KR20030060768A - 면역조절제 - Google Patents

면역조절제 Download PDF

Info

Publication number
KR20030060768A
KR20030060768A KR1020027012952A KR20027012952A KR20030060768A KR 20030060768 A KR20030060768 A KR 20030060768A KR 1020027012952 A KR1020027012952 A KR 1020027012952A KR 20027012952 A KR20027012952 A KR 20027012952A KR 20030060768 A KR20030060768 A KR 20030060768A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
immune
hcg
nmpf
cells
peptides
Prior art date
Application number
KR1020027012952A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100800876B1 (ko
Inventor
니사 아메드 칸
로베르트 베너
Original Assignee
에라스무스 유니베르시테이트 로테르담
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에라스무스 유니베르시테이트 로테르담 filed Critical 에라스무스 유니베르시테이트 로테르담
Publication of KR20030060768A publication Critical patent/KR20030060768A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100800876B1 publication Critical patent/KR100800876B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Abstract

본 발명은 면역학 분야에 관한것으로, 더욱 특별하기는 알러지, 자가면역 질환 이식관련 질환 또는 염증성 질환과 같은 면역-중개 장해 분야에 관한 것이다. 본 발명은 특히 면역조절제(NMPF), 면역-중개 장해를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하는데 있어서 NMPF의 용도, 약제학적 조성물 및 면역-중개 장해를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

면역조절제{IMMUNOREGULATOR}
면역 시스템은 염증약, 미생물 침입, 또는 부상으로 공격받았을 때 숙주를 방어하기 위하여 사이토킨 또는 다른 체액 성분을 생산한다. 대부분의 경우, 이러한 복합적 방어 네트워크는 정상적인 생체 항상성을 성공적으로 회복하지만, 어떤 경우 면역-매개체들이 숙주에 해로운 것이 실제로 증명될 수 있다. 면역 질환 및 면역 시스템-중개 질환의 어떤 예는 과민성 쇼크, 자가면역 질환, 및 면역 복합 질환을 포함하여 광범위하게 조사되고 있다.
체액성 및 세포성 면역학, 분자 생물학 및 병리학에서의 최근의 발전은 면역-중개 질환의 성분이 되는 자가 면역에 대한 최근의 사고에 영향을 주어왔다. 이들 발전은 항체, B-세포, 및 T-세포 다양성, 선천적인(단핵세포, 대식세포, 과립구, 자연 킬러 세포, 비만 세포, γδT 세포, 보체, 급성기 단백질 등) 그리고 적응성인(T 및 B 세포 및 항체) 또는 세포성 및 체액성 면역 반응 및 이들의 상호 의존성, (자가)-내성 유발 및 자가-항원적 성분에 대항하여 면역 반응성을 일으키는수단의 생성의 기본적 측면에 대한 우리의 이해를 증가시켰다.
1900년 이후, 면역학의 중심적 견해는 면역 시스템이 일반적으로 자가와는 반응하지 않는다고 하였다. 그러나, 최근에는 자가-면역 반응이 이전에 생각되었던 것 만큼 드문 일이 아니며, 모든 자가-면역 반응이 해롭다는 것이 분명해졌다; 어떤 반응은 일반적으로 면역 반응을 매개하는데 분명한 역할을 한다. 예를 들어, 자가 유전형에 대한 항-유전형적 반응 및 주요 조직적합유전자 복합체(MHC)에 의하여 코드화된 세포 표면 항원의 인식과 같은 자가-면역 반응의 특정형이 원래의 면역 시스템의 일반 역할과 다양성을 위하여, 실제로 반드시 중요하다.
분명, 확인과 균형의 정교한 시스템은 면역 시스템의 세포(즉, T 세포)의 다양한 서브세트 사이에서 유지되어, 외부 침입자에 대처할 수 있는 면역 시스템을 개체에게 제공한다. 이러한 의미에서, 자가-면역은 면역 시스템에서 조절 역할을 한다.
그러나, 비정상적 자가-면역 반응은 많은 인간 및 동물 질환에 종종 일차 원인이고 어떤 경우는 2차적 원인이 된다는 것이 또한 현재 인식되기도 한다. 자가-면역 질환의 형태는 종종 중복되고, 하나 이상의 자가-면역 질환은 동일 개체, 특히 자가-면역 내분비증을 갖는 이들에게 일어나는 경향이 있다. 자가-면역 증후군은 림프의 과형성(lymphoid hyperplasia), 악성 림프구 또는 플라즈마 세포 증식, 및 하이포-감마글로불린혈증, 선택적 Ig 부족 및 보체 성분 결핍증과 같은 면역결핍 질환을 매개할 수 있다.
일부가 명명된 전신성 루푸스 홍반증(systemic lupus erythematosus), 당뇨병, 류마티스성 관절염, 분만 후 갑상선 기능 장애, 자가-면역 혈구감소증 (thromocytopenia)와 같은 자가-면역 질환은 널리 분포된 자가-항원성 결정체, 또는 기관- 또는 조직- 특이적 항원에 대항하여 유발되는 자가-면역 반응으로 특징지워진다. 이러한 질환은 단 하나의 항원성 표적 또는 많은 자가 항원에 대항하여 비정상적 면역 반응을 일으킬 수 있다. 많은 경우, 자가-면역 반응이 비개질 자가-항원 또는 바이러스, 박테리아성 항원 및 합텐성 기와 같은 다양한 요인 중 어떤 것에 의하여 개질된(또는 닮은) 자가-항원에 대항하여 유발되는지 아닌지는 분명하지 않다.
아직까지 다양한 자가-면역 질환의 발병학 및 기원을 설명하기 위한 일관된 개념이 정립되지 않았다. 실험 동물에 대한 연구는 자가-면역 질환이 한 개체와 다른 개체 사이에서 다른 유전적 및 면역적 비정상성의 광범위한 스펙트럼으로부터 기인하고, 많은 중복된 외인성(바이러스, 박테리아) 또는 내인성(호르몬, 사이토킨, 비정상 유전자) 자극 인자의 존재 또는 부재에 따라 생애의 초기 또는 후기에 스스로 발현될 수 있다는 생각을 지지한다.
베이(bay)에서 주된 자가면역 질환을 유지하는 유사한 체크 및 균형은 알러지(천식)와 같은 면역-중개 질환, 패혈증 또는 패혈성 쇼크와 같은 급성 염증성 질환, 만성 염증성 질환(즉, 류마티스 병, 쇼그렌 증후군, 다중 경화증), 이식 관련 면역 반응(조직이식 대 숙주 질환, 수혈 후 혈소판 감소증), 및 기타 다른 질환과 또한 타협하고, 원인 항원(적어도 처음에는)은 자가 항원이 될 수 없지만, 상기 항원에 대한 면역 반응은 개체에 해로우며 주로 바람직하지 않다. 패혈증은 예를 들어 미생물 침입, 상처, 또는 다른 요인을 통하여 유발되는 면역 반응이 비정상적 체내 항상성, 기관 손상 및 결과적으로 치명적 쇼크를 이끄는 염증의 급성 상태를 유도하는 증후군이다. 패혈증은 심각한 감염의 전신성 반응에 관한 것이다. 패혈증 환자에게는 일반적으로 열, 빈맥, 백혈구증, 및 국지적인 감염 부위가 나타난다. 혈액 또는 감염 부위로부터 미생물 배양은, 비록 단일하지는 않지만, 종종 양성이다. 이 증후군이 저혈압 또는 다중 기관 시스템 실패(MOSF)를 일으킬 때, 상황을 패혈증 또는 패혈성 쇼크라고 부른다. 초기에는, 미생물이 감염 병소에서 증식한다. 이 개체는 혈류에 침입할 수 있고, 양성 혈액 배양을 일으키거나, 국지적으로 성장하고, 혈류 내에 다양한 물질을 방출할 수 있다. 병원성 특성이 두가지 기본 분류로 나뉘어질때 이러한 물질들은: 내인성 독소 및 외인성 독소이다. 내인성 독소는 LPS와 같은 그람 음성 유기체로부터 나온 내인성 독소 또는, 포도상 구균으로부터 나온 항원 테이코산과 같은 미생물의 구조적 성분을 이루는 것이 일반적이다. 외인성 독소(예: 독성 쇼크 증후군 독소-1, 또는 포도상 구균성 장독소 A, B, 또는 C)는 합성되어 미생물에 의하여 직접 방출된다.
이들의 이름에 나타난 바와 같이, 박테리아성 독소의 이러한 두 가지 형태는 플라즈마 단백질 전구체 또는 세포(단핵세포/대식세포, 내피세포, 중성백혈구, T 세포, 및 기타)로부터 다수의 내인성 숙주-유도 면역-매개체의 방출을 자극하는 병원성 효과를 가진다.
사실 패혈증 또는 패혈성 쇼크와 관련된 조직 및 기관 손상을 일으키는 이들 면역-매개체는 일반적이다. 이들 효과 중 일부는 기관에 대하여 직접 매개체-유발된 상처로부터 나온다. 그러나, 쇼크-관련-기관 기능장애의 일부는 아마도 혈관계내 매개체-유도 비정상성 때문일 것이며, 그 결과 전신 또는 일부의 혈액 흐름을 비정상이 되고, 면역적 저혈압 또는 MOSF이 유발된다(Bennett 등).
비-비만 당뇨병(NOD) 마우스는 자가-면역 질환, 이 경우 주된 임상적 특징이 상승된 혈중 포도당 농도(다당증)인 인슐린-의존성 당뇨병(IDDM)을 위한 모델이다. 상기한 상승된 혈중 포도당 농도는 췌장의 랑게르한스 섬 내 인슐린-생산 β세포의 자가-면역 파괴에 의하여 유발된다(Bach 등 1991, Atkinson 등 1994). 이는 CD4+ 및 CD8+ T 림프구, B 림프구, 대식세포, 및 수상돌기 세포의 이종성 혼합물로 이루어진 섬(인설리티스)을 침투하여 둘러싸는 대량의 세포성 침입에 의하여 동반된다(O'Reilly 등, 1991).
NOD 마우스는 IDDM의 발전에서 베타 세포에 대한 자가 면역이 주된 현상인 모델이다. 당뇨병 발생은 인간 질환에서와 같이, 단일한 MHC 클래스 II 유전자와 다중, 비연결, 유전적 좌위 사이의 다중인자성 상호작용을 통하여 조정된다. 또한, NOD 마우스는 유전과 환경 사이 및 1차와 2차 자가 면역 사이의 임계적 상호작용을 잘 나타내고, 그 임상적 징후는 예를 들어 다양한 외부적 상황에 따라, NOD 마우스가 수용된 환경의 미생물 부하에 가장 중요하게 의존된다.
NOD 마우스에서 나타날 수 있는 자가-면역에 있어서, 대부분의 항원-특이성 항체 및 T 세포 반응은 이들 항원이 당뇨병 환자에서 자가-항원으로 감지되었던 이후에 측정된다. NOD 당뇨병에서 이들 자동 항원이 하는 역할을 이해하는 것은 부수 현상인 병원성 자가-항원과 자가-면역 사이를 더 구별하게 할 수 있다.
일반적으로, T 림프구는 면역-중개된 질환 과정을 개시하는 데 중추적인 역할을 한다(Sempe 등 1991, Miyazaki 등 1985, Harada 등 1986, Mikino 등 1986). CD+4 T 세포는 적어도 두 개의 주요한 하위세트 Th1 및 Th2로 나뉠 수 있다. Th2 세포가 IL-4, IL-5, 및 IL-10을 생산하는 반면, 활성화된 Th1 세포는 IFN-γ및 TNF-α를 분비한다. Th1 세포는 효율적인 세포성 면역을 일으키는 것을 중요하게 포함하지만, Th2 세포는 호산구 및 비만 세포의 활성화와 IgE 생성을 포함하여 체액성 및 점막성 면역 및 알러지의 생성에 도움이 된다(Abbas 등, 1996). 다수의 연구가 마우스와 인간에서 당뇨병이 Th1 표현형 발전과 연관되어 있다고 한다(Liblau 1995, Katz 1995). 반면, Th2 T 세포는 비교적 무독성으로 보여진다. 사실, Th2 T 세포가 방어적일 수 있고(Katz 등), TCR 그 자체에 의하여 특이적으로 인식되는 항원은 갖지 않지만, 그러나, T 세포 반응의 표현형적 특성을 갖는 순수한 수용체에 당뇨병을 전달하는 CD+4 T 세포의 능력을 나타낸다는 것이 일부에서 고려되어 왔다. 강하게 극성화된 Th1 T 세포는 NOD 신생아 마우스로 병을 전달하는 반면, 당뇨병 생성의 Th1 T 세포군과 같은 TCR을 활성화시키고 이를 가짐에도 불구하고, Th2 T 세포는 그렇지 않았다. 더욱이, 동시 전달될 때, Th2 T 세포는 10배 과량으로 동시에 전달될 때 조차도, Th2 T 세포는 Th1-유도된 당뇨병을 개선할 수 없었다(Pakala 등, 1997).
패혈증 또는 패혈성 쇼크의 발생은 1930년대 이후 증가되어 왔고, 모든 최근의 증거는 이러한 상승세가 지속될 것이라는 것을 제안한다. 이러한 증가적 발생의 이유는 많다: 혈관내 카테테르와 같은 침입적 장치의 사용 증가, 암과 이식을 위한세포 독성적 및 면역 억제적 약물 요법의 광범위한 사용, 패혈증이 발전될 경향을 갖는 암 및 당뇨병 환자의 수명 연장, 및 항생제-내성 유기체에 기인한 감염의 증가. 패혈증 또는 패혈성 쇼크는 집중 보호 단위에서 사망의 가장 흔한 원인이며, 미국 내에서 13번째 흔한 사망 원인이다. 보고될 수는 없었기 때문에 질환의 정교한 발생이 알려져 있지는 않다; 그러나, 미국에서 합리적인 연도별 평가에는 400,000건의 패혈증 발병, 200,000건의 패혈성 쇼크 환자, 및 이 질환으로부터 100,000건의 사망이 있다.
그램-음성 및 그램-양성 세균, 및 균류와 같은 다양한 미생물 개체는 패혈증 및 패혈성 쇼크를 일으킬 수 있다. 어떤 바이러스와 리케차는 아마도 유사한 증후군을 일으킬 수 있을 것이다. 그램-양성 유기체와 비교하여, 그램-음성 박테리아는 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 좀 더 잘 일으킬 것이다. 감염의 어떤 부위도 패혈증이나 패혈성 쇼크가 일으날 수 있다. 패혈증의 주된 원인은 신우신염, 폐렴, 복막염, 담관염, 봉와염, 또는 수막염이다. 이들 감염의 대부분은 다른 의학적 문제때문에 입원한 환자에게서 일어나는 병원성이다. 정상적인 숙주 방어를 갖는 환자에게, 감염부위는 대부분의 환자에게서 밝혀진다. 그러나, 피부 또는 장 내에서 작은 임상적으로 불분명한 감염이 적절한 순환성 호중구가 없는 혈액 침입을 이끌 수 있기 때문에, 호중구 감소 환자에게서 임상적 감염 부위는 패혈증 환자의 반 미만에서 발견된다. 분명, 이러한 위험을 겪는 환자는 패혈증 또는 패혈성 쇼크에 대항하여 방어할 필요가 있다.
최근 치료법이 효과적일 것 같을 경우, 임상적 과정에서 패혈증 환자를 초기에 발견하기 위한 상당한 노력이 시도되고 있다. 정의는 기관 시스템 기능장애(심장 혈관의, 호흡계의, 신장의, 간의, 중앙 신경계의, 혈액적, 또는 대사 이상적)의 증거와 함께 감염(열, 빈맥, 빈호흡, 백혈병)에 대한 전신성 반응의 징후를 구체화하였다. 가장 최근의 정의는 패혈증이 감염성 뿐 아니라 외상 및 췌장염과 같은 비감염성 질환에 의하여도 촉진될 수 있는 체내의 면역-중개된 염증 반응의 한 예라는 것을 강조하는 전신성 염증 반응 증후군(SIRS)이라는 용어를 사용한다(전신성 염증 반응(SIRS), 패혈증, 및 감염 사이의 상호 관계를 위해서는, Crit. Care Med. 20:864, 1992를 참고; 패혈증과 패혈성 쇼크에서 진행의 병원성 배열을 검토하기 위해서는 N Engl J Med 328:1471, 1993 참고).
독성 쇼크 증후군 독소(TSST-1)는 독성 쇼크 증후군 환자의 90% 이상에서 원인 약물로 동정되는 임상적으로 가장 관련있는 외부 독소를 나타낸다(독성 쇼크가 초-항원적 외부독소에 의하여 유발되는 패혈증 또는 패혈성 쇼크로 정의된다). 초 항원은 MHC 분자상에 나타나기 전, 세포적 가공을 요구하지 않는다는 점에서 "규칙적인" 항원과는 다르다. 대신, 이들은 TCR의 외부 상 반(semi)-보존된 영역과 결합하고, MHC 클래스 II 상에 나타난 자가 항원의 잘못된 "인지"를 일으킨다. 이는 T 세포와 APC 모두의 "거짓된(false)" 활성을 일으켜서, 효과기 역할 및 사이토킨 분비의 증식, 활성화를 이끈다. T 세포의 초항원의 폴리크로날 활성에 기인하여, 과량의 염증성 사이토킨 방출때문에 전신성 광범위한 쇼크가 일어난다(Huber 등, 1993, Miethke 등 1992).
패혈증에 포함되는 염증성 사이토킨은 유사하다. 이들 면역적 매개체는 종양괴사 인자(TNF), 인터페론 감마(IFN-감마), 산화 질소(Nox), 인터루킨 1(IL 1)이며, 이들은 박테리아성 독소에 반응하여 단핵세포, 대식세포, 및 다른 백혈구에 의하여 대량으로 방출된다(Bennett 등, Gutierrez-Ramos 등, 1997). TNF 및 다른 내인성 매개체의 방출은 열, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 혈액 동태 변화, 퍼뜨려진 정맥내 응집과 같은 패혈증에서 여러가지 병적 생리 반응 뿐 아니라 백혈구 침투 및 다양한 기관의 염증을 일으킬 수 있고 이들 모두는 결국 사망에 이르게 할 수 있다. TNF는 또한 내피 세포가 유착 수용기(셀렉틴)를 발현하게 하고, 중성 백혈구를 활성화시켜 조직 염증성 병소로 부착, 변연추향(margination), 및 이동하기 위한 내피 세포 표면과 유착하는 중성 백혈구를 도우는 이들 수용기를 위한 리간드를 발현할 수 있다(Bennett 등). 모노크로날 항체로 유착 진행을 막는 것은 조직 손상을 방지하고, 패혈증의 특정 동물 모델에서 생존률을 증가시킨다(Bennett 등).
자가-면역 질환 뿐 아니라 급성 및 만성 염증성 질환과 함께 이러한 발견은 활성화된 Th-하위 개체군 사이의 균형을 조절하는 세포의 요구된 존재를 증명한다. 이러한 조절 T 세포 개체군의 수정된 반응성으로 유도되는 이러한 균형의 가능한 방해는 면연-매개된 질환을 일으킬 수 있고, 이는 특정한 임계적 중요 사이토킨의 과생산 또는 부재를 나타낸다(O'Garra 등, 1997). 이들 Th-하위 개체군은 면역반응의 제약적 조절을 위한 잠재적 표적이다.
일반적으로, 면역-중개된 질환은 치료하기 어렵다. 종종, 코티코스테로이드 또는 여러 모로 치료되는 개체에 해가 될 수 있는 모든 다른 광범위 작용 항염증제로 치료하는 것과 같이 광범위-작용 약제가 처리된다.
일반적으로, 면역-중개된 질환을 치료하고 면역 시스템의 균형 및 체크를 조절하는 더 나은 그리고 더 특이적인 가능성이 필요하다.
본 발명은 면역학 분야에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 알러지, 자가 면역 질환, 이식 관련 질환 또는 염증성 질환과 같은 면역-중개 질환 분야에 관한 것이다.
도 1은 NMPF (Pregnyl) 시료의 마이크로스피어 GPC 300 A 크로마토그램을 도시한다. 세개의 선택된 영역, 외관상으로 >25kDa의 분자량으로 용출하는 NMPF-1, 외관상으로 25kDa~6kDa 사이의 분자량으로 용출하는 NMPF-2, 및 외관상으로 <6kDa의 분자량으로 용출하는 NMPF-3으로 분획되었다.
도 2는 마이크로스피어 GPC 300 A 컬럼으로부터 얻어진 NMP-3의 마이크로스피어 GPC 60 A 크로마토그램을 도시한다. 세개의 선택된 영역, 외관상으로 >2000 Da의 분자량으로 용출하는 NMPF-3.1, 외관상으로 2000~300 Da 사이의 분자량으로용출하는 NMPF-3.2 및 외관상으로 300 Da 미만의 분자량으로 용출하는 NMPF-3.3으로 분획되었다. 모든 분획은 항-쇼크 활성에 관한 시험을 하였다.
도 3은 PBS-처리된 BALB/c 마우스들이 고-용량 LPS 주입후 1일부터 쇼크사하여 5일째에 살아있는 마우스는 10% 이하임을 보여준다. 대조적으로, Pregnyl 공급원으로부터 유래된 NMPF 또는 GPC 300 A 컬럼으로부터 얻어진 분획 NMPF-1 또는 NMPF-2로 처리된 마우스들은 5일째에 100% 생존하였고 (P<0.001), 반면에 Pregnyl 공급원으로부터 유래된 NMPF-2 또는 덱사메탈손 (데이터는 도시되지 않음)으로 처리된 마우스들의 군은 약25%의 생존을 나타내었다. 모든 상업적 hCG 제제가 NMPF 활성을 나타내는 것은 아니었다; 예를들면, Profasi 공급원으로부터 유래된 NMPF는 단지 부분적인 항-쇼크 활성을 보였다 (약 40% 생존).
도 4는 분획 NMPF-3 및 쇼크를 저해하는 그것의 유도된 NMPF-3.2 분획이 존재하는 예비시험된 활성 배스에서 쇼크 유발 24시간 및 36시간 후의 항-쇼크 활성을 도시한다. 그리고 NMPF-3.2 분획 단독으로 처리된 마우스들은 모두, 패혈성 쇼크가 저해되고 2 미만의 병 득점(sickness score)을 가졌고, 반면에 NMPF-3.2 분획의 이 항-쇼크 활성은 NMPF-3.3에 의해 저해되었다. NMPF-3.3 단독 처리는 쇼크를 가속화하였고 처리된 마우스들은 PBS 처리된 마우스들 보다 훨씬 일찍 죽었다.
도 5는 첫번째 임신 3개월째의 소변(항-쇼크 활성을 갖는)에서 유래된 수집된 NMPF-3.2 및 NMPF-3.3 분획의 마이크로스피어 GPC 60A 크로마토그램을 도시한다. 이 도면은 분획 NMPF-3.2과 NMPF-3.3 분획의 비가 1:2.2임을 보여준다.
도 6은 비-활성 Pergnyl 배스(항-쇼크 활성이 갖지않는)에서 유래된 수집된NMPF-3.2 및 NMPF-3.3 분획의 마이크로스피어 GPC 60A 크로마토그램을 도시한다. 이 도면은 분획 NMPF-3.2과 NMPF-3.3 분획의 비가 1:3.4임을 보여준다.
도 7은 활성 Pergnyl 배스(항-쇼크 활성이 갖는)에서 유래된 수집된 NMPF-3.2 및 NMPF-3.3 분획의 마이크로스피어 GPC 60A 크로마토그램을 도시한다. 이 도면은 분획 NMPF-3.2과 NMPF-3.3 분획의 비가 1:1임을 보여준다.
도 8은 스플리노사이트의 LPS 유도된 증식을 도시한다. 항-MIF 및 NMPF (활성 Pregnyl 배스로부터, NMPF-PG*)은 둘다 LPS 자극된 증식을 LPS 단독일때에 비하여 감소시킬 수 있고, 그리고 이것들은 함께 LPS 자극된 증식에 상호의존적인 저해 효과를 보인다.
도 9는 NMPF-A(APL)는 LPS 유도된 증식을 가속화하는 반면에, 이 증식은 항-MIF 및 NMPF-G*에 의해 저해됨을 도시한다.
도 10은 완전 NMPF-PG+뿐만아니라 활성 Pregnyl 배스 (NMPF-PG*)로부터 유래된 저분자량 분획(NMPF-PG3)도 NMPF-A 가속화된 LPS 유도된 증식을 저해할 수 있음을 보여준다.
도 11은 NMPF-PG-(비-활성 Pregnyl 배스) 및 NMPF-A는 또는 조합하여 (상호의존적으로), LPS 유도된 증식을 증가시키는 반면에, NMPF-PG*는 항-MIP와 동일하게 이 증식을 저해함을 보여준다 (도 8~9 참조).
도 12는 NMPF-K는 NMPF-PG-와 동일하에 LPS 유도된 증식을 가속화시키는 반면에, 이들의 조합은 상호의존적으로 증식을 증가시키고 그리고 증식에서 이 증가는 NMPF-kb 또는 NMPF-PG*로 저해된다는 것을 보여준다. 그리고, NMPF-kb 또는 NMPF-PG*는 상호의존적으로 LPS 유도된 증식을 감소시킨다.
도 13~15는 LPS 및 패혈성 쇼크 환자로부터 단리된 PBMC의 PHA/IL-2 유도된 증식에 대한 NMPF-PG+의 용량 의존적(300 및 600 IU/ml) 저해 효과를 보여준다. 일부 효과는 단독 배지 조건에서 관찰되었다.
도 16은 c-hCG의 마이크로스피어 GPC 60A 크로마토그램을 도시한다. 세개의 선택된 영역, 외관상으로 >10kDa의 분자량으로 용출하는 60A-F1, 외관상으로 10 kDa~1 kDa 사이의 분자량으로 용출하는 60A-F2, 및 외관상으로 1 kDa 미만의 분자량으로 용출하는 60A-F3으로 분획되었다. 모든 분획은 항-쇼크 활성에 관해 시험되었다.
도 17은 c-hCG의 G25 Superdex 크로마토그램을 도시한다. 100ml 분획을 수집하고 (분획 I-VII) 모든 분획들을 항-쇼크 활성에 관해 시험하였다.
도 18은 건강한 개인으로부터 유래된 첫번째 임신 3개월째 소변의 G25 Superdex 크로마토그램을 도시한다. 100ml 분획을 수집하고 (분획 I-VII) 모든 분획들을 항-쇼크 활성에 관해 시험하였다.
도 19는 PBS 처리된 마우스들에 비하여 LPS로 생체내 처리는 MIF 생성을 증가시키는 반면에, 쇼크 유발후 펩티드 1 처리는 MIF 생성을 저해했다. MIF 생성에 대한 효과는 펩티드 1 단독 처리된 마우스들에서는 없는 것으로 확인되었다.
도 20은 생체외에서 LPS로 재자극후, LPS 처리된 마우스들로부터 유래된 스플리노사이트는 PBS 처리된 마우스들에 비하여 생체외에서 더 좋은 증식력을 가짐을 보여준다. 반면에, LPS + 펩티드 1 및 LPS + c-hCG-V 처리된 마우스들로부터 유래된 스플리노사이트는 LPS 처리된 대조구 마우스들에 비하여 훨씬 더 높은 증식력을 보였다. PBS, 펩티드 1 또는 c-hCG-V 단독 처리된 마우스들에서 LPS 유도된 증식의 차이는 관찰되지 않았다.
도 21은 다른 용량의 LPS로 생체내 처리된 마우스들로부터의 스플리노사이트의 생체외 재자극의 효과를 보여준다.
도 22는 PBS + LPS 대주구 군과 비교하여, 쇼크 저해 활성은 (c-hCG, 펩티드 1, 펩티드 4 및 펩티드 6) CD19 세포들 상의 CD80 분자의 발현을 증가시켰고, 반면에 펩티드 7은 쇼크를 가속화한다는 소수의 효과가 관찰되었다.
도 23~28은 처리된 BALB/c 마우스들로부터의 스플리노사이트에 관한 유동세포계수 분석을 보여준다.
도 29~31은 hCG 및 c-hCG는 293-hLHRwt/CREluc 세포에 결합하고 용량-의존적 루시페라제 활성을 유도하는 (도 29) 반면에, 펩티드 1(VLPALPQVVC), 2(LQGVLPALPQ), 4(LQGV), 6(VLPALP) 및 저분자량 분획 c-hCG-V는 루시페라제 활성에는 어떠한 영향도 없었음(도 30)을 보여준다. 또한, hCG의 존재하에 펩티드 1, 2, 4, 6 및 분획 c-hCG-V의 첨가는 또한 hCG 자체에 의해 유도된 루시페라제 활성에 대해서는 영향을 나타내지 않았다 (도 31).
도 32는 TH1 편광 조건하에서 발견된 60A-F2(c-hCG) 및 rhCG 단독의 IFN-감마 생성의 적당한 저해가 있는 반면에, Th1 세포의 성장은 rhCG 및 60A-F3(c-hCG)의 조합으로 완전히 방해되었다.
도 33~34는 c-hCG, 및 60A-F1으로 처리된 NOD 마우스들로부터의 항-CD3 자극된 스플리노사이트는 생체외에서 더 적은 증식력을 갖는다는 것을 보여준다. 게다가, 60A-F3(IR-P3) 및 rhCG 처리된 마우스들로부터의 스플리노사이트는 PBS 처리된 대조구 마우스들 (CTL)에 비하여 더 높은 증식력을 갖는 반면에, rhCG와 조합한 60A-F3(IR-P3)은 c-hCG 및 60A-F1(IR-P1)과 동일하게 증식을 감소시켰다 (도 34). 적당한 효과는 60A-F2 처리된 NOD 마우스들로부터의 스플리노사이트의 항-CD3 자극된 증식에서 확인되었다.
도 35~36은 PLP + PTX에 의해 유도된 EAE 모델에서 60A-F1(IR-P1), 60A-F2(IR-P2) 및 60A-F3(IR-P3)의 효과를 도시한다. 또한 도 36은 EAE(MS)의 만성 질환 모델인 PLP/B. 백일해에 의해 유도된 EAE 마우스 모델에서 c-hCG로부터의 c-hCG 및 6-A-F3 분획으로 마우스들의 처리한 효과를 보여준다.
발명의 요약
본 발명은 hCG의 비뇨기계 대사체로부터, 특히 b-hCG의 니크된(nicked) 형태로부터 유도되거나 얻어질 수 있는 면역조절자(NMPF) 또는 이들의 (합성) 펩타이드 동족체 또는 유사체를 제공한다(Birken 등, Endodrinology, 133:1390-1397, 1993). 놀랍게도, 베타-HCG 분해 생성물의 범위는 작용의 주체와 함께 면역 조절자(NMPF)의 케스케이드를 제공한다는 것이 발견되었다. 보다 더 놀라운 것은, 상기 면역 조절자가 서로로부터 유도되고 상호 관련이 있다는 것이다. 본 발명은 면역-중개된 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하는 데 있어서 이러한 NMPF의 용도, 약제학적 조성물, 및 면역-중개된 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 여기 개시된 면역-중개된 질환은 당뇨병 I 또는 II형, 류마티스성 질환, 쇼그렌 증후군, 다중 경변과 같은 만성 염증성 질환, 조직이식 대 숙주 질환, 수혈 후 혈소판 감소증, 만성 이식 거부반응과 같은 이식-관련 면역 반응, 자간전증(pre-eclampsia), 아테로마성 동맥경화증, 천식, 알러지, 만성 자가-면역 질환, 및 (과)급성 이식 거부반응, 패혈성 쇼크, 및 급성 자가면역 질환과 같은 급성 염증성 질환을 포함한다. 자가면역 질환은 일반적으로 알려지지 않은 병인학의 질환 그룹이다. 이들 질환 대부분에서, 자가반응성 항체 및/또는 자가반응성 T 림프구의 생성이 발견될 수 있다. 자가면역 반응은 바이러스성 또는 박테리아성 감염의 발현으로 또한 나타날수 있고, 간염 B 바이러스 감염에 기인한 파괴적인 간염과 같은 심각한 조직 손상을 일으킬 수 있다.
발명의 상세한 설명
자가면역 질환은 반응이 특정 기관에 위치한 항원에 대항하는지 또는 광범위하게 분산된 항원에 대항하여 주로 일어나는지에 따라 기관 특이성 또는 기관 비특이성으로 분류될 수 있다. 자가면역 질환의 치료에 대한 현재의 주요 지지자는 면역 억제 및/또는 (조직손상 때문에) 호르몬 대용요법과 같은 생체 성분의 대용이다. 그러나, 스테로이드나 세포정지제와 같은 면역 억제제는 심각한 부작용을 가지므로 적용이 제한된다. 이제, 자가면역 질환 및 다른 염증의 치료에 더 특이적인 면역조절 약제를 사용하는 것이 본 발명에 의하여 입증된다. Th1/Th2의 비를 조절하기 위한, 수상돌기 세포 분화를 조절하기 위한 능력과 같은 면역 조절에 기초하여, 면역-중개된 염증, 이러한 자가면역 질환을 갖는 환자의 치료에서 매우 도움이될 수 있는 이들의 비뇨기 대사체의 제조 또는 이들의 합성 동족체를 보여준다.
면역 질환의 비제한적 예는 다음을 포함한다:
하시모토 갑상선종, 근원적 점액수종, 중독성 갑상선종, 악성 빈혈, 자가면역 위축성 위염, 애디슨 병, 조기 폐경, 인슐린의존성 당뇨병, 경직 증후군, 굿파스퇴르 증후군, 근무력증, 남성 무정자증, 천포창 불가리스(pemphigus vulgaris), 유천포창(pemphigoid), 교감신경계 안염, 수정체 포도막염, 다중 경화증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판 감소 자반병, 특발성 백혈구 감소증, 근원적 답즙 경변증, 활성 만성 간염, 특발성 경변증, 궤양성 대장염, 쇼그렌 증후군, 류마티스성관절염, 피부근염, 다근염, 공피증, 혼합 연결 조직 질환, 원판상 루푸스 홍반증, 및 전신성 루푸스 홍반증.
한 구현예에서, 본 발명은 Th1 세포 수준 하향 조절 및/또는 Th2 세포 수준의 상향 조절을 할 수 있는, 동물 내 이들의 상대적 비에 영향을 주는 면역조절자를 제공하는데, 상기 조절자는 또는 혈청, 유장, 태반 추출물, 세포 또는 조직과 같은 소변 또는 체내 생성물의 다른 출처로부터 얻어질 수 있다. 여기서 얻어질 수 있다는 것은 상기 출처로부터 상기 NMPF를 직접적으로 또는 간접적으로 얻는 것을 말하며, NMPF는 천연 동물 또는 식물 출처로부터 또는 화학적 합성을 통하여 얻어질 수도 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 병든 동물(예: 인간)에서 림프구의 사이토킨 활성 및/또는 상대적인 비, 수상돌기 또는 항원발현 세포 서브세트를 조절할 수 있고, 바람직하게는 이들 림프구 서브세트는 Th1나 Th2, 또는 DC1나 DC2 군으로 이루어진다. 일반적으로, 순수한 CD4+ 헬퍼 T 림프구(Th)는 항원-발현 세포(APC)에 의하여 주요 조직적합유전자 복합체(MHC) 클래스 II 분자에 발현되는 연관 항원 펩티드로 자극될 때 기능적으로 성숙한 효과기 세포로 발전된다. 생성된 사이토킨의 특징적인 세트에 기초하여, Th 세포는 적어도 두개의 다른 하위개체군으로 일반적으로 나뉜다: Th1 세포는 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-감마(IFN-γ), 및 림프독소를 배타적으로 생산하는 반면, Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13을 생산한다. 이들 Th1 및 Th2 서브세트는 사이토킨 생성 프로필 내에 그리고, 이들 극성화된 서브세트 내에 극단적으로 나타나며, 개별적 Th 세포는 배위된 사이토킨 유전자 발현보다는 더 분화되어 발현된다. 이들 서브세트는 IL-2, IL-4, IL-5, 및 IFN-γ를 포함하는 사이토킨 배열을 생성하는 Th0 세포로 관련있는 펩티드를 유발한 후 일반적인 Th 전구체 세포(Thp)로부터 분화된다. 이들 활성화된 Th0 세포는 이들 미세 환경의 세포성 및 사이토킨 조성물에 기초하여 Th1 또는 Th2 방향으로 연속적으로 분극된다. 대식세포의 서브세트에 더하여 수상돌기 세포의 다양한 서브세트처럼 항원발현 세포는 주로 Th1 또는 Th2 서브세트 분화로 이들 분극을 결정한다. Th1-Th2 서브세트는 주로 IFN-γ및 IL-10을 통하여, 서로의 사이토킨 생성 프로필을 교차 조절하는 것 같고, 이러한 개념으로부터 이들 두 서브세트 사이의 균형 방해는 다른 임상적 발현을 일으킬 수 있다는 것을 합리화한다[5]. IL-12는 Th1 서브세트 분극화를 촉진하는 우세 인자이며, 수상돌기 세포 및 대식세포는 IL-12를 생산한다. 또한, IL-12는 자연 킬러(NK) 세포 및 T 세포에 의하여 IFN-γ생산을 유도한다. 최근, IL-18이 Th1 발전을 유도하는 IL-12와 상승작용한다는 것이 보고되었다. Th2 세포의 분극화는 비만 세포 및 호염기성 세포 또는 T 세포에 의하여 생산되는 IL-4의 존재에 중요하게 의존한다. APC-유도된 IL-6는 Th 세포를 분화시킬 때, IL-4 소량을 유도하는 것으로 나타나기도 한다. IL-10 및 APC-유도 프로스타글란딘 E2(PGE2)는 IL-12 생산 및 Th1 프라이밍을 방해한다.
Th1-Th2 패러다임은 세포 매개된 면역(염증성 반응, 지연형 과민성, 및 세포 독성)을 갖는 Th1 세포의 역할, 및 체액성 면역을 갖는 Th2 세포의 역할을 연결하는데 유용하였다. 일반적으로, 감염성 질환 중 박테리아, 균류, 및 프로토조아에대한 내성은 성공적인 Th1 반응을 개시하는 것과 관련된다. Th1 반응은 관절염, 대장염, 및 다른 염증 상태와 같은 병리학과 연결될 수도 있다. 연충과 같은 세포 외부적 병원균에 대항하는 효과적인 방어는 대부분 Th2 반응을 요구하고, 향상된 체액성 면역은 특이 항체의 생성에 의하여 병원균의 성공적인 중성화를 일으킬 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 수상돌기 세포 분화를 조절할 수 있는 면역조절자를 제공한다. Th1 대 Th2 형 세포의 선택적 성장은 이들의 MHC 클래스 II 분자와 관련하여 연관 펩티드를 운반하는 항원-발현 세포(APC)를 갖는 Th 세포 전구체의 상호 작용에 의존한다. 수상 돌기 세포와 적절한 T 세포 수용기 운반 T 세포 사이의 초기 상호작용 동안 나타나고 APC에 의하여 방출된 사이토킨은 Th1 대 Th2 서브세트로 분화를 유도한다. 최근에는, DC(골수 대 림프)용 두개의 다른 전구체가 인간에게 나타났다. 골수성 전구체로부터 DC1의 선택적 분화는 CD40 리간드 또는 내인성 독소로 자극된 후 일어나고, IL-12의 생산을 높이게 된다. 림프성 전구체는 CD40 리간드 자극 후 DC2 세포를 발생시키고, IL-1, IL-6, IL-10을 생산한다. 이들 사이토킨은 활성화된 Th 세포의 분화를 유도하는데 가장 중요하고: Th1 형 세포의 선택적 분화는 IL-12의 생산에 배타적으로 의존되는 반면, IL-4는 IL-10의 존재로 급격히 향상될 수 있는 Th2 형 세포의 성장을 위하여 요구된다. DC1이 IL-12의 생산에 의하여 특징지워지기 때문에, DC2가 IL-10을 생산하고, 외부 IL-4의 존재하에서 Th2 분화를 선택적으로 촉진하는 반면, DC1은 주로 Th1 형 세포 성장을 유도할 것이다. 본 발명에 의하여 제공된 NMPF가 DC 활성 및 분화를 조절하고바꿀 수 있으므로, Th1 및/또는 Th2 세포의 선택적 분화 및 활성을 가능하게 한다는 것을 여기서 알 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 포유류 융모막 생식선자극호르몬 제제로부터 얻을 수 있는 활성성분으로 이루어지는 면역 조절자를 제공하는데, 상기 활성 성분은 비-비만 당뇨병(NOD) 마우스로부터 얻어지는 스플레노사이트(splenocyte)를 자극할 수 있으며, 또는 당뇨병 또는 예를 들면, 여기 상세한 설명에 나타난 바와 같은 만성 이식 거부반응과 같은 만성 염증의 경우, 상기 활성 화합물과 기능적으로 관련된, 예를 들면 DC 활성 및 분화를 조절하거나 바꿀 수 있거나, Th1 및/또는 Th2 세포의 선택적 분화 및 활성이 가능하도록 하는 활성 성분으로 이루어지는 면역 조절자를 제공하는데, 상기 자극된 스플레노사이트는 상기 스플레노사이트와 재구성된 NOD-심각성-결합-면역 결핍 마우스에서 당뇨병의 개시를 지연시킬 수 있거나, 상기 활성성분은 비-비만 당뇨병(NOD) 마우스로부터 얻어지는 스플레노사이트의 감마-인터페론 생산을 방해할 수 있으며, 또는 상기 활성성분은 비-비만 당뇨병(NOD) 마우스로부터 얻어지는 스플레노사이트의 인터루킨-4를 자극할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 포유류 융모막 생식선자극호르몬 제제로부터 얻을 수 있는 활성성분으로 이루어지는 면역 조절자를 제공하는데, 상기 활성 성분은 지질다당류 유도된 패혈성 쇼크에 대항하여 마우스를 보호할 수 있으며, 쇼크나 (과)급성 이식 거부반응에서 보여지는 바와 같은 급성 염증의 경우 상기 활성성분은 DC 활성 및 분화를 조절하거나 바꿀 수 있거나, Th1 및/또는 Th2 세포의 선택적 분화 및 활성이 가능하도록 하고, 상기 활성성분은 쇼크에서 일반적으로 보여지는 바와 같은 기관 실패 후 또는 동안 ASAT 또는 다른 관련 플라즈마 효소 농도를 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따른 상기 면역 조절자가 비록 비뇨기계의 생식선자극호르몬 대사체 또는 소변으로부터의 파괴 생성물로서 쉽게 얻어지지만, 예를 들어 상기 포유류 융모막 생식선자극호르몬 제제는 소변으로부터 유도되는데, 생식선자극호르몬으로 이루어지는 조직, 세포, 및 혈청과 같은 다른 출처가 마찬가지로 적용될 수 있다. 또한, 상기 출처로부터, 수상 돌기 세포 분화를 조절할 수 있고 그리고/또는 Th1 및/또는 Th2 세포 활성을 조절할 수 있는 등 본 발명에 따른 면역 조절자가 제공된다. 특히, 면역조절자로서, (합성) 펩티드는 베타-HCG, 바람직하게는 니크된 베타-HCG로부터 유도되어 얻을 수 있다. 물론, 이러한 펩티드 또는 이들의 기능적 등가물이 상기한 바와 같이 다른 포유류 생식선자극호르몬으로부터 얻어지고 유도될 수 있다. 상기 펩티드는 패혈성 쇼크 또는 다른 면역-중개된 질환에 대항하여 방어할 수 있다. 바람직하게는, 상기 펩티드 면역조절자는 아미노산 서열 MTRVLQGVLPALPQVVC를 갖는 펩티드, 이들의 기능적 단편(예: 파괴 생성물) 또는 기능적 유사체와 같은 적어도 10개의 아미노산을 갖는 펩티드로부터 얻어진다. 여기서 기능적 단편은 예를 들면, 패혈성 쇼크 또는 NOD 마우스 실험 모델에서 측정될 수 있기 때문에 면역 조절 효과나 활성에 관련된다. 단편은 기능적 활성을 제공하는 반면, 하나 또는 양 측에 더 작거나 더 큰 무언가(즉, 1 또는 2 아미노산)가 있을 수 있다.
본 발명은 또한 당뇨병의 징후를 나타내기 쉬운 동물에게 펩티드 조성물 또는 그것의 단편을 제공함에 의해 면역조절제의 치료적 효과를 결정하고, 상기 동물에서 당뇨병의 발전을 확인하는 것으로 이루어지는 면역조절제의 선택방법을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 패혈성 쇼크의 징후를 나타내기 쉬운 동물에게 펩티드 조성물 또는 그것의 단편을 제공함에 의해 면역조절제의 치료적 효과를 결정하고, 상기 동물에서 패혈성 쇼크의 발전을 결정하는 것으로 이루어진 면역조절제의 선택방법을 제공하며, 패혈성 쇼크 모델은 항-당뇨 활성을 결정하기 위한 신속한 판독-출력 모델이다. 바람직하기는, 본 발명에 따른 방법에서 시험되는 펩티드 조성물은 아미노산 서열 MTRVLQGVLPALPQVVC을 갖는 펩티드 또는 그것의 단편(예를 들면 파괴 생성물) 또는 그것의 유사체와 같은, 적어도 10개의 아미노산을 갖는 펩티드로부터 얻는다.
본 발명의 기능적 단편은, 예를 들면 패혈성 쇼크 또는 NOD 마우스 당뇨병 실험모델에서 측정될 수 있으므로, 면역조절제의 효과 또는 활성과 관련된다. 단편들은 한쪽 또는 양쪽에서 다소(예를 들면 1 또는 2개의 아미노산) 작거나 또는 클 수 있다. 놀랍게도, 본 발명에서 제공된 바와 같은 동물시험 시스템에서 베타-HCG 파괴 생성물의 범위가 펩티드 면역조절제의 캐스케이드에 기능의 숙주를 제공한다는 것이 발견되었다. 더욱 놀랍기는, 상기 면역조절제 펩티드는 서로 관련있고 서로로부터 유도되며 그리고 합성으로 생성될 수 있다. 본 발명은 면역-중개질환의 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 이와 같은 면역조절 펩티드의 용도, 약제학적 조성물 및 면역-중개 질환의 치료방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법에서 발견된 유용한 펩티드는 펩티드 합성의 당업자에 의해, 예를 들면, 대체 유전지도작성법에 의한 기능적 유사체의 확인, 또는 결합-부위(PEPSCAN) 검출법등과 같은 방법에 의해, 하나 이상의 특징에서 추가로 변형되거나 개선될 수 있고, 원하는 서열의 하나 이상(또는 모든)의 위치에 D- 또는 L- 아미노산 또는 변형 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 펩티드 유도체들은 (예를 들면 (터미날)시스테인의 제공에 의한) 순환, 다이머화(dimerisation) 또는 멀티머화에 의해, 라이신 또는 시스테인 또는 연결 또는 멀티머화를 허용하거나, 반복되거나, 세로로 일직선의 배열을 가져오거나, 또는 그렇지 않으면 오직 해리를 허용하는 불안정한 연결에 의해서라면, 다른 부-사슬에 연결됨에 의해 제조될 수 있다. 물론, 새롭게 전개된 펩티드 조성물 또는 유도체들은 본 발명에 제공된 방법에 따라 시험될 수 있다.
본 명세서의 기능적 유사체는 MIF 또는 MIF-류 단백질, LH 또는 PMSG, 또는 글리코실화 또는 미확인 아미노산 또는 비-단백질 아미노산으로 변형됨 의해 변형되는 생식선자극 호르몬 류의 단백질과 같은 유사체 또는 동족체와 관계있을 뿐만 아니라, 당업자들에 의해, 예를 들면 대체 유전지도 작성법, PEPSCAN 검출법 등에 의한 기능적 유사체에 의해 제조될 수 있고, D- 또는 L- 아미노산 또는 원하는 서열의 하나 이상의(또는 모든) 위치에서 변형된 아미노산을 포함할 수 있는 펩티드 합성법에 의해 제조될 수 있는 합성 펩티드 유사체와 관련된다. 또한, 펩티드는 (터미날)시스테인의 제공에 의해 순환될 수 있고, 라이신 또는 시스테인 또는 연결 또는 멀티머화를 허용하는 다른 부-사슬에 연결됨에 의해 다이머화되거나 또는 멀티머화되고, 반복되어 세로로 일직선으로 배열되고, 그렇지 않으면 해리를 허용하는 불안정한 연결에 의해서, 본 분야의 케리어에 연결될 수 있다.
바람직하기는, 본 발명에서 제공되는 면역조절제는 임신한 포유류, 바람직하기는 인간의 생식선자극 호르몬으로부터 얻거나 유도될 수 있고, 예를 들면, 임신한 암말의 혈청에서 발견되는 임신 암말 혈청 생식선자극호르몬(PMSG), 또는 임신중의 마우스의 자궁으로부터 추출한 수태 마우스 자궁 추출물(PMUE), 또는 임신부의 혈액 또는 소변에서 발견되는 인간 융모막 생식선자극 호르몬(hCG 또는 HCG)과 같은 생신선자극 호르몬을 함유하도록 제조된 약제학적 제제로부터 얻을 수 있다. 본 발명에서 제공된 바와 같이 NMPF는, 예를 들면 임신 초기 3개월의 소변 및 면역조절 효과를 갖는 시판 hCD 제제(NMPF)에 존재하는 바와 같은 생식선 자극 호르몬과 관련될 수 있고 또는 관련없을 수도 있다.
특히, NMPF는 자가-면역 및 급성 및 만성 염증성 질환을 억제 또는 조절할 수 있다. TNF 및 IFN-감마 질환 패혈증 또는 패혈성 쇼크와 같은 급성 염증성 질환 및 자가면역 및 만성 염증성 질환에 병리적으로 포함된다. NMPF는 T-세포 하위 개체군을 조절하고 TNF와 IFN-감마를 억제할 수 있는 능력을 가지므로, NMPF는 패혈증 또는 패혈성 쇼크와 같은 면역 조절제 질환 뿐만 아니라, 전신계 홍반성 낭창, 당뇨병, 류마티스성 질환, 쇼그렌 증후근, 다중 경화증, 분만후 갑상선 기능장애 및 알츠하이머와 같은 갑상선 기능장애 관련 치매, 알러지 및 만성 염증성 질환과 같은 자가면역 혈소판 감소증 및 기타, 이식관련 면역반응을 처치, 억제 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
더우기, 본 발명은 면역-중개 질환의 유전적 소인의 검출을 제공하며, HCG 또는 HCG 유도 펩티드 중에 특정 이소포름 또는 아미노산 이형을 갖는 개체는 상기유전적 소인에 의해 특정 질환에 걸리기 쉽다. 일단 유전적 소인이 알려지면, 본 발명에 의해, 유전적으로 특정질환에 걸리기 쉬운 개체인에게 유전자 치료법을 통해 알맞는 펩티드 면역조절제를 제공하게 된다.
특히, 본 발명에 따른 면역조절제가 제공되며, 여기서 상기 기능적 단편은 아미노산 서열, LQGVLPALPQVVC(β45+ β48), 또는 VLPALPQVVC(β48) 또는 LQGVLPALPQ(β 45)를 갖는 것과 같은 적어도 10개의 아미노산을 갖는 펩티드 또는 본 명세서에서는 NMPF-K로 불리는, 그것의 기능적 단편을 포함한다.
적어도 10개의 아미노산(및 특히 시스테인을 통해 또 다른 베타-HCG 단편에 결합될 때와 같이 더 큰 분자에 결합될 때)의 원하는 길이를 갖는 상기 펩티드(또는 펩티드들의 혼합물)를 포함하는 상기 면역조절제는 일반적으로 면역-중개 질환중 선천성 면역성 뿐만 아니라 Th1/Th2 균형을 조절한다. 예를 들면, 패혈성 쇼크, 스플레노사이트의 LPS 유도 증식 또는 당뇨병이 가속되거나 또는 악화된다. 유사 활성이 MTRV 또는 MTR 또는 QVVC 또는 VCC 또는 CLQG 또는 LQGV 또는 LQG을 포함하는 (및 특히 그것의 시스테인을 통해 또 다른 베타-HCG 단편에 결합될 때와 같이 더 큰 분자에 결합될 때) 상대적으로 짧은 사슬 펩티드(제 3의 면역 조절제, 3-5 아미노산 길이)에 의해 제공된다.
더욱 특별히, 본 발명은 아미노산 서열 VLPALPQVVC 또는 LQGVLPALPQ 또는 그것의 기능적 단편을 포함하며, 또 다른, 본 발명에 따른 제 2의 면역조절제의 조절 활성을 방해하는, 제 1의 면역조절제를 제공하며, 여기서 상기 기능적 단편은 9 내지 6의 아미노산(NMPF-K로 칭함), 예를 들면 VLPALPQ 또는 GVLPALPQ 또는 GVLPALP또는 VLPALP 또는 그것의 기능적 유사체인 아미노산 서열로 이루어지며, 이것은 예를 들면, 면역-중개 장해 동안 선천성 면역 뿐만 아니라 Th1/Th2 균형을 조절할 수 있으므로, 면역-중개 질환의 증상을 가속시키거나 또는 악화시키는 대신, 패혈성 쇼크, 스플레노사이트의 LPS 유도 증식 또는 당뇨병과 같은 면역-중개 장해로 나타나는 임상적 증상을 감소시킬 수 있고, 예를 들면, 상세한 설명에 나타낸 바와 같이, NMPF-X는 당지방질 유도 패혈성 쇼크 또는 본 명세서에 설명된 바와 같은 다른 급성 또는 만성 면역-중개 장해로부터 마우스를 보호할 수 있다. β45와 β48 펩티드(β45; LQGVLPALPQ, β48: VLPALPQVVC) 사이에 오버랩이 있기 때문에, 본 발명자들은 BALB/c 마우스에서, LPS 유도 증식(인비트로) 및 항-쇼크 활성(인비보)에 대한 변성 β45+β48 (LQGVLPALPQVVC) 펩티드의 효과를 조사하였다. 그 결과는 변성 β45+β48 펩티드가 LPS 유도 증식과 인비보 패혈성 쇼크를 억제함을 나타낸다. 파괴 생성물은, 예를 들면, 백혈구 엘라스타제에 의한 용해와 같이, 단백질분해를 통해 발생하며, (글루타티온) 전이효소의 활성에 의해 추가 발병될 수 있다. β45+β48 펩티드의 가능한 하나의 파괴 생성물은 글루타티온 (L-시스테인의 아미노 부분과 결합된 이소펩티드를 갖는 L-글루타메이트를 갖는 G, C 및 Q의 트리펩티드)과 닮은 LQG이다. 본 발명자들은 NMPF가 또한 베타-세포의 파괴를 통해 마우스의 (독소) 스트렙토조토신(SZ)유도 당뇨병을 억제한다는 것을 나타내었다. 췌장 베타세포의 파괴에 포함되는 매카니즘 하나는 반응성 라디칼(ROS, NO 등)의 형성이며, 이것은 신장병, 폐쇄성 신장병, 급성 및 만성 신장 타가이식 거부, 자가면역 질환(SLE, 류마티스성 관절염, 당뇨병, MS 등), AIDS, 맥관형성관련 질환, 아테롬성 동맥경화증, 혈전증 및 II형 진성당뇨병과 같은 많은 다른 질환의 발병에도 중요한 역할을 한다. 그러므로, NMPF는 또한 "항-산화제'의 역할을 한다. 예를 들면, LQG 또는 CLQG 펩티드 단독과 같은 β45+β48의 파괴 생성물 또는 어느 탄수화물과의 결합물 또는 미확인 아미노산에 의한 또는 β-알라닌, γ-아미노부틸산, 오르니틴 등과 같은 비단백질 아미노산과의 결합물은 면역조정 활성(NMPF)을 갖는다..
이론에 구속됨 없이, NMPF-K 및 NMPF-Kb 활성은 Th1/Th2 균형을 유지하고, 그것에 의해 NMPF-K가 적당한 수용체에 결합되는 것처럼 작용하지만 그것을 활성화시키지 않는 반면, NMPF-Kb는 상기 수용체에 결합되지만 그것을 활성화하여, 유리한 방법으로 Th1/Th2 균형을 조절한다고 설명될 수 있다.
NMPF-K와 NMPF-Kb는 동일한 두 리간드거나 또는 적어도 구조적으로 유사하거나 또는 똑같은 수용체 분자이다. 상기 수용체 분자 및 그 활성은 상기 리간드에 의해 본 명세서에 정의되므로, 상기 수용체 분자 역시 본 발명에서 제공된다.
예를 들면, 본 발명의 결과는 NMPF-Kb가 내인성 독소에 의해 또는 외인성 독소에 의해 발병하는 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 억제한다는 것을 나타낸다. 본 발명에 의해 제공되는 NMPF-kb는 면역-중개 자가면역질환, 급성 염증성 질환 뿐만 아니라 만성 염증성 질환을 억제하거나 또는 중화시킨다.
본 발명은 알러지, 자가면역질환, 이식관련 질환 또는 급성 또는 만성 염증성 질환과 같은 면역-중개질환 치료용 약제학적 조성물을 제공하며 및/또는 예를 들면, 생후 20주의 암컷 비-비만성 당뇨병(NOD) 마우스로부터 얻은 스플레노사이트를 자극할 수 있는 상기 활성 성분을 포함하는 임파구 작용을 자극 또는 조절하기위한 면역조절제(NMPF)를 제공하며, 상기 자극된 스플레노사이트는 생후 8주에 상기 스플레노사이트로 재구성된 NOD-심각성-결합-면역결핍(NOD.scid) 마우스에서 당뇨병의 개시를 연기시키거나, 또는 그것에 기능적으로 관련된 활성 성분들을 포함한다.
한 구현예에서, 본 발명은 약제학적 조성물 또는 면역조절제를 제공하며, 여기서 상기 활성성분은 감마-인터페론의 생성을 억제하거나 생후 20주의 암컷 비-비만성 당뇨병(NOD) 마우스로부터 얻은 스플레노사이트의 인터로틴-4 생산을 자극할 수 있다. hCG와 PMSG와 같은 생식선 자극 호르몬의 임상적 등급 생산은 포상 증식 또는 배란 촉진이 요구되는 상황에서 생식감퇴 치료를 돕기 위해 사용된다. 상기 제제는 일반적으로 혈청 또는 소변로부터 얻어지며, 종종 혈청 또는 소변중의 초기 농도에 따라 및 사용되는 제제의 여러 방법에 따라, 순도 및 상대적 활성이 변한다.
특별한 구현예에서, 본 발명은 포유류 CG 제제로부터 얻을 수 있거나 유발될 수 있는 활성성분을 포함하며, 상기 활성성분은 비-비만성 당뇨(NOD) 마우스로부터 얻은 스플레노사이트를 자극하고, 또는 상기 활성성분과 기능적으로 관련된 활성성분을 포함하는 면역조절제를 제공하며, 예를 들면, 상기 자극된 스플레노사이트는 상기 스플레노사이트로 재구성된 NOD-심각성-결합-면역결핍(NOD.scid) 마우스에서 당뇨병의 개시를 연기시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 활성성분이 비-비만성 당뇨(NOD) 마우스로부터 얻은 감마-인터페론 생산을 억제할 수 있는 면역조절제를 제공한다. 또한, 본 발명은 활성성분이 비-비만성 당뇨(NOD) 마우스로부터 얻은 스플레노사이트의 인터로킨-4 생산을 자극할 수 있는 면역조절제를 제공한다.
본 발명에 따라 제공되는 면역조절제는 면역조절 효과를 갖는다. 특히, NMPF는 자가면역 및 급성- 및 만성-염증성 질환을 억제하거나 조절한다. TNF와 IFN-감마는 패혈증 또는 패혈성 쇼크와 같은 급성 염증성 질환 및 급성-면역 및 만성 염증성 질환에 병리적으로 포함된다. NMPF가 T-세포 하위 개체군을 조절할 수 있고 TNF와 IFN-감마를 억제할 수 있는 능력을 가지므로, NMPF는 전신홍반성 낭창, 당뇨병, 류마티스성 관절염, 분만후 갑상선 기능장애, 자가면역 혈소판 감소증 뿐만 아니라 패혈증 또는 패혈성 쇼크와 같은 면역조절이상 및 알러지, 만성 염증성 질환(류마티스성 질환, 소그렌 증후군, 다중 경화증 등) 및 이식관련 면역반응등을 치료, 억제 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 NMPF-Kb가 내독소 또는 균체외독소에 의해 야기되는 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 억제한다는 것을 나타낸다. 본 발명에 의해 제공되는 NMPF-Kb는 면역 중재 자가면역 질환, 급성 염증성 질환 뿐만 아니라 만성 염증성 질환을 억제하거나 또는 예방한다.
그러므로 본 발명은 면역-중개-질환 치료용 약제학적 조성물을 생성하기 위한 본 발명에 따른 면역조절제의 용도를 제공한다. 예를 들면, 여기서 상기 면역-중개 질환은 예를 들면, 당뇨병, 다중 경화증 또는 만성 이식거부 등과 같은 만성 염증을 포함하며, 상기 면역-중개 질환은 패혈증 또는 아나필락성 쇼크 또는 급성 또는 과급성 이식 거부등과 같은 급성 염증을 포함하며, 여기서 상기 면역-중개 질환은 전신 홍반성낭창 또는 류마티스성 관절염과 같은 자가면역 질환을 포함하며,상기 면역-중개 질환은 천식, 기생충 질환과 같은 알러지를 포함하며, 특히, 여기서 상기 면역-중개 질환은 바이러스 또는 박테리아과 같은 감염제를 향하는 매우 강한 면역 반응을 포함하거나, 또는 여기서 상기 면역-중개 질환은 자간전증 또는 다른 임신관련 면역-중개 질환을 포함한다. NMPF-K의 피임약으로의 용도(예를 들면, 성교후 복용하는 피임약 또는 접종된 암컷 포유류에서 피임을 얻거나 또는 항체를 불임화하는 피임용 백신) 제공된다. NMPF-Kb의 용도는 생식을 촉진하는데, 특히 향상된 이식이 요구될 때 제공된다. 특히 상기 처치가 선천성 면역성 및/또는 상대적 비 및/또는 임파구, 수지상 또는 처치된 개체에서 세포 서브세트 개체군을 나타내는 항원의 사이토킨 활성의 조절을 포함하는 용도가 제공되며, 특히 여기서 상기 서브세트 개체군은 Th1 또는 Th2, 또는 DC1 또는 DC2 세포를 포함한다. 그러므로, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 면역 조절제로 동물을 처치하는 것을 포함하는 면역-중개 장해를 처치하는 방법을 제공하며, 특히 여기서 상기 장해는 당뇨병과 패혈증을 포함한다.
또한, 본 발명은 NMPF-K 및 NMPF-Kb의 불균형으로 설명되는 Th1/Th2 불균형과 관련된 비-임신 관련 면역 장해의 위험을 진단 또는 확인하는 방법을 제공하며, 예를 들면, 뇌하수체 유도 생식선자극 호르몬으로부터 생산 또는 유도되며, 특히 자가면역 및 만성 염증성 질환, 예를 들면 II형 당뇨병과 같은 노화-관련 질환, 류마티스성 질환, 치매, 알츠하이머 등의 갑상선 기능장애 관련 정신질환, 및 아테롬성동맥경화증 및 관련 질환이며, 상기 방법은 샘플, 바람직하기는 혈액 또는 소변 샘플 중에서 비교적 긴-사슬 펩티즈 대 비교적 짧은 사슬 펩티드의 상대비를 결정하는 것을 포함하며, 여기서 상기 펩티드는 베타-HCG의 분해로부터 유발되고, 특히 아미노산 서열 MTRVLQGVLPALPQVVC를 갖는 펩티드의 분해로부터 유도된 비교적 긴-사슬 펩티드 대 비교적 짧은 사슬 펩티드의 상대비를 결정하는 것을 포함하며, 예를 들면, 여기서 상기 비교적 긴사슬 펩티드는 아미노산 서열 LQGVLPALPQ 또는 GVLPALPQ 또는 VLPALPQ 또는 GVLPALP 또는 VLPALP를 포함하며, 특히 여기서 비교적 짧은 사슬은 MTRV 또는 MTR 또는 PALP 또는 QVVC 또는 VVC 또는 LQGV 또는 LQG를 포함한다. 글리코실화 또는 미확인 아미노산 또는 비-단백질 아미노산에 으한 변형에 의한 변화된, 상기 긴-사슬 펩티드와 짧은 사슬 펩티드의 검출은 바람직하기는 선행기술의 면역원성 검출법에 의해 달성된다.
또한, 본 발명은 자간전증과 같은 임신관련 면역-중개된 장해, 또는 다른 면역-중개 장해의 위험을 진단 또는 결정하는 방법을 제공하며, 임신 및/또는 임신관련 면역 장해(예를 들면 임신중 진성당뇨병)를 샘플, 바람직하기는 소변 샘플에서 비교적 긴-사슬 펩티드 대 비교적 짧은 사슬 펩티드의 상대비를 결정하는 것을 포함하며, 상기 펩티드는 베타-HCG의 분해로부터 유도되며, 특히 아미노산 서열 MTRVLQGVLPALPQVVC를 갖는 펩티드의 분해로부터 유도된 비교적 긴-사슬 펩티드 대 비교적 짧은 사슬 펩티드의 상대비를 결정하는 것을 포함하며, 예를 들면, 여기서 상기 비교적 긴-사슬 펩티드는 아미노산 서열 LQGVLPALPQ 또는 GVLPALPQ 또는 VLPALPQ 또는 GVLPALP를 포함하며, 특히 여기서 비교적 짧은-사슬 펩티드는 MTRV 또는 MTR 또는 QVVC 또는 VVA 또는 LQGV 또는 LQG를 포함한다.
일화적 관찰과 실험실 연구는 hCG는 항-카포시 육종 및 항-인간-면역결핍-바이러스 효과를 가질 수 있다는 것을 나타낸다(treatment Issues, Luly/August 1995, Page 15). hCG 제제는 인비트로 및 면역결핍성 환자 및 마우스에서 카포시 육종에 대한 직접 아포독성(세포독성) 효과를 가지며 면역결핍성 환자에게서 prohematopoetic 효과를 가지며(Lunardi-Iskandar et al., Nature 375, 64-68; Gill et al., New. Eng. J. Med. 335, 1261-1269, 1996; US patent 5677275), 및 인간 및 유인원 면역 결핍 바이러스(HIV 및 SIV)에 대해 직접 억제 항 바이러스 효과를 갖는다는 것이 관찰되었다(Lunardi-Iskandar et al., Nature Med. 4, 428-434, 1998; US patent 5700781). 상기 세포독성과 항-바이러스성 효과는 또한 hCG의 임상적 등급 제제에 존재하는 알려지지 않은 hCG 매개인자(HAF)에 기여한다. 그러나, 상업적 hCG 제제(예를 들면, CG-10, Steris Profasi, Pregnyl, Choragon, Serono Profasi, APL)는 여러가지 효과를 갖는다. 예를 들면, 이들중 몇몇의 분석은 (AIDS, 11:1333-1340, 1997) 예를 들면, 오직 몇몇 만이(CG-10, Steris Profasi) KS-killing인 반면, 나머지 (Pregnyl, Choragon, Serono Profasi)는 아니라는 것을 나타낸다. 두번째로, (α 또는 β)hCG의 재조합 서브유니트는 킬링되지만 온전 재조합 hCH는 킬링되지 않는다. 킬링효과(killing effect)는 임파구에서도 나타나는 것을 발견하였다. KS 치료법은 그것의 항-종양 효과를 위해 베타-hCG에 집중되었고(Eur. J. Med Res.21:155-158, 1997), 소변에서 분리된 베타-핵 단편이 KS 세포에 대한 가장 높은 아포독성 활성을 갖는다는 것이 보고되었다(AIDS, 11: 713-721, 1997)
최근, Gallo et al.은 인간 융모막 생식선자극 호르몬 (hCG)의 임상 등급 원제제의 항-카포시 육종, 항-HIV, 항-SIV 및 분명한 조혈효과를 보고하였다 (Lunardi-Iskandar et al.,1995; Gill et al., 1996; Lunardi-Iskandar et al.,1998).
그들의 이전의 연구와는 반대로, hCG 제제의 항-종양 및 항-바이러스성 활성은, 그것의 정제된 서브유니트 또는 그것의 주요 변성산물, β-핵을 포함하여 본래의 hCG 헤테로다이머 때문이 아니라; 아직 미확인된 hCG 매개인자(HAF)중의 활성부분 잔류물 때문임을 주장한다. 진정한 인자가 무엇이든지 간에, 여러 hCG 제제에서 이들 미확인 인자들은 아포독성의 선택적 유도를 통해 항-종양 활성을 가지며, 그외에 종양세포에 대한 직접 세포독성 효과를 갖는다. 더우기, 이들은 단핵세포를 갖는 종양의 침투가 없으므로 항-종양 활성이 면역-중개반응 때문이 아니라고 가정한다.
또한, 임상등급 hCG의 pro-hematopoietic 효과는 HIV 감염된 인간에 대한 임상연구에서 언급되었고(Lunardi-Iskandar et al.,1998), 이것은 조혈효과는 부수적이며, 그렇지 않으면 hCG의 항-HIV 활성을 통해 HIV에 의해 치사된 CD4+세포들의 회복에 의해 야기된다는 것을 나타낸다.
본 발명은 hCG 제제 또는 그것으로부터 유도되는 단편으로부터 얻을 수 있는 면역-중개 장해를 치료하기 위한 면역조절제 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 면역조절제의 효과는 세포독성 또는 항-바이러스성 효과 대신, (말초 임파구, 흉선세포 또는 스플레노사이트에서 발견되는 것과 같은) 임파구 개체군에 대한 자극효과를 포함한다. 본 발명은 동물을, 적어도 하나의 임신한 포유류로부터 얻을수 있는 면역조절제로 처치하는 것으로 이루어지는 면역-중개 장해를 처리하는 방법을 제공한다. 상기 처치는 예를 들면 상기 개체에, hCG 또는 PMSG 제제와 같은, 본 발명에서 제공되는 면역조절제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면 소변 또는 혈청 또는 (모계 또는 태아로부터 기원되는) 태반 또는 다른 조직 또는 세포들을 샘플링하고, 본 분야에서 알려진 분획법(예를 들면, 겔 투과 크로마토그래피법)으로 상기 소변 또는 혈청 또는 조직 또는 세포로부터 상기 활성성분을 포함하는 면역조절제를 제조하고, NOD 마우스 또는 그것의 스플레노사이트를 자극함에 의해 그것의 활성성분을 시험함으로써, 임신한 동물로부터 유도되는 분획 또는 분획들을 갖는 상기 약제학적 조성물을 제공하는 것이 가능하다. 특히, 상기 제제 또는 성분은 임신한 동물로부터 유도되는 것이 바람직한데, 그것은 태아는 그것의 모체와 어쩌면 치명적인 면역학적 충돌에도 불구하고 생존해야하기 때문이다: 적에 의한 면역공격을 일으킴 없이 자궁내의 필수적인 외부조직으로서 발육된다. 따라서, 이 거부반응 "타가이식"을 막기 위해, 모체와 태아간의 면역학적 상호작용은 예를 들면, 모체 임파구에 대한 태아-항원 태위의 결핍으로 인해 또는 모체 임파구의 기능적 "억제"에 의해 억제되어야 한다. 태아 항원이 존재한다면, 모체 면역 반응은 덜 해로운, 항체-매개 T 헬퍼 2(Th2) 형으로 기울것이다. 이것은 임신한 여성이 압도적으로 감염에 영향을 받기 쉽다는 것을 제안하나, 이것은 사실이 아니다. 임신부 개체는 감염에 대한 그들의 내성을 유지하거나 또는 심지어 증가시킨다. 더우기, 상기 개체가 일반적으로 남성 개체보다 면역 질환, 특히 자가면역질환에 더 걸리기 쉽지만, 임신중 그들은 이들 질환에 더 내성을 갖는다.
또한, 본 발명은 면역-중개 장해의 치료를 위해, 임파구의 인비트로 자극 방법 및 약제학적 조성물로서 상기 자극된 임파구를 동물에게 전달하는 방법을 제공한다. 특히 본 발명의 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 면역조절제를 갖는, 인비보에서 자극된 임파구를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 장해로는 당뇨병이 포함되며, 다른 면역-중개 장해, 예를 들면 급성 및 만성 염증도 치료될 수 있다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 장해는 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 포함한다. 본 발명은 동물을 처치하는 방법을 제공하며, 바람직하기는 여기서 동물은 인간이다.
특별한 구현예에서, 본 발명의 방법은 추가로 상기 동물 중에서 상대비 및/또는 사이토킨 활성 또는 사이토킨 발현 또는 임파구, 수지상 또는 항원 제공 세포 서브세트-개체군의 마커 발현을 조절하는 것을 포함하며, 서브세트-개체군은 Th1 또는 Th2 세포 또는 Th3 또는 Th8 세포, 또는 DC1 또는 DC2 세포 또는 다른 대사인자 또는 제어기 T-세포 개체군을 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에서 사용하기 위한 면역조절제, 및 바람직하기는 알러지, 자가면역질환(예를 들면, 전신 홍반성낭창, 류마티스성 관절염 등), 이식관련 질환 및 급성(패혈증 또는 아니필락성 쇼크 또는 급성 또는 과급성 이식거부 등) 및 만성 염증성 질환(아테롬성 동맥경화증, 당뇨병, 다중 경화증 또는 만성 이식거부 등)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역-중개 장해를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 생산하기 위한, 바람직하기는 임신중인 포유동물에서얻을 수 있는 상기 면역조절제의 용도를 제공한다. 더우기, 본 발명은 상기 면역-중개 질환이 천식 또는 기생충 질환등의 알러지를 포함하는 본 발명에 따른 용도, 또는 상기 면역-중개 질환이 바이러스 또는 박테리아과 같은 감염제를 향하는 매우 강한 면역 반응을 포함하는 본 발명에 따른 용도를 제공한다. 종종 이들 질환중 대부분에서, 자동반응 항체 및/또는 자동반응 t-임파구의 생산이 상승되거나 너무 강한 면역반응의 일부가 되는 것이 발견될 수 있다. 이것은 예를 들면, 기생충 질환에서 나타나는데, 여기서 IgE 생산은 너무 강하거나 또는 그 질환은 Th2 의존이며, 유기체에 해롭고, 또한 TBC 또는 한센병과 같은 (미코)박테리아 감염에서도 나타난다. 자가면역 반응은 바이러스 또는 박테리아의 출현으로 일어날 수 있고, 예를 들면, 간염 B 형 바이러스 감염에 의한 파괴적인 간염, 또는 임파구성 맥락수막염 바이러스(LCMV) 감염에 의해 나타나는, 심한 조직 손상으로 나타날 수 있다.
상기 매우 심한 면역반응은 본 발명에서 제공되는 면역조절제로 저지될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 또 다른 용도는 혈관질환의 치료에 관한 것으로, 그것에 의해 세포와 조직에 대한 근본적인 손상은 본 발명에 따른 NMPF로 처치함에 의해 예방 또는 회복될 수 있고; 그것에 의해 NMPF는 또한 직접적으로 또는 간접적으로 항-산화제로서 작용할 수 있다. 예를 들면, 당뇨병 I의 진단에서 결정하는 일은 인슐린-생산 판크레아제 베타 세포를 파괴하는 것이다. 베타-세포 중량의 점진적 감소는 만성적인 자가면역반응의 결과라는 강한 증거가 있다. 이 과정 중, 소도-침입 면역세포, 소도 모세혈관 내피세포 및 베타 세포 자체는 세포종양 조절제를 방출할 수 있다. 사이토킨, 및 특히 산화질소(NO)는 강력한 베타-세포 독성대사인자 분자이다. 반응성 라디칼 NO는 주로 널리 분포된 DNA 균주 분해물, 다른 라디칼, 예를 들면 산소의 도입을 통해 Th1 및 Th2 세포와 같은 임파구 하위세포군에 대한 그들의 효과를 통해 그것의 해로운 효과를 전달한다. 이러한 초기 손상은 베타세포의 치사 및 면역 반응의 혼란으로 돌아가는 일련의 사건을 일으킨다.
더우기, 본 발명에 따른 면역조절제는 라디칼 유도 또는 지휘된 세포-세포 상호작용 또는 세포 반응, 특히, 예를 들면 선천적 또는 후천적 면역 시스템의 상호작용을 조절하는 것과 관련되는 면역학적 특성의 이들 상호작용 또는 반응을 조절할 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 면역 시스템은 두 분류가 있다: 선천적(비특이) 및 후천적(특이) 시스템으로, 둘다 세포질 및 체액 성분들을 갖는다. 선천적 면역시스템의 세포질 성분의 예는 단핵세포, 대식세포, 과립구, NK 세포, 유선세포, gd T 세포 등이며, 체액 성분의 예는 리소짐, 보체, 급성기 단백질 및 만노스-결합 렉틴(MBL)이다. 후천적 면역 시스템의 주요 세포질 성분들은 T와 B 세포이며, 체액 성분들의 예는 항체이다. 후천적 면역 시스템은 그들의 특이성, 감염 제거에 대한 효과 및 고등 다세포 유기체에서의 배타적 존재 때문에 가장 많이 연구되어왔다. 선천적 시스템은 종종 원시적으로 간주되며 '단순하다'고 생각된다. 그러나, 선천적 시스템은 지속될 뿐만 아니라 가장 기본적인 면역 요구중 하나-태생에서 결정적인 역할을 한다. 선천적 시스템은 임파구에 대한 주요 조직복합유전자 복합체(MHC) 클라스 I 및 II와 관련된 항원의 작용 및 존재에 의해 면역반응을 유발한다. 종종 완전한 반응은 보조약(예를 들면, 내독소)을 요구하며, 이것은 선천적 면역시스템과의 상호작용을 통해 공동-자극 표면분자 또는 사이토킨을 생성한다. 이것은 항원의 생물학적 중요성을 결정하며 후천적 시스템에 이 정보를 제공한다. 따라서, 이것은 후천적 시스템이 반응할 것인지 아닌지를 지시한다. 따라서, 이들 두개의 커다란 면역 시스템의 분류는 서로에게 영향을 미칠 뿐만 아니라, 예를 들면 사이토킨과 공동-자극 분자들을 통해 적어도 세포질 수준에서 서로를 조절한다.
상기 2가지 시스템이 개별적으로 또는 조합하여 연관된 곳에 많은 생리학적 조건 및 면역 병변이 존재한다. 예를 들어, 임신 중에 모계의 선천적 면역 시스템이 더욱 자극되는 것으로 나타나거나, 또는 유형 II의 당뇨병은 만성 과민 선천성 면역 시스템의 질환이라고 제안되어 왔다. 또 다른 예는 선천성 면역 시스템의 리스테리아증과의 연관성이다. 후천성 면역 시스템에서 탈조절은 또한 전신성 또는 기관-특이적 자가면역, 알러지, 천식 등과 같은 면역 질환을 초래할 수 있지만, 임신의 유지 및 "타가이식" 거부의 방지에 있어 역할을 할 수 있다.
상기한 바와 같이, 후천성 시스템은 대부분 감염의 제거 시에 그 특이성 및 유효성, 그리고 고등 다세포 유기체에 있어 배타적인 존재 때문에 연구되어 왔다. 그 조절 또한 많이 연구되어 왔다. 예를 들어, 사이토킨 미세-환경은 면역 반응 중에 Th1 또는 Th2 세포 유형으로 T 헬퍼 세포의 분화에 있어 핵심 역할을 한다. IL-12는 Th1 분화를 유도하는 반면, IL-4는 Th2 분화를 진행시킨다. 최근에, 수상 세포(DC1, DC2)의 서브세트가 Th1 또는 Th2 세포 중의 하나의 분화를 결정하는 다른 사이토킨 미세환경을 제공하는 것으로 알려져 있다. 부가적으로, 성장한 T 헬퍼 세포 반응에서 유래한 음성피드백 루프는 또한, 적당한 수상세포 서브세트의 생존을조절하고, 따라서 연장된 Th1 또는 Th2 반응을 선택적으로 억제한다. 또한, Th1 반응의 진전은 IL-4에 의해 직접적으로 상쇄되고, IL-10에 의해 간접적으로 상쇄되어, 선천성 면역 반응에 의해 자극되는 대식세포에 의한 IL-12 및 인터페론-g-유도 인자(IGIF)의 생성을 억제한다. 증식 및 분화하기 위해 IL-4에 의존하는 Th2 세포들은 내성에 있어 역할을 한다고 제안되어 왔다. 특히, Th1에서 Th2로 전환은 유기-특이적 자가면역 병변의 진행을 방지할 수 있고, 임신의 유지에 필요하다고 제안되어 왔다. 최근에, 조절 T 세포의 독특한 서브세트가 Th1 및 Th2 반응 모두를 조절하는 원인이 되고, 면역 병변의 진전을 방지한다는 것이 명확해지고 있다. 다수의 상기 조절 T 세포의 통상의 특징 중 하나는 그 기능이 적어도 부분적으로 충분히 TGF-베타의 작용이고; 이것은 IL-10이 우선적으로 Th1만을 단독으로 억제할 수 있는 반면, Th1 및 Th2 모두의 진전을 억제하는 TGF-베타의 능력을 유지하게 된다.
Th1 대 Th2 유형 세포의 선택적인 성장은 전구체 Th 세포와 MHC 종류 II분자와 결합한 상응하는 펩티드를 운반하는 항원-존재 세포(APC)와의 상호작용에 의존한다. APC에 의해 방출되고, 상주세포 및 T 세포를 운반하는 적절한 T 세포 수용체 간의 초기 상호작용 중에 존재하는 사이토킨은 Th1 대 Th2 서브세트로 분화를 유도한다. 최근, DC(미엘로이드 대 림포이드)에 대한 두 가지 상이한 전구체가 인간에게 있어 기재되었다. 미엘로이드 전구체에서 유래한 DC1의 선택적인 진전은 CD40L리간드 또는 내독소의 자극 후에 발생하고, IL-12를 다량 생산한다. 림포이드 전구체는 CD40리간드 자극 후 DC2 세포를 유발하고, IL-1, IL-6 및 IL-10을 생성한다.상기 사이토킨은 활성화된 Th 세포의 진전을 유발하는데 매우 중요하다: Th1 유형 세포로 선택적인 분화는 전적으로 IL-12의 존재에 의존하는 반면에, IL-10의 존재에 의해 상당히 증진될 수 있는 Th2 유형 세포의 성장에 IL-4가 요구된다. DC1은 IL-12의 생성에 의해 특성화되기 때문에, 주로 Th1 유형 세포의 성장을 유도하고, DC2는 IL-10을 생성하고, 외인성 IL-4의 존재에 있어 Th2 진행을 선택적으로 촉진한다.
본 발명에 의해 제공되는 NMPF는 인비보(BALB/c, NOD) 및 인비트로 Th1/Th2 균형을 조절할 수 있다. NOD같은 유력한 Th1 표현형 모델에서, 다른 것들 중에 NMPF(NMPF 및 그 분획과 같은)는, NMPF에 의한 Th3 및 Tr1같은 조절 세포의 유도를 나타내는 IL-4 생성과는 대조적으로, IFN-감마 생성(인비보/인비트로)을 하향조절하고, IL-10 및 TGF-베타 생성을 촉진한다. 상기 조절 세포들은 면역 및 염증성 질환과 면역 내성에 있어 NMPF의 치료적 효과에 있어 역할을 한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 의해 선택되는 면역조절제, 상기 선택된 면역조절제로 이루어지는 약학적 조성물 및 면역-중개 장애의 치료를 위한 상기 약학적 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
정제된 NMPF는 모노클론 항체 및/또는 기타 특정한 시약을 생성하기 위해 사용되어, NMPF-특이성 정량적 면역-시험의 디자인을 촉진한다. 또한 단일 사슬 Fv단편은 상당수의 상이한 특이성을 포함하는 목록을 갖는 파지 라이브러리를 사용하는 파지 진열 기술을 사용하여 분리하였다.
또한, 본 발명은 심부전, 뇌골절, 알츠하이머 질환, 혈전증, 동맥경화, 임신관련 혈관 질환 또는 순환계 장애 등의 심장혈관 또는 순환계 장애를 조정하기 위한 방법 및 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 상기한 바와 같은 면역조절제가 인간을 포함하여, 심장혈관 장애로 고생하는 동물에 매우 유익한 결과를 갖는다는 것을 발견했다.
본 발명에 따른 면역조절제는, 또한, 다터(dotter) 치료의 가능성의 범위를 확대한다. 통상적으로 상기 치료가 산소 압력이 너무 낮게 되는 위험 때문에 수행될 수 없는 경우, 다터 치료는 상기 면역조절제로 치료하는 것과 조합할 때 시행할 수 있다. 따라서, 고비용이고 난해한 우회 수술이 많은 경우에 회피될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예 및 첨부된 토의에서 추가로 설명되지만, 본 발명이 이에 한정되지는 않는다. 하기 실시예들은 광범위한 적용가능성을 일반적으로 알 수 있는 당업자에게 명확한 본 발명의 의미를 나타낸다.
실시예 1
서론
면역 시스템은 두 가지 분류가 있다: 비-특이성(선천성) 및 특이성(후천성) 면역 방어, 두 가지 모두 세포상 또는 체액상 성분이다. T 및 B 세포는 항원-특이적 세포성 및 체액성(항체) 면역 방어의 원인이 된다. 반면에, 단핵세포/대식세포, 과립구, NK 세포, 비만세포 및 유사하게 gd T 세포는 선천성 면역 시스템의 세포성 성분이고, 급성기 단백질, 리소짐 및 만노오스-결합 렉틴(MBL)은 선천성 면역 시스템의 주요한 체액상 성분이다. 후천성 시스템은 주로 그 특이성 및 감염을 제거하는 데 있어서 지속적인 효과 때문에 연구되어 왔다. 선천성 시스템은 포유류:태생에 있어 가장 기본적인 면역 도전에서 중요한 역할을 한다고 생각된다.
선천성 시스템은 주요 이식적합성 복합체(MHC) 종류 I 및 II 분자와 관련한 항원을 가공하고 림프구에 전달하여 면역 반응을 유발하는, 즉, 시그날 1을 유발한다. 완전한 반응은 종종 보조제(내독소와 같은)를 필요로 하며, 상기 보조제는 선천성 면역 시스템과 상호작용을 통해, 보조자극성 표면 분자 또는 사이토킨 형태의 시그날 2를 생성한다. 시그날 2는 항원의 생물학적 중요성을 결정하는 것으로 보이고, 이 정보를 후천성 시스템에 전달한다. 사실, 상기 시그날 2는 후천성 시스템이 반응하거나 또는 반응하지 않도록 지시하는 것으로 생각된다(Immunology Today 20, 114-118). 따라서, 선천성 시스템은 특정 면역 방어의 필수적 부분이다.
임신 중에, 초기 3개월 이후부터 단핵세포 및 과립구의 수가 증가한다. 일반 임신에 있어서, 일면 전신성 패혈증에서 관찰되는 변화와 비교할 만한 단핵세포 및 과립구의 순환은 활성화된 표현형을 갖는 것이 발견되었다(Am. J. Obstet. Gynecol. 179, 80-86). 기타, 단핵세포 식균작용 및 호흡기관 파열 활성이 증가되는 것이 나타났다. 내독소 수용체 CD14의 단핵세포 표면 발현이 증가되고, 내독소에 반응하여 일반 임신 여성으로부터의 단핵세포는 더 많은 전-염증성(proinflammatory) 유형 I 사이토킨 IL-12(Immunology Today 20, 114-118)을 생성한다. 기타 연구에서 급성기 반응의 전형인 가용 선천성 인자의 플라즈마 수준에서 변화뿐만 아니라, 임신에 있어 과립구 활성화가 발견되었다(Am. J. Reprod. Immunol. Microbiol. 15, 19-23).
임신 중, 모계 면역 시스템은 조정되어, 감염에 대한 모체의 저항을 유지하면서 태아에 대한 모계 면역 반응을 억제하게 된다. 본 발명자들은 자극성 및 반대 방식에서 선천성 및 후천성 면역 시스템 모두를 조절하는(WO99-59617호), 본 명세서에서 NMPF(Natural immuno-Modulatory Pregnancy-Factor(s))라고 칭해진 면역조절제(IR, WO99-59617호)의 존재를 나타내었다. 상기 인자들은 한정하는 것은 아니지만, 임신부 소변에서 유도된 상용 hCG 약제, b-hCG 약제, b-hCG의 일정 펩티드, b-hCG 펩티드의 일정 배합물 및 상용 hCG 약제와 임신부 소변의 일정 겔 여과 크로마토그래피의 분획을 포함한다. 상기 인자들의 균형은 모계 면역 시스템의 적절한 조절에 매우 중요하다. 예를 들어, 면역 시스템의 과로는 임신 그 자체의 진행에 있어 문제를 야기할 수 있다. 자간전증은 선천성 면역 시스템의 과민화에 의해 특성화되는 상기 상태의 하나이다. 최근에, 두 가지 면역 시스템 간의 만성적인 불균형은 유형 II 당뇨(비-인슐린 의존 당뇨병) 및 기타 질환(WO99-59617호)의 근거가 될 수 있다는 것이 또한 제시되었다.
다양한 사이토킨이 면역 시스템을 균형잡는데 중요한 역할을 한다고 제안되어 왔다. 선천성 면역 방어 및 염증성 반응의 조절에 있어 중요한 역할을 하는 사이토킨 중 하나는 대식세포 이동 억제 인자(MIF)이다.
MIF는 모세관 외부로 대식세포의 이동을 방해하는 능력에 의해 본래 동정되었다. 그 후, MIF 활성의 발현은 숙주 방어에서 대식세포의 기능을 조절하는 작용을 나타내며, 다양한 감염성 위치에서 발견되었다(Science 153, 80-82; J. Exp. Med. 137, 275-288). 최근에, T-세포 사이토킨으로 처음 기재된 MIF는 감염 및 스트레스에 반응하는 뇌하수체 세포에 의해 또한 방출되는 펩티드로 동정되었다 (Nature 365, 756-759; Nature 377, 68-71). MIF 작용의 표적으로 본래 간주되었던 단핵세포 및 대식세포는 세균성 내독소, 외독소 및 사이토킨에 노출후 방출되는 MIF의 주요 공급원이라고 발견되었다. 방출되면, MIF는 대식세포 및 활성화된 T 세포에 의해 전-염증성 매체의 발현을 유도하여, 염증성 및 면역 반응을 강력하게 촉진한다(Nature Medicine 6, 164-170). 면역 시스템 내의 MIF의 중요한 조절 역할은 MIF가 글루코코르티코이드에 의해 유도되고, 대식세포 및 T 세포에 대한 글루코코르티코이드의 항-염증성 및 면역억제효과를 능가하는 독특한 능력을 보유하는 것을 발견함으로써 더욱 강조되었다. 따라서, MIF 및 글루코코르티코이드는 숙주 염증성 및 면역 반응을 조절하는 생리학적 역-조절 쌍으로서 작용한다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7849-7854). 항-MIF 항체는 사구체신염, 관절염 및 타가이식 거부의 실험 모델에서 염증을 감소시켜서 염증성 반응의 조절에 있어 MIF의 역할을 입증한다. MIF의 상승된 농도는 또한 성인 호흡기 고통 증후군(ARDS)이 있는 환자의 기포형 공기 공간에서 발견된다. 또한, 최근의 연구는 MIF가 패혈증 쇼크의 발병에 있어 중요한 역할을 하면서, 치명적인 엔도톡세미아(endotoxemia) 및 포도상구균성 독성 쇼크의 중요한 매개체로 알려졌다. 면역 시스템에서 기능을 제외하고, MIF는또한 다른 활성을 갖고 있다. 예를 들어, MIF mRNA 및 단백질은 뇌 및 미발달 안구 수정체내에서 발현되고, 표피 세포를 분화시키면서 신경내분비 시스템, 세포 성장 및 분화의 조절에 있어 중추적인 역할을 나타낸다. 다양한 기관 및 조직에서 MIF의 존재를 나타내는 다수의 기록이 있다: 피부 혈관은 구성요소적으로 MIF를 발현하고, 습진 및 건선 등의 급성/만성 염증에 있어 MIF를 발현하기 위해 강력하게 활성화될 수 있다. 내피 상에서 MIF 발현은 단핵 식균 세포가 조직 부위로 진행되는 도중에 중요한 분화생성(differentiogenic) 시그날을 제공할 수 있다.
본 발명자들이 임신 중 발견한 면역 조절 메카니즘들 중의 하나는 NMPF에 의한 선천성 및 후천성 면역 방어의 조정을 통한 것이다. 예로써, 한정되는 것은 아니지만, APC 분획(DC1, DC2 같은)의 조절 세포 또는 림프구(조절 T 세포)에 직접적으로 또는 간접적으로 작용하여, NMPF는 활성화된 T 림프구가 Th2 면역 반응으로 편향되도록 한다. Th1 면역 반응의 억제는 감염에 대한 모계 저항의 유지를 설명할 수 있는 NMPF에 의한 선천성 면역 방어의 자극에 의해 보상될 수 있다. 최근에, 일부 경우, 상기 보상 메카니즘(선천적 면역성의 자극)이 더욱 지배적일 수 있고, 비정상적 임신: 자간전증의 원인이 될 수 있다고 발견되었다.
자간전증은 단백뇨 및 부종과 함께, 상승된 혈압의 임상적 발견에 의해 정의되는 통상적인 임신-특이적 증후군이다. 그 발생 빈도는 전체 임신의 2% 내지 7%로 보고되어 있다. 임상적 발견은 임신 말기에 가장 명백해진다. 이 질환은 때때로 예고 없이 급속도로 진행되어서 생명을 위협하는 질환이 될 수 있다. 적절한 전달은 자간전증의 해결을 개시하지만, 태아 및 모체의 질병률 및 사망률에 주요 원인이다.
Robert 등은 그들의 전통적인 문헌에서 잠재적인 과정으로서 모계 내피의 활성화를 자극하는 징후를 수집하였다. 일반화된 모계 내피 세포 기능장애는, 전부는 아니지만, 많은 임상적 측면이 단일의 통일된 과정: 혈관 상태의 교란된 내피성 조절, 증가된 내피적 투과성에 의한 유체 보유 및 전응고제(procoagulant)의 비정상적인 내피 발현에 기인한 응고 기능장애를 통한 고혈압에 의해 잠재적으로 설명될 수 있도록 하였다. 자간은 혈관 수축에 기인한 병소적 뇌 빈혈에 의한 것으로, 새로운 뇌 영상화법에 의해 발견되는 변화의 징후와 일치한다. HELLP(용혈, 상승된 간 효소 및 저 혈소판 수) 증후군을 갖는 간 기능장애는 만성 저환류의 영향에 기인한다.
내피 세포는 내재적으로 자간전증의 기원에 상응하는 여러 가지 다른 방법으로 활성화 될 수 있고, 유리 지방산, 지단백질, 산화된 지단백질 또는 지질 과산화물, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 피브로넥틴(fibronectin) 퇴화 생성물 및 강제 이송된 신시티오트로포블라스트(syncytiotrophoblastic) 미세융모 단편을 포함하여, 여러가지 후보 인자가 출현했다. 내피 세포 기능장애를 야기하는 인자들의 공급원은 확실하게 결정되지는 않았지만, 징후들로 태반이라고 지적된다.
내피성 기능장애에 부가적으로, 자간전증에 모계 염증성 세포 반응의 전신성 활성화가 있는 실질적으로 간행된 증거가 있다. 과립구 및 단핵세포 모두 활성화된다. 전염증성 사이토킨 TNF-α및 그것의 2 가용성 수용체, 인터루킨 6(IL-6) 및 가용성 포스포리파제 A2(염증성 반응의 중요한 매개체)의 순환계로 방출이 증가된다.응고 시스템이 비정상적으로 활성화되고, 보충 시스템이 유사하게 영향을 받는 것은 잘 알려져 있다. 사후 관찰이 일부 환경에서, 치명적인 병리학적 상태가 실험 동물에서 특성화된 내독소에 대한 특정 형태의 염증성 반응인 슈바르츠만 반응의 상태와 유사하다는 것을 나타낸다. 상기한 자간전증의 특징이 패혈성 쇼크와 유사하기 때문에, 본 발명자들은 또한 NMPF(IR) 인자가 패혈성 쇼크 또는 패혈증을 악화시킬 수 있는 자간전증과 관련이 있다는 것을 인식하였다. 본 발명자들은 패혈성 쇼크를 위한 고분량의 LPS 동물 모델을 사용하여 이것을 나타내었다. 자간전증 환자의 소변 중에 고수준의 닉크된 hCG b-서브유니트가 존재하기 때문에, 본 발명자도 또한 상기 닉크된 서브유니트가 패혈성 쇼크를 악화시키고, 따라서 치명적 엔도톡세미아 및 포도상구균 독성 쇼크의 중요한 매개체인 MIF처럼 거동하는지를 발견하기 위해 실험하였다.
재료 및 방법
NMPF 정제: 상용 hCG 약제로부터 NMPF를 분석하기 위해서, 60Å, 100Å 또는 300Å (250 x 4.6 mm 및 300 x 7.5 mm)의 Alltech 거대구체 배제(GPC) 컬럼이 장착된 시마쯔 HPLC 시스템을 사용하였다. 컬럼의 분리 범위는 각각 28,000 - 250, 2500 - 350,00 및 1,200,000 - 7,500 달톤이다. 컬럼 용출 위치를 보정하기 위해서 외부 분자량 표준을 사용하였다. 사용된 마커는: 아프로티닌(6,500 Da), 시토크롬 C(12,400), 탄소성 안하이드라제(29,000), 알부민(66,000) 및 블루 덱스트란 (2,000,000) 이었다.
NMPF를 분석하기 위해서, 세 가지 상이한 hCG 약제: NMPF-PG(Pregnyl;Organon; OSS, 네덜란드), NMPF-A(APL; Weyth Ayerst; 미국 필라델피아) 및 NMPF-PR(Profasi; Serono, 이탈리아 로마)를 사용하였다. 유동 완충액으로서, 에탄올 (5%, 부피/부피)을 함유하는 50 mM 중탄산암모늄 완충액을 사용하였다. 샘플 충전 용적은 250 x 4.6 mm 컬럼에 대해서는 10-50㎖, 그리고 300 x 7.5 mm 컬럼에 대해서는 50-200㎖로 하였다. 250 x 4.6 mm 컬럼 및 300 x 7.5 mm 컬럼에 대한 유속은 각각 45분 동안 0.5 ㎖/분 및 45분 동안 1-2 ㎖/분으로 하였다. 건강한 지원자로부터 초기 3개월 임신 소변(2 리터)을 병에 수집하고, 2일 이내 실험실에서 분배될 때까지 냉장하였다. 분배 후, 1 g/ℓ의 소듐 아지드를 첨가하고, 수산화나트륨으로 pH를 7.2 - 7.4 로 조절하고, 그리고 실온(RT)에서 1시간(h) 동안 침전되게 하였다. 대략, 75%의 상징액을 따라내고, 침전을 제거하기 위해 침전에 근접해 있는 잔류물을 원심분리(40℃에서 25,000 rpm으로 10분)하고, 나머지 상징액을 첨가하였다. 상기 상징액을 Minitan(Millipore) 횡단 여과 장비에서 0.45mm를 통하여 여과하였다. 그리고 나서, 여과물(2 리터)을 10 kDa 절단된 YM Diopore 멤브레인이 장착된 Amicon 한외여과 장비에서 농축하였다. 최종 분량(250㎖)을 2변화(change) 10리터의 Milli Q 물에 대해 투석하였다. 다음에, 샘플을 Amicon 한외여과 시스템에서 10 kDa 절단으로 추가로 농축하여 3 ㎖의 최종 분량이 되도록 하였다.
패혈증 또는 패혈성 쇼크 실험에 사용된 마우스: 8 - 12 주령의 암컷 BALB/c 마우스를 모든 실험에 사용하였다. 상기 동물을 동물 건강에 관한 유럽 실험동물 과학 연합(FELASA) 운영 그룹의 보고서(Laboratory Animals 28: 1-24, 1994)에 기재된 프로토콜에 따라 특정한 무-병원균 상태하에 본 발명자들의 설비에서 양육하였다.
주입 프로토콜: 내독소 모델의 경우, 마우스에 150 - 300 ㎍ LPS(E. coli 026:B6; Difco Lab., 미국 미시간주 디트로이트)로 절치근위에 주입하였다. 대조구는 절치근위에 PBS만으로 처치하였다. NMPF의 효과를 시험하기 위해, 700 IU의 상이한 hCG 약제, 그것의 유도된 분획(10 - 50 ㎎) 또는 초기 3개월의 임신 소변 (NMPF-U)에서 유래된 것의 최적화된 분량으로 BALB/c를 치료하고, 그리고 나서 절치근위에 LPS를 주입하였다.
NMPF가 쇼크 유도 후에도 쇼크를 억제하는지를 측정하기 위해서, LPS를 주입하고 3, 12, 24 및 36시간 후, 절치근위에 NMPF로 BALB/c를 또한 치료하였다. 상이한 시간 지점에서 반-정량적(semi-quantative) 질병 채점 및 생존율을 기록하였다.
반정량적 질병 측정: 하기의 측정안을 사용하여 질병 심각성에 대해 마우스를 채점하였다:
1. 삼투된 백태, 그러나 일반 마우스와 비교하여 감지할 만한 행동 차이가 없음.
2. 삼투된 백태, 허들(huddle) 반사작용, 건강한 마우스를 다루는 동안의 활동적인 것과 같이 자극(케이지를 가볍게 치는 것과 같은)에 반응.
3. 케이지를 가볍게 치는 것에 대한 지연된 반응, 조작시 수동적 또는 순함, 그러나 새로운 환경에서 단독으로 있을때 여전히 호기심 있음.
4. 호기심 결핍, 자극에 거의 또는 전혀 반응 없음, 매우 부동임.
5. 곤란한 호흡, 뒤집은 후 스스로 복원이 늦거나 불가능(빈사상태, 죽음).
b-hCG 펩티드 및 항-MIF 치료: hCG의 대부분의 비뇨기성 대사산물은 닉크된 형태의 b-hCG이다. 이 형태의 b-hCG는 b-서브유니트 내에 펩티드 결합 균열을 갖는다. b48(VLPALPQVVC)은 hCG의 천연 비뇨기성 대사산물에 관련된 것으로 나타난 상기 펩티드 중의 하나이다. 패혈성 쇼크에 대한 상기 펩티드의 효과를 시험하기 위해서, LPS로 BALB/c 마우스를 접종하고, b48-펩티드(100㎎)로 2시간 후 절치근위에 처치하였다. 가능한 파괴 생성물이 또한 패혈성 쇼크에 영향을 미치는 지를 알아보기 위해서, BALB/c 마우스에서 패혈성 쇼크 모델의 펩티드를 시험하기 전에 3시간 동안 37℃에서 b48-펩티드를 인큐베이트하였다.
이전에(WO 99-59617호), 본 발명자들은 NMPF(IR)가 또한 항-당뇨 효과를 갖는다는 것을 나타내었다. 따라서, b48 펩티드가 항-당뇨 효과를 갖는 지를 시험하기 위해서, 이식 실험을 실행하였다. 당뇨병의 NOD 마우스로부터 모든 비장 세포를 회수하고, 항-CD3(145-2c11; 25㎎/㎖)가 코팅된 10% FBS가 보충된 RPMI+ 및 300 IU/㎖) NMPF(Pregnyl)가 있는 IL-2 (50 U/㎖), 또는 b48 펩티드(20 ㎎/㎖)로 인비트로 자극을 하였다. 그리고 나서, 배양 플라스크를 48시간 동안 5% CO2의 공기 중에 37℃에서 인큐베이트하였다. 48시간 후, 세포들을 PBS로 2회 세척하고, 20 x 106 세포를 8주령 NOD.scid 마우스(4개체)로 절치근위에 이식하였다.
인비트로/엑스비보 LPS 자극된 스플레노사이트의 증식: 고투여량의 LPS 접종에 의한 BALB/c 마우스 내의 패혈성 쇼크 유도 48시간 후, 비장 세포(1 x 106세포/㎖)를 회수하고, 96-웰 플레이트(둥근 바닥)에서 LPS(10 U/㎖)로 인비트로 재측정하였다. 배양 24시간 후, 배양 마지막 16시간 동안 [3H]TdR 혼입을 통해 스플레노사이트의 LPS 자극된 증식을 측정하였다. 다른 실험에서, 비-치료된 BALB/c 마우스로부터 유래한 스플레노사이트를 단리하고, 상이한 공급원의 NMPF(37.5 - 600 IU/㎖)(Pregnyl, Organon; APL, Wyeth Ayerst; Profasi, Serono), NMPF 분획(10 - 20 ㎎/㎖), b-48 펩티드 또는 그 파괴 생성물, 항-MIF 또는 상기 산물들의 배합물 각 10 ㎎/㎖의 존재 또는 부재하에 LPS로 인비트로 자극하였다(1 x 106세포/㎖). 24시간 배양 후, 스플레노사이트의 LPS 자극 증식을 측정하였다.
결과
NMPF 정제: 상기한 공급원(Pregnyl, APL, Profasi, 임신 소변)에서 유래한 NMPF 샘플을 거대구체 GPC 300Å 컬럼에 적용시키고, 중탄산암모늄으로 용출하였다. 세가지 선택된 영역, 즉, >25 kDa의 분자량에서 명확하게 용출되는 NMPF-1, 25kDa - 6kDa 사이의 분자량에서 명확하게 용출되는 NMPF-2 및 < 6kDa 분자량에서 명확하게 용출되는 NMPF-3으로 분획화하였다(도 1). 상기 모든 분획을 동결건조하고, 항-쇼크 활성에 대해 시험하였다(본 명세서 어디에나 나타나 있음). 컬럼 용적 후에 용출된 더 낮은 분자량 분획(NMPF-3)은 다시 거대구체 GPC 60Å 컬럼 상에서 분획화 하였다(도 2). 모든 분획을 동결건조하고, 또한 항-쇼크 활성에 대해 시험하였다.
LPS-유도된 패혈성 쇼크에서 NMPF 치료: NMPF 치료된 마우스에서 고투여량 LPS 치료의 효과를 측정하기 위해서, BALB/c 마우스(6 개체)를 LPS(150 ㎎/kg)로복막내 접종시키고, 5일 동안 매일 생존을 평가하였다. PBS-치료 BALB/c 마우스는 고투여량 LPS 접종 후 1일째부터 쇼크로 죽고, 5일 째에 10% 미만의 마우스가 생존하였다(도 3). 반면에, 공급원 Pregnyl 또는 Dexamethasone(데이타는 나타내지 않음)에 유래된 NMPF-2로 치료된 마우스 그룹은 약 25%가 생존하는 동안(도 3), 공급원 Pregnyl에서 유래한 NMPF, 또는 GPC 300Å 컬럼에서 얻어진 그것의 분획인 NMPF-1 또는 NMPF-3로 치료된 마우스는 5일 째에 100% 생존하(P<0.001)(도 3). 모든 상용 hCG 약제가 NMPF 활성을 나타내지는 않는다; 예를 들어, 공급원 Profasi에서 유래된 NMPF는 단지 부분적인 항-쇼크 활성(약 40% 생존)을 나타낸다. 또한, 시간 내의 동일한 배치의 활성 가변성 뿐만 아니라, 동일한 공급원의 상이한 배치사이에서 NMPF에 있어 가변성이 발견되었다. 쇼크 유도 전 또는 후에 APL로 BALB/c 마우스의 치료는 다수의 실험에서 쇼크의 가속 및 일찍 죽는 것을 나타내었다.
쇼크를 가속하고, NMPF 활성을 억제 또는 반대작용하게 하는, hCG 약제 중에 존재하는 인자가 있는 지를 측정하기 위해서, 사전 시험된 활성 배치(항-쇼크 활성 함유) 및 GPC 60Å 컬럼 상에 공급원 Pregnyl에서 유래된 비-활성 배치에서 유래된 NMPF-3를 추가로 분획화하였다. 세가지 선택된 영역, 즉, >2000 Da의 분자량에서 명확하게 용출되는 NMPF-3.1, 2000 Da - 300 Da 사이의 분자량에서 명확하게 용출되는 NMPF-3.2 및 300 Da 미만의 분자량에서 명확하게 용출되는 NMPF-3.3으로 분획화하였다(도 2). 모든 분획을 항-쇼크 활성에 대해 시험하였다.
상기 실험의 결과들은 2가지(활성 및 비-활성) 배치 모두에서 유래한 NMPF-3.3 분획은 쇼크를 가속시키지만, 사전 시험된 활성 배치에서 항-쇼크 활성은NMPF-3.2 분획 중에 존재한다는 것을 나타낸다(도 4).
NMPF-3.3이 NMPF-3.2의 항-쇼크 활성을 억제하는 지를 측정하기 위해서, NMPF-3.3을 10:1 비율(100:10 ㎎)로 NMPF-3.2에 첨가하고, LPS 접종 2시간 후, 마우스 절치근위로 혼합물을 주입하였다(6 개체). 상기 실험에서 유래된 데이타는, NMPF-3.2 분획 단독으로만 치료된 모든 마우스에서 패혈성 쇼크가 억제되고, 2 미만의 질환 점수를 갖고(도 4), NMPF-3.2 분획의 상기 항-쇼크 활성은 NMPF-3.3으로 억제되는 것을 나타내었다. NMPF-3.3 치료만으로는 쇼크를 가속하고, 치료된 마우스가 심지어 PBS 치료된 마우스보다 더 일찍 죽었다(도 4). Pregnyl에서 유래된 활성 및 비-활성 배치를 혼합하고, 패혈성 쇼크 유도 후 BALB/c 마우스 내에 접종하는 실험에서 동일한 경향의 결과를 얻었다(데이타는 나타내지 않음).
NMPF-3.2 및 NMPF-3.3 간의 비율: 다음, 활성 및 비-활성 Pregnyl 배치, 초기 3개월 임신 소변에서 유래된 GPC 60Å 컬럼 상의 NMPF-3.2 및 NMPF-3.3을 추가로 정제하고, 비율을 측정하였다.
항-쇼크 활성을 갖는 초기 3개월 임신 소변은 약 1:2.2의 비(NMPF-3.2:NMPF-3.3)를 갖고(도 5), Pregnyl의 활성 배치는 1:1 비를 갖는 반면(도 7), Pregnyl의 비-활성 배치는 1:3.4의 비를 갖는다(도 6).
엑스비보 LPS 자극 스플레노사이트 증식: LPS 쇼크 유도 48시간 후, PBS 치료 및 NMPF 치료된 마우스에서 유래한(활성 Pregnyl, 그것의 유도된 NMPF-3.2 또는 NMPF-3.3 분획, 또는 APL 약제에서 유래한) 스플레노사이트를 단리하고, LPS로 재자극하였다. 배양 24시간 후, 스플레노사이트의 LPS 자극 증식을 측정하였다.NMPF(APL) 또는 NMPF-3.3에 의한 치료는 LPS 자극된 증식을 증가시키지만(6000 대 7200 cpm), PBS 치료된 마우스(3500 cpm)와 비교하여, NMPF(Pregnyl의 활성 배치) 및 그것의 유도된 NMPF-3.2(1600 대 1350 cpm) 분획 치료된 BALB/c에서 유래된 스플레노사이트의 배양 후 LPS 유도된 증식의 감소가 관찰되었다. 비치료된 BALB/c 마우스에서 유래된 스플레노사이트를 상기한 첨가물의 존재하에 LPS로 인비트로 자극할 때 비교할만한 결과가 얻어졌다(데이타는 나타내지 않음).
상이한 공급원인 b-48 펩티드, 변성된 b-48 펩티드 및 항-MIF에서 유래한 NMPF로 인비트로 치료: 자간전증의 주요 특징은 패혈성 쇼크와 유사하다는 것이다. 따라서, 본 발명자들은 자간전증에 관련 있고 또한 패혈성 쇼크 또는 패혈증을 악화시키는 NMPF(IR) 인자가 또한 존재할 수 있다고 가정하였다. 상기에서, 본 발명자들은, NMPF-3.3은 패혈성 쇼크를 가속하고, 인비트로/엑스비보 LPS 유도된 스플레노사이트 증식을 증가시키는 분획의 하나이고, 질병 심각성의 증가에 관련이 있다. 자간전증성 환자의 소변에, 고 수준의 닉크된 hCG b-서브유니트가 존재한다. 따라서, 상기 닉크된 서브유니트가 패혈성 쇼크를 악화시키고, NMPF-3.3 분획과 유사한지를 시험하였다. 또한, MIF는 치명적인 엔도톡세미아 및 포도상구균 독성 쇼크의 중요한 매개체이고, 따라서 증식에 대한 b-48 펩티드 및 NMPF의 영향을 항-MIF 및 MIF와 비교하였다.
이들 실험은 항-MIF은 항-쇼크 활동(NMPF-PG+)을 보이는 예비 검사된 프레그닐 배치와 유사한, LPS 유도 증식화를 감소하는 경향을 가진다(도 8). 더구나, 항-MIF 및 NMPF-PG+는 함께 공동으로 작용하고, 증식화를 감소시킨다(도 8). APL(NMPF-A)로부터의 NMPF, 비활성 프레그닐 배치(NMPF-PG-; 항-쇼크 활동이 없는) 및 b-48 펩티드(NMPF-K)는 단지 LPS와 비교해서 LPS 유도 증식화를 증가시켰다(도 8-12). 다른 한편으로는, NMPF-PG+또는 변성 b-48 펩티드(NMPF-Kb)는 적어도 항-MIF 치료만의 수준까지 LPS 유도 증식화를 감소시키고 억제한다(도 8-12). NMPF-PG-을 가진 BALB/c 마우스의 인 비보 치료에서, 패혈증 쇼크 유도 후의 NMPF-K 또는 NMPF-A는 PBS 처치 마우스(t=72시간에서 15%의 생존율)와 비교해서 질환의 심함(t=48에서 0-25%의 생존율)을 촉진하는 반면에, BALB/c 마우스에서의 패혈증 쇼크는 NMPF-PG+또는 NMPF-Kb에 의해 완전히 억제된다.
더구나, 본 발명자들의 NOD 비장세포 전달 실험은 전달 후 22일째에,b48-펩티드 및 PBS 처치 비장세포를 받은 NOD.scid 마우스는 당뇨병에 양성이었고, 1주일 내에 그들은 30m㏖/ℓ이상의 혈당 글루코즈(glucose) 수준에 도달하는 반면에, NMPF(프레그닐) 처치 비장세포를 받은 NOD.scid 마우스는 정상(혈당 글루코즈 <8 m㏖/ℓ)으로 남아있었다. 전달 후 6주째에, PBS 및 b48을 재구성한 NOD.scid 마우스는 매우 불안해 보인 반면에, NMPF 마우스군은 건강하게 남아 있었다. 모든 군으로부터의 마우스를 이때에 죽였다.
후천적인 및 선천적인 면역체계가 개별적으로 또는 조합되어 포함되는 많은 생리학적인 조건 및 면역병리학이 있다. 예를 들어, 임신 시에 모계의 선천적인 면역체계는 더욱 활기를 띠는 것으로 보이고, 타입 Ⅱ 당뇨병은 선천적인 면역체계의 만성 과민에 기인한다고 제안되어 왔다. 다른 예로 리스테리아증에서의 선천적인 면역체계를 포함한다. 후천적인 면역체계에서의 이상조절 또한 전신성 또는 기관-특이적인 자가면역, 알러지, 천식 등의 면역 질환을 유도하고, 후천적인 면역체계 또한 임신 유지에서 및 아마도 아테로마성 동맥 경화증 및 관련된 질병을 포함하는, "타가 이식" 거부 반응 및 만성 염증의 예방에서 역할을 할 수 있다.
본 발명자들의 이전의 발명(면역조절제; WO99-59617)에서 보여주는 것처럼, NMPF(IR)는 인 비보(BALB/c, NOD) 및 인 비트로에서 Th1/Th2 균형을 조절할 수 있다. NOD처럼 주요한 Th1 표현형 모델에서, 다른 것들 중에서 NMPF(NMPF-PG 및 그것의 분획처럼)는 NMPF에 의해 Th3 및 Tr1과 같은 조절 세포의 유도를 나타내는, IL-10 및 TGF-베타의 생산을 촉진한다. 이 조절 세포들은 면역 및 염증 질환 및 면역 내성에서 유익한 영향을 줄 것이다. NMPF 및 그것의 분획 중 몇 개는 인 비트로 및 인 비보에서 IFN-감마의 생산을 억제할 수 있는 반면에, 이것은 NMPF-3(IR-P3) 및 재조합 hCG(rhCG)에서는 관찰되지 않는다. NMPF-3(IR-P3) 및 rhCG은 각각 IFN-감마의 생산의 억제를 완화하는 것을 보여주지 않지만, NMPF-3 및 rhCG의 조합은 IFN-감마의 생산의 억제에 강하게 억제한다. 이것은 이러한 모델에서 적어도 그것의 IFN-감마의 억제력을 위한 rhCG에 NMPF-3의 필요함을 내포하는 반면에, NPMPF-1 및 NMPf-2는 단독으로 IFN-감마의 생산을 억제할 능력이 있다. 이것은 또한 인 비보에서 처치된 NOD 마우스로부터 얻어진 항-CD3 자극 비장세포 및 Th2 표현형에 대한 T-헬퍼 세포의 편극화를 억제한다. 본 발명자들은 이전의 실시에서, 본 발명자들은또한 NMPF(IR)이 패혈증 또는 폐혈증 쇼크에서와 같은, 급성 염증 반응을 억제하는 잠재력을 가진다는 것을 보였다. 그래서, 급성과 같은 만성 면역 반응도 NMPF에 의해 조절된다.
이론에 구속되지 않고 예로서, 임신시 태아는 Th2-형 면역 반응에 대한 모계의 면역체계의 편향을 통해 부분적으로 이루어지는, 잠재적인 모계의 면역 거부 반응에서 살아야 한다. 그러나, 이 방법에서는 모계의 면역 억제는 코스티코스테로이드 또는 다른 면역억제 요법을 받은 이식환자에서 관찰되는 것과 같은, 감염의 부수적인 위험이 동반한다. 적어도 임신부 소변에서 얻어질 수 있는 NMPF(IR)인자 및 그것으로부터 유도된 hCG 제제는 태아의 모계의 거부 반응이 억제되는 것 및 모계가 감염에 대한 저항성을 유지하거나 또는 더욱 증가하는 것과 같은 그러한 방법에서 면역 반응을 조절할 잠재력을 가진다. 이들 및 관련된 인자 또한 면역 질환의 억제, 특히 임신 중에, Th1-중재 면역 질환에 대한 원인이 된다.
이론에 구속되지 않고 예로서, 임신은 분명히 모순된 면역 조절을 요구한다. 한편으로는, 임신 중의 후천적인 면역 반응은 면역 내성 상태(Th2-형과 같은)에 대한 다른 세포 수준에서 조절되고, 다른 한편으로는 모계의 선천적인 면역체계는 감염에 대한 저항성을 위해 조절된다. 상기 증거는 모계의 선천적인 면역체계의 구성성분이 전신적으로 활성화된다. 처음 임신 3개월부터의 단핵세포 및 과립구의 수가 증가된다. 정상적인 임신 순환에서 모계의 혈액에서의 단핵세포 및 과립구는 전신성 폐혈증에서 관찰된 변화와 비교할 수 있는 여러 방법에서, 활성 표현형을 가진다. 다른 것들은 증가된 단핵세포의 식균 작용 및 호흡기관 파열을 보이고, 내독소에 대한 증가된 반응뿐만 아니라 단핵세포의 내독소 수용체 CD14의 증가된 발현을 보인다: 정상적인 여성에서의 단핵세포는 패혈증 쇼크에서와 같은 프로인플래머토리 사이토킨(proinflammatroy cytokine)을 더욱 생산한다. 많은 연구에서 급성기 반응에 전형적인, 가용성 선천적 인자의 원형질 농도의 변화와 마찬가지로 임신에서의 과립구 활성이 유사하게 발견되었다. 선천적 체계의 모든 구성 성분이 모두 모계의 순환에서 활성화되지는 않는다. 가장 현저하게, 세포독소 활성 및 NK 세포에 의한 IFN-감마의 생산은 억제된다.
이론에 구속되지 않고 예로서, 본 발명자들은 임신 중의 면역 반응을 조절하는 NMPF의 메카니즘 중 하나가 다음과 같다고 제안한다: 임신 중에 어떤 NMPF 인자는 T 세포가 활성화된다면, Th2 반응에 대한 성향이 있다는 것을 보증할 수 있다. 이것은 대식세포, DC, T 세포 및 조절 서브세트 다른 세포 개체군에 영향을 주는 것으로 이루어질 수 있다. 다르거나 또는 유사한 NMPF 인자는 단핵세포를 활성화할 수 있고, 따라서 다른 선천적인 세포도 활성화할 수 있다. 본 발명자들은 자간전증에서 다른 NMPF 인자 사이에 불균형이 있다고 제안한다. NMPF 인자에 의한 선천적인 세포의 과잉-활성 및/또는 NMPF 인자를 억제하는 반응성이 있는 면역 반응(특히 Th1-형)에서의 감소는 전신성 폐혈증에서 관찰된 변화와 비교할 수 있는 방법에서, Th1 표현형에 대한 Th1/Th2 불균형을 야기할 수 있다. 본 발명자들의 결과는 선천적 면역을 자극하고 폐혈증 쇼크를 촉진할 수 있는 NMPF 인자(NMPF-3.3)가 있다는 것을 보여주는 반면에, NMPF-3.2와 같은 다른 NMPF 인자는 폐혈증 쇼크 및 NMPF-3.3을 억제한다. NMPF-3.2 인자는 예를 들어, Th2-형에 대해 후천적인 면역 반응을조절하고 (WO99-59617; hCG와 조합된 NMPF-3(IR-P3)에 의한 IFN-감마의 억제) 일반적인 임신 및 Th1 자가면역 질병의 억제, 내성 유도 등에 필수적인 hCG와 조합된 NMPF-3 분획에 존재한다.
hCG 제제(프레그닐) 및 임신부 소변의 분석은 hCG 제제 및 임신부 소변이 약 1:2의 비율 또는 그 이상의 NMPF-3.2 및 NMPF-3.3분획을 포함하는 항-쇼크 활성을 갖는 것을 보여주는 반면에, 항-쇼크 활성이 없는 또는 악화되어 있는 폐혈증 쇼크의 hCG 제제는 1:3 또는 보다 낮은 비율의 NMPF-3.2 및 NMPF-3.3을 가진다. 이것은 또한 모든 시판 중인 hCG 제제가 항-쇼크 활성을 갖지 않는 이유를 설명한다. 더구나, 본 발명자들은 NMPF-3.3 : NMPF-3.2의 높은 비율을 가지고 그래서 항-쇼크 활성을 갖지 않는 hCG 제제가 활성 hCG 제제와 혼합되어, 항-쇼크 활성을 갖는 것을 보여주었다. 그래서, NMPF-3.2 및 NMPF-3.3과 같은 다른 NMPF 인자 또는 분획 사이의 비율은 성공적인 임신의 예상을 위해서 뿐만 아니라, 자간전증, 폐혈증 또는 폐혈증 쇼크 등과 같은 다른 면역병리학을 위한 진단 마커(marker)로서 이용될 수 있다. 더구나, 자간전증과 같은 비정상적인 임신에서, 또한 치료로서 NMPF 인자 또는 NMPF-분획을 이용할 수 있다. 본 발명자들의 실험 또한 NMPF(NMPF-3.2)가 쇼크 유도 후 30시간 동안은 폐혈증 쇼크를 억제한다는 것을 보였고, 이것은 NMPF가 TNF-알파, IL-1b, MIF와 같은 내독소 치사의 초기 조절제를 억제할 뿐만 아니라, 최근에 특징화된 고이동성 군-1(HMG-1) 단백질(Science 285, 248-251)과 같은 후기 조절제를 억제한다.
hCG는 NGF, PDGF-B 및 TGF-베타 같은 시스테인 결절 성장 인장의 구조 상위계열 중 하나이고, LH, FSH 및 TSH를 또한 포함하는 당단백질 호르몬 계열 중 하나이다. 그들은 각각 두 개의 비공유적으로 연계된 단백질 서브유니트, 일반 15 kD 알파 사슬 및 호르몬 특이 23 kD 베타 사슬로 구성된다(Annu. Rev. Biochem. 50, 465-495). hCG 는 정상적인 임신의 태반 트로포블라스트에 의해, 그리고 임신 중 트로포블라스트 질환에서 생산된다. 이것은 또한 폐경기 전 및 후의 여성에서의 그리고 남성에서의(Trends in Endocrinology and Metabolism 1, 418-421) 뇌하수체에 의해 매우 적은 양이 생산되고(Endocrinology 137, 1402-1411), 많은 비-임신 악성 종양 및 다른 조직에서 생산된다. hCG는 구조적, 면역학적 및 생물학적인 차이를 갖는 이성질체의 계열로서 복잡한 구조를 가진다. 이종성을 위한 화학적 근거는 확실하게 알려지지는 않았지만, 아미노산 구성, 탄수화물 잔기 또는 둘 다에서의 차이로 제안되었다. 더욱 최근에는 특정 메티오닌 잔기의 산화 역시 그 원인일 것임을 보였다. hCG, 알파 및 베타-서브유니트, 그들의 니크된 단편, 베타-코어 단편의 다른 형태 및 hCG의 다중 이성질체가 다른 조직 및 체액에서 보고되었다(Journal of Endocrinology 161, 99-106; Endocrinology 129, 1541-1550; Obstet. Gynecol. 77, 53-59; Journal of Biochemistry 107, 858-862; Obstet. Gynecol. 80, 223-228; Endocrinology 133, 985-989; 129, 1551-1558; 130, 2052-2058; Journal of Endocrinology 135, 175-188; 139, 519-532; Molecular and Cellular Endocrinology 125, 93-131).
모든 시판 중인 hCG 제제는 임신부 소변으로부터 유도되고 hCG의 다른 파괴 생산물을 함유하므로, 본 발명자들은 이 생산물들이 NMPF 활성을 가진다고 추측하였다. hCG의 가장 알려진 파괴 생산물은 베타-코어 hCG이고, 베타-서브유니트 잔기 44-45, 46-47 및 47-48 사이의 펩티드 결합 니크이다. b48(NMPF-K)는 임신부 소변에서의 분자의 대략 10-20%에서 발견되고, hCG의 일반 소변의 대사 산물과 연계된다. 본 발명자들의 실험은 NMPF-K는 폐혈증 쇼크(MIF 같은) 및 스플레노사이트의 LPS 유도 증식화를 단독으로 또는 비활성 hCG 제제과 결합하여 촉진한다. 이것의 효과는 항-MIF, 활성hCG 제제, NMPF-3.2 및 변성 b48(NMPF-Kb) 펩티드와 하기에 적합하다. 이것은 NMPF-K 활성이 NMPF-3.3과 유사하고, NMPF-Kb 활성은 NMPF-3.2와 유사하다는 것을 보인다. 더구나, 베타-코어 단편의 이종성과 마찬가지로 hCG 및 그것의 서브유니트에서는 다른 펩티드 결합의 분열 또한 있다. 예를 들어, 주로 hCG 제제 및 소변에서 발견되는, b45 결합의 분열은 아마도 박테리아의 단백질 파괴 효소의 활동으로부터 유도된다. 더구나, Medeiros et. al.은 베타-코어의 환원된 및 S-카르복시메틸레이트 형태에서의 HPLC 분리는 세 가지의 펩티드를 보였지만, 그들 중 두 개는 서열화될 수 있고 이전에 보고된 bhCG의 b6-40 및 b55-92 펩티드를 예시하는 반면에, 세 번째 피크는 몇 개의 불확실한 아미노산에 기인한 낮은 신호 때문에 명확한 서열을 주지 않았다고 나타냈다. 본 발명자들은 NMPF-K의 파괴 생산물이 NMPF-3.2와 활성을 분담한다고 제시했다. 이 NMPF-K 펩티드는 두 개의 베타-코어 단편(b6-40 및 b55-92) 사이에 있고 부분적으로 베타-코어 b55-92 단편으로부터 유도되었다. 베타-코어 단편 또는 아직 알려지지 않은 베타-코어 펩티드의(Medeiros et. al. 이 미확인 아미노산을 가진 베타-코어 분획을 제시하는 것처럼) 다른 단독 및/또는 이중 분열 생산물이 hCG 제제 및 임신부 소변에서 NMPF활성의 원인이 되는 것 또한 가능하다. 베타-코어에서의 부가적인 미확인 아미노산 및/또는 부가적인 글리코스화를 가진 b48의 파괴 단백질은 다른 항-당뇨병 및 항-만성 염증 활성을 가진다.
요컨대, 본 발명은 다른 것들 중에서 hCG의 소변 대사 산물로부터 유도되거나 얻어질 수 있는, 특히 베타-hCG의 (니크된) 형태, 또는 (합성의) 펩티드 동족체 또는 그것으로부터의 유사체로부터, 면역조절제(면역조절 펩티드)를 제공한다. 베타-hCG의 이러한 형태들은 베타-서브유니트 안에서 펩티드 결합 균열을 가지고 (Birken et. al., Endocrinology 133:1390-1397, 1993), 여기에서는 파괴 생성물, 특히 베타-44에서 베타-49 영역까지의 그들이 제공하는 것과 같은 동물 모델 시험 시스템을 이용하여 현저한 면역조절 효과를 보인다는 것을 제공한다.
여기에서는 하기에 기재된 것처럼 hCG로부터 얻을 수 있는 펩티드가 폐혈증 쇼크 모델에서 강한 면역조절 효과로 반응하는 동물 실험을 예로 든다.
실시예 2
재료 및 방법
겔 투과: 본 발명자들은 시판 중인 hCG 제제(네덜란드산 c-hCG, 프레그닐, Organon, Oss)을 다음과 같이 분류(分溜)하였다: 본 발명자들은 Alltech의 거대 구체 크기 배제법(GPC)의 60Å 컬럼(column)이 구비된 Shimadzu HPLC 시스템을 50mM 중탄산 암모늄 완충 용액에서 이용하였다. 이 컬럼의 분리 범위는 28,000-250 Dalton이었다. 샘플(20,000 IU hCG/㎖) 도입량은 10-50 ㎖이었다. 외부 분자량 기준 또한 컬럼 용출 위치를 보정하여 이용하였다. 사용된 마커는 다음과 같다: 아프로티닌 (aprotinin) (6,500 Da), 사이토크롬 C (12,400) 및 카보닉 안히드라제 (29,000). 더구나, Pelicon 시스템으로 얻어진 농축된 소변(소변 정제를 참조)은 0.45㎜의 여과기를 통해 여과하였고, 50mM의 중탄산 암모늄에 용해된 40,000 IU c-hCG(프레그닐)은 Superdex G25 (30㎜ ID x 990㎜ L) 탈염화 칼럼이 구비된 Shimadzu HPLC 시스템으로 5%의 메탄올이 보충된 50mM의 중탄산 암모늄 완충 용액에서 분석하였다. 컬럼의 분리 범위는 5000-1000 Dalton이었다. 샘플 도입량은 7-10㎖이었다. 유속은 250분 동안 3㎖/분이었다. 외부 분자량 기준 또한 컬럼 용출 위치를 보정하여 이용하였다. 100㎖의 분획이 수집되고, 동결 건조되고, 더 나아가서 항-쇼크 활성에 대하여 시험되었다.
소변 정제: 임신 초기 3개월의 임신부 소변(2 리터)이 건강한 지원자로부터 병에 수집되었고, 2일 안에 실험실로 인도될 때까지 냉장되었다. 인도 시, 리터당 1그램의 아지화나트륨이 가하여졌고, pH는 수산화나트륨으로 7.2-7.4로 조절되었으며 상온(RT)에서 1시간(h)동안 침전되도록 하였다. 대략적으로, 상청액의 75%은 가만히 따르어지고, 침전물에 가까운 잔류물은 침전물을 제거하기 위해 원심분리(4℃에서 25000 rpm으로 10분간)하고 상청액의 나머지에 가하였다. 상청액(약 2리터)은 5kDa를 차단하는 Pellicon XL 여과기(Millipore, cat. No. PXC010C50)가 구비된 Pellicon 초여과기 배치로 농축하였다. 최종 용량은 150㎖이었다. 건강한 비-임신 여성으로부터의, 그리고 자가면역 질환(SLE, Sjogren)을 가진 초기 3개월의 임신부로부터의 소변은 상기와 같은 방법으로 처치되었다.
내독소 쇼크 모델: 내독소 모델을 위해, BALB/c 마우스에 8-9 ㎎/㎏ LPS(E.coli 026:B6; Difco Lab., Detroit, MI, USA)를 절치근위에 주사하였다. 비교군 (PBS)은 PBS i.p.만을 가지고 처치하였다. NMPF의 효과를 시험하기 위해서, 본 발명자들은 LPS 주사한 다음 2시간 후에 펩티드(5㎎/㎏)를 가진 또는 다른 분획 (0.5-1㎎/㎏)을 가진, 다른 hCG 제제(PG23; 프레그닐 배치 no. 235863, PG25; 프레그닐 배치 no. 255957)의 300-700 IU를 1회 투여량으로 BALB/c를 처치하였다.
LPS 유도 증식화: 비장세포의 증식 반응 변경하는 다른 분획, 펩티드 또는 시판 중인 hCG(c-hCG)로 LPS 주사된 BALB/c 마우스의 처치를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 또한 상기 언급한 LPS 쇼크 실험으로부터 비장세포를 분리하였다. 처치된 BALB/c 마우스로부터의 총 비장세포(1x106세포/㎖)는 다른 농도(5, 10, 20 mcg/㎖)의 LPS를 가진 10%의 FBS로 보충된 RPMI+로 둥근 바닥 96-웰 플레이트에서 재활성화하였다. 플레이트는 37℃에서 24시간동안 5%의 CO2가 있는 대기 중에서 인큐베이트하였다. 증식화는 배양에서 마지막 12시간동안 0.5 mCi/웰을 가하는 [3H]TdR 혼합법을 통해 측정하였다.
유도 세포 계수: 실험에서, 폐혈증 쇼크 유도 48시간 후 비장세포는 유도 세포 계수 분석을 위해 분리되었다. 이들 실험에서 분석된 세포 표면 마커는 CD19, CD80, CD40, B220, CD4, F4/80, NK1.1, DX-5 및 CD25이었다. 이들 마커를 분석하기 위해, FIFC 또는 PE 결합된 mABs를 BD PharMingen으로부터 구입하였다. 간략하게, 비장세포(2x105)는 FACS 완충용액으로 두 번 세척하고 제조자 지침서에 따라서 mABs와 함께 인큐베이트하였다. 이후에, 세포는 세척되고 FACSort 유도 세포 계수기 (Becton Dickinson)으로 분석되었다. 그들의 앞면 및 측면 소산 특성을 기초로 하여, 살아 있는 세포를 차단하고 분석하였다.
관상 동맥 폐색(CAO) 실험: NMPF는 급성 염증 마우스 모델뿐만 아니라 만성 염증에서 면역조절 효과를 가진다. TGF-베타1, TNF-알파, IL-1 및 ROS(반응적인 산소종) 같은 어떤 사이토킨은 빈혈 및 심근경색을 이끄는 인 비보 관상 동맥 폐색 및 재관류의 연장된 에피소드에 의해 생산된 비가역적인 심근 손상에 관련있으므로, 본 발명자들은 임의의 사육된 수컷 Wistar 래트(rat) (300g)에서 펩티드의 심장-보호 특성을 시험하였다. 실험은 Council of the American Physiological Society에 의해 승인된 the Guiding principles in the Care and Use of Animals에 따라서 그리고 Erasmus University Rotterdam의 Animal Care Committee의 규정 하에서 수행하였다. 간략하게, 래트(n=3)는 10분 동안 펩티드 처치(0.5㎎/㎖)의 1㎖을 정맥 주사한 후 30분 동안 안정시켰다. 처치 완료 5분 후에, 래트는 60분 동안 관상 동맥 폐색에 직면하였다. CAO의 최종 5분에, 래트는 다시 120분 동안 재관류(IP)를 이끄는 펩티드(0.5㎎/㎖)의 1㎖를 10분이 넘도록 정맥 주사하였다. 실험 및 외과적인 절차는 Cardiovascular Research 37 (1998) 76-81에 자세하게 기재되었다. 각 실험의 마지막에, 관상 동맥은 재-폐색되고 일반적으로 관류된 심근을 진한 파란색으로 착색하고 위험한 상태에서 착색되지 않는 영역(AR)의 윤곽을 나타내는 Trypan Blue(0.4%, Sigma Chemical Co.) 10㎖으로 관류하였다. 그리고 나서 재빨리 심장을 절개하고 최고점에서 바닥까지 1㎜의 얇은 조각으로 잘랐다. 각각의 얇은 조각으로부터, 우심실은 제거하고, 좌심실은 미세-외과용 가위를 이용하여, AR 및 나머지 좌심실로 나누었다. 그런 다음, AR은 37℃의 핵심 조직을 자주색으로 착색하지만 경색된 조직은 착색하지 않는, Nitro-Blue-Tetrazolium(Sigma Chemical Co.; Sorensen 완충 용액 1㎖당 1㎎, pH 7.4)에서 10분 동안 인큐베이트하였다. 경색되지 않은 영역에서 경색된 영역(IA)을 분리한 후, LV의 다른 영역을 건조하고, 개별적으로 무게를 측정하였다. 경색 크기는 AR의 퍼센트로 표현하였다. 비교군 래트는 PBS로 처치하였다.
NOD 실험: 본 발명자들은 8-10주 정도의 NOD 마우스를 PBS(n=3) 또는 펩티드 1(VLPALPQVVC), 또는 재조합 hCG(rhCG, Sigma) 및 펩티드 1과 조합된 rhCG로 3일 동안 각각 10-40 mcg 절치근위로 처치하였다. Th1 편극화의 처치 효과를 결정하기 위해서, 본 발명자들은 CD4+ 세포를 분리하고 다음과 같이 Th1 편극화 분석을 수행하였다: 비장으로부터 정제된 CD4+ T 세포는 B 세포, NK 세포, 세포/대식세포 및 과립구에 선택적인 항체로 보체 고갈에 기인하는 음성 선택에 의해 얻어진다. 세포는 더 나아가서 CD11b, B220, CD8 및 CD40에 대한 비오틴화 mAbs의 혼합체로 자기 활성화 세포 분류법을 이용하여 정제하고, 이어서 스트렙타비딘-결합된 미세 비드(Milteny Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)로 인큐베이션하였다. 본 실험에서 사용된 CD4+ T-세포는 유도 세포 계수에 의해 결정된 것으로 90-95% 정제된 것이다. 초기 활성화를 위해, 정제된 CD4+ T 세포는 평평한 바닥 96-웰 플레이트 (Nalge Nunc Int., Naperville, IL, USA)에서 1x105세포/웰로 배양되고, 플레이트에 묶인 항-CD3 mAb(145-2C11, 25㎎/㎖), 항-CD28, 및 IL-2(50 U/㎖)로 활성화된다. Th1 세포의 차별화를 위해, 항-IL-4 mAb(11B11; 10㎎/㎖) 및 IL-12 (10ng/㎖)가 상기 배양액에 가하여졌다. 언프라임드(unprimed) 배양액은 오로지 항-CD3, 항-CD28 및 IL-2를 포함하였다. 모든 1회 투여량은 예비 실험에서 극대화하였다. 배양 4일 후에, 세포는 3번 세척되고, 새로운 항-CD3 코팅된 96-웰 플레이트에 옮겨졌고 IL-2(50U/㎖) 및 항-CD28(10mcg/㎖)의 존재 하에서 재활성화되었다. 48시간 후에, 상청액은 편극화를 위한 해독에 의해 ELISA에 의한 IFN-감마 생산을 위해 수집되었고 분석된다.
사이토킨 ELISA: IFN-감마는 포획 항체로서 모노클로날 항-IFN-감마 항체 (XMG1.2)를 이용하여 탐지하고 비오틴화-결합된 래트 항-마우스 IFN-감마 모노클로날 항체(R46A2)를 이용하여 나타냈다. 탐지를 위해 ABTS 기질을 이용하였다.
평평한 바닥 미세 플레이트(96-웰, Falcon 3912, Microtest Ⅱ Flexible Assay Plate, Becton Dickinson, Oxnard, USA)은 PBS에 희석된 IFN-감마 선택적인 포획 항체(XMG1.2, 5㎎/㎖)를 코팅하고, 18시간동안 4℃로 방치하였다. 코팅 후, 플레이트는 세척되고(PBS, 0.1% BSA, 0.05% Tween-20), 1% BSA가 보충된 PBS로 상온에서 1시간동안 차단하였다. 세척 후, 샘플과 표준대조군을 가하고 상온에서 4시간 이상 인큐베이션하였다. 그 후에, 플레이트를 세척하고, 비오틴화 탐지 항체를 가하고 (R46A2, 1mcg/㎖), 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이트하였다. 세척 후, 스트렙타비딘-퍼옥시다제(1/1500로 희석된, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA)을 가하였다. 1시간 후, 플레이트를 세척하고, 반응을 2,2'-아지노-비스-3-에틸벤즈-티아졸린 -6-설폰산(ABTS, 1㎎/㎖, Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 가시화하였다. 광학적인 농도는 Titertek Multiscan(Flow Labs, Redwood City, USA)을 이용하여 414㎚에서 측정하였다.
펩티드 합성: 펩티드는 고형 지지체로 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(Barlos, 1991)를 가지고 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc)/tert-부틸에 기반을 둔 방법론을 이용하는 고체-상 합성(Merrifield, 1963)으로 제조되었다. 글루타민의 부사슬은 트리틸기로 보호하였다. 상기 펩티드는 수동으로 합성되었다. 각각의 결합은 다음의 단계로 구성되었다. (ⅰ) 디메틸포름아미드(DMF)에서 피페리딘에 의한 알파-아미노 Fmoc-보호의 제거 (ⅱ) DMF/N-메틸포름아미드(NMP)에서 디이소프로필카르보디이민(DIC)/1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)로 Fmoc아미노산(3 eq)의 결합 (ⅲ) DMF/NMP에서 무수아세트화물/디이소프로필에틸라민(DIEA)으로 잔류 아미노기의 덧씌음. 상기 합성을 완료하기 위해, 펩티드 수지는 트리플루오로아세트산(TFA)/H2O/트리이소프로필실란(TIS) 95:2.5:2.5의 혼합물로 처치하였다. 30분 후, TIS는 탈색될 때까지 가하였다. 용액은 진공에서 기화되고 펩티드는 디에틸에테르로 침전하였다. 결정질의 펩티드는 물(50-100 ㎎/㎖)에 용해되고 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 정제하였다. HPLC 조건은 다음과 같다: 컬럼: Vydac TP21810C18(10x250㎜); 용출 시스템: v/v으로 물에서의 0.1% TFA (A) 및 v/v으로 아세토니트릴(ACN)에서의 0.1% TFA (B)의 농도 구배 시스템; 유속: 6㎖/분; 흡광도는 190-370㎚에서 탐지하였다. 다른 농도 구배 시스템도 이용하였다. 펩티드 LQG 및 LQGV를 위해: 100%의 A를 10분간 이이서 50분 동안 0-10%의B를 선형 농도 구배하였다. 펩티드 VLPALP 및 VLPALPQ를 위해: 5%의 B를 5분간 이이서 1%의 B/분의 선형 농도 구배하였다. 수집된 분획은 40℃에서 감압 하에서 회전 피막 증발법에 의해 약 5㎖로 농축하였다. 남은 TFA는 아세테이트 형태로 음이온 교환 수지(Merck Ⅱ)으로 컬럼을 두번 이상 용출하는 것으로 아세테이트에 대하여 교환되었다. 용출물을 응축하고 28시간동안 동결건조하였다.
EAE 모델: 암컷 SJL/J 마우스(n=4; 생후 8-12주; Harlan, Zeist, the Netherlands로부터 얻어진, 또는 Erasmus University Rotterdam에서 사육된)는 미코박테리움(Mycobacterium) 결핵 H37 Ra(Difco, St. Louis, MO)의 4㎎/㎖를 포함하는 CFA에서 유상화된, 프로테오리피드 단백질 펩티드 139-151(PLP 139-151; H-His-Ser-Leu-Gly-Lys-Trp-Leu-Gly-His-Pro-Asp-Lys-Phe-OH; Peptides International. Louisville, KY 또는 TNO Prevention and Health, Leiden, The Netherlands 중 한 곳으로부터 얻어진)의 100mcg로 면역화하였다. EAE의 독특한 모델은 면역화 후 0 및 2일째에 50 mcl의 PBS i.v.에서의 200㎎ 백일해 독소 또는 면역화 후 1 및 3일째에 200mcl의 PBS i.v.에서의 1010의 보르데텔라(Bordetella) 백일해 박테리아(RIVM, Bilthoven, The Netherlands) 중 하나를 주사하여 유도하였다. 마우스는 EAE의 임상적인 증상을 위해 조사되고, 매일 중량을 측정하였다. EAE의 임상적인 증상은 중간 점수를 0.5로 하는 등급으로 0 내지 5의 범위의 점수로 기록하였다: (0) 임상적 증상이 전무함; EAE의 (1) 축 늘어진 꼬리; (2) 가벼운 대부전 마비; (3) 이원적인 뒷다리 마비; (4) 다 죽어감; 또는 (5) 죽음. 면역화 후 7일부터 시작하여, 200mcl의 PBS의 총 용량의 c-hCG(10,000 IU)로부터의 60-F2 또는 60-F3 분획은 2주동안 격일마다 절치근위에 주사되었다. 대조군 마우스는 PBS만으로 처지되었다.
결과
소변 및 시판 중인 hCG 제제의 겔 투과: c-hCG(도 16) 및 첫번째 3개월 임신부의 소변은 GPC 60A 컬럼이 구비된 HPLC 시스템에서 분획되었다. 세 개의 선택된 영역, >10 kDa의 분자량이 현저하게 용출되는 60A-분획 1(60A-F1), 10kDa-1kDa 사이의 분자량이 현저하게 용출되는 60A-F2, 및 <1kDa의 분자량이 현저하게 용출되는 60A-F3이 분획되었다. 이 분획들은 더 나아가서 항-쇼크 활동력을 위해 시험하였다.
더구나, 초기 임신 3개월의 건강한 임신부로부터의 소변, 자가면역 질병을 가진 초기 임신 3개월의 임신부로부터의 소변 및 건강한 비-임신 여성으로부터의 소변은 Superdex G25 컬럼에서 분석되었다. 모든 100㎖의 분획 또한 항-쇼크 활성을 위해 시험하였다. 도 17 및 18은 초기 임신 3개월의 건강한 임신부로부터의 c-hCG 및 소변의 크로마토그램을 보여준다.
생존 곡선: c-hCG 및 소변 분획 처치된 마우스에서의 LPS 처치의 높은 1회 투여량의 효과를 결정하기 위해, BALB/c 마우스(n=6)는 LPS(8-9㎎/㎏)가 복막 속으로 주사되었고, 5일 동안 매일 생존을 평가하였다. 본 발명자들의 이전 특허 (WO9959617)에서 그리고 이 환자 적용에서 본 발명자들은 세 개의 선택된 영역이 GPC 60A 컬럼에서 분획된 것을 제시하였다: >10 kDa의 분자량이 현저하게 용출되는60A-F1, 10kDa-1kDa 사이의 분자량이 현저하게 용출되는 60A-F2, 및 <1kDa의 분자량이 현저하게 용출되는 60A-F3. 모든 이들의 활성은 항-쇼크 활성을 위해 시험되고 그들 모두는 항-쇼크 활성(아마도 더 낮은 분자량의 활성 또한 고분자량 분획과 함께 용출된다)을 가졌다. PBS-처지 BALB/c 마우스는 높은 1회 투여량의 LPS 주사 후 1 및 2일 사이에 죽고, 5일째에 생존한 마우스는 10%미만이었다. 대조적으로 60A-F1 및 60A-F3 처지 마우스 100%가 5일째에 생존하는 반면에, 60A-F2 처지 마우스 약 70%정도만이 생존하는 것은 예시하였다. 더 낮은 분자량 분획 또한 항-쇼크 활성을 가지므로, 본 발명자들은 c-hCG, 초기 임신 3개월의 소변, 자가면역 질환을 가진 초기 임신 3개월의 임신부로부터의 소변 및 건강한 비-임신 여성으로부터의 소변을 G25 Superdex 컬럼으로 분획하였다. 모든 100㎖의 분획은 항-쇼크 활성을 위해 시험하였다.
PBS-처지 BALB/c 마우스는 높은 1회 투여량의 LPS 주사 후 1 및 2일 사이에 죽고, 5일째에 생존한 마우스는 10%미만이었다. 대조적으로 c-hCG, 초기 3개월의 건강한 임신부의 소변 분획 Ⅴ 또는 자가면역 질환을 가진 초기 3개월의 임신부로부터의 소변으로 처지된 마우스 100%가 5일째에 생존하였다(P<0.001). 하지만, 전(분획 Ⅱ 및 Ⅳ) 및 후(항-쇼크) 분획 Ⅴ(예를 들어, 분획 Ⅵ) 용출 분획은 쇼크를 촉진하고, 모든 처치 마우스는 PBS 처지 마우스보다 매우 일찍(폐혈증 쇼크 유도 후 24시간 안에) 죽었다. 더구나, 분획 Ⅲ 및 Ⅴ의 항-쇼크 활성은 적어도 1:6의 비율에서 분획 Ⅱ, Ⅳ 또는 Ⅵ의 첨가에 의해 억제되었다. 이것 또한 hCG 제제 및 건강한 개인으로부터의 임신부 소변으로부터 얻어진 분획도 적용하였다. 게다가,본 발명자들은 자가면역 질환을 가진 임신부의 소변으로부터의 항-쇼크 분획의 매우 적은 양이 BALB/c 마우스에서 폐혈증 쇼크를 억제하기 위해 필요하게 된다는 것을 주의하였다. 이 여성들 또한 임신 중 자가면역 질환에서 임상적인 향상을 보였다.
질병 속도: 질병의 가시적인 증상은 모든 실험동물에게서 뚜렷하지만, 속도 및 명백히 이 질병의 심함은 두드러지게 구별되었다. LPS(내독소) 및 초기 3개월의 건강한 임신부의 소변 분획 Ⅴ, 자가면역 질환을 가진 초기 3개월의 임신부의 소변 또는 시판 중인 hCG 제제 중 하나를 가지고 BALB/c 마우스 처치 후, LPS 처치 BALB/c 마우스의 임상적인 증상은 질병의 단계 2를 초과하지 않았다. 더구나, 이 분획들도 또한 LPS 주사 후 32시간을 관리 시 쇼크 및 사망의 증상을 억제했다.
펩티드 데이터(NMPF): 하기의 표는 72시간의 기간동안 마우스의 생존 퍼센트를 나타낸다. LPS(내독소) 모델을 위해, BALB/c 마우스는 8-9㎎/㎏의 LPS(E. coli 026:B6; Difco Lab., Detroit, MI, USA)를 절치근위에 주사하였다. 대조군(PBS)은 PBS만을 절치근위에 주사하였다. 본 발명자들은 LPS 주사 2시간 후 다른 hCG제제 (PG23; 프레그닐 배치 no. 235863, PG25; 프레그닐 배치 no. 255957)의 1회 투여량 300-700 IU를 가지고 또는 펩티드(5㎎/㎏)를 가지고 BALB/c 마우스를 처리하였다.
이들 실험은 펩티드 4 및 6이 쇼크를 완전하게 억제(모든 마우스는 처음 24시간에는 2보다 높지 않은 질병 등급을 가졌다; 간략하게, 그 후에는 그들인 완전하게 회복하였고 0의 질병 등급을 가졌다)하는 반면에, 펩티드 2,3 및 7은 쇼크를 촉진(모든 마우스는 처음 24시간에는 5의 질병 등급을 갖고 대부분이 죽는 반면에,LPS+PBS로 처지된 대조군 마우스는 처음 24시간 내에는 3-4의 질병 등급을 갖고 48시간 후에는 5의 질병등급으로 죽었다)했다는 것을 나타냈다(표 1). 더구나, 펩티드 1, 5, 8, 9, 11, 12, 13 및 14는 각각의 실험에서 활성의 종류(억제 대 촉진)에서 뿐만 아니라 효과에서의 변이성을 나타냈다.
이 변이성은 다양한 펩티드의 파괴 속도에 기여할 수 있을 것이고, 다양한 펩티드 및 그들의 파괴 생성물은 인 비보에서 각각의 영향을 가진다. 상기 언급한 분획을 이용한 쇼크 실험과 유사하게, 쇼크를 억제하는 활성은 쇼크를 촉진하는 활성의 첨가에 의해 억제될 수 있고 그 반대도 가능하다.
이들 데이터는 10번 이상의 개별적인 실험으로 나타낸다.
시험 물질(HRS) 시간당 생존%
0 16 40 72
PBS 100 100 67 17
PG23 100 100 100 100
PG25 100 83 83 83
펩티드
번호 서열
1 VLPALPQVVC 100 100 50 17
2 LQGVLPALPQ 100 67 0 0
3 LQG 100 83 20 17
4 LQGV 100 100 100 100
5 GVLPALPQ 100 100 80 17
6 VLPALP 100 100 100 100
7 VLPALPQ 100 83 0 0
8 GVLPALP 100 100 83 67
9 VVC 100 100 50 50
11 MTRV 100 100 67 50
12 MTR 100 100 67 50
13 LQGVLPALPQVVC 100 100 100 100
14 (시클릭)LQGVLPALPQVVC 100 83 83 83
서열 ID: 항-쇼크 효과
LQGV +++
AQGV +++
LQGA +++
VLPALP +++
ALPALP ++
VAPALP ++
ALPALPQ ++
VLPAAPQ ++
VLPALAQ +++
쇼크 촉진 효과
LAGV +++
LQAV +++
VLAALP +++
VLPAAP +++
VLPALA +++
VLPALPQ +++
PVAALPQ +++
VLPALPA +++
표 2에서, 본 발명자들은 패혈성 쇼크실험에 있어서 펩티드 LQGV, VLPALP. VLPALPQ에 있어서 ALA-치환(PEPSCAN)의 효과를 알았다. 본 발명자들은 하나의 중성 아미노산에 의해서 하나의 아미노산조차의 변화도 다른 활동을 유도할 수 있는 것으로 결론한다. 그래서, 이들 펩티드에서 다형상 뿐만 아니라 게놈성 차이가 면역반응을 매우 정확하게 조정할 수 있다. 또한, 합성, 예를 들면, 벤질화, 아미노화, 글리코실화, 단백질분해성 절단, 항체분자 또는 기타 세포 리간드 등의 결합 도중 또는 후에 다르게 변성되는 비고전적인 아미노산 또는 유도체의 첨가에 의한 이들 펩티드(한정하지 않음)의 유도체들은 더 좋은 효과의 활동을 가져올 수 있다.
MIF는 패혈증의 주요 유도체 중 하나이므로, 본 발명자들은, 또한, 펩티드 1 그룹 마우스로 부터 취한 취장세포를 인비트로에서 LPS로 다시 자극하고, 이어서 MIF 생산을 측정했다. 도 19는 인비보에서 LPS로 처리하는 것이 PBS처리 마우스와 비교해서 MIF 생산을 증가시켰고, 한편으로 쇼크 유도 후, 펩티드 1 처리가 MIF 생산을 억제한 것을 나타내 주고 있다. 펩티드 1 단독으로 처리한 마우스에 있어서아무런 효과도 발견할 수 없었는데, 이것은 펩티드 1의 특이성을 나타내는 것이다. 그 외에, 펩티드 1 및 c-hCG-V(c-hCG로 부터의 단편 V)처리 마우스 유래의 스플레노사이트에서 또한 LPS 재자극 증식을 연구했다. 이들 데이타는, 인 비트로 내에서 LPS로 재자극 후, LPS 처리 마우스 유래의 스플레노사이트가 PBS 처리 마우스(도 20)과 비교해서 인비트로에서 더 큰 증식 능력을 갖는 것을 나타냈다. 또, 한편으로는, LPS+펩티드 1 및 LPS+c-hCG-V 처리 마우스 유래의 스플레노사이트는 LPS 처리 대조 마우스(도 20)과 비교해서 훨씬 더 높은 증식 능력을 나타냈다. PBS, 펩티드 1 또는 c-hCG-V 단독으로 처리한 마우스에 있어서는 LPS유도 증식에 있어서 아무런 차이가 관찰되지 않았다.
도 21은 인비보에서 처리한 마우스 유래의 스플레노사이트를 인비트로에서 다른 투여량의 LPS로 재자극시킨 효과를 나타낸 것이다. 이들 데이타는, 또한, 상기 증식데이타와 일치한다. 이들 실험에서, 패혈성 쇼크 유도 후, 펩티드 1(항쇼크작용) , c-hCG(항쇼크작용) 및 c-hCG-V(c-hCG 유래의 항 쇼크 단편)로 처리한 마우스 유래의 스플레노사이트의 재자극은 LPS+PBS처리 마우스와 비교해서 더 높은 증식능력을 나타냈다. 또, 한편으로는, 펩티드 2(쇼크 촉진 펩티드)로 처리한 마우스 유래의 스플레노사이트는 LPS+PBS처리 마우스(도 21)와 비교해서 같은 증식능력을 나타냈다. 이 도면에서, 펩티드 1 및 c-hCG-V 단편 처리 마우스 유래의 스플레노사이트의 증식속도(kinetics)가 같았음을 유의하는 것이 중요하다.
항패혈성 쇼크 작용을 갖는 LPS 및 펩티드 또는 단편으로 처리한 BALB/c 마우스 유래의 스플레노사이트의 시험관내 자극은 인비보에서 이들 펩티드 또는 단편으로 패혈성 쇼크의 억제와 관련된 증식을 감소시켰다. 이와 반대로, 인비보에서 LPS+항패혈성 쇼크작용 처리 BALB/c 마우스 유래의 스플레노사이트를 인비트로에서 LPS로 재자극하면 패혈성 쇼크의 억제와 관련된 증식을 증가시켰다.
유도세포계수: 처리한 BALB/c 마우스 스플레노사이트의 유도세포계수 분석은 패혈성 쇼크 억제 효과와 패혈성 쇼크 촉진효과가 스플레노사이트의 표면 마커의 특징적인 패턴과 서로 관계 있음을 나타냈다. 도 22는 쇼크억제활성(c-hCG, 펩티드 1, 펩티드 4 및 펩티드 6)이 PBS+LPS 대조군과 비교해서 CD19 세포상에서 CD80 분자의 발현을 증가시킨 것에 반하여, 마이너 효과는 쇼크을 촉진시키는 펩티드 7에서관찰되었음을 나타내 준다. 도 23은 PBS+LPS군과 비교해서 쇼크억제활성의 비장에서 CD19/CD40세포의 수효가 감소된 것을 나타내며, 한편 쇼크실험에서 펩티드 7로는 아무런 효과도 관찰되지 않았다. 도 24 및 도 25는 패혈성 쇼크 억제작용이 PBS+LPS 처리군과 비교했을 때 B220 양성 및 F4/80 양성 세포를 실활(失活)시키는 것을 나타낸다. 한편 활성화 CD4+T세포(도 26)의 수효는 패혈성 쇼크 억제작용으로 증가했다. B220-, F4/80- 및 CD4 양성 세포를 쇼크 촉진 활성(펩티드 7)으로 활성화시킴에 있어서 아무런 차이도 발견되지 않았다(도 24-도 26). 그 외에, PBS+LPS군과 비교해서 패혈성 쇼크 억제활성을 갖는 LPS 및 펩티드로 처리한 후에, NK11 세포막 마커 발현에 있어서 감소가 관찰되었으며, 한편 쇼크 촉진활성(도 27)으로 처리 후 아무런 효과도 발견할 수 없었다. Dx-5(pan-NK 세포 마커)의 수효가 패혈성 쇼크 촉진활성 뿐만 아니라 패혈성 쇼크 억제활성으로 증가한 것이 관찰되었다(도 28). 이들 결과는 패혈성 쇼크 억제활성이 대식세포와 B-세포, 증가된 수효의 활성화 CD4+T세포 및 Dx-5NK 세포와 상관될 수 있고, 한편으로 패혈성 쇼크 촉진활성이 활성화 Dx-5NK 세포의 수증가와 상관(대식세포, B 및 T 세포의 활성화 및 수효를 LPS+PBS와 비교한다)하는 것을 시사해 준다.
hCG 생물활동도: hCG는 LH 리셉터와 결합해서 cAMP를 통해서 시그날링을 유도한다. 본 발명자들은 펩티드 1,2,4,6 및 저분자량 항쇼크 단편 c-hCG-V가 LH 리셉터와 결합해서 hCG 생물활동도를 갖는지를 측정했다. 도 29는 hCG 및 c-hCG가 293-hLHRwt/CREluc 세포와 결합해서 투여량 의존 루시페라제 활동을 유도하는 것을 나타내며, 한편 펩티드 1,2,4,6 및 저분자량 단편 c-hCG-V로는 루시페라제 활동에 있어서 아무런 효과도 관찰되지 않았다(도 30). 또한, hCG 존재하에 펩티드 1,2,4,6 및 단편 c-hCG-V의 첨가는 hCG 자체에 의한 루시페라제 활동유도에 대해서 전혀 효과를 나타내지 않았다(도 31).
이들 데이타는, 이들 펩티드 및 단편 c-hCG-V가 hCG활동을 갖지 아니하고, 이들이 LH 수용체에 결합하지도 않고, 이들이 hCG가 LH 수용체에 결합하는 것을 방해하지도 않는 것을 나타낸다.
NOD 실험: 본 발명자들의 선국제특허공개 WO99/59617에서, 본 발명자들은 고수준의 IFN-감마 및 우성 Th1 세포들이 자가면역질환과 관련되었음을 개시하였으며, 본 발명자들은 c-hCG의 60A 컬럼(60A-F3)과 처음 3개월간 임신소변에서 유래한 저분자량 단편이 우성 Th1 활동을 억제할 수 있는지 여부를 시험했다. 60A-F3가 그의 전체 활동을 발휘하기 위하여 hCG와 같은 추가 인자를 필요로 하는지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 또한 NOD 마우스를 rhCG와 조합해서 60A-F3, rhCG 및60A-F3로 처리한 다음, Th1 편광을 평가했다. 도 32는 60A-F3(c-hCG) 및 rhCG 단독의 Th1 분극조건하에서 IFN-감마 생성의 중간 억제가 발견되었음을 나타내 주며, 한편 Th1 세포의 성장은 rhCG 및 60A-F3(c-hCG)의 조합으로 완전히 차단되었다(도 32). 비슷한 결과가 처음 3개월간 임신소변의 저분자량 단편 60A-F3에서 발견되었다(도시하지 않았다).
본 발명자들은, 또한, 이들 처리한 마우스에서 유래한 비장 세포를 인비트로에서 안티-CD3로 자극한 다음, 다른 시점에서 IFN 감마 생산을 측정했다. 도 33은, c-hCG 및 그의 단편 60A-F1(IR-P1) 및 60A-F2(IR-P2)와의 생체내 처리가 안티-CD3 자극 IFN-감마 생산을 억제했음을 나타낸 것이며, 한편 IFN-감마 생산에 있어서 적당한 증가는 rhCG 및 60A-F3에서 발견되었다. 그 외에, rhCG와 조합하여 단편 60A-F3(IR-P3)은 IFN-감마의 생산을 억제할 수 있다(도 33).
안티-CD3 자극증식을 연구한 결과, c-hCG 및 60A-F1로 처리한 NOD 마우스의 안티-CD3 자극 스플레노사이트는 인비트로에서 더 작은 증식능력을 갖는 것으로 나타났다(도 34). 또한, 60A-F3(IR-P3) 및 rhCG처리 마우스의 스플레노사이트는 PBS처리 대조 마우스(CTL)과 비교해서 더 높은 증식능력을 나타냈으며, 한편 rhCG와 조합하여 60A-F3(IR-P3)는 c-hCG 및 60A-F1(IR-P1)와 동일한 증식감소를 일으켰다(도 34). 60A-F2로 처리한 NOD 마우스의 안티-CD3로 자극시킨 스플레노사이트의 증식에서 적당한 효과가 발견되었다. 마찬가지로, 본 발명자들은 Th1 분화 및 IFN-감마 생산 및 증식에 대하여 rhCG와 조합하여 펩티드 1의 효과를 시험했다. 본 발명자들은, PBS(20ng/㎖)와 비교해서, 펩티드 1(27ng/㎖) 및 r-hCG 단독(25ng/㎖)의Th1 증식조건하에서 IFN-감마 생산이 증가하였고, 한편 Th1 세포의 성장은 rhCG 및 펩티드 1(7ng/㎖)의 조합으로 완전히 차단되었음을 관찰했다. 또한, 펩티드 1 및 rhCG로 처리한 마우스의 스플레노사이트는 PBS로 처리한 대조 마우스(CTL)와 비교해서 더 높은 증식능력을 나타냈으며, 한편 rhCG와 조합해서 펩티드 1은 c-hCG 및 60A-F1 및 60A-F2와 동일한 증식감소를 일으켰다.
EAE 모델: 도 35는 PLP+PTX에 의해 유도된 EAE 모델에서 60A-F1(IR-P1), 60A-F2(IR-P2) 및 60A-F3(IR-P3)의 효과를 나타낸다. 여기서, 본 발명자들은 마우스를 60A-F1 및 60A-F2로 처리하면 EAE의 유도를 지연시킬 뿐만 아니라 질환심도를 감소시키는 것을 알았다. 한편, 60A-F3 처리는 질환의 개시만을 지연시켰으며, 이 것은 60A-F2로부터 추가인자를 요구하는 것을 시사해 준다. 이 결과는, 또한 도 35에 나타낸 체중 결과와 일치한다. 이 도면에서, EAE 유도 후 활성 NMPF 단편으로 처리한 마우스는 PBS로 처리한 마우스보다 적은 체중감소를 나타냈다. 그 외에, c-hCG 및 c-hCG 유래의 60A-F3 단편으로 마우스를 처리한 것은 EAE(MS)의 만성 질환 모델인 PLB/B·백일해에 의해 유발된 EAE 마우스 모델에 있어서 보다 작은 질환심도를 나타냈다(도 36).
CAO 모델: 본 발명자들의 CAO 데이타는, PBS만으로 처리한 대조군에서 15마리의 래트가 CAO 60분 후, 이어서 리퍼퓨전(reperfusion) 2시간 후에 70±2% (평균치±오차)의 경색영역을 갖는 것으로 나타났다. 한편, 펩티드 VLPALP, LQGV, VLPALPQVVC, LQGVLPALPQ, LAGV, LQAV 및 MTRV로 처리한 래트는 각각 62±6%, 55±6%, 55±5%, 67±2%, 51±4%, 62±6% 및 68±2%의 경색영역을 나타냈다. 여기서, 본 발명자들은, 특정 펩티드(예, VLPALP, LQGV, VLPALPQVVC, LAGV)가 경색에 대한 위험에서 영역에 대한 보호성을 갖는 것을 알았다. 그 외에, 펩티드 LQAV는 보다 작은 경색영역을 나타냈지만, 어떤 경우에 있어서 그 영역은 출혈 경색되었다. 이들은 인비보에서 항패혈성 쇼크 활동을 갖는 동일한 펩티드들이다. 상기한 특정 펩티드로 처리한 마우스의 혈액이 보다 낮은 점도를 나타낸 것을 유의하는 것이 중요하다. 면역학적 효과는 별문제로 하고, 이들 펩티드는 또한 혈액응고시스템에 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 미치며, CAO와 패혈증 모델 사이에 특정 상동성이 있을 가능성이 있다. 그리하여, 양 모델에 있어서, 순환계는 질환의 발병에 중요한 역할을 한다.
검토
인간의 만성 생식선자극호르몬(hCG)은, 그의 검출이 모든 임신시험의 기초를 이루므로, 임신 호르몬으로서 알려진 당단백질 호르몬이다. 이것은 태반이 되는 트로포블라스트 조직을 발육시킴으로써 임신초기에 생산된다. 이 호르몬은 황체(배란 후 난소의 난포에서 유래됨)의 스테로이드 분비를 유지하는데 소용된다. 생성되는 스테로이드는 배(胚)의 착상 후 배의 발육에 적합한 상태에서 자궁의 내막(lining)을 유지해준다.
HCG는 당단백질 호르몬 패밀리의 부재(member)이며, 이 것은 또한 인간 황체화 호르몬(LH), 인간 난포자극호르몬(FSH) 및 인간 갑상선자극 호르몬(TSH)을 포함한다. 이들 호르몬은 공통 알파 서브유니트(commom alpha subunit)를 헤테로다이머화, 분배하며, 상기 공통 알파 서브유니트는 인간에 있어서 단일 유전자에 의해암호화되며, 각각은 호르몬 특이성을 갖는 독특한 베타 서브유니트 구조를 갖는다. 4개의 관련된 호르몬 중에서, hCG 및 그의 가까운 구조적 동족체, LH 만이 여성의 난소와 남성의 정소내에 존재하는 동일한 리셉터에 결합한다. 인간 LH는 남성 및 여성 모두에 있어서 성 스테로이드 생산을 자극하며, 따라서, 성특이성 특징을 발육시킨다. 인간 FSH는 난소 및 정소에 있어서 다른 리셉터에 결합하여, 여성의 난자와 남성의 정자의 발육을 자극해준다. 네번째 호르몬, 인간 TSH는 생식기능에 직접 관여하지는 않지만, 신체의 신진대사의 속도를 조절하는 티록신의 생산의 자극에 관여한다. 최근에, HCG의 삼차원(3D) 구조를 해결한 후에, HCG는 NGF, PDGF-B 및 TGF-베타와 같은 시스틴 나트 성장 인자(cystine knot growth factors)의 수퍼패밀리구조의 부재인 것으로 나타났다.
HCG는, 특히 소변에 있어서 여러가지의 형태를 나타낸다(Birken, 1996; O'Connor, 1994; Alfthan, 1996; Cole, 1996; Wide, 1994; Birken, 1993; Cole, 1993). 이것은 임신 처음 3개월 동안에 임신부의 소변 중에서 많이 나타난다. 이것은 그의 시알산 함유량의 가변성에 기인하는 전하 이종성(charge heterogeneity)을 나타낸다. 이들 형들은 완전한 펩티드 중추(hCG)를 갖는 헤테로다이머형 hCG, 그의 베타-루프 2(잔기 44-49)(nicked hCG)에서 펩티드 결합 절단을 갖는 헤테로다이머형 hCG, hCG 베타-서브유니트에서 유래되고, 잔기 55-92에 가지달린 잔기 6-40 디설파이드로 구성되고, 시알산을 갖지 않고 잘라낸 탄화수소기를 함유하는 hCG 베타-코어 단편, hCG(베타-hCG)의 해리에서 유래된 hCG 베타-서브유니트 및 hCG(알파-hCG)의 해리에서 유래된 hCG 알파-서브유니트를 포함한다. 그 외에, hCG의 뇌하수체형과 hLH베타-코어 단편의 뇌하수체형이 있다.
hCG의 알파-서브유니트와 같이 베타-서브유니트는 세개의 루프, 대략 루프 1(잔기 9-40), 루프 2(잔기 41-54) 및 루프 3(잔기 55-92)로 이루어진다. 베타-서브유니트는, 또한, 알파-서브유니트를 싸는 "시트벨트(seatbelt)"로 명칭되는 영역을 갖는다. 베타-서브유니트는, 펩티드결합절단이 니크된 hCG에서 생성되는 루프 2에서 일어날 때에 분자를 함께 지탱해주는 6개의 디설파이드 다리를 갖는다. 베타-코어단편은 루프 2와 시트벨트 영역이 거의 없는 것이다. 그리하여, 베타-코어단편은 전체 시트벨트 영역, 대부분의 루프 2가 없고, 베타-서브 유니트의 아미노 말단의 일부이다. 베타-루프 2 영역에서 절단(용매에 노출되어서 프로테아제에 의해 쉽게 절단되는 것으로 알려졌음)은 생물학적으로 불활성인 hCG를 생성하며, 많은 면역검정은 베타-루프 2에서 절단 후 감소된 면역력 때문에 니크된 hCG를 정확하게 측정하지 못했다.
여기서, 본 발명자들은 많은 루프 2로부터 선택된 파괴 생성물이 면역조절효과를 갖는다는 것을 알았다. 본 발명자들의 실험에서, 펩티드 4(LQGV) 및 6(VLPALP)는 쇼크를 완전히 억제했고, 한편 펩티드 2(LQGVLPALPQ), 3(LQG) 및 7(VLPALPQ)는 쇼크를 촉진시켰다. 그 외에, 1(VLPALPQVVC), 5(GVLPALPQ), 8(GVLPALP), 9(VVC), 11(MTRV), 12(MTR), 13(LQGVLPALPQVVC) 및 14(사이클릭, CLQGVPALPQVVC)는 상이한 실험에서 활성의 종류(억제 대 촉진) 뿐만 아니라 효력에 있어서 다양성을 나타냈다. 이 다양성은 각종 펩티드의 파괴 속도와 각종 펩티드가 갖는 다른 효과에 기인할 수 있다. 인간의 백혈구 엘라스타제에 의한 잔기 44, 45,48 및 49에서 시작하는 베타-hCG의 아미노산 잔기에서 니크됨이 관찰되었으며, 니크된 hCG (및 또한 유사한 니크된 잔기)의 존재는 몇사람의 연구자에 의해 수립되었다(Kardana, 1991; Birkin, 1991). 또한, 1 또는 2개의 니크된 베타 부위는, 또한 LH 제제 뿐만 아니라 단일 hCG 제제에서 보통으로 볼 수 있다(Ward, 1996; Hartree, 1985; Sakakibara, 1990; Birken, 2000; Cole, 1991; Birken, 1993). 임신 중 이들 펩티드 또는 그의 동족체의 존재는 임신의 면역조절상태를 설명해 준다. 본 발명자들은, 또한 펩티드 1과 재조합 hCG의 조합이 우성 Th1 CD4+T 세포의 발육을 억제할 수 있고, 한편 재조합 hCG 뿐만 아니라 펩티드 1 단독도 상기 발육을 억제할 수 없는 것을 발견했다. 이것은 상기 효과를 얻기 위하여 hCG로부터 추가 인자의 필요성을 강력히 시사하는 것이다. 이들 기타 인자들은, 잔기 베타-CG6-40, 베타-CG41-55, 베타-CG55-92 및 베타-CG90-110 등의 단편으로서 존재하는 것으로 알려진 다른 부분 hCG 또는 그의 동족체로부터 유래될 수 있다. 그 외에, 쇼크촉진 펩티드 뿐만 아니라 항패혈성 쇼크 펩티드도 상기 단편의 특정 영역과 약간의 상동성(>30%)을 갖는다. 앞에서, 본 발명자들은, 60A-F2(항당뇨병성 활성을 갖는 IR-P2로서 또한 알려졌음)가 항쇼크 효과를 갖지 아니하고, 어떤 경우에는 패혈성 쇼크를 촉진하는 것을 발표했다. 그리하여, 베타-hCG 유래의 상기 단편들과 조합하여 패혈성 쇼크 모델에서 사용한 펩티드(표 1)이 항-만성염증(항당뇨성) 효과를 가질 가능성이 있다. 항 EAE 활성에 대해서도 동일하다. 이들 각종 펩티드는 면역계에서 지혈을 유지하고, 감염, 패혈증, 자가면역질환 및 면역-중개 질환에서 면역계의 불균형을 조절하도록 작용한다.
본 발명자들은 우리들의 이전 국제특허출원(WO99/59617)에서 이들 NMPF 활동들이 선천 및 후천 면역반응에 대해서 조절효과를 가지며, 단일 제조사로부터의 임신소변에서 유래한 상업용 hCG제제의 결과에서 이종성을 설명하는 가변 비율로 존재하는 것을 개시했다.
여러번 연구한 결과, hCG는 태반에 의해서 생산될 뿐만 아니라, 임신하지 않는 사람 및 남성으로부터 유래한 PBMC 뿐만 아니라 뇌하수체도 hCG를 또한 생산할 수 있는 것을 알았다. NMPF가 태반 및 모성 세포에 의해 생산될 수 있는 가능성은 별문제로 하고, NMPF는 또한 각종 프로테아제의 존재하에 hCG와 같은 분자에 의해 유도될 수 있고, 그의 조정은 이들 프로테아제에 의해 단단히 조절될 수 있다. 많은 프로테아제가 인간의 태반, 혈청 및 신체의 기타 부분에 존재하는 것으로 나타났으며, 이들의 생리적인 역할 중 하나는 이러한 면역조절 펩티드의 생산일 수 있다. 본 발명자들은 또한 우리들의 실험에서 pan-NK 세포의 업레귤레이션(upregul ation)(Dx-5 마커의 업레귤레이션)을 관찰하였으므로, 이들 유형의 세포가 천연 킬러 세포활성을 가질 뿐만 아니라, 또한 선천적 면역 반응과 후천적 면역반응의 조정에 포함된다고 생각하는 것이 타당하다(Saito, 2000). 예를 들면, NK 세포는 대식세포와 같은 항원제공세포(APC), DC, 및 기타 임파구 집단의 세포반응을 조절하는 능력을 갖는다. 그 외에, NK 세포, 특히 pan-NK 세포의 강력한 세포독성활성은 상당한 독성을 일으키지 않고, 종양 및 종양전이의 억제에 기여한다(Arai, 2000). 이와 같은 면역조절효과는, 또한 패혈증과 같은 상이한 병적 발작에 포함되는 신경만에 의해 관찰된다. 이들 세포는 선천적 내성과 후천적 세포-중개 면역반응의 중개역을 하는 중요한 세포집단일 뿐만 아니라, 세포내 유기체에 대해서 APC를 통해서 T-세포 숙주반응에 직접 또는 간접적으로 작용하는 역할을 한다(Tateda, 2001). 그리하여, 임신 중, 모성 내분비계, 탈락성 면역계 및 트로포블라스트 기능에 있어서 NMPF 및 hCG에 의해 조정된 크로스 토크(cross talk)는 모성 및 태아 면역과 내분비계 사이의 관계를 조정해준다. 한편으로 NMPF 및 hCG 때문에, 포유류 태아는 성공적인 타가이식(allograft) 및 성공적인 기생체로서 감지하며, 다른 한편으로 모성 및 태아는 또한 감염과 같은 징조에 대한 보호에 대해서 최적으로 면역능력이 있다.
그 외에, 이 특허 암시에서, 본 발명자들은 특정 펩티드(예, VLPALP, LQGV, VLPALPQVVC, LAGV)가 위험을 무릅쓰고 경색영역을 보호하는 것을 밝혔다. 그 외에, 펩티드 LQAV는 보다 작은 경색면적을 나타냈으나, 어떤 경우에는 이 면적은 출혈 경색되었다. 이들은 생체내에서 항패혈성 쇼크 활성을 갖는 것과 동일한 펩티드이다. 상기한 특정 펩티드로 처리한 마우스가 보다 낮은 혈액점도를 나타낸 것을 유의하는 것이 중요하다. 면역적인 효과는 별문제로 하고, 이들 펩티드가 또한 혈액응고계에 직접 또는 간접적으로 영향을 미치고, CAO와 패혈증모델 사이에 특정 상동성이 있을 가능성이 있다. 그래서, 양 모델에서, 순환계는 질환 발생론에 있어서 중요한 역할을 한다. 이 CAO 모델에 있어서, 본 발명자들은 심근경색에 대한 NMPF의 보호역할을 알았으며, 이것은 또한 순환기 관련 질환에서와 같이 다른 기관에서 NMPF의 동일한 보호효과를 시사해준다. 이와 같은 질환의 예는 제한하는 것은 아니지만 뇌혈관 인시던트(CVI), 뇌의 순환기질환, 망막증(당뇨병과 같이 혈관질환과 관련된 것), 임신의 순환기 질환, 혈전증, 아테톰성동맥경화증이다.
NMPF는 CAO 유도 경색에 대해서 면역조절효과와 보호효과를 가지므로, 이것은 산소공급에 감소를 주는 저혈류순환(저산소증)의 위험이 있는 경우에 또한 사용될 수 있다. 이러한 것의 예로, 제한하는 것은 아니지만, 혈관조영법, PTCA, (관상) 바이패스방법 및 협착증이 있다.

Claims (44)

  1. Th1 및/또는 Th2 세포 활성을 조절할 수 있는 베타-HCG로부터 얻어지는 또는 유래될 수 있는 면역조절제.
  2. 제 1항에 있어서, 수지상 세포 분화를 조절할 수 있는 면역조절제.
  3. 제 1항에 있어서, 리포폴리사카라이드 유도된 패혈성 쇼크에 대하여 마우스를 보호할 수 있는 면역조절제.
  4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 니크된(nicked) 베타-hCG 또는 베타-코어 hCG로부터 얻을 수 있는 면역조절제.
  5. 제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열 MTRVLQGVLPALPQVVC를 갖는 펩티드 또는 그것의 기능성 단편 또는 기능성 유사체를 포함하는 면역조절제.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 기능성 단편은 아미노산 서열 LQGVLPALPQVVC 또는 그것의 기능성 유사체를 포함하는 면역조절제.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 기능성 단편은 아미노산 서열 VLPALPQVVC 또는 LQGVLPALPQ 또는 그것의 기능성 유사체를 포함하는 면역조절제.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 기능성 단편은 아미노산 서열 VLPALPQ 또는 GVLPALPQ 또는 GVLPALP 또는 VLPALP 또는 QVVC 또는 RALP 또는 LQGV 또는 MTRV 또는 VVC 또는 MTR 또는 LQG 또는 그것의 기능성 유사체를 포함하는 면역조절제.
  9. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 알라닌 잔기에 의해 치환되어 있는 면역조절제.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 마우스를 리포폴리사카라이드 유도된 패혈성 쇼크 또는 당뇨병 또는 실험 자동-면역 뇌염/다중 경화증에 대하여 마우스를 보호할 수 있는 면역조절제.
  11. 면역-중개 질환의 치료용 약제학적 조성물의 제조를 위한 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 면역조절제의 용도.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 면역-중개 질환은 당뇨병, 다중 경화증 또는 급성 또는 만성 이식 거부와 같은 만성 염증을 포함하는 용도.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 면역-중개 질환은 패혈성 또는 과민성 쇼크 또는 과-급성 이식 거부와 같은 급성 염증을 포함하는 용도.
  14. 제 11항에 있어서, 상기 면역-중개 질환은 전신계 홍반성 낭창 또는 류마티스 관절염과 같은 자가-면역 질환을 포함하는 용도.
  15. 제 11항에 있어서, 상기 면역-중개 질환은 천식 또는 기생충에 의한 질환과 같은 알러지를 포함하는 용도.
  16. 제 11항에 있어서, 상기 면역-중개 질환은 바이러스 또는 세균과 같은 감염제에 대한 과도하게 강한 면역 반응을 포함하는 용도.
  17. 제 11항에 있어서, 상기 면역-중개 질환은 자간전증(pre-eclampsis) 또는 다른 임신 관련 면역-중개 질환을 포함하는 용도.
  18. 제 12항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 치료되는 개체에서 림포구, 수지상 또는 항원제시 세포 서브세트-집단의 상대적 비 및/또는 사이토카인 활성을 조절하는 것을 포함하는 용도.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 서브세트 집단은 Th1 또는 Th2, 또는 DC1 또는 DC2세포를 포함하는 용도.
  20. 제 12항 내지 제 19항중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역조절제는 hCG 제제 또는 그것의 유래된 분획을 포함하는 용도.
  21. 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 면역조절제를 포함하는 면역-중개 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  22. 면역-중개 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물로, 마우스를 리포폴리사카라이드 유도된 패혈성 쇼크 또는 당뇨병 또는 실험 자동-면역 뇌염/다중 경화증에 대하여 마우스를 보호할 수 있는 HCG의 소변 대사물로부터 얻을 수 있는 활성 성분을 포함하는 조성물.
  23. 면역-중개-질환을 치료하는 방법으로, 동물을 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 면역조절제의 적어도 하나로 처리하는 것으로 이루어지는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 질환은 당뇨병을 포함하는 방법.
  25. 제 23항에 있어서, 상기 질환은 패혈증을 포함하는 방법.
  26. 제 24항 또는 제 25항에 있어서, 상기 동물에서 림포구, 수지상 또는 항원제시 세포 서브세트-집단의 상대적 비 및/또는 사이토카인 활성을 조절하는 것을 포함하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 서브세트-집단은 Th1 또는 Th2, 또는 DC1 또는 DC2 세포를 포함하는 방법.
  28. 제 23항 내지 제 27항중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역조절제는 조절된 및/또는 국소화된 수송을 위해, 모노클로날 항체와 같은 표적화제와 조합하여 사용되는 방법.
  29. 심장혈관 또는 순환계 질환 특히, 임신 관련 심장혈관 또는 순환계 질환을 조정하기 위한 약제의 제조를 위한 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 면역조절제의 용도.
  30. 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 면역조절제를 포함하는, 심장혈관 또는 순환계 질환 특히, 임신 관련 심장혈관 또는 순환계 질환을 조정하기 위한 약제학적 조성물.
  31. 심장혈관 또는 순환계 질환 특히, 임신 관련 심장혈관 또는 순환계 질환을조정하기 위한 방법으로, 동물을 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 면역조절제의 적어도 하나로 처리하는 것으로 이루어지는 방법.
  32. 자간전증과 같은 임신 관련 면역-중개 질환 또는 다른 면역-중개 질환을 진단하는 방법으로, 시료에서, 바람직하기는 소변 또는 혈액시료에서 상대적으로 긴-사슬 펩티드 대 상대적으로 짧은-사슬 펩티드의 상대적 비를 측정하는 것으로 이루어지고, 상기 펩티드들은 베타-HCG의 파괴로부터 유래되는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 아미노산 서열 MTRVLQGVLPALPQVVC를 갖는 펩티드의 파괴로부터 유래되는 상대적으로 긴-사슬 펩티드 대 상대적으로 짧은-사슬 펩티드의 상대적 비를 측정하는 것으로 이루어지는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 상대적으로 긴-사슬 펩티드는 아미노산 서열 LQGVLPALPQ 또는 GVLPALPQ 또는 VLPALPQ 또는 GVLPALP 또는 VLPALP를 포함하는 방법.
  35. 제 32항 또는 제 33항에 있어서, 상기 상대적으로 짧은-사슬은 MTRV 또는 MTR 또는 PALP 또는 QVVC 또는 VVC 또는 LQGV 또는 LQG을 포함하는 방법.
  36. 자간전증과 같은 임신 관련 면역-중개 질환 또는 다른 면역-중개 질환을 진단하는 방법으로, 시료에서, 바람직하기는 소변 또는 혈액시료에서 패혈성 쇼크 증진화 펩티드 대 패혈성 쇼크 감소화 펩티드의 상대적 비를 측정하는 것으로 이루어지고, 상기 펩티드들은 베타-HCG의 파괴로부터 유래되는 방법.
  37. 자간전증과 같은 임신 관련 면역-중개 질환 또는 다른 면역-중개 질환을 진단하는 방법으로, 시료에서, 바람직하기는 소변 또는 혈액시료에서 당뇨병 증진화 펩티드 대 당뇨병 감소화 펩티드의 상대적 비를 측정하는 것으로 이루어지고, 상기 펩티드들은 베타-HCG의 파괴로부터 유래되는 방법.
  38. 심장혈관 질환을 진단하는 방법으로, 시료에서, 바람직하기는 소변 또는 혈액시료에서 심부전 증진화 펩티드 대 심부전 감소화 펩티드의 상대 비를 측정하는 것으로 이루어지고, 상기 펩티드들은 베타-HCG의 파괴로부터 유래되는 방법.
  39. 면역조절제를 선택하는 방법으로, 당뇨병의 징후를 보이는 경향이 있는 동물을 펩티드 조성물 또는 그것의 분획을 처리받게 하고, 상기 동물에서 당뇨병의 발전을 측정하여 면역조절제의 치료효과를 결정하는 것으로 이루어지는 방법.
  40. 면역조절제를 선택하는 방법으로, 패혈성 쇼크의 징후를 보이는 경향이 있는 동물을 펩티드 조성물 또는 그것의 분획을 처리받게 하고, 상기 동물에서 패혈성 쇼크의 발전을 측정하여 면역조절제의 치료효과를 측정하는 것으로 이루어지는 방법.
  41. 제 39항 또는 제 40항에 있어서, 상기 치료학적 효과는 상기 동물에서 림포구, 수지상 또는 항원제시 세포 서브세트-집단의 상대적 비 및/또는 사이토카인 활성을 결정하는 것에 의해 더 측정되는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 치료학적 효과는 상기 동물에서 효소 수준을 결정하는 것에 의해 더 측정되는 방법.
  43. 제 39항 내지 제 42항중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 선택된 면역조절제.
  44. 제 43항에 따른 면역조절제를 포함하는 약제학적 조성물.
KR1020027012952A 2000-03-29 2001-03-29 면역조절제 KR100800876B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP00201139.3 2000-03-29
EP00201139A EP1138692A1 (en) 2000-03-29 2000-03-29 Fragments of human chorionic gonadotropin (hcg) as immunoregulator
PCT/NL2001/000259 WO2001072831A2 (en) 2000-03-29 2001-03-29 Immunoregulator

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20030060768A true KR20030060768A (ko) 2003-07-16
KR100800876B1 KR100800876B1 (ko) 2008-02-04

Family

ID=8171269

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020027012952A KR100800876B1 (ko) 2000-03-29 2001-03-29 면역조절제

Country Status (18)

Country Link
US (2) US7365155B2 (ko)
EP (3) EP1138692A1 (ko)
JP (1) JP5172064B2 (ko)
KR (1) KR100800876B1 (ko)
AT (2) ATE414104T1 (ko)
AU (1) AU781632B2 (ko)
CA (1) CA2407046C (ko)
CY (2) CY1108706T1 (ko)
DE (2) DE60136169D1 (ko)
DK (2) DK1887016T3 (ko)
ES (2) ES2317620T3 (ko)
HK (1) HK1052360B (ko)
IL (2) IL151945A0 (ko)
NZ (1) NZ521703A (ko)
PT (2) PT1887016E (ko)
SG (1) SG127739A1 (ko)
SI (2) SI1272515T1 (ko)
WO (1) WO2001072831A2 (ko)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040202645A1 (en) * 2003-04-08 2004-10-14 Khan Nisar Ahmed Administration of gene-regulatory peptides
US20030220258A1 (en) * 2001-12-21 2003-11-27 Robbert Benner Treatment of ischemic events
US7175679B2 (en) 2001-03-29 2007-02-13 Biotempt B.V. Oligopeptide treatment of NF-κB mediated inflammation
US8680059B2 (en) 1998-05-20 2014-03-25 Biotempt B.V. Oligopeptide acetate and formulations thereof
US6921751B1 (en) 1998-05-20 2005-07-26 Erasmus Universiteit Rotterdam Immunoregulator
EP1138692A1 (en) 2000-03-29 2001-10-04 Erasmus Universiteit Rotterdam Fragments of human chorionic gonadotropin (hcg) as immunoregulator
US20050227925A1 (en) * 2004-04-08 2005-10-13 Robbert Benner Compositions capable of reducing elevated blood urea concentration
US6844315B2 (en) 1998-05-20 2005-01-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Immunoregulator
EP1300418A1 (en) * 2001-10-04 2003-04-09 Erasmus Universiteit Rotterdam Gene regulation by oligopeptides
US20050037430A1 (en) * 2000-03-29 2005-02-17 Biotempt B.V. Methods and uses for protein breakdown products
US7576174B2 (en) 2000-03-29 2009-08-18 Biotempt B.V. Compositions capable of reducing elevated blood urea concentration
USRE43279E1 (en) 2000-03-29 2012-03-27 Biotemp B.V. Compositions capable of reducing elevated blood urea concentration
US7358330B2 (en) 2001-03-29 2008-04-15 Biotempt B.V. Immunoregulatory compositions
US20030220259A1 (en) * 2001-12-21 2003-11-27 Robbert Benner Treatment of neurological disorders
US20030220257A1 (en) * 2001-12-21 2003-11-27 Robbert Benner Treatment of trauma
US20080242837A1 (en) * 2001-12-21 2008-10-02 Khan Nisar A Peptide compositions
US20080318871A1 (en) * 2001-12-21 2008-12-25 Khan Nisar A Treatment of neurological disorders
US7501391B2 (en) 2001-12-21 2009-03-10 Biotempt B.V. Treatment of transplant survival
US7560433B2 (en) * 2001-12-21 2009-07-14 Biotempt B.V. Treatment of multiple sclerosis (MS)
US20030220260A1 (en) * 2001-12-21 2003-11-27 Khan Nisar Ahmed Peptide compositions
US7786084B2 (en) * 2001-12-21 2010-08-31 Biotempt B.V. Treatment of burns
US20030224995A1 (en) * 2001-12-21 2003-12-04 Khan Nisar Ahmed Treatment of burns
US20030220261A1 (en) * 2001-12-21 2003-11-27 Khan Nisar Ahmed Treatment of iatrogenic disease
EP1615655B1 (en) * 2003-04-08 2012-02-22 Biotempt B.V. Use of compositions for mucosal and oral administration comprising hcg fragments
EP1466613A1 (en) * 2003-04-08 2004-10-13 Biotempt B.V. Compositions for mucosal and oral administration comprising hCG fragments
EP1466611A1 (en) * 2003-04-08 2004-10-13 Biotempt B.V. Use of HCG derived peptides in the treatment of iatrogenic diseases
US7517529B2 (en) * 2003-04-08 2009-04-14 Biotempt B.V. Treatment of type I diabetes
EP1466612A1 (en) * 2003-04-08 2004-10-13 Biotempt B.V. Treatment of inflammation and sepsis with hCG derived peptides
US20090227505A1 (en) * 2004-01-07 2009-09-10 Biotempt B.V. Methods and uses for protein breakdown products
JP5252682B2 (ja) * 2005-02-25 2013-07-31 学校法人日本大学 哺乳動物ｔ細胞のサイトカインの分析方法と関連する一切の疾患の評価法と予防・治療の分析
EP1904086A2 (en) * 2005-07-05 2008-04-02 Biotempt B.V. Treatment of tumors
DE102005054454A1 (de) * 2005-11-09 2007-06-28 Universität Duisburg-Essen Verwendung von Choriongonadotropin als Immunsuppressivum
EP1864692A1 (en) 2006-06-07 2007-12-12 Biotempt B.V. Use of peptides for the control of radiation injury
EP2120991B1 (en) * 2007-02-12 2014-01-29 Biotempt B.V. Treatment of trauma hemorrhage with short oligopeptides
US20080217002A1 (en) * 2007-03-07 2008-09-11 Floyd Randolph Simonds Sand control screen having a micro-perforated filtration layer
US20110136911A1 (en) * 2007-12-20 2011-06-09 The Feinstein Institute For Medical Research Treatment of sepsis and inhibition of mif by d-t4
EP2109054A1 (en) 2008-04-09 2009-10-14 Biotempt B.V. Methods for identifying biologically active peptides and predicting their function
EP2490021A1 (en) 2011-02-18 2012-08-22 Biotempt B.V. Modulators of PRR and GPCR signalling
CN104415162B (zh) * 2013-08-21 2018-05-15 常州市肿瘤医院 治疗放化疗后白细胞减少症的中药组合物及其制备方法

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4571336A (en) 1983-08-25 1986-02-18 Endorphin, Inc. Immune stimulation
US4977244A (en) * 1985-06-27 1990-12-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Uromodulin and a process of purifying it
US4855285A (en) * 1985-12-04 1989-08-08 The Ohio State University Research Foundation Antigenic modification of polypeptides
DK237187A (da) 1986-05-12 1987-11-13 Wellcome Found Farmaceutisk anvendelse af t-pa
US5055447A (en) 1988-07-28 1991-10-08 Genentech, Inc. Method and compositions for the treatment and prevention of septic shock
US5308834A (en) 1989-02-14 1994-05-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Treatment of endotoxin-associated shock and prevention thereof using a BPI protein
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US6051596A (en) 1990-08-10 2000-04-18 Anormed, Inc. Immunosuppressive compositions
US5958413A (en) * 1990-11-01 1999-09-28 Celltech Limited Use of antibodies to TNF or fragments derived thereof and xanthine derivatives for combination therapy and compositions therefor
WO1992020795A1 (en) 1991-05-17 1992-11-26 Cetus Oncology Corporation INHIBITOR OF NF-λB TRANSCRIPTIONAL ACTIVATOR AND USES THEREOF
DE4138621A1 (de) * 1991-11-25 1993-06-17 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum screenen von substanzen mit modulierender wirkung auf einen rezeptorabhaengigen zellulaeren signaluebertragungsweg
DE69333433T2 (de) * 1992-04-01 2004-12-02 The Rockefeller University Verfahren zur in vitro kultivierung dendritischer vorläuferzellen und deren verwendung zur immunogen herstellung
ATE152734T1 (de) 1992-05-30 1997-05-15 Sikiric Predrag Bpc-peptide, deren herstellung und verwendung
US5436270A (en) 1993-04-07 1995-07-25 National Science Council Method for protecting against endotoxin-induced shock
US5380668A (en) * 1993-07-06 1995-01-10 University Of Utah Research Foundation Compounds having the antigenicity of hCG
US5837478A (en) 1993-12-23 1998-11-17 Icos Corporation Method of identifying modulators of binding between and VCAM-1
US5677275A (en) 1994-08-05 1997-10-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Treatment of cancer with human chorionic gonadotropin
US5851997A (en) * 1994-10-04 1998-12-22 Harris; Pamela Jo Use of human chorionic gonadotropin as an immune-potentiating antiviral agent
US5700781A (en) 1994-10-04 1997-12-23 Harris; Pamela Jo Method for treating Kaposi's sarcoma and HIV infections
SE520730C2 (sv) 1995-01-20 2003-08-19 Eskil Elmer Behandling av hjärnischemi och hjärnskador med ett neuroprotektivt läkemedel
WO1996032412A1 (fr) 1995-04-13 1996-10-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PEPTIDE SUPPRIMANT LA PHOSPHORYLATION IxB$g(a)
WO1996033218A1 (en) 1995-04-21 1996-10-24 Allelix Biopharmaceuticals Inc. Anti-haemorrhagic peptides
US6361992B1 (en) * 1996-05-08 2002-03-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Thyroid stimulating hormone superagonists
US6319504B1 (en) * 1996-06-24 2001-11-20 University Of Maryland Biotechnology Institute Treatment and prevention of HIV infection by administration of derivatives of human chorionic gonadotropin
WO1997049721A1 (en) * 1996-06-24 1997-12-31 University Of Maryland Biotechnology Institute Methods of treatment of wasting syndrome based on administration of derivatives of human chorionic gonadotropin
US5997871A (en) 1996-06-24 1999-12-07 University Of Maryland Biotechnology Insitute Treatment and prevention of cancer by administration of derivatives of human chorionic gonadotropin
US5968513A (en) 1996-06-24 1999-10-19 University Of Maryland Biotechnology Institute Method of promoting hematopoiesis using derivatives of human chorionic gonadotropin
US6150500A (en) 1996-07-12 2000-11-21 Salerno; John C. Activators of endothelial nitric oxide synthase
GB9617021D0 (en) 1996-08-13 1996-09-25 Salpep Biotechnology Inc Novel peptides for treatment of inflammation and shock
CA2279995A1 (en) 1997-02-07 1998-08-13 Thomas Jefferson University Peptide mimetics of the cytokine receptor gamma chain
NZ337364A (en) 1997-02-15 2001-06-29 Millennium Pharm Inc Treatment of infarcts, ischemia and reperfusion through inhibition of NFkappaB
US5801193A (en) 1997-04-15 1998-09-01 Immune Modulation, Inc. Compositions and methods for immunosuppressing
US6583109B1 (en) * 1997-06-24 2003-06-24 Robert C. Gallo Therapeutic polypeptides from β-hCG and derivatives
DE19735587B4 (de) 1997-08-16 2012-03-22 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Peptid mit radioprotektiver Wirkung, dieses enthaltende kosmetische oder pharmazeutische Zusammensetzung, für dieses kodierende Nukleinsäure, Herstellungsverfahren für dieses Peptid und die Verwendung als radioprotektives Agens
HUP0001237A3 (en) * 1997-10-20 2002-01-28 Lilly Co Eli Methods for treating vascular disorders
ATE338118T1 (de) 1997-12-12 2006-09-15 Univ Western Ontario Neues peptid, apoep1.b, zusammensetzungen und verwendungen davon
US20030220258A1 (en) * 2001-12-21 2003-11-27 Robbert Benner Treatment of ischemic events
US6921751B1 (en) 1998-05-20 2005-07-26 Erasmus Universiteit Rotterdam Immunoregulator
EP1082131B1 (en) * 1998-05-20 2003-09-17 Erasmus Universiteit Rotterdam Immunoregulator
EP1138692A1 (en) 2000-03-29 2001-10-04 Erasmus Universiteit Rotterdam Fragments of human chorionic gonadotropin (hcg) as immunoregulator
US7175679B2 (en) * 2001-03-29 2007-02-13 Biotempt B.V. Oligopeptide treatment of NF-κB mediated inflammation
US6844315B2 (en) * 1998-05-20 2005-01-18 Erasmus Universiteit Rotterdam Immunoregulator
RU2139085C1 (ru) 1998-06-23 1999-10-10 Санкт-Петербургская общественная организация "Институт биорегуляции и геронтологии" Средство, стимулирующее репаративные процессы, и способ его применения
WO2000017348A1 (en) 1998-09-17 2000-03-30 Hopital Sainte-Justine G protein-coupled receptor agonists or antagonists
JP2002531384A (ja) 1998-11-20 2002-09-24 マウント サイナイ ホスピタル ＢクラスｅｐｈｒｉｎとＰＤＺ領域との相互作用を変調するペプチド
US6507788B1 (en) 1999-02-25 2003-01-14 Société de Conseils de Recherches et D'Applications Scientifiques (S.C.R.A.S.) Rational selection of putative peptides from identified nucleotide, or peptide sequences, of unknown function
EP1560590B1 (en) 1999-03-09 2008-10-22 Fornix Biosciences N.V. Synthetic complementary peptides and ophthalmologic uses thereof
US20030148955A1 (en) 1999-04-19 2003-08-07 Pluenneke John D. Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders
RU2157233C1 (ru) * 1999-05-11 2000-10-10 Санкт-Петербургская общественная организация "Институт биорегуляции и геронтологии" Тетрапептид, обладающий геропротекторной активностью, фармакологическое средство на его основе и способ его применения
US7994278B1 (en) 1999-08-06 2011-08-09 Nobel Biosciences Llc Biologically active polypeptides derived from a novel early stage pregnancy factor designated maternin (MA)
MXPA02001349A (es) 1999-08-09 2002-07-22 Tripep Ab Inhibidores de la polimerizacion de proteinas y metodos de uso.
US6864355B1 (en) 2000-05-02 2005-03-08 Yale University Inhibition of NF-κB activation by blockade of IKKβ-NEMO interactions at the NEMO binding domain
CA2387559A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 Histatek, Llc N-formyl peptide receptor complex with a g-protein kinase signal pathway modification agent
RU2155063C1 (ru) 1999-10-20 2000-08-27 Санкт-Петербургская общественная организация "Институт биорегуляции и геронтологии" Тетрапептид, стимулирующий функциональную активность нейронов, фармакологическое средство на его основе и способ его применения
AU781678C (en) 1999-11-18 2005-12-22 Ischemix, Inc. Compositions and methods for counteracting effects of reactive oxygen species and free radicals
WO2001051508A1 (en) 2000-01-14 2001-07-19 Science & Technology Corporation @ Unm Peptide inhibitors of lfa-1/icam-1 interaction
JP2003521938A (ja) 2000-02-11 2003-07-22 イーライ・リリー・アンド・カンパニー プロテインｃ誘導体
AU2001245537A1 (en) 2000-03-10 2001-09-24 Monsanto Company Anti-hypertensive peptides
US7358330B2 (en) 2001-03-29 2008-04-15 Biotempt B.V. Immunoregulatory compositions
EP1300418A1 (en) 2001-10-04 2003-04-09 Erasmus Universiteit Rotterdam Gene regulation by oligopeptides
US7576174B2 (en) 2000-03-29 2009-08-18 Biotempt B.V. Compositions capable of reducing elevated blood urea concentration
US6783757B2 (en) * 2000-06-01 2004-08-31 Kirkman Group, Inc. Composition and method for increasing exorphin catabolism to treat autism
US6586403B1 (en) 2000-07-20 2003-07-01 Salpep Biotechnology, Inc. Treating allergic reactions and inflammatory responses with tri-and dipeptides
US20020155106A1 (en) 2000-12-01 2002-10-24 Hammond David J. Method of identifying a ligand for a target molecule
WO2002085117A1 (en) 2001-04-24 2002-10-31 Eisai Co., Ltd. Methods and compositions for preventing and treating septic shock and endotoxemia
US20030220259A1 (en) * 2001-12-21 2003-11-27 Robbert Benner Treatment of neurological disorders
US7501391B2 (en) * 2001-12-21 2009-03-10 Biotempt B.V. Treatment of transplant survival
US20030224995A1 (en) * 2001-12-21 2003-12-04 Khan Nisar Ahmed Treatment of burns
US7786084B2 (en) 2001-12-21 2010-08-31 Biotempt B.V. Treatment of burns
US7560433B2 (en) * 2001-12-21 2009-07-14 Biotempt B.V. Treatment of multiple sclerosis (MS)
US20030220257A1 (en) * 2001-12-21 2003-11-27 Robbert Benner Treatment of trauma
US20030220261A1 (en) * 2001-12-21 2003-11-27 Khan Nisar Ahmed Treatment of iatrogenic disease
US20030220260A1 (en) * 2001-12-21 2003-11-27 Khan Nisar Ahmed Peptide compositions
US20040013661A1 (en) * 2001-12-21 2004-01-22 Gert Wensvoort Stratification
US7135286B2 (en) * 2002-03-26 2006-11-14 Perlegen Sciences, Inc. Pharmaceutical and diagnostic business systems and methods
CA2482529A1 (en) 2002-04-15 2003-10-30 American National Red Cross Method for detecting ligands and targets in a mixture
US7517529B2 (en) 2003-04-08 2009-04-14 Biotempt B.V. Treatment of type I diabetes
EP1904086A2 (en) 2005-07-05 2008-04-02 Biotempt B.V. Treatment of tumors
EP1864692A1 (en) 2006-06-07 2007-12-12 Biotempt B.V. Use of peptides for the control of radiation injury

Also Published As

Publication number Publication date
CY1110259T1 (el) 2015-01-14
AU4891301A (en) 2001-10-08
DE60136169D1 (de) 2008-11-27
ES2317620T3 (es) 2009-04-16
DK1272515T3 (da) 2009-02-09
ATE414104T1 (de) 2008-11-15
EP1272515B1 (en) 2008-10-15
CA2407046A1 (en) 2001-10-04
IL151945A (en) 2010-04-29
USRE43140E1 (en) 2012-01-24
EP1272515A2 (en) 2003-01-08
HK1052360A1 (en) 2003-09-11
CA2407046C (en) 2011-02-15
JP5172064B2 (ja) 2013-03-27
ES2315278T3 (es) 2009-04-01
JP2004503468A (ja) 2004-02-05
EP1887016A1 (en) 2008-02-13
NZ521703A (en) 2005-06-24
IL151945A0 (en) 2003-04-10
DK1887016T3 (da) 2009-03-02
EP1138692A1 (en) 2001-10-04
EP1887016B1 (en) 2008-11-12
PT1272515E (pt) 2009-01-23
US20030166556A1 (en) 2003-09-04
CY1108706T1 (el) 2014-04-09
KR100800876B1 (ko) 2008-02-04
ATE411340T1 (de) 2008-10-15
PT1887016E (pt) 2009-02-20
US7365155B2 (en) 2008-04-29
WO2001072831A3 (en) 2002-04-25
SI1272515T1 (sl) 2009-04-30
HK1052360B (zh) 2009-05-08
WO2001072831A2 (en) 2001-10-04
AU781632B2 (en) 2005-06-02
SG127739A1 (en) 2006-12-29
SI1887016T1 (sl) 2009-04-30
DE60136577D1 (de) 2008-12-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100800876B1 (ko) 면역조절제
US6844315B2 (en) Immunoregulator
US7402322B2 (en) Methods of treatment for septic shock with urine extract
IL129211A (en) Use of colostrinin in the manufacture of a medicament for the treatment of central nervous system disorders
EP1082131B1 (en) Immunoregulator
KR0159046B1 (ko) 포유류의 자기면역 포도막망막염의 치료 또는 예방방법
AU2003250892A1 (en) Use of alanyl-aminopeptidase inhibitors and pharmaceutical compositions containing said inhibitors
JPS62126199A (ja) ペプチドおよび該ペプチドを含有する医薬組成物
AU2005205734B2 (en) Immunoregulator
CA2270687A1 (en) Use of a peptide compound in the treatment of systemic lupus erythematosus
NZ539807A (en) Pharmaceutical composition comprising an immunoregulator peptide from the beta-loop 2 region of beta-HGC capable of regulating Th1 and/or Th2 cell activity for treating chronic inflammation
JPH11511186A (ja) 免疫寛容誘導のためのトランスフェリングリカン組成物
EP0058857A2 (en) Hepatosin, process for preparing it and therapeutical composition containing hepatosin
EP0958830A1 (en) Immunoregulator from pregnant mammals
JPH04112835A (ja) インスリン依存型糖尿病予防または治療剤

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130524

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140116

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150115

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160114

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170120

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180118

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190508

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200116

Year of fee payment: 13