンプル プレグニール(オレガノン、ロット番号:168558、有効期限:28.11
.99) サンプル容量=0.5 ml=2,000単位;感度0.1AUFS クロマトグラム ピーク1=分画1〜2:Ve=14.7〜15.1ml;KAV=0.37〜0.
39 ピーク2=分画3〜5:Ve=15.38〜17.99ml; KAV=0.41〜0.57 KAV=(Ve−V0)/(Vt−V0) ピーク1は、分離開始後、14.7〜15.1mlの間の容量で溶離する。こ
れは70,000〜80,000ダールトン分子質量に対応する。これは分画に
は部分的にhCGの二量体形態が含まれている(J.E. Griffin, S.R. Ojeda編「
内分泌生理学テキスト」第2版、199頁、オックスフォード大学出版部、オックス
フォード、1992年刊(“Textbook of Endocrine Physiology, Second edition,
J.E. Griffin, S.R. Ojeda(Ed.)Oxford University Press, Oxford, 1992, pp
.199”))。ピーク2は、15.38〜17.99mlの間の容量で溶離し、こ
れは1500〜58,000ダールトンの間の容量に対応する。この分画には部
分的にβ-サブユニット(MW=22,00ダールトン)、hCGとそのほかの分
解産物、不明の分子がまだ含まれている。これらの計算はこのカラムの上述の選
択を基礎とした。
【図13】 敗血症あるいは敗血症ショックの3つ異なるモデルにおいて作動している提案
メカニズム。A)は高用量エンドドキシンモデル。B)は低用量エンドトキシン
である。C)はTSST‐1/SEBである。高および低用量エンドトキシン(
a,b)においては、エンドトキシン(LPS)の全身的な効果はマクロファー
ジにより大部分は仲介されているが、一方、エキソトキシンモデル(C)におい
ては、超抗原(TSST−1/SEB)はT細胞により仲介される。TNF、I
FNならびにICE(IL−1αおよびβ)の両方の場合で、敗血症ショックの
病因で重要な役割を果している。
【図14】 超抗原により誘導されるT細胞活性は、特異的V−βファミリーを表現してい
るT細胞はすべて、TCR/MHCII/と超抗原の非抗原特異的結合により活
性化されるという点で、ポリクローナルT細胞活性化とみなすことができる。
【図15】 非希釈IR−Uサンプルの50μlのFPLCクロマトグラム。
【図16】 非希釈IR−Pサンプルの50μlのFPLCクロマトグラム。
【図17】 図15から分画2と3をさらに分離。
【図18】 2−メルカプトエタノール処理された50μl IR−UサンプルのFPLC
クロマトグラム。
【図19】 2−メルカプトエタノール処理された50μl IR−PサンプルのFPLC
クロマトグラム。
【図20】 TSST−1とD−Gal処置の前にIR−Pにより処置された動物と、処置
されていなかった動物との間の生存率において、はっきりとした差はみつかって
いない。
【図21】 IR−P前処置Balb/cマウスは、TSST−1エキソトキシンモデルに
おける疾患レベル2を超えないが、一方、D−Gal−TSST−1群は疾患レ
ベル5を越え、殺傷された。
【図22】 IR前処置はまた、中毒性ショックの生存動物の体重減少の低下という結果に
なった。
【図23】 この数字は、致死中毒性ショック(棒グラフ2)に罹っているマウスにおける
免疫活性が高い値であることを示している。正常Balb/cマウス(棒グラフ
1)に比較すると、IR−P群(棒グラフ3)ではWBCに関してはまだ正常値
である。
【図24】 この数字は、正常Balb/cマウス(棒グラフ1)に比較すると、TSST
−1群(棒グラフ2)において血小板数での多少の減少を示している。血小板数
はIR−P処置群Balb/cマウス(棒グラフ3)において非常に高値がみら
れた。
【図25】 この数字は、第1トリメスター妊娠尿サンプル(IR−U)のFDC G25
クロマトグラムを示している。分画IR−U/HMDF(高分子量脱塩カラム分
画)は5kDaよりも明らかに大きい分子量を有し、一方、IR−U/LMDF
(低分量脱塩カラム分画)は5kDaよりも小さい分子量を明らかに有する。
【図26】 この数字は、IR−U/LMDFサンプルのSuperdex 75 GPC
クロマトグラムを示す。得られたプロフィールは、その割合は異なっていたが、
少なくとも5ピークを示した。
【図27】 Superdexペプチド、PC3.2/30を装備されているPharma
cia Biotech SMARTシステムにおいては低分子量分画(IR−
U/LMDF)を示している。運転用緩衝液に関しては、40mMトリス、5
mM MgCl2+150 mM NaClは使用され、またフロー率は75分
間50 ml/分であり、また単一のものは214と254 nm波長で分析さ
れた。回収された1〜3分画があった(LMDF1〜3)。シトクロームCとG
ly16は内部サイズマーカーとして使用された。ピーク1、2、3はそれぞれ
約1.3kDa、1.15kDa、400Daで溶離された。
【図28】 この図は、CD4+細胞のTh1表現型に分極するCD4+細胞に対し、IR
−PおよびIR−U/LMDFではIFN−ガンマ産生に強い阻害があることを
示す(in vivo)。組換えベータ−hCGではIFN−ガンマ産生の弱い阻害だ
けが観察され、組換えhCGでは、対照(MED)と比べて、効果は見られなか
った。
【図29】〜
【図31】 IRはまたDCの成熟に関して効果を有しており、NODマウス由来のBMも
また7日間GM−CSFとIRとともに直接共同培養された。8日目に、すべて
の細胞が以下のマーカーの発現についてフローサイトメーターにより分析された
。すなわち、CD1d、CD11c、CD14、CD31、CD43、CD80
、CD95、ER−MP20、ER−MP58、F4/80、E−cad、MH
C II、MHC I、RB6、8C5である。 われわれは、IRにより処置されたすべてのDCは、GM−CSFのみにより
処置された対照DCよりも成熟してはいなかった。細胞表面マーカーCD1d、
ER−MP58、F4/80、CD14における減少、CD43、CD95、C
D31、E−cadにおける増加から結論付けられた。さらに、細胞表面マーカ
ーER−MP20/LY6C、MHC IとIIでは何の変化も観察されなかっ
た(図29)。図30と31は、DCが、6日間GM−CSFとともに培養され
、また7日目に追加して24時間300IU/ml IR−P(図30)あるいは
IR−U/LMDFの100mg/ml(図31)とともに共同培養されたとき
、DCはさらに成熟され、またAPCとしてよりよく機能することができた。こ
れは、CD1d、CD40、CD80、CD86、CD95、F4/80、CD
11c、MHC II細胞表面マーカーにおける増加から結論付けられた(図3
0と31)。
【図32】 Balb/cマウスにおけるIR−P処置により、CD4+細胞がTh2表現
型にシフトすることを示す。これは、対照(CTL)グループと比べて、IFN
−ガンマ産生の阻害によって示される。
【図33】 Th1サブセットのダウンレギュレーションを示唆するPBS処置マウスに比
較して、IR−U/LMDFで処置されたBALB/cマウスの精製CD4+細
胞はTh1分極測定においてはIFN−γをより少なく産生することを示してい
る。
【図34】 Balb/cマウスにおけるIR−P処置により、CD4+細胞は、Th2表
現型にシフトすることを示す。このことは、対照(CTL)マウスと比べて、I
L−4産生の増加によって示される。
【図35】 IR−U/LMDFにより処置されたBALB/cマウスの精製CD4+細胞
は、Th2サブセットのアップレギュレーションを示唆するPBS処置されたマ
ウスに比較すると、Th2分極測定においてより多くIL−4を産生することを
示す。
【図36】 異なる量のIR−P(in vitro)によって処置されたPBSおよびIR−Pマ
ウス(in vivo)からのCD4+T細胞は、IFN−ガンマ産生の増加を示すこ
とを示しており、このことは、Th1表現型へのシフトを示唆する(図37も参
照)。
【図37】 異なる量のIR−P(in vitro)によって処置されたPBSおよびIR−Pマ
ウス(in vivo)からのCD4+T細胞は、IL−4産生の減少を示すことを示
しており、このことは、Th1表現型へのシフトを示唆する(図36も参照)。
【図38】〜
【図41】 Th2表現型に向かうCD4+T細胞のシフトがIL−10あるいはTGF−
β依存性であるかどうかを判定するために、われわれはまた、IR−P処置マウ
ス由来のCD4+T細胞の分極測定において、抗IL10と抗TGF−βを付け
加えた。図38は、Th1分極条件におけるIR−PグループのIFN−ガンマ
産生の増加を示す。これは、Th2サブセットへのIR−Pの効果の促進が、少
なくともIL−10依存性であることを示す(詳細は本文を参照)。図39は、
Th2分極条件における、IL−4産生の増加が、対照(CTL)グループおよ
びIR−Pグループにおける抗−IL10in vi tro処置において見られること
を示している。このことは、Th1/Th2分極におけるIL−10の関与を示
唆している(詳細は本文を参照)。一方、大きな差異は、対照とIR−P処置群
の間の抗TGF−β in vitro処置を伴うTh2とTh1分極条件(図
40と41)におけるIL−4とIFN−γ産生においてはみられなかった。
【図43】〜
【図45】 図43、44a、bと45は、IR−U/LMDF由来の精製CD4+細胞は
対照マウス由来の細胞よりもTFG−βをより多く産生することを示している。
抗IL−10あるいは抗IL−6が両方の培養培地に加えられたとき、対照群マ
ウス由来のCD4+細胞IR−U/LMDF処置群よりもTGF−βをより多く
産生することを示している。これは、TGF−β産生におけるIL−6とIL−
10の関与を示唆している。これは、対照マウス群に比較すると、IR処置マウ
ス由来のLPS刺激脾臓細胞はIL−6の高い値(図45)を産み出すことを示
しているわれわれのデータと一致している。
【図46】,
【図47】 UVB処置BALB/cマウス由来の脾臓細胞の培養後、LPSと抗CD3誘
導増殖の減少が観察され、一方、IRあるいは組み合わせたIRまたはUVB照
射処置がLPSと抗CD3刺激増殖を増加させた(図46と47)。
【0249】
【図48】、
【図49】 LPSと抗CD3刺激増殖におけるこの変化がIL−10依存性であるかどう
かを判定するため、われわれはIR−PあるいはUVBにより、IL−10ノッ
クアウトマウスを処置した。増殖パターンにおける変化は、UVB照射とIR−
P処置BALB/cマウスが比較されたときには(図47)、抗CD3刺激脾臓
細胞においてはみられらなかったが、一方、両群のUVB照射BALB/cと比
較すると、増殖における逆のパターンが抗CD3刺激リンパ節細胞においては観
察された(図49)。これは、UVB処置後の抗CD3刺激増殖の減少、あるい
は脾臓細胞のIR−P処置後の増殖の増加は、完全にIL−10依存性ではなく
、一方、これは抗CD3刺激リンパ節細胞に関しては真実であることを示してい
る。
【図50】,
【図51】 48時間で脾臓細胞のLPS刺激増殖を示しており、われわれは、対照群に比
較すると、UVBとIR‐P処置群における増殖の増加を観察し(図51)、一
方、増殖における増加が増殖に関して72時間で両方の群で観察された(図50
)。
【図52】,
【図53】 B220とM/114陽性細胞の減少、ならびにCD4とCD8陽性細胞の増
加がIR‐P‐処置IL‐10ノックアウトマウス(図52)のリンパ節におい
て観察され、一方、CD4、CD8、B220とM5/114陽性細胞の増加が
脾臓において観察された(図53)。UVB処置群において、CD8陽性細胞の
増加とCD4、B220、M5/114陽性細胞の増加が脾臓において観察され
た(図53)。UVB処置群においては、CD8陽性細胞の増加とCD4、B2
20、M5/114陽性細胞がリンパ節においてみられ(図52)、一方、CD
8陽性細胞の軽度増加以外に細胞マーカーの変化が脾臓細胞の間で観察された(
図53)。
【図54】,
【図55】 BALB/cマウス由来のDCは、7日間、GM−CSFとIR(IR−P、
IR−U、IR−U3-5、IR−U/LMDF)の存在下で共同培養される場
合は、われわれはIRにより処置されたすべてのDCが、GM−CSFのみによ
り処置された対照DCよりも成熟していなかったことを観察している。これは細
胞表面マーカーCD1d、CD40、CD80、CD86、ER−MP58、F
4/80、E−cad、MHC IIの増加から結論付けられた(図54)。さら
に、CD95の軽度増加が観察された(図54)。対照的に、6日間DCがGM
−CSFとともに培養され、また7日目にその培養培地が追加の24時間の間、
300 IU/ml IR−Pあるいは100mg/ml IR−U(IR−U
、IR−U3−5、IR−U/LMDF)を補給された場合には、それらDCは
より成熟し、またAPCとしてよりよく機能することができた。これは細胞表面
マーカーCD1d、CD40、CD80、CD86、ER−MP58、F4/8
0、E−cad、MHC IIの増加から結論付けられた(図54)。
【図56】 図56はアロMLRを示す。増殖データは、全DCのなかのIR処置DC対T
細胞の割合により増殖を抑制することができることを示している(図56)。
【図57】 IR−U/LMDF分画の抗ショック活性を示す。試験活性の方法はこの出願
のなかの他所で説明されている。
【図58】 IR処置マウスにおけるLPS高投与処置の効果を測定。LPS(150mg
/kg)をBalb/cマウス(n=30)に腹膜内注射し、生存率を5日間に
わたり毎日評価。PBS処置Balb/cマウスは、高投与量のLPSの注射の
後、1〜2日の間にショック死し、5日目に生存していたのはわずか10%だけ
であった。対照的に、IR−P,IR−P1およびIR−P3で処置されたマウ
スは100%、5日目でも生存していた(P<0.001)が、IR−P2、I
R−Aおよびデキサメタゾン処置のマウスは約70%の生存率を示した。
【図59】 IR−A,IR−PおよびそのフラクションIR−P1,IR−P3は全て正
常範囲内(100−300×109)の血小板数を有するが、対照、IR−P2
処置およびデキサメタゾン処置のマウスは正常範囲以下の血小板数を有する。
【図60】〜
【図62】 IR−A,IR−PならびにそのフラクションIR−P1,IR−P2および
IR−P3で処置されたマウスは、対照およびデキサメタゾン処置マウスと比べ
て、血漿中に存在するALT,LDH1およびASAT酵素のレベルが比較的低
い。これらの酵素は、臓器損傷のために、ショック時に血液中に高濃度で存在し
、したがって、この結果は我々の生存率の結果と一致する(図58)。
【図63】 IR−A,IR−Pおよびそのフラクションで処置されたマウスは、48時間
後の時点で、対照およびデキサメタゾン処置マウスよりも、中程度〜正常のWB
Cレベルであり、IR処置マウスにおいては炎症反応がより低いことを示唆して
いる。
【図64】 IR−P処置およびIR−P3と組合せたrhCG処置のNODマウスから単
離されたCD4+細胞のTh1分極アセイにおけるIFNガンマ産生の阻害を示
し、中低度の阻害がrhCGとIR−P3によるTh1分極においてのみ見られ
る。このことは、IR−P3と組合せたrhCG処置のNODマウスが、Th1
産生の強い阻害を示すことを示している。これは、IR−P3フラクションは、
Th1サブセットを最大限抑制するためにrhCGを必要とすることを示唆して
いる。
【図65】 PBS処置マウスに比較すると、IR−P、IR−P1、IR−P2、あるい
はrhCGとIR−P3と組み合わせてそれらにより治療されたNODマウスか
ら得られる抗CD3刺激脾臓細胞においてIFN−γの阻害を示している。rh
CGとIR−P3単独では、組み合わせたものと同じ効果を有していなかった。
これは、IR−P3分画が、そのIFN−γ阻害のためにはrhCGを必要とす
ることを再び示唆している。
【図66】 rhCGと組み合わせたIR−P、その分画、rhCGあるいはIR−P3に
より処置されたNODマウスから得られる脾臓細胞の異なる時点(t=12、2
4、48時間)で抗CD3刺激増殖を示している。再び、その結果は前出のIF
N−γ阻害と一致している(図65)。ここで、IR−P3分画はまた、in
vivo処置されたNODマウスから脾臓細胞の抗CD3誘導増殖についてその
阻害効果にはrhCGを必要とした。
【図67】 IR−Pおよびそのフラクションが、PBS処置マウスとに比べて、処置され
たNODマウスからの抗CD3刺激脾臓細胞のIL−10産生を促進することを
示している。
【図68】 IgG2a産生は、IR−P2およびrhCGINVIVO処置によって阻害されな
いが、IR−P,IR−P1,IR−P3およびIR−P3と組合せたrhCG
はIgG2a産生を抑制する。
【図69】,
【図70】 IR−P処置は、HD−STZモデルならびにMD−
STZモデルの双方において糖尿病の誘発を遅延し得ることを示す。この遅延の
背後にあるメカニズムはおそらく異なった性質のものである。
【図71】〜
【図74】 BEAS 2B細胞系統の結果:デキサメタゾンはBEAS 2B細胞系統に
おけるTNF−α誘導IL−6とRANTES産生を阻害することができること
を示している。IR−Pはまた、TNF−α誘導炎症サイトカインの産生を阻害
することができる。さらに、デキサメタゾンは、抗炎症TGF−βサイトカイン
のTGF−α誘導ダウンレギュレーションを回復させることができ、一方、IR
−PはTGF−β産生を回復させるだけではなく、またさらにこの抗炎症サイト
カインを促進する(図75)。さらに、デキサメタゾンとIR−Pは両方ともR
ANTESのIFN−γ誘導産生を阻害することができた(図74)。
【図75】,
【図76】 BEAS 2B細胞系統のフローサイトメトリー分析:結果は、デキサメタゾ
ンとIR−P両方とも、HLA−DRとICAM−1のTNF−α誘導発現をダ
ウンレギュレートすることができた。
【図77】〜
【図80】 EAEモデルの結果;PBS処置マウスは最初の3週間で体重を減らしただけ
であった(図77)。実験全期間疾患に対する抵抗が残っていた1匹のマウスを
除いて、これらのマウスは、少なくとも2およびより長い疾患期間EAEの臨床
徴候をすべて有していた(図78)。IR処置マウス群においては、実験期間中
に観察された体重減少はより少ないものであって(図79)、また2匹のマウス
は実験期間中は疾患には罹らなかった。この群の中で疾患に罹ったマウスは、最
大臨床スコア2を有し、また、短い疾患期間を有していたが、PBS処置群より
もEAE症候群から早く回復した(図80)。
【図81】〜
【図82】 図81は、IR処置前は、患者はステロイド剤の高投与量のために免疫無防備
状態になっていた。IR処置後、Tリンパ球(CD4、CD8)の値が増加し、
またB細胞以外は正常範囲内にあった。われわれはまた、IR処置期間に患者か
ら得られたLPSとPMA/Ca刺激PBMCのサイトカインを測定した。われ
われは、治療期間中にLPS刺激PBMCによりTNF−α、IL−10とIL
−12がより多く産生され(図82a)、一方、PMA/Ca刺激PBMCはよ
り少ないIFN−γを産生した(図82b)。
【図83】〜
【図86】 図83は、IR−P治療のため、リンパ球、T細胞(CD4、CD8)、B細
胞の数が減少し、それがその治療による過剰活性化免疫システムのダウンレギュ
レーションの表示であることを示している。これはまた、PBMCによりLPS
刺激IL−12とTNF−αの阻害を示すわれわれのサイトカインのデータと一
致している。さらに、その治療期間中にIL−10産生の増加があったが、それ
は抗炎症サイトカインである(図86)。さらに、上昇CPKと肝酵素(ASA
T、ALAT)はまた減少した(図84と86)。これはすべて、疾患活性の減
少を反映している。
【図87】,
【図88】 図87と88は、糖尿病患者のIR−P治療の期間中に、正常血糖を維持する
ために必要なインスリンが図87に示されているように、減少したことを示して
いる。プレグニールの停止後、その男性患者のインスリン必要量は再び上昇した
(図87)。糖尿病の新たな発症を伴ったこの患者では、インスリンの必要量が
IR−Pによる治療期間中に有意に下降し、また、ブドウ糖コントロールの改善
もまた見出され、IR−P治療(図87)期間中にグリコシル化HbA1c値の
減少、またLPS刺激PBMCにより産生された炎症性サイトカイン(IL12
、TNF−α、IFN−γ)の減少により支持された。さらに、IL−10(抗
炎症性サイトカイン)の増加もまた治療期間中に観察された(図83)。これは
すべて、膵島細胞機能と最終的により良いブドウ糖調節の改善を示唆している。
【図89】〜
【図91】 MS(多発性硬化症)患者1(in vitro):IR−Pにより処置され
たLPS刺激PBMCにおけるTGF−βとIL−10の産生における増加があ
った(図HとI)。TGF−βとIL−10産生においては、PMA/Caによ
り刺激された培養培地と、IR−Pにより処置された培養培地では差異はなく(
図89と90)、一方、IR−PはPMA/Ca刺激PBMCにおけるIFN−
γの産生を阻害した(図91)。
【図92】〜
【図94】 MS(多発性硬化症)患者2(in vitro):患者2から得られたPB
MCは、TPA/Ca刺激のみと比較すると、IR−Pにより処置された培養培
地におけるTGF−βとIFN−γの産生減少を示し、一方、IR−P処置は、
LPS刺激TGF−β産生を増加させる(図92と93)。IL−10産生は、
LPSとTPA/Ca刺激培養培地の両方でIR−Pにより阻害された(図94
)。
【図95】,
【図96】 非治療対照群と比較すると、BALB/c受容者のIR−Pによる治療は、C
57BL/6皮膚移植生存を延長した。対照受容者は、12日間内に皮膚移植を
拒絶し(図95)、一方、IR−P治療受容者は、移植後22日までその皮膚移
植を延長することができた(図96)。図95と96は、IR−P治療とその対
照マウスからの移植の拒絶のため、こうした1つの延期された移植を示している
(写真は19日目に撮られた)。
【図97】 IR−U/LMDF Bio−Gel P−2クロマトグラムを示している。
【図98】 IR−P3 Bio−Gel P−2クロマトグラムを示している。
【図99】 IR−A3 Bio−Gel P−2クロマトグラムを示している。
【図100】 IR−Pサンプルの巨球GPC60Åクロマトグラムを示している。3つの選
択領域が分画化された。>10kDaの分子量で明らかに溶離されたIR−P1
、10kDa〜1kDaの間の分子量で明らかに溶離されるIR−P2、<1k
Daの分子量で溶離されるIR−P3である。これらすべての活性は少なくとも
抗ショック活性に関して試験された(詳細はテキストを参照)。
【図101】 IR−PとIR−Aサンプルの巨球GPC60Åクロマトグラムを示している
(各サンプルの500 IUは同じ注射量で注射された)。その結果は、IR−
PサンプルにおけるIR−P3分画に比較すると、大量のIR−A3分画がIR
−Aには含まれている。我々は、それらの抗ショック活性に関してIR−AとI
R−Pの同量を試験した。その結果は、IR−Pに比較して低から軽度の抗ショ
ック活性をIR−Aが有することを明らかにした(結果は示さず)。
【図102】 精製方法1、2、3、4(詳細についてはテキストを参照)のフロー図を示し
ている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 3/10 A61P 29/00 11/06 101 25/00 31/00 29/00 31/04 101 31/12 31/00 37/02 31/04 37/06 31/12 37/08 37/02 43/00 37/06 111 37/08 A61K 35/22 43/00 37/02 111 37/24 // A61K 35/22 37/38 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AE,AL,AM,AT,AU,AZ,BA ,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU, CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,G E,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS ,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK, LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,MK,M N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU ,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM, TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN,YU,Z A,ZW (72)発明者 カン,ニサル アフメト オランダ国 ロッテルダム グルーネ ヒ レデイク 256−アー2 (72)発明者 サベルカウル,ヒューベルツス フランシ スキュス ヨセフ オランダ国 アウト−ベイエルラント イ スラエルスドレーフ 32 Fターム(参考) 4C084 AA02 AA17 CA18 CA39 CA70 DA58 DB20 NA14 ZA962 ZB052 ZB082 ZB112 ZB132 ZB152 ZB332 ZB352 ZB372 ZC352 4C087 AA01 AA02 BB40 CA16 NA14 ZA96 ZB05 ZB08 ZB11 ZB13 ZB15 ZB33 ZB35 ZB37 ZC35 4H045 AA10 AA30 CA44 EA20 EA22 EA29 FA71 GA21 HA03 HA04

Claims (42)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 Th1および/またはTh2細胞活性を調節することができる
    、尿から得られる免疫レギュレータ。
  2. 【請求項2】 樹状細胞分化を調節することができる、尿から得られる免疫レ
    ギュレータ。
  3. 【請求項3】 樹状細胞分化を調節することができる請求項1に記載の免疫レ
    ギュレータ。
  4. 【請求項4】 前記尿が妊娠している哺乳動物から得られることを特徴とし、
    好適には前記哺乳動物はヒトであることを特徴とする請求項3に記載の免疫レギ
    ュレータ。
  5. 【請求項5】 免疫レギュレータであって、哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン
    製剤から得られる活性成分を含み、前記活性成分は非肥満性糖尿病(NOD)マ
    ウスから得られる脾臓細胞を刺激することができることを特徴とする、または前
    記活性成分に機能的に関連している活性成分を含むことを特徴とする免疫レギュ
    レータ。
  6. 【請求項6】 免疫レギュレータであって、哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン
    製剤から得られる活性成分を含み、前記活性成分はリポ多糖誘導敗血症ショック
    に対してマウスを保護することができる免疫レギュレータ。
  7. 【請求項7】 前記活性成分が、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求めら
    れる58〜15キロダールトンの見かけの分子量をもって溶離される分画のなか
    に存在することを特徴とする請求項5または6に記載の免疫レギュレータ。
  8. 【請求項8】 前記活性成分が、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求めら
    れる15〜1キロダールトンの見かけの分子量をもって溶離される分画のなかに
    存在することを特徴とする請求項5または6に記載の免疫レギュレータ。
  9. 【請求項9】 前記活性成分が、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求めら
    れる、1キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離される分画のな
    かに存在することを特徴とする請求項5または6に記載の免疫レギュレータ。
  10. 【請求項10】 前記哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤が尿から誘導され
    ることを特徴とする請求項7、8または9に記載の免疫レギュレータ。
  11. 【請求項11】 Th1および/またはTh2細胞活性を調節することができ
    る請求項5〜10のいずれかに記載の免疫レギュレータ。
  12. 【請求項12】 樹状細胞分化を調節することができる請求項5〜11のいず
    れかに記載の免疫レギュレータ。
  13. 【請求項13】 前記刺激脾臓細胞が、前記脾臓細胞によって再構成されてい
    るNOD‐重篤合併免疫欠損マウスにおける糖尿病の発症を遅延させることがで
    きることを特徴とする請求項5〜12のいずれかに記載の免疫レギュレータ。
  14. 【請求項14】 前記活性成分が非肥満性糖尿病(NOD)マウスから得られ
    る脾臓細胞のγ‐インターフェロン産生を阻害することができることを特徴とす
    る請求5〜13に記載のいずれかに記載の免疫レギュレータ。
  15. 【請求項15】 前記成分が非肥満性糖尿病(NOD)マウスから得られる脾
    臓細胞のインターロイキン−4産生を刺激することができることを特徴とする請
    求項5〜14のいずれかに記載の免疫レギュレータ。
  16. 【請求項16】 前記活性成分は臓器不全の後または臓器不全の間にASAT
    血漿値を減少することができることを特徴とする5〜15のいずれかに記載の免
    疫レギュレータ。
  17. 【請求項17】 免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための、請求項1〜
    16のいずれかに記載の免疫レギュレータの使用。
  18. 【請求項18】 前記免疫仲介不全症が、糖尿病、多発性硬化症、または慢性
    移植拒絶反応などの慢性炎症を含むことを特徴とする請求項17に記載の使用。
  19. 【請求項19】 前記免疫仲介不全症が、敗血症、アナフィラキシーショック
    または急性または超急性拒絶反応などの急性炎症を含むことを特徴とする請求項
    17に記載の使用。
  20. 【請求項20】 前記免疫仲介不全症が、全身性エリテマトーデス、または慢
    性関節リウマチなどの自己免疫疾患を含むことを特徴とする請求項17に記載の
    使用。
  21. 【請求項21】 前記免疫仲介不全症が、喘息または寄生生物疾患などのアレ
    ルギーを含むことを特徴とする請求項17に記載の使用。
  22. 【請求項22】 前記免疫仲介不全症が、ウイルスまたは細菌などの感染病原
    体に対して向けられる過度に強力な免疫応答を含むことを特徴とする請求項17
    に記載の使用。
  23. 【請求項23】 前記治療が、治療される個人におけるリンパ球サブセット集
    団の相対的割合および/またはサイトカイン活性の調節を含むことを特徴とする
    請求項17〜22に記載の使用。
  24. 【請求項24】 前記集団がTh1またはTh2細胞を含むことを特徴とする
    請求項23に記載の使用。
  25. 【請求項25】 前記免疫レギュレータがhCG製剤またはそれから誘導され
    た分画を含むことを特徴とする請求項17〜24のいずれかに記載の使用。
  26. 【請求項26】 免疫仲介不全症を治療するための医薬組成物であって、非肥
    満性糖尿病(NOD)マウスから得られる脾臓細胞を刺激することができる、尿
    から得られる活性成分を含み、前記刺激脾臓細胞が前記脾臓細胞により再構成さ
    れるNOD重篤合併免疫欠損マウスにおける糖尿病の発症を遅延させることを特
    徴とする、または、前記活性成分に機能的に関連している活性成分を含むことを
    特徴とする医薬組成物。
  27. 【請求項27】 前記活性成分がγ‐インターフェロン産生を阻害する、また
    は非肥満性糖尿病(NOD)マウスから得られる脾臓細胞のインターロイキン−
    4を刺激することができることを特徴とする請求項26に記載の免疫仲介不全症
    を治療するための医薬組成物。
  28. 【請求項28】 免疫仲介不全症を治療するための医薬組成物であって、リポ
    多糖誘導敗血症ショックに対してマウスを保護することができる、尿から得られ
    る活性成分を含む医薬組成物。
  29. 【請求項29】 妊娠している哺乳動物、好適にはヒトから得られることを特
    徴とする請求項26〜28のいずれかに記載の免疫仲介不全症を治療するための
    医薬組成物。
  30. 【請求項30】 臨床グレードhCG製剤、またはそれから誘導される分画を
    含む請求項29に記載の免疫仲介不全症を治療するための医薬組成物。
  31. 【請求項31】 請求項1〜16のいずれかに記載の少なくとも1つの免疫レ
    ギュレータを用いた治療を動物に受けさせることを含む免疫仲介不全症を治療す
    るための方法。
  32. 【請求項32】 前記不全症が糖尿病を含むことを特徴とする請求項31に記
    載の方法。
  33. 【請求項33】 前記不全症が敗血症を含むことを特徴とする請求項32に記
    載の方法。
  34. 【請求項34】 前記動物におけるリンパ球サブセット集団の相対的割合およ
    び/またはサイトカイン活性を調節することをさらに含むことを特徴とする請求
    項31〜33のいずれかに記載の方法。
  35. 【請求項35】 前記サブセット集団がTh1またはTh2細胞を含むことを
    特徴とする請求項34に記載の方法。
  36. 【請求項36】 尿分画またはそれから誘導される分画に対して、糖尿病の徴
    候を示しやすい動物をさらすことにより、免疫レギュレータの治療的効果を測定
    することと、前記動物において糖尿病の発症を判定することとを含む免疫レギュ
    レータを選択するための方法。
  37. 【請求項37】 尿分画またはそれから誘導される分画に対して、敗血症シ
    ョックの徴候を示しやすい動物をさらすことにより、免疫レギュレータの治療的
    効果を測定することと、前記動物において敗血症ショックの発症を判定すること
    とを含む免疫レギュレータを選択するための方法。
  38. 【請求項38】 前記治療的効果がさらに、前記動物におけるリンパ球サブセ
    ット集団の相対的割合および/またはサイトカイン活性を測定することにより測
    定されることを特徴とする請求項36または37に記載の方法。
  39. 【請求項39】 前記治療的効果がさらに、前記動物における酵素レベルを測
    定することにより測定されることを特徴とする請求項38に記載の方法。
  40. 【請求項40】 請求項36〜39のいずれかに記載の方法によって選択され
    る免疫レギュレータ。
  41. 【請求項41】 請求項40に記載の免疫レギュレータを含む医薬組成物。
  42. 【請求項42】 免疫仲介不全症治療用医薬組成物調製のための請求項40に
    記載の免疫レギュレータの使用。
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