ES2315278T3 - Immunorregulador. - Google Patents

Abstract

Utilización de un péptido aislado para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento, la supresión o la prevención de una enfermedad inflamatoria aguda, en la que el péptido presenta una secuencia de aminoácidos escogida entre el grupo compuesto por LQGV, AQGV, LQGA, VLPALP, ALPALP, VAPALP, ALPALPQ, VLPAAPQ, VLPALAQ, GVLPALP, VVC, MTRV, MTR, LQGVLPALPQVVC y LQGVLPALPQVVC cíclico.

Description

Inmunorregulador.

Sector de la invención

La invención se refiere al campo de la inmunología, más específicamente al campo de los trastornos mediados por un mecanismo inmunitario como las enfermedades inflamatorias.

Antecedentes de la invención

El sistema inmunitario produce citocinas y otros factores humorales que protegen al huésped cuando está amenazado por agentes inflamatorios, invasiones microbianas o lesiones. En la mayoría de los casos, esta compleja red defensiva restaura con éxito la homeostasis normal, pero en otras ocasiones los mediadores inmunológicos pueden ser realmente perjudiciales para el huésped. Algunos ejemplos de enfermedades inmunes y problemas relacionados con el sistema inmunitario han sido investigados exhaustivamente, como es el choque anafiláctico, la enfermedad autoinmune y los trastornos de los complejos inmunes.

Los últimos avances en la inmunología humoral y celular, la biología molecular y la patología han influido en las teorías actuales sobre la autoinmunidad, que se considera un componente de una enfermedad mediada por un mecanismo inmunitario. Estos avances han aumentado nuestros conocimientos sobre los aspectos básicos de los anticuerpos, la diversidad de los linfocitos B y linfocitos T, la generación de las respuestas inmunes innata (efectuada por los monocitos, los macrófagos, los granulocitos, los linfocitos citolíticos naturales, los mastocitos, los linfocitos T \gamma\delta, el complemento, las proteínas de fase aguda y otros) y adaptativa (linfocitos T y B y anticuerpos) o las respuestas inmunes celular y humoral y su interdependencia, los mecanismos de inducción de (auto)-tolerancia y los medios por los que se desarrolla la reactividad inmunológica frente a los constituyentes autoantigénicos.

Ya desde 1900 el dogma central de la inmunología ha sido que el sistema inmunitario no reacciona normalmente ante sí mismo. No obstante, recientemente ha quedado claro que las respuestas autoinmunes no son tan poco frecuentes como se pensaba antiguamente y que no todas las respuestas autoinmunes son perjudiciales; algunas de ellas desempeñan un papel evidente en la mediación de la respuesta inmune en general. Por ejemplo, algunas formas de la respuesta autoinmune como el reconocimiento de los antígenos de superficie celular codificados por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y de las respuestas antiidiotípicas frente a autoidiotipos son importantes, en realidad, esenciales, para la diversificación y funcionamiento normal del sistema inmunitario intacto.

Aparentemente, se mantiene un sistema complejo de comprobaciones y equilibrios entre varias subpoblaciones de las células (es decir, linfocitos T) del sistema inmunitario, con lo que se proporciona al individuo un sistema inmunitario que es capaz de enfrentarse a los invasores externos. En ese sentido, la autoinmunidad desempeña un papel regulador en el sistema inmunitario.

No obstante, ahora también se sabe que una respuesta autoinmune anormal es en ocasiones la causa principal de muchas enfermedades del hombre y de animales, y otras veces es un factor contribuyente secundario. Los tipos de enfermedades autoinmunes se superponen con frecuencia y tiende a aparecer más de un trastorno autoinmune en el mismo individuo, especialmente en los que tienen endocrinopatías autoinmunes. Los síndromes autoinmunes pueden estar mediados por una hiperplasia linfoide, por una proliferación celular maligna linfocítica o de células plasmáticas y por trastornos por inmunodeficiencia como la hipogammaglobulinemia, los déficits selectivos de Ig y los déficits de los componentes del complemento.

Las enfermedades autoinmunes, como el lupus eritematoso sistémico, la diabetes, la artritis reumatoide, la disfunción tiroidea posparto, la trombocitopenia autoinmune, por nombrar sólo algunas, se caracterizan por las respuestas autoinmunes, por ejemplo dirigidas contra determinantes de autoantígenos ampliamente diseminados, o dirigidas contra antígenos específicos de órganos o tejidos. En tal caso, este tipo de enfermedades pueden verse después de unas respuestas inmunes anormales frente a sólo una diana antigénica o frente a muchos autoantígenos. En muchos casos, no está claro si las respuestas autoinmunes se dirigen frente a autoantígenos no modificados o autoantígenos que han sido modificados (o se parecen) a cualquiera de los numerosos agentes como virus antígenos bacterianos y grupos hapténicos.

Hasta la fecha no se ha establecido un concepto unificado que explique el origen y patogenia de los distintos trastornos autoinmunes. Los estudios sobre experimentación animal apoyan la idea de que una enfermedad autoinmune puede ser consecuencia de un amplio espectro de anomalías genéticas e inmunológicas que difieren entre un sujeto y otro, y que se expresan antes o después a lo largo de la vida dependiendo de la presencia o ausencia de muchos factores superpuestos exógenos (virus o bacterias) o endógenos (hormonas, citocinas o genes anormales) que aceleran el proceso.

Es evidente que hay procedimientos de comprobaciones y equilibrios similares que mantienen la enfermedad autoinmune principal en reposo que también están comprometidos en los trastornos mediados por mecanismo inmunitario, como una alergia (asma), una enfermedad inflamatoria aguda como septicemia o choque séptico, una enfermedad inflamatoria crónica (es decir, una enfermedad reumática, síndrome de Sjögren, esclerosis múltiple), respuestas inmunes relacionadas con el trasplante (enfermedad injerto contra huésped, trombocitopenia postransfusional) y muchas otras en las que los antígenos responsables (al menos inicialmente) pueden no ser autoantígenos pero en los cuales la respuesta inmune a dicho antígeno es, en principio, no deseada y perjudicial para el individuo. La septicemia es un síndrome en el que los mediadores inmunes, inducidos por ejemplo por la invasión microbiana, a través de un daño directo o mediante otros factores, inducen un estado agudo de inflamación que provoca la homeostasis anormal, daño orgánico y finalmente, un choque letal. La septicemia se refiere a una respuesta sistémica a una infección grave. Los pacientes que tienen septicemia habitualmente manifiestan fiebre, taquicardia, taquipnea, leucocitosis y un lugar localizado de infección. Los cultivos microbiológicos procedentes de la sangre o del lugar de la infección son con frecuencia, aunque no siempre, positivos. Cuando este síndrome da lugar a hipotensión o a un fracaso multiorgánico (MOSF), la situación se conoce como septicemia o choque séptico. Inicialmente, los microorganismos proliferan en el nido de la infección. Los organismos pueden invadir el torrente sanguíneo, dando lugar a hemocultivos positivos, o pueden crecer localmente y liberar varias sustancias al torrente sanguíneo. Tales sustancias se agrupan en dos categorías básicas cuando son de naturaleza patógena: endotoxinas y exotoxinas. Las endotoxinas consisten habitualmente en componentes estructurales de los microorganismos, como el antígeno del ácido teicoico procedente de los estafilococos o endotoxinas procedentes de organismos gramnegativos (como LPS). Los microorganismos sintetizan y liberan directamente las exotoxinas (como la toxina 1 del síndrome de choque tóxico, o la enterotoxina A, B o C estafilocócica).

Como su nombre indica, ambos tipos de toxinas bacterianas tienen efectos patógenos, estimulando la liberación de un gran número de mediadores inmunes endógenos derivados del propio huésped a partir de proteínas plasmáticas o células precursoras (monocitos/macrófagos, células endoteliales, neutrófilos, linfocitos T y otros).

En general, es un hecho que estos mediadores inmunes causan el daño orgánico y tisular asociado a la septicemia o choque séptico. Algunos de estos efectos derivan de la lesión orgánica inducida por un mediador directo. Sin embargo, es probable que una porción de la disfunción orgánica asociada al choque se deba a anomalías inducidas por el mediador en la red vascular, lo que provoca alteraciones del flujo sanguíneo sistémico y regional que, a su vez, se traducen en una hipotensión refractaria o MOSF (Bennett y otros).

En general, los linfocitos T desempeñan un papel central en el inicio del proceso morboso mediado por mecanismo inmunitario (Sempe y otros 1991, Miyazaki y otros 1985, Harada y otros 1986, Makino y otros 1986). Los linfocitos T CD4+ se pueden separar, como mínimo, en dos subpoblaciones principales, Th1 y Th2. Los linfocitos Th1 activados segregan IFN-\gamma y TNF-\alpha, mientras que los linfocitos Th2 producen IL-4, IL-5 e IL-10. Los linfocitos Th1 están implicados críticamente en la generación de la inmunidad celular eficaz, mientras que los linfocitos Th2 son el instrumento de la generación de la respuesta inmune y alérgica de tipo humoral y mucosa, como es la activación de los eosinófilos y los mastocitos y en la producción de IgE (Abbas y otros 1996).

La incidencia de septicemia o choque séptico ha ido en aumento, desde los años 30 y todos los datos recientes sugieren que este aumento continuará. Las razones para la mayor incidencia son muchas: aumento de la utilización de dispositivos invasivos como catéteres intravasculares, utilización extendida de tratamientos farmacológicos citotóxicos e inmunosupresores para el cáncer y el trasplante, aumento de la longevidad de los pacientes con cáncer y diabetes, que son propensos a desarrollar septicemia, y a un aumento de infecciones debido a los microorganismos resistentes a antibióticos. La septicemia o el choque séptico es la causa más frecuente de muerte en las unidades de cuidados intensivos y es la decimotercera causa de muerte por orden de importancia en los Estados Unidos. La incidencia precisa de la enfermedad se desconoce, porque no se documenta; no obstante, una estimación razonable en los Estados Unidos es 400.000 casos de septicemia, 200.000 casos de choque séptico y 100.000 muertes derivadas de esta afección.

Varios microorganismos, como bacterias gramnegativas y grampositivas, así como hongos, pueden provocar septicemia y choque séptico. Algunos virus y Rickettsias pueden producir probablemente un síndrome similar. Comparadas con los microorganismos grampositivos, las bacterias gramnegativas muestran una mayor tendencia a producir septicemia o choque séptico. Cualquier localización de la infección puede desembocar en septicemia o choque séptico. Las causas frecuentes de septicemia son la pielonefritis, la neumonía, la peritonitis, la colangitis, la celulitis o la meningitis. Muchas de estas infecciones son nosocomiales, apareciendo en pacientes hospitalizados por otros problemas médicos. En los pacientes que tienen unas defensas normales se suele identificar una localización de la infección en la mayoría de los casos. Sin embargo, en los pacientes neutropénicos se encuentra una localización clínica de la infección en menos de la mitad de los pacientes con septicemia debido, probablemente, a pequeñas infecciones clínicamente no evidentes situadas en piel o intestino, que pueden provocar la invasión del torrente sanguíneo en ausencia de neutrófilos circulantes adecuados. Está claro que hay que proteger frente a la septicemia o choque séptico a los pacientes que corren estos riesgos.

Recientemente, se han hecho esfuerzos considerables dirigidos a identificar a los pacientes con septicemia al principio de la evolución clínica, cuando los tratamientos tienen más probabilidades de ser eficaces. Las definiciones han incorporado las manifestaciones de la respuesta sistémica a la infección (fiebre, taquicardia, taquipnea y leucocitosis) junto a los signos de disfunción de órganos y sistemas (con alteraciones cardiovasculares, respiratorias, renales, hepáticas, en el sistema nervioso central, hematológicas o metabólicas). Las definiciones más recientes usan el término (síndrome de respuesta inflamatoria sistémica) (SIRS), resaltando que la septicemia es un ejemplo de las respuestas inflamatorias del cuerpo mediadas por mecanismo inmunitario que se pueden desencadenar no sólo por infecciones, sino también por trastornos no infecciosos como traumatismos o pancreatitis (para obtener información sobre la interrelación existente entre la respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), septicemia e infección, véase Crit. Care Med. 20:864, 1992; para consultar una revisión sobre las secuencias patógenas de los eventos que se desarrollan en la septicemia o choque séptico, véase N Engl J Med 328:1471, 1993).

La toxina del síndrome de choque tóxico (TSST-1) representa la exotoxina clínicamente más relevante, identificada como el agente causante en más del 90% de los casos de síndrome de choque tóxico (en los que el choque tóxico se define como una septicemia o choque séptico causado por exotoxinas superantigénicas). Los superantígenos difieren de los antígenos "normales" porque no requieren el procesamiento celular antes de mostrarse en la molécula del MHC. Por el contrario, se unen a una región semiconservada situada en el exterior del TCR y provocan un "reconocimiento" falso de los antígenos propios que se muestran en la clase II del MHC (Perkins y otros; Huber y otros 1993). Este efecto se traduce en una activación "falsa" de los linfocitos T y del APC, lo que provoca la proliferación y activación de las funciones efectoras y la secreción de citocinas. Debido a la activación policlonal de los linfocitos T por el superantígeno, se produce un extenso choque sistémico debido a la liberación excesiva de citocinas inflamatorias (Huber y otros 1993, Miethke y otros 1992).

Las citocinas inflamatorias implicadas en la septicemia son similares. Estos mediadores inmunes son el factor de necrosis tumoral (TNF), interferón gamma (IFN-gamma), óxido nítrico (ON) e interleucina 1 (IL-1), que se liberan masivamente por monocitos, macrófagos y otros leucocitos en respuesta a toxinas bacterianas (Bennett y otros, Gutiérrez-Ramos y otros 1997). La liberación de TNF y de otros mediadores endógenos puede provocar varias reacciones fisiopatológicas en la septicemia, como fiebre, leucopenia, trombocitopenia, cambios hemodinámicos, coagulación intravascular diseminada, así como la infiltración de leucocitos y la inflamación de varios órganos, todo lo cual puede conducir finalmente a la muerte. El TNF también hace que las células endoteliales expresen receptores de adherencia (selectinas) y pueden activar a los neutrófilos para que expresen ligandos para estos receptores que ayudan a su vez a los neutrófilos a adherirse a la superficie celular del endotelio para la adherencia, marginación y migración hacia los focos inflamatorios de los tejidos (Bennett y otros). El bloqueo del proceso de adherencia con anticuerpos monoclonales pre-
viene el daño tisular y mejora la supervivencia en un modelo animal de septicemia o choque séptico (Bennett y otros).

Estos descubrimientos, tanto en una enfermedad autoinmune como en una enfermedad inflamatoria aguda o crónica, subrayan la existencia propuesta de las células que regulan el equilibrio entre las subpoblaciones Th activadas. Los posibles trastornos de este equilibrio se inducen por una reactividad alterada, como la que se produce en las poblaciones de linfocitos T reguladores que pueden provocar enfermedades mediadas por un mecanismo inmunitario que, a su vez, desembocan en la ausencia o sobreproducción de algunas citocinas fundamentales (O'Garra y otros 1997). Estas subpoblaciones Th son dianas potenciales de la regulación farmacológica de las respuestas inmunes.

En general, los trastornos mediados por un mecanismo inmunitario son difíciles de tratar. Muchas veces se aplican medicaciones de amplio espectro, como el tratamiento con corticoesteroides o cualquier otro fármaco antiinflamatorio de amplio espectro que, en muchos aspectos, pueden ser perjudiciales para el individuo tratado.

Durante el embarazo, el sistema inmunitario materno está modulado, lo que se traduce en la supresión de las respuestas inmunes maternas contra el feto, manteniéndose al mismo tiempo la resistencia de la madre ante las infecciones. Hemos demostrado la presencia del inmunorregulador (IR, W099-59617) citado en este documento, NMPF (factor(es) inmunomoludador(es) durante el embarazo), que regula tanto los sistemas inmunitarios innato como adaptativo de un modo estimulador y antagonista (W099-59617). Estos factores incluyen, entre otros, preparados de hCG comerciales derivados de orina de embarazo humano, preparados de bhCG, ciertos péptidos de b-hCG, ciertas combinaciones de péptidos de b-hCG y ciertas fracciones de cromatografía de filtración en gel de preparados de hCG comerciales y de orina de embarazo humano. El equilibro de estos factores resulta crucial para conseguir una correcta regulación del sistema inmunitario materno. Por ejemplo, la sobreactivación del sistema innato puede provocar problemas en la evolución del propio embarazo. La preeclampsia es una de las afecciones caracterizadas por la hiperactivación del sistema inmunitario innato. Recientemente, también se ha sugerido que el desequilibrio crónico entre los dos sistemas inmunitarios podría constituir la base de la diabetes de tipo II (diabetes mellitus no insulinodependiente), así como de otras enfermedades (WQ99-59617).

En general, hay una necesidad de disponer de posibilidades mejores y más específicas que permitan regular las comprobaciones y equilibrios del sistema inmunitario y tratar los trastornos mediados por un mecanismo inmunitario.

Descripción de la invención

En la presente invención se da a conocer, entre otros, un inmunorregulador (NMPF) que se puede obtener o sintetizar a partir de un metabolito urinario de hCG, en particular a partir de formas cortadas de b-hCG, u homólogos peptídicos (sintéticos) o análogos del mismo. Estas formas de b-hCG presentan cortes de los enlaces peptídicos dentro de la subunidad b (Birken y otros, Endocrinology 133:1390-1397, 1993). De forma sorprendente, se ha descubierto que una gama de productos de degradación de beta-HCG dan lugar a una cascada de inmunorreguladores (NPMF) que desempeñan multitud de funciones. De forma aún más sorprendente, dichos inmunorreguladores están interrelacionados y se derivan los unos de los otros. La invención da a conocer la utilización de un péptido aislado para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento, la supresión o la prevención de una enfermedad inflamatoria aguda, en la que el péptido presenta una secuencia de aminoácidos escogida entre el grupo compuesto por LQGV, AQGV, LQGA, VLPALP, ALPALP, VAPALP, ALPALPQ, MTR, VLPAAPQ, VLPALAQ, GVLPALP, VVC, MTRV, LQGVLPALPQVVC y LQGVLPALPQVVC cíclico. La enfermedad inflamatoria aguda comprende el rechazo (hiper)agudo de un trasplante, el choque séptico y la enfermedad autoinmune aguda.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento, se da a conocer un inmunorregulador que es capaz de regular negativamente las concentraciones de células Th1 o de regular positivamente las concentraciones de células Th2, o de influir en su relación porcentual en un animal, pudiendo dicho inmunorregulador obtenerse a partir de la orina u otras fuentes de productos corporales como suero, suero de leche, extracto de placenta, células o tejidos. Que se puede obtener, significa en esta descripción la obtención directa o indirecta de dicho NMPF a partir de dicha fuente, siendo el NMPF por ejemplo obtenido a través de una síntesis química o a partir de fuentes naturales de origen animal o vegetal.

Por consiguiente, la invención también da a conocer la utilización de un péptido aislado que presenta una secuencia de aminoácidos escogida entre el grupo compuesto por LQGV, AQGV, LQGA, VLPALP, ALPALP, VAPALP, ALPALPQ, VLPAAPQ, VLPALAQ, GVLPALP, VVC, MTRV, MTR, LQGVTPALPQVVC y LQGVLPALPQVVC cíclico, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria aguda, en la que dicho tratamiento comprende la regulación de los índices relativos y/o de la actividad de citocinas de subpoblaciones de células linfocitarias, dendríticas o presentadoras de antígenos en un paciente tratado. Éste permite regular los índices relativos y/o la actividad de citocinas de subpoblaciones de células linfocitarias, dendríticas o presentadoras de antígenos en un animal enfermo (por ejemplo, el hombre), preferentemente cuando estas subpoblaciones de linfocitos consisten en poblaciones Th1 o Th2, o en poblaciones DC1 o DC2. En general, los linfocitos T colaboradores CD4+ vírgenes (Th) desarrollan unas células efectoras funcionalmente maduras tras la estimulación con el péptido antigénico relevante que se encuentra en las moléculas de clase II del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), introducidas por las células presentadoras de antígenos (APC). Basado en el juego característico de citocinas producidas, los linfocitos Th se dividen habitualmente en, como mínimo, dos subpoblaciones diferentes: linfocitos Th1 que producen exclusivamente interleucina 2 (IL-2), interferón-gamma (IFN-\gamma) y linfotoxina, mientras que los linfocitos Th2 producen IL-4, IL-5, IL-6, IL- 10 e IL-13. Estas subpoblaciones Th1 y Th2 parecen ser los extremos de los perfiles de producción de citocinas y entre ambas subpoblaciones polarizadas cada linfocito Th individual muestra una expresión génica más diferencial que coordinada de citocinas. Estas subpoblaciones se desarrollan a partir de unos linfocitos Th precursores comunes (Thp) después de ser activados con los péptidos relevantes sobre las células Th0, produciéndose una serie de citocinas como son IL-2, IL-4, IL-5 e IFN-\gamma. Estos linfocitos Th0 activados se polarizan posteriormente en dirección Th1 o Th2 según la composición celular y la composición de citocinas de su microentorno. Las células presentadoras de antígenos, como las distintas subpoblaciones de células dendríticas y las subpoblaciones de macrófagos, determinan principalmente esta polarización al desarrollo de subpoblaciones Th1 o Th2. Parece que las subpoblaciones Th1-Th2 regulan mutuamente entre sí los perfiles de producción de citocinas, principalmente a través de IFN-\gamma e IL-10 y a partir de este concepto se racionalizó que los trastornos del equilibrio entre ambas subpoblaciones pueden dar lugar a distintas manifestaciones clínicas [5]. IL-12 es un factor dominante que promueve la polarización de la subpoblación Th1 y de las células dendríticas y macrófagos para producir IL-12. Además, IL-12 induce la producción de IFN-\gamma por los linfocitos T y los linfocitos citolíticos naturales (NK). Recientemente, se ha descrito que IL-18 actúa sinérgicamente con IL-12 para inducir el desarrollo de Th1. La polarización de los linfocitos Th2 depende fundamentalmente de la presencia de IL-4 producida por linfocitos T o basófilos y linfocitos T. También se ha demostrado que la IL-6 derivada de APC induce pequeñas cantidades de IL-4 que participan en el desarrollo de las células Th. La prostaglandina E_{2} (PGE_{2}) derivada de IL-10 y APC inhibe la producción de IL-12 y el cebado de la subpoblación Th1.

El paradigma Th1-Th2 ha sido útil para establecer la correlación entre la función de los linfocitos Th1 con la inmunidad por mediación celular (respuestas inflamatorias, hipersensibilidad retardada y citotoxicidad) y de los linfocitos Th2 con la inmunidad humoral. En general, entre las enfermedades infecciosas la resistencia a las bacterias, hongos y protozoos intracelulares está ligada a la consecución de una respuesta Th1 satisfactoria. Las respuestas Th1 también se pueden vincular a una determinada afección, como artritis, colitis y otros estados inflamatorios. La protección eficaz frente a patógenos extracelulares, como helmintos, requiere principalmente la respuesta Th2 y un aumento de la inmunidad humoral puede desembocar en una neutralización satisfactoria de los patógenos mediante la producción de anticuerpos específicos.

En el presente documento, se da a conocer un inmunorregulador capaz de modular la diferenciación de las células dendríticas. El crecimiento selectivo de los linfocitos Th1 frente a los linfocitos Th2 depende de la interacción de los linfocitos Th precursores con las células presentadoras de antígenos (APC) que transportan el péptido relevante junto a sus moléculas de clase II del MHC. Las citocinas liberadas por las APC y que se presentan durante la interacción inicial entre las células dendríticas y el receptor pertinente de los linfocitos T son las que dirigen la diferenciación en subpoblaciones Th1 frente a subpoblaciones Th2. Recientemente, se han descrito en el hombre dos precursores diferentes de DC (mieloide frente a linfoide). El desarrollo selectivo de DC1 a partir de los precursores mieloides se produce después de la estimulación con el ligando CD40 o una endotoxina y da lugar a una producción elevada de IL-12. Los precursores linfoides dan lugar a células DC2 después de la estimulación con el ligando CD40 y producen IL-1, IL-6 e IL-10. Estas citocinas tienen una importancia capital para dirigir el desarrollo de los linfocitos Th activados: se necesita IL-4 para el crecimiento de linfocitos de tipo Th2, que puede potenciarse en gran medida por la presencia de IL-10, mientras que la diferenciación selectiva a células de tipo Th1 depende exclusivamente de la presencia de IL-12. Como los DC1 se caracterizan por la producción de IL-12, inducirán principalmente el crecimiento de linfocitos de tipo Th1, mientras que DC2 produce IL-10 y promueve selectivamente el desarrollo de linfocitos Th2 en presencia de IL-4 exógena. En esta descripción se demuestra que un NMPF como el proporcionado por la invención es capaz de regular o modular la actividad y diferenciación de DC, con lo que permite una diferenciación y actividad selectivas de los linfocitos Th1 y/o Th2.

En otra realización, la invención da a conocer la utilización de un inmunorregulador capaz de proteger a un ratón frente a un choque séptico inducido por un lipopolisacárido, por ejemplo, permitiendo la actividad y diferenciación de DC regular o modulada, o permitiendo la diferenciación y actividad selectiva de los linfocitos Th1 y/o Th2, en caso de una inflamación aguda, como se ve en el choque o en el rechazo (hiper)agudo del trasplante, en la cual dicho principio activo es capaz de reducir la ASAT o la concentración plasmática de otras enzimas relevantes después de o durante un fracaso orgánico, como se observa habitualmente en el choque.

Aunque dicho inmunorregulador, según la invención, se obtiene fácilmente como metabolito urinario de la gonadotropina o como producto de degradación de la orina, por ejemplo, en la cual dicho preparado de gonadotropina coriónica de mamífero se obtiene a partir de la orina, pero también se pueden utilizar otras fuentes, como suero, células o tejidos que contienen gonadotropina. También a partir de dichas fuentes se da a conocer un inmunorregulador, según la invención, que es capaz de, por ejemplo, regular la actividad de los linfocitos Th1 y/o Th2, o que es capaz de modular la diferenciación de las células dendríticas. En particular, como inmunorregulador, se da a conocer un péptido (sintético) que se puede obtener o sintetizar a partir de beta-HCG, preferentemente a partir de beta-HCG cortada. Por supuesto, dicho péptido, o un equivalente funcional del mismo, se puede obtener o sintetizar a partir de gonadotropinas de otros mamíferos, según lo explicado anteriormente en el presente documento. Dicho péptido es capaz, por ejemplo, de proteger frente al choque séptico u otros trastornos mediados por un mecanismo inmune. Preferentemente, dicho inmunorregulador peptídico se obtiene a partir de un péptido que presenta, como mínimo, 10 aminoácidos, tal como un péptido que presenta una secuencia de aminoácidos MTRVLQGVLPALPQVVC o un fragmento funcional (p.ej., un producto de degradación) o un análogo funcional.

En particular, se da a conocer un inmunorregulador en el que dicho fragmento funcional comprende un péptido que presenta, como mínimo, 10 aminoácidos, tal como uno que presenta la secuencia de aminoácidos, LQGVLPALPQVVC (\beta45 + \beta48), o VLPALPQVVC (\beta48) o LQGVLPALPQ (\beta45), o un análogo funcional del mismo, denominado también en el presente documento NMPF-K. Dicho inmunorregulador que comprende dicho péptido (o mezcla de péptidos) que presenta la longitud deseada de, como mínimo, aproximadamente 10 aminoácidos (y en especial cuando se encuentra unido a una molécula de mayor tamaño, por ejemplo cuando se encuentra unido por medio de su cisteína a otro fragmento beta-HCG), regula en general el equilibrio Th1/Th2 así como la inmunidad innata durante un trastorno mediado por un mecanismo inmune. Por ejemplo, en el caso del choque séptico, la proliferación inducida por LPS de los esplenocitos o la diabetes se ven acelerados o agravados. Se da a conocer una actividad similar para un péptido con una cadena relativamente pequeña (tercer inmunorregulador, 3-5 aminoácidos de longitud) que comprende MTRV o MTR o QVVC o VVC o CLQG o LQGV o LQG (y en especial cuando se encuentra unido a una molécula de mayor tamaño, por ejemplo cuando se encuentra unido por medio de su cisteína a otro fragmento beta-HCG).

Más en particular, se da a conocer un primer inmunorregulador que comprende un fragmento funcional que comprende una secuencia de aminoácidos VLPALPQVVC o LQGVLPALPQ o un análogo funcional del mismo, que contrarresta las actividades reguladoras de otro segundo inmunorregulador, comprendiendo dicho fragmento funcional una secuencia de aminoácidos de entre 9 y 6 aminoácidos (también denominada en el presente documento NMPF-Kb), tal como VLPALPQ o GVLPALPQ o GVLPALP o VLPALP o un análogo funcional del mismo, que, por ejemplo, es capaz de regular el equilibrio Th1/Th2, así como la inmunidad innata durante un trastorno mediado por un mecanismo inmune, de tal modo que es capaz de reducir los síntomas clínicos observados durante los trastornos mediados por un mecanismo inmune, tales como el choque séptico, la proliferación inducida por LPS de los esplenocitos o la diabetes, en lugar de acelerar o agravar estos síntomas propios de los trastornos mediados por un mecanismo inmune, tal y como se describe, por ejemplo, en la descripción detallada, en donde el NMPF-Kb es capaz de proteger a un ratón frente a un choque séptico inducido por un lipopolisacárido u otras alteraciones agudas o crónicas inmuno-mediadas tal como se explica en esta descripción. Dado que se produce un solapamiento entre los péptidos \beta45 y \beta48 (\beta45; LQGVLPALPQ \beta48: VLPALPQVVC), también evaluamos el efecto del péptido desnaturalizado \beta45+\beta48 (LQGVLPALPQVVC) sobre la proliferación inducida por LPS (in vitro) y actividad anti-choque (in vivo) en ratones BALB/c. Nuestros resultados demostraron que el péptido \beta45+\beta48 desnaturalizado inhibe la proliferación inducida por LPS y el choque séptico in vivo. Los productos de degradación se generan mediante proteólisis, por ejemplo mediante lisis con leucocito elastasa, y pueden verse sometidos a una modificación adicional como, por ejemplo, mediante la actividad de las (glutatión) transferasas. Uno de los posibles productos de degradación del péptido \beta45+\beta48 es LQG, que tiene un aspecto similar a la glutationa (un tripéptido de G, C y Q con L-glutamato que posee un enlace isopeptídico con el grupo amino de la L-cisteína). Hemos demostrado que el NMPF también inhibe la diabetes inducida por la (toxina) estreptozotocina (SZ) en ratones, a través de la destrucción de las células beta. Uno de los mecanismos implicados en la destrucción de las células beta pancreáticas es la formación de los radicales reactivos (ROS, NO, etc.), que también desempeñan una función importante en la patogenia de muchas enfermedades como la nefropatía, la nefropatía obstructiva, el rechazo de aloinjerto renal agudo y crónico, enfermedades autoinmunes (como SLE, artritis reumatoide, diabetes, MS), el SIDA, enfermedades relacionadas con angiogénesis, aterosclerosis, trombosis y diabetes mellitus de tipo II. Así pues, es probable que el NMPF también actúe como "antioxidante". Por ejemplo, los productos de degradación de \beta45+\beta48 tales como los péptidos LQG o CLQG, solos o en combinación con ciertos hidratos de carbono, o modificados con aminoácidos no identificados o con aminoácidos no proteicos tales como \beta-alanina, ácido \gamma-aminobutírico, ornitina, etc. poseen una actividad inmunomoduladora (NMPF).

Sin pretender depender de una teoría, la actividad del NMPF-K y del NMPF-Kb se puede describir como el mantenimiento de un equilibrio Th1/Th2, en donde el NMPF-K actúa uniéndose a un receptor adecuado pero sin activarlo, mientras que el NMPF-Kb se une a dicho receptor y lo activa para regular el equilibrio Th1/Th2 de forma beneficiosa. El NMPF-K y el NMPF-Kb actúan ambos como ligandos de la misma molécula receptora o, como mínimo, de moléculas receptoras similares o semejantes desde el punto de vista conformacional.

Por ejemplo, nuestros resultados muestran que NMPF-Kb inhibe la septicemia o el choque séptico causado por una endotoxina o una exotoxina. El NMPF-Kb como el dado a conocer por la invención inhibe o contrarresta una enfermedad autoinmune mediada por un mecanismo inmune, las enfermedades inflamatorias crónicas y también las enfermedades inflamatorias agudas.

Un inmunorregulador como el dado a conocer en la presente invención (NMPF) tiene efectos reguladores inmunes. En particular, el NMPF puede inhibir o regular las enfermedades autoinmunes e inflamatorias agudas y crónicas. El TNF y el IFN-gamma están implicados en la patogenia en la enfermedad inflamatoria aguda, como septicemia o choque séptico, y también en las enfermedades autoinmunes y las enfermedades inflamatorias crónicas. Como el NMPF puede regular las subpoblaciones de linfocitos T e inhibir el TNF y el IFN-gamma, el NMPF se puede utilizar para tratar, suprimir o prevenir los trastornos mediados por mecanismos inmunes como septicemia o choque séptico (enfermedad inflamatoria aguda). Por ejemplo, nuestros resultados muestran que NMPF-Kb inhibe la septicemia o el choque séptico causado por una endotoxina o una exotoxina. El NMPF-Kb como el dado a conocer por la invención inhibe o contrarresta las enfermedades inflamatorias.

Así pues, la invención da a conocer la utilización de un inmunorregulador, según la invención, para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune, comprendiendo dicho trastorno mediado por un mecanismo inmune la inflamación aguda, tal como el choque séptico o anafiláctico o el rechazo agudo o hiperagudo de un trasplante. En especial, se da a conocer una utilización en la que dicho tratamiento comprende la regulación de la inmunidad innata y/o los índices relativos y/o de la actividad de citocinas de subpoblaciones de células linfocitarias, dendríticas o presentadoras de antígenos en un paciente tratado, en particular en la que dichas subpoblaciones comprenden células Th1, Th2, o DC1 o DC2. Así pues, la invención da a conocer un procedimiento para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune que consiste en someter a un animal a tratamiento con, como mínimo, un inmunorregulador según la invención, en donde dicho trastorno comprende, en particular, la septicemia.

Se han realizado descripciones de casos aislados y de estudios de laboratorio que indicaban previamente que la hCG podría tener un efecto frente al sarcoma de Kaposi y frente al virus de la inmunodeficiencia humana (Treatment Issues, Julio/Agosto 1995, página 15. Se ha observado que los preparados de hCG tienen un efecto apoptótico directo (citotóxico) sobre el sarcoma de Kaposi (KS) in vitro y en pacientes y en ratones inmunodeficientes, y que tiene un efecto prohematopoyético en los pacientes inmunodeficientes (Lunardi-Iskandar y otros, Nature 375, 64-68; Gill y otros, New. Eng. J. Med. 335, 1261-1269, 1996; patente de los EE.UU. 5677275) y un efecto antivírico inhibidor directo sobre el virus de la inmunodeficiencia humana y de los simios (VIH y VIS) (Lunardi-Iskandar y otros, Nature Med. 4, 428-434, 1998, patente de los EE.UU. 5700781). Dichos efectos citotóxicos y antivíricos también se han atribuido a un factor mediado por hCG (HAF) desconocido que se encuentra en los preparados de hCG de grado clínico. No obstante, los preparados comerciales de hCG (como CG-10, Steris Profasi, Pregnyl, Choragon, Serono Profasi, APL), tienen varios efectos. El análisis de varios de ellos (AIDS, 11:1333-1340, 1997), por ejemplo, muestra que únicamente algunos (como CG-10, Steris Profasi) pueden eliminar el KS, mientras que otros (Pregnyl, Choragon, Serono Profasi) no pueden. En segundo lugar, las subunidades recombinantes de (\alpha o \beta) hCG tenían actividad eliminadora, pero la hCH recombinante intacta, no. También se encontró que el efecto eliminador también se apreciaba con linfocitos. El tratamiento del KS se ha dirigido recientemente a la utilización de beta-hCG para conseguir su efecto antitumoral (Eur. J. Med Res. 21: 155-158, 1997) y se ha descrito que el fragmento del núcleo beta aislado a partir de la orina tuvo la mayor actividad apoptótica sobre las células del KS (AIDS, 11:, 713-721, 1997).

Recientemente, Gallo y otros describieron la actividad antisarcoma de Kaposi, anti-VIH, anti-VIS y distintos efectos hematopoyéticos de los preparados crudos de grado clínico de gonadotropina coriónica humana (hCG) (Lunardi-Iskandar y otros 1995, Gill y otros 1996, Lunardi-Iskandar y otros 1998). Por el contrario, en otros estudios previos también se reivindicaba que la actividad antitumoral y antivírica de un preparado de hCG no se debe al heterodímero de hCG nativa, que incluye sus subunidades purificadas o su principal producto de degradación, el núcleo \beta; en su lugar, la estructura activa reside en un factor mediado por hCG (HAF) que no ha sido identificado hasta el momento. Sea cual sea el verdadero factor, estos factores no identificados en varios preparados de hCG tienen actividad antitumoral a través de la inducción selectiva de la apoptosis, además de los efectos citotóxicos directos sobre las células tumorales. Además, se ha propuesto que su actividad antitumoral podría no deberse a una respuesta mediada por un mecanismo inmune, ya que no se encontró la infiltración tumoral por células mononucleadas.

Además, el efecto prohematopoyético descrito de la hCG de grado clínico se observó en los estudios clínicos efectuados en personas infectadas por el VIH (Lunardi-Iskandar y otros 1998), lo que indica que el efecto hematopoyético es indirecto y que se debe al rescate de los linfocitos CD4+ que, de lo contrario, serían eliminados por el VIH, mediante la actividad anti-VIH de la hCG.

La descripción da a conocer un inmunorregulador o una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune que se puede obtener a partir de un preparado de hCG o una fracción derivada del mismo. Los efectos de dicho inmunorregulador incluyen el efecto de estimulación sobre las poblaciones de linfocitos (como la encontrada en los linfocitos periféricos, los timocitos o los esplenocitos), en lugar de sus efectos citotóxicos o antivíricos. La descripción da a conocer un procedimiento para el tratamiento de un trastorno mediado por un mecanismo inmune que consiste en someter a un animal a tratamiento con, como mínimo, un inmunorregulador que se puede obtener a partir de un mamífero gestante. Dicho tratamiento puede ser directo, por ejemplo el tratamiento puede consistir en proporcionar a dicho individuo una composición farmacéutica, como un preparado con hCG o PMSG, que consiste en un inmunorregulador como el proporcionado por la invención. También es posible proporcionar dicha composición farmacéutica con una fracción o fracciones derivadas de un animal gestante como, por ejemplo, una muestra de orina, suero o placenta (ya sea de origen materno o fetal) u otro tipo de tejido o célula y la preparación de dicho inmunorregulador que consiste en dicho principio activo obtenido a partir de dicha orina o suero o tejido o célula por las técnicas de fraccionamiento conocidas en este campo (por ejemplo, por cromatografía por permeabilidad en gel) y el estudio de su principio activo mediante la estimulación de un ratón NOD o de sus esplenocitos como se describe. En particular, dicho preparado o componente deriva preferentemente de un animal gestante, ya que el embrión tiene que sobrevivir a un conflicto inmunológico potencialmente mortal con su madre: el desarrollo como un tejido esencialmente extraño dentro del útero sin desencadenar una respuesta inmune hostil. Por lo tanto, para prevenir este rechazo de "aloinjerto" debe suprimirse la interacción inmunológica entre la madre y el feto, ya sea por ejemplo a través de una ausencia de presentación de los antígenos fetales a los linfocitos maternos o mediante la "supresión" funcional de los linfocitos maternos. Si los antígenos fetales se presentan, las respuestas inmunes maternas se desviarían hacia el lado menos dañino, el de la respuesta de células T 2 colaboradoras (Th2) mediada por anticuerpos. Esto sugeriría que una mujer gestante es sensible a sufrir una infección incontrolable, lo que no es el caso. En las mujeres gestantes se mantiene su nivel de resistencia a la infección, o incluso aumenta. Además, mientras que dichas mujeres normalmente son más sensibles a las enfermedades inmunes que los varones, especialmente frente a las enfermedades autoinmunes, durante el embarazo son más resistentes a estas últimas.

Según la invención, dicho trastorno comprende la inflamación aguda. En una realización preferente, dicho trastorno consiste en septicemia o choque séptico. La invención proporciona un procedimiento de tratamiento para un animal, siendo preferentemente dicho animal un ser humano.

En una realización específica, un procedimiento descrito del presente documento consiste además en regular los índices relativos y la actividad de citocinas o la expresión de las citocinas o la expresión de un marcador de las subpoblaciones de células linfocitarias, dendríticas o presentadoras de antígenos en dicho animal, como las subpoblaciones que consisten en linfocitos Th1 o Th2, o linfocitos Th3 o Th8, o células DC1 o DC2 u otras poblaciones de células T efectoras o reguladoras.

La invención da a conocer la utilización de un inmunorregulador, que preferentemente se puede obtener a partir de un mamífero gestante, para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria aguda (tal como el choque séptico o anafiláctico o el rechazo agudo o hiperagudo de un trasplante).

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Ejemplo I Materiales y procedimientos

Purificación de NMPF: para analizar el NMPF obtenido de preparados de hCG comerciales, utilizamos un sistema Shimadzu de HPLC equipado con una columna Alltech de macroesferas para exclusión por tamaño (GPC) de 60 \ring{A}, 100 \ring{A} o 300 \ring{A} (250 x 4,6 mm y 300 x 7,5 mm). Los intervalos de separación de las columnas fueron de 28.000 - 250, 2500 - 350,00 y 1.200.000 - 7.500 Dalton, respectivamente. Se utilizaron patrones externos para el peso molecular para calibrar las posiciones de elución de la columna. Los marcadores utilizados fueron: aprotinina (6.500 Da), citocromo C (12.400), anhidrasa carbónica (29.000), albúmina (66.000) y dextrano azul (2.000.000).

Para analizar el NMPF, se utilizaron tres preparados de hCG distintos: NMPF-PG (Pregnyl; Organon; OSS, Países Bajos), NMPF-A (APL; Weyth Ayerst; Filadelfia, EE.UU.) y NMPF-PR (Profasi; Serono, Roma, Italia). Para la ejecución, se utilizó el tampón de bicarbonato amónico 50 mM con etanol (5%, vol/vol). El volumen de carga de la muestra fue de 10-50 ml para la columna de 250 x 4,6 mm y de 50-200 ml para la columna de 300 x 7,5 mm. El caudal para las columnas de 250 x 4,6 mm y 300 x 7,5 mm fue de 0,5 ml/min durante 45 min y de 1-2 ml/min durante 45 min, respectivamente.

La orina del primer trimestre del embarazo (2 litros) se recogió en un frasco de una voluntaria sana y se refrigeró hasta su envío al laboratorio antes de 2 días. Tras su entrega se añadió 1 gramo por litro de azida sódica y el pH se ajustó a 7,2-7,4 con hidróxido sódico y se dejó sedimentar durante 1 hora (h) a temperatura ambiente (RT). Aproximadamente el 75% del sobrenadante se decantó y el resto cercano al precipitado se centrifugó (10 min a 25.000 rpm a 40ºC) para eliminar el sedimento, y se añadió al resto del sobrenadante. El sobrenadante se filtró a través de un equipo de filtración transversal de 0,45 mm Minitan (Millipore). A continuación, el filtrado (2 litros) se concentró en un equipo de ultrafiltración Amicon dotado con una membrana YM Diopore con un valor umbral de 10 kDa. El volumen final (250 ml) se dializó frente a 2 cambios de 10 litros de agua Milli Q. A continuación, la muestra se concentró aún más con un valor umbral de 10 kDa en un equipo Amicon para ultrafiltración hasta un volumen final de 3 ml.

Ratones usados en los experimentos en septicemia o choque séptico: En todos los experimentos se usaron ratones hembra BALB/c entre 8 y 12 semanas de edad. Los animales recibieron el alimento en nuestras instalaciones bajo condiciones específicas libres de patógenos de acuerdo a los protocolos descritos en el Informe del grupo de trabajo de las European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) sobre Salud Animal (Laboratory Animals 28: 1-24, 1994).

Protocolos de inyección: Para el modelo de endotoxina, los ratones BALB/c recibieron inyecciones por vía i.p. de 150-300 \mug de LPS (E. coli 026:: B6; Difco Lab., Detroit, MI, EE.UU.). Los grupos de control recibieron tratamiento únicamente con PBS por vía i.p. Para evaluar el efecto del NMPF, los ratones BALB/c recibieron tratamiento con una dosis optimizada de 700 UI de distintos preparados de hCG, de fracciones derivadas de las mismas (10-50 mg), o de orina del primer trimestre del embarazo (NMPF-U) durante 3 días y después se les inyectó LPS por vía i.p.

Con el fin de determinar si el NMPF inhibió del choque, incluso después de la inducción del choque, también administramos un tratamiento con NMPF por via i.p. a ratones BALB/c transcurridas 3, 12, 24 y 36 h desde de la inyección de LPS. En diferentes momentos, se registraron las puntuaciones semicuantitativas de la enfermedad, así como las tasas de supervivencia.

Mediciones semicuantitativas de la enfermedad: se puntuaron los niveles de gravedad de la enfermedad en los ratones utilizando la siguiente escala de medición:

1.

Pelaje difuso, pero sin diferencias detectables en la conducta con respecto a los ratones normales.

2.

Pelaje difuso, reflejo de acurrucamiento, responden a estímulos (como al golpear sobre la jaula), igual de activo cuando se manipula a un ratón sano.

3.

Respuesta más lenta al golpear sobre la jaula, pasivo o dócil durante la manipulación pero aún curioso cuando está solo en un entorno nuevo.

4.

Falta de curiosidad, escasa o nula respuesta ante los estímulos; bastante inmóvil.

5.

Respiración con dificultades, incapacidad o lentitud para ponerse derecho por sí solo después de enrollarlo sobre la espalda (moribundo, sacrificado).

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Tratamiento con el péptido b-hCG y anti-MIF: la mayoría de los metabolitos urinarios de hCG son una forma cortada de b-hCG. Estas formas de b-hCG presentan cortes de los enlaces peptídicos dentro de la subunidad b. b48 (VLPALPQVVC) es uno de estos péptidos, cuya asociación con un metabolito urinario natural de hCG ha quedado demostrada. Con el fin de evaluar el efecto de este péptido sobre el choque séptico, inyectamos LPS a ratones BALB/c y los tratamos 2 h más tarde por vía i.p. con el péptido b48 (100 mg). Para comprobar si los posibles productos de degradación también tienen efecto sobre el choque séptico, procedimos a incubar el péptido b48 a 37ºC durante tres horas antes de analizar el péptido en un modelo de choque séptico en ratones BALB/c.

Proliferación estimulada con LPS de los esplenocitos in vitro/ex vivo: Tras 48 h de inducción de choque séptico en ratones BALB/c mediante una inyección de LPS en dosis altas, se recuperaron los esplenocitos (1 x 10^{6} células/ml) y se reestimularon in vitro con LPS (10 U/ml) en placas de 96 pocillos (fondo redondo). Transcurridas 24 horas desde el cultivo, se midió la proliferación estimulada con LPS de los esplenocitos mediante la incorporación de [^{3}H]TdR durante las últimas 16 horas de cultivo. En otros experimentos, se aislaron esplenocitos procedentes de ratones BALB/c no tratados y se estimularon in vitro (1 x 10^{6} células/ml) con LPS en presencia o en ausencia de distintas fuentes de NMPF (37,5-600 UI/ml) (Pregnyl, Organon; APL, Wyeth Ayerst; Profasi, Serono), fracciones de NMPF (10-20 mg/ml), péptido b-48 o sus productos de degradación, anti-MIF o combinaciones de estos productos, cada uno de ellos a 10
mg/ml. Transcurridas 24 horas desde el cultivo, se midió la proliferación estimulada con LPS de los esplenocitos.

Resultados

Purificación de NMPF: se aplicaron muestras de NMPF procedentes de diversas fuentes (Pregnyl, APL, Profasi, orina del embarazo) en la columna Macroshere GPC 300 \ring{A} y se eluyó con bicarbonato amónico. Se fraccionaron tres áreas seleccionadas, NMPF-1 que se eluye aparentemente con un peso molecular de >25 kDa, NMPF-2 que se eluye aparentemente con un peso molecular de entre 25 kDa y 6 kDa, y NMPF-3 que se eluye aparentemente con un peso molecular de <6 kDa (figura 1). Todas estas fracciones se liofilizaron y se estudiaron para determinar la actividad anti-choque (como se muestra en otra parte del presente documento). La fracción de menor peso molecular (NMPF-3) que se eluye tras el volumen de la columna se fraccionó adicionalmente en la columna Macrosphere GPC 60 \ring{A} (figura 2.). Todas las fracciones se liofilizaron y también se estudiaron para determinar la actividad anti-choque.

Tratamiento con NMPF en el choque séptico inducido con LPS: Para determinar el efecto del tratamiento con LPS en dosis altas, los ratones BALB/c tratados con NMPF (n=6) recibieron una inyección intraperitoneal de LPS (150 mg/kg) y la supervivencia se valoró diariamente durante 5 días. Los ratones BALB/c tratados con PBS sucumbieron al choque a partir del día 1 después de la inyección de LPS en dosis altas, sobreviviendo menos del 10% de los ratones vivos en el día 5 (Figura 3). Por el contrario, el 100% de los ratones tratados con NMPF de Pregnyl, o con sus fracciones NMPF-1 o NMPF-3 obtenidas con una columna de GPC de 300 \ring{A}, seguía vivo en el día 5 (P<0,001) (Figura 3), mientras que en los grupos de ratones tratados con NMPF-2 de Pregnyl o con dexametasona (datos no mostrados) se alcanzó una supervivencia del 25% aproximadamente (Figura 3). No todos los preparados de hCG comerciales presentaron actividad del NMPF; por ejemplo, el NMPF de Profasi únicamente mostró una actividad anti-choque parcial (supervivencia del 40% próximamente). Además, se observó variabilidad en la actividad del NMPF entre los distintos lotes de la misma fuente, así como variabilidad de la actividad del mismo lote con el tiempo. El tratamiento de ratones BALB/c con APL antes o después de la inducción del choque mostró, en una serie de experimentos, la aceleración del choque y una muerte precoz.

Con el fin de determinar si existen factores en el preparado de hCG que también aceleren el choque e inhiban o contrarresten la actividad del NMPF, llevamos a cabo un fraccionamiento adicional del NMPF-3 de un lote activo previamente analizado (que presentaba actividad anti-choque) y de un lote no activo obtenido de Pregnyl en una columna GPC 60 \ring{A}. Se fraccionaron tres áreas seleccionadas, NMPF-3.1 que se eluye aparentemente con un peso molecular de >2000 Da, NMPF-3.2 que se eluye aparentemente con un peso molecular de entre 2000 y 300 Da, y NMPF-3.3 que se eluye aparentemente con un peso molecular menor que 300 Da (figura 2). Todas las fracciones se estudiaron para determinar la actividad anti-choque.

Los resultados de estos experimentos revelaron que la actividad anti-choque en un lote activo previamente analizado residía en una fracción NMPF-3.2, mientras que una fracción NMPF-3.3 obtenida a partir de lotes tanto (activos como no activos) provocó la aceleración del choque (figura 4).

Con el fin de determinar si NMPF-3.3 inhibe la actividad anti-choque de NMPF-3.2, añadimos NMPF-3.3 a NMPF-3.2 en una proporción de 10:1 (100:10 mg) e inyectamos la mezcla por vía i.p. en ratones dos horas después de la inyección de LPS (n=6). Los datos obtenidos en estos experimentos demostraron que en todos los ratones tratados únicamente con la fracción NMPF-3.2 se inhibió el choque séptico y los animales presentaron puntuaciones de la enfermedad inferiores a 2 (figura 4), mientras que esta actividad anti-choque de la fracción NMPF-3.2 se inhibió con NMPF-3.3. El tratamiento únicamente con NMPF-3.3 aceleró el choque y los ratones tratados murieron antes que los ratones tratados con PBS (figura 4). Se obtuvo la misma tendencia de resultados en experimentos en los que se mezclaron lotes activos y no activos obtenidos de Pregnyl y se inyectaron en ratones BALB/c tras la inducción de un choque séptico (datos no mostrados).

Proporción entre NMPF-3.2 y NMPF-3.3: seguidamente, purificamos NMPF-3.2 y NMPF-3.3 en una columna GPC 60 \ring{A} a partir de lotes activos y no activos procedentes de Pregnyl y de orina del primer trimestre del embarazo y determinamos la proporción. Encontramos que la orina del primer trimestre del embarazo con actividad anti-choque presentó una proporción de aproximadamente 1:2,2 (NMPF-3.2: NMPF-3.3) (figura 5) y que el lote no activo de Pregnyl presentó una proporción de aproximadamente 1:3,4 (figura 6), mientras que el lote activo de Pregnyl presentó una proporción de aproximadamente 1:1 (figura 7).

Proliferación estimulada con LPS de los esplenocitos ex vivo: transcurridas 48 horas desde la inducción del choque con LPS, se aislaron esplenocitos de ratones tratados con PBS y con NMPF (de ratones tratados o bien con Pregnyl activo, con las fracciones NMPF-3.2 o NMPF-3.3 derivadas del mismo, o con un preparado de APL) y se reestimularon con LPS. Transcurridas 24 horas desde el cultivo, se midió la proliferación estimulada con LPS de los esplenocitos. La reducción de la proliferación inducida por LPS se observó después del cultivo de los esplenocitos procedentes de ratones BALB/c tratados con NMPF (lote activo de Pregnyl) y con la fracción NMPF-3.2 derivada del mismo (1600 frente a 1350 cpm) en comparación con ratones tratados con PBS (3500 cpm), mientras que el tratamiento con NMPF (APL) o NMPF-3.3 incrementó la proliferación estimulada por LPS (6000 frente a 7200 cpm). Se obtuvieron resultados comparables al estimular in vitro esplenocitos de ratones BALB/c no tratados con LPS en presencia de las adicciones mencionadas anteriormente (datos no mostrados).

Tratamiento in vitro con NMPF procedentes de diferentes fuentes, con péptido b-48, con péptido b-48 desnaturalizado y con anti-MIF: las principales características de la preeclampsia son semejantes a las del choque séptico. Por consiguiente, planteamos la hipótesis de que también podían existir factores de NMPF (IR) implicados en la preeclampsia y que causasen también un empeoramiento del choque séptico o de la septicemia. Anteriormente hemos mostrado que NMPF-3.3 es una de dichas fracciones que acelera el choque séptico e incrementa la proliferación inducida por LPS de los esplenocitos in vitro/ex vivo, lo que está correlacionado con un aumento de la gravedad de la enfermedad. En la orina de pacientes preeclámticas, se observan niveles elevados de subunidades b de hCG cortadas. Por consiguiente, también analizamos si estas subunidades cortadas provocaron un empeoramiento del choque séptico, asemejándose de ese modo a la fracción NMPF-3.3. Además, MIF es un importante mediador en la endotoxemia letal y en el choque tóxico estafilocócico, de modo que también comparamos los efectos del péptido b-48 y del NMPF sobre la proliferación con anti-MIF y con MIF.

Estos experimentos revelaron que anti-MIF muestra una tendencia a reducir la proliferación inducida por LPS, de forma similar a un lote de Pregnyl analizado previamente, que muestra actividad anti-choque (NMPF-PG+) (figura 8). Además, anti-MIF y NMPF-PG+ actúan juntos de forma sinérgica y reducen la proliferación (figure 8). NMPF de APL (NMPF-A), el lote no activo de Pregnyl (NMPF-PG-; sin actividad anti-choque) y el péptido b-48 (NMPF-K) incrementaron la proliferación inducida por LPS en comparación con LPS solo (figura 8-12). Por otra parte, NMPF-PG+ o el péptido b-48 desnaturalizado (NMPF-Kb) inhibieron y redujeron la proliferación inducida por LPS al menos hasta el nivel del tratamiento anti-MIF solo (figura 8-12). El tratamiento in vivo de ratones BALB/c con NMPF-PG-, NMPF-K o NMPF-A tras la inducción de un choque séptico aceleró la gravedad de la enfermedad (a t=48 h 0-25% de tasa de supervivencia) en comparación con los ratones tratados con PBS (a t=72 h 15% de tasa de supervivencia), mientras que el choque séptico en ratones BALB/c se inhibió completamente mediante NMPF-PG+ o NMPF-Kb.

El análisis del preparado de hCG (Pregnyl) y de la orina del embarazo ha demostrado que el preparado de hCG y la orina del embarazo que presenta actividad anti-choque contienen fracciones NMPF-3.2 y NMPF-3.3 en una proporción de aproximadamente 1:2 o superior, mientras que los preparados de hCG sin actividad anti-choque o que empeoran el choque séptico presentan una proporción de NMPF-3.2 y NMPF-3.3 de 1:3 o inferior. Esto también explica por qué no todos los preparados de hCG comerciales poseen actividad anti-choque. Además, hemos demostrado que un preparado de hCG que presenta una elevada proporción de NMPF-3.3:NMPF-3.2 y, por tanto, no posee actividad anti-choque, mezclado con un preparado de hCG activo, podría obtener actividad anti-choque. Así pues, la proporción entre los diferentes factores NMPF o fracciones, tales como NMPF-3.2 y NMPF-3.3, se puede utilizar como marcador diagnóstico no sólo para la predicción de un embarazo satisfactorio, sino también para distintas inmunopatologías, tales como la preeclampsia, la septicemia o el choque séptico, etc. Además, en los embarazos anómalos, como es el caso de la preeclampsia, también se pueden utilizar los factores NMPF o las fracciones de NMPF (p.ej. NMPF-3.2) como tratamiento. Nuestros experimentos también han mostrado que NMPF (NMPF-3.2) inhibió el choque séptico incluso 30 h después de la inducción del choque, lo que demuestra que NMPF no sólo inhibe a los mediadores precoces de la letalidad por endotoxinas, tales como TNF-alfa, IL-1b, MIF, sino que también inhibe a los mediadores tardíos, tales como la recién caracterizada proteína del grupo 1 de alta movilidad (HMG-1) (Science 285, 248-251).

hCG es un miembro de la superfamilia estructural de los factores de crecimiento con nudo de cisteína tales como NGF, PDGF-B y TGF-beta y un miembro de la familia de hormonas de glucoproteína, que también incluye LH, FSH y TSH. Cada uno de ellos consta de dos subunidades proteínicas asociadas de forma no covalente, una cadena alfa de 15 kD común y una cadena beta de 23 kD específica de cada hormona (Annu. Rev. Biochem. 50, 465-495). El hCG es sintetizado por los trofoblastos placentarios durante el embarazo normal, y en la enfermedad trofoblástica gestacional. Asimismo, se produce en cantidades mucho menores por la pituitaria (Endocrinology 137, 1402-1411) tanto en mujeres premenopáusicas como posmenopáusicas y en hombres (Trends in Endocrinology and Metabolism 1, 418-421), en muchos tumores malignos no gestacionales y en otros tejidos. El hCG posee una estructura compleja como una familia de isoformas con diferencias estructurales, inmunológicas y biológicas. Se desconoce con certeza la base química de esta heterogeneidad, pero se han propuesto como posibles causas las diferencias en la composición de aminoácidos, en los residuos de hidratos de carbono o ambos. Más recientemente, también se ha observado que la oxidación de residuos específicos de metionina también puede ser la responsable. Se han observado diferentes formas de hCG, subunidades alfa y beta, sus fragmentos cortados, fragmentos de núcleo beta y múltiples isoformas de hCG en diferentes tejidos y fluidos corporales (Journal of Endocrinology 161, 99-106; Endocrinology 129, 1541-1550; Obstet. Gynecol. 77, 53-59; Journal of Biochemistry 107, 858-862; Obstet. Gynecol. 80, 223-228; Endocrinology 133, 985-989; 129, 1551-1558; 130, 2052-2058; Journal of Endocrinology 135, 175-188; 139, 519-532; Molecular and Cellular Endocrinology 125, 93-131).

Dado que todos los preparados de hCG comerciales se derivan de orina del embarazo y contienen distintos productos de descomposición de hCG, hemos especulado con la posibilidad de que estos productos puedan presentar actividad del NMPF. Los productos de descomposición de hCG más conocidos son el núcleo beta de hCG, un corte del enlace peptídico en la subunidad beta entre los residuos 44-45, 46-47 y 47-48. b48 (NMPF-K) se encuentran en aproximadamente el 10-20% de las moléculas de la orina del embarazo y está asociado con un metabolito urinario natural de hCG. Nuestros experimentos han demostrado que NMPF-K acelera el choque séptico (como MIF) y la proliferación inducida por LPS de los esplenocitos, sólo o en combinación con un preparado de hCG no activo. Este efecto se puede inhibir con anti-MIF, con un preparado de hCG activo, con NMPF-3.2 y con el péptido b48 desnaturalizado (NMPF-Kb). Esto demuestra que la actividad de NMPF-K se asemeja a NMPF-3.3 y que la actividad de NMPF-Kb se asemeja a NMPF-3.2. Además, también existen otros cortes de enlaces peptídicos en hCG y sus subunidades, así como heterogeneidad del fragmento del núcleo beta. Por ejemplo, el corte del enlace b45, que se observa principalmente en el preparado de hCG y en la orina, se deriva posiblemente de la acción de proteasas bacterianas. Asimismo, Medeiros y otros demostraron que la separación mediante HPLC del núcleo beta en sus formas reducida y S-carboximetilada presentó tres péptidos, pero sólo dos de ellos pudieron ser secuenciados y se demostró que eran los péptidos b6-40 y b55-92 de bhCG previamente documentados, mientras que el tercer pico no dio lugar a ninguna secuencia clara, debido a la baja señal y a varios aminoácidos no identificados. Hemos mostrado que los productos de degradación de NMPF-K comparten actividad con NMPF-3.2. Este péptido NMPF-K se encuentra entre dos fragmentos del núcleo beta (b6-40 y b55-92) y se deriva parcialmente del fragmento del núcleo beta b55-92. Es posible que también existan otros productos de corte simple y/o doble de los fragmentos del núcleo beta o de péptidos del núcleo beta aún no identificados (dado que Medeiros y otros mostraron una fracción del núcleo beta con aminoácidos no identificados) que sean responsables de la actividad del NMPF en preparados de hCG y en orina del embarazo. Los productos de descomposición del péptido b48 con aminoácidos adicionales no identificados del núcleo beta y/o con glucosilación adicional posee, entre otras, actividad antidiabética y antiinflamatoria crónica.

En resumen, la invención da a conocer la utilización de un inmunorregulador (péptido inmunorregulador) que se puede obtener o sintetizar a partir de un metabolito urinario de hCG, en particular a partir de formas (cortadas) de beta-hCG, u homólogos peptídicos (sintéticos) o análogos del mismo. Estas formas de beta-hCG presentan cortes de los enlaces peptídicos dentro de la subunidad beta (Birken y otros, Endocrinology 133:1390-1397, 1993), y en el presente documento se da a conocer que los productos de degradación, en especial los derivados de las regiones beta-44 a beta-49, aportan efectos inmunorreguladores significativos, utilizando los sistemas analíticos en modelos con animales descritos.

Por ejemplo, según el presente documento se ha descubierto en experimentos animales, según lo descrito a continuación, que los péptidos obtenibles a partir de hCG reaccionan en un modelo de choque séptico mostrando efectos inmunorreguladores intensos.

Ejemplo II Materiales y procedimientos

Permeabilidad en gel: procedimos a fraccionar un preparado de hCG comercial (c-hCG, Pregnyl, Organon, Oss, Países Bajos) según se describe a continuación: utilizamos un sistema Shimadzu de HPLC equipado con una columna Alltech de macroesferas para exclusión por tamaño (GPC) de 60 \ring{A} (4,6 mm DI x 250 mm L) en tampón de bicarbonato amónico 50 mM. El rango de separación de esta columna fue de 28.000 - 250 Dalton. El volumen de carga de la muestra (20.000 UI hCG/ml) fue de 10-50 ml. El caudal se ajustó a 0,3 ml/min durante 25 minutos. También se utilizaron patrones externos para el peso molecular, para calibrar las posiciones de elución de la columna. Los marcadores utilizados fueron: aprotinina (6.500 Da), citocromo C (12.400) y anhidrasa carbónica (29.000). Además, la orina concentrada (véase purificación de la orina) obtenida con el sistema Pelicon se filtró a través de un filtro de 0,45 mm y se analizaron 40.000 UI de c-hCG (Pregnyl) disueltas en bicarbonato amónico 50 mM en un sistema Shimadzu de HPLC equipado con una columna desalinizada Superdex G25 (30 mm DI x 990 mm L) en tampón de bicarbonato amónico 50 mM suplementado con metanol al 5%. El rango de separación de la columna fue de 5000 - 1000 Dalton. El volumen de carga de la muestra fue de 7-10 ml. El caudal se ajustó a 3 ml/min durante 250 minutos. También se utilizaron patrones externos para el peso molecular, para calibrar las posiciones de elución de la columna. Se recogieron fracciones de 100 mL, se liofilizaron y se estudiaron para determinar la actividad anti-choque.

Purificación de la orina: la orina del primer trimestre del embarazo (2 litros) se recogió en un frasco de una voluntaria sana y se refrigeró hasta su envío al laboratorio antes de 2 días. Tras su entrega se añadió 1 gramo por litro de azida sódica y el pH se ajustó a 7,2-7,4 con hidróxido sódico y se dejó sedimentar durante 1 hora (h) a temperatura ambiente (RT). Aproximadamente el 75% del sobrenadante se decantó y el resto cercano al precipitado se centrifugó (10 min a 25000 rpm a 4ºC) para eliminar el sedimento, y se añadió al resto del sobrenadante. El sobrenadante (aproximadamente 2 litros) se concentró en un sistema de ultrafiltración Pellicon equipado con un filtro Pellicon XL (Millipore, Nº ref. PXC010C50) con un valor umbral de 5 kDa. El volumen final fue de 150 ml. Muestras de orina de mujeres sanas no embarazadas y de mujeres con una enfermedad autoinmune (SLE, Sjogren) en su primer trimestre del embarazo se trataron con el mismo procedimiento descrito anteriormente.

Modelo de choque por endotoxinas: para el modelo de endotoxina, los ratones BALB/c recibieron inyecciones por vía i.p. de 8-9 mg/kg de LPS (E. coli 026:: B6; Difco Lab., Detroit, MI, EE.UU.). Los grupos de control (PBS) recibieron tratamiento únicamente con PBS por vía i.p. Para evaluar el efecto del NMPF, los ratones BALB/c recibieron tratamiento con una dosis de 300-700 UI de distintos preparados de hCG (PG23; Pregnyl lote nº 235863, PG25; Pregnyl lote nº 255957), con péptidos (5 mg/kg) o con diferentes fracciones (0,5-1 mg/kg) transcurridas dos horas desde la inyección de LPS.

Proliferación inducida por LPS: con el fin de determinar si el tratamiento con distintas fracciones, péptidos o hCG comercial (c-hCG) de ratones BALB/c a los que se les había inyectado LPS consiguió alterar la respuesta proliferativa de los esplenocitos, también aislamos los esplenocitos de los experimentos de choque con LPS mencionados anteriormente. Los esplenocitos totales (1 x 10^{6} células/ml) procedentes de ratones BALB/c tratados se reestimularon en RPMI+ suplementado con FBS al 10% con distintas concentraciones de LPS (5, 10, 20 mcg/ml) en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Las placas se incubaron a 37ºC en 5% de CO_{2} en aire durante 24 h. La proliferación se midió por la incorporación de [^{3}H]TdR añadiendo 0,5 mCI/pocillo durante las últimas 12 horas de cultivo.

Citometría de flujo: en algunos experimentos, tras 48 horas de inducción del choque séptico, se aislaron los esplenocitos para realizar un análisis mediante citometría de flujo. Los marcadores de superficie celular analizados en estos experimentos fueron CD19, CD80, CD40, B220, CD4, F4/80, NK1.1, DX-5 y CD25. Para el análisis de estos marcadores, los anticuerpos monoclonales (mABs) conjugados con FITC o PE se compraron a BD PharMingen. Brevemente, se lavaron los esplenocitos (2x10^{5}) dos veces con tampón FACS y se incubaron con los anticuerpos monoclonales siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, se lavaron las células y se analizaron en un citómetro de flujo FACSort (Becton Dickinson). En función de sus características de dispersión frontal y dispersión lateral, las células vivas se controlaron y se analizaron.

ELISA de citocinas: el IFN-gamma se detectó usando anticuerpo monoclonal anti-IFN-gamma (XMG1.2) como el anticuerpo de captura y se reveló con anticuerpo monoclonal de rata anti-IFN-gamma de ratón conjugado y biotinilado (R46A2). Para la detección se utilizó el sustrato ABTS.

Las microplacas de fondo plano (96 pocillos, Falcon 3912, Microtest II Flexible Assay Plate, Becton Dickinson, Oxnard, USA) se recubrieron con anticuerpos de captura específicos de IFN-gamma (XMG1.2, 5 mg/ml) diluidos en PBS y se conservaron a 4ºC durante 18 horas. Después de recubrirlas, las placas se lavaron (PBS, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20) y se bloquearon con PBS suplementado con BSA al 1% a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado, las muestras y los patrones se añadieron y la incubación continuó, como mínimo, durante 4 horas a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron y se añadieron anticuerpos biotinilados de detección (R46A2, 1 mcg/ml) y se incubaron toda la noche a 4ºC. Después del lavado, se añadió estreptavidina peroxidasa (diluido 1/1500, Jackson Inmunoresearch, West Grove, PA, USA). Después de 1 hora las placas se lavaron y la reacción se visualizó usando ácido 2,2'-azino-bis-3-etilbenzo-tiazolina-6-sulfónico (ABTS, 1 mg/ml, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). La densidad óptica se midió a 414 nm, utilizando un Titertek Multiscan (Flow Labs, Redwood City, EE.UU.).

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Síntesis peptídica: los péptidos se prepararon mediante síntesis en fase sólida (Merrifield, 1963) utilizando la metodología basada en fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc)/tert-butilo (Atherton, 1985) con resina de cloruro de 2-clorotritilo (Barlos, 1991) como soporte sólido. La cadena lateral de glutamina se protegió mediante una función tritilo. Los péptidos se sintetizaron manualmente. Cada uno de los enlaces comprendió las siguientes etapas: (i) eliminación de la protección con Fmoc alfa-amino mediante piperidina en dimetilformamida (DMF) (ii) acoplamiento del aminoácido Fmoc (3 eq) con diisopropilcarbodiimida (DIC)/1-hidroxi-benzotriazola (HOBt) en DMF/N-metilformamida (NMP) (iii) protección de las demás funciones amino con anhídrido acético/diisopropiletilamina (DIEA) en DMF/NMP. Tras completar la síntesis, la resina del péptido se trató con una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA)/H_{2}O/triisopropilsilano (TIS) 95:2.5:2.5. Transcurridos 30 minutos, se añadió TIS hasta que se observó la decoloración. La solución se evaporó en vacío y el péptido se precipitó en dietiléter. Los péptidos crudos se disolvieron en agua (50-100 mg/ml) y se purificaron mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RPHPLC). Las condiciones de HPLC fueron: columna: Vydac TP21810C18 (10 x 250 mm); sistema de elución: sistema de gradiente de TFA al 0,1% en agua v/v (A) y TFA al 0,1% en acetonitrilo (ACN) v/v (B); caudal 6 ml/min; se detectó la absorbencia a 190-370 nm. Se utilizaron distintos sistemas de gradiente. Para los péptidos LQG y LQGV: 10 minutos de 100% de A seguidos de un gradiente lineal de 0-10% de B durante 50 minutos. Para los péptidos VLPALP y VLPALPQ: 5 minutos de 5% de B seguidos de un gradiente lineal de 1% de B/minuto. Las fracciones recogidas se concentraron hasta aproximadamente 5 ml mediante evaporación en película rotatoria a presión reducida a 40ºC. El TFA restante se intercambió frente a acetato mediante dos pasos de elución en una columna con una resina de intercambio aniónico (Merck II) en forma de acetato. El eluido se concentró y liofilizó en 28 horas.

Resultados

Permeación en gel de la orina y del preparado de hCG comercial: c-hCG (figura 16) y la orina del primer trimestre del embarazo se fraccionaron en un sistema de HPLC equipado con una columna GPC 60A. Se fraccionaron tres áreas seleccionadas, 60A-fracción 1 (60A-F1) que se eluye aparentemente con un peso molecular de >10 kDa, 60A-F2 que se eluye aparentemente con un peso molecular entre 10 kDa-1 kDa y 60A-F3 que se eluye aparentemente con un peso molecular <1 kDa. Estas fracciones se estudiaron posteriormente para determinar la actividad anti-choque.

Además, se analizaron en una columna Superdex G25 muestras de orina de mujeres sanas embarazadas en su primer trimestre del embarazo, muestras de orina de mujeres con una enfermedad autoinmune en su primer trimestre del embarazo y muestras de orina de mujeres sanas no embarazadas. Todas las fracciones de 100 ml también se estudiaron para determinar la actividad anti-choque. Las figuras 17 y 18 muestran los cromatogramas de c-hCG y de orina de mujeres sanas embarazadas en su primer trimestre del embarazo.

Curva de supervivencia: para determinar el efecto del tratamiento con LPS en dosis altas en ratones tratados con c-hCG y fracciones de orina, ratones BALB/c (n=6) recibieron una inyección intraperitoneal de LPS (8-9 mg/kg) y la supervivencia se valoró diariamente durante 5 días. En nuestra Patente anterior (WO9959617) y en esta solicitud de patente, hemos descrito que se fraccionaron en una columna GPC 60A tres áreas seleccionadas: 60A-F1 que se eluye aparentemente con un peso molecular de >10 kDa, 60A-F2 que se eluye aparentemente con un peso molecular entre 10 kDa-1 kDa y 60A-F3 que se eluye aparentemente con un peso molecular <1 kDa. Todas estas actividades se estudiaron para determinar la actividad anti-choque y todas ellas presentaron actividad anti-choque (presumiblemente, la actividad de menor peso molecular también se eluye junto con las fracciones de alto peso molecular). Los ratones BALB/c tratados con PBS sucumbieron al choque entre 1 y 2 días después de la inyección de LPS en dosis altas, sobreviviendo menos del 10% de los ratones vivos en el día 5. Por el contrario, el 100% de los ratones tratados con 60A-F1 y 60A-F3 seguían vivos el día 5 (p<0,001), mientras que los ratones tratados con 60A-F2 presentaron una supervivencia de tan solo alrededor del 70%. Dado que la fracción de menor peso molecular también presentó actividad anti-choque, procedimos a fraccionar en una columna Superdex G25 muestras de c-HCG, orina del primer trimestre del embarazo, orina de mujeres con una enfermedad autoinmune en su primer trimestre del embarazo y orina de mujeres
sanas no embarazadas. Todas las fracciones de 100 ml se estudiaron para determinar la actividad anti-choque.

Los ratones BALB/c tratados con PBS sucumbieron al choque entre 1 y 2 días después de la inyección de LPS en dosis altas, sobreviviendo menos del 10% de los ratones vivos en el día 5. Por el contrario, el 100% de los ratones tratados con c-hCG, con la fracción V de la orina del primer trimestre del embarazo de mujeres sanas o con la orina de mujeres con una enfermedad autoinmune en su primer trimestre de embarazo permanecieron vivos en el día 5 (P<0,001). No obstante, algunas fracciones que eluyeron antes (fracción II y IV) y después de la fracción (anti-choque) V (p.ej. fracción VI) aceleraron el choque y todos los ratones tratados murieron incluso mucho antes (en un plazo de 24 horas después de la inducción del choque séptico) que los ratones tratados con PBS. Además, la actividad anti-choque de las fracciones III y V quedó inhibida por la adición de la fracción II, IV o VI, como mínimo, en una proporción de 1:6. Esto se aplica también a las fracciones obtenidas de los preparados de hCG comerciales y a la orina del embarazo de mujeres sanas. Además, hemos observado que fue necesaria una cantidad mucho menor de las fracciones anti-choque procedentes de la orina de mujeres embarazadas con enfermedades autoinmunes para inhibir al choque séptico en ratones BALB/c. Estas mujeres también presentaron una mejora clínica en la enfermedad autoinmune durante el embarazo.

Cinética de la enfermedad: los signos visibles de la enfermedad eran evidentes en todos los animales de experimentación pero la cinética y, obviamente, la gravedad de la enfermedad eran significativamente diferentes: tras el tratamiento de los ratones BALB/c con LPS (endotoxina) y o bien con la fracción V de la orina del primer trimestre del embarazo procedente de mujeres sanas, o bien con la orina del primer trimestre del embarazo procedente de mujeres con una enfermedad autoinmune, o bien con el preparado de hCG comercial, los síntomas clínicos de los ratones BALB/c tratados con LPS no superaron el nivel de enfermedad 2. Además, estas fracciones lograron inhibir incluso los síntomas de choque y mortalidad cuando se administraron 32 horas después de la inyección de LPS.

Datos de los péptidos (NMPF): la siguiente tabla muestra los porcentajes de supervivencia de los ratones durante un período de 72 horas. Para el modelo de LPS (endotoxina), los ratones BALB/c recibieron inyecciones por vía i.p. de 8-9 mg/kg de LPS (E. coli 026:: B6; Difco Lab., Detroit, MI, EE.UU.). Los grupos de control (PBS) recibieron tratamiento únicamente con PBS por vía i.p. Los ratones BALB/c recibieron tratamiento con una dosis de 300-700 UI de distintos preparados de hCG (PG23; Pregnyl lote nº 235863, PG25; Pregnyl lote nº 255957) o con péptidos (5 mg/kg) transcurridas dos horas desde la inyección de LPS.

Estos experimentos demostraron (tabla 1) que los péptidos 4 y 6 inhibieron el choque por completo (todos los ratones presentaron, durante las primeras 24 horas, puntuaciones de enfermedad no superiores a 2; poco después se recuperaron por completo y presentaron puntuaciones de enfermedad de 0), mientras que los péptidos 2, 3 y 7 aceleraron el choque (todos los ratones presentaron, durante las primeras 24 horas, puntuaciones de enfermedad de 5 y la mayor parte de ellos murieron, mientras que los ratones de control tratados con LPS+PBS presentaron puntuaciones de enfermedad de 3-4- durante las primeras 24 horas y murieron transcurridas 48 horas, con puntuaciones de enfermedad de 5). Además, los péptidos 1, 5, 8, 9, 11, 12, 13 y 14 mostraron en varios experimentos distintos una variabilidad en la efectividad, así como en el tipo (inhibitoria frente a aceleradora) de actividad. Probablemente, esta variabilidad puede atribuirse a la tasa de descomposición de los diversos péptidos, y a los distintos efectos que los diversos péptidos y sus productos de descomposición presentan in vivo. De forma similar a los experimentos de choque con fracciones descritos anteriormente, la actividad de inhibición del choque se pudo inhibir mediante la adición de la actividad de aceleración del choque, y viceversa.

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Estos datos son representativos, como mínimo, de 10 experimentos independientes.

TABLA 1

1

TABLA 2

2

En la tabla 2 vemos el efecto de la sustitución ALA (PEPSCAN) en los péptidos LQGV, VLPALP, VLPALPQ en experimentos del choque séptico. Podemos concluir que el cambio de tan sólo un aminoácido por un aminoácido neutral puede dar lugar a una actividad distinta. Así pues, las diferencias genómicas, así como el polimorfismo en estos péptidos, puede regular la respuesta inmunitaria de forma muy precisa. Los derivados de estos péptidos, por ejemplo (sin limitación) mediante la adición de aminoácidos no clásicos o los derivados que se modifiquen de forma diferencial durante o después de la síntesis, por ejemplo, mediante bencilación, amidación, glicosilación, corte proteolítico, enlace a una molecula de anticuerpo o a otro ligando celular, etc. también podrían desembocar en una mayor efectividad de la actividad.

Dado que MIF es uno de los principales inductores de la septicemia, también procedimos a reestimular con LPS in vitro los esplenocitos de los ratones del grupo tratado con el péptido 1 y, a continuación, medimos la producción de MIF. La figura 19 muestra que el tratamiento in vivo con LPS incrementó la producción de MIF en comparación con los ratones tratados con PBS, mientras que el tratamiento con el péptido 1 tras la inducción del choque inhibió la producción de MIF (figura 19). No se observó ningún efecto sobre la producción de MIF en los ratones tratados sólo con el péptido 1; esto demuestra la especificidad del péptido 1. Además, la proliferación reestimulada con LPS también se estudió en esplenocitos procedentes de ratones tratados con el péptido 1 y con c-hCG-V (fracción V de c-hCG). Estos datos demostraron que, tras la reestimulación con LPS in vitro, los esplenocitos de ratones tratados con LPS presentan una mayor capacidad de proliferar in vitro, en comparación con los ratones tratados con PBS (figura 20). Por otro lado, los esplenocitos procedentes de ratones tratados con LPS+péptido 1 y LPS+c-hCG-V presentaron una capacidad de proliferación mucho mayor, en comparación con los ratones de control tratados con LPS (figura 20). No se observaron diferencias en la proliferación inducida por LPS en ratones tratados con PBS, con el péptido 1 o sólo con c-hCG-V.

La figura 21 muestra el efecto de la reestimulación de los esplenocitos procedentes de ratones tratados in vivo con diferentes dosis de LPS in vitro. Estos datos también concuerdan con los datos de proliferación mencionados anteriormente. En estos experimentos, la reestimulación de los esplenocitos procedentes de ratones tratados con el péptido 1 (actividad anti-choque), con c-hCG (con actividad anti-choque) y con c-hCG-V (fracción anti-choque de c-hCG) tras la inducción del choque séptico, dio lugar a una mayor capacidad para proliferar, en comparación con los ratones tratados con LPS+PBS. Por otro lado, los esplenocitos procedentes de ratones tratados con el péptido 2 (péptido acelerador del choque) presentaron la misma capacidad de proliferación en comparación con los ratones tratados con LPS+PBS (figura 21). En esta figura, es importante observar que las cinéticas de la proliferación de los esplenocitos procedentes de ratones tratados con el péptido 1 y con la fracción c-hCG-V fueron similares.

En conjunto, la estimulación in vitro de los esplenocitos procedentes de ratones BALB/c tratados con LPS y con péptido o con la fracción con actividad anti-choque séptico redujo la proliferación asociada con la inhibición del choque séptico in vivo con estos péptidos o fracciones. Por otra parte, la reestimulación in vitro con LPS de los esplenocitos procedentes de ratones BALB/c tratados in vivo con LPS+actividad anti-choque séptico incrementó la proliferación asociada con la inhibición del choque séptico.

Citometría de flujo: los análisis mediante citometría de flujo de los esplenocitos procedentes de ratones BALB/c tratados revelaron que los efectos de inhibición del choque séptico y de aceleración del choque séptico estanco relacionados con un patrón característico de los marcadores superficiales de los esplenocitos. La figura 22 muestra que las actividades de inhibición del choque (c-hCG, péptido 1, péptido 4 y péptido 6) incrementaron la expresión de la molécula CD80 en las células CD19, en comparación con el grupo de control de PBS+LPS, mientras que se observó un efecto menor con el péptido 7, que acelera el choque. La figura 23 muestra un menor número de células CD19/CD40 en los bazos de las actividades inhibidoras del choque, en comparación con el grupo de PBS+LPS, mientras que no se observó efecto alguno con el péptido 7 en los experimentos de choque. Las figuras 24 y 25 muestran que la actividad inhibidora del choque séptico desactiva las células B220 positivas y F4/80 positivas, en comparación con los grupos tratados con PBS+LPS. Si bien el número de linfocitos T CD4+ activados (figura 26) aumentó con las actividades inhibidoras del choque séptico. No se observaron diferencias en la activación de las células B220, F4/80 y CD4 positivas con la actividad aceleradora del choque (péptido 7) (figuras 24-26). Además, se observó un descenso en la expresión del marcador de membrana celular Nk1.1 tras el tratamiento con LPS y péptido con actividades inhibidoras del choque séptico, en comparación con el grupo PBS+LPS, mientras que no se observó efecto alguno tras el tratamiento con una actividad aceleradora del choque (figura 27). Se observó un mayor número de Dx-5 (marcador celular pan-NK) tanto con la actividad inhibidora del choque séptico como con la actividad aceleradora del choque (figura 28). Estos resultados sugieren que la actividad inhibidora del choque séptico puede estar correlacionada con la desactivación de los macrófagos y de los linfocitos B, con un mayor número de linfocitos T CD4+ activados y de linfocitos NK Dx-5, mientras que la actividad aceleradora del choque séptico se correlaciona con un mayor número de linfocitos NK Dx-5 activados (la activación y el número de macrófagos y linfocitos B y T es comparable al grupo de LPS+PBS).

Bioactividad de hCG: hCG se une a un receptor LH e induce la señalización mediante cAMP. Hemos determinado si los péptidos 1, 2, 4, 6 y la fracción anti-choque de bajo peso molecular c-hCG-V pueden unirse al receptor LH y poseen bioactividad de hCG. La figura 29 muestra que hCG y c-hCG se unen a las células 293-hLHRwt/CREluc e inducen una actividad de la luciferasa dependiente de la dosis, mientras que no se observó ningún efecto en la actividad de la luciferasa con los péptidos 1, 2, 4, 6 ni con la fracción de bajo peso molecular c-hCG-V (figura 30). Además, la adición del péptido 1, 2, 4, 6 y de la fracción c-hCG-V en presencia de hCG tampoco causó ningún efecto sobre la actividad de la luciferasa inducida por el propio hCG (figura 31).

Estos datos demuestran que estos péptidos y la fracción c-hCG-V no presentan bioactividad hCG y que no se unen al receptor LH y, además, no interfieren en la unión de hCG al receptor LH.

Comentarios

La gonadotropina coriónica humana (hCG) es la hormona glucoproteica conocida como la hormona del embarazo, dado que su detección constituye la base de todas las pruebas del embarazo. Es sintetizada en las etapas más precoces del embarazo por el tejido trofoblástico en desarrollo que se convertirá en la placenta. La hormona sirve para mantener las secreciones esteroideas del cuerpo lúteo (derivadas del folículo ovárico tras la ovulación). Los esteroides resultantes conservan el recubrimiento del útero en un estado adecuado para el desarrollo del embrión tras su implante.

HCG presenta diversas formas, especialmente en la orina (Birken, 1996; O'Connor, 1994; Alfthan, 1996; Cole, 1996; Wide, 1994; Birken, 1993; Cole, 1993). Se presenta de forma abundante en la orina de las mujeres durante el primer trimestre del embarazo. Presenta heterogeneidad de carga debido a la variabilidad de su contenido en ácido siálico. Estas formas incluyen la hCG heterodimérica con estructura polipeptídica intacta (hCG), la hCG heterodimérica con cortes de los enlaces peptídicos en su bucle beta 2 (residuos 44-49) (hCG cortada), el fragmento del núcleo beta de hCG que se deriva de la subunidad beta de hCG y está compuesto por los residuos 6-40 unidos mediante enlaces disulfuro a los residuos 55-92 y que contiene grupos carbohidrato cortados sin ácido siálico, la subunidad beta de hCG derivada de la disociación de hCG (beta-hCG), la subunidad alfa de hCG derivada de la disociación de hCG (alfa-hCG). Además, existe una forma pituitaria de hCG y una forma pituitaria del fragmento del núcleo beta
de hLH.

La subunidad beta, al igual que la subunidad alfa de hCG, está compuesta por tres bucles; principalmente el bucle 1 (residuos 9-40), bucle 2 (residuos 41-54) y el bucle 3 (residuos 55-92). La subunidad beta también presenta la región denominada "cinturón de seguridad", que envuelve a la subunidad alfa. La subunidad beta contiene seis puentes disulfuro que mantienen la molécula junta cuando se producen los cortes de los enlaces peptídicos en el bucle 2, dando lugar a la hCG cortada. El fragmento del núcleo beta carece de la mayor parte del bucle 2 y la región del cinturón de seguridad. Por consiguiente, el fragmento del núcleo beta carece de la región del cinturón de seguridad, de la mayor parte del bucle 2 y de parte del extremo amino terminal de la subunidad beta. Los cortes en la región del bucle beta 2 (dado que se sabe que está expuesta a disolventes y se degrada fácilmente por acción de las proteasas) tienen como resultado una forma de hCG biológicamente inactiva y muchos inmunoensayos son incapaces de medir con precisión la hCG cortada debido a la inmunopotencia reducida tras los cortes en el bucle beta 2.

En el presente documento hemos demostrado que algunos productos de descomposición del bucle 2 seleccionados presentan efectos reguladores inmunes. En nuestros experimentos, los péptidos 4 (LQGV) y 6 (VLPALP) inhibieron el choque por completo, mientras que el péptido 2 (LQGVLPALPQ), 3 (LQG) y 7 (VLPALPQ) aceleraron el choque. Además, los péptidos 1 (VLPALPQVVC), 5 (GVLPALPQ), 8 (GVLPALP), 9 (VVC), 11 (MTRV), 12 (MTR), 13 (LQGVLPALPQVVC) y 14 (CLQGVPALPQVVC cíclico) mostraron en varios experimentos distintos una variabilidad en la efectividad, así como en el tipo (inhibitoria frente a aceleradora) de actividad. Probablemente, esta variabilidad puede atribuirse a la tasa de descomposición de los diversos péptidos, y a los distintos efectos que presentan los diversos péptidos.

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Leyendas de las figuras

Figura 1: esta figura muestra el cromatograma obtenido con la columna GPC 300 A con macroesferas de una muestra de NMPF (Pregnyl). Se fraccionaron tres áreas seleccionadas, NMPF-1 que se eluye aparentemente con un peso molecular de >25 kDa, NMPF-2 que se eluye aparentemente con un peso molecular de entre 25 kDa y 6 kDa, y NMPF-3 que se eluye aparentemente con un peso molecular de <6 kDa.

Figura 2: esta figura muestra el cromatograma obtenido con la columna GPC 60A con macroesferas de la fracción NMP-3 obtenida con la columna GPC 300 A con macroesferas. Se fraccionaron tres áreas seleccionadas, NMPF-3.1 que se eluye aparentemente con un peso molecular de entre 2000 y 300 Da, y NMPF-3.8 que se eluye aparentemente con un peso molecular menor que 300 Da (figura 2). Todas las fracciones se estudiaron para determinar la actividad anti-choque.

Figura 3: esta figura muestra que los ratones BALB/c tratados con PBS sucumbieron al choque a partir del día 1 después de la inyección de LPS en dosis altas, sobreviviendo menos del 10% de los ratones vivos en el día 5. Por el contrario, el 100% de los ratones tratados con NMPF de Pregnyl, o con sus fracciones NMPF-1 o NMPF-3 obtenidas con una columna de GPC de 300 A, seguían vivos en el día 5 (P<0,001), mientras que los grupos de ratones tratados con NMPF-2 de Pregnyl o con dexametasona (datos no mostrados) se alcanzó una supervivencia del 25% aproximadamente. No todos los preparados de hCG comerciales presentaron actividad del NMPF; por ejemplo, el NMPF de Profasi únicamente mostró una actividad anti-choque parcial (supervivencia del 40% próxi-
mamente).

Figura 4: esta figura muestra que la actividad anti-choque en un lote activo previamente analizado residía en una fracción NMPF-3 y en la fracción NMPF-3.2 derivada de la misma, que inhibe el choque incluso 24 horas y 36 horas después de la inducción del choque. Además, en todos los ratones tratados únicamente con la fracción NMPF-3.2 se inhibió el choque séptico y los animales presentaron puntuaciones de la enfermedad inferiores a 2, mientras que esta actividad anti-choque de la fracción NMPF-3.2 se inhibió con NMPF-3.3. El tratamiento únicamente con NMPF-3.3 aceleró el choque y los ratones tratados murieron antes que los ratones tratados con PBS.

Figura 5: esta figura muestra el cromatograma obtenido con la columna GPC 60A con macroesferas de una mezcla de fracciones NMPF-3.2 y NMPF-3.3 obtenidas de orina del primer trimestre del embarazo (con actividad anti-choque). Esta figura muestra que la proporción entre la fracción NMPF-3.2 y NMPF-3.3 es de aproximadamente 1:2.2 (consúltese el texto).

Figura 6: esta figura muestra el cromatograma obtenido con la columna GPC 60A con macroesferas de una mezcla de fracciones NMPF-3.2 y NMPF-3.3 obtenidas de un lote no activo de Pregnyl (con actividad anti-choque). Esta figura muestra la proporción entre la fracción NMPF-3.2 y NMPF-3.3 es de aproximadamente 1:3,4 (consúltese el texto).

Figura 7: esta figura muestra el cromatograma obtenido con la columna GPC 60A con macroesferas de una mezcla de fracciones NMPF-3.2 y NMPF-3.3 obtenidas de un lote activo de Pregnyl (con actividad anti-choque). Esta figura muestra que la proporción entre la fracción NMPF3,2 y NMPF3,3 es de aproximadamente 1:1 (consúltese el texto).

Figura 8: esta figura muestra la proliferación inducida por LPS de los esplenocitos. Tanto anti-MIF como NMPF (obtenidos de un lote activo de Pregnyl, NMPF-PG*) son capaces de disminuir la proliferación estimulada con LPS en comparación con LPS sólo, y juntos muestran un efecto inhibitorio sinérgico sobre la proliferación estimulada con LPS.

Figura 9: esta figura muestra que NMPF-A (APL) acelera la proliferación inducida por LPS, mientras que esta proliferación se ve inhibida por anti-MIF y NMPF-G*.

Figura 10: esta figura muestra que la fracción de bajo peso molecular (NMPF-PG3) de un lote activo de Pregnyl (NMPF-PG*), así como el NMPF-PG+ completo, son capaces de inhibir la proliferación inducida por LPS acelerada por NMPF-A.

Figura 11: esta figura muestra que NMPF-PG- (lote no activo de Pregnyl) y NMPF-A o en combinación (sinérgicamente) aumentan la proliferación inducida por LPS, mientras que NMPF-PG* inhibe esta proliferación, del mismo modo que anti-MIF (véase la figura 8-9).

Figura 12: esta figura muestra que NMPF-K acelera la proliferación inducida por LPS del mismo modo que NMPF-PG-, mientras que cuando están combinados, incrementan la proliferación de forma sinérgica, y este incremento de la proliferación se ve inhibido por NMPF-Kb o NMPF-PG*. Además, NMPF-Kb y NMPF-PG* reducen de forma sinérgica la proliferación inducida por LPS.

Figuras 13-15: éstas figuras muestran un efecto inhibitorio dependiente de la dosis (300 y 600 UI/ml) de NMPF-PG+ sobre la proliferación inducida por LPS y PHA/IL-2 de PBMC aislados de un paciente en choque séptico. Se observó el mismo efecto en condiciones de medio sólo.

Figura 16: esta figura muestra el cromatograma obtenido con la columna GPC 60A con macroesferas de c-hCG. Se fraccionaron tres áreas seleccionadas, 60A-F1 que se eluye aparentemente con un peso molecular de >10 kDa, 60A-F2 que se eluye aparentemente con un peso molecular entre 10 kDa-1 kDa y 60A-F3 que se eluye aparentemente con un peso molecular menor que 1 kDa. Todas las fracciones se estudiaron para determinar la actividad anti-choque.

Figura 17: esta figura muestra el cromatograma obtenido con la columna G25 Superdex de c-hCG. Se recogieron fracciones de 100 mL (fracciones I-VII) y todas las fracciones se estudiaron para determinar la actividad anti-choque.

Figura 18: esta figura muestra el cromatograma obtenido con la columna G25 Superdex de una muestra de orina del primer trimestre del embarazo obtenida en mujeres sanas. Se recogieron fracciones de 100 mL (fracciones I-VII) y todas las fracciones se estudiaron para determinar la actividad anti-choque.

Figura 19: esta figura muestra que el tratamiento in vivo con LPS incrementó la producción de MIF en comparación con los ratones tratados con PBS, mientras que el tratamiento con el péptido 1 tras la inducción del choque inhibió la producción de MIF. No se observó ningún efecto sobre la producción de MIF en los ratones tratados sólo con el péptido 1.

Figura 20: esta figura muestra que, tras la reestimulación con LPS in vitro, los esplenocitos de ratones tratados con LPS presentan una mayor capacidad de proliferar in vitro, en comparación con los ratones tratados con PBS. Por otro lado, los esplenocitos procedentes de ratones tratados con LPS+péptido 1 y LPS+c-hCG-V presentaron una capacidad de proliferación mucho mayor, en comparación con los ratones de control tratados con LPS. No se observaron diferencias en la proliferación inducida por LPS en ratones tratados con PBS, con el péptido 1 o sólo con c-hCG-V.

Figura 21: Esta figura muestra el efecto de la reestimulación de los esplenocitos procedentes de ratones tratados in vivo con diferentes dosis de LPS in vitro.

Figura 22: Esta figura muestra que las actividades de inhibición del choque (c-hCG, péptido 1, péptido 4 y péptido 6) incrementaron la expresión de la molécula CD80 en las células CD19, en comparación con el grupo de control de PBS+LPS, mientras que se observó un efecto menor con el péptido 7, que acelera el choque.

Figura 23-28: esta figura muestra los análisis de citometría de flujo de esplenocitos procedentes de ratones BALB/c tratados.

Figura 29-31: Estas figuras muestran que hCG y c-hCG se unen a las células 293-hLHRwt/CREluc e inducen una actividad de la luciferasa dependiente de la dosis (fig. 29), mientras que no se observó ningún efecto con los péptidos 1 (VLPALPQVVC), 2 (LQGVLPALPQ), 4 (LQGV), 6 (VLPALP) ni con la fracción de bajo peso molecular c-hCG-V (figura 30).

Además, la adición del péptido 1, 2, 4, 6 y de la fracción c-hCG-V en presencia de hCG tampoco causó ningún efecto sobre la actividad de la luciferasa inducida por el propio hCG (figura 31).

Claims (9)

1. Utilización de un péptido aislado para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento, la supresión o la prevención de una enfermedad inflamatoria aguda, en la que el péptido presenta una secuencia de aminoácidos escogida entre el grupo compuesto por LQGV, AQGV, LQGA, VLPALP, ALPALP, VAPALP, ALPALPQ, VLPAAPQ, VLPALAQ, GVLPALP, VVC, MTRV, MTR, LQGVLPALPQVVC y LQGVLPALPQVVC cíclico.

2. Utilización, según la reivindicación 1, en la que el péptido presenta una secuencia de aminoácidos escogida entre el grupo compuesto por LQGV, VLPALP, GVLPALP, VVC, MTRV, MTR, LQGVLPALPQVVC y LQGVLPALPQVVC cíclico.

3. Utilización, según la reivindicación 1, en la que el péptido presenta una secuencia de aminoácidos escogida entre el grupo compuesto por LQGV, AQGV, LQGA, VLPALP, ALPALP, VAPALP, ALPALPQ, VLPAAPQ y VLPALAQ.

4. Utilización, según la reivindicación 3, en la que el péptido presenta una secuencia de aminoácidos escogida entre el grupo compuesto por LQGV, AQGV, LQGA, VLPALP y VLPALAQ.

5. Utilización, según una de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicha enfermedad inflamatoria aguda es un choque séptico o anafiláctico o un rechazo hiperagudo de un trasplante.

6. Utilización, según la reivindicación 5, en la que dicha enfermedad inflamatoria aguda es el choque séptico.

7. Utilización, según una de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho tratamiento comprende la regulación de los índices relativos y/o de la actividad de citocinas de subpoblaciones de células linfocitarias, dendríticas o presentadoras de antígenos en un paciente tratado.

8. Utilización, según la reivindicación 7, en la que dichas subpoblaciones comprenden células Th1, Th2, o DC1 o DC2.

9. Utilización, según una de las reivindicaciones anteriores, en la que el inmunorregulador se utiliza en combinación con un agente diana, tal como un anticuerpo monoclonal, para la administración controlada y/o localizada.