WO2006090874A1 - 哺乳動物ｔ細胞のサイトカインの分析方法と関連する一切の疾患の評価法と予防・治療の分析 - Google Patents

哺乳動物ｔ細胞のサイトカインの分析方法と関連する一切の疾患の評価法と予防・治療の分析 Download PDF

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Masato Kuwabara
Takeo Sakai
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    • G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating, preventing, and treating all diseases associated with a method for analyzing T cell site force-in in mammals.
  • Th lymphocytes involved in acquired immunity are classified into several subsets including Thl and Th2, depending on the difference in the site force-in produced.
  • Those that produce interferon (IF N) ⁇ , interleukin (IL) -2, etc. are called Thl cells, and those that produce IL 4, -5, -6, -10, -13 are called Th2 cells.
  • IFN-y a Thl site force-in
  • Th2 site force-in is known to suppress the Thl reaction.
  • Th cells and T cells that function suppressively to the responsiveness of ThlZTh2 cells has been proven.
  • Th3 cells cells that produce latent TGF- ⁇ at high concentrations are called Th3 cells. Yes.
  • Th3 cells cells that produce latent TGF- ⁇ at high concentrations are called Th3 cells.
  • Thl D Thl disease
  • Th2 cells Th2 cells secrete diseases.
  • the disease in which tumor formation is induced by the reaction of the site force in is caused by the reaction of Th 2 D (Th2 disease), Th3 cells or Th3 cells with transforming growth factor (TGF) ⁇ (Th3 reaction)
  • TGF transforming growth factor
  • the formation-induced disease is characterized by applying a mammalian immunoreactive tumor formation inhibitor based on interferon gamma to the tumor induced in any of Th3-D (Th3 disease). To do.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-2028
  • the present inventor has found that the redox regulation including tumors and allergies, and various Th reactions, that is, various diseases with varying Th paradigm patterns, the relationship between the intensity of such Th reactions and the failure of Lance and the disease. Based on the knowledge that there is sex, I thought that it was necessary to control the disease information for individuals by clarifying the correlation between the combination of site force-in produced by T cell subsets and the disease.
  • the present invention provides a step of measuring each site force in of Thl, Th2, and Th3 of a mammal, and a step of determining a paradigm pattern of each site force in of the measurement result force And a parasitem pattern, and a method for associating a method for evaluating a disease associated with the paradigm, and a preventive / therapeutic method.
  • the paradigm pattern of Thl, Th2, and Th3 site force-in varies from individual to individual, and the strength of immunity varies from individual to individual, and infection It has been found that this pattern is different when suffering from diseases such as sickness and cancer.
  • the paradigm patterns of Thl, Th2, and Th3 site force-in it is possible to diagnose diseases such as infectious diseases and cancer, and to determine the state of the solid such as resistance to these diseases. it can. Therefore, by obtaining this paradigm pattern, it is possible to apply the most appropriate treatment (tailor-made medicine) for each individual.
  • the paradigm pattern is helper T cell CD4 positive cell, Thl IFN—y positive CD4 positive cell, Th2 interleukin 4 positive CD4 cell, Th3 transforming growth factor ⁇ 1 positive CD4 positive
  • This is a pattern in which the number of cells is measured by flow cytometry, and the ratio of Thl, Th2, and Th3 cells in helper sputum cells is calculated from the obtained scatter plot.
  • Th lZTh2 balance and the proportion of Th3 showing the strength of immune regulation can be derived
  • Deviations from the normal level of Thl, Th2, and Th3 site force-in balance can be corrected by applying a suitable agent described later to the individual mammal. Treatment In this process, if this balance is checked, it is possible to evaluate the degree of treatment effect.
  • representative examples of the Thl, Th2, and Th3 site force-in are, in order, IFN- ⁇ , IL-4, and TGF- ⁇ 1.
  • the present invention is a method comprising the step of administering to a mammal an agent that regulates at least one Th reaction of Thl, Th2, and Th3.
  • a representative example of the measurement of site force-in required for obtaining a paradigm pattern is a flow of the number of Th cells that exhibit each site force-in reaction, that is, the number of cells that generate each site force-in. It is to measure using a cytometer. Alternatively, the concentration of each site force in may be measured.
  • Th reaction in an unstimulated Th cell and a Th reaction in a Th cell to which an artificial activation stimulus is added in addition to an artificial activation stimulus. Since the former Th reaction represents an immune response in a mammal, it is referred to as a phenotypic Th reaction or an activated Th reaction. Since the latter Th reaction represents a latent immune reaction that mammals have, it is called an intracellular Th reaction or latent Th reaction.
  • the second invention of the present application uses a computer, a first step of measuring each site force in of Thl, Th2, and Th3 of a mammal, a second step of inputting the measured value to a computer, and a computer.
  • a reference line grating straight line indicating the greatness of the paradigm patterns is obtained from the paradigm pattern, and the gray of the reference line is compared with the database, so that the mammal solid It is possible to know the tendency of Th reaction, disease diagnosis of mammals, or disease prediction. In order to change or restore an abnormal paradigm pattern to a normal type, it is possible to predict the drugs that can use the paradigm pattern force.
  • the present invention provides a fifth step in which the computing means of the computer specifies the disease or the treatment state of the disease in the measurement object from the paradigm pattern measured as a result of the comparison. Prepare.
  • Yet another invention is a computer apparatus for carrying out this analysis method.
  • TGF- ⁇ has an activated form (oxidation) and a latent form, and the latent form is converted to an activated form by acid, plasmin, or the like.
  • TGF- ⁇ is a modulator for evaluation of neoplastic diseases. This cytokine develops the pathology associated with redox regulation.
  • Redox control refers to modification of a function expressed by a cell by oxidative stress.
  • Redox is a chemical reaction involving oxidation or reduction and its environment. Oxidative stress generated in vivo affects the redox control system by activating the signal transduction system as an information molecule. Active oxygen that causes oxidative stress is generated by the mitochondrial electron transport system, neutrophil oxidase, radiation, heavy metals, and alkylating agents. When the redox control state is tilted toward the acid type, the ability of the cell to remove active oxygen is reduced, and various disorders such as DNA damage occur under high V and oxidative stress. Sex is reduced. TGF- ⁇ suppresses the expression of genes such as catalase, dartathione peroxidase GPX, and superoxide dismutase SOD, which are antioxidative enzymes.
  • TGF-8 due to chronic inflammation suppresses the expression of such antioxidant enzymes, resulting in more and more active oxygen accumulation.
  • the present inventor has found that redox control regulates the kinetics of the Th3 reaction. Furthermore, it has been clarified that active TGF-
  • the mammal in the present invention includes humans, domestic animals such as dogs and cats other than humans, and other animals.
  • a 5-year-old male golden retriever (facial tumor and left eyeball symptom) was used.
  • MR imaging confirms a mass with cysts and dynamic MR imaging detects malignant tumor was diagnosed.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • both the working group and the non-stimulated group are incubated for a certain period of time at 37 ° C and 5.0% carbon dioxide.
  • the production of each site force-in peaked at about 4 hours after stimulation, and IFN-y and TGF- ⁇ reached a plateau after about 4 hours. For this reason, incubation is performed for 4 hours.
  • the Thl / 2/3 paradigm pattern is analyzed from the obtained data, and the disease stage, disease state, drug resistance, evaluation of drug efficacy, drug selection, and the like are evaluated.
  • CD4 graph axis
  • CD8 graph Axis
  • the number of cells producing Thl site force in (INF— y), Th2 site force in (IL 14), and Th3 site force in (TGF- ⁇ 1) is Scatter plots with “dots” were obtained by flow itometry.
  • the Th reaction is an aggregate that combines the functions and functions of lymphocytes (helper T cells) marked with CD4 and each Th site force-in.
  • the number of CD4 (+) CD8 ( ⁇ ) cells having each Th reaction was counted from the force of the scatter diagram, and this was expressed as three bar graphs.
  • Fig. 1 shows the Thl / 2/3 paradigm pattern in normal and cancer-bearing dogs in the phenotypic ThlZ2Z3 response
  • Fig. 2 shows normal dogs and cancer-bearing dogs in the intracellular ThlZ2Z3 response. Shows the paradigm pattern of ThlZ2Z3.
  • the paradigm pattern is visualized as follows. The number of mammalian Thl, Th2, and Th3 Itoda cysts is manually input into a computer, and the computer is used to calculate the paradigm pattern for each site force in mitoda vesicle, which is displayed on the monitor.
  • the balance of the strength of multiple site force-ins exhibited by a subset of helper T cells (Th) may differ depending on the individual (normal dog or cancer-bearing dog). It could be confirmed. Therefore, it is possible to correlate the paradigm pattern of site force-in with the nature and state of the solid, which demonstrates that the solid state can be diagnosed without examining the gene by examining the pattern. Is. In FIGS. 1 and 2, the vertical axis in the figure means the ratio (%) of each Th-site force-in positive CD4 positive cell to the CD4 positive cell. That is,
  • the pattern of ThlZ2Z3 could be changed by administering a substance that controls at least one of the ThlZ2Z3 reactions.
  • 45 g / head of Katsumoto Masaru (Ganoderma communis mycelia extract) was orally administered to a mammal solid once a day.
  • This substance is a drug that suppresses the Th2 reaction and at the same time enhances the Thl reaction.
  • This was used to treat patients with a predominant phenotypic Th2 response. As a result, the Thl response was increased and the imbalance of the pathological Th response was improved.
  • DB bacteria (a kind of bacterial cell component of Bacillus subtilis), 120 mg / head sid was orally administered to a suckling solid once a day. Gave. This bacterium is a drug that induces drug resistance by administration for several days. In this drug resistance, Smad-7 increased simultaneously with the increase in TGF-j8, and as a result, NK / NKT activity was suppressed.
  • TGF- ⁇ was higher than that in normal dogs, particularly on day 5 of the disease.
  • Intracellular site force-in was weaker in the activity of lymphocytes when stimulated with Ionomycine compared to normal dogs.
  • the dynamics of each site force-in showed a high IFN- ⁇ and a low IL-4 on the fifth disease day.
  • TGF- ⁇ did not change significantly.
  • Vaginal cell activity increased markedly on the 3rd and 5th disease days, but decreased on the 7th disease day.
  • Th reaction paradigm in this case was considered to be a state of anagenesis due to suppression of high concentrations of TGF-
  • NK cell activity is usually significantly reduced by radiotherapy, but if NK cell activity is enhanced by BRM administration, IL4 production is suppressed from Th2 cells and IFN- ⁇ production is promoted, so tumor growth, metastasis It is thought that the Thl reaction, which is effective in suppressing the above, is strengthened.
  • TGF- ⁇ Transforming Growth Factor- ⁇ 1: Th3 reaction
  • Example 1 For normal dogs and non-normal dogs (such as malignant tumors, benign tumors, Each site force-in reaction is measured based on Example 1. Traps the amount of reaction (number of cells) of each site force in a three-dimensional coordinate space that includes Thl, Th2, and Th3 axial forces. Next, the factor axis is determined from this raw data by the method of least squares. By adding a factor axis that intersects the factor axis at right angles, the correlation coefficient of each measured value is calculated based on these two two-dimensional coordinate axes.
  • a paradigm pattern of Th reaction is created from the correlation coefficient of each group.
  • the average of the correlation coefficient of each Th is calculated.
  • Figure 3 is an example of a noradyme pattern.
  • the trend (grating) force of this paradigm pattern is determined by the baseline.
  • Fig. 3, 30 is an example of the reference line.
  • Th2 site force-in IL-10 suppresses Thl.
  • the reference line is defined as passing through the intersection of the connection between the maximum value of Thl and the minimum value of Th2 (zero) and the connection of the maximum value of Th2 and the minimum value of Thl.
  • the slope 32 of this reference line is evaluated as a grating.
  • the level of the grating for example, the normal level, the small abnormal level (+), the medium abnormal level (++) +)
  • a large abnormal level (++++) can be established.
  • cancer has a higher degree of malignancy.
  • Benign tumor a ⁇ grating ⁇ b
  • the level of the grating is made into a database and stored in advance in the memory of the computer system.
  • the process of obtaining the above-mentioned reference line and grating for the Th measured value force of the test solid is automated by a computer program.
  • Computations for comparing and comparing the grating values obtained by inspection with the grating levels in the database are also automated by computer programs.
  • FIG. 4 shows a computer system, which includes an input device 10 for inputting inspection data, a memory 14 having a database 16, and an arithmetic device for performing various calculations by comparing measured values with the database. Yes.
  • the database may be provided by an external recording medium such as a CD or DVD.
  • FIG. 5 is a paradigm pattern in the case of a benign tumor obtained in the same manner as in Example 1. It can be seen that the ratio of Th3 is small in both the phenotype ThlZTh2ZTh3 response and the intracellular ThlZTh2ZTh3 response. That is, it can be seen that the evaluation of the grating and the evaluation of the ratio of Th3 make it possible to distinguish between a malignant tumor and a benign tumor by a paradigm pattern of Th reaction. In addition, in the paradigm pattern for malignant and benign tumors, the Th2 value increases with respect to Thl! It can be seen that the latter is significantly smaller than the former.
  • Th3 the presence of a tumor is suspected when Th2 is larger than Thl, and the presence of a malignant tumor is suspected by a large Th3 value.
  • the Th3 phenotype has a correlation coefficient value above the reference line.
  • the intrinsic type the value of the correlation coefficient is located below the reference line.
  • Th 3 correlation coefficient values are above the baseline for both phenotype and intrinsic type. This also makes it possible to distinguish between malignant and benign tumors.
  • ⁇ 2 A graph showing the ratio of site force-in production in intracellular TH1Z2Z3 (stimulation group).
  • FIG. 5 Shows the paradigm pattern of each Th reaction in benign tumors, (1) is a phenotypic paradigm pattern, and (2) is an endogenous paradigm pattern.

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Abstract

　Ｔ細胞サブセットが産出するサイトカインの組み合せと疾患の相関関係を明らかにすることにより個体に対する疾患情報の制御を実現するため、哺乳動物のＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ３の各細胞のサイトカインを測定する工程と、各サイトカインのパラダイムパターンを求める工程と、パラダイムパターンと疾患の予防、治療ならびに予後とを関連付ける工程と、を備える。  

Description

明 細 書
哺乳動物 T細胞のサイト力インの分析方法と関連する一切の疾患の評価 法と予防 '治療の分析
技術分野
[0001] 本発明は、哺乳動物の T細胞サイト力インの分析方法と関連する一切の疾患の評 価法と予防，治療に関するものである。
背景技術
[0002] 獲得免疫に関与するヘルパー T(Th)リンパ球は、生産するサイト力インの相違によ り Thl、 Th2をはじめとするいくつかのサブセットに分類される。インターフェロン（IF N) γ、インターロイキン（IL)—2などを作るものを Thl細胞と呼び、主として IL 4 , - 5, -6, - 10, —13を作るものを Th2細胞と呼んでいる。 Thlサイト力インである IFN- yは Th2反応を抑制することが知られ、 Th2サイト力インである IL— 10は Thl 反応を抑制する事が知られて ヽる。
[0003] 近年 ThlZTh2細胞の応答性に対して抑制的に機能する Th細胞と T細胞 (Tr)の 存在が証明され、特に潜在型 TGF— β を高濃度に生産する細胞を Th3細胞と呼ん でいる。腫瘍やアレルギーをはじめとする様々な疾患において、このような複数の Th 反応の強弱やバランスの破綻と疾患の関連性が示唆されている。
[0004] 関連する従来例として、例えば、特開 2005— 2028号公報に記載のものがある。こ のものは、 Thl細胞または Thl細胞に分泌されるサイト力インの反応 (Thl反応）によ り腫瘤の形成が誘導される疾患は Thl D (Thl疾患）、 Th2細胞または Th2細胞 に分泌されるサイト力インの反応 (Th2反応）により腫瘤形成が誘導される疾患は Th 2 D (Th2疾患）、 Th3細胞または Th3細胞とトランスフォーミング増殖因子 (TGF) βとの反応 (Th3反応）により腫瘤形成が誘導される疾患は Th3— D (Th3疾患） のいずれかの疾患において誘導される腫瘤に、インターフェロン γを主成分とする 哺乳動物の免疫反応性腫瘤形成抑制剤を適用することを特徴とするものである。 特許文献 1：特開 2005— 2028号公報
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明者は、腫瘍やアレルギーをはじめとするレドックス制御、各 Th反応すなわち Thパラダイムパターンの変動する様々な疾患において、このような Th反応の強弱や ノ《ランスの破綻と疾患の関連性があるとの知見に基づいて、 T細胞サブセットが産出 するサイト力インの組み合せと疾患の相関関係を明らかにすることにより個体に対す る疾患情報の制御が必要であると思い至った。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明は、このような課題を達成するために、哺乳動物の Thl、 Th2、及び Th3の 各サイト力インを測定する工程と、測定結果力 各サイト力インのパラダイムパターン を求める工程と、前記パラダイムパターンとその関連疾患の評価法と予防 ·治療を関 連付ける工程と、を備える、哺乳動物のサイト力インの分析方法であることを特徴とす るものである。
[0007] 本発明者が鋭意検討したところ、 Thl、 Th2、及び Th3の各サイト力インのパラダイ ムパターンは、個体によって異なり、それによつて固体ごとの免疫力の強さが異なり、 また、感染症や癌などの疾患を患って 、る場合にはこのパターンが異なってくる事が 判った。この結果、 Thl、 Th2、及び Th3の各サイト力インのパラダイムパターンを調 ベる事により、感染症や癌などの疾患の診断や、これら疾患に対する抵抗力など固 体の状態を判断することができる。したがって、このパラダイムパターンを求めることに よって固体ごとにもっとも適した治療 (テーラーメード医療)を適用する事が可能となる
[0008] パラダイムパターンとはヘルパー T細胞である CD4陽性細胞、 Thlである IFN— y 陽性 CD4陽性細胞、 Th2であるインターロイキン 4陽性 CD4細胞、 Th3であるトラン スフォーミンググロウスファクター β 1陽性 CD4陽性細胞の各細胞数をフローサイトメ トリー法により測定し、得られた散布図からヘルパー Τ細胞中の Thl, Th2, Th3の 各細胞の割合を算出したパターンであり、このパターン力も免疫反応の質といえる Th lZTh2バランスと免疫制御の強さを示す Th3の割合を導き出すことができる
[0009] Thl, Th2、及び Th3の各サイト力インのバランスの正常レベルからのずれは、後 述の適した薬剤を哺乳動物個体に適用することによって補正することができる。治療 の過程で、このバランスをチ ックすれば、治療効果の程度を評価することが可能と なる。
[0010] 本発明において、前記 Thl、 Th2、及び Th3のサイト力インの代表例は、順番に、 I FN - γ、 IL— 4、 TGF— β 1である。さら〖こ、本発明は、前記 Thl、 Th2、及び Th3 の少なくとも一つの Th反応を制御する薬剤を哺乳動物に投与する工程を含む方法 である。さらに、本発明において、パラダイムパターンを求めるために必要なサイト力 インの測定の代表例は、各サイト力イン反応を発揮する Th細胞数、即ち、各サイト力 インを生成する細胞の数をフローサイトメータを用いて測定することである。これに代 えて各サイト力インの濃度を測定してもよい。サイト力インの反応には、人為的な活性 化刺激を加えて 、な 、無刺激の Th細胞における Th反応と人為的な活性ィ匕刺激を 加えた Th細胞における Th反応がある。前者の Th反応は哺乳動物個体における免 疫反応を表すものであるので、表現型 Th反応あるいは活性型 Th反応と言うことにす る。後者の Th反応は哺乳動物が持って 、る潜在的な免疫反応を表すものであるの で、細胞内在型 Th反応或いは潜在型 Th反応という。
[0011] 本願の第 2の発明は、哺乳動物の Thl、 Th2、及び Th3の各サイト力インを測定す る第 1工程と、測定値をコンピュータに入力する第 2工程と、コンピュータを用いて各 サイト力インのパラダイムパターンを求める第 3工程と、前記パラダイムパターンをモ- ターに表示する工程と、コンピュータの演算手段が、当該パラダイムパターンと、予め メモリに記憶された、各疾患に於ける既知のノ ラダィムパターンとを比較する第 4ェ 程と、を備える、哺乳動物のサイト力インの分析方法である。
[0012] このパラダイムパターン同士を比較するために、パラダイムパターンのグレートを示 す、基準線 (グレーティング直線)をパラダイムパターンから求め、この基準線のグレー トをデータベースと比較して、哺乳動物固体の Th反応の傾向、或いは哺乳動物個体 の疾病診断、或いは疾病予測を知ることができる。正常でないパラダイムパターンを 正常タイプに変化或いは復帰させるために、パラダイムパターン力 使用可能な薬剤 を予測することができる。
[0013] 更に本発明は、コンピュータの演算手段が、前記比較の結果、測定されたパラダイ ムパターンから、測定対象固体の疾患或いは疾患の治療状態を特定する第 5工程を 備える。さらに他の発明は、この分析方法を実施するためのコンピュータ装置である。
[0014] TGF- β は活性型（酸化）と潜在型 (latent form)があり、潜在型は、酸やプラスミンな どにより活性型 (activated form)に変換される。本発明では、 TGF- β は腫瘍性疾患 の評価の修飾因子となることを明らかにした。このサイトカインはレドックス制御と関連 して病態を進展させる。
[0015] レドックス制御とは、酸化ストレスにより細胞が発現する機能を修飾することをいう。
レドックス (redox)とは酸化'還元が関与する化学反応やその環境をいう。生体内で生 じた酸化ストレスは、情報分子としてシグナル伝達系を作動してレドックス制御系に影 響する。酸化ストレスの原因となる活性酸素は、ミトコンドリア電子伝達系、好中球の ォキシダーゼ、放射線、重金属、アルキル化剤などによって生じる。レドックス制御状 態が酸ィ匕型に傾いた状態では、細胞が活性酸素などを除去する能力は低下し、高 V、酸化ストレス下では DNAが損傷するなどさまざまな障害が発生して、 Th反応性は 低下する。 TGF- βは抗酸ィ匕酵素であるカタラーゼ、ダルタチオンペルォキシダー ゼ GPX、スーパーォキシドジスムターゼ SOD、などの遺伝子発現を抑制する。特に 、慢性炎症などで TGF- |8の産生が高まると、このような抗酸化酵素の発現が抑制さ れ、ますます活性酸素の蓄積を招く結果となる。本発明者は、レドックス制御が Th3 反応の動態を規定するとの知見を得た。さらに、活性型 TGF- |8 は Thl反応に抑制 的に作用して、繰り返し産生されることにより、症状が悪ィ匕していく方向性を固定する 作用を有することを明らかにした。本発明における哺乳動物とは、ヒト、ヒト以外の犬 や猫などの家畜やその他のものを 、う。
発明の効果
[0016] 本発明によれば、 Th反応の強弱やバランスの破綻と疾患の関連性があるとの知見 に基づ!/、て、 T細胞サブセットが産出するサイト力インの組み合せと疾患の相関関係 を明らかにすることにより個体に対する疾患情報の制御が可能となった。
発明を実施するための最良の形態
[0017] 実施例 1
5才令の雄のゴールデンレトリバー (顔面腫瘍及び左眼球突出の症状)を使用した 。 MR撮像によりシストを伴った腫瘤を確認し、ダイナミック MR撮像法により悪性腫瘍 と診断した。
[0018] へパリン 0. 5mlをカ卩えたシリンジにて頸静脈より採血し、血液を PBSに倍希釈し、 F icoll氏液に重層、遠心して末梢血中単核球 (PBMC)を分離した。この単核球を 4 X 10 6個 Zmlとなるように 10%牛血清加 RPMI 1640メディウムに浮遊させる。この細胞浮 遊液を刺激群 (細胞内在型）と無刺激群 (表現型）に分ける。刺激群には、 PMA40n g/mU Ionomych^ /z gZmlを添カ卩しポリクローナルなリンパ球活性化刺激をカ卩える 。その後、使役群、無刺激群とも 37°C、 5. 0%二酸化炭素存在下で一定時間インキ ユーべーシヨンする。それぞれのサイト力インの産生量は、 IL— 4が刺激後 4時間程 度でピークを迎え、 IFN— y、 TGF- βは 4時間程度でプラトーとなる。このため、ィ ンキューべーシヨンは 4時間行う。
[0019] インキュベート終了 2時間前に、細胞内タンパク質輸送阻害剤である Brefeldin A を 40 gZmlカロえ、産生サイト力インを細胞内（ゴルジ装置内に）にトラップする。イン キュペート終了後、冷 PBSをカ卩えて活性化リンパ球の反応を止め、 4°Cにて遠心洗 浄を 2回行う。上清を除去し、 50 iu l Xサンプル数の10%FBS加RPMI1640を加ぇ る。各サンプルに細胞表面抗原に対する標識抗体を加え、氷上で 45分培養して CD 4や CD8などの細胞表面タンパク質を染色する。
[0020] それぞれのサンプルに Intraprep Reagent l(Beckman Coulter社)を 100 μ 1加える。
室温で 15分インキュベートし、 PBSを加えて遠心洗浄する。上清を除去し、それぞれ のサンプノレに Intraprep Reagent2(Beckman Coulter社)を 100 μ 1加え、室温で 5分間 インキュベートする。表面タンパクの染色後、 5. 5%ホルムアルデヒドにより細胞を固 定し、サポニン処理により細胞膜透過性を高め、表現型あるいは細胞内在型 Thサイ トカインを測定するサンプルにそれぞれのサイト力インに対する標識抗体を入れ、室 温にて 20分間インキュベートする。 PBSを加えて遠心洗浄する。次いで、 0. 5%ホ ルムアルデヒド加 PBS500 μ 1に浮遊させ、フローサイトメーターにより TH1/2/3反 応を分析する。
[0021] 得られたデータから Thl/2/3パラダイムパターン（paradigm pattern)を解析し、 病期、病態'病勢、薬剤耐性、薬効の評価、薬剤の選択などを評価する。 Thl, Th2 , Th3の濃度のバランスをグラフ化するに際して、 CD4〔グラフの軸〕と CD8 (グラフの 軸）と!、うふたつの基準によって、 Thlサイト力イン (INF— y )、 Th2サイト力イン (IL 一 4)、 Th3サイト力イン (TGF- β 1)の産生細胞のそれぞれの数を「点」とした散布図 をフローアイトメトリーによって得た。なお、 Th反応とは CD4という印のついたリンパ 球 (ヘルパー T細胞）と各 Thサイト力インの作用と機能を併せ持った集合体の事であ る。次いで、各 Th反応を有する CD4(+)CD8(—)細胞の数を散布図のな力からカウ ントし、これを三つの棒グラフとして表した。
[0022] 図 1は、表現型 ThlZ2Z3反応における、正常犬と担癌犬とにおける、 Thl/2/ 3のパラダイムパターンを示し、図 2は細胞内在型 ThlZ2Z3反応における、正常犬 と担癌犬とにおける、 ThlZ2Z3のパラダイムパターンを示した。
[0023] パラダイムパターンの映像化は、次のようにして行われる。哺乳動物の Thl、 Th2、 及び Th3の各糸田胞数をコンピュータに人力し、コンピュータを用 ヽて各サイト力イン糸田 胞のパラダイムパターンが計算され、これがモニターに表示される。
[0024] 図 1及び図 2に示すように、固体 (正常犬か担癌犬）の相違によって、ヘルパー T細 胞 (Th)のサブセットが呈する複数のサイト力インの強弱のバランスが異なることが確 認できた。したがって、サイト力インのパラダイムパターンと固体の性質や状態を関連 付けることができ、このことは、パターンを調べる事によって遺伝子の診断をすること 無ぐ固体の状態を診断することができることを実証したものである。図 1及び図 2に お ヽて、図の縦軸は CD4陽性細胞に対する各 Thサイト力イン陽性 CD4陽性細胞の 割合 (％)を意味する。すなわち、
(Thサイト力イン陽性 CD4陽性細胞数 ZCD4陽性細胞数） X 100 (%)、
によって定義される。
[0025] 次に、 ThlZ2Z3反応の少なくとも一つを制御する物質を投与することによって、 ThlZ2Z3のパターンを変えることができた。克元勝 (マンネンタケ菌糸抽出物）の 4 5g/headを 1日 1回を哺乳固体に経口投与した。この物質は、 Th2反応を抑制し、同 時に Thl反応を増強する薬剤である。これを用いて表現型 Th2反応が優位であった 症例に投与した。その結果、 Thl反応が上昇して病的 Th反応のインバランスが改善 された。
[0026] DB菌（枯草菌の一種の菌体成分）、 120mg/head s.i.dを 1日 1回哺乳固体に経口投 与した。この菌は数日間の投与により薬剤耐性を誘導する薬剤である。この薬剤耐 性は、 TGF- j8 の増量により Smad— 7が同時に増加し、結果的に NK/NKT活性を 抑制した。
[0027] 担癌宿主では血漿中の TGF— β は正常犬と比較して高値を示し、特に第 5病日 に高い値を認めた。細胞内サイト力インについては正常犬と比較すると ΡΜΑ添加 Ion omycine刺激に対するリンパ球の活性は弱力つた。各サイト力インの動態は第 5病日 に IFN— γが高値を示し、 IL— 4は低値を示した。 TGF— β は大きな変動は見られ なかった。 ΝΚ細胞活性は第 3, 5病日に著しく上昇したが第 7病日には低下が認め られた。
[0028] 本症例の Th反応パラダイムは高濃度の TGF— |8 の抑制によるァナジ一の状態で あると考えられた。 NK細胞活性は通常、放射線治療により著しく低下するが、 BRM 投与により NK細胞活性を増強すると、 Th2細胞から IL 4産生が抑制され、 IFN— γ産生が促進されることから、腫瘍の増大、転移の抑制に有効な Thl反応が強化さ れると考えられる。
[0029] 実施例 2
次に良性腫瘍の例について説明する。レドックス状態が酸ィ匕を呈したので、腫瘤中 の活性型 TGF— β (Transforming Growth Factor- β 1 :Th3反応）を測定した結果 は以下の通りである。
活性型あるいは潜在型 Th2反応サイト力イン/ TGF— βェの産生
潜在型/活性型 TGF - |8 ( ng /ml )
血漿中 正常値 1.70 (ィヌの潜在型、活性型は検出-)
血漿中 潜在型 4.94 活性型 - 腫瘤内 潜在型 +† 活性型 18.88
このような結果、治療法を変更して治療したところ活性型 TGF— β は検出されず 臨床症状 (治療法変更後 56日現在）は著しく改善された。
[0030] 実施例 3
次に、パラダイムパターンから、疾病の診断や予測を自動的に可能にする例につ いて説明する。正常犬、非正常犬 (悪性腫瘍、良性腫瘍や感染症など）について、実 施例 1に基づいて各サイト力イン反応を測定する。 Thl, Th2, Th3の各軸力もなる 3 次元の座標空間に、各サイト力インの反応量 (細胞数)をトラップする。次いで、この素 データを最小二乗法によって因子軸を決定する。この因子軸に直角に交わる因子軸 を追加して、この二つの 2次元の座標軸に基づいて、各測定値の相関係数を算出す る。
[0031] 次いで、正常犬の群と、各異常犬の群 (例えば、悪性腫瘍、或いは良性腫瘍）につ いて、各群の相関係数から Th反応のパラダイムパターンを作成する。各群についえ 、各 Thの相関係数の平均を算出する。図 3は、ノラダィムパターンの一例である。こ のパラダイムパターンの傾向 (グレーティング)力 基準線によって決定される。図 3に おいて、 30が基準線の一例である。 Thlと th2との関係が相互に相反する状態、即 ち、 Thlサイト力インである、 INF- yは Th2を抑制し、 Th2サイト力インである IL— 1 0は Thlを抑制する関係にあることから、 Thlの最大値と Th2の最小値 (零）との結線 と、 Th2の最大値と Thlの最小値との結線との交点を通過するものとして、基準線が 定義される。この基準線の傾き 32がグレーティングとして評価される。
[0032] 正常犬の群と、各症例の異常群のそれぞれにつ 、て、グレーティングを求めること により、グレーティングのレベル、例えば、正常レベル、小異常レベル（ + )、中異常レ ベル（+ + +)、大異常レベル（+ + +)を策定することができる。グレーティングが高 くなるほど、異常レベルが高いことになり、例えば、癌であれば悪性度が高いことを示 している。例えば、 a< b< (a, bは、正の値）としたときに、
正常レべノレ：グレーティング≤ a
良性腫瘍 ：a<グレーティング≤b
悪性腫瘍 ：b <グレーティング
の関係を定めることができる。したがって、ある検査対象である固体についての各 Th 反応を測定し、その測定値に基づいてパラダイムパターンを形成して基準線を求め、 これを予め定まっているグレーティングのレベルと比較することによって、外科的な検 查ゃ遺伝子診断などの、本願発明の検査項目として説明されたもの以外の検査を行 うことなしに、検査固体の疾病診断或いは将来の発症を予見することができる。なお 、グレーティングのレベルの決定に必要な検査対象固体として、種別、体重別、年齢 別、性別などの区別は必要ではないが、ある項目について検査対象固体を区別して ちょい。
[0033] このグレーティングのレベルはデータベース化されて、コンピュータシステムのメモリ に予め記憶されている。検査固体の Th測定値力も既述の基準線、グレーティングを 求める過程はコンピュータプログラムによって自動化されている。また、検査して得ら れたグレーティング値とデータベースのグレーティングレベルとの比較、比較のため の演算もコンピュータプログラムによって自動化されている。図 4は、コンピュータシス テムを示すものであり、検査データを入力する入力装置 10と、データベース 16を備 えるメモリ 14と、測定値とデータベースを比較して各種演算を実行する演算装置を備 えている。データベースは、 CDや DVDのような外部記録媒体によって提供されても よい。
[0034] 実施例 4
図 5は、実施例 1と同様にして得た、良性腫瘍の場合におけるパラダイムパターンで ある。表現型 ThlZTh2ZTh3反応、細胞内在型 ThlZTh2ZTh3反応のいずれ においても、 Th3の割合が少ないことが分かる。即ち、既述のグレーティングの評価と Th3の割合の評価によって、悪性腫瘍と良性腫瘍の区別を Th反応のパラダイムバタ ーンカゝら可能になることが分かる。なお、悪性腫瘍および良性腫瘍の場合のパラダイ ムパターンにお 、て、 Thlに対して Th2の値が増加して!/、る点にお!、て共通するも のの、 Th3の値については、後者のものが前者のものに比較して顕著に小さくなつて いることがわかる。すなわち、 Thlに比較して Th2が大きい場合に腫瘍の存在が疑わ れ、 Th3の値が大きいことによって悪性腫瘍の存在が疑われる。さら〖こ、良性腫瘍の 場合、各 Th反応のパラダイムパターンを表現型および内在型で比較すると、表現型 のものでは Th3では、基準線より上に相関係数の値が位置しているのに対して、内 在型ものでは基準線より下に相関係数の値が位置している。悪性腫瘍の場合は、 Th 3の相関係数の値は表現型および内在型とも基準線より上に位置している。これによ つても、悪性腫瘍および良性腫瘍の区別が可能となる。
図面の簡単な説明
[0035] [図 1]表現型 TH1Z2Z3 (無刺激群）におけるサイト力イン産生の割合をビジュアル 化したグラフである。
圆 2]細胞内在型 TH1Z2Z3 (刺激群）におけるサイト力イン産生の割合をビジユア ルイ匕したグラフである。
圆 3]各 Th反応の相関係数と基準線戸の関係を示す特性図である。
圆 4]各 Th反応の結果の測定値に基づいて、疾患の予測、診断を自動化するコンビ ユータシステムのブロック図である。
[図 5]良性腫瘍における、各 Th反応のパラダイムパターンを示したものであり、（1)は 表現型のパラダイムパターンであり、 (2)は内在型のパラダイムパターンである。

Claims

請求の範囲
[I] 哺乳動物の Thl、 Th2、及び Th3の各細胞内のサイト力インを測定する工程と、各 サイト力インのパラダイムパターンを求める工程と、パラダイムパターンと疾患とを関連 付ける工程と、を備える、哺乳動物のサイト力インの分析方法。
[2] 前記パラダイムパターンに基づ 、て、特定疾患に罹患する可能性を決定する請求 項 1記載の方法。
[3] 前記パラダイムパターンと特定疾患の予防又は治療を関連付ける請求項 1又は 2 記載の方法。
[4] 前記 Thl、 Th2、及び Th3のサイト力インが順番に、主としてインターフェロン一 γ
、インターロイキン一 4、 TGF- β である請求項 1記載の方法。
[5] 前記 Thl、 Th2、及び Th3の少なくとも一つのあるいは複数の Th反応を制御する 薬剤を投与する工程を含む請求項 1記載の方法。
[6] 前記サイト力インを測定する工程は、体液中と細胞内の前記サイト力インを測定する 工程を備える、請求項 1記載の方法。
[7] 前記サイト力インを測定する工程は、表現型 Th反応と細胞内在型 Th反応を測定 する工程を備える、請求項 1記載の方法。
[8] 前記パラダイムパターンに、レドックス制御、 TGF- β 1の活性化の行程の評価結 果、 ΝΚ及び Ζ又は ΝΚΤ細胞活性の測定値の少なくとも一つを組み合わせて、疾患 を関連付ける請求項 1の方法。
[9] レドックス制御が表現型あるいは細胞内在型 TGF- |8 に規定される前記 Th3反応 を調整する請求項 1又は 3記載の方法。
[10] 哺乳動物の Thl、 Th2、及び Th3の各サイト力インを測定する第 1工程と、測定値 をコンピュータに入力する第 2工程と、コンピュータを用いて各サイト力イン反応のパ ラダィムパターンを求める第 3工程と、前記パラダイムパターンをモニタに表示するェ 程と、コンピュータの演算手段力 当該パラダイムパターンと、予めメモリに記憶され た、各疾患に於ける既知のパラダイムパターンとを比較する第 4工程と、を備える、哺 乳動物のサイト力イン、 Th反応の型ならびに感染症などの病態の分析方法。
[I I] コンピュータの演算手段が、前記比較の結果、測定されたパラダイムパターンの図 示化から、測定対象個体の疾患或!、は疾患の病態とその治療 ·方法を特定する第 5 工程を備える請求項 10記載の方法。
[12] Th反応が変化する疾患、とくに Thl/2/3病に対する Thl/2反応のパターンとレド ックス制御、 Thl/2/3反応のパターンによりクロストークすることと、これに基づいた治 療法。
[13] Th3サイト力インである表現型 TGF- |8 の増加と異常な上昇の確認と、これに関連 した Th3反応の優位性 (増強）、さらにレドックス制御の偏重固定化、その結果誘導さ れる細胞内型 Thl反応と Th2反応のアンバランスならびに反応性の低下に基づくテ 一ラーメイド療法の評価方法。
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