ES2216516T3 - Inmunorregulador. - Google Patents

Abstract

El uso de un inmunorregulador que se puede obtener a partir de la orina que es capaz de regular la actividad celular Th1 o Th2 para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune.

Description

Inmunorregulador.

La invención se refiere al campo de la inmunología, más específicamente al campo de los trastornos mediados por un mecanismo inmune como alergias, enfermedades autoinmunes, enfermedades relacionadas con el trasplante o enfermedades inflamatorias.

El sistema inmune produce citocinas y otros factores humorales que protegen al huésped cuando está amenazado por sustancias inflamatorias, una invasión microbiana o lesiones. En la mayoría de los casos, esta compleja red defensiva restaura con éxito la homeostasis normal, pero en otras ocasiones los mediadores inmunológicos pueden ser realmente perjudiciales para el huésped. Algunos ejemplos de enfermedades inmunes y problemas relacionados con el sistema inmune han sido investigados exhaustivamente, como es el shock anafiláctico, la enfermedad autoinmune y los trastornos de los complejos inmunes.

Los últimos avances en la inmunología humoral y celular, la biología molecular y la anatomía patológica han influido en las teorías actuales sobre la autoinmunidad, que se considera un componente de una enfermedad mediada por un mecanismo inmune. Estos avances han aumentado nuestros conocimientos sobre los aspectos básicos de los anticuerpos, la diversidad de las células B y células T, la generación de las respuestas inmunes innata (efectuada por monocitos, macrófagos, granulocitos, células citolíticas, células T, células T gamma\delta, complemento, proteínas de fase aguda y otras) y adaptativa (células T y células B y anticuerpos) o las respuestas inmunes celular y humoral y su interdependencia, los mecanismos de inducción de (auto)-tolerancia y los medios por los que se desarrolla la reactividad inmunológica frente a los constituyentes autoantigénicos.

Ya desde 1900 el dogma central de la inmunología ha sido que el sistema inmune no reacciona normalmente ante sí mismo. No obstante, recientemente ha quedado claro que las respuestas autoinmunes no son tan poco frecuentes como se pensaba antiguamente y que no todas las respuestas autoinmunes son perjudiciales; algunas de ellas desempeñan un papel evidente en la mediación de la respuesta inmune en general. Por ejemplo, algunas formas de la respuesta autoinmune como el reconocimiento de los antígenos de superficie celular codificados por el complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) y de las respuestas antiidiotípicas frente a autoidiotipos son importantes, en realidad, esenciales, para la diversificación y funcionamiento normal del sistema inmune intacto.

Aparentemente, se mantiene un sistema intrincado de comprobaciones y equilibrios entre varias subpoblaciones de las células (es decir, células T) del sistema inmune, con lo que se proporciona al individuo un sistema inmune que es capaz de enfrentarse a los invasores externos. En ese sentido, la autoinmunidad desempeña un papel regulador en el sistema inmune.

No obstante, ahora también se sabe que una respuesta autoinmune anormal es en ocasiones la causa principal de muchas enfermedades del hombre y de animales, y otras veces es un factor contribuyente secundario. Los tipos de enfermedades autoinmunes se superponen con frecuencia y tiende a aparecer más de un trastorno autoinmune en el mismo individuo, especialmente en los que tienen endocrinopatías autoinmunes. Los síndromes autoinmunes pueden estar mediados por una hiperplasia linfoide, por una proliferación celular maligna linfocítica o de células plasmáticas y por trastornos por inmunodeficiencia como la hipogammaglobulinemia, los déficit selectivos de Ig y los déficit de los componentes del complemento.

Las enfermedades autoinmunes, como lupus eritematoso sistémico, diabetes, artritis reumatoide, disfunción tiroidea posparto, tromocitopenia autoinmune, por nombrar sólo algunas, se caracterizan por las respuestas autoinmunes, por ejemplo dirigidas frente a determinantes de autoantígenos ampliamente diseminados, o dirigidas frente a antígenos específicos de órganos o tejidos. En tal caso, este tipo de enfermedades puede verse después de unas respuestas inmunes anormales frente a sólo una diana antigénica o frente a muchos autoantígenos. En muchos casos, no está claro si las respuestas autoinmunes se dirigen frente a autoantígenos no modificados o autoantígenos que han sido modificados (o se parecen) a cualquiera de los numerosos agentes como antígenos víricos o bacterianos y grupos
hapténicos.

Hasta la fecha no se ha establecido un concepto unificado que explique el origen y patogenia de los distintos trastornos autoinmunes. Los estudios sobre experimentación animal apoyan la idea de que una enfermedad autoinmune puede ser consecuencia de un amplio espectro de anomalías genéticas e inmunológicas que difieren entre un sujeto y otro, que se expresan antes o después a lo largo de la vida dependiendo de la presencia o ausencia de muchos factores superpuestos exógenos (virus o bacterias) o endógenos (hormonas, citocinas o genes anormales) que aceleran el proceso.

Es evidente que hay métodos de comprobaciones y equilibrios similares que mantienen la enfermedad autoinmune principal en reposo que también están comprometidos en los trastornos mediados por mecanismo inmune, como una alergia (asma), una enfermedad inflamatoria aguda como sepsis o shock séptico, una enfermedad inflamatoria crónica (es decir, una enfermedad reumática, síndrome de Sjögren, esclerosis múltiple), respuestas inmunes relacionadas con el trasplante (enfermedad injerto contra huésped, trombocitopenia postransfusional) y muchas otras en las que los antígenos responsables (al menos inicialmente) pueden no ser autoantígenos pero en los cuales la respuesta inmune a dicho antígeno es, en principio, no deseada y perjudicial para el individuo. La sepsis es un síndrome en el que los mediadores inmunes, inducidos por ejemplo por la invasión microbiana, a través de un daño directo o mediante otros factores, inducen un estado agudo de inflamación que provoca la homeostasis anormal, daño orgánico y finalmente, un shock letal. La sepsis se refiere a una respuesta sistémica a una infección grave. Los pacientes que tienen sepsis habitualmente manifiestan fiebre, taquicardia, taquipnea, leucocitosis y un lugar localizado de infección. Los cultivos microbiológicos procedentes de la sangre o del lugar de la infección son con frecuencia, aunque no siempre, positivos. Cuando este síndrome da lugar a hipotensión o a un fracaso multiorgánico (MOSF), la situación se conoce como sepsis o shock séptico. Inicialmente, los microorganismos proliferan en el nido de la infección. Los organismos pueden invadir el torrente sanguíneo, dando lugar a hemocultivos positivos, o pueden crecer localmente y liberar varias sustancias al torrente sanguíneo. Tales sustancias se agrupan en dos categorías básicas cuando son de naturaleza patógena: endotoxinas y exotoxinas. Las endotoxinas consisten habitualmente en componentes estructurales de los microorganismos, como el antígeno del ácido teicoico procedente de los estafilococos o endotoxinas procedentes de organismos gramnegativos (como LPS). Los microorganismos sintetizan y liberan directamente las exotoxinas (como la toxina 1 del síndrome de shock tóxico, o la enterotoxina A, B o C estafilocócica).

Como su nombre indica, ambos tipos de toxinas bacterianas tienen efectos patógenos, estimulando la liberación de un gran número de mediadores inmunes endógenos derivados del propio huésped a partir de proteínas plasmáticas o células precursoras (monocitos/macrófagos, células endoteliales, neutrófilos, células T y otros).

En general, es un hecho que estos mediadores inmunes causan el daño orgánico y tisular asociado a la sepsis o shock séptico. Algunos de estos efectos derivan de la lesión orgánica inducida por un mediador directo. Sin embargo, es probable que una porción de la disfunción orgánica asociada al shock se deba a anomalías inducidas por el mediador en la red vascular, lo que provoca alteraciones del flujo sanguíneo sistémico y regional que, a su vez, se traducen en una hipotensión refractaria o MOSF (Bennett y cols.).

El ratón obeso no diabético (NOD) es un modelo para una enfermedad autoinmune, en este caso la diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) cuya principal característica es la concentración elevada de glucosa sanguínea (hiperglucemia). Dicha concentración elevada de glucosa sanguínea se debe a la destrucción autoinmune de las células \beta de los islotes de Langerhans del páncreas productoras de insulina (Bach y cols. 1991, Atkinson y cols. 1994). Este aumento se acompaña por un infiltrado celular masivo que rodea y penetra en los islotes (insulitis) y que está formado por una mezcla heterogénea de linfocitos TCD4+ y CD8+, linfocitos B, macrófagos y células dendríticas (O'Reilly y cols. 1991).

El ratón NOD representa un modelo en el que la autoinmunidad frente a las células beta es el principal evento en el desarrollo de DMID. La diabetogénesis está mediada por una interacción multifactorial entre un gen exclusivo de clase II del MHC y múltiples loci genéticos no ligados entre sí, como en la enfermedad humana. Además, el ratón NOD demuestra elegantemente la interacción crítica entre la herencia y el entorno y entre la autoinmunidad primaria y secundaria y sus manifestaciones clínicas dependen, por ejemplo, de varias situaciones externas, principalmente la carga de microorganismos en el entorno en que se aloja el ratón NOD.

En lo que se refiere a la autoinmunidad demostrable en los ratones NOD, la mayoría de las respuestas de anticuerpos específicas del antígeno y de las células T se midieron después de que estos antígenos se detectasen como autoantígenos en los pacientes diabéticos. Si se comprende el papel que estos autoantígenos desempeñan en la diabetes del ratón NOD se podrá distinguir entre los autoantígenos patógenos y la autoinmunidad como un epifenómeno.

En general, los linfocitos T desempeñan un papel central en el inicio del proceso morboso mediado por mecanismo inmune (Sempe y cols. 1991, Miyazaki y cols. 1985, Harada y cols. 1986, Makino y cols. 1986). Las células T CD4+ se pueden separar al menos en dos subpoblaciones mayores, Th1 y Th2. Las células Th1 activadas segregan IFN-gamma y TNF-alfa, mientras que las células Th2 producen IL-4, IL-5 e IL-10. Las células Th1 están implicadas críticamente en la generación de la inmunidad celular eficaz, mientras que las células Th2 son el instrumento de la generación de la respuesta inmune y alérgica de tipo humoral y mucosa, como es la activación de los eosinófilos y las células T y en la producción de IgE (Abbas y cols. 1996). Varios estudios han demostrado ahora que hay una correlación entre la diabetes en ratones y en el hombre con desarrollo del fenotipo Th1 (Liblau y cols. 1995, Katz y cols. 1995). Por otro lado, se demuestra que las células T Th2 son relativamente inocuas. Algunos autores han especulado con que las células T Th2 pueden ser, en realidad, protectoras. Katz y cols. han demostrado que la capacidad que tienen las células T CD4+ de transferir la diabetes a receptores vírgenes reside no en la especificidad del antígeno que reconoce el TCR per se, sino en la naturaleza fenotípica de la respuesta de las células T. Las células T Th1 fuertemente polarizadas transfieren la enfermedad a los ratones NOD recién nacidos, mientras que las células T Th2 no lo hacen, a pesar de ser activadas y de llevar la misma TCR que la población de células T Th1 diabetogénicas. Además, durante la transferencia simultánea, las células T Th2 podrían no mejorar la diabetes inducida por las células Th1, incluso cuando las células Th2 se transfieren simultáneamente en un exceso de 10 veces (Pakala y cols. 1997).

La incidencia de sepsis o shock séptico ha ido en aumento, y los datos recopilados en los años 30 y todos los datos recientes sugieren que este aumento continuará. Las razones para la mayor incidencia son muchas: uso aumentado de dispositivos invasivos como catéteres intravasculares, uso extendido de tratamientos farmacológicos citotóxicos e inmunosupresores para el cáncer y el trasplante, aumento de la longevidad de los pacientes con cáncer y diabetes, que son propensos a desarrollar sepsis, y a un aumento de infecciones debido a los microorganismos resistentes a antibióticos. La sepsis o el shock séptico es la causa más frecuente de muerte en las unidades de cuidados intensivas y es la causa de muerte número 13 por orden de importancia en los Estados Unidos. La incidencia precisa de la enfermedad se desconoce, porque no se comunica; no obstante, una estimación razonable en los Estados Unidos es 400.000 casos de sepsis, 200.000 casos de shock séptico y 100.000 muertes derivadas de esta afección.

Varios microorganismos, como bacterias gramnegativas y grampositivas, así como hongos, pueden provocar sepsis y shock séptico y es probable que algunos virus y Rickettsias puedan producir un síndrome similar. Comparadas con los microorganismos grampositivos, las bacterias gramnegativas muestran una mayor tendencia a producir sepsis o shock séptico. Cualquier localización de la infección puede desembocar en sepsis o shock séptico. Las causas frecuentes de sepsis son pielonefritis, neumonía, peritonitis, colangitis, celulitis o meningitis. Muchas de estas infecciones son nosocomiales, apareciendo en pacientes hospitalizados por otros problemas médicos. En los pacientes que tienen unas defensas normales se suele identificar una localización de la infección en la mayoría de los casos, mientras que en los pacientes neutropénicos se encuentra una localización clínica de la infección en menos de la mitad de los pacientes con sepsis debido, probablemente, a pequeñas infecciones clínicamente no evidentes situadas en piel o intestino, que pueden provocar la invasión del torrente sanguíneo en ausencia de neutrófilos circulantes adecuados. Está claro que hay que proteger frente a la sepsis o shock séptico a los pacientes que corren estos riesgos.

Recientemente, se han hecho esfuerzos considerables dirigidos a identificar a los pacientes con sepsis al principio de la evolución clínica, cuando los tratamientos tienen más probabilidades de ser eficaces. Las definiciones han incorporado las manifestaciones de la respuesta sistémica a la infección (fiebre, taquicardia, taquipnea y leucocitosis) junto a los signos de disfunción de órganos y sistemas (con alteraciones cardiovasculares, respiratorias, renales, hepáticas, en el sistema nervioso central, hematológicas o metabólicas). Las definiciones más recientes usan el término (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica) (SIRS), resaltando que la sepsis es un ejemplo de las respuestas inflamatorias del cuerpo mediadas por mecanismo inmune que se pueden desencadenar no sólo por infecciones, sino también por trastornos no infecciosos como traumatismos o pancreatitis (para obtener información sobre la interrelación existente entre la respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), sepsis e infección, consultar Crit. Care Med. 20:864, 1992; para consultar una revisión sobre las secuencias patógenas de los eventos que se desarrollan en la sepsis o shock séptico, véase N Engl J Med 328:1471, 1993).

La toxina del síndrome de shock tóxico (TSST-1) representa la exotoxina clínicamente más relevante, identificada como el agente causante en más del 90% de los casos de síndrome de shock tóxico (en los que el shock tóxico se define como una sepsis o shock séptico causado por exotoxinas superantigénicas). Los superantígenos difieren de los antígenos "normales" porque no requieren el procesamiento celular antes de mostrarse en la molécula del MHC. Por el contrario, se unen a una región semiconservada situada en el exterior del TCR y provocan un "reconocimiento" falso de los antígenos propios que se muestran en la clase II del MHC (Perkins y cols.; Huber y cols. 1993). Este efecto se traduce en una activación "falsa" de las células T y del APC, lo que provoca la proliferación y activación de las funciones efectoras y la secreción de citocinas. Debido a la activación policlonal de células T por el superantígeno, el extenso shock sistémico se traduce en una liberación excesiva de citocinas inflamatorias (Huber y cols. 1993, Miethke y cols. 1992).

Las citocinas inflamatorias implicadas en la sepsis son similares. Estos mediadores inmunes son el factor de necrosis tumoral (TNF), interferón gamma (IFN-gamma), óxido nítrico (ON) e interleucina 1(IL-1), que se liberan masivamente por monocitos, macrófagos y otros leucocitos en respuesta a toxinas bacterianas (Bennett y cols., Gutiérrez-Ramos y cols. 1997). La liberación de TNF y de otros mediadores endógenos puede provocar varias reacciones fisiopatológicas en la sepsis, como fiebre, leucopenia, trombocitopenia, cambios hemodinámicos, coagulación intravascular diseminada, así como la infiltración de leucocitos y la inflamación de varios órganos, todo lo cual puede conducir finalmente a la muerte. El TNF también hace que las células endoteliales expresen receptores de adhesión (selectinas) y pueden activar a los neutrófilos para que expresen ligandos para estos receptores que ayudan a su vez a los neutrófilos a adherirse a la superficie celular del endotelio para la adhesión, marginación y migración hacia los focos inflamatorios de los tejidos (Bennett y cols.). El bloqueo del proceso de adhesión con anticuerpos monoclonales previene el daño tisular y mejora la supervivencia en un modelo animal de sepsis o shock séptico (Bennett y cols.).

Estos hallazgos, tanto en una enfermedad autoinmune como en una enfermedad inflamatoria aguda o crónica, subrayan la existencia propuesta de las células que regulan el equilibrio entre las subpoblaciones Th activadas. Los posibles trastornos de este equilibrio se inducen por una reactividad alterada, como la que se produce en las poblaciones de células T reguladoras que pueden provocar enfermedades mediadas por un mecanismo inmune que, a su vez, desembocan en la ausencia o sobreproducción de algunas citocinas fundamentales (O'Garra y cols. 1997). Estas subpoblaciones Th son dianas potenciales de la regulación farmacológica de las respuestas inmunes.

En general, los trastornos mediados por un mecanismo inmune son difíciles de tratar. Muchas veces se aplican medicaciones de amplio espectro, como el tratamiento con corticoesteroides o cualquier otro fármaco antiinflamatorio de amplio espectro que, en muchos aspectos, pueden ser perjudiciales para el individuo tratado.

En general hay una necesidad de disponer de posibilidades mejores y más específicas que permitan regular las comprobaciones y equilibrios del sistema inmune y tratar los trastornos mediados por un mecanismo inmune.

La invención proporciona entre otros un inmunorregulador (IR), el uso de un IR en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune, una composición farmacéutica y un método para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune. El trastorno mediado por un mecanismo inmune, tal como se describe en este documento, consiste en una enfermedad inflamatoria crónica, como diabetes tipo I o II, enfermedad reumática, síndrome de Sjögren, esclerosis múltiple, respuestas inmunes relacionadas con el trasplante como la enfermedad injerto contra huésped, trombocitopenia postransfusional, rechazo crónico de un trasplante, preeclampsia, aterosclerosis, asma, alergia y enfermedad autoinmune crónica y enfermedad inflamatoria aguda, como (hiper)rechazo agudo de un trasplante, shock séptico y enfermedad autoinmune aguda. Las enfermedades autoinmunes son un grupo de trastornos de una etiología en general desconocida. En la mayoría de estas enfermedades se puede encontrar la producción de anticuerpos autorreactivos o linfocitos T autorreactivos. Una respuesta autoinmune puede ocurrir también como manifestación de una infección vírica o bacteriana y puede dar lugar a un daño tisular importante, por ejemplo, una hepatitis destructiva debida a una infección por el virus de la Hepatitis B.

Las enfermedades autoinmunes se pueden clasificar como específicas o inespecíficas de un órgano, dependiendo de si la respuesta se dirige principalmente frente a antígenos localizados en órganos determinados o frente a antígenos de existencia difusa. El pilar actual del tratamiento de las enfermedades autoinmunes es la supresión inmune o (debido a un deterioro tisular) la sustitución de componentes vitales como la sustitución hormonal. Sin embargo, los fármacos inmunsupresores como esteroides o fármacos citostáticos tienen efectos secundarios significativos que limitan su aplicación. Ahora, la presente invención proporciona el uso de fármacos inmunorreguladores más específicos para el tratamiento de la enfermedad autoinmune y otras inflamaciones. Basado en las propiedades inmunorreguladoras que se describen a continuación, por ejemplo, al regular el índice Th1/Th2, se modula la diferenciación de las células dendríticas. El bajo perfil de efectos secundarios, las observaciones clínicas iniciales, etc., demuestran que estos preparados pueden ser muy útiles para el tratamiento de los pacientes que tengan una enfermedad mediada por mecanismo inmune, como es la enfermedad autoinmune.

Una relación no exhaustiva de las enfermedades inmunes podría ser: tiroiditis de Hashimoto, mixedema primario tirotoxicosis, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmune, enfermedad de Addison, menopausia prematura, diabetes mellitus insulinodependiente, síndrome del hombre rígido, síndrome de Goodpasture, miastenia gravis, infertilidad masculina, pénfigo vulgar, penfigoide, oftalmía simpática, uveítis facógena, esclerosis múltiple, anemia hemolítica autoinmune, púrpura trombocitopénica idiopática, leucopenia idiopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa, cirrosis criptogénica, colitis ulcerosa, síndrome de Sjögren, artritis reumatoide, dermatomiositis, polimiositis, esclerodermia, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, lupus eritematoso discoide y lupus eritematoso sistémico.

En una realización, la invención proporciona un inmunorregulador que es capaz de regular negativamente las concentraciones de células Th1 o de regular positivamente las concentraciones de células Th2, o de influir en su relación porcentual en un animal, pudiendo dicho inmunorregulador obtenerse a partir de la orina u otras fuentes de productos corporales como suero, suero de leche, extracto de placenta, células o tejidos. Que se puede obtener, se refiere a la obtención directa o indirecta de dicho IR a partir de dicha fuente, siendo IR por ejemplo obtenido a través de una síntesis química o a partir de fuentes naturales de origen animal o vegetal.

En una realización preferida; la invención permite regular los índices relativos y/o la actividad de citocinas de subpoblaciones de linfocitos en un animal enfermo (como el hombre), preferiblemente cuando estas subpoblaciones de linfocitos consisten en poblaciones Th1 o Th2. En general, los linfocitos T colaboradores CD4+ vírgenes (Th) desarrollan unas células efectoras funcionalmente maduras tras la estimulación con el péptido antigénico relevante que se encuentra en las moléculas de clase II del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC), introducidas por las células presentadoras del antígeno (APC). Basado en el juego característico de citocinas producidas, las células Th se dividen habitualmente en al menos dos subpoblaciones diferentes: células Th1 que producen exclusivamente interleucina 2 (IL-2), interferón-gamma (IFN-gamma) y linfotoxina, mientras que las células Th2 producen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13. Estas subpoblaciones Th1 y Th2 parecen ser los extremos de los perfiles de producción de citocinas y entre ambas subpoblaciones polarizadas cada célula Th individual muestra una expresión génica más diferencial que coordinada de citocinas. Estas subpoblaciones se desarrollan a partir de unas células Th precursoras comunes (Thp) después de ser activadas con los péptidos relevantes sobre las células Tho, produciéndose una serie de citocinas como son IL-2, IL-4, IL-5 e IFN-gamma. Estas células Tho activadas se polarizan posteriormente en dirección Th1 o Th2 según la composición celular y la composición de citocinas de su microentorno. Las células presentadoras del antígeno, como las distintas subpoblaciones de células dendríticas y las subpoblaciones de macrófagos, determinan principalmente esta polarización al desarrollo de subpoblaciones Th1 o Th2. Parece que las subpoblaciones Th1-Th2 regulan mutuamente entre sí los perfiles de producción de citocinas, principalmente a través de IFN-gamma e IL-10 y a partir de este concepto se racionalizó que los trastornos del equilibrio entre ambas subpoblaciones pueden dar lugar a distintas manifestaciones clínicas [5]. IL-12 es un factor dominante que promueve la polarización de la subpoblación Th1 y de las células dendríticas y macrófagos para producir IL-12. Además, IL-12 induce la producción de IFN-gamma por las células T y las células citolíticas (NK). Recientemente, se ha descrito que IL-18 actúa sinérgicamente con IL-12 para inducir el desarrollo de Th1. La polarización de células Th2 depende fundamentalmente de la presencia de IL-4 producida por células T o basófilos y células T. También se ha demostrado que la IL-6 derivada de APC induce pequeñas cantidades de IL-4 que participan en el desarrollo de las células Th. La prostaglandina E_{2} (PGE_{2}) derivada de IL-10 y APC inhibe la producción de IL-12 y el cebado de la subpoblación Th1.

El paradigma Th1-Th2 ha sido útil para establecer la correlación entre la función de las células Th1 con la inmunidad celular (respuestas inflamatorias, hipersensibilidad retardada y citotoxicidad) y de las células Th2 con la inmunidad humoral. En general, entre las enfermedades infecciosas la resistencia a las bacterias, hongos y protozoos intracelulares está ligada al montaje de una respuesta Th1 de éxito. Las respuestas Th1 también se pueden vincular a una determinada afección, como artritis, colitis y otros estados inflamatorios. La protección eficaz frente a patógenos extracelulares, como helmintos, requiere principalmente la respuesta Th2 y un aumento de la inmunidad humoral puede desembocar en una neutralización satisfactoria de los patógenos mediante la producción de anticuerpos específicos.

En otra realización preferida más, la invención proporciona un inmunorregulador que es capaz de modular la diferenciación de las células dendríticas. El crecimiento selectivo de las células Th1 frente a células Th2 depende de la interacción de células Th precursoras con las células presentadoras del antígeno (APC) que transportan el péptido relevante junto a sus moléculas de clase II del MHC. Las citocinas liberadas por las APC y que se presentan durante la interacción inicial entre las células dendríticas y el receptor pertinente de las células T son las que dirigen la diferenciación en subpoblaciones Th1 frente a subpoblaciones Th2. Recientemente, se han descrito en el hombre dos precursores diferentes de DC (mieloide frente a linfoide). El desarrollo selectivo de DC1 a partir de los precursores mieloides se produce después de la estimulación con el ligando CD40 o una endotoxina y da lugar a una producción elevada de IL-12. Los precursores linfoides dan lugar a células DC2 después de la estimulación con el ligando CD40 y producen IL-1, IL-6 e IL-10. Estas citocinas tienen una importancia capital para dirigir el desarrollo de las células Th activadas: se necesita IL-4 para el crecimiento de células de tipo Th2, que puede potenciarse en gran medida por la presencia de IL-10, mientras que la diferenciación a células de tipo Th1 depende exclusivamente de la presencia de IL-12. Como los DC1 se caracterizan por la producción de IL-12, inducirán principalmente el crecimiento de células de tipo Th1, mientras que DC2 produce IL-10 y promueve selectivamente el desarrollo de células Th2 en presencia de IL-4 exógena. En esta invención se demuestra que un IR como el proporcionado por la invención es capaz de regular o modular la actividad y diferenciación de DC, con lo que permite una diferenciación y actividad selectivas de las células Th1 o Th2.

En una realización, la invención proporciona un inmunorregulador que consiste en un principio activo que se puede obtener a partir de un preparado de gonadotropina coriónica de mamífero, principio activo que es capaz de estimular a los esplenocitos obtenidos a partir de ratones obesos no diabéticos (NOD), o que consiste en un principio activo funcionalmente relacionado con dicho compuesto activo, permitiendo, por ejemplo, una actividad y diferenciación DC regular o modulada, o permitiendo la diferenciación y actividad selectiva de células Th1 o células Th2, en caso de una inflamación crónica, como diabetes o rechazo crónico de un trasplante por ejemplo, como se demuestra por la descripción detallada que se incluye en este documento, en la cual dichos esplenocitos estimulados son capaces de retrasar el inicio de la diabetes en el ratón NOD con inmunodeficiencia combinada grave reconstituido con dichos esplenocitos, o en la cual dicho principio activo es capaz de inhibir la producción del interferón gamma de los esplenocitos obtenidos a partir de ratones obesos no diabéticos (NOD), o en la cual dicho principio activo es capaz de estimular la producción de interleucina 4 de los esplenocitos obtenidos a partir de ratones obesos no diabéticos (NOD).

En otra realización, la invención proporciona un inmunorregulador que consiste en un principio activo que se puede obtener a partir de un preparado de gonadotropina coriónica de mamífero, principio activo que es capaz de proteger a un ratón frente a un shock séptico inducido por un lipopolisacárido, por ejemplo, permitiendo la actividad y diferenciación de DC regular o modulada, o permitiendo la diferenciación y actividad selectiva de las células Th1 o células Th2, en caso de una inflamación aguda, como se ve en el shock o en el rechazo (hiper)agudo del trasplante, por ejemplo, como se demuestra en la descripción detallada que se incluye en este documento, en la cual dicho principio activo es capaz de reducir la ASAT o la concentración plasmática de otras enzimas relevantes después de o durante un fracaso orgánico, como se observa habitualmente en el shock.

En una realización dicho inmunorregulador de acuerdo con la invención consiste, como se describe con más detalle a continuación, en un principio activo que reside en una fracción que se eluye con un peso molecular aparente de 58 a 15 kilodalton determinado mediante una cromatografía por permeabilidad en gel, en la cual se encuentra también la asociación, inhibición o sinergia. En otra realización, la invención proporciona un inmunorregulador, como se describe con más detalle a continuación, en la cual dicho principio activo se encuentra en una fracción que se eluye con un peso molecular aparente de menos de 15 kilodalton determinado mediante una cromatografía por permeabilidad en gel, por ejemplo, en la cual dicho principio activo se encuentra en una fracción que se eluye con un peso molecular aparente
de < 1 kilodalton determinado mediante una cromatografía por permeabilidad en gel. Aunque dicho inmunorregulador de acuerdo con la invención se obtiene fácilmente a partir de la orina, por ejemplo, en la cual dicho preparado de gonadotropina coriónica de mamífero se obtiene a partir de la orina, pero también se pueden utilizar otras fuentes, como suero, células o tejidos que contienen gonadotropina. También a partir de dichas fuentes se proporciona un inmunorregulador de acuerdo con la invención que es capaz de, por ejemplo, regular la actividad celular Th1 o Th2, o que es capaz de modular la diferenciación de las células dendríticas.

Preferiblemente, un inmunorregulador como el proporcionado por la invención se puede obtener a partir de un mamífero gestante, preferiblemente una mujer, por ejemplo que se puede obtener a partir de un compuesto farmacológico preparado para contener gonadotropinas (placentarias) como la gonadotropina sérica de yeguas gestantes (PMSG) que se encuentra en el suero de las yeguas gestantes (IR-S), o del extracto de útero de ratonas gestantes (PMUE) extraído a partir del útero (IR-UE) de ratonas grávidas o de la gonadotropina coriónica humana (hCG o HCG) que se encuentra en la sangre u orina de las mujeres gestantes. Un IR como el proporcionado por la invención puede asociarse o no a una gonadotropina como, por ejemplo, la que se presenta en la orina del primer trimestre de embarazo (IR-U) y en preparados comerciales de hCG (IR-P) tiene efectos reguladores inmunes. En particular, el IR puede inhibir o regular las enfermedades autoinmunes e inflamatorias agudas o crónicas. El TNF y el IFN- gamma están implicados en la patogenia en la enfermedad inflamatoria aguda, como sepsis o shock séptico, y también en las enfermedades autoinmunes y las enfermedades inflamatorias crónicas. Como el IR puede regular las subpoblaciones de células T e inhibir el TNF e IFN-gamma, el IR se puede usar para tratar, suprimir o prevenir los trastornos mediados por mecanismos inmunes como sepsis o shock séptico (enfermedad inflamatoria aguda) así como una enfermedad autoinmune o enfermedades inflamatorias crónicas como lupus eritematoso sistémico, diabetes, artritis reumatoide, disfunción tiroidea posparto, tromocitopenia autoinmune y otras, como alergias y enfermedad inflamatoria crónica (como la enfermedad reumática, síndrome de Sjögren o esclerosis múltiple) y en las respuestas inmunes relacionadas con el trasplante. Nuestros resultados por ejemplo muestran que el IR inhibe la sepsis o el shock séptico causado por una endotoxina o una exotoxina. El IR como el proporcionado por la invención inhibe o contrarresta una enfermedad autoinmune mediada por un mecanismo inmune, las enfermedades inflamatorias crónicas y también las enfermedades inflamatorias agudas.

La invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune como una alergia, una enfermedad autoinmune, la enfermedad relacionada con el trasplante o la enfermedad inflamatoria aguda o crónica, o proporciona un inmunorregulador (IR), por ejemplo para estimular o regular la acción de los linfocitos, que consiste en un principio activo; dicho principio activo es capaz de estimular a los esplenocitos obtenidos a partir de ratones hembra obesas no diabéticas (NOD) de 20 semanas de edad, retrasando dichos esplenocitos estimulados el inicio de diabetes en un ratón NOD con inmunodeficiencia combinada grave (NOD.scid) reconstituido a las 8 semanas de edad con dichos esplenocitos, o que consiste en un principio activo funcionalmente relacionado con él.

En una realización, la invención proporciona una composición farmacéutica o un inmunorregulador en el cual dicho principio activo es capaz de inhibir la producción del interferón gamma o estimular la producción de interleucina 4 de los esplenocitos obtenidos a partir de ratones diabéticos no obesos (NOD), hembras de 20 semanas de edad en este caso. Los preparados de grado clínico de gonadotropinas como hCG y PMSG tienen ya un largo historial de uso en el tratamiento de los problemas de la reproducción en situaciones en las que se desea el crecimiento o estimulación folicular de la ovulación. Dichos preparados se obtienen en general a partir de suero u orina y a menudo tienen un grado variable de purificación y actividad relativa, dependiendo de la concentración inicial en suero u orina y de los distintos métodos de preparación utilizados.

En una realización en particular, la invención proporciona un inmunorregulador que consiste en un principio activo que se puede obtener a partir de un preparado de CG de mamífero, siendo dicho principio activo capaz de estimular a los esplenocitos obtenidos a partir de ratones obesos no diabéticos (NOD), o que consiste en un principio activo funcionalmente relacionado con dicho compuesto activo, por ejemplo, en el cual dichos esplenocitos estimulados son capaces de retrasar el inicio de diabetes en un ratón NOD con inmunodeficiencia combinada grave reconstituido con dichos esplenocitos.

La invención también proporciona un inmunorregulador en el cual dicho principio activo es capaz de inhibir la producción del interferón gamma obtenido a partir de ratones obesos no diabéticos (NOD). La invención también proporciona un inmunorregulador en el cual dicho principio activo es capaz de estimular la producción de interleucina 4 de los esplenocitos obtenidos a partir de ratones obesos no diabéticos (NOD).

Un inmunorregulador como el proporcionado por la invención (IR) con o sin hCG como por ejemplo los que se presentan en la orina del primer trimestre del embarazo (IR-U) y en preparados comerciales de hCG (IR-P) tiene unos efectos reguladores de la inmunidad. En particular, el IR puede inhibir o regular las enfermedades autoinmunes y las enfermedades inflamatorias agudas o crónicas. El TNF y el IFN-gamma están implicados en la patogenia de la enfermedad inflamatoria aguda como sepsis o shock séptico y también en la enfermedad autoinmune y en las enfermedades inflamatorias crónicas. Ya que el IR tiene la capacidad de regular las subpoblaciones de células T e inhibir el TNF e IFN-gamma, el IR se puede usar para tratar, suprimir o prevenir los trastornos mediados por un mecanismo inmune como la sepsis o el shock séptico (enfermedad inflamatoria aguda) así como una enfermedad autoinmune o enfermedades inflamatorias crónicas como lupus eritematoso sistémico, diabetes, artritis reumatoide, disfunción tiroidea posparto, tromocitopenia autoinmune y otras, como alergias y enfermedad inflamatoria crónica (es decir, enfermedad reumática, síndrome de Sjögren o esclerosis múltiple) y las respuestas inmunes relacionadas con el trasplante. Nuestros resultados por ejemplo muestran que el IR inhibe la sepsis o el shock séptico causado por una endotoxina o por una exotoxina. El IR como el proporcionado por la invención inhibe o contrarresta las enfermedades autoinmunes mediadas por mecanismo inmune, las enfermedades inflamatorias crónicas y también las enfermedades inflamatorias agudas.

Hay descripciones de casos aislados y de estudios de laboratorio que indicaban previamente que la hCG podría tener un efecto frente al sarcoma de Kaposi y frente al virus de la inmunodeficiencia humana (Treatment Issues, Julio/Agosto 1995, pág. 15). Se ha observado que los preparados de hCG tienen un efecto apoptótico directo (citotóxico) sobre el sarcoma de Kaposi (KS) in vitro y en pacientes y en ratones inmunodeficientes, y que tiene un efecto prohematopoyético en los pacientes inmunodeficientes (Lunardi-Iskandar y cols., Nature 375, 64-68; Gill y cols., New. Eng. J. Med. 335, 1261-1269, 1996; patente de los EE.UU. 5677275) y un efecto antivírico inhibidor directo sobre el virus de la inmunodeficiencia humana y de los simios (VIH y VIS) (Lunardi-Iskandar y cols., Nature Med. 4, 428-434, 1998, patente de los EE.UU. 5700781). Dichos efectos citotóxicos y antivíricos también se han atribuido a un factor mediado por hCG (HAF) desconocido que se encuentra en los preparados de hCG de grado clínico. No obstante, los preparados comerciales (como CG-1 0, Steris Profasi, Pregnyl, Choragon, Serono Profasi, APL), tienen varios efectos. El análisis de varios de ellos (AIDS, 11: 1333-1340, 1997) por ejemplo muestra que únicamente algunos (como CG-10, Steris Profasi) pueden eliminar el KS mientras que otros (Pregnyl, Choragon, Serono Profasi) no pueden. En segundo lugar, las subunidades recombinantes de (\alpha o \beta hCG tenían actividad eliminadora pero la hCH recombinante intacta, no. También se encontró que el efecto eliminador también se apreciaba con linfocitos. El tratamiento del KS se ha dirigido recientemente al uso de beta-hCG para conseguir su efecto antitumoral (Eur. J. Med Res. 21: 155-158, 1997) y se ha descrito que el fragmento del núcleo beta aislado a partir de la orina tuvo la mayor actividad apoptótica sobre las células del KS (AIDS, 11:, 713-721, 1997). Recientemente, Gallo y cols. describieron la actividad antisarcoma de Kaposi, anti-VIH, anti-VIS y distintos efectos hematopoyéticos de los preparados crudos de grado clínico de gonadotropina coriónica humana (hCG) (Lunardi-Iskandar y cols. 1995, Gill y cols. 1996, Lunardi-Iskandar y cols. 1998). Por el contrario, en otros estudios previos también se reivindicaba que la actividad antitumoral y antivírica de un preparado de hCG no se debe al heterodímero de hCG nativa, que incluye sus subunidades purificadas o su principal producto de degradación, el núcleo \beta; en su lugar, la estructura activa reside en un factor mediado por hCG (HAF) que no ha sido identificado hasta el momento. Sea cual sea el verdadero factor, estos factores no identificados en varios preparados de hCG tienen actividad antitumoral a través de la inducción selectiva de la apoptosis, además de los efectos citotóxicos directos sobre las células tumorales. Además, se ha propuesto que su actividad antitumoral podría no deberse a una respuesta mediada por un mecanismo inmune, ya que no se encontró la infiltración tumoral por células mononucleadas.

Además, el efecto prohematopoyético descrito de la hCG de grado clínico se observó en los estudios clínicos efectuados en personas infectadas por el VIH (Lunardi-Iskandar y cols. 1998), lo que indica que el efecto hematopoyético es indirecto y que se debe al rescate de las células CD4+ que, de lo contrario, serían eliminadas por el VIH, mediante la actividad anti-VIH de la hCG.

La invención proporciona un inmunorregulador o una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune que se puede obtener a partir de un preparado de hCG o una fracción derivada del mismo. Los efectos de dicho inmunorregulador incluyen el efecto de estimulación sobre las poblaciones de linfocitos (como la encontrada en los linfocitos periféricos, los timocitos o los esplenocitos), en lugar de sus efectos citotóxicos o antivíricos. La invención proporciona un método para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune que consiste en someter a un animal a tratamiento con al menos un inmunorregulador que se puede obtener a partir de un mamífero gestante. Dicho tratamiento puede ser directo, por ejemplo el tratamiento puede consistir en proporcionar a dicho individuo una composición farmacéutica, como un preparado con hCG o PMSG, que consiste en un inmunorregulador como el proporcionado por la invención. También es posible proporcionar dicha composición farmacéutica con una fracción o fracciones derivadas de un animal gestante como, por ejemplo, una muestra de orina, suero o placenta (ya sea de origen materno o fetal) u otro tipo de tejido o célula y la preparación de dicho inmunorregulador que consiste en dicho principio activo obtenido a partir de dicha orina o suero o tejido o célula por las técnicas de fraccionamiento conocidas en este campo (por ejemplo, por cromatografía por permeabilidad en gel) y el estudio de este principio activo en la estimulación de un ratón NOD o de sus esplenocitos como se describe. En particular, dicho preparado o componente deriva preferiblemente de un animal gestante, ya que el embrión tiene que sobrevivir a un conflicto inmunológico potencialmente mortal con su madre: el desarrollo como un tejido esencialmente extraño dentro del útero sin desencadenar una respuesta inmune hostil. Por lo tanto, para prevenir este rechazo de "aloinjerto" debe suprimirse la interacción inmunológica entre la madre y el feto, ya sea por ejemplo a través de una ausencia de presentación de los antígenos fetales a los linfocitos maternos o mediante la "supresión" funcional de los linfocitos maternos. Si los antígenos fetales se presentan, las respuestas inmunes maternas deberían desviarse hacia el lado menos dañino, el de la respuesta de células T 2 colaboradoras (Th2) mediada por anticuerpos, lo que sugeriría que una mujer gestante es sensible a sufrir una infección incontrolable, lo que no es el caso. En las mujeres gestantes se mantiene su nivel de resistencia a la infección, o incluso aumenta. Además, mientras que dichas mujeres normalmente son más sensibles a la enfermedad inmune que los varones, especialmente frente a las enfermedades autoinmunes, durante el embarazo son más resistentes a ellas.

La invención también proporciona un método para la estimulación in vitro de linfocitos y la transferencia de dichos linfocitos estimulados como una composición farmacéutica a un animal para el tratamiento de dicho animal por un trastorno mediado por un mecanismo inmune. En una realización en particular de la invención se proporciona una composición farmacéutica que consiste en linfocitos estimulados in vitro con un inmunorregulador proporcionado por la invención.

En una realización preferida de la invención, dicho trastorno consiste en diabetes, aunque también se pueden tratar otros trastornos mediados por un mecanismo inmune, como una inflamación aguda o crónica. En otra realización preferida más, dicho trastorno consiste en sepsis o shock séptico. La invención proporciona un método de tratamiento para un animal, siendo preferiblemente dicho animal un ser humano.

En una realización en particular, la invención se puede usar para regular los índices relativos y la actividad de citocinas o la expresión de las citocinas o la expresión de un marcador de las subpoblaciones de linfocitos en dicho animal, como las subpoblaciones que consisten en células Th1 o Th2, o las células Th3 o Th8, u otras poblaciones de células T efectoras o reguladoras. La invención también proporciona un inmunorregulador para su uso en un método de acuerdo con la invención y el uso de dicho inmunorregulador, que preferiblemente se puede obtener a partir de un mamífero gestante, para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune, preferiblemente seleccionado entre un grupo formado por alergias, enfermedad autoinmune (como lupus eritematoso sistémico o artritis reumatoide), enfermedad relacionada con el trasplante y la enfermedad inflamatoria aguda (como el shock séptico o anafiláctico o el rechazo agudo o hiperagudo de un trasplante) y la enfermedad inflamatoria crónica (como aterosclerosis, diabetes, esclerosis múltiple o rechazo crónico de un trasplante). Además, la invención proporciona un uso de acuerdo con la invención en el cual dicho trastorno mediado por un mecanismo inmune consiste en alergia, como asma o una enfermedad parasitaria, o el uso de acuerdo con la invención en el cual dicho trastorno mediado por un mecanismo inmune consiste en una respuesta inmune demasiado fuerte dirigida frente a un agente infeccioso, como un virus o una bacteria. A menudo, en la mayoría de estas enfermedades se puede encontrar una producción de anticuerpos autorreactivos o linfocitos T autorreactivos que componen o forman parte de una respuesta inmune demasiado fuerte. Este es el caso, por ejemplo, que se ve en una enfermedad parasitaria, donde la producción de IgE es demasiado fuerte o cuando la enfermedad depende de Th2 y es perjudicial para el organismo, pero también con infecciones (mico)bacterianas como TBC o lepra. Una respuesta autoinmune también puede aparecer como una manifestación de una infección vírica o bacteriana y puede dar lugar a un daño tisular grave, por ejemplo, una hepatitis destructiva debida a una infección por el virus de la Hepatitis B, o como el que se ve en las infecciones por el virus de la coriomeningitis linfocitaria (LCMV). Dicha respuesta inmune demasiado fuerte se mantiene en reposo con un inmunorregulador como el proporcionado por la invención. Otro uso más proporcionado por la invención se refiere al tratamiento de las enfermedades vasculares, de manera que se previene o repara el daño por radicales (daño causado por radicales) a las células y tejidos mediante el tratamiento con IR de acuerdo con la invención; de manera que el IR también actúa como antioxidante directa o indirectamente. Por ejemplo, un episodio determinado de la patogenia de diabetes I es la destrucción de las células beta pancreáticas productoras de insulina. Hay datos importantes de que la reducción progresiva de la masa de células beta es el resultado de una reacción autoinmune crónica. Durante este proceso, las células inmunes que infiltran los islotes, las células endoteliales de los capilares de los islotes y las células beta por sí mismas pueden liberar mediadores citotóxicos. Las citocinas y en particular el óxido nítrico (NO) son potentes moléculas efectoras de la toxicidad sobre las células beta. El radical reactivo ON media su efecto perjudicial principalmente a través de la inducción de fragmentaciones difusas de la cadena de ADN, mientras que otros radicales, como el oxígeno, ejercen sus efectos sobre subpoblaciones de linfocitos como las células Th1 y células Th2. Este daño inicial desencadena una serie de episodios que terminan en la muerte de las células beta y la desorganización de la respuesta inmune.

Además, un inmunorregulador de acuerdo con la invención es capaz de regular las interacciones célula-célula inducidas o dirigidas por radicales o las respuestas celulares, específicamente aquellas interacciones o respuestas de naturaleza inmunológica, por ejemplo, las relacionadas con interacciones reguladoras del sistema inmune innato o adaptativo. Sin pretender depender de una teoría, hay dos grupos dentro del sistema inmune: los sistemas innato (inespecífico) y adaptativo (específico), teniendo ambos componentes celulares y humorales. Ejemplos de los componentes celulares del sistema inmune innato son los monocitos, macrófagos, granulocitos, las células NK, las células T, las células T gd etc., mientras que ejemplos de componentes humorales son la lisozima, el complemento, las proteínas de fase aguda y la lectina de unión a manosa (MBL). Los principales componentes celulares del sistema inmune adaptativo son las células T y las células B, mientras que ejemplos de los componentes humorales son los anticuerpos. El sistema adaptativo es el más estudiado debido a su especificidad, eficacia en la eliminación de la infección y presencia exclusiva en organismos multicelulares superiores. El sistema innato se considera, a menudo, primitivo y se cree que no es "sofisticado". Sin embargo, el sistema innato no sólo persiste, sino que también podría desempeñar un papel crítico en uno de los retos inmunes más importantes: la reproducción de los seres vivíparos. El sistema innato instiga una respuesta inmune para procesar y presentar el antígeno asociado a las moléculas de clase I y II del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) a los linfocitos. La respuesta completa requiere a menudo un adyuvante (como una endotoxina), que, a través de la interacción con el sistema inmune innato, produce moléculas coestimuladoras de superficie o citocinas, lo que determina el significado biológico de los antígenos y comunica esta información al sistema adaptativo. De esta manera, instruye al sistema adaptativo para que responda o no. Por lo tanto, estos dos grupos amplios del sistema inmune no sólo influyen el uno en el otro, sino que también se regulan entre sí al menos a nivel celular a través, por ejemplo, de las citocinas y moléculas coestimuladoras, etc.

Hay muchas situaciones fisiológicas y patologías inmunes en las que ambos sistemas están implicados por separado o en combinación. Por ejemplo, se ha demostrado que en el embarazo el sistema inmune innato de la madre sufre una mayor estimulación o por esa teoría se ha propuesto que la diabetes mellitus de tipo II es una enfermedad de un sistema inmune innato hiperactivo crónicamente. Otro ejemplo es la implicación del sistema inmune innato en la listeriosis. La disregulación del sistema inmune adaptativo puede también provocar una enfermedad inmune como la autoinmunidad sistemática o específica de los órganos, alergia, asma etc., pero también puede desempeñar un papel en el mantenimiento del embarazo y en la prevención del rechazo al "aloinjerto".

Como se ha mencionado anteriormente, el sistema adaptativo se ha estudiado más debido a su especificidad, a la eficacia en la eliminación de la infección y a la presencia exclusiva en los organismos multicelulares superiores. Su regulación también es la más estudiada. Por ejemplo, es bien sabido que el microentorno de citocinas desempeña una función clave en la diferenciación de las células T colaboradoras hacia el tipo celular Th1 o Th2 durante las respuestas inmunes. La subpoblación IL-12 induce la diferenciación Th1, mientras que IL-4 conduce la diferenciación Th2. Recientemente se ha demostrado también que las subpoblaciones de células dendríticas (DC1, DC2) proporcionan microentornos diferentes de citocinas que determinan la diferenciación de las células Th1 o de las células Th2. Además, hay un bucle de retroalimentación negativa que procede de las respuestas de las células T colaboradoras maduras que regula también la supervivencia de la subpoblación adecuada de células dendríticas y después inhibe selectivamente las respuestas prolongadas de tipo Th1 o Th2. Además, el desarrollo de las respuestas Th1 puede antagonizarse directamente por la presencia de IL-4 e indirectamente por la IL-10, que inhibe la producción de IL- 12 y del factor de inducción del interferón-g (IGIF) por macrófagos estimulados por la respuesta inmune innata. Se ha sugerido que las células Th2 que dependen de la IL-4 para proliferar y diferenciar están implicadas en las manifestaciones alérgicas y atípicas y además a través de su producción de IL-4 e IL-10 desempeñan un papel en la tolerancia. Específicamente, se ha sugerido que el cambio Th1 a Th2 puede prevenir el desarrollo de patologías autoinmunes específicas del órgano y es necesario para el mantenimiento del embarazo. Recientemente, ha quedado claro que las distintas subpoblaciones de las células T reguladoras son las responsables de regular las respuestas tanto Th1 como Th2 y prevenir el desarrollo de patologías inmunes. Una de las características comunes de muchas de estas células T reguladoras es que su función se debe, al menos en parte, a la acción de TGF-beta, lo que estaría de acuerdo con la capacidad que tiene el TGF-beta para inhibir el desarrollo de Th1 y Th2 mientras que la IL-10 podría inhibir preferentemente la subpoblación Th1 sola.

El crecimiento selectivo de las células Th1 frente a células Th2 depende de la interacción de células Th precursoras con las células presentadoras del antígeno (APC) que transportan el péptido relevante junto a sus moléculas de clase II del MHC. Las citocinas liberadas por las APC y que se presentan durante la interacción inicial entre las células dendríticas y el receptor pertinente de las células T son las que dirigen la diferenciación en subpoblaciones Th1 frente a subpoblaciones Th2. Recientemente, se han descrito en el hombre dos precursores diferentes de DC (mieloide frente a linfoide). El desarrollo selectivo de DC1 a partir de los precursores mieloides se produce después de la estimulación con el ligando CD40 o una endotoxina y da lugar a una producción elevada de IL-12. Los precursores linfoides dan lugar a células DC2 después de la estimulación con el ligando CD40 y producen IL-1, IL-6 e IL-10. Estas citocinas tienen una importancia capital para dirigir el desarrollo de las células Th activadas: se necesita IL-4 para el crecimiento de células de tipo Th2, que puede potenciarse en gran medida por la presencia de IL-10, mientras que la diferenciación a células de tipo Th1 depende exclusivamente de la presencia de IL-12. Como las DC1 se caracterizan por la producción de IL-12, inducirán principalmente el crecimiento de células de tipo Th1, mientras que DC2 produce IL-10 y promueve selectivamente el desarrollo de células Th2 en presencia de IL-4 exógena.

En una realización en particular dicho inmunorregulador consiste en un preparado de hCG o PMSG de grado clínico o una fracción derivada del mismo. Por ejemplo, la invención proporciona el uso de un preparado de hCG, o de un preparado funcionalmente equivalente a él, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de diabetes. En otro ejemplo más, la invención proporciona el uso de un preparado de hCG, o un preparado funcionalmente equivalente al mismo, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de la sepsis o shock séptico. Por ejemplo, la invención proporciona un uso de acuerdo con la invención en el cual dicho tratamiento consiste en regular los índices relativos o la actividad de citocinas de subpoblaciones de linfocitos, por ejemplo las células Th1 o las células Th2 en un individuo tratado.

La invención además proporciona un método para seleccionar un inmunorregulador que consiste en determinar el efecto terapéutico de una fracción inmunorreguladora candidata. A modo de ejemplo se indica un método en el cual para someter a un animal propenso a mostrar signos de diabetes, como un ratón NOD, útil como modelo experimental, a una fracción de orina o una fracción derivada de la misma y determinar posteriormente el desarrollo de diabetes en dicho animal, se selecciona o identifica una fracción inmunorreguladora o un principio activo. En otra realización más, la invención proporciona un método para seleccionar un inmunorregulador que consiste en determinar el efecto terapéutico de un inmunorregulador para someter a un animal propenso a mostrar signos de shock séptico, como un ratón que experimenta el efecto de LPS o de otra toxina, a una fracción de orina o una fracción derivada de la misma para determinar el desarrollo de shock séptico en dicho animal. Preferiblemente, se elige un método de acuerdo con la invención en el cual dicho efecto terapéutico se mide además por la determinación de los índices relativos y/o actividad de citocinas de subpoblaciones de linfocitos en dicho animal, o en el cual dicho efecto terapéutico se mide además por la determinación de las concentraciones de enzimas en dicho animal, o por la medición de otros parámetros clínicos conocidos en este campo, como por ejemplo los que se muestran con detalle en este documento.

Sin querer depender de una teoría, nuestros resultados muestran que el IR tal como se proporciona por la invención es capaz de regular el equilibrio Th1/Th2 in vivo (BALB/c, NOD) e in vitro. En los modelos de fenotipo Th1 dominante, como el ratón NOD, el IR (como el IR-P y sus fracciones) entre otras funciones regula negativamente la producción de IFN-gamma (in vivo/in vitro) y favorece la producción de IL-10 y TGF-beta, opuesta a la producción de IL-4, lo que indica la inducción de células reguladoras como Th3 y Thi por el IR. Estas células reguladoras pueden desempeñar un papel en el efecto terapéutico de IR en las enfermedades inmunes e inflamatorias y en la tolerancia inmune. También hemos demostrado que el IR y sus fracciones pueden inhibir la producción de IFN-gamma in vitro e in vivo excepto para la fracción IR-P3 y rhCG que por separado no muestran una inhibición moderada de la producción de IFN gamma. La combinación de IR-P3 y rhCG consigue una inhibición mayor del IFN-gamma, lo que implica la necesidad de la presencia de IR-P3 para que actúe el rhCG para conseguir al menos la inhibición del IFN-gamma en estos modelos. Esto implica también las células esplénicas estimuladas con anti-CD3 obtenidas a partir de los ratones NOD tratados in vivo y la polarización de las células T colaboradoras hacia el fenotipo Th2.

Además, el IR-P, sus fracciones (IR-P1, IR-P2, IR-P3) y el IR-P3 en combinación con rhCG pueden inhibir el cambio de clase de las células B a IgG2a, mientras que el IR-P2 y rhCG no consiguen moderar la inhibición. Nuestros resultados sobre la producción y proliferación del IFN-gamma demuestran que el IR-P3 solo no tiene un efecto máximo comparado con el IR-P mientras que para la inhibición de IgG2a vemos que el IR-P3 no necesita de la presencia de rhCG para dar los resultados máximos. No obstante, el aumento de producción de IL-10 bajo la influencia de IR-P3 es menor que para el IR-P1, lo que sugiere que para la producción máxima de IL-10, se necesita hCG, un producto de degradación de ella o una subfracción de IR-P1 aún desconocida en combinación con IR-P3. Como el IR-P3 solo ya puede promover la producción de IL-10, no es necesaria ninguna otra fracción o componente para inhibir la producción de IgG2a.

También hemos demostrado que el IR tal como se proporciona por la invención es capaz de inhibir la producción del IFN-gamma y la promoción de IL-10, TGF-beta, IL-4 e IL-6 en el modelo animal de ratones BALB/c (in vitro y también ex vivo). Por lo tanto, está claro que al menos estas citocinas están implicadas en la regulación de las respuestas inmunes por el IR y en la inducción de las células reguladoras. Es importante que el IR promueve la proliferación de las células esplénicas anti-CD3 estimuladas (ex vivo) en ratones BALB/c al contrario de lo que sucede en los ratones NOD. Esto podría reflejar la diferencia en los ratones NOD porque es un modelo de enfermedad autoinmune y el ratón BALB/c es un modelo animal que no tiene una inmunopatología diferenciada. En ambos modelos animales (NOD/BALB/c) el IR promueve la proliferación de LPS estimulada en el bazo (in vitro y ex vivo).

Nuestros experimentos con DC con ratones NOD y ratones BALB/c muestran que el IR no sólo regula las respuestas de las células T, sino que también puede regular la maduración y función de las DC. Las DC que funcionan como un antígeno profesional que procesa las células (APC) y desempeñan un importante papel en la tolerancia inmune. El tratamiento de DC C57B/6 con IR en alo-MLR es capaz de regular negativamente la proliferación de las células T, lo que demuestra que el IR también puede facilitar la inducción de un estado de tolerancia. A partir de estos datos, realizamos un trasplante de piel compatible e incompatible con el MHC (C57BL/6) a receptores (BALB/c) tratados con IR. Nuestros datos demostraron que en el grupo control el aloinjerto (piel) había sido rechazado completamente en un plazo de 15 días, mientras que el injerto de piel de los ratones receptores tratados con IR tres veces fue rechazado después de 21 días. Por lo tanto, el IR es capaz de retrasar el rechazo del injerto. El IR, como se proporciona por la invención, es capaz de inhibir la inmunopatología en numerosos modelos animales para las enfermedades inmunes. El IR inhibe la inmunopatología y los síntomas clínicos en el modelo NOD (de diabetes) y en el modelo EAE (de EM), inhibe el rechazo del aloinjerto y retarda la diabetes inducida por SZT. Nuestros datos también demuestran que el IR tiene efectos sobre diferentes poblaciones de células T, los efectos del IR en las células T y regula el equilibrio Th1/Th2 e induce las células reguladoras que a su vez no sólo regulan únicamente las células T pero también tienen efectos sobre el compartimiento de las células APC. Además, el IR puede regular el compartimiento APC directamente y puede influir en las respuestas inmunes innatas y adaptativas. Al hacerlo así, el IR no sólo puede influir en las enfermedades causadas por el desequilibrio en el sistema inmune adaptativo, pero también puede influir en las enfermedades debidas al desequilibrio del sistema inmune innato o de ambos sistemas. Por ejemplo, es probable que el papel de las citocinas y el sistema inmune innato en la etiología de la diabetes de tipo II sea importante. Recientemente, se ha sugerido que los factores desconocidos como la edad y el exceso de nutrición en los sujetos predispuestos genéticamente o de otro modo provocan un aumento de la secreción de citocinas a partir de las células como macrófagos y una mayor secreción de citocinas a partir de las placas ateroscleróticas. La respuesta de fase aguda inducida por citocinas incluye una dislipidemia característica (elevación de los triglicéridos VLDL y descenso del colesterol HDL) y otros factores de riesgo para aterosclerosis, como fibrinógeno. Las citocinas también actúan sobre las células beta pancreáticas (contribuyendo al deterioro de la secreción de insulina), sobre el tejido adiposo (estimular la liberación de leptina) y sobre el cerebro, la estimulación de una hormona liberadora de corticotropina, ACTH y, en consecuencia, la secreción de cortisol. Esta última puede contribuir a la obesidad central, la hipertensión y la resistencia a la insulina. Una nueva causa de la resistencia a la insulina es la citocina TNF-alfa, que inhibe la actividad tirosina cinasa del receptor de la insulina. Los pacientes con diabetes de tipo II sin complicaciones microvasculares o macrovasculares tienen una respuesta de fase aguda importante pero con complicaciones tisulares debidas al aumento posterior de los reactantes de estrés en la diabetes de tipo II. En los sujetos no diabéticos con aterosclerosis se ha reconocido durante años un "síndrome de estrés hematológico" que consiste en reactantes de fase aguda altos, como fibrinógeno, aumento de la viscosidad sanguínea y aumento del número y actividad de las plaquetas. Las citocinas producidas por el endotelio, las células del músculo liso y los macrófagos de la placa aterosclerótica podrían contribuir a esta respuesta de fase aguda que se ve en la aterosclerosis. Aparte de las proteínas de fase aguda que son factores de riesgo establecidos o posibles para las enfermedades cardiovasculares, como es el caso del fibrinógeno, el amiloide A sérico, el PAI-1, la lipoproteína Lp(a) y los triglicéridos VLDL, las citocinas proinflamatorias producidas en los puntos de complicaciones diabéticas o por el propio proceso diabético también pueden exacerbar la aterosclerosis al actuar sobre el endotelio, las células del músculo liso y los macrófagos. En consecuencia, es probable que haya factores de retroalimentación positivos relacionados con las citocinas y la aterosclerosis, que quizás expliquen la aceleración de la enfermedad arterial en la diabetes. La placa produce citocinas, que después exacerban localmente el proceso de la aterosclerosis pero también causan un aumento de las proteínas de fase aguda circulantes, muchas de las cuales son por sí mismas un factor de riesgo de aterosclerosis. Brevemente, las citocinas y el sistema inmune innato desempeñan un papel central en la fisiopatología de la diabetes de tipo II y en la aterosclerosis. Como el IR tiene la capacidad de regular esta respuesta, también tiene un efecto beneficioso sobre la diabetes de tipo II y la aterosclerosis y sus complicaciones. Además, el IR puede retrasar la inducción de una enfermedad como la diabetes en el modelo de HD-STZ en el que las especies de oxígeno reactivo (ROS) desempeñan un importante papel, por lo que el IR también puede actuar como un antioxidante directa o indirectamente y también es una razón por la que el tratamiento y prevención de la diabetes y enfermedades relacionadas es beneficioso. Además, la invención proporciona un inmunorregulador seleccionado por un método de acuerdo con la invención, una composición farmacéutica que consiste en un inmunorregulador seleccionado de este tipo y el uso de dicho regulador para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune. Las fracciones que contienen IR con actividad biológica se purifican hasta su homogeneidad por cromatografía líquida. El análisis directo por espectrometría de masas combinado con el estudio de la base de datos usando el método MALDI-TOF (matrix assisted laser mass desorption/ionization-time of flight), permite la identificación del IR las fracciones del mismo en complejos multimoleculares. La espectroscopia por resonancia magnética nuclear proporciona información sobre los tipos de unión a los átomos de hidrógeno en el IR y la estructura molecular del IR. La espectroscopia infrarroja y ultravioleta cercana facilita la determinación estructural del IR y el análisis MALDI-TOF y NMR complementa la separación si es necesaria y el posterior secuenciado y síntesis del IR con actividad biológica. La mutagénesis química se utiliza para mutar la composición química del IR, permitiendo un mapeo fino del locus de interacción con el receptor/aceptor para realizar el análisis de unión cualitativo y cuantitativo en los sistemas de detección apropiados, como el sistema de
biosensores.

En los derivados de IR por modificación química o genética se estudió de nuevo la actividad biológica con los métodos mencionados anteriormente u otros que demostraron la actividad de IR o mezclas que contienen IR. Además, la presente invención proporciona la verificación de la presencia de un receptor de IR. Varias fracciones de orina (embarazo), preparados comerciales de hCG o fragmentos de los mismos y hCG recombinante o fragmentos de la misma se añaden a cantidades conocidas de IR. Las mezclas se analizaron por cromatografía por permeabilidad en gel y se compararon con las muestras mencionadas con IR añadido y sin IR. Los desplazamientos de los picos de IR hacia unas fracciones de un peso molecular mayor indican la presencia de un receptor/aceptor. Analizando en las fracciones la actividad IR (después de que el IR se ha desplazado desde el receptor/aceptor) se valida este perfil de elución que contiene los picos desplazados de IR. A partir de la fracción que contiene la actividad desplazada de IR se purifica el receptor/aceptor por cromatografía líquida y se valida la función IR tras el desplazamiento. Además el IR se yoda y se añade a las fracciones de la orina del primer trimestre del embarazo, preparados comerciales de hCG o fragmentos de los mismos y hCG recombinante o fragmentos de la misma y las mezclas se evalúan mediante los sistemas de detección apropiados como SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) bajo condiciones reducidas y no reducidas. Las transferencias de estos geles se analizan por sistemas como el análisis cuantitativo de la imagen de fósforo usando tecnología STORM. El IR se inmoviliza por ejemplo sobre Affigel mediante un conector químico o una proteína transportadora que permite el aislamiento de estructuras de unión mediante la cromatografía de afinidad. La elución posterior proporciona las moléculas purificadas del receptor/aceptor. El receptor/aceptor aislado de las fuentes extracelulares e intracelulares en forma soluble o unido a membrana se inmoviliza sobre una superficie de un biosensor activado. El IR en varias concentraciones se introducirá a continuación sobre esta superficie de sensores y a partir de los perfiles de unión resultantes se determinan las constantes de la velocidad de asociación y de la velocidad de disociación y se calcula la constante de afinidad. Al introducir diferentes mezclas de IR y de receptores/aceptores se evalúa el mapa de epitopos para obtener información sobre la naturaleza del epitopo de unión. El IR se marca (por ejemplo, con fluorescencia y radiactividad) para permitir la detección de los receptores de IR en el enlace de membrana formado para evaluar la expresión celular y la distribución tisular en situaciones no patológicas y en distintos trastornos inmunes y relacionados pertinentes a la actividad del IR. Usando un IR marcado y teniendo disponible el receptor purificado se generan anticuerpos monoclonales y otros reactivos específicos que permiten diseñar un inmunoensayo cuantitativo para la medición de los receptores solubles de IR. La tecnología del ADN recombinante se usa para generar sistemas de expresión procariotas y eucariotas productores de IR. La mutagénesis dirigida al locus se usa para producir variantes del IR con perfiles de unión alterados que permiten la identificación fina del locus de interacción con el receptor/aceptor. Al clonar el gen se generan ratones transgénicos con la expresión constitutiva e inducible del IR, además de ratones deficientes en el gen IR, lo que permite la entrada en el campo de la biotecnología y la terapia génica.

El IR purificado se usa para producir anticuerpos monoclonales u otros reactivos específicos para facilitar el diseño de un inmunoensayo cuantitativo específico del IR. También se aíslan los fragmentos F_{v} monocatenarios usando la tecnología de fagos y una librería de fagos que contiene un repertorio que consiste en un inmenso número de diferentes especificidades.

La invención se explica mejor con la descripción detallada no limitativa que se incluye a continuación.

Descripción detallada Inmunorregulador (IR) Purificación de IR-U a partir de la orina del primer trimestre del embarazo

Método 1

La orina del primer trimestre del embarazo (2 litros) se recogió en un frasco de una voluntaria sana y se refrigeró hasta su envío al laboratorio antes de 2 días. Tras se entrega se añadió 1 gramo por litro de azida sódica y el pH se ajustó a 7,2-7,4 con hidróxido sódico y se dejó sedimentar durante 1 hora (h) a temperatura ambiente (RT). Aproximadamente el 75% del sobrenadante se decantó y el resto cercano al precipitado se centrifugó (10 min a 25000 rpm a 4ºC) para eliminar el sedimento, y se añadió al resto del sobrenadante. El sobrenadante se filtró a través de un equipo de filtración transversal de 0,45 \mum Minitan (Millipore). A continuación, el filtrado (2 litros) se concentró en un equipo de ultrafiltración Amicon dotado con una membrana YM Diopore con un valor umbral de 10 kDa. El volumen final (250 ml) se dializó frente a 2 cambios de 10 litros de agua Milli Q. A continuación, la muestra se concentró aún más con un valor umbral de 10 kDa en un equipo Amicon para ultrafiltración hasta un volumen final de
3 ml.

Permeabilidad en gel: Se usó un sistema Pharmacia de FPLC equipado con una columna Superdex 75 de permeabilidad en gel para analizar la muestra de orina tratada (IR-U) y un preparado comercial de hCG (IR-P) (Pregnyl; Organon; Oss, NL). Las condiciones de ejecución se muestran en otro lugar de este documento:

Purificación de IR-U a partir de la orina del primer trimestre del embarazo

Método 2

Para purificar las fracciones de bajo peso molecular a partir de la orina del primer trimestre del embarazo se desalinizaron directamente 50 m1 de la orina utilizando un sistema de FPLC equipado con FDC®G25 en bicarbonato amónico 50 mM. Las condiciones de ejecución son las siguientes:

0,0	CONC %B	0,0
0,0	ML/MIN	0,50
0,1	ML/MIN	1,00
0,2	ML/MIN	2,00
0,3	ML/MIN	3,00
0,4	ML/MIN	4,00
0,5	ML/MIN	5,00
0,5	CM/MIN	1,00
1,5	VALVE.POS	1,2
1,5	CLEAR DATA
1,5	MONITOR	1
1,5	LEVEL %	2,0
1,5	MIN/MARK	2,0
1,5	INTEGRATE	1
1,8	VALVE.POS	1,1
2,3	PORT.SET	6,1
6,6	FEED TUBE
10,8	PORT.SET	6,0
10,8	INTEGRATE	0
10,8	FEED TUBE
12,8	CONC %B	0,0

Purificación de IR-U a partir de la orina del primer trimestre del embarazo

Método 3

Para analizar el IR-U (en la orina del primer trimestre) obtenido a partir de los métodos 1 y 2 también usamos un sistema Shimadzu de HPLC equipado con una columna Alltech de macrosferas para exclusión por tamaño (GPC) de 60A o 300A (250 x 4,6 mm) en bicarbonato amónico 50 mM. El intervalo de separación de ambas columnas fue de 28.000 - 250 y 1.200.000 - 7.500 Dalton, respectivamente. El volumen de carga de la muestra fue de 10-50 ml. El flujo se ajustó a 0,3 ml/min durante 25 minutos. También se usaron patrones externos para el peso molecular, para calibrar las posiciones de elución de la columna. Los marcadores usados fueron: aprotinina (6.500 Da), citocromo C (12.400), anhidrasa carbónica (29.000), albúmina (66.000) y dextrano azul (2.000.000).

Para analizar mejor el IR se usaron dos preparados distintos de hCG, IR-P (Pregnyl; Organon; OSS, Holanda) e IR-A (APL; Weyth Ayerst; Filadelfia, EE.UU.). El IR-P se separó a continuación por dos métodos. Se usó un sistema Pharmacia de FPLC equipado con una columna Superdex 75 para permeabilidad en gel (HR 5/30) (Pharmacia, Suecia) para analizar el IR-P. Para la ejecución se usó el tampón de bicarbonato amónico 50 mM. El rango de separación de esta columna fue de 100.000 - 3.000 Da para proteínas globulares. El volumen de carga de la muestra fue de 1 ml y el flujo fue de 0,5 ml/min durante 45 min. Además, también se usó Macrosphere GPC 60A (250 X 4,6 mm). Esta columna separa proteínas, péptidos y otras macromoléculas hidrosolubles por cromatografía de exclusión por tamaño. El rango de separación de esta columna fue de 28.000 - 250 Dalton. Se fraccionaron tres áreas seleccionadas,
IR-P1 que se eluye aparentemente con un peso molecular de >10 kDa, IR-P2 que se eluye aparentemente con un peso molecular entre 10 kDa - 1 kDa e IR-P3 que se eluye aparentemente con un peso molecular <1 kDa.

Purificación de IR a partir de una fracción de bajo peso molecular en la orina del primer trimestre del embarazo (IR-U/LMDF) y preparados comerciales de hCG (Pregnyl, APL)

Método 4

Procedimiento: La fracción liofilizada de baja masa molecular (<2 kDa) obtenida a partir de la orina del primer trimestre del embarazo y a partir de preparados comerciales de hCG (Pregnyl, APL) por el método 3 se analizó con más detalle mediante cromatografía de filtración en gel sobre una columna Bio-Gel P-2 (96 x 1,5 cm). La fracción (13-17 mg) se suspendió en agua bidestilada (8-12 ml). El material no se disolvió completamente. El sedimento (8-11 mg) se separó del sobrenadante por centrifugación (Sigma 201, 10 min, 3000 rpm). El sobrenadante (6-8 ml) se fraccionó por cromatografía de filtración en gel sobre una columna BioGel P-2. La columna se eluyó con agua con un flujo de 15 ml/min. La elución se monitorizó con un refractómetro diferencial LKB 2142 y un sistema LKB 2238 Uvicord SII (206 nm). Las fracciones (20 min) se recogieron en un colector de fracciones Pharmacia Frac 100. Las fracciones definitivas se combinaron y liofilizaron y en estas fracciones se estudió posteriormente la actividad antishock.

Permeabilidad en gel: Para analizar la muestra de orina tratada (IR-U) y el preparado comercial de hCG (IR-P) (Pregnyl; Organon; Oss, NL) se usó un sistema Pharmacia de FPLC equipado con una columna Superdex 75 para permeabilidad en gel. Las condiciones de ejecución utilizadas son las que se muestran a continuación:

0,0	CONC %B	0,0
0,0	ML/MIN	0,20
0,5	ML/MIN	0,50
0,5	CM/ML	0,50
0,8	ML/MIN	1,00
0,8	CM/ML	1,00
2,0	CLEAR DATA HOLD
2,0	VALVE.POS	1,2
2,0	MONITOR	1
2,0	LEVEL %	5,0
2,0	ML/MARK	2,0
2,0	INTEGRATE	1
4,0	VALVE.POS	1,1
6,0	PORT.SET	6,1
50,0	INTEGRATE	0
52,0	CONC %B	0,0

Cromatografía por intercambio de aniones: Para una mejor separación de las fracciones superpuestas se usó una columna de 1 ml MONO Q HR 5/5 de FPLC para intercambio aniónico. Las condiciones de ejecución son las que se muestran a continuación y la combinación de tampones consistió en PBS 10 mM, pH 7,3 como el tampón A y PBS con NaCl 1 M como el tampón B:

\newpage

0,0	CONC %B	0,0
0,0	ML/MIN	1,00
0,0	CM/ML	1,00
1,0	ALARM	0,1
1,0	HOLD
1,0	CLEAR DATA
1,0	MONITOR	1
1,0	LEVEL %	5,0
1,0	ML/MARK	2,0
1,0	INTEGRATE	1
1,0	PORT.SET	6,0
1,0	VALVE.POS	1,2
6,0	CONC %B	0,0
6,0	PORT.SET	6,0
11,0	CONC %B	50,0
14,0	CONC %B	50,0
16,0	CONC %B	100
16,0	PORT.SET	6,0
18,0	CONC %B	100
18,0	CONC %B	0,0
18,0	INTEGRATE	0
25,0	CONC %B	0,0

Tratamiento posterior de IR-U e IR-P: Para reducir la unión covalente entre las proteínas que se encuentran en la muestra de orina se trató la orina (IR-U) y la muestra del preparado de hCG (IR-P) con 2-mercaptoetanol 60 mM durante 3 min a 100ºC. A continuación, las muestras tratadas de IR-U e IR-P se aplicaron a una columna Superdex 75 en condiciones de ejecución idénticas.

Determinación de la actividad de las fracciones de FPLC de IR-U: La concentración de proteínas de las fracciones de orina se determinaron con una DO de 280 nm dividida por 1,4. A partir de este valor se calculó la cantidad de unidades de hCG usando 5000 UI/ml de Pregnyl: el preparado de hCG correspondió a 100 \mug.

Los métodos alternativos necesarios para purificar o aislar el IR consisten en filtración en gel, por ejemplo en una columna Superdex 75 en un sistema de FPLC usando PBS con o sin etanol para aumentar la resolución e interrumpir las interacciones hidrofóbicas, seguido opcionalmente por el intercambio catiónico. Las muestras se pueden enviar en forma reducida o no reducida. Otro método consiste en una cromatografía de afinidad con lecitina para separar mejor los carbohidratos que contienen los componentes de los demás componentes, de manera que el efluente se somete después a otra filtración en gel. Desde luego, es posible derivar secuencias (poli)peptídicas de síntesis o recombinantes con métodos que se conocen en este campo, y seleccionar los anticuerpos (de síntesis), es decir, derivados de fagos, para seleccionar mejor el IR.

Experimentos con la enfermedad autoinmune

El ratón diabético no obeso (NOD) es un modelo para una enfermedad autoinmune, en este caso la diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) cuya principal característica es la concentración elevada de glucosa sanguínea (hiperglucemia). Dicha concentración elevada de glucosa sanguínea se debe a la destrucción mediada por un mecanismo inmune de las células \beta de los islotes de Langerhans del páncreas productoras de insulina (Bach y cols. 1991, Atkinson y cols. 1994). Esta destrucción se acompaña por un infiltrado celular masivo que rodea y penetra en los islotes (insulitis) y que está formado por una mezcla heterogénea de linfocitos T CD4+ y CD8+, linfocitos B, macrófagos y células dendríticas (O'Reilly y cols. 1991). La forma más fácil y fiable de detectar el inicio de la diabetes en estos ratones consiste en estudiar las concentraciones de glucosa en sangre.

El ratón NOD representa un modelo en el que la autoinmunidad frente a las células beta es el principal evento en el desarrollo de DMID. En general, los linfocitos T desempeñan un papel central en el inicio del proceso morboso (Sempe y cols. 1991, Miyazaki y cols. 1985, Harada y cols. 1986, Makino y cols. 1986). La diabetogénesis está mediada por una interacción multifactorial entre un gen exclusivo de clase II del MHC y múltiples loci genéticos no ligados entre sí, como en la enfermedad humana. Además, el ratón NOD demuestra elegantemente la interacción crítica entre la herencia y el entorno. Las diferencias existentes entre las condiciones de limpieza del alojamiento ilustran cómo los factores ambientales pueden afectar a la acción de los genes mediadores de la diabetes (Elias y cols. 1994).

En lo que se refiere a la autoinmunidad registrada en los ratones NOD, la mayoría de las respuestas de anticuerpos específicas del antígeno y de las células T se estudiaron después de que estos antígenos se detectasen como autoantígenos en los pacientes diabéticos. Si se comprende el papel que estos autoantígenos desempeñan en la diabetes del ratón NOD se podrá distinguir entre los autoantígenos patógenos y la autoinmunidad como un epifenómeno. Además, habría que tener en cuenta que los pacientes con DMID son genética y patogénicamente heterogéneos.

El estudio histológico longitudinal típico del páncreas de los animales NOD demuestra células infiltrantes que rodean los vasos sanguíneos a las 3-4 semanas de edad, pero los islotes se mantienen claros habitualmente aún a las 6-7 semanas. Las células infiltrantes alcanzan después los islotes, rodeándoles o acumulándose en un polo. Entre 10 y 12 semanas, las células infiltrantes penetran en los islotes, que se inflaman con linfocitos. Como se ha mencionado anteriormente, las diferencias entre las condiciones de alojamiento y los factores microbianos y ambientales pueden afectar a la penetración de los genes de sensibilidad a la diabetes.

En nuestras manos, habitualmente entre 14-17 semanas los ratones NOD se hacían diabéticos. Sin embargo, la edad varía en cada laboratorio (con un promedio de 14-19 semanas) (Elias y cols. 1994). Las células T CD4+ se pueden separar al menos en dos subpoblaciones mayores, Th1 y Th2. Las células Th1 activadas segregan IFN-gamma y TNF-alfa, mientras que las células Th2 producen IL-4, IL-5 e IL-10. Las células Th1 están implicadas críticamente en la generación de la inmunidad celular eficaz, mientras que las células Th2 son el instrumento de la generación de la respuesta inmune y alérgica de tipo humoral y mucosa, como es la activación de los eosinófilos y las células T en la producción de IgE (Abbas y cols. 1996). Varios estudios han demostrado ahora que hay una correlación entre la diabetes en ratones y en el hombre con desarrollo del fenotipo Th1 (Liblau y cols. 1995, Katz y cols. 1995).

Se demuestra que las células T Th2 son relativamente inocuas. Algunos autores han especulado con que las células T Th2 pueden ser, en realidad, protectoras. Pero Katz y cols. han demostrado que la capacidad que tienen las células T CD4+ de transferir la diabetes a receptores vírgenes reside no en la especificidad del antígeno que reconoce el TCR per se, sino en la naturaleza fenotípica de la respuesta de las células T. Las células T Th1 fuertemente polarizadas transfieren la enfermedad a los ratones NOD recién nacidos, mientras que las células T Th2 no lo hacen, a pesar de ser activadas y de llevar igual TCR que la población de células T Th1 diabetogénicas. Además, durante la transferencia simultánea, las células T Th2 podrían no mejorar la diabetes inducida por las células Th1, incluso cuando las células Th2 se transfieren simultáneamente en un exceso de 10 veces (Pakala y cols. 1997).

Las células T polarizadas en Th1 pueden transferir la enfermedad en los ratones NOD recién nacidos, algo que las células T polarizadas en Th2 no pueden hacer, y ambas células T polarizadas en Th1 y Th2 pueden transferir la enfermedad en ratones NOD.scid y otros receptores con compromiso inmune. La diabetes mediada por Th2 en los receptores NOD.scid mostró una fase prediabética más prolongada y una incidencia global menor. Además, la lesión diabética generada por las células Th2 es exclusiva y es bastante improbable encontrarla en los animales diabéticos espontáneamente o en las diabetes inducidas por células T Th1 en ratones recién nacidos o NOD.scid (Pakala y cols. 1997).

Además, el IFN-gamma se corresponde con la diabetes (en los animales NOD y también en el hombre) y el anti-IFN-gamma previene la enfermedad; en condiciones patológicas, las células IFN-gamma+ se presentan en islotes y los clones Th1 específicos del antígeno aceleran el inicio de la diabetes (Pakala y cols. 1997, O'Garra y cols. 1997). Además, las células Th2 únicamente inducen insulitis en los ratones NOD recién nacidos, pero pueden inducir diabetes en los animales NOD.scid con compromiso inmune; además, la enfermedad se puede inhibir mediante anti-IL-10, pero no por anti-IL-4 (Pakala y cols. 1997), lo que sugiere que las células T reguladoras que no son de tipo Th2 se presentan en el ratón normal que están ausentes en los ratones inmunodeficientes. Estos resultados resaltan la existencia de las células que regulan el equilibrio entre las subpoblaciones Th activadas. Los posibles trastornos de este equilibrio inducido por la reactividad alterada de dichas poblaciones de células T reguladoras pueden provocar enfermedades mediadas por un mecanismo inmune, que da lugar a la ausencia o sobreproducción de ciertas citocinas clínicamente importantes (O'Garra y cols. 1997).

Algunas enfermedades autoinmunes, en particular las enfermedades mediadas por Th1, como la artritis reumatoide (RA) (Grossman y cols. 1997, Russel y cols. 1997, Buyon y cols. 1998, Hintzen y cols. 1997) pueden remitir durante el embarazo. Además, el éxito del embarazo es un fenómeno de tipo Th2 (Raghupath y cols. 1997). Estudiamos el preparado de hCG y sus fracciones a partir de Pregnyl [Organon, Oss] en relación con el desarrollo de diabetes en los ratones NOD y en un modelo in vitro.

Sorprendentemente, encontramos que el tratamiento intraperitoneal de los ratones NOD de 15 semanas de edad con un preparado de hCG tres veces por semana durante un mes puede retrasar o inhibir el inicio de la diabetes. Además, la transferencia de las células esplénicas totales a partir de estos ratones NOD tratados a ratones NOD.scid puede retrasar o prevenir la diabetes en los animales NOD.scid mientras que la transferencia de las células esplénicas no tratadas no lo puede hacer. Este efecto antidiabético reside en una fracción que se puede obtener a partir de mujeres gestantes pero no con hCG.

Ratones. Los ratones NOD se alimentaron en nuestras instalaciones bajo condiciones específicas libres de patógenos. La incidencia espontánea de diabetes en nuestra colonia es del 85% en las hembras a las 15 semanas de edad. Los ratones NOD.scid también recibieron los alimentos en nuestras instalaciones en condiciones específicas libres de patógenos. La transferencia de las células diabetogénicas procedentes de los animales NOD a los animales NOD.scid a las 8 semanas de edad induce diabetes después de 22 días.

Diabetes. La diabetes se evaluó midiendo la sangre venosa usando un glucómetro Abbott Medisense Precision Q.I.D. y también monitorizando la glucosuria (Gluketur Test; Boehringer Mannheim, Mannheim; Alemania). Los animales se consideraron diabéticos después de dos mediciones consecutivas de la glucosa mayores de 13,75 mmol/l (250 mg/ dl). El inicio de la diabetes se fechó a partir de la primera lectura consecutiva. Los animales se sacrificaron en caso de una hiperglucemia mantenida de >33 mmol/l para evitar un sufrimiento prolongado.

Inmunohistoquímica. Los ratones se sacrificaron por asfixia con CO_{2}. El páncreas completo se extrajo y se congeló instantáneamente en un compuesto OCT (Tissue-tek) para los criocortes, obteniéndose criocortes de 5-\mum que se secaron al aire y se almacenaron a -20ºC hasta su uso. Los cortes fijados con formol se desparafinaron en xileno y alcohol y se tiñeron con hematoxilina y eosina para estudiar su morfología general. La inmunohistoquímica para insulina se realizó a continuación usando un protocolo de dos pasos. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó y los cortes se incubaron con un antisuero de conejo frente a insulina (Dako Corp., Carpenteria, CA; 1:500 en suero de ratón normal al 5% durante 30 min). Después de los pasos de lavado, la tinción se reveló con Ig anticonejo conjugada con peroxidasa de rábano (Dako; 1:500 en NMS al 5% durante 30 min), se desarrolló con amino-etil-carbazol (AEC; Pierce) durante 10 min y se montó en un montaje de cristal.

Efecto antidiabético in vivo : los ratones NOD de una edad de 15 semanas se trataron con PBS (n= 4), 300 UI de Pregnyl (n= 4), o 600 UI de Pregnyl (n= 4) i.p., 3 veces por semana durante cuatro semanas y la diabetes se evaluó como se mencionó anteriormente. Después de cuatro semanas el tratamiento se interrumpió y el grupo tratado con PBS y 600 UI de Pregnyl se sacrificó después de una semana. El grupo tratado con 300 UI de Pregnyl se dejó vivir hasta la edad de 28 semanas. Transferencia de las células esplénicas. El bazo se extrajo de los animales NOD tratados con 600 UI de Pregnyl y los ratones NOD control tratados con PBS y se recuperaron las células esplénicas totales. Estas células se lavaron dos veces con PBS y 20 x 10^{6} células se transfirieron por vía i.p. a ratones NOD.scid de 8 semanas de edad.

Experimentos de transferencia

Las células esplénicas totales se recuperaron de los ratones NOD de 9 semanas de edad y se estimularon in vitro en RPMI suplementado con FBS al 10% con anti-CD3 recubierto (145-2C11; 25 mg/ml) e IL-2 (50 U/ml) junto a 300 UI/ml de IR-P, 100 mg/ml de IR-U3-5 o de IR-U/LMDF. Las placas se incubaron a continuación a 37ºC con un 5% de CO_{2} en aire durante 48 horas. Después de 48 horas las células se lavaron dos veces con PBS y 20 x 10^{6} células se transfirieron por vía i.p. a un ratón NOD.scid de 8 semanas.

Restimulación in vitro. Las células esplénicas totales (1 x 10^{6} células/ml) procedentes de los ratones NOD de 20 semanas de edad se estimularon en RPMI+ suplementado con un 10% de FBS con LPS (E. coli; 10 \mug/ml) o anti-CD3 recubierto (145-2c11; 25 \mug/ml) con dosis diferentes de hCG-Pregnyl (50, 100, 300, 600, 800 UI/ml), Fracción 1-2 (200 \mug/ml), Fracción 3-5 (200(g/ml), hCG recombinante humana, alfa-hCG y beta-hCG (cada uno de ellos en 200 \mug/ml) en placas de 96 pocillos de fondo plano. Los pocillos con recubrimiento de anti-CD3 se rellenaron con IL-2 (40 UI/ml). Las placas se incubaron a 37ºC en un 5% de CO_{2} en aire durante 48 horas. Después de 48 horas de incubación el sobrenadante se recogió para proceder al análisis de citocinas.

Las células T CD4+ se aislaron a partir de las células esplénicas totales de ratones NOD de 20 semanas de edad y se estimularon como se menciona anteriormente con anti-CD3 en diferentes condiciones. Estos pocillos se rellenaron con IL-2 (40 \mug/ml) y anti-CD28 (10 \mug/ml). Después de 48 horas de incubación el sobrenadante también se recogió para el análisis de citocinas.

Para determinar el efecto del IR sobre el potencial de las células CD4^{-} de diferenciarse en células efectoras productoras de citocinas Th1 o Th2 se realizó el método de polarización Th en presencia o ausencia de IR. Las células esplénicas totales procedentes de hembras NOD de 8 semanas de edad se usaron como fuente para purificar las células CD4+. Las células T CD4+ purificadas a partir del bazo se obtuvieron mediante la selección negativa debido a la depleción del complemento con anticuerpos específicos para células B, células NK, monocitos/macrófagos y granulocitos. Las células se purificaron a continuación usando células activadas por métodos magnéticos mezcladas con un cóctel de mAb biotinilados frente a CD11b, B220, CD8 y CD40, seguido por la incubación con microesferas conjugadas con estreptavidina (Milteny Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania). Las células CD4+ usadas para los experimentos se purificaron siempre al 90-95%, determinado mediante citometría de flujo. Para la estimulación primaria, las células T CD4+ purificadas se cultivaron en 1 x 10^{5} células/pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano (Nalge Nunc Int., Naperville, IL, USA) y se estimularon con mAb anti-CD3 ligado en la placa (145-2C11, 25 mg/ml), anti-CD28 e IL-2 (50 U/ml). Para la diferenciación de células Th1 se añadió mAb anti-IL-4 (11B11; 10 mg/ml) e IL-12 (10 ng/ml) a los cultivos. El cebado para las células Th2 se efectuó con IL-4 (35 ng/ml) y con el mAb anti-IFN-g (XMG 1.2; 5 mg/ml). Además, en las condiciones de cebado Th1 y Th2, también se añadieron 300 UI/ml de IR-P y 100 mg/ml de IR-U/LMDF en presencia o ausencia de bloqueo anti-IL-10 (10 mg/ml), anti-TGF-b (10 mg/ml) y Vit-D3 (10 mg/ml). Los cultivos no cebados contenían únicamente anti-CD3, anti-CD28 e IL-2. Todas las dosis se optimizaron en los experimentos preliminares. Después de 4 días de cultivo, las células se lavaron 3 veces y se transfirieron a nuevas placas de 96 pocillos recubiertos con anti-CD3 y se volvieron a estimular en presencia de IL-2 (50 U/ml) y anti-CD28 (10 mg/ml). Cuarenta y ocho horas más tarde se recogieron los sobrenadantes y se determinó en ellos IL-4, IFN-gamma y la producción de IL-10 por ELISA como una lectura de la polarización Th1 frente a la polarización
Th2.

Experimento con citocinas ex vivo en ratones NOD

En los roedores, el cambio en la producción de anticuerpos a partir de IgM a IgG y otras clases parece estar principalmente bajo el control de las células T mediado por citocinas. La polarización Th1 dominante media el cambio de las células B de la producción de IgM a la producción de IgG2a bajo la influencia de la producción masiva de IFN-gamma, mientras que la polarización Th2 induce el cambio del isotipo en las células B para la producción de IgG1. Tratamos a los ratones NOD de 8-10 semanas de edad con PBS (n= 5) o IR-P y sus fracciones IR-P1, IR-P2, IR-P3, o hCG recombinante (rhCG) y rhCG en combinación con IR-P3, cada uno de ellos con 200 mg por vía i.p. durante tres días. Las células esplénicas totales se aislaron a partir de todos los grupos y se estimularon con LPS o con anti-CD3 recubierto, como se menciona anteriormente. En distintos tiempos se midieron las citocinas y la proliferación como sigue: proliferación estimulada con anti-CD3(t= 12, 24, 48 h), IFN-gamma estimulado con anti-CD3 (t= 24, 30, 48 h) y producción de IgG2a estimulada con LPS (t= 7 días). Para determinar el efecto del tratamiento con IR sobre la polarización Th1 aislamos las células CD4+ y realizamos los métodos de polarización Thl como se ha mencionado anteriormente.

Experimentos con ratones BALB/c

Para separar la actividad inmune-modular de IR de sus efectos clínicos beneficiosos, tratamos a los ratones BALB/c sanos por vía i.p. con 300 UI de IR-P o 100 mg/ml de IR-U/LMDF (n= 5). En general, se considera que esta cepa reacciona tras la estimulación con una respuesta inmune provocada por Th2. Después de cuatro días de tratamiento con IR las células CD4+ esplénicas purificadas a partir de los ratones control y tratados con IR-P se analizaron mediante la polarización Th como se ha mencionado anteriormente. Para determinar el efecto del IR-P sobre las concentraciones de citocina producidas por las pacientes esplénicas, las células esplénicas procedentes de los ratones BALB/c control y tratados con IR-P se estimularon in vitro con LPS (E. coli 026:B6; 10 mg/ml, Difco Laboratories, Detroit Mi, USA). Después de 48 horas de incubación se recuperaron los sobrenadantes para el análisis de citocinas (IL-12p70, IL-6).

Experimento con ratones carentes de IL-10

Para determinar el efecto in vivo del IR-P en ratones génicos IL-10 (IL-1 10 KO), tratamos dichos ratones (n= 2) por vía i.p. con 300 UI de IR-P/día durante 4 días consecutivos. Después de 4 días de tratamiento se extrajeron las células del bazo y los ganglios linfáticos y se estudió en ellas su capacidad para proliferar en respuesta al LPS y anti-CD3. Además, las células CD4+ se purificaron a partir de los ratones control y tratados con IR-P y se analizó en ellas su potencial de polarización Th como se ha mencionado anteriormente.

Suspensiones de células de médula ósea de ratones NOD

Para determinar los efectos inducidos por el IR sobre las células dentríticas (DC) derivadas de la médula ósea (BM), se aisló la BM de ratones NOD hembra de 9 semanas de edad (n= 2) y se incubó con 20 ng/ml de GM-CSF (2,0 x 10^{5} células/ml) durante 6 días y en el día 7 se cultivaron junto a 300 UI/ml de IR-P o 100 mg/ml de IR-U (IR-U, IR-U-F3-5 [derivada de superdex 75], o IR-U/LMDF [derivada de FDC]) durante otras 24 horas. Brevemente, los fémures y tibias se limpiaron de músculos y tendones y se trituraron en un mortero con DBSS-FCS. Las suspensiones celulares simples se obtuvieron por aspiración a través de una aguja de calibre 22 con una jeringa de 2 ml, seguida por el tamizado de la suspensión celular dos veces sobre filtros de nailon (tamaño de malla 100 y 30 mm, respectivamente; Polimon PES, Kabel, Amsterdam, Países Bajos). Además, para saber si el IR también tiene efectos sobre la maduración de las DC, la BM de los ratones NOD también se cultivó directamente con GM-CSF e IR durante 7 días. En el día 8 todas las células se analizaron con un citómetro de flujo para determinar la expresión de los siguientes marcadores: CD1d, CD11c, CD14, CD31, CD40, CD43, CD80, CD86, CD95, ER-MP20, ER-MP58, F4/80, E-cad, MHC II,
MHC I y RB6 8C5.

Se realizó un experimento similar con las células de BM procedentes de ratones BALB/c hembra de 9 semanas de edad (n= 3).

Reacción de los linfocitos alo-mezclados (MLR)

Para estudiar la actividad inmunosupresora del IR sobre el rechazo del trasplante, realizamos un alo-MLR. Las células de BM procedentes de ratones BALB/c hembra de 9 semanas de edad (n= 3) se aislaron como se ha comentado anteriormente con rmGM-CSF (recombinante de ratón) (20 ng/ml) e IR (IR-P; 300 UI/ml, IR-U; 300 mg/ml, IR-U3-5; 300 mg/ml, IR-U/LMDF; 300 mg/ml) durante 7 días. Después de 7 días las DC generadas se irradiaron (2.000 rad) y cultivaron junto a células esplénicas CD3+ aisladas a partir de hembras C57BL6/Ly de 9 semanas de edad. Estas células CD3+ y DC se cultivaron con distintas relaciones y se midió la proliferación de las células T mediante la incorporación de [^{3}H]TdR (0,5 mCi/pocillo durante las últimas 16 horas de cultivo).

ELISA de citocinas. La IL-4 se detectó usando un anticuerpo monoclonal anti-IL-4 (11B11) como el anticuerpo de captura y se reveló con anticuerpo monoclonal de rata anti-IL-4 de ratón conjugado y biotinilado (BVD6 24G2.3). El IFN-gamma se detectó usando anticuerpo monoclonal anti-IFN-gamma (XMG1.2) como el anticuerpo de captura y se reveló con anticuerpo monoclonal de rata anti-IFN-gamma de ratón conjugado y biotinilado (R46A2). En ambos casos, para la detección se usó el sustrato ABTS.

Las microplacas de fondo plano (96 pocillos, Falcon 3912, Microtest II Flexible Assay Plate, Becton Dickinson, Oxnard, USA) se recubrieron con anticuerpos de captura específicos de citocinas para IL-6, IL-10, IL-4 e IFN-gamma diluido en PBS (1 mg/ml de 20F3 y SXC-1; 5 mg/ml de 11B11 y XMG1.2, respectivamente) a 4ºC durante 18 horas. Después de recubrirlas, las placas se lavaron (PBS, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20) y se bloquearon con PBS suplementado con BSA al 1% a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado, las muestras y los patrones se añadieron y la incubación continuó al menos durante 4 horas a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron y se añadieron anticuerpos biotinilados de detección (1 mg/ml de 32C11 (IL-6) y R46A2 (IFN-g); 0,1 mg/ml de 2A5.1 (IL-10) y BVD6.24G2 (IL-4)) y se incubaron toda la noche a 4ºC. Después del lavado, se añadió estreptavidina peroxidasa (diluido 1/1500, Jackson Inmunoresearch, West Grove, PA, USA). Después de 1 hora las placas se lavaron y la reacción se visualizó usando ácido 2,2'-azino-bis-3-etilbenz-tiazolina-6-sulfónico (ABTS, 1 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO, USA). La densidad óptica se midió a 414 nm, usando un Titertek Multiscan (Flow Labs, Redwood City, USA). Las cantidades de IL-12p70, TNF-alfa y TGF-b se midieron con kits ELISA comerciales (Genzime Corp, Cambridge, MA) de acuerdo a los protocolos proporcionados por el fabricante.

Experimentos en sepsis o shock séptico

Hay tres modelos en ratón que se usaron para investigar la sepsis o el shock séptico: LPS en dosis altas, LPS en dosis bajas con sensibilización con D-Galactosamina y superantígeno en dosis bajas con D-Galactosamina.

Uno de los primeros modelos usados para investigar la sepsis o el shock séptico incluyó tratamientos con dosis más bien grandes de LPS en la cavidad interperitoneal (entre 300-1200 \mug). Los ratones son bastantes resistentes a las toxinas bacterianas, aunque sucumben ante dosis altas. Se ha sugerido que una dosis alta de LPS en ratones podría correlacionarse con una dosis más baja en el hombre (Mietheke y cols.) Aproximadamente el 70% de los casos de sepsis o shock séptico en el hombre están causados por endotoxinas de bacterias gramnegativas y hasta un 30% se deben a exotoxinas liberadas a partir de bacterias grampositivas. El lipopolisacárido tradicional distintivo de la endotoxina (LPS) que se asocia con la membrana celular de los microorganismos gramnegativos representa el iniciador más frecuente de la cascada patogénica de la sepsis o shock séptico. La molécula de endotoxina consiste en un núcleo exterior que tiene una serie de oligosacáridos que son antigénica y estructuralmente diferentes, un núcleo interno de oligosacáridos que tiene similitudes entre las bacterias gramnegativas habituales y un núcleo lipídico A muy conservado entre las especies bacterianas. El lípido A es responsable de muchas de las propiedades tóxicas de la endotoxina. Los efectos sistémicos de las endotoxinas, como los de los LPS, parecen estar mediados en gran medida por los macrófagos, ya que la transferencia adaptativa de los macrófagos sensibles a endotoxina hace que los ratones previamente resistentes a la endotoxina se vuelvan sensibles a la toxina (Freudenberg y cols. 1986).

El modelo usado más comúnmente de endotoxina en la sepsis o shock séptico aprovecha la mayor susceptibilidad de los ratones BALB/c a las dosis bajas de LPS después de ser tratados simultáneamente con Galactosamina (sensibilizados con D-Gal). Este tratamiento con D-Gal sensibiliza de forma espectacular a los animales ante el efecto tóxico de LPS, por lo que cantidades de nanogramos inducen una toxina hepática que es letal para los animales de tipo salvaje en un periodo de 6-7 h. Estos efectos sistémicos de la endotoxina parecen estar mediados principalmente por los macrófagos (Gutierrez-Ramos y cols. 1997). Aunque es indudable que algunos mediadores son más importantes que otros en la producción de la sepsis, es probable que haya docenas de factores derivados del microorganismo y del huésped que interaccionen y se aceleren e inhiben entre sí, siendo responsables de la patogenia de la sepsis o del shock séptico.

Con respecto a la respuesta a LPS, TNF y otros mediadores, las células endoteliales y los macrófagos pueden liberar un potente agente vasodilatador, el factor relajante derivado del endotelio (EDRF), que recientemente se ha identificado como óxido nítrico. Esta molécula causa la relajación del músculo liso y una vasodilatación potente. La inhibición de la producción de óxido nítrico con inhibidores competitivos de la sintasa del óxido nítrico da lugar a un aumento de la tensión arterial en animales con shock por endotoxinas, lo que sugiere que el óxido nítrico puede ser responsable de parte de la hipotensión que se asocia con la sepsis. Aunque la inhibición del óxido nítrico restaura la tensión arterial, dicha inhibición puede reducir el flujo sanguíneo tisular (Bennett y cols.).

La endotoxina también puede activar la cascada del complemento, habitualmente por la vía alternativa. Con ello se produce la liberación de las anafilotoxinas C3a y C5a, lo que puede inducir una vasodilatación. El aumento de la permeabilidad vascular, la agregación plaquetaria, la activación y agregación de neutrófilos. Estos mediadores derivados del complemento pueden ser los responsables de parte de las alteraciones microvasculares asociadas a la sepsis o el shock séptico. Además, la endotoxina puede dar lugar a la liberación de bradicinina mediante la activación del factor XII (factor de Hageman), calicreína y cininógeno. La bradicinina también es un vasodilatador y agente hipotensor potente. La activación por LPS del factor XII también provoca la activación de la vía de la coagulación intrínseca y (a través de los macrófagos y células del endotelio que liberan el factor tisular) también de la extrínseca. Ello da lugar al consumo de los factores de coagulación y DIC. El TNF también activa la vía extrínseca y puede contribuir a estas anomalías de la coagulación.

También se sabe que los diferentes productos del metabolismo de la cascada del ácido araquidónico provocan vasodilatación (prostaciclinas), vasoconstricción (tromboxanos), agregación plaquetaria o activación de los neutrófilos. En los animales de experimentación la inhibición de la ciclooxigenasa o de la tromboxano sintasa ha protegido frente al shock por endotoxinas. En los pacientes con sepsis se encuentran concentraciones elevadas de tromboxano B2 (TBX2) y 6-cetoprostaglandina F1 (el producto final del metabolismo de la prostaciclina). Varias citocinas pueden provocar la liberación de estos metabolitos del ácido araquidónico a partir de las células endoteliales o los leucocitos.

De forma similar, en el modelo de shock por exotoxina los ratones BALB/c sensibilizados con D-Gal reciben tratamiento con dosis bajas de TSST-1 o SEB. Estos superantígenos estimulan la proliferación y activación de una gran proporción de células T. En realidad, la activación de las células T inducida por estos superantígenos puede contemplarse casi siempre como una activación policlonal de células T en la que las células T expresan una familia V-beta específica que se activan mediante la unión a un antígeno inespecífico de TCR/MHCII/ y un superantígeno (Figura 14).

Se ha demostrado que D-Galactosamina es un inhibidor de la trascripción que se dirige al hígado, interfiriendo con la síntesis de proteínas de fase aguda. Se cree que estas proteínas de fase aguda en realidad ayudan al hígado a desintoxicar o desactivar el TNF\alpha. En realidad, el tratamiento con D-Galactosamina en los modelos de endotoxina o exotoxina en dosis bajas se acompaña por una apoptosis hepática mediada por TNF\alpha. El tratamiento con D-Galactosamina solo no da lugar a apoptosis hepática y estos efectos perjudiciales sobre los órganos se pueden neutralizar en ambos modelos con dosis bajas, al neutralizar los anticuerpos anti-TNF\alpha (Gutierrez-Ramos y cols. 1997).

Ratones usados en los experimentos en sepsis o shock séptico: En todos los experimentos se usaron ratones hembra BALB/c y SJL entre 8-12 semanas de edad. Los animales recibieron el alimento en nuestras instalaciones bajo condiciones específicas libres de patógenos de acuerdo a los protocolos descritos en el Informe del grupo de trabajo de las European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) sobre Salud Animal (Laboratory Animals 28: 1-24, 1994).

Protocolos de inyección: el del shock tóxico (TSST-1 y D-Galactosamina) (n= 6).

Para el modelo de exotoxina, se inyectó a los ratones BALB/c con 20 mg de D-Galactosamina disueltos en 100 \mul de solución salina estéril (9%) por vía intraperitoneal. A continuación recibieron 4 \mug de TSST-1 disueltos en 100 \mul de solución salina estéril (9%) inyectados por vía subcutánea en dos puntos aproximadamente 0,5 cm por debajo de cada escápula. Los grupos control recibieron la inyección de 4 \mug de TSST-1 por vía subcutánea sin D-Galactosamina, o tratamiento con D-Galactosamina sola.

Un grupo de ratones BALB/c sensibilizados con D-Galactosamina también recibieron tratamiento previo por vía i.p. con 700 UI de IR-P durante 3 días antes del tratamiento con TSST-1.

Modelo LPS (n= 6)

Para el modelo de endotoxina, los ratones BALB/c y SJL recibieron tratamiento por vía i.p. con 600 \mug de LPS. El grupo control recibió tratamiento únicamente con PBS por vía i.p. Para estudiar el efecto del IR-P los ratones BALB/c y SJL también recibieron un pretratamiento con 700 UI durante 3 días y a continuación se inyectaron con 600 \mug de LPS. Además, un grupo de ratones BALB/c también recibió pretratamiento con fracciones de IR-U (IR-U1, IR-U2, IR-U3-5), cada vez con las mismas dosis de 200 \mug por vía i.p. durante 3 días y a continuación una inyección de 600 \mug de LPS.

Para estudiar la fracción de bajo peso molecular estudiamos el IR-U/LMDF (que también contiene la fracción IR-U5 [<10 Kda]), IR-P3 (obtenido por el método 3), IR-A e IR-A3 (obtenidos por el método 3) y sus fracciones obtenidas por el método 4 para determinar la actividad antishock. Además, estudiamos también la actividad antishock de tres fracciones procedentes de la columna peptídica (F1-3) (los métodos se muestran en otra parte de este mismo documento). También tratamos ratones BALB/c con 700 UI de IR-P dos veces por vía i.p. después de 1 y 2 horas de la inyección con LPS, respectivamente.

Mediciones semicuantitativas de la enfermedad: se puntuaron los niveles de enfermedad en los ratones utilizando la siguiente escala de medición:

1. Pelaje difuso, pero sin diferencias detectables en la conducta con respecto a los ratones normales.

2. Pelaje difuso, reflejo de acurrucamiento, responden a estímulos (como al golpear sobre la jaula), igual de activo cuando se manipula a un ratón sano.

3. Respuesta más lenta al golpear sobre la jaula, pasivo o dócil durante la manipulación pero aún curioso cuando está solo en un entorno nuevo.

4. Falta de curiosidad, escasa o nula respuesta ante los estímulos; bastante inmóvil.

5. Respiración laboriosa, incapacidad o lentitud para ponerse derecho por sí solo después de enrollarlo sobre la espalda (moribundo, sacrificado).

Recuentos de leucocitos y plaquetas: se obtuvieron 100 \mul de sangre a partir de 2 ratones seleccionados al azar en cada grupo, utilizando para ello el sangrado de la cola a las 24 horas en el modelo TSST-1. Se extrajo la sangre total en tubos con EDTA y se analizó en un analizador automático de hematología.

Datos sobre el shock

Animales y tratamientos: en este estudio se usaron los ratones hembra BALB/c de 8-10 semanas obtenidos en Harlan. Los animales se sacrificaron y los hígados y bazos se escindieron para un estudio más detallado como se indica a continuación. La manipulación de los animales y los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las normas de la American Association of Accreditation of Laboratory Animal Care para cuidados y uso de los animales.

Protocolos de inyección: se administró LPS procedente de Escherichia coli (Sigma Chemical Co) por vía intraperitoneal en dosis de 150 mg/kg en el modelo de shock por LPS en dosis altas. Para estudiar el efecto del IR los ratones recibieron un pretratamiento con IR-P (Pregnyl; Organon; Oss, Países Bajos) y sus fracciones, IR-P1, IR-P2, IR-P3 y con IR-A3 (APL; Wyeth Ayerst, Filadelfia, PA, USA) durante 3 días (t = -3, t = -2, t = -1), recibiendo cada uno de ellos la misma dosis de 200 mg por vía i.p. y a continuación se inyectó el LPS en t= 0 h. Un grupo de ratones también recibió tratamiento con IR-P o dexametasona dos veces por vía i.p. después de 1 y 2 horas de la inyección de LPS, respectivamente.

Análisis de sangre: En cada grupo se extrajo la sangre por sangrado de la cola en 3 ratones en cada tiempo (t= -72 h, -1 h y 48 h) y se combinó para la medición habitual de leucocitos, plaquetas, enzimas plasmáticas, LDH, ALAT y ASAT. Los ratones se sacrificaron a continuación y se extrajeron el hígado y el bazo como se indica a continuación.

Modelo de trasplante

Animales y tratamiento: para determinar si el IR-P es capaz de proteger el aloinjerto, tratamos a los ratones BALB/c (n= 5) con 600 UI de IR-P/día por vía i.p. o PBS durante dos días. En el día 3 se inyectó piel de la cola de donantes C57BL/6 en la parte dorsal del tórax de los ratones BALB/c tratados con IR-P o PBS usando una modificación del método de Billingham y Medawar. Los injertos se consideraban rechazados cuando no había piel o pelo viable detectable del donante. Después del trasplante, los ratones BALB/c receptores pretratados con IR-P recibieron tratamiento durante otros dos días.

Modelo EAE (MS)

Inducción de EAE. Los ratones hembra SJL de 8-12 semanas de edad (n= 5) fueron inmunizados por vía s.c. con 50 ml (0,5 mg/ml) de péptido PLP en cuatro lugares diferentes (t= 0). Después de 24 horas se inyectaron 10^{10} células de Bordetella pertussis por vía i.v. en la cola. A continuación, después de 72 (t= 3) horas los ratones fueron inmunizados de nuevo con Bordetella pertussis. A partir del día 7 los ratones se pesaron y los signos clínicos de EAE se puntuaron cada día sobre una escala de 0 a 5 de la siguiente forma:

Puntuación del EAE	Síntomas
0	Sin signos
0,5	Paresia o parálisis parcial de la cola
1	Parálisis completa de la cola
2	Paraparesia; debilidad de la pata delantera y parálisis de la cola
2,5	Parálisis parcial de la pata delantera

(Continuación)

Puntuación del EAE	Síntomas
3	Parálisis completa de la pata trasera o de la pata delantera
3,5	Paraplejia
4	Quadriplejia
5	Muerte

Tratamiento con IR: Un grupo de ratones también recibió tratamiento desde el día 8 con 600 UI de IR-P/día por vía i.p. tres veces por semana durante dos semanas, mientras que el grupo control recibió tratamiento con el mismo volumen de PBS.

Modelo de estreptozotocina

Inyecciones de estreptozotocina. En el modelo de dosis múltiples de estreptozotocina (MD-STZ) se disolvieron 25 mg/kg de STZ (Sigma) en tampón citrato (pH 4,2) y se inyectaron por vía intraperitoneal antes de 5 min de su solubilización como se ha descrito previamente. Los ratones macho recibieron una inyección durante 5 días consecutivos (experimento del día 1 al día 5) a las 6-9 semanas de edad. Después de 5 días consecutivos de tratamiento con STZ los ratones recibieron tratamiento con IR-P (600 UI por vía i.p.) (n= 5) o tampón citrato (n= 5) cuatro veces por semana durante tres semanas. En el modelo de estreptozotocina en dosis altas (HD-STZ) la hiperglucemia se indujo en los ratones por una sola inyección intraperitoneal de estreptozotocina (160 mg/kg). Los ratones del grupo control recibieron un volumen correspondiente del tampón citrato solo.

Resultados Preparación e identificación de la fracción de hCG

Se realizó una filtración en gel de la solución de 1 ó 2 viales de hCG-Pregnyl de grado comercial (5000 UI/vial) utilizando un sistema Pharmacia FPLC equipado con una columna Superdex 75 (HR 5/30) (Pharmacia, Suecia) en PBS. El volumen de carga de la muestra fue de 1 ml. El flujo fue de 0,5 ml/min durante 45 min y después de implantó un flujo de 0,2 ml/min durante 1 minuto debido a la viscosidad de la solución de hCG de grado comercial que tiene un alto contenido de lactosa. En el preparado de Pregnyl relativamente purificado se encontró hCG y una cantidad muy baja del fragmento nuclear de hCG, y sus posiciones se usaron como marcadores internos del tamaño. La hCG se eluyó como una molécula de 78 kDa y el núcleo beta de la hCG se eluyó como moléculas de 19 kDa en la filtración en gel. Se recogieron 1-5 fracciones de manera que las fracciones 1-2 contenían hCG y la fracción 5 contenía los fragmentos del núcleo beta de hCG. En las fracciones 1-2 y en las fracciones 3-5 se estudió el efecto antidiabético tratando las células esplénicas totales in vitro de ratones NOD de 20 semanas y se transfirieron a ratones NOD.scid. De esta misma forma se estudiaron también la hCG recombinante humana, la alfa-hCG y la beta-hCG (Sigma, St. Louis, MO.USA).

Permeabilidad en gel de IR-U e IR-P

La Figura 15 representa un cromatograma de FPLC de 50 \mul de una muestra de IR-U sin diluir. El tampón de ejecución fue PBS. El cromatograma indica 4 picos principales de 70, 37, 15 y 10 kDa. Para identificar estos picos se aplicó una muestra de 500 \mul (que contiene 5000 UI) de IR-P (Pregynl) en la misma columna en condiciones de ejecución similares. Los perfiles obtenidos (Figura 16) mostraron también estos 4 picos aunque sus relaciones fueron diferentes. El pico de la fracción 2 representa el heterodímero (alfa/beta) de hCG (37 kDa) mientras que la fracción 3 representa las cadenas individuales, los homodímeros de estas cadenas o las cadenas residuales del núcleo beta y otras moléculas (15-30 kDa). A partir de estos resultados concluimos que la orina del primer trimestre contiene las mismas 4 fracciones mayores de proteínas que también se presentan en el preparado comercial de hCG, como sería de esperar. Las fracciones recibieron el nombre de (IR-P1, IR-P2, IR3-5 [combinados]), (IR-Ul, IR-U2, IR-U3-5 [combinados]). La fracción 5 no contiene proteínas o contiene proteínas menores de 10 kDa. Además se ve la superposición de las fracciones 2 y 3 en IR-P y en IR-U, lo que sugirió una unión covalente de las proteínas en estas fracciones.

Cromatografía por intercambio de aniones y tratamiento posterior de IR-U e IR-P

Se efectuó una nueva separación de las fracciones 2 y 3 superpuestas en una columna de intercambio de aniones MONO Q HR 5/5 de 1 ml. La Figura 17 representa un cromatograma de una muestra de 50 \mul de IR-U diluida 1:20 en PBS. Se eluyeron dos picos de proteínas mayores con un 43% y un 55% el tampón B pero no se separaron, lo que sugirió la unión covalente entre estas especies de proteínas. La separación de ambos picos no se pudo conseguir incluso al usar un gradiente de elución discontinua con un 50% del tampón B fijo (datos no presentados). Por lo tanto; concluimos que la cromatografía por intercambio de iones no podría usarse para la purificación posterior debido a la unión covalente de las proteínas que se encuentran en la muestra de la orina.

Para reducir la unión covalente que se sospechaba entre las proteínas importantes mencionadas en la muestra de IR-U, tratamos la muestra con 2-mercaptoetanol 6 mM durante 3 min a 100ºC y la muestra se aplicó a continuación en una columna Superdex 75 en condiciones idénticas. La Figura 18 representa el perfil de elución en el que se demuestra que el pico 1 (70 kDa) sigue presente (ver también la Figura 15-17), la fracción 2 (que representa la hCG, 37 kDa) casi desapareció y dio lugar a dos picos nuevos de bajo peso molecular (<10 kDa). El pico 3 se mantuvo y por lo tanto es probable que contenga el exceso del núcleo beta aislado y proteínas monoméricas. El pico 4 (10 kDa) también desapareció debido al tratamiento reducido.

Se aplicó un tratamiento reducido similar a la muestra de IR-P (Pregnyl). Como el perfil de la muestra de IR-U también se trató, la hCG (Figura 19) mostró el descenso del pico 2, el aumento del pico 3 y la aparición del pico de una proteína nueva entre los picos 1 y 2. Además, fue evidente un aumento de los productos de fragmentación del pico (<10 kDa).

Experimentos de transferencia

Las células esplénicas totales se recuperaron a partir de ratones NOD de 9 semanas de edad y se estimularon in vitro en RPMI+ suplementado FBS al 10% con anti-CD3 recubierto (145-2c11; 25 mg/ml) e IL-2 (50 U/ml) junto a 300 UI/ml de IR-P, 100 mg/ml de IR-U3-5 o IR-U/LMDF. Las placas se incubaron a continuación a 37ºC en un 5% de CO_{2} en aire durante 48 horas. Después de 48 horas las células se lavaron dos veces con PBS y se transfirieron 20 x 10^{6} células por vía i.p. a un ratón NOD.scid de 8 semanas de edad.

Efecto antidiabético in vivo de IR: cuatro ratones hembra NOD de 15 semanas (n= 4) recibieron tratamiento con PBS, 300 UI de Pregnyl; o 600 UI de Pregnyl por vía intraperitoneal, 3 veces por semana durante cuatro semanas. Después del tratamiento todos los ratones del grupo PBS fueron diabéticos (glucosa sanguínea >33 mmol/I), perdieron peso y parecían incómodos, mientras que los grupos tratados con 300 UI de Pregnyl y 600 UI de Pregnyl se mantuvieron libres de la enfermedad. Sus concentraciones de glucosa sanguínea nunca excedieron los 6 mmol/l y parecieron muy sanos (Figura 1 y 3). Para evaluar la posible infiltración o si las células productoras de insulina en el páncreas se mantenían intactas, los ratones de los grupos PBS y 600 UI de Pregnyl se sacrificaron después del tratamiento y se extrajeron los páncreas enteros para el estudio inmunohistoquímico de insulina. Los cortes de páncreas procedentes del grupo PBS mostraron muchas células infiltrantes en el páncreas, que penetraban en los islotes. También se apreció un gran número de linfocitos B y linfocitos T presentes en el páncreas de los animales del grupo PBS. Este resultado fue compatible con nuestros resultados sobre un cociente elevado de células CD8/CD4 en el bazo, debido a la reducción selectiva del número de células CD4+ y al descenso del número de linfocitos B en el bazo de estos ratones (datos no presentados). En el grupo tratado con 600 UI de Pregnyl los páncreas estaban libres de infiltración y, sorprendentemente, se encontraron varios islotes nuevos productores de insulina. Se encontró también un descenso del número de linfocitos B y de linfocitos T en páncreas, que fue compatible con concentraciones normales del cociente CD8/CD4 y también un número normal de linfocitos B en el bazo de estos ratones. Los ratones procedentes del grupo tratado con 300 UI de Pregnyl seguían vivos a las 28 semanas de edad. Parecían sanos, no habían perdido peso y nunca tuvieron concentraciones de glucosa sanguínea por encima de 8 mmol/l (Figuras 1 y 3). También se efectuó el estudio inmunohistoquímico de la presencia de insulina. Asimismo, se encontraron células infiltrativas presentes y algún islote productor de insulina en el páncreas. Estos ratones recibieron tratamiento durante cuatro semanas con Pregnyl junto al grupo tratado con 600 UI de Pregnyl y entre las semanas 20 y 28 se dejaron sin tratamiento.

Para determinar si las células esplénicas de los ratones NOD tratados y no tratados aún tenían el potencial de inducir diabetes en los animales NOD.scid, se transfirieron células esplénicas procedentes de los grupos tratados con PBS y 600 UI de Pregnyl a ratones NOD.scid. Veintidós días después de la transferencia los animales del grupo PBS NOD.scid tenían diabetes y en una semana habían alcanzado una concentración de glucosa sanguínea por encima de 33 mmol/l, mientras que los ratones NOD.scid que recibieron las células esplénicas procedentes del grupo tratado con 600 UI de Pregnyl se mantuvieron normales (glucosa sanguínea <7 mmol/I). A las 7 semanas después de la transferencia el grupo PBS parecía muy incómodo (Figura 2), mientras que el grupo tratado con 600 UI de Pregnyl. NOD.scid aún tenía concentraciones de glucosa sanguínea menores de 9 mmol/l y se mantenían sanos. Los ratones procedentes de ambos grupos se sacrificaron en este momento.

Reestimulación in vitro. Como se habían descrito concentraciones altas de IFN-gamma, IL-1 y TNF-alfa durante la enfermedad en los animales NOD y como este perfil de citocinas encaja en la activación selectiva de la subpoblación Th1, estudiamos el efecto in vitro de Pregnyl sobre la producción de citocinas por las células esplénicas totales y las células CD4+ purificadas de los ratones NOD hembra de 20 semanas de edad. Para evaluar si el efecto antidiabético reside en la hCG o en una de sus dos subunidades, o en otros factores contenidos en el preparado que se utiliza, también estudiamos el efecto de diferentes fracciones obtenidas por cromatografía de permeabilidad en gel a partir de Pregnyl (Figura 12) y de hCG recombinante humana y sus subunidades sobre la producción de citocinas. También se estudió in vivo el efecto de estas fracciones sobre las concentraciones de glucosa sanguínea en ratones NOD.scid
reconstituidos.

Observamos una fuerte inhibición de la producción de IFN-gamma por las células esplénicas obtenidas a partir de ratones tratados con 50-600 UI/ml de Pregnyl, F3-5 (58-15 kDa) y, en menor grado, con hCG recombinante humana (Figuras 4-6). Se encontró únicamente un aumento moderado de la producción de IFN-gamma en los esplenocitos procedentes de ratones tratados con 800 UI/ml de Pregnyl. Se observó un patrón similar cuando se analizó la producción de IL-4 (Figura 5). Además se observó una importante inhibición de la producción de IL-1 y TNF-6 en esplenocitos estimulados procedentes de ratones tratados con 300-600 UI/ml de Pregnyl, con la estimulación concomitante de
IL-6 y la producción de IL-10 (datos no presentados).

Además, los experimentos de transferencia demostraron que las células esplénicas totales de los ratones NOD de 20 semanas de edad tratados con F3-5 ó 600 UI de Pregnyl pueden retrasar o incluso prevenir el inicio de la diabetes en los animales NOD.scid comparadas con la reconstitución con células de ratones NOD tratados con PBS (Figura 7). Sin embargo, no se observó un efecto significativo con F1-2 (80-70 kDa) sobre el inicio de la diabetes en ratones NOD.scid. Para estudiar si Pregnyl tiene también un efecto sobre los ratones de tipo Th2, tratamos a los ratones BALB/c (n= 5) con 300 UI de Pregnyl por vía i.p. durante cuatro días y con PBS (n= 5). Después de aislar las células CD4+ procedentes del bazo las estimulamos con anti-CD3/IL-2 durante 48 horas y el sobrenadante se recogió para determinar las citocinas IFN-gamma e IL-4. También tratamos las células CD4+ con diferentes dosis de Pregnyl. A continuación se extrajo más sobrenadante para el análisis de citocinas. Se encontró una importante inhibición de IFN-gamma y la estimulación concomitante de IL-4 en las células CD4+ estimuladas con anti-CD3/IL-2 únicamente
(Th1->Th2), mientras que se observó lo contrario en las células CD4+ tratadas in vitro con diferentes dosis de Pregnyl (Th2 -> Th1).

Actividad antidiabética de IR-U/LMDF

Para estudiar la actividad antidiabética de IR-U/LMDF (<5 kDa) tratamos las células diabetogénicas in vitro con esta fracción y con PBS (control). La transferencia de estas células a ratones NOD.scid reveló que en los ratones NOD.scid reconstituidos con células tratadas con IR-U/LMDF se retrasó el inicio de la diabetes comparados con el grupo control (n= 3).

Para determinar el efecto del IR sobre el potencial de las células CD4+ para diferenciarse de células efectoras Th1 productoras de citocinas se estudió la polarización Th en presencia o ausencia de IR. También estudiamos el efecto de la hCG (rhCG) y beta-hCG recombinantes en este método de polarización Th. Se encontró una importante inhibición de IFN-gamma con IR-P e IR-U/LMDF en las células CD4+ que se polarizan hacia el fenotipo Th1 (Figura 28). Se encontró únicamente una inhibición moderada de la producción de IFN-gamma con beta-hCG recombinante y no se apreció efecto alguno con hCG recombinante (Figura 28).

Para determinar si el IR-P3 necesitaba algún factor adicional, como hCG, para ejercer plenamente su actividad, también tratamos los ratones NOD con IR-P, su fracción IR-P3, rhCG e IR-P3 en combinación con rhCG y a continuación se estudió su polarización Th1. La Figura 64 muestra que el IR-P inhibió la producción de IFN-gamma en la prueba de polarización Th1 y con ello inhibió el crecimiento de las células Th1 bajo condiciones de polarización Th1. Se encontró una inhibición moderada de la polarización Th1 con IR-P3 y rhCG solos, mientras que el crecimiento de las células Th1 se bloqueó completamente con la combinación de rhCG e IR-P3 (Figura 64).

También estimulamos las células esplénicas procedentes de estos ratones tratados con IR con anti-CD3 y a continuación se midieron en distintos tiempos el IFN-gamma y la producción de IL-10. La Figura 65 muestra que el tratamiento in vivo con IR-P y sus fracciones IR-P1 e IR-P2 inhibió la producción de IFN-gamma estimulada in vitro con anti-CD3, mientras que se encontró un aumento moderado de la producción de IFN-gamma con rhCG e IR-P3. Además, la fracción IR-P3 en combinación con rhCG fue capaz de inhibir la producción de IFN-gamma (Figura 65). También medimos la producción de IL-10 estimulada con anti-CD3 (t= 48) en cultivos de esplenocitos de estos ratones tratados in vivo. La Figura 67 muestra que todas las fracciones (IR-P, IR-P1, IR-P2, IR-P3) fueron capaces de aumentar la producción de IL-10.

Como IR y sus fracciones promueven la proliferación de los esplenocitos in vitro estimulada con anti-CD3, para conocer el efecto del tratamiento in vivo con IR sobre proliferación estimulada con anti-CD3 in vitro también medimos la proliferación estimulada con anti-CD3 de los esplenocitos obtenidos procedentes de estos ratones tratados con IR en diferentes tiempos (t= 12, 24, 48 h). La Figura 66 muestra que los esplenocitos estimulados con anti-CD3 procedentes de los ratones NOD tratados con IR-P e IR-P1 tienen una capacidad menor de proliferar in vitro. Además, los esplenocitos procedentes de ratones tratados con IR-P3 y rhCG muestran una capacidad mayor de proliferación comparada con los ratones control tratados con PBS (CTL), mientras que el uso de IR-P3 en combinación con rhCG causó el mismo descenso de la proliferación que el IR-P. Se encontró un efecto moderado en la proliferación estimulada con anti-CD3 de los esplenocitos procedentes de los ratones NOD tratados con IR-P2.

Como se ha mencionado anteriormente, la polarización dominante Th1 hace que las células B se desplacen de la producción de IgM a la producción de IgG2a bajo la influencia de la producción masiva de IFN-gamma. Por lo tanto, también medimos la producción de IgG2a en esplenocitos estimulados con LPS obtenidos a partir de los ratones NOD tratados con IR. La Figura 68 muestra que los esplenocitos estimulados con LPS a partir de animales tratados con IR-P, IR-P1 e IR-P3 produjeron in vitro menos IgG2a, mientras que se encontró una inhibición moderada de IgG2a con IR-P2. Además, de nuevo el tratamiento con rhCG no fue capaz de disminuir la producción de IgG2a mientras que sí pudo hacerlo en combinación con IR-P3 (Figura 68).

Células de médula ósea de ratones NOD estimuladas con GM-CSF

Para determinar el efecto de IR sobre la maduración de las células dendríticas (DC) procedentes de la médula ósea, cultivamos células de médula ósea procedentes de ratones NOD de 8 semanas de edad durante 7 días en presencia de GM-CSF. En estas condiciones, el crecimiento de las DC a partir de la médula ósea es mayor del 90%. Cuando cultivamos las células DC en presencia de GM-CSF e IR-P durante 7 días, observamos que todas las células DC tratadas con IR habían madurado menos que las células DC control tratadas con GM-CSF solamente. Se llegó a esta conclusión a partir del descenso de los marcadores de superficie celular CD1d, ER-MP58, F4/80, CD14 y del aumento de CD43, CD95, CD31 y E-cad (Figura 29). Además, no se observaron cambios en los marcadores de superficie celular ER-MP20/LY6C, MHC I y II (Figura 29).

Por el contrario, cuando las células DC se cultivaron con GM-CSF durante 6 días y en el día 7 se cultivaron simultáneamente con 300 UI/ml de IR-P (Figura 30) o 100 mg/ml de IR-U/LMDF (Figura 31) durante otras 24 horas, las células DC habían madurado más y podrían funcionar mejor que las células APC. Se llegó a esta conclusión a partir del aumento de los marcadores de superficie celular CD1d, CD40, CD80, CD86, CD95, F4/80, CD11c y MHC II (Figuras 30 y 31).

Método de polarización en ratones BALB/c

Para estudiar si el IR también tiene efecto sobre los ratones de fenotipo Th2, estudiamos el efecto de IR-P e IR-U/LMDF en ratones BALB/c. Después del tratamiento con IR aislamos las células T CD4+ por el método de polarización. Los métodos de polarización revelaron que las células T CD4+ procedentes de los ratones tratados con IR-P e IR-U/LMDF tenían una capacidad menor de producir IFN-gamma (Figuras 32 y 33), mientras que estas células produjeron más IL-4 comparadas con las células procedentes de los ratones tratados con PBS (Figuras 34 y 35), lo que sugiere que debido al tratamiento in vivo con IR las células T se habían desplazado más hacia el fenotipo Th2. Las células T CD4+ procedentes de los ratones tratados con PBS y con IR-P que recibieron dosis distintas de IR-P mostraron un aumento de la producción de IFN-gamma (Figura 36) y un descenso de la producción de IL-4 (Figura 37), lo que sugiere un desplazamiento hacia el fenotipo Th1. Para determinar si este desplazamiento de las células T CD4+ hacia el fenotipo Th2 depende de IL-10 o de TGF-beta, también añadimos anti-IL-10 y anti-TGF-beta en el método de polarización de las células T CD4+ procedentes de los ratones tratados con IR-P, lo que provocó un aumento de la producción de IFN-gamma bajo condiciones de polarización Th1 de las células de los ratones tratados con IR-P y de producción de IL-4 en condiciones de polarización Th2 apoyado por la adición de anti-IL-10 (Figuras 38 y 39), lo que sugiere una participación de IL-10 en la polarización Th1/Th2 con IR-P. Además, se apreciaron grandes diferencias entre la producción de IL-4 y de IFN-gamma en las condiciones de polarización Th2 y Th1 con el tratamiento con anti-TGF-beta in vitro (Figuras 40 y 41) entre los grupos control y tratado con IR-P. Estos resultados demuestran que debido al tratamiento con IR se implica la participación de IL-10 y TGF-beta. Además, las células CD4+ purificadas a partir de los animales tratados con IR-U/ LMDF producen más TFG-beta que las células procedentes de los ratones control (Figura 43). Cuando se añadió anti-IL-10 o anti-IL-6 en ambos cultivos, las células CD4+ procedentes de los ratones del grupo control producen más TGF-beta en el grupo tratado con IR-U/LMDF, lo que sugiere la participación de IL-6 e IL-10 en la producción de TGF-beta. Este resultado es compatible con nuestros datos que demuestra que las células esplénicas estimuladas con LPS procedentes de ratones tratados con IR producen niveles altos de IL-6 (Figura 45) comparadas con las de los ratones control.

Las células esplénicas procedentes de ratones irradiados con UVB también produjeron más IL-10 e indujeron la supresión de citocinas Th1. La estimulación con LPS y anti-CD3 de las células esplénicas procedentes de estos ratones reveló que tienen una capacidad de proliferación menor. También comparamos la proliferación estimulada con LPS y anti-CD3 de las células esplénicas procedentes de ratones BALB/c tratados con UVB e IR. La reducción de la proliferación inducida por LPS y anti-CD3 se observó después del cultivo de los esplenocitos procedentes de ratones BALB/c tratados con UVB (Figuras 46 y 47), mientras que el IR o el tratamiento combinado con IR e irradiación UVB aumentó la proliferación estimulada con anti-CD3 y LPS (Figuras 46 y 47).

Resultados en los ratones carentes de IL-10

Para determinar si este cambio en la proliferación estimulada con LPS y anti-CD3 es dependiente de IL-10 tratamos a los ratones carentes de IL-10 con IR-P o UVB. No se apreciaron cambios en el patrón de proliferación de las células esplénicas estimuladas con anti-CD3 cuando se compararon con los ratones BALB/c irradiados con UVB o tratados con IR-P (Figura 47), mientras que se observó el patrón inverso de proliferación en las células estimuladas con anti-CD3 de los ganglios linfáticos comparadas con las procedentes de ratones BALB/c irradiados con UVB de ambos grupos (Figura 49), lo que demuestra que el descenso de la proliferación estimulada con anti-CD3 después del tratamiento con UVB o el aumento de proliferación después del tratamiento con IR-P de las células esplénicas no es completamente dependiente de IL-10, mientras que sí es cierto para las células estimuladas con anti-CD3 de los ganglios linfáticos. Cuando se evaluó la proliferación estimulada con LPS de las células esplénicas a 48 horas, observamos un aumento de la proliferación de los grupos tratados con UVB e IR-P comparados con el grupo control (Figura 51), mientras que se observó un descenso de la proliferación en ambos grupos a las 72 horas de la proliferación (Figura 50).

Para determinar la influencia del tratamiento in vivo con UVB o con IR-P sobre el porcentaje de células positivas para los marcadores CD4, CD8, B220, M5/114 de superficie celular, realizamos un análisis por citometría de flujo con las células de los ganglios linfáticos y las células esplénicas. Se observó una reducción de las células positivas B220 y M5/114 y un aumento de las células positivas CD4 y CD8 en los ganglios linfáticos de los ratones carentes de IL-10 tratados con IR-P (Figura 52), mientras que se observó un aumento de las células positivas CD4, CD8, B220 y M5/114 en el bazo (Figura 53). En el grupo tratado con UVB se apreció un aumento de las células positivas CD8 y un descenso de las células positivas CD4, B220 y M5/114 en ganglios linfáticos (Figura 52), mientras que no se apreciaron cambios en los marcadores celulares entre las células esplénicas, excepto un aumento moderado de las células positivas CD8 (Figura 53).

Células de médula ósea estimuladas con GM-CSF Resultados

Para determinar el efecto de IR sobre la madurez de las células dendríticas (DC) de la médula ósea, cultivamos las células de la médula ósea procedente de ratones BALB/c durante 7 días en presencia de GM-CSF. De esta forma, el crecimiento de DC a partir de médula ósea es mayor del 90%. Cuando se cultivaron simultáneamente estas DC en presencia de GM-CSF e IR (IR-P, IR-U, IR-U3-5, IR-U/LMDF) durante 7 días, observamos que todas las DC tratadas con IR eran menos maduras que las DC control tratadas con GM-CSF solamente. Se llegó a esta conclusión a partir del descenso de los marcadores de superficie celular CD1 d, CD40, CD80, CD86, ER-MP58, F4/80, E cad y MHC II (Figura 54). Además, se observó un aumento moderado de CD95 (Figura 54). Por el contrario, cuando se cultivaron las DC con GM-CSF durante 6 días y en el día 7 se suplementó el cultivo con 300 UI/ml IR-P o 100 mg/ ml IR-U (IR-U, IR-U3-5 o IR-U/LMDF) durante otras 24 horas, maduraron más y podían funcionar mejor como APC. Se llegó a esta conclusión a partir del aumento de los marcadores de superficie celular CD1 d, CD14, CD40, CD80, CD86, CD95, ER-MP58, F4/80, RB6 8C5, E-cad y MHC II (Figura 55).

Resultados con ALLO-MLR

Para estudiar la actividad inmunosupresora de IR por ejemplo para fines de trasplante, también realizamos un allo-MLR con las células BM a partir de ratones BALB/c hembra de 9 semanas de edad, como se ha mencionado anteriormente, y se cultivaron con GM-CSF (20 ng/ml) e IR (IR-P, 300 UI/ml; IR-U, 300 mg/ml; IR-U3-5, 300 mg/ml; IR-U/LMDF, 300 mg/ml) durante 7 días. Después de 7 días estas DC se irradiaron (2.000 rad) y se cultivaron simultáneamente en varias proporciones con las células CD3+ esplénicas aisladas a partir de hembras C57BL6/Ly de 9 semanas de edad. La proliferación de las células T se midió por la incorporación de [3H]TdR durante un cultivo de al menos 16 horas. Los datos de proliferación muestran que las DC tratadas con IR en todas las DC frente a las proporciones de células T estudiadas pueden suprimir la proliferación (Figura 56).

Actividad anti-shock de IR-U/LMDF, IR-P3, IR-A3

La fracción de peso molecular más bajo de IR obtenida por el método de purificación 2 (IR-U/LMDF) también tuvo actividad anti-shock (Figura 57) y los ratones tratados con esta fracción siguieron vivos. Estudiamos también la actividad anti-shock de las tres fracciones obtenidas a partir de superdex@peptide, IR-P3 e IR-A3. El método para estudiar esta actividad se menciona en otra parte de este documento. Nuestros resultados demuestran que las tres fracciones obtenidas a partir de la columna superdex@peptide e IR-P3 tenían actividad anti-shock, mientras que la obtenida a partir de IR-A3 tenía una actividad baja o moderada (datos no presentados).

Purificación por el Método 3

La Figura 100 muestra el cromatograma obtenido con la columna de Macroshere GPC 60A de una muestra IR-P.

Se fraccionaron tres áreas seleccionadas, IR-P1 que se eluye aparentemente con un peso molecular de > 10 kDa, IR-P2 que se eluye aparentemente con un peso molecular entre 10 kDa-1 kDa e IR-P3 que se eluye aparentemente con un peso molecular < 1 kDa. Todas estas actividades se estudiaron para determinar al menos la actividad anti-shock y todas ellas tenían actividad anti-shock (como se demuestra en otra parte de este documento). La Figura 101 muestra el cromatograma obtenido con la columna de Macroshere GPC 60A de una muestra IR-P e IR-A (se inyectaron 500 UI de cada muestra con un mismo volumen de inyección). Los resultados revelaron que IR-A contiene una gran cantidad de fracción IR-A3 comparada con la fracción IR-P3 en la muestra IR-P. Hemos estudiado la actividad anti-shock en la misma cantidad de IR-A e IR-P. Los resultados revelaron que IR-A tenía una actividad anti-shock baja o moderada comparada con IR-P (resultados no presentados).

Purificación por el Método 4

Se obtuvo orina combinada a partir de mujeres gestantes durante el primer trimestre de su embarazo. Después de eliminar la sal en una columna de FDC en un sistema de FPLC y utilizando bicarbonato amónico 50 mM como el tampón de elución, se liofilizaron las fracciones combinadas de bajo peso molecular (LMDF; < 5 kDa). La muestra LMDF (13-17 mg) se suspendió y se aplicó en una columna Bio-Gel P-2 usando agua para la elución. El perfil de elución se segregó en 8 picos diferentes y en las fracciones combinadas se estudió la actividad biológica en el shock séptico inducido por LPS (método mencionado en otra parte de este documento). Basándose en la inhibición del shock inducido por LPS, la actividad se localizó en las fracciones Ic ("?"), II, III, VI y VII. Estos picos comprendían unos volúmenes de elución entre 40-45 ml (pico Ic "?"), 45-50 ml (pico III), 60-65 ml (pico VI) y 65-70 ml (pico VII) (Figura 97).

Se aplicó una muestra de IR-P (Pregnyl) en la columna de Macroshere GPC 60A y se eluyó con bicarbonato amónico. La fracción del tercer pico (Figura 100) (IR-P3) se combinó y se aplicó en la columna Bio-Gel P-2 y se eluyó con agua generando varios picos. El estudio de la actividad en el modelo de shock inducido por LPS reveló que la actividad se localizaba en las fracciones situadas entre el tiempo de elución de 7 y 9 horas (Figura 98).

Se aplicó una muestra de IR-A (APL) en la columna de Macroshere GPC 60A y se eluyó con bicarbonato amónico. La fracción del tercer pico (IR -A3) se combinó y se aplicó en una columna Bio-Gel P-2 y se eluyó con agua en varios tiempos. El estudio de la actividad en el modelo de shock inducido por LPS reveló que la actividad se localizaba en los picos 2, 3 y 7. Estos picos comprendían unos los volúmenes de elución entre 105-115 ml (pico 2), 115-120 ml (pico 3) y 160-180 ml (pico 7) (Figura 99).

Efecto in-vivo antisepsis o anti-shock séptico de IR

Curva de supervivencia: Los resultados más llamativos derivados de este experimento son las diferencias totalmente contrapuestas encontradas en los animales tratados con IR-P antes de TSST-1 y D-Gal frente a los que no recibieron ese tratamiento (Figura 20). Esta diferencia es evidente en la curva de supervivencia obtenida a partir de este experimento, mientras que una dosis de 4 \mug de TSST-1 junto a la sensibilización con D-Galactosamina fue letal en el 100% de los casos en 32 horas; los animales pretratados con IR antes de la exposición a TSST-1 no sucumbieron a los efectos del shock tóxico letal.

El estudio de los ratones BALB/c y ratones SJL tratados con LPS reveló una sensibilidad diferente a LPS. Una dosis de 600 \mug de LPS fue letal en el 100% de los casos en 48 horas y en 36 horas en los ratones BALB/c y SJL respectivamente, mientras que los ratones BALB/c y los ratones SJL pretratados con IR siguieron vivos. También administramos un pretratamiento a ratones BALB/c con fracciones de IR-U, a saber, IR-U1, IR-U2 e IR-U3-5 [combinados] y a continuación se trataron con LPS. Estos experimentos demostraron que los ratones pretratados con IR-U1 e IR-U2 estaban muy enfermos a las 48 horas y fueron sacrificados con el grupo LPS. No obstante, los ratones tratados con IR-U3-5 seguían vivos.

Un grupo de ratones BALB/c recibió tratamiento dos veces con 700 UI de IR-P después de la inyección de LPS. Los ratones del grupo control (tratados solamente con LPS) se sacrificaron a las 48 horas debido a su grave enfermedad. Los ratones tratados con IR-P seguían vivos, excepto dos (2/6) ratones que fueron sacrificados a las 60 horas.

Cinética de la enfermedad: Los signos visibles de la enfermedad eran evidentes en todos los animales de experimentación pero la cinética y, obviamente, la gravedad de la enfermedad eran significativamente diferentes: como el grupo de ratones BALB/c pretratados con IR-P no superaron el nivel de enfermedad 2 en el modelo de exotoxina TSST-1 (Figura 21) y tampoco en el modelo de exotoxina LPS añadida a los ratones pretratados con IR-U3-5. Los ratones SJL pretratados con IR-P y los ratones BALB/c postratados con IR-P en el modelo de LPS no superaron el nivel de enfermedad 3. Todos los ratones de ambos modelos se sacrificaron cuando superaron el nivel de enfermedad 5.

Pérdida de peso inducida por shock en TSST 1: El pretratamiento con IR también dio lugar a una pérdida de peso significativamente menor entre los supervivientes al shock tóxico. Los datos de pérdida de peso en este experimento se combinaron con los procedentes de otro experimento que siguió una cinética de la enfermedad idéntica (datos no presentados), pero en el que sobrevivieron dos de los animales del grupo tratado con 4 \mug de TSST-1 y D-Gal sin pretratamiento con IR (Figura 12.).

Cuando se efectuó el análisis estadístico de estos datos de pérdida de peso usando una prueba de la t de 2 muestras (usando el programa estadístico Minitab, versión 11.21) se observaron diferencias significativas (P(HO:\mu 1= \mu2)< 0,05) en la pérdida de peso a las 32 y 48 horas a pesar del bajo número de casos n, lo que indicaba una significación posiblemente mayor si aumentaba el número de casos n:

Prueba de la t de dos muestras e intervalo de confianza

Prueba de la t de dos muestras para pérdida de peso a las 32 horas

(grupo 1= TSST1 y D-Gal; grupo 2= T y D con pretratamiento con IR)

Grupo	N	Media	DE	EEM
1	4	4,75	1,79	0,89
2	6	1,28	2,22	0,91

IC al 95% para \mu1 - \mu2: ( 0,45, 6,48)

Prueba de la t \mu1= \mu2 (frente a no = ): T= 2,72 P= 0,030 DF= 7

Prueba de la t de dos muestras para pérdida de peso a las 48 horas

(grupo 1= TSST1 y D-Gal; grupo 2= T y D con pretratamiento con IR)

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Grupo	N	Media	DE	EEM
1	3	10,05	2,25	1,3
2	6	3,49	4,41	1,8

IC al 95% para \mu1 - \mu2: ( 1,1, 12,0)

Prueba de la t \mu1 = \mu2 (frente a no = ): T= 2,95 P= 0,026 DF= 6

Recuentos de leucocitos y plaquetas: Los niveles de leucocitos en sangre (Figura 23) fueron significativamente mayores en los ratones tratados con TSST y D-Gal solos (barra Nº 2) frente a los recuentos de leucocitos en los ratones normales (barra Nº 1) y en los ratones pretratados con IR-P (barra Nº 3). Esto indica, como era de esperar, un nivel más alto de activación inmune en los ratones que sufrían un shock tóxico letal. Se encuentra también un nivel normal de leucocitos en el grupo IR-P, como es un hallazgo también en otros resultados nuestros, ya que este grupo no mostró signos visibles graves de enfermedad.

Los recuentos de plaquetas (Figura 24) también estaban reducidos en los ratones tratados con TSST-1 y D-Gal. Se observaron recuentos de plaquetas elevados en ratones tratados con IR-P.

Resultados en el trasplante

Un objetivo principal de la investigación en el trasplante es el desarrollo de estrategias para inhibir el rechazo del aloinjerto e incluso mejor, inducir una tolerancia aloespecífica. Con tal fin, se han usado extensamente los modelos animales y ha quedado claro que el rechazo del aloinjerto de piel puede ser uno de los más difíciles de prevenir.

La pérdida del injerto con MHC dispar es inevitable si no se suprime la alorreactividad mediante fármacos inmunosupresores. Actualmente, los protocolos inmunosupresores se basan en el uso combinado de múltiples fármacos inmunosupresores que pueden interferir potencialmente con los distintos pasos del proceso de rechazo, como son el reconocimiento del antígeno, la producción de citocinas de células T, la actividad de citocinas y la proliferación de células T, macrófagos, células NK y células T citotóxicas. En los medios experimentales se ha evaluado y se sigue evaluando la capacidad inmunosupresora de muchos fármacos y anticuerpos monoclonales (mAb). Entre ellos, se pueden citar mizorbina, R-S-61443, 15-deoxispergualina, brequinar sódico y mAb frente a LFA-1, ICAM1, CD3, CD4 e IL-2R. Las citocinas producidas por muchos tipos celulares, como células T, macrófagos y células NK, pueden influir en el proceso de rechazo. Debido a su papel central en el rechazo del injerto, se han estudiado extensamente las células T CD4+ y las citocinas que producen en el rechazo y la aceptación de los aloinjertos. Los linfocitos T CD4+ se pueden subdividir al menos en dos subgrupos, células Th1 y células Th2, según su patrón de producción de citocinas. Las células Th1, que producen IL-2, IFN-gamma y TNF-beta, desempeñan un papel en las reacciones de hipersensibilidad de tipo tardío (DTH) y citotoxicidad celular, mientras que las células Th2, que producen IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10, son eficaces estimuladoras de la diferenciación de células B y producción de anticuerpos. Estos dos subgrupos de células Th pueden regular mutuamente su proliferación y función. Mientras que el IFN-gamma inhibe la proliferación celular Th2 y antagoniza con los efectos IL-4, la IL-10 inhibe la producción de citocinas Th1. Hay algunos que indican la existencia de células T reguladoras que también pueden regular estos dos subgrupos. Se piensa que el rechazo del injerto está mediado por células Th1, que pueden estimular la actividad DTH y CTL. Por otro lado, la supresión de las células Th1 alorreactivas puede provocar la aceptación del
injerto.

La inmunosupresión puede conseguirse neutralizando las citocinas proinflamatorias mediante la administración de un mAb anticitocina o receptores solubles de citocina. Como alternativa, el "desplazamiento" de la diferenciación de las células T hacia uno de los dos subgrupos Th se puede conseguir introduciendo variaciones en el entorno de las citocinas. Por ejemplo, el IFN-gamma (Th1, células NK) y la IL-12 (macrófagos, células B) promueven la diferenciación de células Th1, mientras que la IL-4 (Th2) potencia el desarrollo de células Th2. Puede conseguirse un efecto similar con el cambio del entorno de citocinas que se encuentra in vivo por mAb anticitocinas o citocinas. Además, la inducción de células reguladoras como Th3 y Tr1 y como DC1 y DC2 también reduce el rechazo al trasplante e induce la tolerancia al injerto.

Resultados: el tratamiento de receptores BALB/c con IR-P prolongó la supervivencia del injerto de piel C57BL/6 comparada con el grupo control no tratado. Los receptores control rechazaron el injerto de piel antes de 12 días (Figura 95) mientras que los receptores tratados con IR-P pudieron prolongar el injerto hasta 22 días después del trasplante (Figura 96). Las Figuras 95 y 96 muestran uno de estos injertos prolongados (imagen tomada en el día 19) debido al tratamiento con IR-P y un injerto rechazado por los ratones control.

Resultados de EAE

Los ratones tratados con PBS únicamente perdieron peso durante las tres primeras semanas (Figura 77). Estos ratones tenían signos clínicos de EAE de una intensidad de al menos 2 y una duración mayor de la enfermedad, excepto los ratones que se mantuvieron resistentes a la enfermedad durante todo el experimento (Figura 78). En el grupo de ratones tratados con IR se encontró una menor pérdida de peso durante el experimento (Figura 79) y dos ratones no tenían enfermedad durante el experimento. Los ratones enfermos de este grupo tenían unas puntuaciones clínicas máximas de 2 y una duración corta de la enfermedad y se recuperaron más rápidamente de los síntomas de EAE que el grupo tratado con PBS (Figura 80).

Resultados sobre el shock

Los ratones tratados con IR son resistentes al shock inducido por LPS: Para determinar el efecto del tratamiento con LPS en dosis altas, los ratones BALB/c tratados con IR (n= 30) recibieron una inyección intraperitoneal de LPS (150 mg/kg) y la supervivencia se valoró diariamente durante 5 días. Los ratones BALB/c tratados con PBS sucumbieron al shock entre 1 y 2 días después de la inyección de LPS en dosis altas, sobreviviendo únicamente el 10% de los ratones vivos en el día 5 (Figura 58). Por el contrario, el 100% de los ratones tratados con IR-P, o con sus fracciones IR-P1 o IR-P3, seguía vivo en el día 5 (P< 0,001) (Figura 58), mientras que en los grupos de ratones tratados con IR-P2, IR-A y dexametasona se alcanzó una supervivencia del 70% aproximadamente (Figura 58).

Análisis de sangre: Las principales manifestaciones de la respuesta sistémica sobre el efecto de LPS en el shock es la inflamación grave de órganos que acaba en un fracaso orgánico o una disfunción de órganos y sistemas, inicialmente en el hígado. Por lo tanto, medimos las enzimas ALAT, ASAT, LDH1 y los recuentos de leucocitos y plaquetas. La Figura 59 muestra que tras la administración de IR-A, IR-P y sus fracciones IR-P1 e IR-P3 todos los recuentos de plaquetas están dentro del límite de la normalidad (100-300 x 10^{9}/ml), mientras que los ratones control y los tratados con IR-P2 y dexametasona tenían unos recuentos de plaquetas por debajo del límite normal. Las Figuras 60-62 muestran que los ratones tratados con IR-A, IR-P y sus fracciones IR-P1, IR-P2 o IR-P3 tenían unos niveles relativamente bajos de las enzimas ALAT, LDH1 y ASAT en el plasma en comparación con los ratones control y los tratados con dexametasona. Estas enzimas se encontraban en concentraciones mayores en sangre durante el shock debido al daño orgánico. Estos resultados son compatibles con nuestros resultados de supervivencia (Figura 58). Además, durante el shock se encontraron niveles bajos de leucocitos en sangre debido a su migración hacia los lugares de inflamación. Nuestros resultados, expuestos en la Figura 63, muestran que los ratones tratados con IR-A, IR-P y sus fracciones tienen unos niveles moderados o normales de leucocitos a t= 48 horas en comparación con los ratones control y los tratados con dexametasona, lo que sugiere una respuesta inflamatoria más débil en los ratones tratados con IR.

Resultados ex vivo en ratones NOD/LTJ

La Figura 64 muestra la inhibición de la producción de IFN-gamma en el método de polarización con Th1 con células CD4+ aisladas a partir de los ratones NOD tratados con IR-P o IR-P3 en combinación con rhCG, mientras que se encontró una inhibición moderada en la polarización con Th1 por rhCG e IR-P3 solos. Esto demuestra que el tratamiento con IP-P3 en combinación con rhCG proporciona una inhibición masiva del crecimiento de Th1 en los ratones NOD. Esto sugiere que la fracción IR-P3 necesita rhCG para alcanzar la inhibición máxima del subgrupo Th1.

La Figura 65 muestra la inhibición de la producción de IFN-gamma en las células esplénicas estimuladas con anti-CD3 obtenidas a partir de los ratones NOD tratados con IR-P, IR-P1, IR-P2 o con IP-P3 en combinación con rhCG comparada con los ratones tratados con PBS. El uso de rhCG e IR-P3 por separado no tuvo el mismo efecto que en combinación, lo que sugiere, de nuevo, que la fracción IR-P3 necesita rhCG para la inhibición del IFN-gamma.

La Figura 66 muestra la proliferación estimulada con anti-CD3 en distintos tiempos (t= 12, 24, 48 h) de las células esplénicas obtenidas a partir de los ratones NOD tratados con IR-P, sus fracciones, rhCG, o IR-P3 en combinación con rhCG. De nuevo los resultados son compatibles con la inhibición anterior del IFN-gamma (Figura 65). Aquí la fracción IR-P3 también necesitaba rhCG para su efecto inhibidor sobre la proliferación inducida con anti-CD3 de las células esplénicas a partir de los ratones NOD tratados in vivo.

La Figura 67 muestra que IR-P y sus fracciones promueven la producción de IL-10 de las células esplénicas estimuladas con anti-CD3 procedentes de los ratones NOD tratados comparados con los ratones tratados con PBS.

La Figura 68 muestra que la producción de IgG2a no se inhibe por el tratamiento in vivo de los ratones NOD con IR-P2 o rhCG, mientras que el uso de IR-P, IR-P1, IR-P3 e IR-P3 en combinación con rhCG inhibió la producción de IgG2a.

Como sucede que el uso de IR-P3 en combinación con rhCG tiene las mismas características que IR-P, se puede pensar que esta combinación también puede usarse para la inducción del embarazo, IVF, prevención del aborto o problemas relacionados.

Modelo STZ

El fenómeno determinante en la patogenia de la diabetes tipo I es la destrucción de las células beta pancreáticas productoras de insulina. Hay datos importantes de que la reducción progresiva de la masa de células beta es el resultado de una reacción autoinmune crónica. Durante este proceso, las células inmunes que infiltran los islotes, las células endoteliales del capilar de los islotes y las propias células beta pueden liberar mediadores citotóxicos. Las citocinas y, en particular, el óxido nítrico (ON), son moléculas efectoras potentes tóxicas para las células beta. El radical reactivo ON media su efecto negativo principalmente por la inducción de fragmentación abundante del filamento de ADN. Este daño inicial desencadena presumiblemente una cadena de episodios que desembocan en la muerte de las células beta.

La diabetes inducida en los roedores por la toxina de las células beta estreptozotocina (SZ) se ha usado abundantemente como modelo animal para estudiar el mecanismo implicado en la destrucción de las células beta pancreáticas. Las células beta del páncreas captan la SZ a través del transportador de glucosa GLUT-2. Esta sustancia se descompone intracelularmente y provoca el daño del ADN por alquilación o por la generación de ON. La aparición de los fragmentos en el filamento del ADN provoca la activación de la abundante enzima nuclear poli(ADP ribosa) polimerasa (PARP), que sintetiza grandes cantidades del polímero (ADP ribosa), usando NAD+ como sustrato. Como consecuencia de la activación de PARP la concentración celular de NAD+ puede disminuir a continuación hasta concentraciones muy bajas, lo que se cree que anula la capacidad de la célula para generar energía suficiente y, finalmente, provoca la muerte celular.

Los radicales reactivos también juegan un papel importante en la patogenia de muchas enfermedades como la nefropatía, la nefropatía obstructiva, el rechazo de aloinjerto renal agudo y crónico, enfermedades autoinmunes (como SLE, artritis reumatoide, diabetes, MS), el SIDA, enfermedades relacionadas con angiogénesis, aterosclerosis, trombosis y diabetes mellitus de tipo II. Por ejemplo, recientemente se ha observado un daño oxidativo incrementado en bases de ADN en pacientes de diabetes mellitus de tipo II que contribuyen a la patogenia y complicaciones de la diabetes. Hemos estudiado si el IR tiene también capacidad para retrasar la inducción de diabetes STZ inducida y por tanto si tiene algún efecto sobre la formación y protección de radicales reactivos celulares.

En el modelo HD-STZ la inducción de la diabetes se debe al efecto directo en las células beta del tejido pancreático al inducir la activación de PARP. Consiguientemente, la reducción de NAD+ y la supresión de la capacidad de la célula de generar energía suficiente conduce finalmente a la muerte de la célula. Esto sugiere que no hay ningún componente inmunológico implicado en este proceso. En contraste, en el modelo MD-STZ están presentes componentes inmunológicos fuertes.

Las figuras 69 y 70 muestran que el tratamiento IR-P es capaz de retrasar la inducción de diabetes en ambos modelos. El mecanismo que se esconde detrás de este retraso es probablemente de naturaleza diferente.

Estudios en humanos

El sistema inmune cuenta con una capacidad notable para mantener un estado de equilibrio incluso aunque responda a una serie diversa de microbios y pese a su constante exposición a auto-antígenos. Tras una respuesta productiva a un antígeno extraño, el sistema inmune vuelve a un estado de reposo, de manera que los números y el estatus funcional de los linfocitos quedan reestablecidos a un nivel muy similar a la preinmunización. Este proceso se denomina homeostasis y permite al sistema inmune responder de manera efectiva a un nuevo reto antigénico. El tamaño y el repertorio de las subpoblaciones de linfocitos preinmunes están asimismo estrechamente regulados ya que los nuevos enmigrantes procedentes de los órganos linfoides generativos compiten por "espacio" con las células residentes. Los linfocitos con receptores capaces de reconocer auto-antígenos se generan constantemente, aunque individuos normales mantienen un estado de no respuesta a sus propios antígenos, denominado auto-tolerancia.

En enfermedades autoinmunes, el sistema inmune se reconoce inapropiadamente a sí mismo, lo que conduce a una reacción inmune patológica humoral y/o mediada por células. En un estado normal, no autoinmune, los linfocitos auto-reactivos se eliminan o quedan sin respuesta a autoligandos periféricos. Las poblaciones de células potencialmente autorreactivas pueden demostrarse si bien no parece que provoquen una reacción autoinmune apatogénica a sus ligandos. Emerge una imagen de enfermedad autoinmune cuando estas células autorreactivas se activan a través de mimetismo molecular, dado que las interacciones del receptor de la célula T (TCR) pueden degenerar y las células T pueden ser activadas por una diversidad de ligandos (1, 2). Está demostrado que, en condiciones apropiadas, la activación de las células T autorreactivas se ve facilitada por la inducción de citocinas y la regulación positiva de moléculas costimulatorias particulares (por ejemplo, CD80/CD86 y CD40), que conducen a la autoinmunidad.

Cuando el sistema inmune confunde auto tejidos por no auto tejidos y monta un ataque inapropiado, el resultado es una enfermedad autoinmune. Se conocen muchas y muy diferentes enfermedades autoinmunes. Cabe citar como ejemplos la granulomatosis de Wegener, la esclerosis múltiple, la diabetes mellitus de tipo 1 y la artritis reumatoide. No obstante, la infección puede inducir también respuestas inmunes que provocan la inducción de enfermedades inmunes, mientras que la propia infección no es peligrosa para el huésped. Por ejemplo, el papel de los bacilos Tubercle en la tuberculosis, donde el sistema inmune reacciona agresivamente a los bacilos Tubercle provocando como resultado una enfermedad inflamatoria y una destrucción del tejido debido a la propia respuesta inmune. Esto ocurre también, por ejemplo, en el caso de la lepra tuberculoide.

Las enfermedades autoinmunes pueden afectar al organismo de diferentes maneras. Por ejemplo, la reacción autoinmune está dirigida contra el cerebro en esclerosis múltiple y el intestino en la enfermedad de Crohn. En otras enfermedades autoinmunes, como la enfermedad de Sjögren, y el lupus eritematosos sistémico (lupus; SLE), los tejidos y los órganos afectados pueden variar entre personas con la misma enfermedad. Muchas enfermedades autoinmunes son raras. Como grupo, sin embargo, afligen a muchas personas en las sociedades del mundo occidental.

Muchas enfermedades autoinmunes se dan más en mujeres que en hombres. El dimorfismo sexual cubre un amplio campo de trastornos autoinmunes que van desde el específico de un órgano (como la enfermedad de Graves) hasta los generalizados como el SLE. En la MS, se observa una preponderancia de mujeres sobre hombres que oscila entre 2:1 y 3:1. Las razones de esta desviación sexual en la MS y en otras enfermedades autoinmunes no están claras pero muchas de ellas incluyen factores tales como las diferencias relacionadas con el sexo en respuestas inmunes a la infección, efectos esteroides del sexo y factores genéticos relacionados con el sexo. Está reconocido que las enfermedades MS, de Sjogren, SLE y RA son enfermedades diferentes y probablemente difieren en su etiología.

Sin embargo la relación común es la prevalencia abrumadora de estas enfermedades en las mujeres. Considerando que cada una de estas enfermedades es autoinmune, los efectos de las hormonas sexuales y el género pueden ser similares por lo que una comparación de estas enfermedades puede resultar útil. Las enfermedades autoinmunes afectan a las mujeres, en particular durante la edad laboral de éstas y durante los años en que pueden tener hijos. Sin embargo, la evolución clínica de estas enfermedades es sorprendentemente menos severa e incluso se ha observado su remisión durante el embarazo.

Durante el embarazo, las mujeres sufren cambios inmunológicos propios del debilitamiento de la inmunidad mediada por células (respuestas Th1) y el fortalecimiento de determinados componentes de la inmunidad humoral (respuestas Th2). Estas respuestas similares a una desviación Th2 del sistema maternal durante el embarazo introducen un estatus de inmunosupresión o inmunomodulación temporal, que provoca la supresión de respuestas de rechazo materno contra el feto, si bien mantienen, o incluso incrementan, su resistencia a la infección. Además, se ha observado una menor susceptibilidad a algunas enfermedades autoinmunes, especialmente a trastornos inmunes mediados por las células Th1. Por ejemplo, aproximadamente el 77% de las mujeres con artritis reumatoide (predominantemente un trastorno autoinmune mediado por las células Th1) experimentan una remisión temporal de sus síntomas durante la gestación, que resultan aparentes desde el primer trimestre en la mayoría de los casos. Por consiguiente, la mejoría clínica durante la gestación en las enfermedades autoinmunes mediadas por las células Th1 está probablemente relacionada con los cambios inmunes fisiológicos durante la primera fase del embarazo.

Como quiera que nuestro IR tiene la capacidad de inhibir el desarrollo de la enfermedad autoinmune en modelos de animales tales como NOD y EAE, hemos tratado a pocos pacientes con enfermedades inmunes. Todos los pacientes fueron tratados ante la persistencia de la enfermedad y tras su consentimiento informado.

Paciente 1

Granulomatosis de Wegener

La granulomatosis de Wegener es una enfermedad vascular autoinmune que puede afectar tanto a mujeres como a hombres; y aunque es más frecuente en personas de edad media, puede afectar a personas de cualquier edad. Las manifestaciones iniciales se observan generalmente en el tracto respiratorio superior e inferior, con una inflamación crónica progresiva. La inflamación puede formar nudos o granulomas en los tejidos o en la piel. Puede progresar hasta una inflamación generalizada de los vasos sanguíneos (vasculitis) y del riñón (glomerulonefritis). También se puede presentar una forma restringida de la enfermedad que no afecta a los riñones.

La vasculitis es el resultado de una reacción autoinmune en la pared de los vasos sanguíneos de tamaño pequeño y mediano. La vasculitis crónica provoca un estrechamiento del interior del vaso sanguíneo y puede desembocar en la obstrucción del flujo sanguíneo a los tejidos. Esta situación puede provocar daños en los tejidos (necrosis).

Las enfermedades autoinmunes aparecen cuando se producen inexplicablemente estas reacciones contra las propias células y tejidos del organismo produciendo anticuerpos auto-reactivos. En la granulomatosis de Wegener, un autoanticuerpo se dirige hacia los componentes del citoplasma de ciertos leucocitos. La causa de la granulomatosis de Wegener continua siendo desconocida. Aunque la enfermedad presenta un parecido con un proceso infeccioso no se ha conseguido aislar un agente causante. En la mayoría de los pacientes se ha encontrado un Anticuerpo Citoplásmico Antineutrófilo (ANCA) y su nivel parece guardar relación con la actividad de la enfermedad. La granulomatosis de Wegener es una enfermedad muy rara, especialmente en Europa y en la población de color (africanos, suramericanos, pueblos de Asia). El número exacto de pacientes se desconoce si bien según una estimación aproximada aparecen dos nuevos casos por cada millón de norteamericanos por año, o lo que es igual, cada año se diagnostican en los Estados Unidos unos 500 casos nuevos. La enfermedad puede aparecer en cualquier edad; sin embargo su pico se aprecia en la 4ª ó 5ª década de la vida.

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Afecta por igual a hombres y a mujeres

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El 85% de los pacientes tiene más de 19 años

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La edad media de los pacientes es de 41 años (el rango de edad actual oscila entre 5-91)

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El 97% de todos los pacientes son blancos, el 2% negros y el 1% de otras razas.

Los síntomas de la granulomatosis de Wegener y la severidad de estos síntomas varían de un paciente a otro, aunque la mayoría de los pacientes observan los primeros síntomas en el tracto respiratorio superior. Una manifestación común de la enfermedad es una rinorrea persistente ("nariz suelta") u otros síntomas similares al resfriado que no responden a un tratamiento estándar y que van empeorando progresivamente.

La rinorrea puede tener su origen en el drenaje del sinus y puede provocar una obstrucción respiratoria superior y dolor. Entre las quejas recibidas se incluyen la descarga de la nariz, sinusitis, ulceraciones de la membrana nasal y formación de costras, inflamación del oído con problemas de audición, tos, expectoración con sangre y pleuritis (inflamación de la membrana pulmonar).

Otros síntomas iniciales incluyen fiebre, fatiga, malestar (sensación de enfermo), pérdida del apetito, pérdida de peso, dolor de las articulaciones, sudoración nocturna, cambios en el color de la orina, debilidad. La mayoría de los pacientes con granulomatosis de Wegener no han experimentado la totalidad de los síntomas antes descritos y la severidad de la enfermedad es diferente en cada paciente. La fiebre aparece con frecuencia, en ocasiones tiene su origen en una infección bacteriana de los sinus.

Un tercio de los pacientes puede no presentar síntomas en el momento de detectarse la enfermedad.

Los ensayos de laboratorio no son específicos de la granulomatosis de Wegener y sólo sugieren que los pacientes tienen una enfermedad inflamatoria. Los análisis de sangre con frecuencia manifiestan anemia (bajo recuento de hematies) y otros cambios en la sangre. Para el diagnóstico de la granulomatosis de Wegener se utilizan como herramientas importantes las radiografías de pecho y la biopsia de riñón. Para el tratamiento eficaz es crítico el diagnóstico precoz. Los pacientes asintomáticos pueden ser diagnosticados mediante análisis de sangre ANCA y un escáner CT de los sinus y pulmones. Se requieren de 5 a 15 meses en promedio, para diagnosticar la granulomatosis de Wegener. El 40% de todos los diagnósticos se realizan en un plazo inferior a 3 meses, mientras que un 10% necesita de 5 a 15 años.

Otras herramientas de diagnóstico son las siguientes:

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La velocidad de sedimentación de eritrocitos es generalmente elevada,

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El recuento completo de sangre con frecuencia presenta anemia, recuento elevado de leucocitos y recuento elevado de plaquetas,

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La urinalisis se considera frecuentemente una prueba que permite detectar la implicación del riñón,

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En ciertos pacientes se utiliza la recogida de orina durante 24 horas para determinar la función del riñón,

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El c-ANCA es característico para medir los anticuerpos de proteinasa-3.

Nuestros resultados iniciales del tratamiento del paciente 1 con IR-P. El paciente fue tratado vista la persistencia de la enfermedad y tras consentimiento informado.

Diagnóstico: Granulomatosis de Wegener basada en histopatología sinal y prueba cANCA.

Caso: Un paciente varón de 34 años de edad que padecía granulomatosis de Wegener reincidente desde hace 5 años. Este paciente fue tratado con esteroides a dosis elevada, ciclosporina (5 mg/kg) y ciclofosfamida (1-2 mg/kg). Debido a la progresión de la enfermedad, en Julio de 1998 fue tratado con IR (Pregnyl), 5000 UI, por vía s.c. diariamente.

La figura 81 muestra que antes del tratamiento con IR el paciente era inmunocomprometido debido a la elevada dosis de esteroides. Tras el tratamiento con IR los niveles de linfocitos T (CD4, CD8) aumentaron y se mantuvieron dentro de un rango normal, excepto las células B. Asimismo medimos las citocinas en PBMC estimuladas con LPS y PMA/Ca obtenidas del paciente durante el tratamiento con IR. Observamos que la PBMC estimulada con LPS producía más TNF-alfa, IL-10 e IL-12 durante el tratamiento (figura 82a), mientras que la PBMC estimulada con PMA/Ca producía menos IFN-gamma (figura 82b). Así pues se demuestra que el tratamiento IR incrementa la producción de citocinas antiinflamatorias (IL-10, TNF) mientras que reduce la producción de citocina inflamatoria (IFN-gamma). Este resultado es coherente con nuestra observación clínica ya que durante los tres meses de tratamiento no se observó una mayor progresión medida por la actividad de la inflamación sinal. Estos resultados sugieren un efecto beneficioso de IR-P.

Paciente 2

Polimiositis

Definición: Una enfermedad sistémica del tejido conjuntivo que se produce por la inflamación mediada de células T provocando la destrucción de las fibras del músculo. Otras posibles causas de estos síndromes incluye activación de complementos, infección, fármacos, estrés, vacunas. Puede afectar a personas de cualquier edad pero en la mayoría de los casos se presenta en personas entre 50 y 70 años de edad, o en niños entre 5 y 15 años. Afecta a las mujeres dos veces más que a los hombres. El debilitamiento muscular puede aparecer de manera repentina o poco a poco, a lo largo de semanas o meses. Puede resultar difícil levantar los brazos por encima de la cabeza, levantarse estando sentado o subir escaleras. La voz puede verse afectada por debilitamiento de la laringe. También puede manifestarse como dolor de las articulaciones, inflamación del corazón y como enfermedad pulmonar. Una condición similar, denominada dermatomiositis, resulta evidente cuando aparece por la cara, el cuello, los hombros, la parte superior del pecho y la espalda unas ronchas de color rojo oscuro. Una malignidad puede estar asociada con este trastorno. La incidencia de polimiositis es de 5 entre cada 10,000 personas.

Paciente 2: Diagnóstico: esclerosis sistémica/polimiositis sobrepuesta (en base a la histopatología).

Caso: Una mujer de 50 años que padecía desde hace dos años esclerosis sistémica con un componente de polimiositis activa. Fue tratada con Dapsone, esteroides, metotrexato y ciclosporina. Debido a la miositis recalcitrante medida por el nivel de creatina fosfato fue tratada durante tres meses con una combinación de prednisona, zyrtec y Pregnyl 5000 U.I, por vía s.c.. Durante el tratamiento el nivel CPK se redujo desde 1100 a 750. Este refleja una reducción de la actividad de la enfermedad.

La figura 83 muestra que debido al tratamiento IR-P se fue reduciendo el número de linfocitos, células T (CD4, CD8) y células B lo que indica la regulación negativa del sistema inmune hiperactivo debido al tratamiento. Esto es también consistente con nuestros datos de citocina (figura 86) que muestra la inhibición de IL-12 estimulada por LPS y de PBMC por TNF-alfa. Asimismo se observó un incremento en la producción de IL-10 durante el tratamiento, que es una citocina antiinflamatoria (figura 86). Además, también se redujeron el CPK elevado y las encimas hepáticas (ASAT, ALAT) (figuras 84 y 85). Todo ello refleja una reducción en la actividad de la enfermedad.

Paciente 3

Diabetes mellitus (tipo I)

La diabetes mellitus es un trastorno crónico que se caracteriza por un deterioro del metabolismo de la glucosa y de otras fuentes de energía, así como por el desarrollo tardío de complicaciones vasculares y neuropáticas. La diabetes mellitus abarca un grupo de trastornos relacionados con mecanismos patógenos diferenciados que tienen la hiperglucemia como denominador común. Independientemente de la causa, la enfermedad se asocia con déficit de insulina, que puede ser total, parcial o relativo cuando se contempla en el contexto de una resistencia a la insulina coexistente. La falta de insulina desempeña un papel principal en los trastornos metabólicos vinculados a la diabetes y la hiperglucemia que, a su vez, desempeñan una función clave en las complicaciones de la enfermedad. En los Estados Unidos la diabetes mellitus, que es la cuarta causa más frecuente entre los pacientes que contactan con un médico, es una causa importante de discapacidad y mortalidad prematuras. Es la principal causa de ceguera entre las personas en edad laboral, de nefropatía terminal y de amputaciones no traumáticas de extremidades inferiores. Aumenta el riesgo de morbilidad y mortalidad cardiaca, cerebral y periférica. Como dato positivo, se puede citar que los datos más recientes indican que la mayoría de las complicaciones debilitantes de esta enfermedad pueden prevenirse o retrasarse con un tratamiento prospectivo de la hiperglucemia y de los factores de riesgo cardiovasculares.

La diabetes mellitus insulinodependiente (DMID) es uno de los tipos de diabetes definidos clínicamente y se desarrolla predominantemente en niños y adultos jóvenes, pero puede aparecer en todos los grupos de edad. La principal susceptibilidad genética a la DMID está relacionada con el complejo HLA del cromosoma 6. Estos antecedentes genéticos interaccionan con los factores ambientales (posiblemente algunos virus; alimentos y el clima) para iniciar el proceso mediado por un mecanismo inmune que provoca la destrucción de las células beta. Mientras que la diabetes independiente de insulina (DMNID), que es otro tipo de diabetes definida clínicamente, es la forma más frecuente de la enfermedad. La prevalencia de DMNID varía enormemente en cada población. Las tasas más altas se han encontrado entre los indios Pima. Los principales factores ambientales identificados como factores contribuyentes a esta forma de diabetes son la obesidad y el descenso de la actividad física. La DMNID muestra una fuerte agregación familiar en todas las poblaciones y es claramente el resultado de una interacción entre la susceptibilidad genética y los factores ambientales. Antes del desarrollo de DMNID las concentraciones de insulina son altas para el grado de glucemia y de obesidad, reflejando la presencia de la resistencia a la insulina. A medida que empeora la resistencia a la insulina aumentan las concentraciones de glucosa, con la aparición de una intolerancia a la glucosa y, finalmente, de la DMNID, cuando la respuesta de la insulina no puede compensar dicha resistencia a la insulina.

Como nuestros datos preliminares en ratones demuestran que el IR puede desplazar el fenotipo de las citocinas Th1 hacia un fenotipo Th2 y que el IR también es capaz de inhibir la diabetes en los ratones NOD, postulamos que también tendría unos efectos clínicos positivos en enfermedades inmunes del hombre, como la diabetes.

Paciente 3: Diagnóstico: Diabetes mellitus tipo I. Caso: El paciente es un varón de 21 años de edad que padece diabetes mellitus desde hace 3 meses. Fue tratado con insulina (actrapid e insulatard). En sangre se encontraron niveles altos de anticuerpos anti-células de los islotes. El sujeto fue tratado con Pregnyl en dosis de 5000 UI por vía s.c. durante tres meses, tiempo en el que su tratamiento con insulina necesario para mantener la euglucemia disminuyó como se muestra en la Figura 87. Después de retirar el Pregnyl fue necesario aumentar de nuevo la dosis de insulina (Figura 87). En este paciente con diabetes mellitus de nueva aparición las necesidades de insulina cayeron significativamente durante el tratamiento con IR-P y también mejoró el control de la glucosa, confirmado por el descenso de la concentración de HbAlc glicosilada durante el tratamiento con IR-P (Figura 87) y por el descenso de citocinas inflamatorias (IL-12, TNF-alfa, IFN-gamma) producido por PBMC estimuladas con LPS (Figura 88). Además, se observó también el aumento de IL-10 (citocina antiinflamatoria) durante el tratamiento (Figura 88). Todo ello sugiere la mejoría de la función de las células de los islotes y, eventualmente, también una mejor regulación de la glucosa.

Esclerosis múltiple y afecciones relacionadas (datos in vitro)

La esclerosis múltiple (EM) es un trastorno de causa desconocida, definida clínicamente por síntomas, signos y progresión característicos y por una anatomía patológica con áreas dispersas de inflamación que afectan al cerebro, nervios ópticos y médula espinal. Los primeros síntomas de EM aparecen con mayor frecuencia entre los 15 y 50 años de edad.

La causa de la EM es desconocida, pero ahora se opina que su patogenia implica la desmielinización inflamatoria mediada por un mecanismo inmune. El estudioanatomopatológico de un cerebro con EM muestra los datos características de un proceso infiltrativo perivascular inmunopatológico con linfocitos y monocitos, expresión del antígeno de clase II del MHC por las células en las lesiones, secreción de linfocinas y monocinas por las células inmunes activadas y ausencia de signos manifiestos de una infección. Otros datos que indican una patogenia autoinmune son (1) las alteraciones inmunológicas en sangre y líquido cefalorraquídeo (LCR) de los pacientes con EM, principalmente una activación inmune humoral intratecal, alteraciones en las subpoblaciones de linfocitos y una alta frecuencia de linfocitos activados en sangre y LCR; (2) una asociación entre EM y ciertos alotipos de clase II del MHC, (3) la respuesta clínica de los pacientes con EM a la inmunomodulación tiende a mejorar con fármacos inmunosupresores y empeora con el tratamiento interferón gamma, que estimula la respuesta inmune; y (4) importantes similitudes entre la EM y la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), un modelo animal en el que los episodios recurrentes de desmielinización inflamatoria se pueden inducir inoculando la proteína básica de la mielina o proteínas de proteolípidos a los animales susceptibles.

Los estudios epidemiológicos sugieren la participación de factores genéticos y ambientales en la etiopatogenia de la EM. La distribución geográfica irregular de la enfermedad y la aparición de varias epidemias puntuales han sugerido la participación de factores ambientales; no obstante, un estudio intenso desarrollado en los últimos 30 años no ha podido establecer una causa infecciosa. Los estudios de migraciones han demostrado que es necesaria la exposición a factores ambientales indefinidos antes de la adolescencia para el desarrollo posterior de la EM. La influencia genética está bien establecida por un exceso de concordancia entre los gemelos monocigotos comparados con los dicigotos, el agrupamiento de la EM en algunas familias, la variabilidad racial del riesgo y su asociación con alotipos de clase II del MHC. En los sujetos de raza blanca parece ser que los haplotipos DR15, DQ6, Dw2 de clase II del HLA se asocian fuerte y coherentemente con un aumento del riesgo de EM.

Los datos inmunológicos, epidemiológicos y genéticos apoyan la teoría de la exposición de individuos genéticamente susceptibles a unos factores ambientales durante la infancia (quizás por muchos virus habituales) lo que puede provocar finalmente una desmielinización inflamatoria mediada por un mecanismo inmune. Sigue sin establecerse la relación precisa que existe entre los factores genéticos, ambientales e inmunológicos y la naturaleza de los desencadenantes ambientales. Aislamos PBMC procedentes de pacientes con EM y las estimulamos con LPS o PMA/Ca. Después de 24 horas de cultivo se obtuvo el sobrenadante para el análisis de citocinas (TGF-beta, IL-10, IFN-gamma).

Paciente con EM 1 (in vitro): se encontró un aumento de la producción de TGF-beta e IL-10 en células PBMC estimuladas con LPS tratadas con IR-P (Figuras H e I). No se observaron diferencias en la producción de TGF-beta y de IL-10 en los cultivos estimulados con PMA/Ca y tratados con IR-P (Figuras 89 y 90), mientras que IR-P inhibió la producción de IFN-gamma en células PBMC estimuladas con PMA/Ca (Figura 91).

Paciente con EM 2 (in vitro): las células PBMC obtenidas a partir del paciente 2 mostraron un descenso de la producción de TGF-beta e IFN-gamma en cultivos tratados con IR-P comparadas con la estimulación con TPA/Ca sola, mientras que el tratamiento con IR-P aumentó la producción de TGF-beta estimulada con LPS (Figuras 92 y 93). La producción de IL-10 se inhibió con IR-P en ambos cultivos estimulados con LPS y TPA/Ca (Figura 94).

El efecto estimulante de IR-P sobre la producción de citocinas antiinflamatorias en las células PBMC procedentes de pacientes con EM in vitro y los efectos inhibidores sobre la producción de citocinas inflamatorias se correlacionaron con los efectos clínicos favorables del tratamiento con IR-P de los ratones SJL en los que se había inducido un EAE (ver en otros párrafos de este documento).

Línea de células epiteliales bronquiales humanas BEAS 2B (datos in vitro de asma)

Las enfermedades caracterizadas por una inflamación de las vías respiratorias afectan a una proporción sustancial de la población. Estas enfermedades son asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). En la Unión Europea, EPOC y asma, junto a la neumonía, son la tercera causa de muerte. La producción de citocinas y factores de crecimiento en respuesta a sustancias irritantes, agentes infecciosos y mediadores de la inflamación desempeñan un importante papel en el inicio, perpetuación e inhibición la inflamación aguda y crónica de las vías respiratorias.

La inflamación de las vías respiratorias se asocia con una producción y actividad excesivas de varios mediadores y citocinas liberados por las células T inflamatorias que residen en las vías respiratorias. Ahora se sabe que el epitelio no es únicamente una diana importante para la acción de los mediadores de la inflamación, sino también un participante activo en el propio proceso inflamatorio. Las células epiteliales bronquiales son capaces de reclutar células inflamatorias hacia las vías respiratorias a través de la liberación de sustancias quimioatractivas que dirigen la migración de las células inflamatorias a través del epitelio, mediante la expresión de moléculas de adhesión, y regulan la actividad inflamatoria de otras células mediante la liberación de mediadores, como citocinas, quimiocinas, metabolitos del ácido araquidónico y factores relajantes y contráctiles.

Las células epiteliales bronquiales no sólo forman una barrera pasiva sino que desempeñan también un papel activo en la respuesta inmune. Son capaces de producir varios mediadores que pueden actuar como pro- o anti-inflamatorios. Además, las células epiteliales bronquiales pueden expresar moléculas de adhesión para muchos tipos diferentes de células T, con lo que contribuyen a su reclutamiento.

El TNF-alfa producido por las células inflamatorias presenten en las vías respiratorias puede desencadenar otras citocinas y quimiocinas inflamatorias como RANTES e IL-6. También regula negativamente la producción de citocinas antiinflamatorias y, por tanto, daña la función de barrera de las células epiteliales. Los glucocorticoides inhiben la trascripción de la mayoría de citocinas y quimiocinas que son relevantes en el asma, como son IL-6, RANTES e IL-4. Esta inhibición es al menos parcialmente responsable del efecto terapéutico de los glucocorticoides.

Nuestros resultados (Figuras 71-73) son compatibles con estos resultados y muestran que dexametasona es capaz de inhibir la producción inducida por TNF-alfa de IL-6 y RANTES en la línea BEAS 2 de células B. IR-P es también capaz de inhibir la producción inducida por TNF-alfa de citocinas inflamatorias. Además, dexametasona fue capaz de restaurar la regulación negativa inducida por TNF-alfa de la citocina antiinflamatoria TGF-beta, mientras que IR-P no sólo restaura la producción de TGF-beta sino que también promueve un mayor efecto de esta citocina antiinflamatoria (Figura 73). Además, dexametasona e IR-P fueron capaces de inhibir la producción de RANTES inducida por IFN-gamma (Figura 74).

TNF-alfa también puede inducir la actividad de los marcadores de adhesión celular, como HLA-DR e ICAM-1 sobre la superficie de las células epiteliales que a continuación reclutan las células inflamatorias. De esta forma, las células epiteliales también actúan como células presentadoras del antígeno (APC). Nuestros resultados muestran que tanto dexametasona como IR-P pudieron regular negativamente la expresión de HLA-DR e ICAM-1 inducida por TNF-alfa (Figuras 75 y 76).

Estos resultados muestran que IR-P también puede afectar a la evolución clínica de las enfermedades caracterizadas por un fenotipo de citocinas de tipo Th2 como alergia, asma y algunas enfermedades parasitarias en particular.

Discusión

Los ratones diabéticos no obesos (NOD) desarrollan de forma natural una diabetes insulinodependiente (DMID) que tiene similitudes notables en su inmunopatología y síntomas clínicos con los pacientes con DMID. En consecuencia, los ratones NOD se han convertido en una valiosa herramienta para el estudio de la inmunobiología que subyace en la DMID y la genética compleja que la controla. A través de su estudio sabemos ahora que la diabetes está causada por un desequilibrio en la relación entre las subpoblaciones Th1/Th2 y en consecuencia, la destrucción de las células beta productoras de insulina. Esta destrucción está coordinada por células T CD4+ específicas del antígeno de células beta, que producen citocinas proinflamatorias como IFN-gamma, TNF-alfa/beta e IL-1. Un número de estudios cada vez mayor demuestra ahora que existe una correlación entre la diabetes (en ratones y en el hombre) y un desarrollo preferente de células de tipo Th1.

Por el contrario, se piensa que el embarazo es un fenómeno selectivo Th2 y, sorprendentemente, durante el mismo se ha observado la reducción de la intensidad de muchas enfermedades mediadas por un mecanismo inmune. Por el contrario, Gallo y cols. han demostrado que los factores mediados por hCG (HAF) presentes en la orina en el primer trimestre del embarazo tienen un efecto antitumoral (y antivírico), que se consigue posiblemente mediante un efecto citotóxico directo sobre las células tumorales y, de acuerdo con estos autores, no está mediado por una respuesta de mecanismo inmune.

Aquí demostramos que el inmunorregulador que se puede obtener, por ejemplo, a partir de la orina del (primer trimestre del) embarazo no sólo afecta a la desviación inmune comentada anteriormente durante el embarazo, sino que también afecta al desarrollo de la diabetes en los ratones NOD.

Nuestros resultados muestran que, por ejemplo, Pregnyl, un preparado de hCG parcialmente purificado a partir de la orina del primer trimestre del embarazo, puede retrasar el inicio de la diabetes, por ejemplo, en ratones NOD de 15 semanas de edad cuando reciben tratamiento únicamente durante 3 veces por semana durante cuatro semanas. Además, las células esplénicas aisladas a partir de estos ratones tratados con la transferencia también pueden retrasar el inicio de la diabetes en los ratones NOD.scid con compromiso inmune. Fraccionamos un preparado de Pregnyl para evaluar si esta actividad antidiabética reside en la propia hCG, en sus subunidades, en el núcleo G3 (producto natural de degradación de \beta-hCG) o en factores aún no identificados (HAF). Hay que recordar que Pregnyl es uno de los preparados más purificados de hCG que existen y que contiene únicamente cantidades bajas de fragmentos del núcleo R. Encontramos que la mayoría de la actividad antidiabética reside en una fracción sin hCG. Además, demostramos que la alfa-hCG y la beta-hCG recombinantes humanas tampoco tuvieron efecto. Sin embargo, no excluimos la posibilidad de que la hCG pueda actuar de forma sinérgica con otros factores en la diabetes y otras enfermedades mediadas por mecanismo inmune.

El análisis inmunohistológico de la presencia de insulina y de la infiltración en el páncreas de los ratones NOD demostró que los ratones NOD tratados con 600 UI de Pregnyl no mostraban un infiltrado significativo. Además, se observaron islotes de insulina nuevos en el páncreas, lo que demuestra un posible proceso de regeneración inducido por este tratamiento. Como se ha mencionado anteriormente, normalmente a la edad de 9 semanas las células infiltrativas penetran en los islotes y éstos se inflaman con linfocitos. En nuestros experimentos, los ratones NOD tenían 15 semanas de edad y los ratones control tratados con PBS tenían muchas células infiltrativas y casi sin células productoras de insulina en el páncreas en ese momento. Además, los ratones tratados con PBS también presentaban una relación elevada de CD8/CD4 en el bazo y muchas células T en su páncreas. Como nuestros ratones tratados tenían un cociente CD8/CD4 normal en el bazo y no se encontró infiltración en su páncreas, el aumento del cociente CD8/CD4 se debió al reclutamiento selectivo de células CD4+ en el páncreas. El IFN-gamma y el TNF-alfa están implicados en el reclutamiento de los linfocitos T (Rosenberg y cols. 1998).

Nuestros resultados demuestran que el tratamiento de los ratones NOD con 600 UI de Pregnyl durante cuatro semanas tuvo unos efectos espectaculares sobre la morfología y función de un páncreas que, por otro lado, se encontraba inflamado. Además, nuestros ratones NOD tratados con 300 UI de Pregnyl seguían vivos a las 28 semanas de edad sin tratamiento y se mantuvieron no diabéticos. También se examinaron los síntomas de enfermedades autoinmunes generalizadas en los ratones NOD que recibieron 600 UI de Pregnyl, como la enfermedad de Sjögren, que no se encontraron.

Nuestros experimentos efectuados in vitro con células esplénicas totales y células CD4+ purificadas de NOD son compatibles con los datos in vivo. Se encontró una importante inhibición de la liberación de IFN-gamma, IL-1 y TNF-alfa por las células esplénicas (datos no presentados) a partir de los ratones NOD tratados in vitro con Pregnyl, F3-5 y, en menor grado, beta-hCG recombinante humana. También se observó un aumento de la producción de IL-4, lo que implica un desplazamiento de la respuesta desde el tipo Th1 al tipo Th2 con el tratamiento. Sin embargo, las dosis mayores a 800 UI de Pregnyl provocan los resultados contrarios y pueden deberse a la presencia de una cantidad elevada de la propia hCG.

El sistema inmune está claramente implicado en el inicio de la diabetes. El tratamiento con Pregnyl afecta al sistema inmune y por tanto puede reducir la actividad de la enfermedad en los ratones NOD. Para separar la actividad de modulación inmune de Pregnyl a partir de su efecto clínico favorable, tratamos a ratones BALB/c sanos. En general, se considera que esta cepa reacciona a la estimulación con una respuesta inmune dirigida de tipo Th2. Nuestros resultados sugieren que las células T CD4+ purificadas obtenidas a partir de los ratones BALB/c tratados con Pregnyl desempeñan un nuevo desplazamiento Th2. Las mismas células, cuando son reestimuladas con Pregnyl in vitro, muestran un aumento de la producción de IFN-gamma y un descenso de la producción de IL-4, lo que implica que los efectos de Pregnyl son diferentes en cada subpoblación de células T reguladoras tras el tratamiento in vivo frente al tratamiento in vitro. Sugerimos que el tratamiento in vivo estimula el crecimiento de una población de células presumiblemente CD4+ Tri, que se caracterizan por la producción selectiva de TGF-beta y el descenso o ausencia de producción de IL-10. Se ha demostrado (O'Garra y cols. 1997) en diferentes modelos de enfermedades inmunes de mecanismo Th1 como son diabetes y EM, que estas células CD4+ Tri inhiben selectivamente la actividad de células Th1, con lo que disminuye también la intensidad de la enfermedad. De modo similar, las células T CD4+ procedentes de ratones BALB/c tratados con Pregnyl que son reestimuladas in vitro con Pregnyl muestran un aumento de células Th1 junto al descenso de las células Th2. Este resultado es compatible con una estimulación preferente de las células CD4+ Th3 que se caracterizan por una producción elevada de IL-10 y una producción baja de TGF-beta. Estas células reguladoras inhiben la producción de IFN-gamma por células Th1, así como el crecimiento de las células de tipo Th2. También se ha demostrado en los ratones NOD.scid un aumento constante de células Th2 que es responsable de la hiperglucemia menos intensa y de la naturaleza diferente de los infiltrados en los islotes del páncreas.

Nuestros resultados obtenidos en los ratones NOD tratados con 300 UI de Pregnyl y en los ratones NOD.scid reconstituidos demuestran un bajo aumento de glucosa sanguínea bajo similar, en particular en los animales NOD.scid, y una naturaleza diferente de los infiltrados comparada con la de los ratones NOD tratados con PBS. En los ratones NOD la actividad de Pregnyl podría muy bien estar mediada por la inducción de células Th3 que inhiben tanto las células Th1 como las células Th2. Estas células Th3 pueden suprimir la actividad de la enfermedad durante periodos prolongados de tiempo. En los ratones NOD.scid que no tienen células T funcionantes, la reconstitución con células esplénicas tratadas con Pregnyl está mediada por la inducción selectiva de las células Tr1 y, por tanto, inhiben solamente la subpoblación Th1. Después de periodos prolongados de crecimiento estable de las células diabetogénicas, las células Th2 son responsables del inicio tardío de una forma menos grave de diabetes. De igual modo, nuestras fracciones F3-5, pero no las fracciones F1-2, desempeñan las acciones comentadas anteriormente, argumentando que la hCG no puede ser la responsable de los efectos observados. Estas fracciones F3-5 indican principalmente hacia un efecto decisivo sobre la respuesta inmune en el inicio de la diabetes autoinmune, y es un principio activo para el tratamiento inmune de esta enfermedad y de otros trastornos de mecanismo inmune.

Además, Pregnyl y los inmunorreguladores funcionalmente equivalentes a él son eficaces en el tratamiento de la diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID). Los problemas esenciales en los pacientes que tienen DMNID son la resistencia a la insulina y la obesidad, y se ha demostrado que el TNF-(alfa) es la causa de la resistencia a la insulina que aparece en la obesidad y en la DMNID (Miles y cols. 1997, Solomon y cols. 1997, Pfeiffer y cols. 1997, Hotamisligil y cols. 1994, Argiles y cols. 1994). Esta resistencia a la insulina inducida por TNF-alfa puede revertirse por medicamentos desarrollados recientemente, como pioglitazona y metformina, y con anticuerpos anti-TNF-alfa humano obtenidos por ingeniería genética (CDP571) (Solomon y cols. 1997, Ofei y cols. 1996), que posiblemente consiguen sus acciones beneficiosas al reducir la concentración de ácidos grasos libres (AGL) en sangre inducidos por TNF-alfa o al estimular la captación de glucosa en un punto del interior celular distal a la autofosforilación del receptor de insulina en el músculo. Además, la presencia de retinopatía (Pfeiffer y cols. 1997) (una de las complicaciones tardías de la diabetes) ha estado mediada por una concentración significativamente elevada de TNF-alfa en plasma y depende del sexo (Pfeiffer y cols. 1997). El aumento de TNF-alfa se produce en varones pero no en mujeres con DMNID y puede participar en el desarrollo de la retinopatía y de otras complicaciones como la neuropatía, la nefropatía o la macroangiopatía (Pfeiffer y cols. 1997). Como Pregnyl y las fracciones 3-5 pueden actuar como moduladores inmunes, y en particular inhiben el TNF-alfa directamente o indirectamente, Pregnyl y sus fracciones 3-5 también tienen efectos en los pacientes con DMNID. Además, una incidencia menor de complicaciones de la diabetes entre las mujeres podría implicar la participación de las hormonas femeninas. Una citocina patogénica fundamental implicada en la sepsis o en el shock séptico es el mediador inmune TNF\alpha, que ocupa una función clave en la fisiopatología asociada a diversos estados inflamatorios y otras enfermedades graves, como la sepsis o el shock séptico y la caquexia. Cuando el TNF se produce en las células T (por ejemplo, por la activación de las células T a través de un superantígeno [exotoxina]) o por macrófagos a través de una endotoxina), media una respuesta inflamatoria que puede alinearse y repeler los microorganismos atacantes. Cuando la infección se disemina, la liberación posterior de grandes cantidades de TNF hacia la circulación resulta catastrófica, dañando los sistemas y desencadenando un estado de shock letal. Este efecto tóxico se produce por la acción directa del TNF sobre las células T y por la interacción con la cascada de otros mediadores endógenos inmunes, como son la IL-1 y el IFN-gamma.

Esta hipótesis se ha demostrado por la inducción de los síntomas de shock en ratones sensibilizados con D-Galactosamina y tratados con TNF\alpha, así como la inhibición de los signos letales y visibles de la enfermedad después de la infusión concurrente de mAb anti-TNF\alpha después del tratamiento con TSST-1 y D-Galactosamina.

En el modelo de endotoxina en dosis bajas y en el modelo de exotoxinas, el tratamiento con D-Galactosamina es necesario para inhibir la trascripción de las proteínas de fase aguda que permiten que el hígado elimine la toxicidad derivada de las concentraciones altas de TNF\alpha que aparecen después de la inducción del shock. La ausencia de estas proteínas de fase aguda provoca una mayor susceptibilidad de los hepatocitos de roedor ante la inducción de la apoptosis mediada por TNF\alpha. Esta apoptosis y la incapacidad para neutralizar los efectos inflamatorios del TNF\alpha provocarán finalmente la muerte.

Hemos demostrado que los factores (IR) con o sin hCG, presentes, por ejemplo, en la orina del primer trimestre de embarazo (IR-U) y en preparados comerciales de hCG (IR-P) tienen efectos reguladores inmunes. En particular, pueden inhibir las enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Como el TNF y el IFN-gamma están implicados en la patogenia de la sepsis o del shock séptico y también en las enfermedades autoinmunes e inflamatorias, IR también puede inhibir el TNF y el IFN-gamma en los estados inflamatorios agudos, como el shock. Nuestros resultados muestran que el IR inhibe la sepsis o el shock séptico en los ratones BALB/c o SJL tratados con LPS (modelo de endotoxina) o con TSST-1 (modelo de exotoxina). El IR no sólo tiene la potencia de inhibir las enfermedades inflamatorias crónicas, sino que también puede suprimir las enfermedades inflamatorias agudas como el shock. Además, también hemos demostrado que incluso un postratamiento con IR inhibe el shock. Además, nuestros datos sobre la fracción IR demuestran que la mayoría de la actividad anti-shock reside en las fracciones IR-(U/P)3-5[combinadas] que contienen principalmente cadenas individuales de hCG, homodímeros de estas cadenas o cadenas residuales del núcleo beta, los productos de degradación de estas cadenas y otras moléculas (> 30 kDa). También hemos demostrado que las mismas fracciones IR-U/P3-5 tienen un efecto antidiabético en el modelo de ratones NOD. En consecuencia, los modelos de endotoxinas y exotoxinas sirven como un modelo de lectura rápida para determinar la actividad antidiabética de los ratones NOD y de los ratones NOD.scid. Con ayuda de los modelos de endotoxinas y exotoxinas podemos comprobar la actividad antidiabética en las fracciones del IR en 48 horas.

En consecuencia, tanto el IR como Pregnyl y sus fracciones 3-5 tienen una potencia alta que suprime la diabetes autoinmune al modular el sistema inmune mediante subpoblaciones de células T reguladoras efectoras. Nuestros datos obtenidos en ratones NOD y BALB/c demuestran que pueden restaurar el equilibrio de las subpoblaciones de células T (Th1 -> Th2/Th2 -> Th1). Por lo tanto, Pregnyl y sus fracciones 3-5 son moduladores eficaces de la intensidad de otras enfermedades mediadas por un mecanismo inmune, como aquellas en las que las citocinas Th1 son las dominantes como es la artritis reumatoide (RA), la esclerosis múltiple (EM), la DMNID, el lupus eritematoso sistémico (LES), los modelos de trasplante y las enfermedades como alergias y asma, donde las respuestas de las citocinas Th2 son las dominantes. Los modelos animales de estas enfermedades (como el modelo EAE para EM, las ratas BB para DMNID, los modelos de rata Fishe y MLR para RA, el modelo OVA para alergias, los modelos MLR/Ipr y BXSB para LES), los ratones KK-Ay, las ratas GK, las ratas obesas Wistar y las ratas fa/fa proporcionan, entre otros, los modelos de otras enfermedades mediadas por un mecanismo inmune.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Muestra que los ratones NOD de 15 semanas de edad tratados con PBS durante 4 semanas se convierten en diabéticos (> 13,75 mmol/l) a la edad de 17 semanas y en una semana tenían unas concentraciones de glucosa sanguínea por encima de 30 mmol/l, mientras que los ratones NOD tratados con 300 UI de Pregnyl se mantuvieron no diabéticos hasta que fueron sacrificados (a la edad de 28 semanas) aunque el tratamiento se interrumpiese a la edad de 19 semanas. La concentración de glucosa sanguínea se mantuvo por debajo de los 8 mmol/l.

Figura 2. Muestra que los ratones NOD.scid reconstituidos que recibieron las células esplénicas procedentes de ratones NOD tratados con PBS (Figura 3) se convirtieron en diabéticos a los 22 días de la transferencia, mientras que los ratones NOD.scid reconstituidos con 600 UI de Pregnyl de ratones tratados con NOD se mantuvieron no diabéticos hasta que fuesen sacrificados (8 semanas después de la transferencia).

Figura 3. Muestra que los ratones NOD de 15 semanas de edad tratados con PBS durante 4 semanas se convierten en diabéticos (> 13,75 mmol/ I) a la edad de 17 semanas y en una semana tenían unas concentraciones de glucosa sanguínea por encima de 30 mmol/l, mientras que los ratones NOD tratados con 600 UI de Pregnyl se mantuvieron no diabéticos hasta que fueron sacrificados junto al grupo PBS (a la edad de 21 semanas). Los ratones NOD de 15 semanas de edad tratados con 300 UI de Pregnyl se mantuvieron no diabéticos hasta que fueron sacrificados (a la edad de 28 semanas) aunque el tratamiento se interrumpiese a la edad de 19 semanas. Las concentraciones de glucosa sanguínea se mantuvieron por debajo de 8 mmol/l.

Figura 4. Las células esplénicas procedentes de hembras NOD de 20 semanas de edad se aislaron y cultivaron durante 48 horas en diferentes situaciones ("-" sólo medio, "+" con anti-CD3, 50, 100, 300, 600, 800 UI/ml de Pregnyl, F1-2, F3-5, rh-hCG, rh-alfa-hCG, rh-beta-hCG [cada uno en una concentración de 200 \mug/ml]) en presencia de anti-CD3 e IL-2. Después de 48 horas se efectuó un ELISA de la citocina INF-(. Los resultados demuestran que hay una inhibición dependiente de la dosis de INF-(con Pregnyl (50-600 UI/ml) y la fracción 3-5 (F3-5) que no contienen hCG. Hay un aumento de INF-g con 800 UI/ml de Pregnyl que sugiere el efecto de la propia hCG. No se observó un efecto sobre INF-g con las fracciones 1-2 (F1-2) que contienen hCG, hCG recombinante humana (rh), rh-alfa-hCG. Se observa un ligero descenso de la concentración de INF-g con rh-beta-hCG.

Figura 5. Las células esplénicas procedentes de hembras NOD de 20 semanas de edad se aislaron y cultivaron durante 48 horas en diferentes situaciones ("-" sólo medio, "+" con anti-CD3, 50, 100, 300, 600, 800 UI/ml de Pregnyl, F1-2, F3-5, rh-hCG, rh-alfa-hCG, rh-beta-hCG [cada uno en una concentración de 200 \mug/ml]) en presencia de anti-CD3 e IL-2. Después de 48 horas se efectuó un ELISA de la citocina IL-4. Los resultados demuestran que hay un incremento dependiente de la dosis de IL-4 con Pregnyl (50-600 UI/ml) y las fracciones 3-5 (F3-5) que no contienen hCG. Hay un descenso de IL-4 con 800 UI/ml de Pregnyl que sugiere el efecto de la propia hCG. No se observó un efecto sobre la IL-4 con las fracciones 1-2 (F1-2) que contienen hCG, hCG recombinante humana (rh), rh-alfa-hCG y rh-beta-hCG.

Figura 6. Las células T CD4 procedentes del bazo de hembras NOD de 20 semanas de edad se aislaron y cultivaron durante 48 horas en diferentes situaciones ("-" sólo medio, "+" con anti-CD3, 50, 100, 300, 600, 800 UI/ml de Pregnyl, F1-2, F3-5, rh-hCG, rh-alfa-hCG, rh-beta-hCG [cada uno en concentraciones de 200 \mug/ml]) en presencia de anti-CD3, IL-2 y anti-CD28. Después de 48 horas se efectuó un ELISA de la citocina INF-gamma. Los resultados demuestran que hay una inhibición dependiente de la dosis de INF-gamma con Pregnyl (50-300 UI/ml) y las fracciones 3-5 (F3-5) que no contienen hCG. Hay un aumento de INF- gamma con 600- 800 UI/ml de Pregnyl que sugiere el efecto de la propia hCG. No se observó un efecto sobre INF-g con las fracciones 1-2 (F1-2) que contienen hCG, hCG recombinante humana (rh), rh-alfa-hCG. Se observa un ligero descenso de la concentración de INF- gamma con rh-beta-hCG.

Figura 7. Muestra el experimento de transferencia de las células esplénicas de hembras de 20 semanas de edad tratadas con PBS, 600 UI de Pregnyl, fracciones 1-2(F1-2), fracciones 3-5 (F3-5) o beta-hCG recombinante humana (b-hCG) durante 48 horas y transferidas a continuación a ratones NOD.scid de 8 semanas de edad (n= 3). Después de 22 días de la transferencia, los ratones NOD.scid que recibieron los bazos de ratones NOD tratados con PBS se hicieron diabéticos. Los ratones NOD.scid que recibieron F1-2 y b-hCG eran diabéticos después de 4 y 5 semanas respectivamente mientras que los ratones NOD.scid que recibieron 600 UI de Pregnyl y F3-5 se mantuvieron no diabéticos aproximadamente 6 semanas y a continuación todos ellos fueron sacrificados. Muestra que el efecto antidiabético máximo reside en Pregnyl y F3-5. Ya que las F1-2 que contienen principalmente hCG no tienen efecto sobre la incidencia de diabetes en estos ratones, está claro que el efecto antidiabético no reside en la propia hCG. Se observa un efecto ligeramente antidiabético de la beta-hCG recombinante humana.

Figuras 8-11

Para estudiar si Pregnyl también tiene efecto sobre los ratones de tipo Th2, se trataron ratones BALB/c (n= 5) con 300 UI de Pregnyl i.p. durante cuatro días y con PBS (n= 5). Después de aislar las células CD4+ a partir de bazos, las estimulamos con anti-CD3/IL-2 durante 48 horas y los sobrenadantes se recuperaron para determinar las citocinas IFN-gamma (Figura 8) e IL-4 (Figura 9). También tratamos las células CD4+ con dosis diferentes de Pregnyl. Posteriormente, se recuperaron los sobrenadantes para los análisis por ELISA de INF-g (Figura 10).

La Figura 8 muestra que el tratamiento in vivo con 300 UI de Pregnyl suprime INF-g y, por otro lado, aumenta la producción de IL-4. Esto implica que hay un mayor desplazamiento hacia el fenotipo Th-2. Las mismas células tratadas de nuevo in vitro con dosis diferentes de Pregnyl muestran (Figura 10) un aumento de INF-g y un descenso de IL-4 (Figura 11) que sugieren el desplazamiento hacia el fenotipo Th-1. Todos estos resultados implican que Pregnyl y F3-5 afectan al subgrupo de las células T reguladoras (Th3, Tr1).

Figura 12 Columna

Superdex 75 HR 10/30; Sistema de FPLC (Pharmacia): volumen total V_{t}= 25 ml; espacio muerto: V_{o}= 8,7ml; flujo: 1 ml/min; tampón: solución salina tamponada con fosfato 10 mM; pH 7,3; eficiencia de la columna a temperatura ambiente = 38,000 N/m; selectividad K_{AV}= 1,737 - 0,2782 log (r^{2} = 0,982), PM = peso molecular; intervalo de separación: 3.000 - 100.000 Dalton para proteínas globulares.

Método de ejecución

Método nº 4
0,0	CONC%B	0,0
0,0	ML/MIN	0,20
0,0	CM/ML	0,20
0,5	ML/MIN	0,50
0,5	CM/ML	0,50
0,8	ML/MIN	1,00
2,0	CLEAR DATA
2,0	ALARM	0,1
2,0	HOLD
2,0	VALVE.POS	1,2
2,0	MONITOR	1
2,0	LEVEL %	5,0
2,0	ML/MARK	2,0
2,0	INTEGRATE	1
4,0	VALVE.POS	1,1
6,0	PORT.SET	6,0
30,0	INTEGRATE	0
45,0	CONC %B	0,0

Muestra

Pregnyl (Organon, Nº de lote:168558, fecha de producción: 28.11.99); volumen de la muestra = 0,5 ml = 2.000 unidades; sensibilidd 0,1 AUFS.

Cromatograma

Pico 1 = fracciones 1-2: Ve = 14,7 - 15,1 ml; K_{AV}= 0,37-0,39; pico 2 = fracciones 3-5: Ve = 15,38 - 17,99 ml; K_{AV}= 0,41 - 0,57; K_{AV} = (V_{e}-V_{0})/(V_{t} -V_{0}).

El pico 1 se eluye en un volumen entre 14,7 - 15,1 ml después del inicio de la separación, lo que corresponde a un peso molecular entre 70.000 - 80.000 Dalton. Esta fracción contiene en parte la forma dimérica de hCG (Textbook of Endocrine Physiology, Second edition, J. E. Griffin, S. R. Ojeda (Ed.) Oxford University Press, Oxford, 1992, pp. 199). El pico 2 se eluye en un volumen entre 15,38 y 17,99 ml, lo que corresponde a un volumen entre 1500 - 58.000 Dalton. Esta fracción contiene parte de la subunidad -B (PM= 22.200 Dalton), productos de fragmentación de hCG y otras moléculas desconocidas hasta la fecha. Estos cálculos se basaron en la selectividad de esta columna mencionada anteriormente.

Figura 13. Mecanismos propuestos que actúan en tres modelos diferentes de sepsis o shock séptico. A) es un modelo de endotoxina en dosis altas. B) es un modelo de endotoxina en dosis bajas. C) es un modelo de exotoxina para TSST-1/SEB. En el modelo de endotoxina en dosis altas y bajas (a, b) gran parte de los efectos sistémicos de la endotoxina (LPS) están mediados por macrófagos mientras que en el modelo de exotoxina (c) los efectos sistémicos del superantígeno (TSST-1/SEB) están mediados por células T. En ambos casos, la producción de TNF, IFN e ICE (IL-1 alfa y beta) desempeña un importante papel en la patogenia del shock séptico.

Figura 14. La activación de las células T inducidas por superantígenos como TSST-1 se puede ver como una activación de células T policlonales en la que las células T que expresan una familia específica de V-beta se activan todas a través de la unión no específica de un antígeno del TCR/ MHCII/ y del superantígeno.

Figura 15. Un cromatograma por FPLC de 50 \mul de una muestra IR-U sin diluir.

Figura 16. Un cromatograma por FPLC de 500 \mul de una muestra IR-P sin diluir.

Figura 17. Mayor separación de las fracciones 2 y 3 de la Figura 15.

Figura 18. Un cromatograma por FPLC de 50 \mul de una muestra IR-U tratada con 2-mercaptoetanol.

Figura 19. Un cromatograma por FPLC de 500 \mul de una muestra IR-P tratada con 2-mercaptoetanol.

Figura 20. Se encuentra una diferencia abismal en la supervivencia de los animales tratados con IR-P antes del tratamiento con TSST-1 y D-Gal frente a los que no fueron tratados.

Figura 21. El grupo de los ratones BALB/c pretratados con IR-P no excedieron el nivel de enfermedad 2 en el modelo de exotoxina TSST-1 mientras que el grupo D-Gal-TSST-1 excedió el nivel de enfermedad 5 y fue sacrificado.

Figura 22. El pretratamiento con IR también dio lugar una pérdida de peso significativamente menor de los supervivientes a un shock tóxico.

Figura 23. Esta Figura indica un nivel mayor de activación inmune en los ratones que sufren un shock tóxico letal (barra Nº 2). Hay aún un nivel normal de leucocitos en el grupo tratado con IR-P (barra Nº 3) comparado con los ratones normales BALB/c (barra Nº 1).

Figura 24. Esta Figura indica una ligera reducción del recuento de plaquetas en el grupo TSST-1 (barra Nº 2) comparado con los ratones normales BALB/c (barra Nº 1). El recuento de plaquetas fue muy alto en el grupo de ratones BALB/c tratados con IR-P (barra Nº 3).

Figura 25. Esta Figura muestra el cromatograma de FDCG 25 en una muestra de orina tomada en el primer trimestre del embarazo (IR-U). La fracción IR-U/HMDF (fracción de alto peso molecular desalinizada en la columna) tiene aparentemente un peso molecular mayor de 5 kDa, mientras que la fracción IR-U/LMDF (fracción de bajo peso molecular desalinizada en la columna) tiene aparentemente un peso molecular de menos de 5 kDa.

Figura 26. Esta Figura muestra un cromatograma Superdex 75 GPC de la muestra IR-U/LMDF. Los perfiles obtenidos mostraron al menos 5 picos aunque las relaciones entre ellos fueron diferentes.

Figura 27. Muestra una fracción de bajo peso molecular (IR-U/LMDF) en un sistema Pharmacia Biotech SMART equipado con una columna Superdex®peptide, PC 3.2/30. Para el tampón de ejecución se usó Tris 40 mM, MgCl_{2} 5 mM + NaCl 150 mM y el flujo se ajustó a 50 ml/min durante 75 minutos, y la señal se analizó en una longitud de onda de 214 y 254 nm. Se recogieron 1-3 fracciones (LMDF1 -3). Como marcadores internos del tamaño se usaron citocromo C y Gly16. Los picos 1, 2 y 3 se eluyeron con unos 1,3 kDa, 1,15 kDa y 400 kDa, respectivamente.

Figura 28. Esta Figura muestra que hay una fuerte inhibición de la producción de IFN-gamma con el tratamiento con IR-P e IR-U/ LMDF en las células CD4+ que se polarizan hacia un fenotipo Th1 (in vivo). Se encontró únicamente una inhibición moderada de la producción de IFN-gamma observada con beta-hCG recombinante y no se encontró ningún efecto con hCG recombinante comparado con los controles (MED).

Figuras 29-31. Para saber si el IR también tiene efectos sobre la maduración de DC, se cocultivó también directamente BM a partir de los ratones NOD con GM-CSF e IR durante 7 días. En el día 8 todas las células se analizaron en un citómetro de flujo para determinar la expresión de los marcadores siguientes: CD1d, CD11c, CD14, CD31, CD40, CD43, CD80, CD86, CD95, ER-MP20, ER-MP58, F4/80, E-cad, MHC II, MHC I y RB6 8C5.

Observamos que todas las DC tratadas con IR eran menos maduras que los controles de DC tratados a continuación con GM-CSF solamente. Se llegó a esta conclusión a partir del descenso de marcadores de superficie celular CD1d, ER-MP58, F4/80, CD14 y del aumento de CD43, CD95, CD31 y E-cad. Además no se observaron cambios en marcadores de superficie celular ER-MP20/LY6C, MHC I y II (Figura 29).

Figuras 30 y 31. Muestran el cultivo de las células DC con GM-CSF durante 6 días; en el día 7 se añadieron al cultivo 300 UI/ml de IR-P (Figura 30) o 100 mg/ml de IR-U/LMDF (Figura 31) durante otras 24 horas, siendo las DC más maduras y con una funcionalidad mejor que las APC. Se llegó a esta conclusión a partir del aumento de los marcadores de superficie celular CD1d, CD40, CD80, CD86, CD95, F4/80, CD11c y MHC II (Figuras 30 y 31).

Figura 32. Muestra que debido al tratamiento con IR-P en ratones BALB/c las células CD4+ se desvían hacia el fenotipo Th2, apareciendo a partir de la inhibición de la producción del IFN-gamma comparada con el grupo control (CTL).

Figura 33. Muestra que las células CD4+ purificadas de ratones BALB/c tratados con IR-U/LMDF producen menos IFN-gamma en el método de polarización Th1 comparados con los ratones tratados con PBS, lo que sugiere una regulación negativa de subpoblaciones Th1.

Figura 34. Muestra que debido al tratamiento con IR-P en ratones BALB/c las células CD4+ se desvían hacia el fenotipo Th2, apareciendo a partir del aumento de la producción de IL-4 comparados con los ratones control (CTL).

Figura 35. Muestra que las células CD4+ purificadas de ratones BALB/c tratados con IR-U/LMDF producen más IL-4 en el método de polarización Th2 comparados con los ratones tratados con PBS, lo que sugiere una regulación positiva de las subpoblaciones Th2.

Figura 36. Muestra que las células T CD4+ procedentes de ratones tratados con PBS e IR-P (in vivo) con diferentes dosis de IR-P (in vitro) muestran un aumento de la producción de IFN-gamma que sugiere el desplazamiento hacia el fenotipo Th1 (ver también la Figura 37).

Figura 37. Muestra que las células T CD4+ procedentes de ratones tratados con PBS e IR-P (in vivo) con diferentes dosis de IR-P (in vitro) muestran un descenso de la producción de IL-4 que sugiere el desplazamiento hacia el fenotipo Th1 (ver también la Figura 36).

Figuras 38-41. Para determinar si el desplazamiento de las células T CD4+ hacia el fenotipo Th2 depende de IL-10 o de TGF-beta también se añadieron anti-IL-10 y anti-TGF-beta en los métodos de polarización de las células T CD4+ procedentes de ratones tratados con IR-P. La Figura 38 muestra un aumento de la producción de IFN-gamma en condiciones de polarización Th1 en el grupo tratado con IR-P, que sugiere que el efecto promotor de IR-P sobre la subpoblación depende al menos en parte de la IL-10 (para más detalles consultar el texto). Figura 39. Muestra un aumento de la producción de IL-4 en condiciones de polarización Th2 con el tratamiento in vitro con anti-IL-10 en el grupo control (CTL) y en el grupo tratado con IR-P, lo que sugiere la participación de IL-10 en la polarización Th1/Th2 (para más detalles, consultar el texto), mientras que no se encontraron grandes diferencias en la producción de IL-4 e IFN-gamma en condiciones de polarización Th1 y Th2 con el tratamiento con anti-TGF-beta in vitro (Figuras 40 y 41) entre los grupos control y tratado con IR-P.

Figuras 43, 44a y 44b y 45. Muestran que las células CD4+ purificadas procedentes de IR-U/LMDF producen más TFG-beta en las células procedentes de los ratones control. Cuando se añadió anti-IL-10 o anti-IL-6 en ambos cultivos, las células CD4+ procedentes de los ratones del grupo control producen más TGF-beta después del tratamiento con IR-U/LMDF, lo que sugiere una participación de IL-6 e IL-10 en la producción de TGF-beta. Este resultado es compatible con nuestros datos, que demuestran que las células esplénicas estimuladas con LPS procedentes de ratones tratados con IR producen niveles altos IL-6 (Figura 45) comparadas con las del grupo de ratones control.

Figuras 46 y 47. Muestran la reducción de la proliferación inducida por LPS y anti-CD3 después del cultivo de los esplenocitos procedentes de ratones BALB/c tratados con UVB (Figuras 46 y 47), mientras que el tratamiento con IR o con IR combinado con irradiación UVB aumentó la proliferación de las células estimuladas con LPS y anti-CD3 (Figuras 46 y 47).

Figuras 48 y 49. Para determinar si este cambio de la proliferación estimulada por LPS y anti-CD3 depende de la IL-10 tratamos a ratones carentes de IL-10 con IR-P o UVB. No se observaron cambios en el patrón de proliferación que se observa en las células esplénicas estimuladas con anti-CD3 cuando se compararon los ratones BALB/c irradiados con UVB frente a los tratados con IR-P (Figura 47), mientras que se observó el patrón inverso de proliferación en las células de los ganglios linfáticos estimuladas con anti-CD3 comparados con los grupos de ratones BALB/c irradiados con UVB de ambos grupos (Figura 49). Esto demuestra que el descenso de la proliferación estimulada con anti-CD3 después del tratamiento con UVB o el aumento de la proliferación después del tratamiento con IR-P de las células esplénicas no depende completamente de la IL-10, mientras que sí depende en las células estimuladas con anti-CD3 en los ganglios linfáticos.

Figuras 50 y 51. Muestran la proliferación estimulada con LPS de las células esplénicas a las 48 horas, observándose un aumento de la proliferación en los grupos tratados con UVB e IR-P comparados con el grupo control (Figura 51), mientras que se observó un descenso de la proliferación en ambos grupos a las 72 horas de proliferación (Figura 50).

Figuras 52 y 53. Muestran que se observó una reducción de las células B220 y M5/114 positivas y un aumento de las células CD4 y CD8 positivas en los ganglios linfáticos de los ratones carentes de IL-10 tratados con IR-P (Figura 52), mientras que se observó un aumento de las células positivas a CD4, CD8, B220 y M5/114 en el bazo (Figura 53). En el grupo tratado con UVB se encontró un aumento de las células CD8 positivas y un descenso de las células CD4, B220 y M5/114 positivas en los ganglios linfáticos (Figura 52), mientras que no se observaron cambios en los marcadores celulares entre las células esplénicas, excepto un aumento moderado de células CD8 positivas (Figura 53).

Figuras 54 y 55. Muestran que cuando las DC procedentes de ratones BALB/c se cultivan simultáneamente en presencia de GM-CSF e IR (IR-P, IR-U, IR-U3-5, IR-U/LMDF) durante 7 días, observamos que todas las DC tratadas con IR eran menos maduras que las DC control tratadas con GM-CSF solamente. Se llegó a esta conclusión a partir del descenso de marcadores de superficie celular CD1d, CD40, CD80, CD86, ER-MP58, F4/80, E-cad y MHC II (Figura 54). Además, se observó un aumento moderado de CD95 (Figura 54). Por el contrario, cuando las DC se cultivaron con GM-CSF durante 6 días y el día 7 el cultivo se suplementó con 300 UI/ml de IR-P o 100 mg/ml de IR-U (IR-U, IR-U3-5, o IR-U/LMDF) durante otras 24 horas, fueron más maduras y tenían una funcionalidad mejor que las APC. Se llegó a esta conclusión a partir del aumento de los marcadores de superficie celular CD1d, CD14, CD40, CD80, CD86, CD95, ER-MP58, F4/80, RB6 8C5, E-cad y MHC II (Figura 55).

Figura 56. Muestra un alo-MLR. Los datos de proliferación muestran que las DC tratadas con IR, en todos los cocientes de células DC frente a células T, son capaces de suprimir la proliferación (Figura 56).

Figura 57. Muestra la actividad anti-shock de la fracción IR-U/LMDF. El método para estudiar esta actividad se menciona en otra parte de este documento.

Figura 58. Para determinar el efecto del tratamiento con dosis altas de LPS en ratones tratados con IR, se inyectó a los ratones BALB/c (n= 30) por vía intraperitoneal con LPS (150 mg/kg) y la supervivencia se evaluó cada día durante 5 días. Los ratones BALB/c tratados con PBS sucumbieron al shock entre los días 1 y 2 después de una inyección de LPS en dosis altas, viviendo únicamente el 10% de los ratones en el día 5 (Figura 58). Por el contrario, el 100% de los ratones tratados con IR-P o con sus fracciones IR-P1 o IR-P3 estaban vivos en el día 5 (P< 0,001) (Figura 58), mientras que los grupos de ratones tratados con IR-P2, IR-A y dexametasona demostraron en torno al 70% de supervivientes.

Figura 59. Muestra que IR-A, IR-P y sus fracciones IR-P1 e IR-P3 generan recuentos de plaquetas dentro del intervalo normal (100-300 x 10^{9}/ml), mientras que los animales control y los tratados con IR-P2 y dexametasona tienen recuentos por debajo del intervalo normal.

Figuras 60-62. Muestra que los ratones tratados con IR-A, IR-P y sus fracciones IR-P1, IR-P2 o IR-P3 tenían una concentración relativamente baja de las enzimas ALAT, LDH1, ASAT en el plasma comparados con los ratones control y los tratados con dexametasona. Estas enzimas se encontraban en concentraciones mayores en sangre durante el shock debido a daño orgánico, por lo que estos resultados son compatibles con nuestros resultados de supervivencia (Figura 58).

Figura 63. Muestra que ratones tratados con IR-A, IR-P y sus fracciones tienen un nivel moderado o normal de leucocitos a t= 48 horas comparados con los controles y los ratones tratados con dexametasona, lo que sugiere una respuesta inflamatoria más débil en los ratones tratados con IR. Figura 64. Muestra la inhibición de la producción de IFN-gamma en la prueba de polarización Th1 de las células CD4+ aisladas procedentes de los ratones NOD tratados con IR-P o rhCG en combinación con IR-P3, mientras que se encontró una inhibición moderada de la polarización Th1 por rhCG e IR-P3 solos, lo que demuestra que el tratamiento con rhCG en combinación con IR-P3 consigue la inhibición masiva del crecimiento Th1 en los ratones NOD. Este resultado sugiere que la fracción IR-P3 necesita rhCG para conseguir su inhibición máxima de la subpoblación Th1.

Figura 65. Muestra la inhibición de la producción de IFN-gamma en las células esplénicas estimuladas con anti-CD3, obtenidas a partir de los ratones NOD tratados con IR-P, IR-P1, IR-P2 o con rhCG en combinación con IR-P3 comparados con los ratones tratados con PBS. El uso de rhCG e IR-P3 solos no consiguió el mismo efecto que en la combinación, lo que sugiere de nuevo que la fracción IR- P3 necesita rhCG para la inhibición del IFN-gamma.

Figura 66. Muestra la proliferación estimulada con anti-CD3 en tiempos diferentes (t=12, 24, 48 h) de las células esplénicas obtenidas a partir de los ratones NOD tratados con IR-P, sus fracciones, y rhCG o IR-P3 en combinación con rhCG. De nuevo los resultados son compatibles con la inhibición previa del IFN-gamma (Figura 65). En este caso, la fracción IR-P3 también necesitó rhCG para sus efectos inhibidores sobre la proliferación inducida por anti-CD3 de las células esplénicas procedentes de los ratones NOD tratados in vivo.

Figura 67. Muestra que IR-P y sus fracciones promueven la producción de IL-10 de las células estimuladas con anti-CD3 esplénicas procedentes de los ratones NOD tratados comparados con los ratones tratados con PBS.

Figura 68. Muestra que la producción de IgG2a no se inhibió por el tratamiento in vivo de los ratones NOD con IR-P2 y rhCG, mientras que el uso de IR-P, IR-P1, IR-P3 e IR-P3 en combinación con rhCG inhibió la producción de IgG2a.

Figuras 69 y 70. Muestran que el tratamiento con IR-P es capaz de retrasar la inducción de la diabetes en ambos modelos. El mecanismo por el que se produce este retardo tiene una naturaleza probablemente diferente en ellos.

Figuras 71-74. Resultados de la línea BEAS 2 de células B: muestran que dexametasona es capaz de inhibir la producción de IL-6 y RANTES inducida por TNF-alfa en la línea BEAS 2 de células B. El IR-P también es capaz de inhibir la producción de citocinas inflamatorias inducidas por TNF-alfa. Además, la dexametasona fue capaz de restaurar la regulación negativa inducida por TNF-alfa de la citocina antiinflamatoria TGF-beta, mientras que el IR-P no sólo restaura la producción de TGF-beta sino que también promueve aún más esta citocina antiinflamatoria (Figura 73). Además, tanto dexametasona como IR-P pudieron inhibir la producción de RANTES inducida por IFN-gamma (Figura 74).

Figuras 75 y 76. Análisis por citometría de flujo de la línea BEAS 2 de células B; los resultados muestran que dexametasona e IR-P fueron ambos capaces de regular negativamente la expresión de HLA-DR e ICAM-1 inducida por TNF-alfa.

Figuras 77-80. Resultados del modelo EAE; los ratones tratados con PBS únicamente perdieron peso durante las primeras tres semanas (Figura 77). Todos estos ratones tenían signos clínicos de EAE de al menos 2 y con una duración mayor de la enfermedad, excepto en los ratones que se mantuvieron resistentes a la enfermedad durante todo el experimento (Figura 78). En el grupo de ratones tratados con IR se encontró una menor pérdida de peso durante el experimento (Figura 79) y dos ratones estaban libres de enfermedad durante el experimento. Los ratones enfermos de este grupo tenían unas puntuaciones clínicas máximas de 2 y una duración corta de la enfermedad y se recuperaron más rápidamente de los síntomas de EAE que el grupo tratado con PBS (Figura 80).

Figuras 81, 82a, b. La Figura 81 muestra que antes del tratamiento con IR el paciente tenía un compromiso inmune debido a una dosis alta de esteroides. Después del tratamiento con IR los niveles de linfocitos T (CD4, CD8) aumentaron y se encontraban dentro del intervalo normal, pero no las células B. También medimos las citocinas en las células PBMC estimuladas con LPS y PMA/Ca y obtenidas en el paciente durante el tratamiento con IR. Observamos que las PBMC estimuladas con LPS produjeron más TNF-alfa, IL-10 e IL-12 durante el tratamiento (Figura 82a), mientras que las PBMC estimuladas con PMA/Ca produjeron menos IFN-gamma (Figura 82b).

Figuras 83-86. La Figura 83 muestra que debido al tratamiento con IR-P el número de linfocitos, células T (CD4, CD8) y células B disminuyó, lo que indica la regulación negativa del sistema inmune hiperactivo debido al tratamiento. Este resultado también es compatible con nuestros datos de citocina (Figura 86) que muestran la inhibición de IL-12 y TNF-alfa estimulada por IL-12 en PBMC. Además, se encontró un aumento de la producción de IL-10 durante el tratamiento; que es una citocina antiinflamatoria (Figura 86). Además, el aumento de CPK y enzimas hepáticas (ASAT, ALAT) también disminuyó (Figuras 84 y 85). Todo ello refleja el descenso de la actividad de la enfermedad.

Figuras 87 y 88. Muestran que durante el tratamiento con IR-P de los pacientes con diabetes la insulina necesaria para mantener la euglucemia disminuyó como se muestra en la Figura 87. Después de retirar el Pregnyl la necesidad de insulina volvió a aumentar de nuevo (Figura 87). En este paciente con diabetes mellitus de nueva aparición la necesidad de insulina cayó significativamente durante el tratamiento con IR-P y también se encontró un mejor control de la glucosa, apoyado por un descenso de la concentración de HbAlc glicosilada durante el tratamiento con IR-P (Figura 87) y un descenso de citocinas inflamatorias (IL-12, TNF-alfa, IFN-gamma) producidas por las PBMC estimuladas con LPS (Figura 88). Además, se observó también el aumento de IL-10 (citocina antiinflamatoria) durante el tratamiento (Figura 88). Todo ello sugiere una mejoría de la funcionalidad de las células de los islotes y, eventualmente, también una mejor regulación de la glucosa.

Figuras 89-91. Paciente 1 con EM (in vitro): se encontró un aumento de producción de TGF-beta e IL-10 en PBMC estimuladas con LPS y tratadas con IR-P (Figuras H e I). No se observaron diferencias en la producción de TGF-beta e IL-10 en cultivos estimulados con PMA/Ca y tratados con IR-P (Figuras 89 y 90), mientras que el IR-P inhibió la producción de IFN-gamma en PBMC estimuladas con PMA/Ca (Figura 91).

Figuras 92-94. Paciente 2 con EM (in vitro): Las PBMC obtenidas a partir del paciente 2 muestran una producción disminuida de TGF-beta e IFN-gamma en cultivos tratados con IR-P comparadas con la estimulación con TPA/Ca sola, mientras que el tratamiento con IR-P aumentó la producción estimulada con LPS de TGF-beta (Figuras 92 y 93). La producción de IL-10 se inhibió con IR-P en los cultivos estimulados tanto con LPS como con TPA/Ca (Figura
94).

Figuras 95 y 96. El tratamiento de los ratones BALB/c receptores con IR-P prolongó la supervivencia del injerto de piel C57BL/6 comparados con el grupo control no tratado. Los receptores del control rechazaron el injerto de piel antes de 12 días (Figura 95) mientras que los receptores tratados con IR-P pudieron prolongar el injerto hasta los 22 días después del trasplante (Figura 96). Las Figuras 95 y 96 muestran un injerto prolongado (imagen obtenida en el día 19) debido al tratamiento con IR-P y un injerto rechazado procedente de los ratones control.

Figura 97. Muestra un cromatograma IR-U/LMDF en Bio-Gel P-2.

Figura 98. Muestra un cromatograma IR-P3 en Bio-Gel P-2.

Figura 99. Muestra un cromatograma IR-A3 en Bio-Gel P-2.

Figura 100. Muestra el cromatograma obtenido con la columna de Macroshere GPC 60A de una muestra IR-P.

Se fraccionaron tres áreas seleccionadas, IR-P1 que se eluye aparentemente con un peso molecular de > 10 kDa, IR-P2 que se eluye aparentemente con un peso molecular entre 10 kDa-1 kDa e IR-P3 que se eluye aparentemente con un peso molecular < 1 kDa. Todas estas actividades se estudiaron al menos mediante la actividad anti-shock (para más detalles, consultar el texto).

Figura 101. Muestra el cromatograma obtenido con la columna de Macroshere GPC 60A de una muestra IR-P e IR-A (se inyectaron 500 UI de cada muestra con un mismo volumen de inyección). Los resultados revelaron que la muestra IR-A contiene una gran cantidad de fracción IR-A3 comparada con la fracción IR-P3 en la muestra IR-P. Hemos estudiado la misma cantidad de IR-A e IR-P para determinar su actividad anti-shock. Los resultados revelaron que IR-A tenía una actividad anti-shock baja o moderada comparada con IR-P (resultados no presentados).

Figura 102. Muestra el diagrama de flujo de los métodos de purificación 1, 2, 3 y 4 (para más detalles, consultar el texto).

Bibliografía

Abbas, A.K., K.M. Murphy, and A. Sher. 1996. Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature (Lond.). 383: 787-793.

Argiles J.M., Lopez-Soriano J., Lopez-Soriano F.J. 1994. Cytokines and diabetes: the final step? Involvement of TNF-alfalpha in both type I and II diabetes mellitus. Horm Metab.Res. 26:447-449. Atkinson, M.A., and N.K. Maclaren. 1994. The Pathogenesis of insulin-dependent diabetes mellitus. N. Engl. J. Med. 331:1428-1436.

Bach, J.F. 1991. Insulin-dependent diabetes mellitus. Curr. Opin. Immunol. 3:902-905.

Buyon J.P. 1998. The effects of pregnancy on auto-immune diseases. J. Leukoc. Biol. 63:281-287.

Elias D. 1994. The NOD mouse: a model for auto-immune insulin-dependent diabetes. (book) Auto-immune Models: A guidebook. 147-161.

Gill, P.S., Lunardi-Iskandar, Y.Gallo R.C. 1996. The effects of preparations of human chorionic gonadotropin on AIDS-related kaosi's Sarcoma. New Eng. J. Med. 335:1261-1269.

Grossman J.M., Brahn E. 1997. Rheumatoid arthritis: current clinical and research directions. J. Womens Health. 6:627-638.

Harada, M., and S. Makino. 1986. Suppression of overt diabetes in NOD mice by anti-thmocyte serum or anti-Thy 1, 2 antibody. Jikken. Dobutsu. 35:501-504. Hintzen R.Q. 1997. Th-cell modulation in multiple sclerosis. Immunology today. 18:507-508.

Hotamisligil G.S., Spiegelman B.M. 1994. Tumour necrosis factor alpha: a key component of the obesity-diabetes link. Diabetes 43:1271-1278.

Katz, J.D., C. Benoist and D. Mathis. 1995. T helper cell subsets in insulin-dependent diabetes. Science (Wash. DC). 268:1185-1188.

Liblau, R.S., S.M. Singer, and H.O. McDevitt. 1995. Th1 and Th2 CD4+ T cells in the pathogenesis of organspecific auto-immune diseases. Immunol. Today. 16:34-38. Lunardi-Iskandar, ...Gallo R.C. 1995. Tumourigenesis and metastasis of neoplastic kaposi's sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature (Lond.). 375:64-68.

Lunardi-Iskandar, Y., Bryant, J.L. Blattner W.A., Hung C.L, Flamand L, Gill P., Hermans P., Birken S., and Gallo R.C. 1998. Effects of a urinary factor from women in early pregnancy on VIH-1, VIS and mediated disease. Nature Med. 4:428-434.

Makino, S., M. Harada, Y. Kishimoto, and Y. Hayashi. 1986. Absence of insulitis and overt diabetes in athymic nude mice with NOD genetic background. Jikken. Dobutsu. 35:495-498.

Miles P.D., Romeo O.M., Higo K., Cohen A., Rafaat K., Olefsky J.M. 1997.TNF-alfalpha-induced insulin resistance in vivo and its prevention by troglitazone. Diabetes 46:1678-1683.

Miyazaki, A., T. Hanafusa, K. Yamada, J. Miyagawa, H. Fujino-Kurihara, H. Nakajima, K. Nonaka, and S. Tarui. 1985. Predominance of T lymphocytes in pancreatic islets and spleen of pre-diabetic non-obese diabetic (NOD) mice: a longitudinal study. Clin. Exp. Immunol. 60:622-630. Ofei F., Hurel S., Newkirk J., Sopwith M., Taylor R. 1996. Effects of an engineered human anti-TNF-alfalpha antibody (CDP571) on insulin sensitivity and glycemic control in patients with NIDDM. Diabetes 45:881-885. O'Garra, A., Steinman, L, and Gijbels, K. 1997. CD4+ T-cell subsets in auto-immunity. Curr. Opin. Immunol. 9(6):872-883.

O'Reilly, L.A., P.R. Hutchings, P.R. Crocker, E. Simpson, T. Lund, D. Kiossis, F. Takei, J. Baird, and A. Cooke. 1991. Characterization of pancreatic islet cell infiltrates in NOD mice: effect of cell transfer and transgene expression. Eur. J. Immunol. 21:1171-1180. Pakala, S.V., Kurrer, M.O. and Katz, J.D. 1997. T helper 2 (Th2) T cells induce acute pancreatitis and diabetes in immune-compromised nonobese diabetic (NOD) mice. J. Exp. Med. 186: 299-306.

Pfeiffer A., Janott J., Mohlig M., Ristow M., Rochlitz H., Busch K., Schatz H., Schifferdecker E. 1997. Circulating tumour necrosis factor alpha is elevated in male but not in female patients with type II diabetes mellitus. Horm. Metab Res. 29:111-114.

Raghupathy R. 1997. Th1-type immunity is incompatible with successful pregnancy. Immunology today. 18: 478-482. Rosenberg, Y.J., Anderson, A.O., and Pabst, R. 1998. VIH-induced decline in blood CD4/CD8 ratios: viral killing or altered lymphocyte trafficking?. Immunology Today 19:10-16.

Russell A.S., Johnston C., Chew C., Maksymowych W.P. 1997. Evidence for reduced Th1 function in normal pregnancy:a hypothesis for the remission of rheumatoid arthritis. J. Rheumatol. 24:1045-1050.

Sempe, P., P. Bedossa, M.F. Richard, M.C. Villa, J.F. Bach, and C. Boitard. 1991. Anti-alpha/beta T cell receptor monoclonal antibody provides an efficient therapy for auto-immune diabetes in nonobese diabetic (NOD) mice. Eur. J. Immunol. 21:1163-1169.

Solomon S.S., Mishra S.K., Cwik C., Rajanna B., Postlethwaite A.E. 1997. Pioglitazone and metformin reverse insulin resistance induced by tumour necrosis factor-alpha in liver cells. Horm. Metab. Res. 29:379-382. Zhu X.P, Satoh J., Muto G., Muto Y., Sagara M., Takahashi K., Seino H., Hirai S., Masuda T., Tanaka S., Ishida H., Seino Y., Toyota T. 1996. Improvement of glucose tolerance with immunomodulators on type 2 diabetic animals. Biotherapy 9:189-197.

Bennett, JC and Plum, F. Cecil textbook of medicine. 20th edition, page 496-501. Freudenberg, MA, Keppler, D, and Galanos, C. (1986) Infect. Immun. 51, 891-895. Perkins, David et al. (1994). Cellular immunology. 156, 310-321.

Huber, Pamer et al. (1993). Superantigens: a pathogens view of the immune system: Current communications in cell and molecular biology, vol. 7, coldspring harbor laboratory.

Miekthke, Thomas et al. (1992) J. Exp. Med. 175, 91-98. Gutierrez-Ramos, JC and Bluethmann, H. (1997) Immunology today. 18, 329-334.

Claims (55)

1. El uso de un inmunorregulador que se puede obtener a partir de la orina que es capaz de regular la actividad celular Th1 o Th2 para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune.

2. El uso de un inmunorregulador que se puede obtener a partir de la orina que es capaz de modular la diferenciación de las células dendríticas para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el cual dicho inmunorregulador es capaz de modular la diferenciación de las células dendríticas.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en el cual dicha orina se obtiene a partir de un mamífero gestante, preferiblemente en el cual dicho mamífero es una mujer.

5. El uso de un inmunorregulador que consiste en un principio activo que se puede obtener a partir de un preparado de gonadotropina coriónica de mamífero, SINDO dicho principio activo capaz de estimular a los esplenocitos obtenidos a partir de ratones obesos no diabéticos (NOD), o que comprende un principio activo funcionalmente relacionado con dicho principio activo, para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune.

6. El uso de un inmunorregulador que consiste en un principio activo que se puede obtener a partir de un preparado de gonadotropina coriónica de mamífero, siendo dicho principio activo capaz de proteger a un ratón frente a un shock séptico inducido por un lipopolisacárido, para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 en el cual dicho principio activo se encuentra en una fracción que se eluye con un peso molecular aparente de 58 a 15 kilodalton determinado mediante una cromatografía por permeabilidad en gel.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 en el cual dicho principio activo se encuentra en una fracción que se eluye con un peso molecular aparente de 15 a 1 kilodalton determinado mediante una cromatografía por permeabilidad en gel.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6 en el cual dicho principio activo se encuentra en una fracción que se eluye con un peso molecular aparente de < 1 kilodalton determinado mediante una cromatografía por permeabilidad en gel.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, 8 ó 9 en el cual dicho preparado de gonadotropina coriónica de mamífero se obtiene a partir de la orina.

11. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 en el cual dicho inmunorregulador es capaz de regular la actividad celular Th1 o Th2.

12. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 en el cual dicho inmunorregulador es capaz de modular la diferenciación de las células dendríticas.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 5 en el cual dichos esplenocitos estimulados son capaces de retrasar el inicio de la diabetes en un ratón NOD con inmunodeficiencia combinada grave reconstituido con dichos
esplenocitos.

14. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13 en el cual dicho principio activo es capaz de inhibir la producción del interferón gamma de los esplenocitos obtenidos a partir de ratones obesos no diabéticos (NOD).

15. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13 en el cual dicho principio activo es capaz de estimular la producción de interleucina 4 de los esplenocitos obtenidos a partir de ratones obesos no diabéticos (NOD).

16. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14 en el cual dicho principio activo es capaz de reducir las concentraciones plasmáticas de ASAT después de un fracaso orgánico.

17. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en el cual dicho trastorno consiste en una inflamación crónica, como diabetes, esclerosis múltiple o rechazo crónico de un trasplante.

18. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en el cual dicho trastorno consiste en una inflamación aguda, como shock séptico o anafiláctico o rechazo agudo o hiperagudo de un trasplante.

19. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en el cual dicho trastorno consiste en una enfermedad autoinmune, como lupus eritematoso sistémico o artritis reumatoide.

20. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en el cual dicho trastorno consiste en una alergia, como asma o una enfermedad parasitaria.

21. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en el cual dicho trastorno consiste en una fuerte respuesta inmune superpuesta dirigida frente a un agente infeccioso, como un virus o una bacteria.

22. El uso de acuerdo con la reivindicación 16 a 21 en el cual dicho tratamiento consiste en regular los índices relativos o la actividad de citocinas de subpoblaciones de linfocitos en un individuo tratado.

23. El uso de acuerdo con la reivindicación 22 en el cual dichas subpoblaciones consisten en células Th1 o Th2.

24. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23 en el cual dicho inmunorregulador consiste en un preparado de hCG o una fracción derivada del mismo.

25. Un inmunorregulador que se puede obtener a partir de la orina que se eluye con un peso molecular aparente de < 1 kilodalton determinado mediante una cromatografía por permeabilidad en gel y que es capaz de regular la actividad celular Th1 o Th2.

26. Un inmunorregulador que se puede obtener a partir de la orina que se eluye con un peso molecular aparente de < 1 kilodalton determinado mediante una cromatografía por permeabilidad en gel y que es capaz de modular la diferenciación de las células dendríticas.

27. Un inmunorregulador de acuerdo con la reivindicación 25 que es capaz de modular la diferenciación de las células dendríticas.

28. Un inmunorregulador de acuerdo con la reivindicación 27 en el cual dicha orina se obtiene a partir de un mamífero gestante, preferiblemente en el cual dicho mamífero es una mujer.

29. Un inmunorregulador que se eluye con un peso molecular aparente de < 1 kilodalton determinado mediante una cromatografía por permeabilidad en gel que consiste en un principio activo que se puede obtener a partir de un preparado de gonadotropina coriónica de mamífero, siendo dicho principio activo capaz de estimular a los esplenocitos obtenidos a partir de ratones obesos no diabéticos (NOD).

30. Un inmunorregulador que se eluye con un peso molecular aparente de < 1 kilodalton determinado mediante una cromatografía por permeabilidad en gel que consiste en un principio activo que se puede obtener a partir de un preparado de gonadotropina coriónica de mamífero, siendo dicho principio activo capaz de proteger a un ratón frente a un shock séptico inducido por un lipopolisacárido.

31. Un inmunorregulador de acuerdo con la reivindicación 29 ó 30 en el cual dicho preparado de gonadotropina coriónica de mamífero se obtiene a partir de la orina.

32. Un inmunorregulador de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31 que es capaz de regular la actividad celular Th1 o Th2.

33. Un inmunorregulador de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 29 a 32 que es capaz de modular la diferenciación de las células dendríticas.

34. Un inmunorregulador de acuerdo con la reivindicación 29 en el cual dichos esplenocitos estimulados son capaces de retrasar el inicio de la diabetes en un ratón NOD con inmunodeficiencia combinada grave reconstituido con dichos esplenocitos.

35. Un inmunorregulador de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 29 a 34 en el cual dicho principio activo es capaz de inhibir la producción del interferón gamma de los esplenocitos obtenidos a partir de ratones obesos no diabéticos (NOD).

36. Un inmunorregulador de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 29 a 35 en el cual dicho principio activo es capaz de estimular la producción de interleucina 4 de los esplenocitos obtenidos a partir de ratones obesos no diabéticos (NOD).

37. Un inmunorregulador de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 29 a 36 en el cual dicho principio activo es capaz de reducir las concentraciones plasmáticas de ASAT después de o durante un fracaso orgánico.

38. El uso de un inmunorregulador de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 25 a 37 para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune.

39. El uso de acuerdo con la reivindicación 38 en el cual dicho trastorno mediado por un mecanismo inmune consiste en una inflamación crónica, como diabetes, esclerosis múltiple o rechazo crónico de un trasplante.

40. El uso de acuerdo con la reivindicación 38 en el cual dicho trastorno mediado por un mecanismo inmune consiste en una inflamación aguda, como shock séptico o anafiláctico o rechazo agudo o hiperagudo de un trasplante.

41. El uso de acuerdo con la reivindicación 38 en el cual dicho trastorno mediado por un mecanismo inmune consiste en una enfermedad autoinmune, como lupus eritematoso sistémico o artritis reumatoide.

42. El uso de acuerdo con la reivindicación 38 en el cual dicho trastorno mediado por un mecanismo inmune consiste en una alergia, como asma o una enfermedad parasitaria.

43. El uso de acuerdo con la reivindicación 38 en el cual dicho trastorno mediado por un mecanismo inmune consiste en una fuerte respuesta inmune superpuesta dirigida frente a un agente infeccioso, como un virus o una bacteria.

44. El uso de acuerdo con la reivindicación 38 a 43 en el cual dicho tratamiento consiste en regular de los índices relativos o la actividad de citocinas de subpoblaciones de linfocitos en un individuo tratado.

45. El uso de acuerdo con la reivindicación 44 en el cual dichas subpoblaciones consisten en células Th1 o Th2.

46. El uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 38 a 45 en el cual dicho inmunorregulador consiste en una fracción derivada de un preparado de hCG.

47. Una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune que consiste en una fracción purificada con un principio activo que se puede obtener a partir de la orina que se eluye con un peso molecular aparente de < 1 kilodalton determinado mediante una cromatografía por permeabilidad en gel y que es capaz de estimular a los esplenocitos obtenidos a partir de ratones obesos no diabéticos (NOD), retrasando dichos esplenocitos estimulados el inicio de la diabetes en un ratón NOD con inmunodeficiencia combinada grave reconstituido con dichos esplenocitos.

48. Una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune de acuerdo con la reivindicación 47 en el cual dicho principio activo es capaz de inhibir la producción del interferón gamma o estimular la producción de interleucina 4 de los esplenocitos obtenidos a partir de un ratón no obeso diabético (NOD).

49. Una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune que consiste en una fracción purificada con un principio activo que se puede obtener a partir de la orina que se eluye con un peso molecular aparente de < 1 kilodalton determinado mediante una cromatografía por permeabilidad en gel y que es capaz de proteger a un ratón frente a un shock séptico inducido por un lipopolisacárido.

50. Una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 47 a 49 que se puede obtener a partir de un mamífero gestante, preferiblemente una mujer.

51. Una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune de acuerdo con la reivindicación 50 que consiste en un preparado de hCG de grado clínico o una fracción derivada del mismo.

52. Un método para seleccionar un inmunorregulador que consiste en determinar el efecto terapéutico de un inmunorregulador sometiendo a un animal propenso a mostrar signos de diabetes una fracción de orina o una fracción derivada de la misma y determinar el desarrollo de diabetes en dicho animal.

53. Un método para seleccionar un inmunorregulador que consiste en determinar el efecto terapéutico de un inmunorregulador sometiendo a un animal propenso a mostrar signos de shock séptico a una fracción de orina o una fracción derivada de la misma y determinar el desarrollo de shock séptico en dicho animal.

54. Un método de acuerdo con la reivindicación 52 ó 53 en el cual dicho efecto terapéutico se mide además por la determinación de los índices relativos y o la actividad de citocinas de subpoblaciones de linfocitos en dicho animal.

55. Un método de acuerdo con la reivindicación 34 en el cual dicho efecto terapéutico se mide además por la determinación las concentraciones de enzimas en dicho animal.