ES2317620T3 - Fragmentos de gonadotropina corionica humana (hcg) como inmunorregulador. - Google Patents
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Abstract
Un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos escogida entre el grupo compuesto por VLPALPQVVC, VLPALPQ, VLPALP, MTRV, MTR, PALP, QVVC, LQGV, AQGV, LQGA, ALPALP, VAPALP, ALPALPQ, VLPAAPQ, VLPALAQ y LQGVLPALPQVVC cíclico.
Description
Fragmentos de ganodotropina corionica humana
(hCG) como inmunorregulador.
La invención se refiere al campo de la
inmunología, más específicamente al campo de los trastornos mediados
por un mecanismo inmunitario como las enfermedades
inflamatorias.
El sistema inmunitario produce citocinas y otros
factores humorales que protegen al huésped cuando está amenazado
por agentes inflamatorios, invasiones microbianas o lesiones. En la
mayoría de los casos, esta compleja red defensiva restaura con
éxito la homeostasis normal, pero en otras ocasiones los mediadores
inmunológicos pueden ser realmente perjudiciales para el huésped.
Algunos ejemplos de enfermedades inmunes y problemas relacionados
con el sistema inmunitario han sido investigados exhaustivamente,
como es el choque anafiláctico, la enfermedad autoinmune y los
trastornos de los complejos inmunes.
Los últimos avances en la inmunología humoral y
celular, la biología molecular y la patología han influido en las
teorías actuales sobre la autoinmunidad, que se considera un
componente de una enfermedad mediada por un mecanismo inmunitario.
Estos avances han aumentado nuestros conocimientos sobre los
aspectos básicos de los anticuerpos, la diversidad de los
linfocitos B y linfocitos T, la generación de las respuestas inmunes
innata (efectuada por los monocitos, los macrófagos, los
granulocitos, los linfocitos citolíticos naturales, los mastocitos,
los linfocitos T \gamma\delta, el complemento, las proteínas de
fase aguda y otros) y adaptativa (linfocitos T y B y anticuerpos) o
las respuestas inmunes celular y humoral y su interdependencia, los
mecanismos de inducción de (auto)-tolerancia y los
medios por los que se desarrolla la reactividad inmunológica frente
a los constituyentes autoantigénicos.
Ya desde 1900 el dogma central de la inmunología
ha sido que el sistema inmunitario no reacciona normalmente ante sí
mismo. No obstante, recientemente ha quedado claro que las
respuestas autoinmunes no son tan poco frecuentes como se pensaba
antiguamente y que no todas las respuestas autoinmunes son
perjudiciales; algunas de ellas desempeñan un papel evidente en la
mediación de la respuesta inmune en general. Por ejemplo, algunas
formas de la respuesta autoinmune como el reconocimiento de los
antígenos de superficie celular codificados por el complejo
principal de histocompatibilidad (MHC) y de las respuestas
antiidiotípicas frente a autoidiotipos son importantes, en
realidad, esenciales, para la diversificación y funcionamiento
normal del sistema inmunitario intacto.
Aparentemente, se mantiene un sistema complejo
de comprobaciones y equilibrios entre varias subpoblaciones de las
células (es decir, linfocitos T) del sistema inmunitario, con lo que
se proporciona al individuo un sistema inmunitario que es capaz de
enfrentarse a los invasores externos. En ese sentido, la
autoinmunidad desempeña un papel regulador en el sistema
inmunitario.
No obstante, ahora también se sabe que una
respuesta autoinmune anormal es en ocasiones la causa principal de
muchas enfermedades del hombre y de animales, y otras veces es un
factor contribuyente secundario. Los tipos de enfermedades
autoinmunes se superponen con frecuencia y tiende a aparecer más de
un trastorno autoinmune en el mismo individuo, especialmente en los
que tienen endocrinopatías autoinmunes. Los síndromes autoinmunes
pueden estar mediados por una hiperplasia linfoide, por una
proliferación celular maligna linfocítica o de células plasmáticas
y por trastornos por inmunodeficiencia como la
hipogammaglobulinemia, los déficits selectivos de Ig y los déficits
de los componentes del complemento.
Las enfermedades autoinmunes, como el lupus
eritematoso sistémico, la diabetes, la artritis reumatoide, la
disfunción tiroidea posparto, la trombocitopenia autoinmune, por
nombrar sólo algunas, se caracterizan por las respuestas
autoinmunes, por ejemplo dirigidas contra determinantes de
autoantígenos ampliamente diseminados, o dirigidas contra antígenos
específicos de órganos o tejidos. En tal caso, este tipo de
enfermedades pueden verse después de unas respuestas inmunes
anormales frente a sólo una diana antigénica o frente a muchos
autoantígenos. En muchos casos, no está claro si las respuestas
autoinmunes se dirigen frente a autoantígenos no modificados o
autoantígenos que han sido modificados (o se parecen) a cualquiera
de los numerosos agentes como virus antígenos bacterianos y grupos
hapténicos.
Hasta la fecha no se ha establecido un concepto
unificado que explique el origen y patogenia de los distintos
trastornos autoinmunes. Los estudios sobre experimentación animal
apoyan la idea de que una enfermedad autoinmune puede ser
consecuencia de un amplio espectro de anomalías genéticas e
inmunológicas que difieren entre un sujeto y otro, y que se
expresan antes o después a lo largo de la vida dependiendo de la
presencia o ausencia de muchos factores superpuestos exógenos
(virus o bacterias) o endógenos (hormonas, citocinas o genes
anormales) que aceleran el proceso.
Es evidente que hay procedimientos de
comprobaciones y equilibrios similares que mantienen la enfermedad
autoinmune principal en reposo que también están comprometidos en
los trastornos mediados por mecanismo inmunitario, como una alergia
(asma), una enfermedad inflamatoria aguda como septicemia o choque
séptico, una enfermedad inflamatoria crónica (es decir, una
enfermedad reumática, síndrome de Sjögren, esclerosis múltiple),
respuestas inmunes relacionadas con el trasplante (enfermedad
injerto contra huésped, trombocitopenia postransfusional) y muchas
otras en las que los antígenos responsables (al menos inicialmente)
pueden no ser autoantígenos pero en los cuales la respuesta inmune
a dicho antígeno es, en principio, no deseada y perjudicial para el
individuo. La septicemia es un síndrome en el que los mediadores
inmunes, inducidos por ejemplo por la invasión microbiana, a través
de un daño directo o mediante otros factores, inducen un estado
agudo de inflamación que provoca la homeostasis anormal, daño
orgánico y finalmente, un choque letal. La septicemia se refiere a
una respuesta sistémica a una infección grave. Los pacientes que
tienen septicemia habitualmente manifiestan fiebre, taquicardia,
taquipnea, leucocitosis y un lugar localizado de infección. Los
cultivos microbiológicos procedentes de la sangre o del lugar de la
infección son con frecuencia, aunque no siempre, positivos. Cuando
este síndrome da lugar a hipotensión o a un fracaso multiorgánico
(MOSF), la situación se conoce como septicemia o choque séptico.
Inicialmente, los microorganismos proliferan en el nido de la
infección. Los organismos pueden invadir el torrente sanguíneo,
dando lugar a hemocultivos positivos, o pueden crecer localmente y
liberar varias sustancias al torrente sanguíneo. Tales sustancias
se agrupan en dos categorías básicas cuando son de naturaleza
patógena: endotoxinas y exotoxinas. Las endotoxinas consisten
habitualmente en componentes estructurales de los microorganismos,
como el antígeno del ácido teicoico procedente de los estafilococos
o endotoxinas procedentes de organismos gramnegativos (como LPS).
Los microorganismos sintetizan y liberan directamente las exotoxinas
(como la toxina 1 del síndrome de choque tóxico, o la enterotoxina
A, B o C estafilocócica).
Como su nombre indica, ambos tipos de toxinas
bacterianas tienen efectos patógenos, estimulando la liberación de
un gran número de mediadores inmunes endógenos derivados del propio
huésped a partir de proteínas plasmáticas o células precursoras
(monocitos/macrófagos, células endoteliales, neutrófilos, linfocitos
T y otros).
En general, es un hecho que estos mediadores
inmunes causan el daño orgánico y tisular asociado a la septicemia
o choque séptico. Algunos de estos efectos derivan de la lesión
orgánica inducida por un mediador directo. Sin embargo, es probable
que una porción de la disfunción orgánica asociada al choque se deba
a anomalías inducidas por el mediador en la red vascular, lo que
provoca alteraciones del flujo sanguíneo sistémico y regional que,
a su vez, se traducen en una hipotensión refractaria o MOSF (Bennett
y otros).
El ratón diabético no obeso (NOD) es un modelo
para las enfermedades autoinmunes, en este caso diabetes mellitus
insulinodependiente (IDDM), cuyo rasgo clínico principal es el
elevado nivel de glucosa en sangre (hipeglicemia). Dicho nivel de
glucosa en sangre elevado es provocado por la destrucción autoinmune
de las células \beta productoras de insulina en las isletas de
Langerhans del páncreas (Bach y otros, 1991, Atkinson y otros,
1994). Esto va acompañado por una infiltración celular masiva que
rodea y penetra las isletas (insulitis) compuesta de una mezcla
heterogénea de linfocitos T CD4+ y CD8+, linfocitos B, macrófagos y
células dendríticas (O'Reilly y otros, 1991).
El ratón NOD representa un modelo en el que la
autoinmunidad contra las células beta es el evento primario en el
desarrollo de IDDM. La diabetogénesis es mediada por una interacción
multifactorial entre un gen MHC clase II único y múltiples loci
genéticos no unidos, como la enfermedad en humanos. Además, el ratón
NOD demuestra maravillosamente la interacción crítica entre
herencia y medio ambiente y entre autoinmunidad primaria y
secundaria, su manifestación clínica es, por ejemplo, dependiente
de varias condiciones externas, en mayor medida de la carga de
microorganismos del medio ambiente en que se mantiene el ratón
NOD.
Como en la autoinmunidad demostrable en ratones
NOD, la mayoría de respuestas específicas de antígeno de anticuerpos
y células T se miden después de que estos antígenos sean detectados
como auto-antígenos en pacientes diabéticos. La
comprensión del papel que juegan estos
auto-antígenos en la diabetes de los NOD puede
permitir, además, distinguir entre auto-antígenos
patogénicos y autoinmunidad, es decir, un epifenómeno.
En general, los linfocitos T desempeñan un papel
central en el inicio del proceso morboso mediado por mecanismo
inmunitario (Sempe y otros 1991, Miyazaki y otros 1985, Harada y
otros 1986, Makino y otros 1986). Los linfocitos T CD4+ se pueden
separar, como mínimo, en dos subpoblaciones principales, Th1 y Th2.
Los linfocitos Th1 activados segregan IFN-\gamma
y TNF-\alpha, mientras que los linfocitos Th2
producen IL-4, IL-5 e
IL-10. Los linfocitos Th1 están implicados
críticamente en la generación de la inmunidad celular eficaz,
mientras que los linfocitos Th2 son el instrumento de la generación
de la respuesta inmune y alérgica de tipo humoral y mucosa, como es
la activación de los eosinófilos y los mastocitos y en la producción
de IgE (Abbas y otros 1996). Numerosos estudios han correlacionado
la diabetes en ratones y humanos con el desarrollo del fenotipo Th1
(Liblau y otros, 1995, Katz y otros, 1995). Por otro lado, las
células T Th2 han mostrado ser inocuas de manera relativa. Algunos
han especulado que células T Th2 de hecho pueden ser protectivas.
Katz y otros han mostrado que la capacidad de las células T CD4+ de
transferir diabetes a receptores no tratados anteriormente no radica
en la especificidad antigénica reconocida por las TCR en sí, sino
en la naturaleza fenotípica de la respuesta de las células T.
Células T Th1 fuertemente polarizadas transfirieron la enfermedad a
ratones neonatales TCR NOD, mientras que las células T Th2 no lo
hicieron, a pesar de ser activadas y de portar las mismas TCR que
la población de células T Th1 diabetogénicas. Además, la
cotransferencia de células T Th2 puede que no mejore la diabetes
inducida por Th1, aún cuando las células Th2 se cotransfieran en un
exceso de 10 veces (Pakala y otros, 1997).
La incidencia de septicemia o choque séptico ha
ido en aumento, desde los años 30 y todos los datos recientes
sugieren que este aumento continuará. Las razones para la mayor
incidencia son muchas: aumento de la utilización de dispositivos
invasivos como catéteres intravasculares, utilización extendida de
tratamientos farmacológicos citotóxicos e inmunosupresores para el
cáncer y el trasplante, aumento de la longevidad de los pacientes
con cáncer y diabetes, que son propensos a desarrollar septicemia,
y a un aumento de infecciones debido a los microorganismos
resistentes a antibióticos. La septicemia o el choque séptico es la
causa más frecuente de muerte en las unidades de cuidados
intensivos y es la decimotercera causa de muerte por orden de
importancia en los Estados Unidos. La incidencia precisa de la
enfermedad se desconoce, porque no se documenta; no obstante, una
estimación razonable en los Estados Unidos es 400.000 casos de
septicemia, 200.000 casos de choque séptico y 100.000 muertes
derivadas de esta afección.
Varios microorganismos, como bacterias
gramnegativas y grampositivas, así como hongos, pueden provocar
septicemia y choque séptico. Algunos virus y Rickettsias pueden
producir probablemente un síndrome similar. Comparadas con los
microorganismos grampositivos, las bacterias gramnegativas muestran
una mayor tendencia a producir septicemia o choque séptico.
Cualquier localización de la infección puede desembocar en
septicemia o choque séptico. Las causas frecuentes de septicemia
son la pielonefritis, la neumonía, la peritonitis, la colangitis,
la celulitis o la meningitis. Muchas de estas infecciones son
nosocomiales, apareciendo en pacientes hospitalizados por otros
problemas médicos. En los pacientes que tienen unas defensas
normales se suele identificar una localización de la infección en
la mayoría de los casos. Sin embargo, en los pacientes neutropénicos
se encuentra una localización clínica de la infección en menos de
la mitad de los pacientes con septicemia debido, probablemente, a
pequeñas infecciones clínicamente no evidentes situadas en piel o
intestino, que pueden provocar la invasión del torrente sanguíneo
en ausencia de neutrófilos circulantes adecuados. Está claro que hay
que proteger frente a la septicemia o choque séptico a los
pacientes que corren estos riesgos.
Recientemente, se han hecho esfuerzos
considerables dirigidos a identificar a los pacientes con septicemia
al principio de la evolución clínica, cuando los tratamientos
tienen más probabilidades de ser eficaces. Las definiciones han
incorporado las manifestaciones de la respuesta sistémica a la
infección (fiebre, taquicardia, taquipnea y leucocitosis) junto a
los signos de disfunción de órganos y sistemas (con alteraciones
cardiovasculares, respiratorias, renales, hepáticas, en el sistema
nervioso central, hematológicas o metabólicas). Las definiciones
más recientes usan el término (síndrome de respuesta inflamatoria
sistémica) (SIRS), resaltando que la septicemia es un ejemplo de
las respuestas inflamatorias del cuerpo mediadas por mecanismo
inmunitario que se pueden desencadenar no sólo por infecciones,
sino también por trastornos no infecciosos como traumatismos o
pancreatitis (para obtener información sobre la interrelación
existente entre la respuesta inflamatoria sistémica (SIRS),
septicemia e infección, véase Crit. Care Med. 20:864, 1992; para
consultar una revisión sobre las secuencias patógenas de los
eventos que se desarrollan en la septicemia o choque séptico, véase
N Engl J Med 328:1471, 1993).
La toxina del síndrome de choque tóxico
(TSST-1) representa la exotoxina clínicamente más
relevante, identificada como el agente causante en más del 90% de
los casos de síndrome de choque tóxico (en los que el choque tóxico
se define como una septicemia o choque séptico causado por
exotoxinas superantigénicas). Los superantígenos difieren de los
antígenos "normales" porque no requieren el procesamiento
celular antes de mostrarse en la molécula del MHC. Por el
contrario, se unen a una región semiconservada situada en el
exterior del TCR y provocan un "reconocimiento" falso de los
antígenos propios que se muestran en la clase II del MHC (Perkins y
otros; Huber y otros 1993). Este efecto se traduce en una activación
"falsa" de los linfocitos T y del APC, lo que provoca la
proliferación y activación de las funciones efectoras y la secreción
de citocinas. Debido a la activación policlonal de los linfocitos T
por el superantígeno, se produce un extenso choque sistémico debido
a la liberación excesiva de citocinas inflamatorias (Huber y otros
1993, Miethke y otros 1992).
Las citocinas inflamatorias implicadas en la
septicemia son similares. Estos mediadores inmunes son el factor de
necrosis tumoral (TNF), interferón gamma
(IFN-gamma), óxido nítrico (ON) e interleucina 1
(IL-1), que se liberan masivamente por monocitos,
macrófagos y otros leucocitos en respuesta a toxinas bacterianas
(Bennett y otros, Gutiérrez-Ramos y otros 1997). La
liberación de TNF y de otros mediadores endógenos puede provocar
varias reacciones fisiopatológicas en la septicemia, como fiebre,
leucopenia, trombocitopenia, cambios hemodinámicos, coagulación
intravascular diseminada, así como la infiltración de leucocitos y
la inflamación de varios órganos, todo lo cual puede conducir
finalmente a la muerte. El TNF también hace que las células
endoteliales expresen receptores de adherencia (selectinas) y
pueden activar a los neutrófilos para que expresen ligandos para
estos receptores que ayudan a su vez a los neutrófilos a adherirse
a la superficie celular del endotelio para la adherencia,
marginación y migración hacia los focos inflamatorios de los tejidos
(Bennett y otros). El bloqueo del proceso de adherencia con
anticuerpos monoclonales previene el daño tisular y mejora la
supervivencia en un modelo animal de septicemia o choque séptico
(Bennett y otros).
Estos descubrimientos, tanto en una enfermedad
autoinmune como en una enfermedad inflamatoria aguda o crónica,
subrayan la existencia propuesta de las células que regulan el
equilibrio entre las subpoblaciones Th activadas. Los posibles
trastornos de este equilibrio se inducen por una reactividad
alterada, como la que se produce en las poblaciones de linfocitos T
reguladores que pueden provocar enfermedades mediadas por un
mecanismo inmunitario que, a su vez, desembocan en la ausencia o
sobreproducción de algunas citocinas fundamentales (O'Garra y otros
1997). Estas subpoblaciones Th son dianas potenciales de la
regulación farmacológica de las respuestas inmunes.
En general, los trastornos mediados por un
mecanismo inmunitario son difíciles de tratar. Muchas veces se
aplican medicaciones de amplio espectro, como el tratamiento con
corticoesteroides o cualquier otro fármaco antiinflamatorio de
amplio espectro que, en muchos aspectos, pueden ser perjudiciales
para el individuo tratado.
En general, hay una necesidad de disponer de
posibilidades mejores y más específicas que permitan regular las
comprobaciones y equilibrios del sistema inmunitario y tratar los
trastornos mediados por un mecanismo inmunitario.
En la presente invención se da a conocer, entre
otros, un inmunorregulador (NMPF) que se puede obtener o sintetizar
a partir de un metabolito urinario de hCG, en particular a partir de
formas cortadas de b-hCG, u homólogos peptídicos
(sintéticos) o análogos del mismo. Estas formas de
b-hCG presentan cortes de los enlaces peptídicos
dentro de la subunidad b (Birken y otros, Endocrinology
133:1390-1397, 1993).
El documento WO9959617 da a conocer que la hcg
(gonadotropina coriónica humana) tiene una actividad beneficiosa en
ciertos estadios de enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias.
Además, da a conocer que esta actividad no radica en la hcg nativa,
sino en las subunidades moleculares inferiores o en los productos de
degradación. Además, parece que las preparaciones de hcg,
principalmente sus fracciones moleculares inferiores, son
beneficiosas para el tratamiento de choque (séptico) y otras
enfermedades inflamatorias. De forma sorprendente, se ha descubierto
que una gama de productos de degradación de
beta-HCG dan lugar a una cascada de
inmunorreguladores (NPMF) que desempeñan multitud de funciones. De
forma aún más sorprendente, dichos inmunorreguladores están
interrelacionados y se derivan los unos de los otros. La invención
da a conocer un péptido aislado que consiste en una secuencia de
aminoácidos escogida entre el grupo compuesto por VLPALPQVVC,
VLPALPQ, VLPALP, MTRV, MTR, PALP, QVVC, LQGV, AQGV, LQGA, ALPALP,
VAPALP, ALPALPQ, VLPAAPQ, VLPALAQ y LQGVLPALPQVVC cíclico y una
composición farmacéutica que comprende como componente activo, como
mínimo, uno de dichos péptidos.
En el presente documento, se da a conocer un
inmunorregulador que es capaz de regular negativamente las
concentraciones de células Th1 o de regular positivamente las
concentraciones de células Th2, o de influir en su relación
porcentual en un animal, pudiendo dicho inmunorregulador obtenerse a
partir de la orina u otras fuentes de productos corporales como
suero, suero de leche, extracto de placenta, células o tejidos. Que
se puede obtener, significa en esta descripción la obtención
directa o indirecta de dicho NMPF a partir de dicha fuente, siendo
el NMPF por ejemplo obtenido a través de una síntesis química o a
partir de fuentes naturales de origen animal o vegetal.
Éste permite regular los índices relativos y/o
la actividad de citocinas de subpoblaciones de células
linfocitarias, dendríticas o presentadoras de antígenos en un
animal enfermo (por ejemplo, el hombre), preferentemente cuando
estas subpoblaciones de linfocitos consisten en poblaciones Th1 o
Th2, o en poblaciones DC1 o DC2. En general, los linfocitos T
colaboradores CD4+ vírgenes (Th) desarrollan unas células efectoras
funcionalmente maduras tras la estimulación con el péptido
antigénico relevante que se encuentra en las moléculas de clase II
del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), introducidas
por las células presentadoras de antígenos (APC). Basado en el
juego característico de citocinas producidas, los linfocitos Th se
dividen habitualmente en, como mínimo, dos subpoblaciones
diferentes: linfocitos Th1 que producen exclusivamente interleucina
2 (IL-2), interferón-gamma
(IFN-\gamma) y linfotoxina, mientras que los
linfocitos Th2 producen IL-4, IL-5,
IL-6, IL- 10 e IL-13. Estas
subpoblaciones Th1 y Th2 parecen ser los extremos de los perfiles de
producción de citocinas y entre ambas subpoblaciones polarizadas
cada linfocito Th individual muestra una expresión génica más
diferencial que coordinada de citocinas. Estas subpoblaciones se
desarrollan a partir de unos linfocitos Th precursores comunes
(Thp) después de ser activados con los péptidos relevantes sobre las
células Th0, produciéndose una serie de citocinas como son
IL-2, IL-4, IL-5 e
IFN-\gamma. Estos linfocitos Th0 activados se
polarizan posteriormente en dirección Th1 o Th2 según la
composición celular y la composición de citocinas de su
microentorno. Las células presentadoras de antígenos, como las
distintas subpoblaciones de células dendríticas y las subpoblaciones
de macrófagos, determinan principalmente esta polarización al
desarrollo de subpoblaciones Th1 o Th2. Parece que las
subpoblaciones Th1-Th2 regulan mutuamente entre sí
los perfiles de producción de citocinas, principalmente a través de
IFN-\gamma e IL-10 y a partir de
este concepto se racionalizó que los trastornos del equilibrio entre
ambas subpoblaciones pueden dar lugar a distintas manifestaciones
clínicas [5]. IL-12 es un factor dominante que
promueve la polarización de la subpoblación Th1 y de las células
dendríticas y macrófagos para producir IL-12.
Además, IL-12 induce la producción de
IFN-\gamma por los linfocitos T y los linfocitos
citolíticos naturales (NK). Recientemente, se ha descrito que
IL-18 actúa sinérgicamente con IL-12
para inducir el desarrollo de Th1. La polarización de los
linfocitos Th2 depende fundamentalmente de la presencia de
IL-4 producida por linfocitos T o basófilos y
linfocitos T. También se ha demostrado que la IL-6
derivada de APC induce pequeñas cantidades de IL-4
que participan en el desarrollo de las células Th. La prostaglandina
E_{2} (PGE_{2}) derivada de IL-10 y APC inhibe
la producción de IL-12 y el cebado de la
subpoblación Th1.
El paradigma Th1-Th2 ha sido
útil para establecer la correlación entre la función de los
linfocitos Th1 con la inmunidad por mediación celular (respuestas
inflamatorias, hipersensibilidad retardada y citotoxicidad) y de
los linfocitos Th2 con la inmunidad humoral. En general, entre las
enfermedades infecciosas la resistencia a las bacterias, hongos y
protozoos intracelulares está ligada a la consecución de una
respuesta Th1 satisfactoria. Las respuestas Th1 también se pueden
vincular a una determinada afección, como artritis, colitis y otros
estados inflamatorios. La protección eficaz frente a patógenos
extracelulares, como helmintos, requiere principalmente la
respuesta Th2 y un aumento de la inmunidad humoral puede desembocar
en una neutralización satisfactoria de los patógenos mediante la
producción de anticuerpos específicos.
En el presente documento, se da a conocer un
inmunorregulador capaz de modular la diferenciación de las células
dendríticas. El crecimiento selectivo de los linfocitos Th1 frente a
los linfocitos Th2 depende de la interacción de los linfocitos Th
precursores con las células presentadoras de antígenos (APC) que
transportan el péptido relevante junto a sus moléculas de clase II
del MHC. Las citocinas liberadas por las APC y que se presentan
durante la interacción inicial entre las células dendríticas y el
receptor pertinente de los linfocitos T son las que dirigen la
diferenciación en subpoblaciones Th1 frente a subpoblaciones Th2.
Recientemente, se han descrito en el hombre dos precursores
diferentes de DC (mieloide frente a linfoide). El desarrollo
selectivo de DC1 a partir de los precursores mieloides se produce
después de la estimulación con el ligando CD40 o una endotoxina y
da lugar a una producción elevada de IL-12. Los
precursores linfoides dan lugar a células DC2 después de la
estimulación con el ligando CD40 y producen IL-1,
IL-6 e IL-10. Estas citocinas tienen
una importancia capital para dirigir el desarrollo de los
linfocitos Th activados: se necesita IL-4 para el
crecimiento de linfocitos de tipo Th2, que puede potenciarse en
gran medida por la presencia de IL-10, mientras que
la diferenciación selectiva a células de tipo Th1 depende
exclusivamente de la presencia de IL-12. Como los
DC1 se caracterizan por la producción de IL-12,
inducirán principalmente el crecimiento de linfocitos de tipo Th1,
mientras que DC2 produce IL-10 y promueve
selectivamente el desarrollo de linfocitos Th2 en presencia de
IL-4 exógena. En esta descripción se demuestra que
un NMPF como el proporcionado por la invención es capaz de regular o
modular la actividad y diferenciación de DC, con lo que permite una
diferenciación y actividad selectivas de los linfocitos Th1 y/o
Th2.
En el presente documento se da a conocer un
inmunorregulador que comprende un componente activo obtenible a
partir de una preparación de gonadotropina coriónica de mamífero,
dicho componente activo es capaz de estimular esplenocitos
obtenidos de un ratón diabético no obeso (NOD), o que comprende un
componente activo relacionado funcionalmente con dicho compuesto
activo, por ejemplo, que permite la regulación o modulación de la
actividad DC y la diferenciación, o permite la diferenciación
selectiva de la actividad de los linfocitos Th1 y/o Th2, en caso de
inflamación crónica, tal como diabetes o rechazo crónico de
transplante, por ejemplo como se muestra en la descripción
detallada de la presente memoria, en la que dichos esplenocitos
estimulados son capaces de retrasar la aparición de diabetes en un
ratón NOD inmunodeficiente combinado severo reconstituido con dichos
esplenocitos, o en la que dicho componente activo es capaz de
inhibir la producción de interferón gamma de esplenocitos obtenidos
de un ratón diabético no obeso (NOD), o en la que dicho componente
activo es capaz de estimular la producción de
interleucina-4 de esplenocitos obtenidos de un ratón
diabético no obeso (NOD).
La invención da a conocer un inmunorregulador
que comprende un componente activo obtenible a partir de una
preparación de gonadotropina coriónica de mamífero, dicho componente
activo es capaz de proteger a un ratón frente a un choque séptico
inducido por un lipopolisacárido, por ejemplo, permitiendo la
actividad y diferenciación de DC regular o modulada, o permitiendo
la diferenciación y actividad selectiva de los linfocitos Th1 y/o
Th2, en caso de una inflamación aguda, como se ve en el choque o en
el rechazo (hiper)agudo del trasplante, en la cual dicho
principio activo es capaz de reducir la ASAT o la concentración
plasmática de otras enzimas relevantes después de o durante un
fracaso orgánico, como se observa habitualmente en el choque.
Aunque dicho inmunorregulador, según la
invención, se obtiene fácilmente como metabolito urinario de la
gonadotropina o como producto de degradación de la orina, por
ejemplo, en la cual dicho preparado de gonadotropina coriónica de
mamífero se obtiene a partir de la orina, pero también se pueden
utilizar otras fuentes, como suero, células o tejidos que contienen
gonadotropina. También a partir de dichas fuentes se da a conocer un
inmunorregulador, según la invención, que es capaz de, por ejemplo,
regular la actividad de los linfocitos Th1 y/o Th2, o que es capaz
de modular la diferenciación de las células dendríticas. En
particular, como inmunorregulador, se da a conocer un péptido
(sintético) que se puede obtener o sintetizar a partir de
beta-HCG, preferentemente a partir de
beta-HCG cortada. Por supuesto, dicho péptido, o un
equivalente funcional del mismo, se puede obtener o sintetizar a
partir de gonadotropinas de otros mamíferos, según lo explicado
anteriormente en el presente documento. Dicho péptido es capaz, por
ejemplo, de proteger frente al choque séptico u otros trastornos
mediados por un mecanismo inmune. Preferentemente, dicho
inmunorregulador peptídico se obtiene a partir de un péptido que
presenta, como mínimo, 10 aminoácidos, tal como un péptido que
presenta una secuencia de aminoácidos MTRVLQGVLPALPQVVC o un
fragmento funcional (p.ej., un producto de degradación) o un análogo
funcional del mismo. En el presente documento fragmentos
funcionales se refiere al efecto o actividad inmunorreguladora,
como puede ser medida, por ejemplo, en el choque séptico o en el
modelo experimental de ratón NOD. Los fragmentos pueden ser algo
más pequeños o más grandes (es decir, 1 ó 2 aminoácidos) por uno o
ambos lados, mientras aún muestren actividad funcional. De manera
sorprendente se ha encontrado en los sistemas de ensayo en animales,
como el que se da a conocer en este documento, que una gama de
productos de degradación de HCG-beta da lugar a una
cascada de péptidos inmunorreguladores con una serie de funciones.
Aún más sorprendentemente, dichos péptidos inmunorreguladores están
interrelacionados y derivados unos de otros y también pueden ser
producidos de manera sintética.
Un péptido inmunorregulador, como se da a
conocer en la presente invención, es obtenible o derivable de una
gonadotropina de un mamífero gestante, preferentemente un humano,
por ejemplo, obtenible de una preparación farmacológica preparada
para contener gonadotropinas (placentarias), tal como gonadotropina
de suero de yegua gestante (PMSG) encontrada en suero de yeguas
preñadas o extracto de útero de ratón gestante (PMUE), extraído de
úteros de ratonas grávidas o gonadotropina coriónica humana (hCG o
HCG) encontrada en sangre u orina de mujeres gestantes. Un NMPF,
como se da a conocer en la presente invención, puede estar asociado
con o sin gonadotropina, como por ejemplo la que está presente en
la orina de primer trimestre de gestación (NMPF) y en preparaciones
de hCG comerciales (NMPF) tiene efectos inmunorreguladores.
En particular, se da a conocer un
inmunorregulador en el que dicho fragmento funcional comprende un
péptido
que presenta, como mínimo, 10 aminoácidos, tal como uno que presenta la secuencia de aminoácidos,
LQGVLPALPQVVC (\beta45 + \beta48), o VLPALPQVVC (\beta48) o LQGVLPALPQ (\beta45), o un análogo funcional del mismo, denominado también en el presente documento NMPF-K. Dicho inmunorregulador que comprende dicho péptido (o mezcla de péptidos) que presenta la longitud deseada de, como mínimo, aproximadamente 10 aminoácidos (y en especial cuando se encuentra unido a una molécula de mayor tamaño, por ejemplo cuando se encuentra unido por medio de su cisteína a otro fragmento beta-HCG), regula en general el equilibrio Th1/Th2 así como la inmunidad innata durante un trastorno mediado por un mecanismo inmune. Por ejemplo, en el caso del choque séptico, la proliferación inducida por LPS de los esplenocitos o la diabetes se ven acelerados o agravados. Se da a conocer una actividad similar para un péptido con una cadena relativamente pequeña (tercer inmunorregulador, 3-5 aminoácidos de longitud) que comprende MTRV o MTR o QVVC o VVC o CLQG o LQGV o LQG (y en especial cuando se encuentra unido a una molécula de mayor tamaño, por ejemplo cuando se encuentra unido por medio de su cisteína a otro fragmento beta-HCG).
que presenta, como mínimo, 10 aminoácidos, tal como uno que presenta la secuencia de aminoácidos,
LQGVLPALPQVVC (\beta45 + \beta48), o VLPALPQVVC (\beta48) o LQGVLPALPQ (\beta45), o un análogo funcional del mismo, denominado también en el presente documento NMPF-K. Dicho inmunorregulador que comprende dicho péptido (o mezcla de péptidos) que presenta la longitud deseada de, como mínimo, aproximadamente 10 aminoácidos (y en especial cuando se encuentra unido a una molécula de mayor tamaño, por ejemplo cuando se encuentra unido por medio de su cisteína a otro fragmento beta-HCG), regula en general el equilibrio Th1/Th2 así como la inmunidad innata durante un trastorno mediado por un mecanismo inmune. Por ejemplo, en el caso del choque séptico, la proliferación inducida por LPS de los esplenocitos o la diabetes se ven acelerados o agravados. Se da a conocer una actividad similar para un péptido con una cadena relativamente pequeña (tercer inmunorregulador, 3-5 aminoácidos de longitud) que comprende MTRV o MTR o QVVC o VVC o CLQG o LQGV o LQG (y en especial cuando se encuentra unido a una molécula de mayor tamaño, por ejemplo cuando se encuentra unido por medio de su cisteína a otro fragmento beta-HCG).
Más en particular, se da a conocer un primer
inmunorregulador que comprende un fragmento funcional que comprende
una secuencia de aminoácidos VLPALPQVVC o LQGVLPALPQ o un análogo
funcional del mismo, que contrarresta las actividades reguladoras
de otro segundo inmunorregulador, comprendiendo dicho fragmento
funcional una secuencia de aminoácidos de entre 9 y 6 aminoácidos
(también denominada en el presente documento
NMPF-Kb), tal como VLPALPQ o GVLPALPQ o GVLPALP o
VLPALP o un análogo funcional del mismo, que, por ejemplo, es capaz
de regular el equilibrio Th1/Th2, así como la inmunidad innata
durante un trastorno mediado por un mecanismo inmune, de tal modo
que es capaz de reducir los síntomas clínicos observados durante los
trastornos mediados por un mecanismo inmune, tales como el choque
séptico, la proliferación inducida por LPS de los esplenocitos o la
diabetes, en lugar de acelerar o agravar estos síntomas propios de
los trastornos mediados por un mecanismo inmune, tal y como se
describe, por ejemplo, en la descripción detallada, en donde el
NMPF-Kb es capaz de proteger a un ratón frente a un
choque séptico inducido por un lipopolisacárido u otras alteraciones
agudas o crónicas inmuno-mediadas tal como se
explica en esta descripción. Dado que se produce un solapamiento
entre los péptidos \beta45 y \beta48 (\beta45; LQGVLPALPQ
\beta48: VLPALPQVVC), también evaluamos el efecto del péptido
desnaturalizado \beta45+\beta48
(LQGVLPALPQVVC) sobre la proliferación inducida por LPS (in vitro) y actividad antichoque (in vivo) en ratones BALB/c. Nuestros resultados demostraron que el péptido \beta45+\beta48 desnaturalizado inhibe la proliferación inducida por LPS y el choque séptico in vivo. Los productos de degradación se generan mediante proteólisis, por ejemplo mediante lisis con leucocito elastasa, y pueden verse sometidos a una modificación adicional como, por ejemplo, mediante la actividad de las (glutatión) transferasas. Uno de los posibles productos de degradación del péptido \beta45+\beta48 es LQG, que tiene un aspecto similar a la glutationa (un tripéptido de G, C y Q con L-glutamato que posee un enlace isopeptídico con el grupo amino de la L-cisteína). Hemos demostrado que el NMPF también inhibe la diabetes inducida por la (toxina) estreptozotocina (SZ) en ratones, a través de la destrucción de las células beta. Uno de los mecanismos implicados en la destrucción de las células beta pancreáticas es la formación de los radicales reactivos (ROS, NO, etc.), que también desempeñan una función importante en la patogenia de muchas enfermedades como la nefropatía, la nefropatía obstructiva, el rechazo de aloinjerto renal agudo y crónico, enfermedades autoinmunes (como SLE, artritis reumatoide, diabetes, MS), el SIDA, enfermedades relacionadas con angiogénesis, aterosclerosis, trombosis y diabetes mellitus de tipo II. Así pues, es probable que el NMPF también actúe como "antioxidante". Por ejemplo, los productos de degradación de \beta45+\beta48 tales como los péptidos LQG o CLQG, solos o en combinación con ciertos hidratos de carbono, o modificados con aminoácidos no identificados o con aminoácidos no proteicos tales como \beta-alanina, ácido \gamma-aminobutírico, ornitina, etc. poseen una actividad inmunomoduladora (NMPF).
(LQGVLPALPQVVC) sobre la proliferación inducida por LPS (in vitro) y actividad antichoque (in vivo) en ratones BALB/c. Nuestros resultados demostraron que el péptido \beta45+\beta48 desnaturalizado inhibe la proliferación inducida por LPS y el choque séptico in vivo. Los productos de degradación se generan mediante proteólisis, por ejemplo mediante lisis con leucocito elastasa, y pueden verse sometidos a una modificación adicional como, por ejemplo, mediante la actividad de las (glutatión) transferasas. Uno de los posibles productos de degradación del péptido \beta45+\beta48 es LQG, que tiene un aspecto similar a la glutationa (un tripéptido de G, C y Q con L-glutamato que posee un enlace isopeptídico con el grupo amino de la L-cisteína). Hemos demostrado que el NMPF también inhibe la diabetes inducida por la (toxina) estreptozotocina (SZ) en ratones, a través de la destrucción de las células beta. Uno de los mecanismos implicados en la destrucción de las células beta pancreáticas es la formación de los radicales reactivos (ROS, NO, etc.), que también desempeñan una función importante en la patogenia de muchas enfermedades como la nefropatía, la nefropatía obstructiva, el rechazo de aloinjerto renal agudo y crónico, enfermedades autoinmunes (como SLE, artritis reumatoide, diabetes, MS), el SIDA, enfermedades relacionadas con angiogénesis, aterosclerosis, trombosis y diabetes mellitus de tipo II. Así pues, es probable que el NMPF también actúe como "antioxidante". Por ejemplo, los productos de degradación de \beta45+\beta48 tales como los péptidos LQG o CLQG, solos o en combinación con ciertos hidratos de carbono, o modificados con aminoácidos no identificados o con aminoácidos no proteicos tales como \beta-alanina, ácido \gamma-aminobutírico, ornitina, etc. poseen una actividad inmunomoduladora (NMPF).
Sin pretender depender de una teoría, la
actividad del NMPF-K y del NMPF-Kb
se puede describir como el mantenimiento de un equilibrio Th1/Th2,
en donde el NMPF-K actúa uniéndose a un receptor
adecuado pero sin activarlo, mientras que el
NMPF-Kb se une a dicho receptor y lo activa para
regular el equilibrio Th1/Th2 de forma beneficiosa. El
NMPF-K y el NMPF-Kb actúan ambos
como ligandos de la misma molécula receptora o, como mínimo, de
moléculas receptoras similares o semejantes desde el punto de vista
conformacional.
Por ejemplo, nuestros resultados muestran que
NMPF-Kb inhibe la septicemia o el choque séptico
causado por una endotoxina o una exotoxina. El
NMPF-Kb como el dado a conocer por la invención
inhibe o contrarresta una enfermedad autoinmune mediada por un
mecanismo inmune, las enfermedades inflamatorias crónicas y también
las enfermedades inflamatorias agudas.
Un inmunorregulador como el dado a conocer en la
presente invención (NMPF) tiene efectos reguladores inmunes. En
particular, el NMPF puede inhibir o regular las enfermedades
autoinmunes e inflamatorias agudas y crónicas. El TNF y el
IFN-gamma están implicados en la patogenia en la
enfermedad inflamatoria aguda, como septicemia o choque séptico, y
también en las enfermedades autoinmunes y las enfermedades
inflamatorias crónicas. Como el NMPF puede regular las
subpoblaciones de linfocitos T e inhibir el TNF y el
IFN-gamma, el NMPF se puede utilizar para tratar,
suprimir o prevenir los trastornos mediados por mecanismos inmunes
como septicemia o choque séptico (enfermedad inflamatoria aguda).
Por ejemplo, nuestros resultados muestran que
NMPF-Kb inhibe la septicemia o el choque séptico
causado por una endotoxina o una exotoxina. El
NMPF-Kb como el dado a conocer por la invención
inhibe o contrarresta las enfermedades inflamatorias.
Se han realizado descripciones de casos aislados
y de estudios de laboratorio que indicaban previamente que la hCG
podría tener un efecto frente al sarcoma de Kaposi y frente al virus
de la inmunodeficiencia humana (Treatment Issues, Julio/Agosto
1995, página 15. Se ha observado que los preparados de hCG tienen un
efecto apoptótico directo (citotóxico) sobre el sarcoma de Kaposi
(KS) in vitro y en pacientes y en ratones inmunodeficientes,
y que tiene un efecto prohematopoyético en los pacientes
inmunodeficientes (Lunardi-Iskandar y otros, Nature
375, 64-68; Gill y otros, New. Eng. J. Med. 335,
1261-1269, 1996; patente de los EE.UU. 5677275) y un
efecto antivírico inhibidor directo sobre el virus de la
inmunodeficiencia humana y de los simios (VIH y VIS)
(Lunardi-Iskandar y otros, Nature Med. 4,
428-434, 1998, patente de los EE.UU. 5700781).
Dichos efectos citotóxicos y antivíricos también se han atribuido a
un factor mediado por hCG (HAF) desconocido que se encuentra en los
preparados de hCG de grado clínico. No obstante, los preparados
comerciales de hCG (como CG-10, Steris Profasi,
Pregnyl, Choragon, Serono Profasi, APL), tienen varios efectos. El
análisis de varios de ellos (AIDS, 11:1333-1340,
1997), por ejemplo, muestra que únicamente algunos (como
CG-10, Steris Profasi) pueden eliminar el KS,
mientras que otros (Pregnyl, Choragon, Serono Profasi) no pueden.
En segundo lugar, las subunidades recombinantes de (\alpha o
\beta) hCG tenían actividad eliminadora, pero la hCH recombinante
intacta, no. También se encontró que el efecto eliminador también
se apreciaba con linfocitos. El tratamiento del KS se ha dirigido
recientemente a la utilización de beta-hCG para
conseguir su efecto antitumoral (Eur. J. Med Res. 21:
155-158, 1997) y se ha descrito que el fragmento
del núcleo beta aislado a partir de la orina tuvo la mayor actividad
apoptótica sobre las células del KS (AIDS, 11:,
713-721, 1997).
Recientemente, Gallo y otros describieron la
actividad antisarcoma de Kaposi, anti-VIH,
anti-VIS y distintos efectos hematopoyéticos de los
preparados crudos de grado clínico de gonadotropina coriónica humana
(hCG) (Lunardi-Iskandar y otros 1995, Gill y otros
1996, Lunardi-Iskandar y otros 1998). Por el
contrario, en otros estudios previos también se reivindicaba que la
actividad antitumoral y antivírica de un preparado de hCG no se
debe al heterodímero de hCG nativa, que incluye sus subunidades
purificadas o su principal producto de degradación, el núcleo
\beta; en su lugar, la estructura activa reside en un factor
mediado por hCG (HAF) que no ha sido identificado hasta el momento.
Sea cual sea el verdadero factor, estos factores no identificados
en varios preparados de hCG tienen actividad antitumoral a través de
la inducción selectiva de la apoptosis, además de los efectos
citotóxicos directos sobre las células tumorales. Además, se ha
propuesto que su actividad antitumoral podría no deberse a una
respuesta mediada por un mecanismo inmune, ya que no se encontró la
infiltración tumoral por células mononucleadas.
Además, el efecto prohematopoyético descrito de
la hCG de grado clínico se observó en los estudios clínicos
efectuados en personas infectadas por el VIH
(Lunardi-Iskandar y otros 1998), lo que indica que
el efecto hematopoyético es indirecto y que se debe al rescate de
los linfocitos CD4+ que, de lo contrario, serían eliminados por el
VIH, mediante la actividad anti-VIH de la hCG.
La invención da a conocer un inmunorregulador o
una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno
mediado por un mecanismo inmune que se puede obtener a partir de un
preparado de hCG o una fracción derivada del mismo siendo dicho
inmunorregulador un péptido aislado que comprende una secuencia de
aminoácidos escogida entre el grupo compuesto por VLPALPQVVC,
VLPALPQ, VLPALP, MTRV, MTR, PALP, QVVC, LQGV, AQGV, LQGA, ALPALP,
VAPALP, ALPALPQ, VLPAAPQ, VLPALAQ y LQGVLPALPQVVC cíclico. Los
efectos de dicho inmunorregulador incluyen el efecto de
estimulación sobre las poblaciones de linfocitos (como la encontrada
en los linfocitos periféricos, los timocitos o los esplenocitos),
en lugar de sus efectos citotóxicos o antivíricos.
Purificación de NMPF: para analizar el
NMPF obtenido de preparados de hCG comerciales, utilizamos un
sistema Shimadzu de HPLC equipado con una columna Alltech de
macroesferas para exclusión por tamaño (GPC) de 60 \ring{A}, 100
\ring{A} o 300 \ring{A} (250 x 4,6 mm y 300 x 7,5 mm). Los
intervalos de separación de las columnas fueron de 28.000 - 250,
2500 - 350,00 y 1.200.000 - 7.500 Dalton, respectivamente. Se
utilizaron patrones externos para el peso molecular para calibrar
las posiciones de elución de la columna. Los marcadores utilizados
fueron: aprotinina (6.500 Da), citocromo C (12.400), anhidrasa
carbónica (29.000), albúmina (66.000) y dextrano azul
(2.000.000).
Para analizar el NMPF, se utilizaron tres
preparados de hCG distintos: NMPF-PG (Pregnyl;
Organon; OSS, Países Bajos), NMPF-A (APL; Weyth
Ayerst; Filadelfia, EE.UU.) y NMPF-PR (Profasi;
Serono, Roma, Italia). Para la ejecución, se utilizó el tampón de
bicarbonato amónico 50 mM con etanol (5%, vol/vol). El volumen de
carga de la muestra fue de 10-50 ml para la columna
de 250 x 4,6 mm y de 50-200 ml para la columna de
300 x 7,5 mm. El caudal para las columnas de 250 x 4,6 mm y 300 x
7,5 mm fue de 0,5 ml/min durante 45 min y de 1-2
ml/min durante 45 min, respectivamente.
La orina del primer trimestre del embarazo (2
litros) se recogió en un frasco de una voluntaria sana y se
refrigeró hasta su envío al laboratorio antes de 2 días. Tras su
entrega se añadió 1 gramo por litro de azida sódica y el pH se
ajustó a 7,2-7,4 con hidróxido sódico y se dejó
sedimentar durante 1 hora (h) a temperatura ambiente (RT).
Aproximadamente el 75% del sobrenadante se decantó y el resto
cercano al precipitado se centrifugó (10 min a 25.000 rpm a 40ºC)
para eliminar el sedimento, y se añadió al resto del sobrenadante.
El sobrenadante se filtró a través de un equipo de filtración
transversal de 0,45 mm Minitan (Millipore). A continuación, el
filtrado (2 litros) se concentró en un equipo de ultrafiltración
Amicon dotado con una membrana YM Diopore con un valor umbral de 10
kDa. El volumen final (250 ml) se dializó frente a 2 cambios de 10
litros de agua Milli Q. A continuación, la muestra se concentró aún
más con un valor umbral de 10 kDa en un equipo Amicon para
ultrafiltración hasta un volumen final de 3 ml.
Ratones usados en los experimentos en
septicemia o choque séptico: En todos los experimentos se usaron
ratones hembra BALB/c entre 8 y 12 semanas de edad. Los animales
recibieron el alimento en nuestras instalaciones bajo condiciones
específicas libres de patógenos de acuerdo a los protocolos
descritos en el Informe del grupo de trabajo de las European
Laboratory Animal Science Associations (FELASA) sobre Salud Animal
(Laboratory Animals 28: 1-24, 1994).
Protocolos de inyección: Para el modelo
de endotoxina, los ratones BALB/c recibieron inyecciones por vía
i.p. de 150-300 \mug de LPS (E. coli 026::
B6; Difco Lab., Detroit, MI, EE.UU.). Los grupos de control
recibieron tratamiento únicamente con PBS por vía i.p. Para evaluar
el efecto del NMPF, los ratones BALB/c recibieron tratamiento con
una dosis optimizada de 700 UI de distintos preparados de hCG, de
fracciones derivadas de las mismas (10-50 mg), o de
orina del primer trimestre del embarazo (NMPF-U)
durante 3 días y después se les inyectó LPS por vía i.p.
Con el fin de determinar si el NMPF inhibió del
choque, incluso después de la inducción del choque, también
administramos un tratamiento con NMPF por via i.p. a ratones BALB/c
transcurridas 3, 12, 24 y 36 h desde de la inyección de LPS. En
diferentes momentos, se registraron las puntuaciones
semicuantitativas de la enfermedad, así como las tasas de
supervivencia.
Mediciones semicuantitativas de la
enfermedad: se puntuaron los niveles de gravedad de la
enfermedad en los ratones utilizando la siguiente escala de
medición:
1. Pelaje difuso, pero sin diferencias
detectables en la conducta con respecto a los ratones normales.
2. Pelaje difuso, reflejo de acurrucamiento,
responden a estímulos (como al golpear sobre la jaula), igual de
activo cuando se manipula a un ratón sano.
3. Respuesta más lenta al golpear sobre la
jaula, pasivo o dócil durante la manipulación pero aún curioso
cuando está solo en un entorno nuevo.
4. Falta de curiosidad, escasa o nula respuesta
ante los estímulos; bastante inmóvil.
5. Respiración con dificultades, incapacidad o
lentitud para ponerse derecho por sí solo después de enrollarlo
sobre la espalda (moribundo, sacrificado).
Tratamiento con el péptido
b-hCG y anti-MIF: la mayoría de
los metabolitos urinarios de hCG son una forma cortada de
b-hCG. Estas formas de b-hCG
presentan cortes de los enlaces peptídicos dentro de la subunidad
b. b48 (VLPALPQVVC) es uno de estos péptidos, cuya asociación con un
metabolito urinario natural de hCG ha quedado demostrada. Con el
fin de evaluar el efecto de este péptido sobre el choque séptico,
inyectamos LPS a ratones BALB/c y los tratamos 2 h más tarde por
vía i.p. con el péptido b48 (100 mg). Para comprobar si los
posibles productos de degradación también tienen efecto sobre el
choque séptico, procedimos a incubar el péptido b48 a 37ºC durante
tres horas antes de analizar el péptido en un modelo de choque
séptico en ratones BALB/c.
En el documento WO 99-59617 los
presente inventores habían demostrado que NMPF (IR) tiene también un
efecto antidiabético. Por lo tanto, a efectos de ensayar si el
péptido b48 tiene un efecto antidiabético, se realizaron
experimentos de transferencia. Células de bazo totales se
recuperaron de ratones NOD diabéticos y se estimularon in
vitro en RPMI+ suplementado con FBS 10% con
anti-CD3 recubierto (145-2c11; 25
mg/ml) e IL-2 (50 U/ml) junto con 300 IU/ml de NMPF
(Pregnyl) o péptido b48 (20 mg/ml). A continuación, los frascos de
cultivo se incubaron a 37ºC en 5% de CO_{2} en aire durante 48 h.
A continuación de las 48h, las células fueron lavadas dos veces con
PBS y fueron transferidas 20 x 10^{6} células i.p. a ratones
NOD.scid de 8 semanas (n=4).
Proliferación estimulada con LPS de los
esplenocitos in vitro/ex vivo : Tras 48 h de
inducción de choque séptico en ratones BALB/c mediante una
inyección de LPS en dosis altas, se recuperaron los esplenocitos (1
x 10^{6} células/ml) y se reestimularon in vitro con LPS
(10 U/ml) en placas de 96 pocillos (fondo redondo). Transcurridas
24 horas desde el cultivo, se midió la proliferación estimulada con
LPS de los esplenocitos mediante la incorporación de
[^{3}H]TdR durante las últimas 16 horas de cultivo. En
otros experimentos, se aislaron esplenocitos procedentes de ratones
BALB/c no tratados y se estimularon in vitro (1 x 10^{6}
células/ml) con LPS en presencia o en ausencia de distintas fuentes
de NMPF (37,5-600 UI/ml) (Pregnyl, Organon; APL,
Wyeth Ayerst; Profasi, Serono), fracciones de NMPF
(10-20 mg/ml), péptido b-48 o sus
productos de degradación, anti-MIF o combinaciones
de estos productos, cada uno de ellos a 10 mg/ml. Transcurridas 24
horas desde el cultivo, se midió la proliferación estimulada con
LPS de los esplenocitos.
Purificación de NMPF: se aplicaron
muestras de NMPF procedentes de diversas fuentes (Pregnyl, APL,
Profasi, orina del embarazo) en la columna Macroshere GPC 300
\ring{A} y se eluyó con bicarbonato amónico. Se fraccionaron tres
áreas seleccionadas, NMPF-1 que se eluye
aparentemente con un peso molecular de >25 kDa,
NMPF-2 que se eluye aparentemente con un peso
molecular de entre 25 kDa y 6 kDa, y NMPF-3 que se
eluye aparentemente con un peso molecular de <6 kDa (figura 1).
Todas estas fracciones se liofilizaron y se estudiaron para
determinar la actividad antichoque (como se muestra en otra parte
del presente documento). La fracción de menor peso molecular
(NMPF-3) que se eluye tras el volumen de la columna
se fraccionó adicionalmente en la columna Macrosphere GPC 60
\ring{A} (figura 2.). Todas las fracciones se liofilizaron y
también se estudiaron para determinar la actividad antichoque.
Tratamiento con NMPF en el choque séptico
inducido con LPS: Para determinar el efecto del tratamiento con
LPS en dosis altas, los ratones BALB/c tratados con NMPF (n=6)
recibieron una inyección intraperitoneal de LPS (150 mg/kg) y la
supervivencia se valoró diariamente durante 5 días. Los ratones
BALB/c tratados con PBS sucumbieron al choque a partir del día 1
después de la inyección de LPS en dosis altas, sobreviviendo menos
del 10% de los ratones vivos en el día 5 (Figura 3). Por el
contrario, el 100% de los ratones tratados con NMPF de Pregnyl, o
con sus fracciones NMPF-1 o NMPF-3
obtenidas con una columna de GPC de 300 \ring{A}, seguía vivo en
el día 5 (P<0,001) (Figura 3), mientras que en los grupos de
ratones tratados con NMPF-2 de Pregnyl o con
dexametasona (datos no mostrados) se alcanzó una supervivencia del
25% aproximadamente (Figura 3). No todos los preparados de hCG
comerciales presentaron actividad del NMPF; por ejemplo, el NMPF de
Profasi únicamente mostró una actividad antichoque parcial
(supervivencia del 40% próximamente). Además, se observó
variabilidad en la actividad del NMPF entre los distintos lotes de
la misma fuente, así como variabilidad de la actividad del mismo
lote con el tiempo. El tratamiento de ratones BALB/c con APL antes o
después de la inducción del choque mostró, en una serie de
experimentos, la aceleración del choque y una muerte precoz.
Con el fin de determinar si existen factores en
el preparado de hCG que también aceleren el choque e inhiban o
contrarresten la actividad del NMPF, llevamos a cabo un
fraccionamiento adicional del NMPF-3 de un lote
activo previamente analizado (que presentaba actividad antichoque) y
de un lote no activo obtenido de Pregnyl en una columna GPC 60
\ring{A}. Se fraccionaron tres áreas seleccionadas,
NMPF-3.1 que se eluye aparentemente con un peso
molecular de >2000 Da, NMPF-3.2 que se eluye
aparentemente con un peso molecular de entre 2000 y 300 Da, y
NMPF-3.3 que se eluye aparentemente con un peso
molecular menor que 300 Da (figura 2). Todas las fracciones se
estudiaron para determinar la actividad antichoque.
Los resultados de estos experimentos revelaron
que la actividad antichoque en un lote activo previamente analizado
residía en una fracción NMPF-3.2, mientras que una
fracción NMPF-3.3 obtenida a partir de lotes tanto
(activos como no activos) provocó la aceleración del choque (figura
4).
Con el fin de determinar si
NMPF-3.3 inhibe la actividad antichoque de
NMPF-3.2, añadimos NMPF-3.3 a
NMPF-3.2 en una proporción de 10:1 (100:10 mg) e
inyectamos la mezcla por vía i.p. en ratones dos horas después de
la inyección de LPS (n=6). Los datos obtenidos en estos experimentos
demostraron que en todos los ratones tratados únicamente con la
fracción NMPF-3.2 se inhibió el choque séptico y los
animales presentaron puntuaciones de la enfermedad inferiores a 2
(figura 4), mientras que esta actividad antichoque de la fracción
NMPF-3.2 se inhibió con NMPF-3.3.
El tratamiento únicamente con NMPF-3.3 aceleró el
choque y los ratones tratados murieron antes que los ratones
tratados con PBS (figura 4). Se obtuvo la misma tendencia de
resultados en experimentos en los que se mezclaron lotes activos y
no activos obtenidos de Pregnyl y se inyectaron en ratones BALB/c
tras la inducción de un choque séptico (datos no mostrados).
Proporción entre NMPF-3.2 y
NMPF-3.3: seguidamente, purificamos
NMPF-3.2 y NMPF-3.3 en una columna
GPC 60 \ring{A} a partir de lotes activos y no activos
procedentes de Pregnyl y de orina del primer trimestre del embarazo
y determinamos la proporción. Encontramos que la orina del primer
trimestre del embarazo con actividad antichoque presentó una
proporción de aproximadamente 1:2,2 (NMPF-3.2 :
NMPF-3.3) (figura 5) y que el lote no activo de
Pregnyl presentó una proporción de aproximadamente 1:3,4 (figura 6),
mientras que el lote activo de Pregnyl presentó una proporción de
aproximadamente 1:1 (figura 7).
Proliferación estimulada con LPS de los
esplenocitos ex vivo : transcurridas 48 horas desde la
inducción del choque con LPS, se aislaron esplenocitos de ratones
tratados con PBS y con NMPF (de ratones tratados o bien con Pregnyl
activo, con las fracciones NMPF-3.2 o
NMPF-3.3 derivadas del mismo, o con un preparado de
APL) y se reestimularon con LPS. Transcurridas 24 horas desde el
cultivo, se midió la proliferación estimulada con LPS de los
esplenocitos. La reducción de la proliferación inducida por LPS se
observó después del cultivo de los esplenocitos procedentes de
ratones BALB/c tratados con NMPF (lote activo de Pregnyl) y con la
fracción NMPF-3.2 derivada del mismo (1600 frente a
1350 cpm) en comparación con ratones tratados con PBS (3500 cpm),
mientras que el tratamiento con NMPF (APL) o
NMPF-3.3 incrementó la proliferación estimulada por
LPS (6000 frente a 7200 cpm). Se obtuvieron resultados comparables
al estimular in vitro esplenocitos de ratones BALB/c no
tratados con LPS en presencia de las adicciones mencionadas
anteriormente (datos no mostrados).
Tratamiento in vitro con NMPF
procedentes de diferentes fuentes, con péptido b-48,
con péptido b-48 desnaturalizado y con
anti-MIF: las principales características de la
preeclampsia son semejantes a las del choque séptico. Por
consiguiente, planteamos la hipótesis de que también podían existir
factores de NMPF (IR) implicados en la preeclampsia y que causasen
también un empeoramiento del choque séptico o de la septicemia.
Anteriormente hemos mostrado que NMPF-3.3 es una de
dichas fracciones que acelera el choque séptico e incrementa la
proliferación inducida por LPS de los esplenocitos in vitro/ex
vivo, lo que está correlacionado con un aumento de la gravedad
de la enfermedad. En la orina de pacientes preeclámticas, se
observan niveles elevados de subunidades b de hCG cortadas. Por
consiguiente, también analizamos si estas subunidades cortadas
provocaron un empeoramiento del choque séptico, asemejándose de ese
modo a la fracción NMPF-3.3. Además, MIF es un
importante mediador en la endotoxemia letal y en el choque tóxico
estafilocócico, de modo que también comparamos los efectos del
péptido b-48 y del NMPF sobre la proliferación con
anti-MIF y con MIF.
Estos experimentos revelaron que
anti-MIF muestra una tendencia a reducir la
proliferación inducida por LPS, de forma similar a un lote de
Pregnyl analizado previamente, que muestra actividad antichoque
(NMPF-PG+) (figura 8). Además,
anti-MIF y NMPF-PG+ actúan juntos de
forma sinérgica y reducen la proliferación (figure 8). NMPF de APL
(NMPF-A), el lote no activo de Pregnyl
(NMPF-PG-; sin actividad antichoque) y el péptido
b-48 (NMPF-K) incrementaron la
proliferación inducida por LPS en comparación con LPS solo (figura
8-12). Por otra parte, NMPF-PG+ o
el péptido b-48 desnaturalizado
(NMPF-Kb) inhibieron y redujeron la proliferación
inducida por LPS al menos hasta el nivel del tratamiento
anti-MIF solo (figura 8-12). El
tratamiento in vivo de ratones BALB/c con
NMPF-PG-, NMPF-K o
NMPF-A tras la inducción de un choque séptico
aceleró la gravedad de la enfermedad (a t=48 h
0-25% de tasa de supervivencia) en comparación con
los ratones tratados con PBS (a t=72 h 15% de tasa de
supervivencia), mientras que el choque séptico en ratones BALB/c se
inhibió completamente mediante NMPF-PG+ o
NMPF-Kb.
Además, nuestros experimentos de transferencia
de células de bazo NOD revelaron que 22 días posteriores a la
transferencia los ratones NOD.scid que recibieron el péptido
b-48 y las células de bazo tratadas con PBS
resultaron positivos a la diabetes y en una semana alcanzaron un
nivel de glucosa en sangre por encima de 30 mmol/l, mientras que
los ratones NOD.scid que recibieron células de bazo tratadas con
NMPF (Pregnyl) permanecieron normales (glucosa en sangre <8
mmol/l). Seis semanas posteriores a la transferencia los ratones
NOD.scid reconstituidos con PBS y b48 se mostraron muy incómodos,
mientras que el grupo de ratones NMPF se mantuvo saludable. Los
ratones de todos los grupos fueron sacrificados en ese momento.
Existen numerosas condiciones fisiológicas y
patologías inmunes en las que los sistemas inmunes innato y
adaptativo están implicados de forma separada o en combinación. Por
ejemplo, se ha demostrado que en la gestación el sistema inmune
innato maternal está más estimulado y se ha propuesto que la
diabetes mellitus tipo II es debida a la hiperactivación crónica
del sistema inmune innato. Otro ejemplo es la implicación del
sistema inmune innato en la listeriosis. La disregulación en el
sistema inmune adaptativo puede también llevar a enfermedades
inmunes como autoinmunidad sistémica o específica de órgano,
alergia, asma, etc. y el sistema inmune adaptativo puede también
jugar un papel en el mantenimiento de la gestación y en la
prevención del rechazo de "aloinjerto" e inflamación crónica,
presumiblemente que incluye aterosclerosis y enfermedades
relacionadas.
Como se demostró en nuestro documento anterior
(Inmunorregulador; WO99-59617), NMPF (IR) es capaz
de regular el balance Th1/Th2 in vivo (BALB/c, NOD) e in
vitro. En los modelos de fenotipo Th1 dominante como NOD, NMPF
(como NMPF-PG y sus fracciones) entre otros,
estimulan la producción de IL-10 y
TGF-beta, lo que indica la inducción de células
reguladoras, tal como Th3 y Tr1 por NMPF. Estas células reguladoras
pueden jugar un papel en los efectos beneficiosos de NMPF en las
enfermedades inmunes e inflamatorias y en la inmunotolerancia.
Mientras que NMPF y varias de sus fracciones son capaces de inhibir
la producción de IFN-gamma in vitro e in
vivo, esto no se observa para NMPF-3
(IR-P3) y hCG recombinante (rhCG).
NMPF-3 (IR-P3) y rhCG por separado
no parecen moderar la inhibición de la producción de
IFN-gamma, pero la combinación de
NMPF-3 y rhCG produce una fuerte inhibición de la
producción de IFN-gamma. Esto implica la necesidad
de NMPF-3 para rhCG para, como mínimo, su capacidad
de inhibición de IFN-gamma en estos modelos,
mientras que NMPF-1 y NMPF-2 solos
son capaces de inhibir la producción de IFN-gamma.
Esto también se cumple para las células de bazo estimuladas
anti-CD3 obtenidas de ratones NOD tratados in
vivo y por la polarización de linfocitos T colaboradores al
fenotipo Th2. En nuestro trabajo anterior también demostramos que
NMPF (IR) tiene el potencial de inhibir respuestas inflamatorias
agudas, tal como en la sepsis o choque séptico. Por lo tanto, tanto
las respuestas inmunes crónicas como las agudas son moduladas por
NMPF.
A manera de ejemplo y sin pretender depender de
una teoría, en la gestación un feto tiene que sobrevivir al
potencial rechazo inmune maternal, que se logra en parte mediante la
desviación del sistema inmune maternal hacia respuestas inmunes del
tipo Th2. Pero de esta manera la supresión del sistema inmune
maternal lleva el consiguiente riesgo de infección, como se observa
en pacientes transplantados que han recibido corticosteroides u
otra terapia inmunosupresora. El factor o factores NMPF (IR)
obtenibles, como mínimo, de orina de gestación y preparaciones de
hCG derivadas del mismo tienen el potencial de modular las
respuestas inmunes de tal manera que el rechazo de la madre al feto
es suprimido y que la madre mantiene o incluso aumenta su
resistencia a infecciones. Estos y otros factores relacionados son
también responsables durante la gestación de la inhibición de
enfermedades inmunes, particularmente enfermedades inmunes mediadas
por Th1.
A manera de ejemplo y sin pretender depender de
una teoría, la gestación aparentemente demanda ajustes inmunes
incompatibles. Por otra parte, las respuestas inmune adaptativas
durante la gestación son moduladas a diferentes niveles celulares
hacia un estado de tolerancia inmune (tal como tipo Th2) y por otro
lado el sistema inmune innato maternal es modulado para la
resistencia a la infección. La evidencia es que los componentes de
sistema inmune innato maternal son activados sistemáticamente.
Existe un numero incrementado de monocitos y granulocitos a partir
del primer trimestre en adelante. También se ha encontrado que en
una gestación normal los monocitos y granulocitos que circulan en
la sangre maternal tienen un fenotipo activado, de alguna manera
comparados con los cambios observados en la sepsis sistémica. Otros
han demostrado una actividad incrementada de la fagocitosis y del
estallido respiratorio de los monocitos, y una expresión
incrementada del receptor de endotoxina CD14 en los monocitos, así
como una respuesta incrementada a endotoxina: monocitos de mujeres
normales producen más de las citocinas proinflamatorias como en un
choque séptico. Muchos estudios han encontrado de manera similar la
activación de granulocitos en la gestación, así como cambios en los
niveles en plasma de factores solubles innatos típicos de una
respuesta en fase aguda. No todos los componentes del sistema innato
son activados en la circulación maternal. Sobre todo, se suprime la
actividad citotóxica y de producción de interferón gamma de las
células NK.
A manera de ejemplo y sin pretender depender de
una teoría, los presentes inventores proponen que uno de los
mecanismos de NMPF para modular la respuesta inmune durante la
gestación es el siguiente: algunos factores NMPF durante la
gestación pueden asegurar que si los linfocitos T están activados,
existe una tendencia hacia una respuesta Th2. Esto podría lograrse
aplicando diferentes poblaciones celulares, tales como macrófagos,
DC, linfocitos T y sus subconjuntos regulatorios. Otros factores
NMPF o similares podrían activar los monocitos y por lo tanto otras
células innatas. Por consiguiente, el balance entre diferentes
factores NMPF es crucial para una regulación balanceada de
respuestas inmunes diferentes. Los presentes inventores proponen que
en pre-eclampsia existe un desequilibrio entre los
diferentes factores NMPF. La sobreactivación de las células innatas
por el factor o los factores NMPF y/o una disminución en la
respuesta inmune adaptativa (particularmente del tipo Th1) que
inhibe al factor o los factores NMPF puede causar un desequilibrio
Th1/Th2 hacia el fenotipo Th1, de alguna manera comparable con los
cambios observados en la sepsis sistémica. Los resultados de los
presentes inventores muestran que también existen factor o factores
NMPF (NMPF-3.3) que pueden estimular la inmunidad
innata y acelerar el choque séptico, mientras que otro factor o
factores NMPF, tal como NMPF-3.2, inhiben el choque
séptico y la actividad de NMPF-3.3. El factor o
factores NMPF-3.2 presentes en la fracción
NMPF-3 en combinación, por ejemplo, con hCG modulan
la respuesta inmune adaptativa hacia el tipo Th2
(WO99-59617; inhibición de
IFN-gamma mediante NMPF-3
(IR-P3) en combinación con hCG) y es esencial para
la gestación normal y la inhibición de enfermedades autoinmunes
Th1, inducción de tolerancia, etc.
El análisis del preparado de hCG (Pregnyl) y de
la orina del embarazo ha demostrado que el preparado de hCG y la
orina del embarazo que presenta actividad antichoque contienen
fracciones NMPF-3.2 y NMPF-3.3 en
una proporción de aproximadamente 1:2 o superior, mientras que los
preparados de hCG sin actividad antichoque o que empeoran el choque
séptico presentan una proporción de NMPF-3.2 y
NMPF-3.3 de 1:3 o inferior. Esto también explica
por qué no todos los preparados de hCG comerciales poseen actividad
antichoque. Además, hemos demostrado que un preparado de hCG que
presenta una elevada proporción de
NMPF-3.3:NMPF-3.2 y, por tanto, no
posee actividad antichoque, mezclado con un preparado de hCG
activo, podría obtener actividad antichoque. Así pues, la proporción
entre los diferentes factores NMPF o fracciones, tales como
NMPF-3.2 y NMPF-3.3, se puede
utilizar como marcador diagnóstico no sólo para la predicción de un
embarazo satisfactorio, sino también para distintas
inmunopatologías, tales como la preeclampsia, la septicemia o el
choque séptico, etc. Además, en los embarazos anómalos, como es el
caso de la preeclampsia, también se pueden utilizar los factores
NMPF o las fracciones de NMPF (p.ej. NMPF-3.2) como
tratamiento. Nuestros experimentos también han mostrado que NMPF
(NMPF-3.2) inhibió el choque séptico incluso 30 h
después de la inducción del choque, lo que demuestra que NMPF no
sólo inhibe a los mediadores precoces de la letalidad por
endotoxinas, tales como TNF-alfa,
IL-1b, MIF, sino que también inhibe a los mediadores
tardíos, tales como la recién caracterizada proteína del grupo 1 de
alta movilidad (HMG-1) (Science 285,
248-251).
hCG es un miembro de la superfamilia estructural
de los factores de crecimiento con nudo de cisteína tales como NGF,
PDGF-B y TGF-beta y un miembro de la
familia de hormonas de glucoproteína, que también incluye LH, FSH y
TSH. Cada uno de ellos consta de dos subunidades proteínicas
asociadas de forma no covalente, una cadena alfa de 15 kD común y
una cadena beta de 23 kD específica de cada hormona (Annu. Rev.
Biochem. 50, 465-495). El hCG es sintetizado por
los trofoblastos placentarios durante el embarazo normal, y en la
enfermedad trofoblástica gestacional. Asimismo, se produce en
cantidades mucho menores por la pituitaria (Endocrinology 137,
1402-1411) tanto en mujeres premenopáusicas como
posmenopáusicas y en hombres (Trends in Endocrinology and Metabolism
1, 418-421), en muchos tumores malignos no
gestacionales y en otros tejidos. El hCG posee una estructura
compleja como una familia de isoformas con diferencias
estructurales, inmunológicas y biológicas. Se desconoce con certeza
la base química de esta heterogeneidad, pero se han propuesto como
posibles causas las diferencias en la composición de aminoácidos,
en los residuos de hidratos de carbono o ambos. Más recientemente,
también se ha observado que la oxidación de residuos específicos de
metionina también puede ser la responsable. Se han observado
diferentes formas de hCG, subunidades alfa y beta, sus fragmentos
cortados, fragmentos de núcleo beta y múltiples isoformas de hCG en
diferentes tejidos y fluidos corporales (Journal of Endocrinology
161, 99-106; Endocrinology 129,
1541-1550; Obstet. Gynecol. 77,
53-59; Journal of Biochemistry 107,
858-862; Obstet. Gynecol. 80,
223-228; Endocrinology 133, 985-989;
129, 1551-1558; 130, 2052-2058;
Journal of Endocrinology 135, 175-188; 139,
519-532; Molecular and Cellular Endocrinology 125,
93-131).
Dado que todos los preparados de hCG comerciales
se derivan de orina del embarazo y contienen distintos productos de
descomposición de hCG, hemos especulado con la posibilidad de que
estos productos puedan presentar actividad del NMPF. Los productos
de descomposición de hCG más conocidos son el núcleo beta de hCG, un
corte del enlace peptídico en la subunidad beta entre los residuos
44-45, 46-47 y
47-48. b48 (NMPF-K) se encuentran en
aproximadamente el 10-20% de las moléculas de la
orina del embarazo y está asociado con un metabolito urinario
natural de hCG. Nuestros experimentos han demostrado que
NMPF-K acelera el choque séptico (como MIF) y la
proliferación inducida por LPS de los esplenocitos, sólo o en
combinación con un preparado de hCG no activo. Este efecto se puede
inhibir con anti-MIF, con un preparado de hCG
activo, con NMPF-3.2 y con el péptido b48
desnaturalizado (NMPF-Kb). Esto demuestra que la
actividad de NMPF-K se asemeja a
NMPF-3.3 y que la actividad de
NMPF-Kb se asemeja a NMPF-3.2.
Además, también existen otros cortes de enlaces peptídicos en hCG y
sus subunidades, así como heterogeneidad del fragmento del núcleo
beta. Por ejemplo, el corte del enlace b45, que se observa
principalmente en el preparado de hCG y en la orina, se deriva
posiblemente de la acción de proteasas bacterianas. Asimismo,
Medeiros y otros demostraron que la separación mediante HPLC del
núcleo beta en sus formas reducida y
S-carboximetilada presentó tres péptidos, pero sólo
dos de ellos pudieron ser secuenciados y se demostró que eran los
péptidos b6-40 y b55-92 de bhCG
previamente documentados, mientras que el tercer pico no dio lugar a
ninguna secuencia clara, debido a la baja señal y a varios
aminoácidos no identificados. Hemos mostrado que los productos de
degradación de NMPF-K comparten actividad con
NMPF-3.2. Este péptido NMPF-K se
encuentra entre dos fragmentos del núcleo beta
(b6-40 y b55-92) y se deriva
parcialmente del fragmento del núcleo beta b55-92.
Es posible que también existan otros productos de corte simple y/o
doble de los fragmentos del núcleo beta o de péptidos del núcleo
beta aún no identificados (dado que Medeiros y otros mostraron una
fracción del núcleo beta con aminoácidos no identificados) que sean
responsables de la actividad del NMPF en preparados de hCG y en
orina del embarazo. Los productos de descomposición del péptido b48
con aminoácidos adicionales no identificados del núcleo beta y/o
con glucosilación adicional posee, entre otras, actividad
antidiabética y antiinflamatoria crónica.
En resumen, la invención da a conocer la
utilización de un inmunorregulador (péptido inmunorregulador) que
se puede obtener o sintetizar a partir de un metabolito urinario de
hCG, en particular a partir de formas (cortadas) de
beta-hCG, u homólogos peptídicos (sintéticos) o
análogos del mismo. Estas formas de beta-hCG
presentan cortes de los enlaces peptídicos dentro de la subunidad
beta (Birken y otros, Endocrinology 133:1390-1397,
1993), y en el presente documento se da a conocer que los productos
de degradación, en especial los derivados de las regiones
beta-44 a beta-49, aportan efectos
inmunorreguladores significativos, utilizando los sistemas
analíticos en modelos con animales descritos.
Por ejemplo, según el presente documento se ha
descubierto en experimentos animales, según lo descrito a
continuación, que los péptidos obtenibles a partir de hCG
reaccionan en un modelo de choque séptico mostrando efectos
inmunorreguladores intensos.
\vskip1.000000\baselineskip
Permeabilidad en gel: procedimos a
fraccionar un preparado de hCG comercial (c-hCG,
Pregnyl, Organon, Oss, Países Bajos) según se describe a
continuación: utilizamos un sistema Shimadzu de HPLC equipado con
una columna Alltech de macroesferas para exclusión por tamaño (GPC)
de 60 \ring{A} (4,6 mm DI x 250 mm L) en tampón de bicarbonato
amónico 50 mM. El rango de separación de esta columna fue de 28.000
- 250 Dalton. El volumen de carga de la muestra (20.000 UI hCG/ml)
fue de 10-50 ml. El caudal se ajustó a 0,3 ml/min
durante 25 minutos. También se utilizaron patrones externos para el
peso molecular, para calibrar las posiciones de elución de la
columna. Los marcadores utilizados fueron: aprotinina (6.500 Da),
citocromo C (12.400) y anhidrasa carbónica (29.000). Además, la
orina concentrada (véase purificación de la orina) obtenida con el
sistema Pelicon se filtró a través de un filtro de 0,45 mm y se
analizaron 40.000 UI de c-hCG (Pregnyl) disueltas en
bicarbonato amónico 50 mM en un sistema Shimadzu de HPLC equipado
con una columna desalinizada Superdex G25 (30 mm DI x 990 mm L) en
tampón de bicarbonato amónico 50 mM suplementado con metanol al 5%.
El rango de separación de la columna fue de 5000 - 1000 Dalton. El
volumen de carga de la muestra fue de 7-10 ml. El
caudal se ajustó a 3 ml/min durante 250 minutos. También se
utilizaron patrones externos para el peso molecular, para calibrar
las posiciones de elución de la columna. Se recogieron fracciones de
100 mL, se liofilizaron y se estudiaron para determinar la actividad
antichoque.
Purificación de la orina: la orina del
primer trimestre del embarazo (2 litros) se recogió en un frasco de
una voluntaria sana y se refrigeró hasta su envío al laboratorio
antes de 2 días. Tras su entrega se añadió 1 gramo por litro de
azida sódica y el pH se ajustó a 7,2-7,4 con
hidróxido sódico y se dejó sedimentar durante 1 hora (h) a
temperatura ambiente (RT). Aproximadamente el 75% del sobrenadante
se decantó y el resto cercano al precipitado se centrifugó (10 min
a 25000 rpm a 4ºC) para eliminar el sedimento, y se añadió al resto
del sobrenadante. El sobrenadante (aproximadamente 2 litros) se
concentró en un sistema de ultrafiltración Pellicon equipado con un
filtro Pellicon XL (Millipore, Nº ref. PXC010C50) con un valor
umbral de 5 kDa. El volumen final fue de 150 ml. Muestras de orina
de mujeres sanas no embarazadas y de mujeres con una enfermedad
autoinmune (SLE, Sjogren) en su primer trimestre del embarazo se
trataron con el mismo procedimiento descrito anteriormente.
Modelo de choque por endotoxinas: para el
modelo de endotoxina, los ratones BALB/c recibieron inyecciones por
vía i.p. de 8-9 mg/kg de LPS (E. coli 026::
B6; Difco Lab., Detroit, MI, EE.UU.). Los grupos de control (PBS)
recibieron tratamiento únicamente con PBS por vía i.p. Para evaluar
el efecto del NMPF, los ratones BALB/c recibieron tratamiento con
una dosis de 300-700 UI de distintos preparados de
hCG (PG23; Pregnyl lote nº 235863, PG25; Pregnyl lote nº 255957),
con péptidos (5 mg/kg) o con diferentes fracciones
(0,5-1 mg/kg) transcurridas dos horas desde la
inyección de LPS.
Proliferación inducida por LPS: con el
fin de determinar si el tratamiento con distintas fracciones,
péptidos o hCG comercial (c-hCG) de ratones BALB/c
a los que se les había inyectado LPS consiguió alterar la respuesta
proliferativa de los esplenocitos, también aislamos los esplenocitos
de los experimentos de choque con LPS mencionados anteriormente.
Los esplenocitos totales (1 x 10^{6} células/ml) procedentes de
ratones BALB/c tratados se reestimularon en RPMI+ suplementado con
FBS al 10% con distintas concentraciones de LPS (5, 10, 20 mcg/ml)
en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Las placas se incubaron a
37ºC en 5% de CO_{2} en aire durante 24 h. La proliferación se
midió por la incorporación de [^{3}H]TdR añadiendo 0,5
mCI/pocillo durante las últimas 12 horas de cultivo.
Citometría de flujo: en algunos
experimentos, tras 48 horas de inducción del choque séptico, se
aislaron los esplenocitos para realizar un análisis mediante
citometría de flujo. Los marcadores de superficie celular
analizados en estos experimentos fueron CD19, CD80, CD40, B220, CD4,
F4/80, NK1.1, DX-5 y CD25. Para el análisis de
estos marcadores, los anticuerpos monoclonales (mABs) conjugados con
FITC o PE se compraron a BD PharMingen. Brevemente, se lavaron los
esplenocitos (2x10^{5}) dos veces con tampón FACS y se incubaron
con los anticuerpos monoclonales siguiendo las instrucciones del
fabricante. A continuación, se lavaron las células y se analizaron
en un citómetro de flujo FACSort (Becton Dickinson). En función de
sus características de dispersión frontal y dispersión lateral, las
células vivas se controlaron y se analizaron.
Experimentos de Oclusión de Arteria Coronaria
(CAO): NMPF tiene efectos inmunorreguladores en modelos en
ratones de inflamación crónica, así como inflamación aguda. Ya que
algunas citocinas, tal como TGF-betaI,
TNF-alfa, IL-1 y ROS (especies
reactivas del oxígeno) han estado implicadas en el daño irreversible
al miocardio producido por episodios prolongados de oclusión de la
arteria coronaria y reperfusión in vivo que lleva a isquemia
y a infarto del miocardio, se ensayaron las propiedades
cardioprotectoras de los péptidos en ratas Wistar machos
alimentadas ad libitum (300 g). Los experimentos se
realizaron según las Guías Principio en el Cuidado y Uso de
Animales aprobado por el Consejo de la Sociedad Fisiológica de
América y bajo las regulaciones del Comité para el Cuidado de
Animales de la Universidad Erasmus de Rótterdam. En resumen, las
ratas (n=3) fueron estabilizadas durante 30 minutos seguido de 1 ml
i.v. del tratamiento de péptido (0,5 mg/ml) en 10 minutos. Cinco
minutos a continuación del tratamiento, las ratas se sometieron a
oclusión de la arteria coronaria (CAO) de 60 min. En los últimos 5
minutos de CAO, las ratas fueron tratadas nuevamente i.v. durante 10
minutos con 1 ml de péptido (0,5 mg/ml) seguido de 120 minutos de
reperfusión (IP). Los procedimientos experimentales y quirúrgicos
se describen en detalle en Investigación Cardiovascular
37(1998) 76-81 (Cardiovascular Research
37(1998) 76-81). Al final de cada
experimento, la arteria coronaria fue reocluida y se perfundió con
10 ml de Azul Tripan (0,4%, Sigma Chemical Co.) para teñir el
miocardio perfundido normalmente de azul oscuro y delinear el área
en riesgo no teñida (AR). A continuación, el corazón fue
rápidamente escindido y se le realizaron cortes de 1 mm del vértice
a la base. En cada corte se eliminó el ventrículo derecho y el
ventrículo izquierdo se dividió en AR y el resto del ventrículo
izquierdo, utilizando tijeras microquirúrgicas. A continuación, el
AR se incubó durante 10 minutos a 37ºC en azul de nitrotetrazolio
(Sigma Chemical Co.; 1 mg per 1 ml tampón Sorensen, pH 7,4), que
tiñe el tejido vital de púrpura pero no tiñe el tejido infartado.
Después de que el área infartada (IA) se aisló del área no
infartada, las diferentes áreas de LV se secaron y pesaron por
separado. El tamaño del infarto se expresó como el porcentaje de
AR. Las ratas de control se trataron con PBS
Experimentos NOD: Los presentes
inventores trataron a los ratones NOD de 8-10
semanas de edad con PBS (n=3) o péptido 1 (VLPALPQVVC), o hCG
recombinante (rhCG, Sigma) y rhCG en combinación con péptido 1 cada
uno con 10-40 mcg i.p. durante 3 días. Para
determinar el efecto del tratamiento en la polarización Th1, se
aislaron células CD4+ y se realizó el ensayo de polarización Th1
como sigue: linfocitos T CD4+ purificados a partir del bazo se
obtuvieron mediante selección negativa debido al agotamiento del
complemento con anticuerpos específicos para células B, células NK,
monocitos/macrófagos y granulocitos. Las células se purificaron
adicionalmente utilizando la separación celular activada por un
campo magnético con un cóctel de mAbs biotinilados contra CD11b,
B220, CD8 y CD40, seguido de una incubación con microesferas
conjugadas con estreptavidina (Milteny Biotech, Bergisch Gladbach,
Alemania). Los linfocitos T CD4+ utilizados para los experimentos se
purificaron hasta 90-95%, tal como se determinó por
citometría de flujo. Para la estimulación primaria, los linfocitos
T CD4+ purificados se cultivaron a 1 x 10^{5} células/ml en placas
de 96 pocillos de fondo plano (Nalge Nunc Int., Naperville, IL,
EE.UU.), y estimulados con mAb anti-CD3 unido a la
placa (145-2C11, 25 mg/ml),
anti-CD28, e IL-2 (50 U/ml). Para la
diferenciación de las células Th1, se añadieron a los cultivos mAb
anti-IL-4 (11B11; 10 mg/ml) e
IL-12 (10 ng/ml). Los cultivos sin cebador contenían
solamente anti-CD3, anti-CD28 e
IL-2. Todas las dosis fueron optimizadas en
experimentos preliminares. Después de 4 días de cultivo, las células
se lavaron 3 veces y se transfirieron a placas de 96 pocillos
recubiertas con anti-CD3 nuevas y se reestimularon
en presencia de IL-2 (50 U/ml) y
anti-CD28 (10 mcg/ml). Después de 48 horas, se
colectaron los sobrenadantes y se analizaron para determinar la
producción de IFN-gamma mediante ELISA como lectura
de la polarización Th1.
ELISA de citocinas: el
IFN-gamma se detectó usando anticuerpo monoclonal
anti-IFN-gamma (XMG1.2) como el
anticuerpo de captura y se reveló con anticuerpo monoclonal de rata
anti-IFN-gamma de ratón conjugado y
biotinilado (R46A2). Para la detección se utilizó el sustrato
ABTS.
Las microplacas de fondo plano (96 pocillos,
Falcon 3912, Microtest II Flexible Assay Plate, Becton Dickinson,
Oxnard, USA) se recubrieron con anticuerpos de captura específicos
de IFN-gamma (XMG1.2, 5 mg/ml) diluidos en PBS y se
conservaron a 4ºC durante 18 horas. Después de recubrirlas, las
placas se lavaron (PBS, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20) y
se bloquearon con PBS suplementado con BSA al 1% a temperatura
ambiente durante 1 hora. Después del lavado, las muestras y los
patrones se añadieron y la incubación continuó, como mínimo, durante
4 horas a temperatura ambiente. A continuación, las placas se
lavaron y se añadieron anticuerpos biotinilados de detección
(R46A2, 1 mcg/ml) y se incubaron toda la noche a 4ºC. Después del
lavado, se añadió estreptavidina peroxidasa (diluido 1/1500,
Jackson Inmunoresearch, West Grove, PA, USA). Después de 1 hora las
placas se lavaron y la reacción se visualizó usando ácido
2,2'-azino-bis-3-etilbenzo-tiazolina-6-sulfónico
(ABTS, 1 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). La densidad óptica se
midió a 414 nm, utilizando un Titertek Multiscan (Flow Labs, Redwood
City, EE.UU.).
Síntesis peptídica: los péptidos se
prepararon mediante síntesis en fase sólida (Merrifield, 1963)
utilizando la metodología basada en fluorenilmetoxicarbonilo
(Fmoc)/tert-butilo (Atherton, 1985) con resina de
cloruro de 2-clorotritilo (Barlos, 1991) como
soporte sólido. La cadena lateral de glutamina se protegió mediante
una función tritilo. Los péptidos se sintetizaron manualmente. Cada
uno de los enlaces comprendió las siguientes etapas: (i)
eliminación de la protección con Fmoc alfa-amino
mediante piperidina en dimetilformamida (DMF) (ii) acoplamiento del
aminoácido Fmoc (3 eq) con diisopropilcarbodiimida
(DIC)/1-hidroxibenzotriazola (HOBt) en
DMF/N-metilformamida (NMP) (iii) protección de las
demás funciones amino con anhídrido acético/diisopropiletilamina
(DIEA) en DMF/NMP. Tras completar la síntesis, la resina del péptido
se trató con una mezcla de ácido trifluoroacético
(TFA)/H_{2}O/triisopropilsilano (TIS) 95:2.5:2.5. Transcurridos 30
minutos, se añadió TIS hasta que se observó la decoloración. La
solución se evaporó en vacío y el péptido se precipitó en
dietiléter. Los péptidos crudos se disolvieron en agua
(50-100 mg/ml) y se purificaron mediante
cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RPHPLC).
Las condiciones de HPLC fueron: columna: Vydac TP21810C18 (10 x 250
mm); sistema de elución: sistema de gradiente de TFA al 0,1% en
agua v/v (A) y TFA al 0,1% en acetonitrilo (ACN) v/v (B); caudal 6
ml/min; se detectó la absorbencia a 190-370 nm. Se
utilizaron distintos sistemas de gradiente. Para los péptidos LQG y
LQGV: 10 minutos de 100% de A seguidos de un gradiente lineal de
0-10% de B durante 50 minutos. Para los péptidos
VLPALP y VLPALPQ: 5 minutos de 5% de B seguidos de un gradiente
lineal de 1% de B/minuto. Las fracciones recogidas se concentraron
hasta aproximadamente 5 ml mediante evaporación en película
rotatoria a presión reducida a 40ºC. El TFA restante se intercambió
frente a acetato mediante dos pasos de elución en una columna con
una resina de intercambio aniónico (Merck II) en forma de acetato.
El eluido se concentró y liofilizó en 28 horas.
Modelos EAE: ratones SJL/J hembras (n=4;
8-12 semanas de edad; obtenidos de Harlan, Zeist,
Países Bajos, o reproducidos en la Universidad Erasmus de
Rótterdam) se inmunizaron con 10 mcg de péptido proteína
proteolípido 139-151 (PLP 139-151;
H-His-Ser-Leu-Gly-Lys-Trp-Leu-Gly-His-Pro-Asp-Lys-Phe-OH;
obtenido tanto de Peptides International, Louisville, KY o TNO
Prevention and Health, Leiden, Países Bajos), emulsificado en CFA
que contiene 4 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis H37 Ra
(Difco, St. Louis, MO). Un modelo diferente de EAE se indujo
mediante la inyección tanto de 200 mg de toxina pertussis (Sigma) en
50 mcl de PBS i.v. los días 0 y 2
post-inmunización, o 10^{10} de la bacteria
Bordetella pertussis (RIVM, Bilthoven, Países Bajos) en 200 mcl de
PBS i.v. los días 1 y 3 después de la inmunización. Se examinaron
los signos clínicos de EAE a los ratones y se pesaron diariamente.
Los síntomas clínicos de EAE se llevaron a una escala de 0 a 5 con
graduaciones de 0,5 de anotaciones intermedias: (0) sin síntomas
clínicos; (1) cola flácida; (2) paraparecia leve; (3) doble
parálisis de los miembros posteriores; (4) moribundo; o (5) muerte
debido a EAE. Comenzando en el día 7
post-inmunización, se inyectaron i.p. las fracciones
60-F2 o 60-F3 (20 mcg) de
c-hCG (10 000 IU) en un volumen total de 200 mcl en
PBS durante dos semanas en días alternos. Los ratones que se
utilizaron como control se trataron con PBS solamente.
Permeación en gel de la orina y del preparado
de hCG comercial: c-hCG (figura 16) y la orina
del primer trimestre del embarazo se fraccionaron en un sistema de
HPLC equipado con una columna GPC 60A. Se fraccionaron tres áreas
seleccionadas, 60A-fracción 1
(60A-F1) que se eluye aparentemente con un peso
molecular de >10 kDa, 60A-F2 que se eluye
aparentemente con un peso molecular entre 10 kDa-1
kDa y 60A-F3 que se eluye aparentemente con un peso
molecular <1 kDa. Estas fracciones se estudiaron posteriormente
para determinar la actividad antichoque.
Además, se analizaron en una columna Superdex
G25 muestras de orina de mujeres sanas embarazadas en su primer
trimestre del embarazo, muestras de orina de mujeres con una
enfermedad autoinmune en su primer trimestre del embarazo y
muestras de orina de mujeres sanas no embarazadas. Todas las
fracciones de 100 ml también se estudiaron para determinar la
actividad antichoque. Las figuras 17 y 18 muestran los cromatogramas
de c-hCG y de orina de mujeres sanas embarazadas en
su primer trimestre del embarazo.
Curva de supervivencia: para determinar
el efecto del tratamiento con LPS en dosis altas en ratones tratados
con c-hCG y fracciones de orina, ratones BALB/c
(n=6) recibieron una inyección intraperitoneal de LPS
(8-9 mg/kg) y la supervivencia se valoró
diariamente durante 5 días. En nuestra Patente anterior (WO9959617)
y en esta solicitud de patente, hemos descrito que se fraccionaron
en una columna GPC 60A tres áreas seleccionadas:
60A-F1 que se eluye aparentemente con un peso
molecular de >10 kDa, 60A-F2 que se eluye
aparentemente con un peso molecular entre 10 kDa-1
kDa y 60A-F3 que se eluye aparentemente con un peso
molecular <1 kDa. Todas estas actividades se estudiaron para
determinar la actividad antichoque y todas ellas presentaron
actividad antichoque (presumiblemente, la actividad de menor peso
molecular también se eluye junto con las fracciones de alto peso
molecular). Los ratones BALB/c tratados con PBS sucumbieron al
choque entre 1 y 2 días después de la inyección de LPS en dosis
altas, sobreviviendo menos del 10% de los ratones vivos en el día 5.
Por el contrario, el 100% de los ratones tratados con
60A-F1 y 60A-F3 seguían vivos el día
5 (p<0,001), mientras que los ratones tratados con
60A-F2 presentaron una supervivencia de tan solo
alrededor del 70%. Dado que la fracción de menor peso molecular
también presentó actividad antichoque, procedimos a fraccionar en
una columna Superdex G25 muestras de c-HCG, orina
del primer trimestre del embarazo, orina de mujeres con una
enfermedad autoinmune en su primer trimestre del embarazo y orina de
mujeres sanas no embarazadas. Todas las fracciones de 100 ml se
estudiaron para determinar la actividad antichoque.
Los ratones BALB/c tratados con PBS sucumbieron
al choque entre 1 y 2 días después de la inyección de LPS en dosis
altas, sobreviviendo menos del 10% de los ratones vivos en el día 5.
Por el contrario, el 100% de los ratones tratados con
c-hCG, con la fracción V de la orina del primer
trimestre del embarazo de mujeres sanas o con la orina de mujeres
con una enfermedad autoinmune en su primer trimestre de embarazo
permanecieron vivos en el día 5 (P<0,001). No obstante, algunas
fracciones que eluyeron antes (fracción II y IV) y después de la
fracción (antichoque) V (p.ej. fracción VI) aceleraron el choque y
todos los ratones tratados murieron incluso mucho antes (en un
plazo de 24 horas después de la inducción del choque séptico) que
los ratones tratados con PBS. Además, la actividad antichoque de
las fracciones III y V quedó inhibida por la adición de la fracción
II, IV o VI, como mínimo, en una proporción de 1:6. Esto se aplica
también a las fracciones obtenidas de los preparados de hCG
comerciales y a la orina del embarazo de mujeres sanas. Además,
hemos observado que fue necesaria una cantidad mucho menor de las
fracciones antichoque procedentes de la orina de mujeres embarazadas
con enfermedades autoinmunes para inhibir al choque séptico en
ratones BALB/c. Estas mujeres también presentaron una mejora
clínica en la enfermedad autoinmune durante el embarazo.
Cinética de la enfermedad: los signos
visibles de la enfermedad eran evidentes en todos los animales de
experimentación pero la cinética y, obviamente, la gravedad de la
enfermedad eran significativamente diferentes: tras el tratamiento
de los ratones BALB/c con LPS (endotoxina) y o bien con la fracción
V de la orina del primer trimestre del embarazo procedente de
mujeres sanas, o bien con la orina del primer trimestre del embarazo
procedente de mujeres con una enfermedad autoinmune, o bien con el
preparado de hCG comercial, los síntomas clínicos de los ratones
BALB/c tratados con LPS no superaron el nivel de enfermedad 2.
Además, estas fracciones lograron inhibir incluso los síntomas de
choque y mortalidad cuando se administraron 32 horas después de la
inyección de LPS.
Datos de los péptidos (NMPF): la
siguiente tabla muestra los porcentajes de supervivencia de los
ratones durante un período de 72 horas. Para el modelo de LPS
(endotoxina), los ratones BALB/c recibieron inyecciones por vía
i.p. de 8-9 mg/kg de LPS (E. coli 026:: B6;
Difco Lab., Detroit, MI, EE.UU.). Los grupos de control (PBS)
recibieron tratamiento únicamente con PBS por vía i.p. Los ratones
BALB/c recibieron tratamiento con una dosis de
300-700 UI de distintos preparados de hCG (PG23;
Pregnyl lote nº 235863, PG25; Pregnyl lote nº 255957) o con
péptidos (5 mg/kg) transcurridas dos horas desde la inyección de
LPS.
Estos experimentos demostraron (tabla 1) que los
péptidos 4 y 6 inhibieron el choque por completo (todos los ratones
presentaron, durante las primeras 24 horas, puntuaciones de
enfermedad no superiores a 2; poco después se recuperaron por
completo y presentaron puntuaciones de enfermedad de 0), mientras
que los péptidos 2, 3 y 7 aceleraron el choque (todos los ratones
presentaron, durante las primeras 24 horas, puntuaciones de
enfermedad de 5 y la mayor parte de ellos murieron, mientras que
los ratones de control tratados con LPS+PBS presentaron
puntuaciones de enfermedad de 3-4- durante las
primeras 24 horas y murieron transcurridas 48 horas, con
puntuaciones de enfermedad de 5). Además, los péptidos 1, 5, 8, 9,
11, 12, 13 y 14 mostraron en varios experimentos distintos una
variabilidad en la efectividad, así como en el tipo (inhibitoria
frente a aceleradora) de actividad. Probablemente, esta
variabilidad puede atribuirse a la tasa de descomposición de los
diversos péptidos, y a los distintos efectos que los diversos
péptidos y sus productos de descomposición presentan in vivo.
De forma similar a los experimentos de choque con fracciones
descritos anteriormente, la actividad de inhibición del choque se
pudo inhibir mediante la adición de la actividad de aceleración del
choque, y viceversa.
Estos datos son representativos, como mínimo, de
10 experimentos independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
En la tabla 2 vemos el efecto de la sustitución
ALA (PEPSCAN) en los péptidos LQGV, VLPALP, VLPALPQ en experimentos
del choque séptico. Podemos concluir que el cambio de tan sólo un
aminoácido por un aminoácido neutral puede dar lugar a una
actividad distinta. Así pues, las diferencias genómicas, así como el
polimorfismo en estos péptidos, puede regular la respuesta
inmunitaria de forma muy precisa. Los derivados de estos péptidos,
por ejemplo (sin limitación) mediante la adición de aminoácidos no
clásicos o los derivados que se modifiquen de forma diferencial
durante o después de la síntesis, por ejemplo, mediante bencilación,
amidación, glicosilación, corte proteolítico, enlace a una molecula
de anticuerpo o a otro ligando celular, etc. también podrían
desembocar en una mayor efectividad de la actividad.
Dado que MIF es uno de los principales
inductores de la septicemia, también procedimos a reestimular con
LPS in vitro los esplenocitos de los ratones del grupo
tratado con el péptido 1 y, a continuación, medimos la producción
de MIF. La figura 19 muestra que el tratamiento in vivo con
LPS incrementó la producción de MIF en comparación con los ratones
tratados con PBS, mientras que el tratamiento con el péptido 1 tras
la inducción del choque inhibió la producción de MIF (figura 19). No
se observó ningún efecto sobre la producción de MIF en los ratones
tratados sólo con el péptido 1; esto demuestra la especificidad del
péptido 1. Además, la proliferación reestimulada con LPS también se
estudió en esplenocitos procedentes de ratones tratados con el
péptido 1 y con c-hCG-V (fracción V
de c-hCG). Estos datos demostraron que, tras la
reestimulación con LPS in vitro, los esplenocitos de ratones
tratados con LPS presentan una mayor capacidad de proliferar in
vitro, en comparación con los ratones tratados con PBS (figura
20). Por otro lado, los esplenocitos procedentes de ratones
tratados con LPS+péptido 1 y
LPS+c-hCG-V presentaron una
capacidad de proliferación mucho mayor, en comparación con los
ratones de control tratados con LPS (figura 20). No se observaron
diferencias en la proliferación inducida por LPS en ratones
tratados con PBS, con el péptido 1 o sólo con
c-hCG-V.
La figura 21 muestra el efecto de la
reestimulación de los esplenocitos procedentes de ratones tratados
in vivo con diferentes dosis de LPS in vitro. Estos
datos también concuerdan con los datos de proliferación mencionados
anteriormente. En estos experimentos, la reestimulación de los
esplenocitos procedentes de ratones tratados con el péptido 1
(actividad antichoque), con c-hCG (con actividad
antichoque) y con c-hCG-V (fracción
antichoque de c-hCG) tras la inducción del choque
séptico, dio lugar a una mayor capacidad para proliferar, en
comparación con los ratones tratados con LPS+PBS. Por otro lado, los
esplenocitos procedentes de ratones tratados con el péptido 2
(péptido acelerador del choque) presentaron la misma capacidad de
proliferación en comparación con los ratones tratados con LPS+PBS
(figura 21). En esta figura, es importante observar que las
cinéticas de la proliferación de los esplenocitos procedentes de
ratones tratados con el péptido 1 y con la fracción
c-hCG-V fueron similares.
En conjunto, la estimulación in vitro de
los esplenocitos procedentes de ratones BALB/c tratados con LPS y
con péptido o con la fracción con actividad antichoque séptico
redujo la proliferación asociada con la inhibición del choque
séptico in vivo con estos péptidos o fracciones. Por otra
parte, la reestimulación in vitro con LPS de los
esplenocitos procedentes de ratones BALB/c tratados in vivo
con LPS+actividad antichoque séptico incrementó la proliferación
asociada con la inhibición del choque séptico.
Citometría de flujo: los análisis
mediante citometría de flujo de los esplenocitos procedentes de
ratones BALB/c tratados revelaron que los efectos de inhibición del
choque séptico y de aceleración del choque séptico estanco
relacionados con un patrón característico de los marcadores
superficiales de los esplenocitos. La figura 22 muestra que las
actividades de inhibición del choque (c-hCG, péptido
1, péptido 4 y péptido 6) incrementaron la expresión de la molécula
CD80 en las células CD19, en comparación con el grupo de control de
PBS+LPS, mientras que se observó un efecto menor con el péptido 7,
que acelera el choque. La figura 23 muestra un menor número de
células CD19/CD40 en los bazos de las actividades inhibidoras del
choque, en comparación con el grupo de PBS+LPS, mientras que no se
observó efecto alguno con el péptido 7 en los experimentos de
choque. Las figuras 24 y 25 muestran que la actividad inhibidora
del choque séptico desactiva las células B220 positivas y F4/80
positivas, en comparación con los grupos tratados con PBS+LPS. Si
bien el número de linfocitos T CD4+ activados (figura 26) aumentó
con las actividades inhibidoras del choque séptico. No se observaron
diferencias en la activación de las células B220, F4/80 y CD4
positivas con la actividad aceleradora del choque (péptido 7)
(figuras 24-26). Además, se observó un descenso en
la expresión del marcador de membrana celular Nk1.1 tras el
tratamiento con LPS y péptido con actividades inhibidoras del choque
séptico, en comparación con el grupo PBS+LPS, mientras que no se
observó efecto alguno tras el tratamiento con una actividad
aceleradora del choque (figura 27). Se observó un mayor número de
Dx-5 (marcador celular pan-NK) tanto
con la actividad inhibidora del choque séptico como con la
actividad aceleradora del choque (figura 28). Estos resultados
sugieren que la actividad inhibidora del choque séptico puede estar
correlacionada con la desactivación de los macrófagos y de los
linfocitos B, con un mayor número de linfocitos T CD4+ activados y
de linfocitos NK Dx-5, mientras que la actividad
aceleradora del choque séptico se correlaciona con un mayor número
de linfocitos NK Dx-5 activados (la activación y el
número de macrófagos y linfocitos B y T es comparable al grupo de
LPS+PBS).
Bioactividad de hCG: hCG se une a un
receptor LH e induce la señalización mediante cAMP. Hemos
determinado si los péptidos 1, 2, 4, 6 y la fracción antichoque de
bajo peso molecular c-hCG-V pueden
unirse al receptor LH y poseen bioactividad de hCG. La figura 29
muestra que hCG y c-hCG se unen a las células
293-hLHRwt/CREluc e inducen una actividad de la
luciferasa dependiente de la dosis, mientras que no se observó
ningún efecto en la actividad de la luciferasa con los péptidos 1,
2, 4, 6 ni con la fracción de bajo peso molecular
c-hCG-V (figura 30). Además, la
adición del péptido 1, 2, 4, 6 y de la fracción
c-hCG-V en presencia de hCG tampoco
causó ningún efecto sobre la actividad de la luciferasa inducida por
el propio hCG (figura 31).
Estos datos demuestran que estos péptidos y la
fracción c-hCG-V no presentan
bioactividad hCG y que no se unen al receptor LH y, además, no
interfieren en la unión de hCG al receptor LH.
Experimentos NOD: en un documento
anterior de los presentes inventores (WO9959617 se demostró que
altos niveles de IFN-gamma y células Th1 dominantes
están asociados con enfermedades autoinmunes, se ensayó si las
fracciones de bajo peso molecular de una columna 60A
(60A-F3) de c-hCG y orina del primer
trimestre de embarazo podían suprimir la actividad Th1 dominante.
Para determinar si 60A-F3 necesitaba un factor
adicional, tal como hCG, para ejercer su actividad completa, se
trataron a los ratones NOD con 60A-F3, rhCG y
60A-F3 en combinación con rhCG y a continuación se
evaluó la polarización Th1. La figura 32 muestra que hubo una
inhibición moderada de la producción de IFN-gamma
bajo las condiciones de polarización Th1 con 60A-F3
(c-hCG) y con rhCG sola, mientras que el
crecimiento de las células Th1 fue completamente bloqueado con la
combinación de rhCG y 60A-F3
(c-hCG)(figura 32). Resultados similares se
encontraron con la fracción 60A-F3 de bajo peso
molecular de la orina del primer trimestre de embarazo (datos no
mostrados).
Además, se estimularon las células de bazo de
estos ratones tratados con anti-CD3 in vitro
y a continuación se midió la producción de
IFN-gamma en diferentes puntos en el tiempo. La
figura 33 muestra que el tratamiento in vivo con
c-hCG y sus fracciones 60A-F1
(IR-P1) y 60A-F2
(IR-P2) inhibieron el anti-CD3
estimulado por la producción de IFN-gamma, mientras
que se encontró un moderado incremento de la producción de
IFN-gamma con rhCG y 60A-F3.
Además, la fracción 60A-F3 (IR-P3)
en combinación con rhCG fue capaz de inhibir la producción de
IFN-gamma (figura 33).
Los estudios de proliferación estimulados por
anti-CD3 mostraron que los esplenocitos estimulados
por anti-CD3 de ratones NOD tratados con
c-hCG y 60A-F1 tienen una capacidad
menor de proliferar in vitro (figura 34). Además, los
esplenocitos de ratones tratados con 60A-F3
(IR-P3) y rhCG mostraron una capacidad mayor de
proliferar en comparación con el grupo de control tratado con PBS
(CTL), mientras que 60A-F3 (IR-P3)
en combinación con rhCG provocó la misma disminución de la
proliferación que c-hCG y 60A-F1
(IR-P1) (figura 34). Se encontró un efecto moderado
en la proliferación de esplenocitos estimulada por
anti-CD3 en los ratones NOD tratados con
60A-F2. De manera similar, se ensayó el efecto del
péptido 1 en combinación con rhCG sobre la diferenciación Th1,
sobre la producción de IFN-gamma y la proliferación.
Se observó que hubo un incremento en la producción de
IFN-gamma encontrado bajo las condiciones de
polarización Th1 con péptido 1 (27 ng/ml) y r-hCG
sola (25 ng/ml) en comparación con PBS (20 ng/ml), mientras que el
crecimiento de células Th1 fue completamente bloqueado con la
combinación de rhCG y péptido 1 (7 ng/ml). Además, los esplenocitos
de ratones tratados con péptido 1 y rhCG mostraron una mayor
capacidad para proliferar en comparación con el grupo de control
tratado con PBs (CTL), mientras que el péptido 1 en combinación con
rhCG provocó la misma disminución en la proliferación que
c-hCG y 60A-F1 y
60A-F2.
Modelo EAE: la figura 35 muestra el
efecto de 60A-F1 (IR-P1),
60A-F2 (IR-P2) y
60A-F3 (IR-P3) en el modelo EAE
inducido por PLP+PTX. Se vio que el tratamiento de ratones con
60A-F1 y 60A-F2 redujo la severidad
de la enfermedad, así como que retrasó la inducción de EAE.
Mientras que el tratamiento con 60A-F3 solamente
retrasó la aparición de la enfermedad, sugiriendo que es necesario
un factor o factores adicionales de 60A-F2. Estos
resultados son también consistentes con los resultados del pesaje,
que se muestra en la figura 35. En esta figura, los ratones
tratados con fracciones de NMPF activas después de la inducción de
EAE perdieron menos peso que los ratones tratados con PBS. Además,
el tratamiento de los ratones con c-hCG y la
fracción 60A-F3 de c-hCG mostraron
una enfermedad menos severa en el modelo de ratón EAE inducido por
PLP/B pertussis, que es un modelo de enfermedad crónica para EAE
(MS) (figura 36).
Modelo CAO: Los datos de CAO mostraron
que 15 ratas del grupo control tratado solamente con PBS tenían un
área infartada de 70\pm2% (promedio \pm error estándar) después
de 60 minutos de CAO seguido de 2 horas de reperfusión. Mientras
que las ratas tratadas con los péptidos VLPALP, LQGV, VLPALPQVVC,
LQGVLPALPQ, LAGV, LQAV y MTRV mostraron un área infartada de
62\pm6%, 55\pm6%, 55\pm5%, 67\pm2%, 51\pm4%, 62\pm6% y
68\pm2%, respectivamente. Se vio que ciertos péptidos (tales como
VLPALP, LQGV, VLPALPQVVC, LAGV) protegen el área de riesgo de
infarto. Además, el péptido LQAV mostró una menor área de infarto
pero en algunos casos el área presentaba infarto hemorrágico. Estos
son los mismos péptidos que tienen actividad antichoque séptico
in vivo. Es importante notar que los ratones tratados con
ciertos péptidos mencionados anteriormente mostraron una menor
viscosidad de la sangre. Aparte del efecto inmunológico, existe una
posibilidad de que estos péptidos tengan también efecto sobre el
sistema de coagulación directa o indirectamente y haya cierta
homología entre los modelos de sepsis y CAO. Por consiguiente, en
ambos modelos el sistema circulatorio juega un papel importante en
la patogénesis de la enfermedad.
La gonadotropina coriónica humana (hCG) es la
hormona glucoproteica conocida como la hormona del embarazo, dado
que su detección constituye la base de todas las pruebas del
embarazo. Es sintetizada en las etapas más precoces del embarazo
por el tejido trofoblástico en desarrollo que se convertirá en la
placenta. La hormona sirve para mantener las secreciones
esteroideas del cuerpo lúteo (derivadas del folículo ovárico tras la
ovulación). Los esteroides resultantes conservan el recubrimiento
del útero en un estado adecuado para el desarrollo del embrión tras
su implante.
La HCG es un miembro de la familia de hormonas
glicoproteínas, que también comprende la hormona luteinizante
humana (LH), la hormona estimuladora de folículo humana (FSH) y la
hormona estimuladora de tiroides humana (TSH). Estas hormonas son
heterodiméricas, comparten una subunidad alfa común que en humanos
es codificada por un gen simple y cada una tiene una subunidad beta
única que les confiere la especificidad como hormona. Entre estas
cuatro hormonas relacionadas, sólo hCG y su homólogo estructural más
cercano, LH, se unen al mismo receptor presente en el ovario en las
hembras y en los testículos en los machos. La LH humana estimula la
producción de esteroides sexuales tanto en machos como en hembras y,
por lo tanto, el desarrollo de características específicas del
sexo. La FSH humana se une a diferentes receptores en el ovario y
testículos y sirve para estimular el desarrollo del óvulo en las
hembras y de esperma en los machos. La cuarta hormona, la TSH
humana, no está directamente relacionada con la función
reproductiva sino que es responsable de la estimulación de la
producción de tiroxina, que controla la velocidad del metabolismo
corporal. Recientemente, después de resolver la estructura
tridimensional (3D)de hCG, se ha demostrado que hCG es un
miembro de una superfamilia estructural de los factores de
crecimiento con nudo de cistina, tales como NGF,
PDGF-B y TGF-beta.
HCG presenta diversas formas, especialmente en
la orina (Birken, 1996; O'Connor, 1994; Alfthan, 1996; Cole, 1996;
Wide, 1994; Birken, 1993; Cole, 1993). Se presenta de forma
abundante en la orina de las mujeres durante el primer trimestre
del embarazo. Presenta heterogeneidad de carga debido a la
variabilidad de su contenido en ácido siálico. Estas formas
incluyen la hCG heterodimérica con estructura polipeptídica intacta
(hCG), la hCG heterodimérica con cortes de los enlaces peptídicos
en su bucle beta 2 (residuos 44-49) (hCG cortada),
el fragmento del núcleo beta de hCG que se deriva de la subunidad
beta de hCG y está compuesto por los residuos 6-40
unidos mediante enlaces disulfuro a los residuos
55-92 y que contiene grupos carbohidrato cortados
sin ácido siálico, la subunidad beta de hCG derivada de la
disociación de hCG (beta-hCG), la subunidad alfa de
hCG derivada de la disociación de hCG (alfa-hCG).
Además, existe una forma pituitaria de hCG y una forma pituitaria
del fragmento del núcleo beta de hLH.
La subunidad beta, al igual que la subunidad
alfa de hCG, está compuesta por tres bucles; principalmente el
bucle 1 (residuos 9-40), bucle 2 (residuos
41-54) y el bucle 3 (residuos
55-92). La subunidad beta también presenta la
región denominada "cinturón de seguridad", que envuelve a la
subunidad alfa. La subunidad beta contiene seis puentes disulfuro
que mantienen la molécula junta cuando se producen los cortes de los
enlaces peptídicos en el bucle 2, dando lugar a la hCG cortada. El
fragmento del núcleo beta carece de la mayor parte del bucle 2 y la
región del cinturón de seguridad. Por consiguiente, el fragmento del
núcleo beta carece de la región del cinturón de seguridad, de la
mayor parte del bucle 2 y de parte del extremo amino terminal de la
subunidad beta. Los cortes en la región del bucle beta 2 (dado que
se sabe que está expuesta a disolventes y se degrada fácilmente por
acción de las proteasas) tienen como resultado una forma de hCG
biológicamente inactiva y muchos inmunoensayos son incapaces de
medir con precisión la hCG cortada debido a la inmunopotencia
reducida tras los cortes en el bucle beta 2.
En el presente documento hemos demostrado que
algunos productos de descomposición del bucle 2 seleccionados
presentan efectos reguladores inmunes. En nuestros experimentos, los
péptidos 4 (LQGV) y 6 (VLPALP) inhibieron el choque por completo,
mientras que el péptido 2 (LQGVLPALPQ), 3 (LQG) y 7 (VLPALPQ)
aceleraron el choque. Además, los péptidos 1 (VLPALPQVVC), 5
(GVLPALPQ), 8 (GVLPALP), 9 (VVC), 11 (MTRV), 12 (MTR), 13
(LQGVLPALPQVVC) y 14 (CLQGVPALPQVVC cíclico) mostraron en varios
experimentos distintos una variabilidad en la efectividad, así como
en el tipo (inhibitoria frente a aceleradora) de actividad.
Probablemente, esta variabilidad puede atribuirse a la tasa de
descomposición de los diversos péptidos, y a los distintos efectos
que presentan los diversos péptidos. Se observó clivaje en los
residuos de aminoácidos de la hCG-beta comenzando en
los residuos 44, 45, 48 y 49 mediante la elastasa leucocitaria
humana y la existencia de hCG clivada (y también residuos clivados
análogos) ha sido establecida por numerosos investigadores (Kardana,
1991; Birken, 1991). Además, uno o dos sitios beta clivados han
sido vistos de manera común en una preparación simple de hCG, así
como en preparaciones de LH (Ward, 1986; Hartree, 1985; Sakakibara,
1990; Birken, 2000; Cole, 1991; Birken, 1993). La existencia de
estos péptidos o sus homólogos durante el embarazo explica el estado
inmunorregulador del embarazo. También se demostró que la
combinación de péptido 1 con hCG recombinante es capaz de inhibir el
desarrollo de linfocitos T CD4+ Th1 mientras que el péptido 1 solo,
así como la hCG recombinante, no lo hicieron. Esto sugiere
fuertemente la necesidad de un factor adicional de hCG para lograr
este efecto. Estos otros factores pueden derivarse de diferentes
partes de hCG o sus homólogos que se conoce que existen como
fragmentos, tales como los residuos
beta-CG6-40,
beta-CG41-55,
beta-CG55-92 y
beta-CG90-110. Además, los péptidos
antichoque séptico, así como los péptidos que aceleran el choque
tienen cierta homología (>30%) con ciertas regiones de los
fragmentos mencionados anteriormente. Anteriormente, se demostró que
60A-F2 (también conocido como IR-P2
con actividad antidiabética) no posee efectos antichoque y en
algunos caso hasta acelera el choque séptico. Por tanto, es
probable que de hecho los péptidos (tabla 1) utilizados en el modelo
de choque séptico en combinación con los fragmentos antes
mencionados de hCG beta tengan efectos antiinflamatorios crónicos
(antidiabéticos). Esto mismo se cumple para la actividad antiEAE.
Estos péptidos actúan de manera conjunta para mantener la
hemostasis en el sistema inmune y para prevenir y controlar los
desequilibrios del sistema inmune, tales como infecciones, sepsis,
enfermedad autoinmune y enfermedades mediadas por el sistema
inmune.
También se ha demostrado en una patente anterior
de los presentes inventores (WO9959617) y su solicitud de patente
que estas actividades NMPF tienen efectos regulatorios sobre las
respuestas inmune innatas y adoptivas y están presentes en una
proporción variable, lo que explica la heterogeneidad de los
resultados con preparaciones comerciales de hCG derivadas de orina
del embarazo aún de un solo fabricante comercial.
Numerosos estudios han demostrado que la hCG no
sólo es producida por la placenta, sino, por ejemplo, la pituitaria
así como PBMC de individuos masculinos y no embarazadas también son
capaces de producir hCG. Aparte de la posibilidad que NMPF pueda
ser producido por la placenta y por las células maternas, es posible
que NMPF pudiera también derivarse de moléculas similares a hCG en
presencia de varias proteasas y su regulación pudiera estar también
fuertemente controlada por estas proteasas. Se ha demostrado que
existen muchas proteasas en la placenta humana, suero y en otras
partes de cuerpo y uno de sus papeles fisiológicos pudiera ser la
producción de dichos péptidos inmunorreguladores. Ya que los
presentes inventores han observado en sus experimentos la regulación
hacia arriba de las células pan-NK (regulación
hacia arriba del marcador Dx-5), es razonable pensar
que estos tipos de células no sólo tiene actividad celular de
asesinas naturales ("natural killer"), sino que también están
involucradas en la regulación de la respuesta inmune adoptiva, así
como la innata (Saito, 2000). Por ejemplo, las células NK tienen la
capacidad de modular la respuesta celular de las células
presentadoras de antígenos (APC), tales como los macrófagos, DC y
otras poblaciones de linfocitos. Además, la fuerte actividad
citotóxica de las células NK, especialmente de las células
pan-NK, contribuye a la inhibición de tumor o
metástasis de tumor sin inducir una toxicidad significativa (Arai,
2000). Dicho efecto inmunomodulador es observado también en los
neutrófilos, que están involucrados en diferentes daños patológicos,
tal como sepsis. Esta población de células no sólo son cruciales
porque tienden un puente entre las respuestas de resistencia innata
y la respuesta inmune adquirida mediada por células, sino que
también juegan un papel en dirigir las respuestas de los linfocitos
T en el hospedero de manera directa o indirecta a través de APC
contra el organismo intracelular (Tateda, 2001). Por consiguiente,
durante el embarazo la interacción mediada por NMPF y hCG en el
sistema endocrino maternal, el sistema inmune decidual y la función
trofoblástica modulan la relación entre la inmunidad maternal y
fetal y los sistemas endocrinos. Por un lado, debido a NMPF y hCG,
el feto de mamífero percibe, como un transplante satisfactorio y
parásito de manera satisfactoria y por otro lado también la madre y
el feto inmuno-compiten de manera óptima por la
protección contra amenazas, tal como las infecciones.
Además, en esta implicación de la patente, se ha
demostrado que ciertos péptidos (tales como VLPALP, LQGV,
VLPALPQVVC, LAGV) tienen protección sobre el área de riesgo de
infarto. Además, el péptido LQAV mostró un área de infarto menor
pero en algunos casos el área estaba infartada de manera
hemorrágica. Estos son los mismos péptidos que tienen actividad
antichoque séptico in vivo. Es importante señalar que los
ratones tratados con ciertos péptidos antes mencionados mostraron
menos viscosidad en la sangre. Aparte del efecto inmunológico,
existe una posibilidad de que estos péptidos tengan también efecto
sobre el sistema de coagulación de la sangre directa o
indirectamente y existe cierta homología entre los modelos de CAO y
sepsis. Por consiguiente, en ambos modelos el sistema circulatorio
juega un papel importante en la patogénesis de la enfermedad. En
este modelo CAO se vio un papel protectivo de NMPF sobre el infarto
de miocardio, lo que también sugiere el mismo efecto protectivo de
NMPF en otros órganos, así como en las enfermedades relacionadas con
la circulación. Ejemplos de dichas enfermedades son (sin constituir
limitación) el incidente vascular cerebral (CVI), enfermedades
circulatorias del cerebro, retinopatía (tales como las asociadas con
enfermedades vasculares como la diabetes), enfermedades
circulatorias del embarazo, trombosis, aterosclerosis.
Ya que NMPF tiene efecto inmunomodulador y
efecto protectivo en el infarto inducido por CAO, también puede ser
utilizado en casos en los que exista riesgo de baja circulación de
la sangre que conlleve a la disminución del suministro de oxígeno
(hipoxia). Ejemplos (sin constituir limitación) son los
procedimientos de angiografía, PTCA, procedimientos de
"bypass" (coronario) y estenosis.
Figura 1: esta figura muestra el cromatograma
obtenido con la columna GPC 300 A con macroesferas de una muestra
de NMPF (Pregnyl). Se fraccionaron tres áreas seleccionadas,
NMPF-1 que se eluye aparentemente con un peso
molecular de >25 kDa, NMPF-2 que se eluye
aparentemente con un peso molecular de entre 25 kDa y 6 kDa, y
NMPF-3 que se eluye aparentemente con un peso
molecular de <6 kDa.
Figura 2: esta figura muestra el cromatograma
obtenido con la columna GPC 60A con macroesferas de la fracción
NMP-3 obtenida con la columna GPC 300 A con
macroesferas. Se fraccionaron tres áreas seleccionadas,
NMPF-3.1 que se eluye aparentemente con un peso
molecular de entre 2000 y 300 Da, y NMPF-3.8 que se
eluye aparentemente con un peso molecular menor que 300 Da (figura
2). Todas las fracciones se estudiaron para determinar la actividad
antichoque.
Figura 3: esta figura muestra que los ratones
BALB/c tratados con PBS sucumbieron al choque a partir del día 1
después de la inyección de LPS en dosis altas, sobreviviendo menos
del 10% de los ratones vivos en el día 5. Por el contrario, el 100%
de los ratones tratados con NMPF de Pregnyl, o con sus fracciones
NMPF-1 o NMPF-3 obtenidas con una
columna de GPC de 300 A, seguían vivos en el día 5 (P<0,001),
mientras que los grupos de ratones tratados con
NMPF-2 de Pregnyl o con dexametasona (datos no
mostrados) se alcanzó una supervivencia del 25% aproximadamente. No
todos los preparados de hCG comerciales presentaron actividad del
NMPF; por ejemplo, el NMPF de Profasi únicamente mostró una
actividad antichoque parcial (supervivencia del 40%
próximamente).
Figura 4: esta figura muestra que la actividad
anti-choque en un lote activo previamente analizado
residía en una fracción NMPF-3 y en la fracción
NMPF-3.2 derivada de la misma, que inhibe el choque
incluso 24 horas y 36 horas después de la inducción del choque.
Además, en todos los ratones tratados únicamente con la fracción
NMPF-3.2 se inhibió el choque séptico y los animales
presentaron puntuaciones de la enfermedad inferiores a 2, mientras
que esta actividad antichoque de la fracción
NMPF-3.2 se inhibió con NMPF-3.3. El
tratamiento únicamente con NMPF-3.3 aceleró el
choque y los ratones tratados murieron antes que los ratones
tratados con PBS.
Figura 5: esta figura muestra el cromatograma
obtenido con la columna GPC 60A con macroesferas de una mezcla de
fracciones NMPF-3.2 y NMPF-3.3
obtenidas de orina del primer trimestre del embarazo (con actividad
antichoque). Esta figura muestra que la proporción entre la
fracción NMPF-3.2 y NMPF-3.3 es de
aproximadamente 1:2.2 (consúltese el texto).
Figura 6: esta figura muestra el cromatograma
obtenido con la columna GPC 60A con macroesferas de una mezcla de
fracciones NMPF-3.2 y NMPF-3.3
obtenidas de un lote no activo de Pregnyl (con actividad
antichoque). Esta figura muestra la proporción entre la fracción
NMPF-3.2 y NMPF-3.3 es de
aproximadamente 1:3,4 (consúltese el texto).
Figura 7: esta figura muestra el cromatograma
obtenido con la columna GPC 60A con macroesferas de una mezcla de
fracciones NMPF-3.2 y NMPF-3.3
obtenidas de un lote activo de Pregnyl (con actividad antichoque).
Esta figura muestra que la proporción entre la fracción NMPF3,2 y
NMPF3,3 es de aproximadamente 1:1 (consúltese el texto).
Figura 8: esta figura muestra la proliferación
inducida por LPS de los esplenocitos. Tanto anti-MIF
como NMPF (obtenidos de un lote activo de Pregnyl,
NMPF-PG*) son capaces de disminuir la proliferación
estimulada con LPS en comparación con LPS sólo, y juntos muestran
un efecto inhibitorio sinérgico sobre la proliferación estimulada
con LPS.
Figura 9: esta figura muestra que
NMPF-A (APL) acelera la proliferación inducida por
LPS, mientras que esta proliferación se ve inhibida por
anti-MIF y NMPF-G*.
Figura 10: esta figura muestra que la fracción
de bajo peso molecular (NMPF-PG3) de un lote activo
de Pregnyl (NMPF-PG*), así como el
NMPF-PG+ completo, son capaces de inhibir la
proliferación inducida por LPS acelerada por
NMPF-A.
Figura 11: esta figura muestra que
NMPF-PG- (lote no activo de Pregnyl) y
NMPF-A o en combinación (sinérgicamente) aumentan
la proliferación inducida por LPS, mientras que
NMPF-PG* inhibe esta proliferación, del mismo modo
que anti-MIF (véase la figura
8-9).
Figura 12: esta figura muestra que
NMPF-K acelera la proliferación inducida por LPS del
mismo modo que NMPF-PG-, mientras que cuando están
combinados, incrementan la proliferación de forma sinérgica, y este
incremento de la proliferación se ve inhibido por
NMPF-Kb o NMPF-PG*. Además,
NMPF-Kb y NMPF-PG* reducen de forma
sinérgica la proliferación inducida por LPS.
Figuras 13-15: éstas figuras
muestran un efecto inhibitorio dependiente de la dosis (300 y 600
UI/ml) de NMPF-PG+ sobre la proliferación inducida
por LPS y PHA/IL-2 de PBMC aislados de un paciente
en choque séptico. Se observó el mismo efecto en condiciones de
medio sólo.
Figura 16: esta figura muestra el cromatograma
obtenido con la columna GPC 60A con macroesferas de
c-hCG. Se fraccionaron tres áreas seleccionadas,
60A-F1 que se eluye aparentemente con un peso
molecular de >10 kDa, 60A-F2 que se eluye
aparentemente con un peso molecular entre 10 kDa-1
kDa y 60A-F3 que se eluye aparentemente con un peso
molecular menor que 1 kDa. Todas las fracciones se estudiaron para
determinar la actividad antichoque.
Figura 17: esta figura muestra el cromatograma
obtenido con la columna G25 Superdex de c-hCG. Se
recogieron fracciones de 100 mL (fracciones I-VII)
y todas las fracciones se estudiaron para determinar la actividad
antichoque.
Figura 18: esta figura muestra el cromatograma
obtenido con la columna G25 Superdex de una muestra de orina del
primer trimestre del embarazo obtenida en mujeres sanas. Se
recogieron fracciones de 100 mL (fracciones I-VII)
y todas las fracciones se estudiaron para determinar la actividad
antichoque.
Figura 19: esta figura muestra que el
tratamiento in vivo con LPS incrementó la producción de MIF
en comparación con los ratones tratados con PBS, mientras que el
tratamiento con el péptido 1 tras la inducción del choque inhibió
la producción de MIF. No se observó ningún efecto sobre la
producción de MIF en los ratones tratados sólo con el péptido 1.
Figura 20: esta figura muestra que, tras la
reestimulación con LPS in vitro, los esplenocitos de ratones
tratados con LPS presentan una mayor capacidad de proliferar in
vitro, en comparación con los ratones tratados con PBS. Por
otro lado, los esplenocitos procedentes de ratones tratados con
LPS+péptido 1 y LPS+c-hCG-V
presentaron una capacidad de proliferación mucho mayor, en
comparación con los ratones de control tratados con LPS. No se
observaron diferencias en la proliferación inducida por LPS en
ratones tratados con PBS, con el péptido 1 o sólo con
c-hCG-V.
Figura 21: Esta figura muestra el efecto de la
reestimulación de los esplenocitos procedentes de ratones tratados
in vivo con diferentes dosis de LPS in vitro.
Figura 22: Esta figura muestra que las
actividades de inhibición del choque (c-hCG, péptido
1, péptido 4 y péptido 6) incrementaron la expresión de la molécula
CD80 en las células CD19, en comparación con el grupo de control de
PBS+LPS, mientras que se observó un efecto menor con el péptido 7,
que acelera el choque.
Figuras 23-28: estas figuras
muestran los análisis de citometría de flujo de esplenocitos
procedentes de ratones BALB/c tratados.
Figuras 29-31: Estas figuras
muestran que hCG y c-hCG se unen a las células
293-hLHRwt/CREluc e inducen una actividad de la
luciferasa dependiente de la dosis (fig. 29), mientras que no se
observó ningún efecto con los péptidos 1 (VLPALPQVVC), 2
(LQGVLPALPQ), 4 (LQGV), 6 (VLPALP) ni con la fracción de bajo peso
molecular c-hCG-V (figura
30).Además, la adición del péptido 1, 2, 4, 6 y de la fracción
c-hCG-V en presencia de hCG tampoco
causó ningún efecto sobre la actividad de la luciferasa inducida por
el propio hCG (figura 31).
Figura 32: Esta figura muestra que hubo una
inhibición moderada de la producción de IFN-gamma
encontrada bajo condiciones de polarización Th1 con
60A-F3 (c-hCG) y rhCG sola, mientras
que el crecimiento de las células Th1 fue bloqueado completamente
con la combinación de rhCG y 60A-F3
(c-hCG).
Figuras 33-34: Estas figuras
muestran que los esplenocitos estimulados con
anti-CD3 de los ratones NOD tratados con
c-hCG y 60A-F1 tienen una menor
capacidad de proliferar in vitro. Además, los esplenocitos de
ratones tratados con 60A-F3 (IR-P3)
y rhCG mostraron una mayor capacidad para proliferar en comparación
con los ratones del grupo de control (CTL) tratados con PBS,
mientras que 60A-F3 (IR-P3) y rhCG
en combinación provocó la misma disminución en la proliferación que
c-hCG y 60A-F1
(IR-P1)(figura 34). Se encontró un efecto moderado
en la proliferación estimulada por anti-CD3 de los
esplenocitos de ratones NOD tratados con 60A-F2.
Figuras 35-36: Estas figuras
muestran el efecto de 60A-F1
(IR-P1), 60A-F2
(IR-P2) y 60A-F3
(IR-P3) en el modelo EAE inducido por PLP+PTX.
Además, la figura 36 muestra el efecto del tratamiento de ratones
con c-hCG y la fracción 60A-F3 de
c-hCG en el modelo de ratón EAE inducido por PLP/B
pertussis, que es un modelo de enfermedad crónica para EAE (MS).
Claims (5)
1. Un péptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos escogida entre el grupo compuesto
por
VLPALPQVVC, VLPALPQ, VLPALP, MTRV, MTR, PALP, QVVC, LQGV, AQGV, LQGA, ALPALP, VAPALP, ALPALPQ, VLPAAPQ, VLPALAQ y LQGVLPALPQVVC cíclico.
VLPALPQVVC, VLPALPQ, VLPALP, MTRV, MTR, PALP, QVVC, LQGV, AQGV, LQGA, ALPALP, VAPALP, ALPALPQ, VLPAAPQ, VLPALAQ y LQGVLPALPQVVC cíclico.
2. Péptido, según la reivindicación 1, en el que
el péptido comprende una secuencia de aminoácidos escogida entre
LQGV, VLPALP, MTRV, MTR y LQGVLPALPQVVC cíclico.
3. Péptido, según la reivindicación 1, en el que
el péptido comprende una secuencia de aminoácidos escogida entre
LQGV, AQGV, LQGA, VLPALP, ALPALP, VAPALP, ALPALPQ, VLPAAPQ y
VLPALAQ.
4. Péptido, según la reivindicación 3, en el que
el péptido comprende una secuencia de aminoácidos escogida entre
LQGV, AQGV, LQGA, VLPALP y VLPALAQ.
5. Preparación farmacéutica que comprende como
componente activo, como mínimo, un péptido aislado según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4.
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