ES2256070T3 - Actividad antimicrobiana de la primera agrupacion cationica de lactoferrina humana. - Google Patents

Abstract

Uso de un polipéptido seleccionado del grupo consistente en: a) un polipéptido que comprende al menos 8 pero no más de 18 aminoácidos contiguos del segmento N-termina de la proteína lactoferrina humana (SEC ID NO:1), donde el N-terminal de dicho polipéptido es el residuo 1 de la SEC ID NO:1; b) un polipéptido que comprende al menos 7 pero no más de 27 aminoácidos contiguos del segmento N-termina de la proteína lactoferrina humana (SEC ID NO:1), donde el N-terminal de dicho polipéptido es el residuo 2 de la SEC ID NO:1; y, c) un polipéptido que comprende al menos 6 pero no más de 27 aminoácidos contiguos del segmento N-termina de la proteína lactoferrina humana (SEC ID NO:1), donde el N-terminal de dicho polipéptido es el residuo 3 de la SEC ID NO:1; como agente antimicrobiano único para la producción de un medicamento para tratar a un paciente infectado con un microbio.

Description

Actividad antimicrobiana de la primera agrupación catiónica de lactoferrina humana.

Campo de invención

La presente invención se refiere al campo de los polipéptidos teniendo varias aplicaciones terapéuticas y profilácticas, incluida la actividad bactericida. Como tal, la presente invención se refiere en general a los campos de la química proteínica y médica.

Antecedentes de la invención

La lactoferrina (LF) es una glicoproteína de unión a metales de Mr 77.000 encontrada en la leche, lágrimas, saliva, secreciones bronquiales, intestinales, y otras secreciones. La LF está también presente en los gránulos secundarios de neutrófilos. La lactoferrina representa un papel importante en numerosas funciones inflamatorias y de respuesta inmunitaria tales como la regulación de la síntesis del factor estimulante de colonias de monocitos, la activación de la actividad de células asesinas naturales, la inhibición de metástasis, y la maduración de células T. La lactoferrina también inhibe la mielopoyesis, se une a elementos de la familia receptora de glicoproteínas de baja densidad, y bloquea la depuración de partículas remanentes de quilomicrones de las lipoproteínas (2, 32, 33, 34). También parece representar un papel en la inhibición de la producción o liberación de la prostaglandina E_{2}, interleukinas, y del factor de la necrosis tumoral por células mononucleares (35, 36, 37).

La lactoferrina humana (hLF) es también un componente muy importante de la defensa no específica de superficies mucosas y neutrófilos y es activa contra una variedad de agentes patógenos (revisados en 1,2). Esta proteína muestra propiedades antimicrobianas contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas limitando la disponibilidad de hierro medioambiental (3). No obstante, puesto que la hLF saturada con hierro es también capaz de matar bacterias determinadas (4), hay unos mecanismos distintos a la depleción de hierro que están claramente implicados en la actividad antibacteriana de la lactoferrina.

La secuencia de aminoácidos de LF ha sido determinada por la secuenciación de proteínas y secuenciación de clones de ADNc. La LF humana (hLF) consiste en una cadena de polipéptidos de 692 aminoácidos y contiene dos dominios catiónicos N-terminales, es decir, RRRR (residuos 2-5 de la SEC ID NO: 1) y RKVR (residuos 28-31 de la SEC ID NO: 1), mientras que la lactoferrina bovina (bLF) tiene sólo un dominio catiónico (residuos 17-42 (8.9)). El polipéptido de la LF está plegado en dos lóbulos globulares, cada uno de los cuales contiene una fisura de unión al hierro. La alta afinidad de la LF al hierro confiere a la proteína ciertas propiedades antibacterianas y, además, puede representar un papel en la absorción del hierro dietético por el intestino delgado.

Se ha constatado que los péptidos de origen bLF (9) al igual que los péptidos sintéticos que incluyen el segundo dominio catiónico de hLF (12) muestran actividad antibacteriana resultante de la despolarización de la membrana, permeabilidad de la membrana aumentada y daños metabólicos. Existe una controversia considerable sobre si la hLF se une a productos bacterianos, tales como la endotoxina y los glicosaminoglicanos, a través de su primer (13-15) o segundo (16.17) dominio catiónico. Un grupo de investigadores ha concluido que una región en bucle consistente en los residuos 20 a 37 de los aminoácidos de hLF es la responsable del efecto antibacteriano de hLF, mientras que los residuos 1 a 17 en la región N-terminal no son esenciales (5).

Resumen de la invención

Esta invención proporciona polipéptidos y composiciones farmacéuticas que son útiles para el tratamiento de una amplia variedad de infecciones microbianas tales como infecciones bacterianas y métodos terapéuticos para usar tales composiciones.

Por ejemplo, la presente invención proporciona polipéptidos que incluyen al menos 6 pero no más de 27 aminoácidos contiguos del segmento N-terminal de la proteína lactoferrina humana (SEC ID NO: 1), donde el N-terminal de dicho polipéptido es el residuo I de la SEC ID NO: 1. La invención además incluye polipéptidos similares que incluyen al menos 6 pero no más de 26 o 25 aminoácidos contiguos del segmento N-terminal de la proteína lactoferrina humana, donde el N-terminal de dicho polipéptido es el residuo 2 y 3 de la SEC ID NO: 1, respectivamente. Ejemplos específicos de los polipéptidos proporcionados por la invención incluyen hLF(1-11), hLF(2-11) y hLF(3-11).

La presente invención proporciona además una variedad de composiciones farmacéuticas que en general incluyen un polipéptido como se describe más abajo y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Ciertos polipéptidos usados en algunas composiciones farmacéuticas no tienen más de 27 aminoácidos de longitud, tienen una secuencia N-terminal de aminoácidos XaaArgArg, (Xaa es cualquier aminoácido y Arg es la arginina del aminoácido) y tienen actividad antimicrobiana. Otros polipéptidos usados en otras composiciones farmacéuticas de la invención son similares a los recién descritos, a excepción de que no tienen más de 26 residuos de aminoácidos de longitud y tienen una secuencia N-terminal ArgArg. Otros polipéptidos también relacionados tienen 25 aminoácidos o menos de longitud y tienen un N-terminal de Arg. Los polipéptidos que pueden ser incluidos en otras composiciones farmacéuticas incluyen cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente, incluyendo, por ejemplo, varios fragmentos N-terminales de hLF (p. ej., hLF(1-11), hLF(2-11) y hLF(3-11)).

La invención también proporciona métodos para tratar pacientes que sufren varias infecciones microbianas, tales como, infecciones bacterianas víricas, micóticas o parasitarias, por ejemplo. Los métodos incluyen administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un polipéptido o composición farmacéutica de la invención a un paciente.

Los métodos para la detección de infecciones microbianas en un paciente están también proporcionados por la invención. Estos métodos normalmente implican la administración de un polipéptido marcado a un paciente infectado con, o con sospechas de estar infectado con, un microbio, donde dicho polipéptido es la proteína lactoferrina humana (SEC ID NO: 1) o una subsecuencia derivada capaz de interactuar con dicho microbio y la detección de la presencia de dicho polipéptido marcado en un sitio de infección. En un método de este tipo, el polipéptido está marcado con un radioisótopo y la presencia del radioisótopo en el sitio de infección está visualizado con una cámara gamma.

La invención además proporciona métodos para alterar la permeabilidad de la membrana celular microbiana poniendo en contacto la membrana celular microbiana con un polipéptido de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Las Figs. 1A y 1B son tablas que representan la actividad antibacteriana de hLF natural y hLF^{-3N} (proteína hLF sin glicina N-terminal ni las dos argininas N-terminales, es decir, sin los residuos 1-3 de la SEC ID NO: 1) contra L. monocytogenes, y S. aureus resistente a los antibióticos. Las Figs. 1A y 1B ilustran una reducción dosis dependiente del número de L. monocytogenes viables (fig. 1A), y S. aureus resistente a los antibióticos (fig. 1B) por hLF natural y hLF^{-3N}. Las pruebas implicaron la exposición de aproximadamente 1-2 x 10^{6} CFU de L. monocytogenes o S. aureus resistentes a los antibióticos a varias concentraciones de hLF natural o hLF^{-3N} durante 3 h a 37ºC; el número de bacterias viables restantes en este punto fueron determinadas posteriormente usando técnicas microbiológicas estándar. El límite de detección fue 4.000 CFU. Los resultados están expresados como un valor medio (\pm desviación estándar (SD)) y están calculados a partir de al menos tres experimentos separados.

Las Figs. 1C-1E muestran una reducción tiempo dependiente del número de L. monocytogenes viables (Fig. 1C), S. aureus resistente a los antibióticos (Fig. 1D) y K. pneumoniae (Fig. 1E) por hLF natural y hLF^{-3N}. Aproximadamente 1-2 x 10^{6} CFU de las distintas bacterias fueron expuestas a 4 \muM de hLF natural o hLF^{-3N} para varios intervalos a 37ºC, y posteriormente, se determinó el número de bacterias viables microbiológicamente. Los resultados están expresados como un valor medio (\pm SD) y están calculados a partir de al menos tres experimentos separados. El límite de detección fue 4.000 CFU.

Las Figs. 2A-2D son gráficos que muestran las capacidades relativas de hLF(1-11) (los residuos 1-11 inclusive del N-terminal de hLF, es decir, los residuos 1-11 de la SEC ID NO: 1) y sus fragmentos derivados, al igual que hLF(21-31) (los residuos 21-31 de la región N-terminal de hLF, es decir, los residuos 21-31 de la SEC ID NO: 1), para matar L. monocytogenes (Fig. 2A), S. aureus resistente a los antibióticos (Fig. 2B), K. pneumoniae (Fig. 2C) y E. coli (Fig. 2D). Aproximadamente 2 x 10^{6} CFU de las distintas bacterias fueron expuestas a 7 \muM de hLF (1-11) o sus fragmentos derivados, o a 65 \muM de hLF(21-31) durante 1 h a 37ºC; posteriormente, se determinó el número de bacterias viables microbiológicamente. Los resultados están expresados como un valor medio (\pm SD) y están calculados a partir de al menos tres experimentos separados. Además, los efectos de los péptidos en la permeabilidad de la membrana de las distintas bacterias fue evaluado usando 1 \mug de yoduro de propidio/ml y análisis de FACS. Los resultados están expresados como un valor medio (\pm SD) y como un porcentaje de bacterias positivas con yoduro de propidio.

Las Figs. 3A-3C ilustran el efecto de hLF(1-11) y sus fragmentos derivados y hLF(21-31) en L. monocytogenes (Fig. 3A), S. aureus resistente a los antibióticos (Fig. 3B), y E. coli (Fig. 3C). Aproximadamente 1 x 10^{6} CFU de las distintas bacterias fueron expuestas a concentraciones micromolares en aumento de estos péptidos durante 1 h a 37ºC. El número de bacterias viables fue determinado microbiológicamente y el porcentaje de bacterias positivas con yoduro de propidio fue determinado por análisis de FACS. Los resultados están expresados como un valor medio (\pm SD) y están calculados a partir de al menos tres experimentos separados.

La Fig. 4 representa el efecto de hLF natural y hLF^{-3N} en la actividad esterasa no específica de L. monocytogenes. Aproximadamente 2 x 10^{6} CFU de bacterias fueron inicialmente incubadas con 4 \muM de hLF natural, hLF^{-3N}, o BSA (-) durante 2 h a 37ºC, y posteriormente incubadas con 100 \muM de diacetato de 5-sulfofluoresceína en etanol al 20% (V/V) durante 20 min a la temperatura ambiente a oscuras. Las bacterias fueron luego lavadas y la intensidad de la fluorescencia fue evaluada por análisis de FACS.

La Fig. 5 muestra la actividad bactericida de hLF natural, hLF^{-3N} y varios péptidos relacionados en ratones infectados con S. aureus resistente a los antibióticos. Los ratones fueron infectados intramuscularmente con aproximadamente 1 x 10^{6} CFU de S. aureus resistente a los antibióticos en 0.1 ml de solución salina. Veinticuatro horas después, se inyectaron 0.2 ml de solución salina conteniendo varias cantidades (0.1-10 nmol) de hLF natural, hLF^{-3N}, hLF(1-11), hLF(4-11) o hLF(21-31) por vía intravenosa. 24 h después de la inyección del péptido radiomarcado, los ratones fueron matados con una inyección intraperitoneal con sodio pentobarbital. El músculo del muslo fue posteriormente extraído, pesado, y luego homogenizado. Las diluciones en serie de estos homogenizados fueron pipetadas sobre placas y el número de CFU fue determinado microbiológicamente. Los valores están expresados como valores medios (\pm SD) de las CFU de S. aureus resistente a los antibióticos por gramo de músculo del muslo (n = 3).

La Fig. 6 muestra la acumulación de ^{99m}Tc-hLF o péptidos relacionados en ratones experimentalmente infectados con S. aureus resistente a los antibióticos. Las proporciones de diana a no diana de hLF, hLF^{-3N}, hLF (1-11), hLF (4-11), o hLF (21-31) en S. aureus resistente a los antibióticos infectaron los ratones a varios intervalos después de la administración de la(el) proteína/péptido radiomarcada(o). Los resultados están expresados como un valor medio (\pm SD) de al menos tres ratones (p<0.05), comparados con ^{99m}Tc-IgG.

Definiciones

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de forma intercambiable para aludir a un polímero de residuos de aminoácidos. A menos que se indique lo contrario, el término también se aplica a polímeros de aminoácidos en los que uno o más aminoácidos son análogos químicos de un aminoácido natural correspondiente.

El término "proteína lactoferrina humana", "lactoferrina humana" o simplemente "proteína hLF" o "hLF" se refiere a un polipéptido de la lactoferrina humana de longitud completa, p. ej., un polipéptido con una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se describe por Powell, M.J. y Ogden, J.E., Nucleic Acids Res. 18:4013 (1990), incorporado aquí por referencia. Una secuencia ejemplar para la proteína lactoferrina humana es la secuencia establecida en la SEC ID NO: 1. Otras secuencias de lactoferrina humana relacionadas están provistas, por ejemplo, por Metz-Boutigue, M.H., et al., Eur. J. Biochem. 145:659-676 (1984), Rado, T.A., et al., Blood 70:989-993 (1987), y Heyneker, H.L., WO 91/08216, cada uno ellos incorporado aquí por referencia. El término proteína lactoferrina humana también incluye variantes alélicas humanas de origen natural y variantes que implican sustituciones conservadoras de aminoácidos.

El término proteína lactoferrina humana también incluye hLF donde el esqueleto de la proteína está modificado. Ejemplos de tales modificaciones incluyen acetilaciones, carboxilación, modificaciones por glicosilación y otras variantes del tratamiento de hLF. Por ejemplo, la lactoferrina humana natural incluye lactoferrina humana codificada de forma recombinante expresada en un animal no humano transgénico, tal como un animal bovino donde el modelo de glicosilación puede ser diferente de los modelos de glicosilación de la lactoferrina humana de origen natural obtenida a partir de leche humana.

El término "fragmento de hLF", "subsecuencia de hLF" o "secuencia de aminoácidos contigua de hLF" se refiere a un polipéptido donde los residuos de los aminoácidos del polipéptido consisten en una secuencia contigua de aminoácidos de hLF. Como en el caso de hLF, estos términos incluyen polipéptidos que tienen variaciones modificadas de forma conservadora o modificaciones químicas (p. ej., carboxilación, glicosilación, acetilaciones) a una subsecuencia de hLF. El término también incluye fragmentos donde la cisteína en el residuo 10 (ver SEC ID NO: 1) está conservada, en ambos fragmentos consistente en la secuencia contigua de aminoácidos de hLF así como los fragmentos que tienen variaciones conservadoras.

En un formato estenográfico para hacer referencia a las subsecuencias de hLF, los residuos específicos a los que se hace referencia están entre paréntesis. Por ejemplo, hLF(1-11) se refiere a los residuos 1 a 11 inclusive del N-terminal de la hLF; de forma similar, hLF(2- 11) se refiere a los residuos 2 a 11 inclusive de la región N-terminal de la hLF. La hLF (es decir, la proteína de longitud completa) que carece de un número determinado de residuos del N-terminal se denomina hLF^{-XN}, donde x es el número de residuos N-terminales que faltan. Así, por ejemplo, la hLF en la que se ha eliminado la glicina N-terminal y la arginina se denomina hLF^{-2N}; la hLF a la que le falta la glicina N-terminal y las dos argininas N-terminales, se denomina hLF^{-3N}, y la hLF que carece de la glicina N-terminal y de los tres primeros residuos de arginina se denomina hLF^{-4N}. Las tres argininas localizadas en el N-terminal (es decir, los residuos 2, 3 y 4 de la SEC ID NO: 1) se denominan Arg^{2}, Arg^{3} y Arg^{4}, respectivamente. A menos que se indique lo contrario, el aminoácido N-terminal de hLF se refiere a Gly^{1} (ver SEC ID NO: 1); los 31 residuos localizados en el amino-teminal de la hLF son: N'-GRRRRSVQWCAVSQPEATKCFQWQRNMRKVR (residuos 1-31 de la SEC ID NO: 1).

Una "sustitución conservadora" al describir una proteína, se refiere a un cambio en la composición de los aminoácidos de la proteína que no altera sustancialmente la actividad proteínica. De este modo, "variaciones modificadas de forma conservadora" de una secuencia de aminoácidos particular se refiere a sustituciones de los aminoácidos que no son fundamentales para la actividad proteínica o la sustitución de unos aminoácidos con otros aminoácidos que tengan propiedades similares (p. ej., acídicos, básicos, cargados positivamente o negativamente, polares o no polares) de tal manera que las sustituciones incluso de los aminoácidos fundamentales no alteren sustancialmente la actividad. Las tablas de substitución conservadora que proporcionan funcionalmente aminoácidos similares son bien conocidas en la técnica. Ver, p. ej. Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company. Además, las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales que alteran, añaden o eliminan un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en una secuencia codificada son también "variaciones modificadas de forma conservadora".

El término "de origen natural" aplicado a un objeto se refiere al hecho de que el objeto puede ser encontrado en la naturaleza. Por ejemplo, la secuencia polipeptídica que está presente en un organismo que puede ser aislado de una fuente de la naturaleza y que no ha sido intencionalmente modificada por los seres humanos en el laboratorio es de origen natural.

El término "aislado", "purificado" o "sustancialmente puro" significa que la especie del objeto (e.g., hLF o un fragmento derivado) es la especie macromolecular predominante presente (es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual de la composición), y preferiblemente la especie del objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, la especie del objeto en una composición, aislada, purificada o substancialmente pura comprenderá más del 80 al 90 por ciento de todas especies macromoleculares presentes en una composición. Más preferiblemente, la especie del objeto está purificada hasta la homogeneidad esencial (es decir, las especies contaminantes no pueden ser detectadas en la composición por los métodos de detección convencionales) donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.

Las frases "se enlaza específicamente a una proteína" o "es específicamente inmunorreactivo con", cuando se refiere a un anticuerpo se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína en presencia de una población heterogénea de proteínas y otras especies biológicas. Así, bajo las condiciones de inmunoensayo designadas, un anticuerpo especifico se une preferiblemente a una proteína particular y no se enlaza en una cantidad significante a otras proteínas presentes en la muestra. El enlace específico a una proteína bajo tales condiciones requiere un anticuerpo seleccionado por su especificidad para una proteína particular. Una molécula tal como un anticuerpo que se une específicamente a una proteína tiene una asociación constante de al menos 10^{6} M^{-1} o 10^{7} M^{-1} preferiblemente 10^{8} M^{-1} a 10^{9} M^{-1}, y más preferiblemente, aproximadamente 10^{10} M^{-1} a 10^{11} M^{-1} o superior. Una variedad de formatos del inmunoensayo pueden ser usados para seleccionar anticuerpos específicamente inmunoreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos de ELISA de fase sólida son rutinariamente usados para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Ver, p. ej., Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, para una descripción de formatos del inmunoensayo y condiciones que pueden utilizarse para determinar la inmunorreactividad específica.

El término "paciente" incluye sujetos humanos y animales.

Descripción detallada I. General

La invención proporciona polipéptidos tales como fragmentos de hLF y composiciones farmacéuticas que utilizan tales polipéptidos que son útiles para una variedad de aplicaciones terapéuticas y profilácticas, incluyendo el uso como agentes antimicrobianos. La invención está basada en parte en el hallazgo de que los polipéptidos cortos que tienen una o más argininas en el segmento N-terminal del polipéptido, tal y como se ha encontrado en el primer dominio catiónico de la hLF, muestran una actividad terapéutica significante.

Más específicamente, los polipéptidos de la invención incluyen uno o más residuos del primer dominio catiónico de hLF, pero no incluyen los aminoácidos del segundo dominio catiónico los polipéptidos son bastante cortos, generalmente con menos de 27 aminoácidos de longitud. Dada su corta longitud, los polipéptidos son preparados fácilmente y de forma económica y son fácilmente susceptibles de ser usados en composiciones farmacéuticas. Los anticuerpos que se enlazan específicamente con los polipéptidos de la invención están también proporcionados.

La invención además proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen un polipéptido y uno o más componentes tales como un excipiente aceptable farmacéuticamente. El polipéptido usado en la composición es un polipéptido corto normalmente con menos de 27 aminoácidos de longitud, tiene uno o más residuos de arginina en el segmento N-terminal, y actividad antimicrobiana. Así, el polipéptido puede consistir en secuencias contiguas del primer dominio catiónico de la hLF, por ejemplo.

Los métodos para tratar pacientes que sufren infecciones están también proporcionados por la invención. Los métodos implican administrar una dosis terapéutica de uno de los polipéptidos o las composiciones farmacéuticas de la invención a un paciente. Los métodos son eficaces contra una gama amplia de microbios, incluidos, por ejemplo, los virus y las bacterias.

La invención también expone métodos para detectar o mostrar imágenes de infecciones microbianas tales como infecciones bacterianas usando hLF marcada o fragmentos derivados que se desplazan al sitio de una infección microbiana. Usando un detector adecuado para el tipo de marcador fijado al péptido, es posible detectar los sitios de infección.

II. Polipéptidos A. General

La invención proporciona varios polipéptidos que incluyen al menos una o más argininas del primer dominio catiónico de hLF (residuos 2-5 de la SEC ID NO: 1), pero que excluyen los residuos que componen el segundo dominio catiónico (residuos 28-31 de la SEC ID NO:1). Así, por ejemplo, la invención proporciona polipéptidos que comprenden al menos 6 pero no más de 27 aminoácidos contiguos del segmento N-terminal de la hLF (SEC ID NO: 1), donde el N-terminal del polipéptido es el residuo 1 de la SEC ID NO: 1 es decir, glicina.

La invención además incluye polipéptidos similares que incluyen el primer dominio catiónico pero no el segundo dominio catiónico de la hLF, y que también carecen de uno o más residuos del N-terminal de la hLF. Por ejemplo, la invención también incluye los polipéptidos que comprenden al menos 6 aminoácidos pero no más de 26 aminoácidos contiguos de la hLF, donde el N-terminal del polipéptido es Arg^{2} (por ejemplo, un fragmento de hLF carente de Gly^{1}). La invención también incluye polipéptidos que comprenden al menos 6 pero no más de 25 aminoácidos contiguos del segmento N-terminal de hLF, donde el N-terminal del polipéptido es Arg^{3} (por ejemplo, un fragmento de hLF carente de Gly^{1} Arg^{2}).

En algunos ejemplos, los fragmentos polipeptídicos de la hLF recién descritos son elegidos de tal manera que el residuo 10 de la cisteína (ver SEC ID NO: 1) sea retenido. En otros casos, el polipéptido incluye una cisteína aproximadamente en la misma ubicación en la secuencia. Esta cisteína puede utilizarse para dimerizar un fragmento con otro polipéptido que tiene un residuo de cisteína, como por ejemplo otro fragmento de hLF, por ejemplo. En algunos ejemplos, la dimerización puede aumentar la actividad del polipéptido.

La longitud mínima de los polipéptidos puede incluir más de 6 aminoácidos contiguos del N-terminal de la hLF. Por ejemplo, algunos polipéptidos de la invención pueden incluir 7, 8, 9, 10, 11 o 12 aminoácidos contiguos de hLF, por ejemplo. Los polipéptidos pueden también incluir menos de 27, 26 o 25 aminoácidos contiguos de hLF. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden incluir menos de 24, 22, 20, 18, 16, 14 o 12 aminoácidos contiguos de hLF, o cualquier número de aminoácidos comprendido entre éstos. En algunos ejemplos, el polipéptido incluye no más de 19 aminoácidos contiguos de hLF. En otros ejemplos, el polipéptido incluye no más de 11 aminoácidos contiguos de hLF. Por ejemplo, como se describe posteriormente en los Ejemplos, los polipéptidos de la invención incluyen hLF(1-11), hLF(2-11) y hLF(3-11).

B. Preparación de los polipéptidos

Particularmente debido al hecho de que los polipéptidos de la invención son relativamente cortos, los polipéptidos pueden ser fácilmente sintetizados usando los métodos conocidos. Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser sintetizados por el bien conocido método de síntesis de fase sólida de Merrifield donde los aminoácidos son consecutivamente añadidos a una cadena creciente. Ver Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156; y Atherton et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", IRL Press, Londres, (1989). Sintetizadores automáticos de péptidos están comercialmente disponibles por muchos proveedores, como Applied Biosystems, Foster City, California. Enfoques sintéticos adicionales para preparar los polipéptidos de la invención están descritos en el Ejemplo I más abajo.

Algunos polipéptidos de la invención pueden también ser preparados por medio de un método de reducción y de proteólisis. Este enfoque se inicia con la digestión de pepsina de hLF según los métodos conocidos (ver, p. ej., Bellamy, W. et al., Biochim. Biophys. Acta. 1121:130-136 (1992); y Tomita, M. et al., J. Daily Sci. 74:4137-4132 (1991)). Para romper el enlace de disulfuro entre Cys 10 y Cys 46, los productos digeridos son posteriormente reducidos y alquilados usando reactivos estándar (p. ej., DTT o \beta-mercaptoetanol para la reducción y yodoacetamina o 4-vinilpiridina para la alquilación) según los métodos conocidos (ver, p. ej., "Current Protocols in Protein Chemistry". (Coligan, J.E., et al., Eds.) John Wiley and Sons, Inc. El orden puede ser invertido de tal manera que las fases de reducción y de alquilación precedan a la fase de digestión de pepsina. Después de la digestión, reducción y alquilación, los péptidos N-terminales pueden ser aislados de la mezcla de digestión por métodos cromatográficos estándar, incluyendo, por ejemplo, el intercambio de cationes, la filtración en gel, HIC o RP-HPLC.

De forma alternativa, los polipéptidos de la invención pueden ser preparados usando técnicas recombinantes bien conocidas en las que una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de interés está expresada en las células cultivadas como las descritas en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987) y en Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2^{a} ed., vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989, los cuales están incorporados aquí por referencia en su totalidad. También ver, Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad Sci. 82:488 (que describe la mutagénesis sitio dirigida) y Roberts et al., 1987, Nature 328:731-734 o Wells, J.A., et al. (1985) Gene 34:315 (describiendo la mutagénesis en "cassette").

Normalmente, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos deseados son usados en vectores de expresión. La frase "vector de expresión" generalmente se refiere a secuencias de nucleótidos que son capaces de influir en la expresión de un gen en huéspedes compatibles con tales secuencias. Estos vectores de expresión normalmente incluyen al menos secuencias promotoras adecuadas y opcionalmente, señales de terminación de la transcripción. Los factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión pueden también ser usados según se describe en este caso. El ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención normalmente será incorporado en constructos de ADN capaces de introducirse y expresarse en un cultivo celular in vitro. De forma específica, los constructos de ADN serán adecuados para la replicación en un huésped procariótico, como por ejemplo las bacterias, p. ej., E. coli, o pueden ser introducidos en un mamífero cultivado, planta, insecto, levadura, hongos u otras líneas celulares eucarióticas.

Los constructos de ADN preparados para ser introducidos en un huésped particular normalmente incluyen un sistema de replicación reconocido por el huésped, el segmento de ADN destinado que codifica el polipéptido deseado, y las secuencias reguladoras de la iniciación y terminación transcripcional y traduccional operativamente enlazadas al polipéptido que codifica el segmento. Un segmento de ADN está "operativamente enlazado" cuando es colocado en una relación funcional con otro segmento de ADN. Por ejemplo, un promotor o intensificador está operativamente enlazado a una secuencia de codificación si estimula la transcripción de la secuencia. El ADN para una secuencia señal está operativamente enlazado al ADN que codifica un polipéptido si es expresado como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido. Generalmente, las secuencias de ADN que están operativamente enlazadas son contiguas, y, en el caso de una secuencia señal, son a la vez contiguas y en fase de lectura. No obstante, los intensificadores no necesitan ser contiguos a las secuencias de codificación cuya transcripción éstos controlan. El enlace es conseguido por la ligadura a los sitios de restricción convenientes o a los adaptadores o ligadores insertados en su lugar.

La selección de una secuencia de promotores apropiada generalmente depende de la célula huésped seleccionada para la expresión del segmento de ADN. Ejemplos de secuencias de promotores adecuadas incluyen promotores procarióticos, y eucarióticos bien conocidos en la técnica. Ver, p. ej., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^{a} ed.), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989). Las secuencias reguladoras transcripcionales normalmente incluyen un intensificador o promotor heterólogo que es reconocido por el huésped. La selección de un promotor apropiado dependerá del huésped, pero los promotores como los promotores Trp, lac y del fago, promotores de ARNt y promotores de enzimas glicolíticas son conocidas y están disponibles. Ver Sambrook et al., supra.

Se pueden emplear los vectores de expresión convenientemente disponibles que incluyen el sistema de replicación y las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales con el sitio de inserción para el segmento que codifica el polipéptido. Ejemplos de combinaciones factibles de líneas celulares y vectores de expresión están descritos en Sambrook et al., supra, y en Metzger et al., Nature 334:31-36 (1988). Por ejemplo, unos vectores de expresión adecuados pueden ser expresados en, p. ej., células de insectos, p. ej., células Sf9, células mamíferas, p. ej., células CHO y células bacterianas, p. ej., E. coli.

En algunos ejemplos, los polipéptidos de la invención son producidos por expresión en animales transgénicos (es decir, animales no humanos conteniendo una secuencia de ADN exógena en el genoma de la línea germinal y células somáticas introducidas por intervención humana) tales como animales bovinos, cabras, conejos, oveja, cerdos o ratones. Los métodos para la producción de polipéptidos recombinantes por especies no humanas transgénicas son conocidos en la técnica y están descritos, por ejemplo, en las patentes estadounidenses Nos. 5.304.489; 5.633.076; y 5.565.362 que están incorporadas aquí por referencia en su totalidad, al igual que en las publicaciones PCT/US93/05724 y PCT/US95/09580, las cuales están incorporadas aquí por referencia en su totalidad. Una ventaja de los animales transgénicos es el aislamiento de los polipéptidos de interés en grandes cantidades, especialmente por métodos de purificación económicos. Por ejemplo, la producción de especies bovinas transgénicas conteniendo un transgen que codifica un polipéptido de la lactoferrina humana dirigido a la expresión en células segregadoras mamarias está descrita en WO 91/08216, incorporada aquí por referencia en su totalidad. Cuando las variantes de la lactoferrina son producidas en animales bovinos transgénicos, la proteína humana normalmente es separada de las proteínas de la leche bovina (p. ej., proteínas de lactosuero, caseínas, lactoferrina bovina, IgA, albúmina, lisozima, \beta-lactoglobulina) antes del uso (p. ej., administración a pacientes). De forma alternativa, se puede usar leche bovina totalmente o parcialmente purificada conteniendo el polipéptido deseado.

Otro método para preparar los polipéptidos de la invención es emplear un sistema de transcripción/traducción in vitro. El ADN que codifica un polipéptido de la invención es clonado en un vector de expresión según se ha descrito supra. El vector de expresión es luego transcrito y traducido in vitro. El producto de la traducción puede ser usado directamente o purificado primero. Los polipéptidos que resultan de la traducción in vitro normalmente no contienen las modificaciones de la postraducción presentes en los polipéptidos sintetizados in vivo. Los métodos para la síntesis de polipéptidos por traducción in vitro están descritos, por ejemplo, por Berger & Kimmel, Methods in Enzymology, Volumen 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1987 (incorporada aquí por referencia en su totalidad).

III. Composiciones farmacéuticas A. Utilidad

Los polipéptidos y las composiciones farmacéuticas de la invención muestran varias actividades biológicas que proporcionan beneficios en aplicaciones terapéuticas o profilácticas. Por ejemplo, como se describe con mayor detalle en los ejemplos a continuación, las composiciones son útiles para el tratamiento de varias infecciones microbianas, como las infecciones bacterianas. Los polipéptidos y composiciones farmacéuticas pueden también tener otras muchas actividades provechosas. Éstas incluyen actividades antinflamatorias, antivíricas y antinfecciosas, así como efectos pro y anticoagulantes, modulación de la activación de complementos, inhibición de la activación mediada por lipopolisacáridos (LPS) de neutrófilos, y promoción del crecimiento de células epiteliales intestinales. Otras propiedades y actividades biológicas de la lactoferrina están descritas en Nuijens et al., 1996, J. Mammary Gland Biology and Neoplasia 1:3, 283-293, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Las indicaciones terapéuticas para las composiciones farmacéuticas descritas aquí incluyen el uso en la terapia o profilaxis de una infección, incluida una infección local, una infección a gran escala (bacteriana), infección transmitida por la sangre (sepsis), así como la inflamación resultante de una infección o enfermedades inflamatorias no infecciosas (p. ej., enfermedad inflamatoria crónica del íleon o colon). Las composiciones pueden también ser usadas para preparar o tratar receptores de transplantes de órganos u otros individuos inmunosuprimidos (p. ej., pacientes de SIDA) contra los efectos de las infecciones.

Las composiciones farmacéuticas son eficaces para el tratamiento de una variedad de infecciones microbianas, tales como varias infecciones víricas, bacterianas y micóticas. Por ejemplo, las composiciones son eficaces para el tratamiento de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. Más específicamente, algunos ejemplos de bacterias patógenas que provocan infecciones tratables por los métodos de la invención incluyen: Listeria, Escherichia, chlamydia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, treptococos, pneumonococos, meningococos y gonococos, Klebsiella, proteus, serratia, Pseudomonas, Legionella, difteria, salmonella, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, plaga, leptospirosis, y bacterias de la enfermedad de Lymes.

Algunos ejemplos de virus patógenos que provocan infecciones tratables por los métodos de la invención incluyen: hepatitis (A, B. o C), herpes virus (p. ej., VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, y CMV, virus de Epstein Barr), adenovirus, virus Influenza, flavivirus, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavirus, virus sincitial respiratorio (RSV), virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubeola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del Dengue, virus del papilloma, virus molluscum, virus de la polio, virus de la rabia, virus JC, virus de encefalitis arbovírica, y virus de la inmunodeficiencia humana (virus VIH; p. ej., tipo I y II).

Algunos ejemplos de hongos patógenos que provocan infecciones tratables por los métodos de la invención incluyen: Candida (p. ej., albicans, krusei, glabrala, tropicalis), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (p.ej., fumigatus, niger), Genus Mucorales (Mucor, Absidia, Rhizopus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.

Algunos ejemplos de parásitos patógenos que provocan infecciones tratables por los métodos de la invención incluyen: Entamoeba histolytica, Balantidium coi, Naegleria,Fowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii y Plasmodium falciparis.

La eficacia de los polipéptidos y composiciones farmacéuticas de la invención puede ser mejorada adicionalmente combinando el uso de las composiciones de la invención con composiciones para tratar infecciones microbianas conocidas en la técnica per se. Como tales, los polipéptidos y composiciones de la invención pueden ser combinados con p. ej. penicilinas tales como amplicilina, cefalosporinas, eritromicina, canamicina, gentamicina, vancomicina o tetraciclina, para tratar infecciones bacterianas. Para tratar infecciones víricas éstas pueden ser combinadas con análogos de nucleosidos antivíricos tales como aclicovir, ganciclovir, cidovudina (AZT) o didanosina. De forma similar, para tratar infecciones micóticas los polipéptidos y composiciones de la invención pueden ser combinados con anfotericina B, nistatina, miconazol, fluconazol, clotrimazol, terbinafina, naftifina o butenafina.

B. Composición

La forma particular de la composición varía según el modo de administración al que está destinada y al uso terapéutico. Normalmente, no obstante, la composición incluye un polipéptido y un excipiente aceptable farmacéuticamente, donde el polipéptido tiene una longitud definida, consiste en uno o más residuos de arginina en el N-terminal y tiene actividad antimicrobiana (p. ej., es eficaz para matar virus o bacterias). En ciertas composiciones, el polipéptido incluye un segmento contiguo de hasta 27 aminoácidos y los aminoácidos N-terminales del polipéptido consisten en los residuos XRR (dónde X es cualquier aminoácido y R es arginina). La invención también incluye composiciones en las que el polipéptido no tiene más de 26 aminoácidos de longitud y los aminoácidos N-terminales son RR. También están incluidas en la invención las composiciones en las que el polipéptido no tiene más de 25 aminoácidos de longitud y el N-terminal es R (es decir, Arg). En otros ejemplos, el polipéptido es más corto, como 5, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos de largo, o cualquier longitud comprendida entre éstas. El polipéptido es incluso más pequeño en otras composiciones. Por ejemplo, el polipéptido puede simplemente consistir en los residuos N-terminales XRR o RR. Los polipéptidos usados en las composiciones farmacéuticas pueden también incluir cualquiera de los polipéptidos anteriormente descritos.

Mientras que el N-terminal del polipéptido consiste en los aminoácidos XRR, RR o R, la secuencia de aminoácidos contigua restante de la secuencia polipeptídica puede variar a condición de que el polipéptido tenga actividad antimicrobiana. Por ejemplo, la secuencia contigua restante puede consistir en una secuencia de aminoácidos contigua de hLF, especialmente la secuencia que comienza después de Arg^{3}. Así, como se describe en los Ejemplos a continuación, el polipéptido puede ser hLF(1-11), hLF(2-11) o hLF(3-11). Cuando el polipéptido usado en la composición farmacéutica consiste en una secuencia de aminoácidos contigua del segmento N-terminal de hLF, la secuencia de aminoácidos puede incluir secuencias en las que un número pequeño (p. ej., uno, dos o tres) aminoácidos son insertados o extraídos de la secuencia de hLF. De forma alternativa, el polipéptido incluye secuencias contiguas de hLF, donde uno o más de estos aminoácidos han sido químicamente modificados.

Las composiciones pueden también incluir, dependiendo de la formulación deseada, los portadores farmacéuticamente aceptables y no tóxicos de diluyentes, que están definidos como vehículos comúnmente usados para formular composiciones farmacéuticas para la administración a animales o a humanos. El diluyente está seleccionado para que no influya en la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, agua tamponada, solución salina fisiológica, PBS, solución de Ringer, solución de dextrosa, y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica puede también incluir otros portadores, adyuvantes, o estabilizadores, no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos, excipientes y similares. Las composiciones pueden también incluir sustancias adicionales para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes reguladores del pH y agentes tamponadores, agentes reguladores de la toxicidad, agentes humectantes, detergentes y similares. Dada la capacidad de la hLF para enlazar hierro, en algunos casos puede ser provechoso incluir hierro en la composición farmacéutica.

La composición puede también incluir cualquiera de una variedad de agentes estabilizadores, tales como un antioxidante por ejemplo. Además, los polipéptidos pueden estar formados por varios compuestos bien conocidos que realzan la estabilidad in vivo del polipéptido, o que por el contrario realzan sus propiedades farmacológicas (p. ej., aumentan la vida media del polipéptido, reducen su toxicidad, realzan la solubilidad o captación). Ejemplos de tales modificaciones o agentes complejantes incluyen la producción de sulfato, gluconato, citrato, fosfato y similares. Los polipéptidos de la composición pueden también estar formados por moléculas que realzan sus atributos in vivo. Una lista de tales moléculas, proporcionadas a modo de ejemplo y no como limitación, incluye carbohidratos, poliaminas, aminoácidos, otros péptidos, iones (p. ej., sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso), y lípidos.

Otros consejos con respecto a las formulaciones que son adecuadas para varios tipos de administración pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17^{a} ed. (1985). Para una revisión breve de los métodos para la administración de medicamentos, ver, Langer, Science 249:1527-1533 (1990). Ambas referencias están incorporadas aquí por referencia en su totalidad.

Las composiciones conteniendo los polipéptidos pueden ser administradas para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. El polipéptido en la composición farmacéutica normalmente está presente en una cantidad terapéutica, que es una cantidad suficiente para remediar un estado de enfermedad o síntomas, en particular síntomas relacionados con una infección microbiana, o que por el contrario previene, obstaculiza, retarda, o invierte la progresión de la enfermedad o infección u otros síntomas indeseables de cualquiera de las maneras. La concentración del polipéptido en la composición farmacéutica puede variar mucho, es decir, de menos de aproximadamente el 0.1% en peso, normalmente siendo al menos aproximadamente el 1% en peso, hasta tanto como el 20% en peso o más.

En usos terapéuticos, las composiciones son administradas a un paciente que ya padece una enfermedad, como se acaba de describir, en una cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los síntomas de la enfermedad o infección y sus complicaciones. Una dosificación apropiada de la composición farmacéutica o polipéptido de la invención es fácilmente determinada según cualquiera de los diferentes protocolos bien establecidos. Por ejemplo, los estudios de animales (p. ej., ratones, ratas) son usados de forma común para determinar la dosis tolerable máxima del agente bioactivo por kilogramo de peso. En general, al menos una de las especies animales evaluadas es un mamífero. Los resultados de los estudios de animales pueden ser extrapolados para determinar la dosis para el uso en otras especies, tales como seres humanos por ejemplo.

Aquella que constituye una dosis efectiva también depende de la naturaleza y gravedad de la enfermedad o condición, y del estado general de la salud del paciente, pero generalmente variará de aproximadamente 1 a 500 mg de proteína purificada por kilogramo de masa corporal, con dosificaciones a partir de aproximadamente 5 a 100 mg por kilogramo siendo normalmente más empleadas.

En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los compuestos de la invención son administradas a un paciente susceptible de o por el contrario con riesgo de una enfermedad particular o infección. Tal cantidad está definida por ser una cantidad o dosis "profilácticamente efectiva". En este uso, las cantidades precisas nuevamente dependen del estado de salud y peso del paciente. Normalmente, la dosis varia de aproximadamente 1 a 500 mg de proteína purificada por kilogramo de masa corporal, con dosificaciones de aproximadamente 5 a 100 mg por kilogramo siendo normalmente más utilizadas.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden ser administradas en una variedad de formas diferentes. Ejemplos ilustrativos incluyen la administración de una composición conteniendo un portador farmacéuticamente aceptable por vía oral, intranasal, rectal, tópica, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular subcutánea, subdérmica, transdérmica, intratecal, y métodos intracraneales. La formulación preferida y opción de entrega normalmente varía dependiendo de la ubicación y tamaño del área que requiere tratamiento. Por ejemplo, para infecciones localizadas, la formulación puede ser diseñada para aplicación tópica o inyección localizada, por ejemplo. Las reacciones sistémicas, sin embargo, pueden ser tratadas o evitadas mediante la administración de composiciones formuladas para la administración parenteral.

Para la administración oral, la sustancia activa puede ser administrada en formas de dosificación sólidas, tales como cápsulas, comprimidos, y polvos, o en formas de dosificación líquidas, tales como elixires, jarabes, y suspensiones. El(Los) componente(s) activo(s) puede(n) ser envuelto(s) en cápsulas de gelatina junto con ingredientes inactivos y portadores en polvo, tales como glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidón, celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, ácido esteárico, sacarina de sodio, talco, carbonato magnésico y similares. Ejemplos de ingredientes inactivos adicionales que pueden ser añadidos para proporcionar un color deseable, sabor, estabilidad, capacidad tamponadora, dispersión u otras características deseables conocidas son óxido de hierro rojo, gel de sílice, lauril sulfato de sodio, dióxido de titanio, y tinta blanca comestible. Se pueden utilizar diluyentes similares para hacer pastillas comprimidas. Las pastillas y las cápsulas pueden ser fabricadas como productos de liberación asistida para proporcionar una liberación continua de la medicación durante un periodo de horas. Las pastillas comprimidas pueden ser revestidas con azúcar o por una película para enmascarar cualquier sabor y proteger la pastilla de la atmósfera, o ser revestidas entéricamente para una desintegración selectiva en el tracto gastrointestinal. Las formas de dosificación líquidas para la administración oral pueden contener un colorante y aromatizante para aumentar la aceptación del paciente.

Si se desea, por ejemplo en el tratamiento de infecciones o trastornos del tracto digestivo o incluso para la administración oral en general de las composiciones, es posible formular formulaciones sólidas o líquidas con un revestimiento entérico o cualquier otra forma protegida. En el caso de formulaciones líquidas, la formulación puede mezclarse o simplemente ser coadministrada con un protector, tal como una mezcla líquida de triglicéridos de cadena media, o la formulación puede ser introducida en cápsulas entéricas (p. ej., blandas o de gelatina dura, las cuales son opcionalmente revestidas adicionalmente entéricamente). De forma alternativa, las formulaciones sólidas que comprenden el polipéptido pueden ser revestidas con materiales entéricos para formar pastillas. El espesor del revestimiento entérico en las pastillas o cápsulas puede ser un espesor de, por ejemplo, 0.5 a 4 micras. El revestimiento entérico puede comprender cualquiera de los materiales entéricos utilizados de forma convencional en formulaciones farmacéuticas administrables oralmente. Los materiales de revestimiento entérico adecuados son conocidos, por ejemplo, a partir de Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, 17^{a} ed. (1985); y Hagars Handbuch der Pharmazeutischen Praxie, Springer Verlag, 4^{a} ed., Vol. 7a (1971), que se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

Otra opción de entrega implica cargar la composición en estructuras asociadas con lípidos (p. ej., liposomas, u otros complejos lipídicos) que pueden realzar las características farmacéuticas del componente polipeptídico de la composición. El complejo conteniendo la composición puede posteriormente destinarse a células diana específicas mediante la incorporación de las moléculas diana apropiadas (p. ej., anticuerpos específicos o receptores). Es también posible formar directamente el polipéptido con un agente objetivo.

Las composiciones preparadas para la administración intravenosa normalmente contienen de 100 a 500 ml de NaCl estéril 0.9% o de glucosa 5% opcionalmente suplementada con solución de albúmina 20% y 100 a 500 mg de un polipéptido de la invención. Una composición farmacéutica típica para la inyección intramuscular podría ser preparada de tal manera que contenga, por ejemplo, 1 ml de agua tamponada estéril y 1 a 10 mg del polipéptido purificado de la invención. Los métodos de preparación de composiciones administrables parenteralmente son bien conocidas en la técnica y están descritos con más detalle en varias fuentes, incluyendo, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing, Philadelphia, PA, 17^{a} ed., (1985) (previamente incorporada aquí por referencia en su totalidad).

Particularmente cuando las composiciones deben ser usadas in vivo, los componentes usados para formular las composiciones farmacéuticas de la presente invención son preferiblemente de alta pureza y están sustancialmente libres de contaminantes potencialmente nocivos (p. ej., al menos de calidad National Food (NF, Seguridad Alimentaria), generalmente al menos de calidad analítica, y con más frecuencia al menos de calidad farmacéutica). Además, las composiciones destinadas para el uso in vivo son normalmente estériles. Puesto que un compuesto dado debe ser sintetizado antes de su uso, el producto resultante está normalmente sustancialmente libre de cualquier agente potencialmente tóxico, particularmente cualquier endotoxina, que puede estar presente durante la síntesis o proceso de purificación. Las composiciones para la administración parenteral son también estériles, sustancialmente isotónicas y preparadas bajo condiciones GMP.

Cualquiera de las composiciones farmacéuticas anteriores pueden comprender además de los polipéptidos de la invención, uno o más agentes antimicrobianos conocidos en la técnica per se. Para tratar infecciones bacterianas las composiciones farmacéuticas pueden comprender, además de los polipéptidos de la invención, antibióticos tales como amplicilina, cefalosporinas, eritromicina, canamicina, gentamicina, vancomicina y/o tetraciclina. Para tratar infecciones víricas las composiciones farmacéuticas pueden comprender, además de los polipéptidos de la invención, análogos de nucleosidos antivíricos tales como aclicovir, ganciclovir, cidovudina (AZT) y/o didanosina. De forma similar, para tratar infecciones micóticas las composiciones farmacéuticas pueden comprender, además de los polipéptidos de la invención, anfotericina B, nistatina, miconazol, fluconazol, clotrimazol, terbinafina, naftifina y/o butenafina.

III. Métodos de detección de infecciones microbianas

Los métodos para detectar infecciones microbianas, como infecciones bacterianas, están también proporcionados por la invención. El método normalmente implica administrar un polipéptido marcado a un paciente infectado, o con sospechas de estar infectado con algún tipo de organismo microbiano. El polipéptido es hLF o un fragmento derivado que es capaz de interactuar con el organismo. Como el polipéptido marcado es capaz de interactuar con el organismo infeccioso, éste se acumula en el sitio de infección. Es posible detectar la acumulación del polipéptido en un sitio de infección usando varios detectores que son sensibles al marcador que está fijado al polipéptido.

El polipéptido usado puede variar, pero incluye los polipéptidos de la invención descritos en la presente. Sin embargo, además de estos fragmentos N-terminales, también se puede usar la hLF, así como otros fragmentos (es decir, fragmentos distintos a los fragmentos N-terminales anteriormente descritos) que sean capaces de unirse a organismos microbianos tales como las bacterias. Como se describe adicionalmente en el Ejemplo VI, hLF(1-11), hLF(2-11) y hLF(3-11) se acumulan rápidamente en el sitio de infección.

El marcador utilizado para marcar el polipéptido puede variar mucho; el marcador simplemente necesita ser una molécula o macromolécula que sea capaz de generar una señal detectable y que pueda ser fijada al polipéptido. Ejemplos ilustrativos de tales moléculas incluyen isótopos radioactivos, fluoroforos, cromoforos, reactivos densos electrónicos, partículas magnéticas, enzimas, y ligandos con un compañero de enlace específico (p. ej., biotina).

De forma similar, el detector usado para detectar el marcador puede ser cualquier dispositivo que sea capaz de detectar la señal generada por el marcador. Por ejemplo, cuando el polipéptido está marcado con un isótopo radioactivo, el detector puede incluir una cámara gamma. Usando esta cámara es posible obtener imágenes del sitio de infección que puede ser utilizado en varias investigaciones, diagnósticos y usos terapéuticos.

IV. Métodos de selección

La invención además proporciona métodos para seleccionar polipéptidos para determinar cuáles de los polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos del primer dominio catiónico de hLF pero carentes de residuos del segundo dominio catiónico tienen actividad antimicrobiana. La selección puede ser realizada usando métodos in vitro o in vivo. Los métodos in vitro generalmente implican mezclar una suspensión conteniendo las bacterias de interés con una solución conteniendo el polipéptido de prueba. Normalmente, se evalúan diferentes concentraciones del polipéptido de prueba. Con varios intervalos de tiempo diferentes, el número de bacterias viables es determinado usando técnicas microbiológicas estándar. Los resultados son comparados con soluciones de control que no contienen ningún polipéptido o que contienen un polipéptido del cual se sabe que no tiene actividad antibacteriana. Detalles adicionales con respecto a este enfoque están expuestos en el ejemplo II más abajo.

Los métodos in vivo generalmente implican inyectar a un animal de prueba (p. ej., un ratón o rata) una cantidad conocida de bacterias suspendidas en una solución de prueba. Los animales de control son inyectados con una solución que no contiene ningún polipéptido o una solución que contiene un polipéptido del cual se sabe que no tiene actividad antimicrobiana. Se permite que las bacterias crezcan durante un periodo de tiempo establecido y luego los animales de la prueba son sacrificados. El tejido infectado es retirado y el número de bacterias presentes en el tejido infectado es determinado usando técnicas microbiológicas estándar. El Ejemplo II a continuación proporciona más características con respecto a un método in vivo.

V. Otros Usos/actividades

Los polipéptidos de la presente invención tienen varias actividades relacionadas con la primera agrupación catiónica de hLF. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención son especialmente útiles para activar selectivamente respuestas que implican el primer dominio catiónico mientras que se evita la activación de respuestas relacionadas con la unión del segundo dominio catiónico y/o actividades relacionadas con las actividades de unión del hierro de la hLF.

Algunos polipéptidos de la invención pueden enlazarse y neutralizan la heparina y el lipopolisacárido (LPS), el lípido A, y el ADN y la lisozima humana. Ciertos polipéptidos proporcionados en la presente pueden también enlazarse con varias células diana. La lactoferrina se enlaza a las superficies de la célula a través de dos clases de sitios de unión de la LF: sitios con afinidad relativamente baja que son moléculas sulfatadas de la superficie de la célula (p. ej., proteoglicanos o glicosaminoglicanos de la superficie de la célula) y receptores de alta afinidad. Puesto que la unión de la LF a los sitios de baja afinidad implica el primer dominio catiónico, algunos polipéptidos de la presente invención pueden enlazarse selectivamente con los sitios de baja afinidad sin activar los receptores de alta afinidad de la LF. Así, por ejemplo, algunos polipéptidos de la presente invención son útiles para neutralizar la heparina o lipopolisacárido (LPS) sin activar el receptor de la lactoferrina de alta afinidad. En el caso de la heparina, algunos polipéptidos pueden neutralizar la actividad anticoagulante de la heparina (incluyendo de la heparina de peso molecular bajo). Para neutralizar los lipopolisacáridos bacterianos, algunos polipéptidos de la invención pueden reducir la respuesta inflamatoria en relación con estos compuestos. Los ensayos sobre la unión celular son bien conocidos y están descritos en, p. ej., Mazurier, 1989, Eur. J. Chem. 179:481-87.

Las células con las cuales los polipéptidos pueden interactuar incluyen las células intestinales (Hu et al., 1990, Biochemistry 29:535-541; Kawakam et al, 1991, Am. J. Physiol. 261:G841-G846; Mikogami et al, 1994, Am. J. Physiol. 267:G308-G31), células epiteliales mamarias (Rochard et al, 1992, Anticancer Res. 1:2047-2052), hepatocitos (Regoeczi et al, 1985, Am. J. Physiol. 248:G8-G14; MacAbee et al, 1991, J. Biol. Chem. 226:23624-2363 1; Ziere et al, 1992, J. Biol. Chem. 267:11229-11235), monocitos (Ismail et al, 1993, J. Biol. Chem. 268:21618-21625), linfocitos activados (Mazurier et al, 1989, Eur. J. Biochem. 179.481-487) y plaquetas (Leveugle et al, 1993, Eur. J. Biochem., 213:1205-1211), cada uno de los cuales está incorporado por referencia en su totalidad para todos los objetivos.

Varios polipéptidos y composiciones de la invención pueden también ser usados para inhibir la entrada de los virus en una célula, por ejemplo, CMV (citomegalovirus), VIH (virus de inmunodeficiencia humana) o virus HSV1 (virus herpes simplex 1). Así, los métodos de la invención incluyen administrar un polipéptido de la invención a un paciente para protegerle contra la infección por virus. Aunque no se pretende que esté limitada a esta explicación particular, se supone que la acción antivírica está mediada por la interacción de la hLF con los proteoglicanos de la superficie de la célula (p. ej., heparina) empleada por las partículas víricas para entrar en la célula, y/o por la estimulación de células asesinas naturales.

Algunos polipéptidos son también útiles para reducir la inflamación. Esto puede ocurrir, como se ha indicado arriba, a través de la neutralización de los lipopolisacáridos bacterianos, al igual que a través de una reducción en la producción de citoquinas y en la degranulación neutrofílica.

En otros aspectos, la invención proporciona métodos en los que algunos polipéptidos y composiciones farmacéuticas de la invención son administrados a un paciente para inhibir la mielopoiesis y reducir la producción de GM-CSF.

VI. Anticuerpos

La invención también proporciona anticuerpos que se enlazan específicamente con los polipéptidos de la invención. Los anticuerpos monoclonales han sido hechos a partir de los polipéptidos de la invención o de fragmentos conteniendo antígenos derivados por métodos bien conocidos en la técnica (ver, p. ej., Kohler, et al. Nature, 256:495, (1975); y Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (C.S.H.P., NY, 1988), los cuales están incorporados aquí por referencia en su totalidad). Los anticuerpos de la invención son útiles para depurar los polipéptidos de la invención, para seleccionar bibliotecas de expresión de ADNc, y para identificar clones que contienen injertos de ADNc que codifican polipéptidos estructuralmente relacionados e inmunorreactivos cruzados.

Los ejemplos siguientes están presentados para ilustrar adicionalmente ciertos aspectos de la invención y no deben de ser construidos para limitar el objetivo de la invención.

Ejemplo I Materiales A. Lactoferrina y péptidos sintéticos

La hLF natural (Mr 77.000) fue purificada de la leche fresca de un único donante por cromatografía de intercambio catiónico usando S-Sefarosa (14). El N-terminal de la proteína fue intacto, según fue determinado por la cromatografía analítica Mono-S del N-terminal y la degradación de Edman y secuenciación del N-terminal. La lactoferrina humana, libre de contaminación con endotoxina y lisozima humana (14) y purificada por SDS PAGE, fue dializada contra una solución salina y almacenada a -70ºC a concentraciones de aproximadamente 20 mg/ml. Una variante de hLF carente de los tres primeros residuos N-terminales (GRR), posteriormente denominada hLF^{-3N}, fue aislada de hLF natural tratada con tripsina según está descrito (18). La albúmina de suero bovino (BSA, Sigma Chem Co. St. Louis, MO) fue aplicada en vez de hLF o hLF^{-3N} como control. Los péptidos sintéticos correspondientes a los residuos 1-11 de la hLF (GRRRRSVQWCA (residuos 1-11 de la SEC ID NO: 1-SEC ID Nº: 2); Mr 1,374), posteriormente denominada hLF(1-11), y fragmentos derivados, y un péptido correspondiente a los residuos 21-31 de la hLF (FQWQRNMRKVR (residuos 21-31 de la SEC ID NO: 1-SEC ID NO: 4); Mr 1,548), denominado hLF(21-31), fueron preparados y purificados según está descrito (19). La pureza de los péptidos sintéticos normalmente excedió el 88%, según fue determinado por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC). Se almacenaron reservas de péptidos sintéticos a una concentración de 1 mM en el 5% (v/v) de HAc (pH 6.0) a -20ºC e inmediatamente antes de su uso fueron secados en un SPEED-VAC (Savant Instruments Inc, Farmingdale, NY). Como controles, se sintetizó protegrina-1 (RGGRLCYCRRRFCVCWGR (SEC ID NO: 5) control positivo) y péptido 4 (RPWSTQLLNGSLAEEEW (SEC ID NO: 6) parte de la proteína gp120 de HIV-1 como control negativo).

B. Bacterias

La cepa 2141 de Staphylococcus aureus resistente a los antibióticos, un aislamiento clínico (Dept. of Infectious Diseases, LUMC), fue resistente a un panel de antibióticos incluyendo la meticilina y mostró sólo sensibilidad limitada a la teicoplanina y rifampicina. La cepa EGD de Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae (43816), y Escherichia coli O54 fueron adquiridas de la American Type Culture Collection (ATTC, Rockville, MD). S. aureus resistente a los antibióticos, K. pneumoniae y E. coli fueron cultivadas durante toda la noche en un caldo nutritivo (Oxoid, Basingstoke, UK) a 37ºC, diluidas en caldo de triptasa de soja (TSB, Oxoid) y cultivadas durante 2 h adicionales en un baño maría con agitación a 37ºC. L. monocytogenes fue cultivada durante toda la noche en un caldo de infusión de corazón y cerebro (BHI, Oxoid) a 37ºC, diluida y cultivada durante 2 h adicionales en un baño maría con agitación a 37ºC.

Ejemplo II Métodos experimentales A. Ensayo de la actividad antibacteriana de lactoferrinas y polipéptidos relacionados

Un ensayo in vitro fue usado para evaluar la actividad antibacteriana de la hLF y los péptidos relacionados. En resumen, las bacterias fueron lavadas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7.4) y diluidas hasta una concentración de aproximadamente 2 x 10^{6} CFU/ml de solución salina tamponada con fosfato (pH 6.0) suplementada con 0.1% (v/v) Tween-20 (en adelante denominada PBS-Tw). Se mezclaron volúmenes iguales de esta suspensión bacteriana y PBS-Tw conteniendo varias concentraciones de hLF o péptidos sintéticos relacionados. A varios intervalos de tiempo (una gama de 0-4 h) tras la incubación a 37ºC, el número de bacterias viables fue determinado microbiológicamente. Como controles negativos, no se incluó albúmina de suero bovino (BSA; Sigma) o ningún péptido. Los experimentos preliminares revelaron que la actividad antibacteriana de los péptidos sintéticos en 10 mM de fosfato sódico (pH 7.4; NaPB) suplementados con el 1% v/v de TSB, posteriormente denominado NaPB-TSB, fue diez veces más potente matando bacterias en comparación con los experimentos realizados en PBS-Tw (resultados no mostrados). En consecuencia todas las actividades antibacterianas in vitro de péptidos sintéticos fueron evaluadas en NaPB-TSB. Todos los demás detalles fueron tal y como se describe para la hLF natural y hLF^{-3N}.

B. Ensayo para la permeabilidad de la membrana

Se visualizaron cambios en la permeabilidad de la membrana de las bacterias tras la exposición a hLF, hLF^{-3N} y los péptidos relacionados tras la incubación con yoduro de propidio (PI; Sigma), usando el análisis FACS (12, 20). Se prepararon soluciones madre de PI (1 mg/ml de agua desionizada). Aproximadamente 2 x 10^{6} bacterias/ml de PBS-Tw fueron incubadas en varios intervalos a 37ºC, lavadas, incubadas durante 5 min con 1 \mug de PI/ml (concentración final) y luego analizadas con un FACScan (Becton & Dickinson, CA) equipado con un argon-laser a 488 nm. Los voltajes fotomultiplicadores fueron rutinariamente establecidos a 500 V para una intensidad de fluorescencia del PI en el segundo canal. La toma de datos y análisis fueron controlados usando el software Lysis II.

C. Ensayo para evaluar la actividad esterasa no específica

Como una indicación de los efectos intracelulares de hLF, hLF^{-3N} y los péptidos relacionados (p. ej., hLF (1-11) y hLF(21-31) en bacterias, la actividad esterasa no específica de las bacterias tras la exposición a estas(os) proteínas/péptidos antimicrobianas(os) fue evaluada usando diacetato de 5-sulfofluoresceina (SFDA; Molecular Probes, Leiden, Países Bajos) y el análisis FACS (21). Para estos experimentos, una solución madre de SFDA (1 mg/ml de etanol) fue preparada. Aproximadamente 2 x 10^{6} CFU de bacterias/ml de PBS-Tw fueron incubadas con varias concentraciones de hLF, hLF^{-3N} y péptidos relacionados con la hLF para varios intervalos a 37ºC, lavadas, incubadas con 100 \muM de SFDA/ml (concentración final de etanol al 20% v/v) durante 20 min a la temperatura ambiente a oscuras y luego analizadas con un FACScan usando el voltaje fotomultiplicador del primer canal establecido a 700 V.

D. Marcado de la lactoferrina v de los péptidos relacionados con ^{99m}Tc

Las lactoferrinas y los péptidos relacionados fueron marcados con ^{99m}Tecnecio (^{99m}Tc) como se describe (22, 23). En resumen, 10 \mul de una solución peptídica (1 mg/ml de HAc) fue añadida a 2 \mul de una solución aséptica de 0.5 mg de pirofosfato estánnico/ml (Dept. of Clinical Pharmacy and Toxicology, Leiden University Medical Center (LUMC), Leiden, Países Bajos). Inmediatamente después, 4 \mul de una solución de 10 mg de KBH_{4}, (solución cristalina, Sigma) por ml de NaOH 0.1 M fue añadida. Después de añadir 0.1 ml de una solución de pertecnetato de sodio-^{99m}Tc (200 MBq/ml, Mallinckrodt Medical BV, Petten, Países Bajos), la mezcla fue suavemente agitada a temperatura ambiente durante 30 min y luego fue preparada para el uso. El control de la calidad del marcado fue realizado por análisis RP-HPLC usando un cartucho Sep-Pak C18 (Waters, Milford, MA) en 20 ml de HAc 0.01 M. Después del aclarado con 20 ml de HAc 0.01 M, las proteínas y péptidos fueron eluidos con 2 ml de metanol (Sigma). Los rendimientos del marcado dieron un total del 88-95%.

E. Infecciones experimentales del muslo

Todos los estudios en animales fueron hechos conforme al Comité Etico de LUMC y las leyes Holandesas relacionadas con la realización de experimentos a animales. Nuestro interés fue evaluar si la hLF, hLF^{-3N}, y los péptidos relacionados mostraban actividad antimicrobiana in vivo, se usó un modelo de animal bien establecido para las infecciones experimentales del muslo (23). En resumen, ratones suizos de 20-25 g de peso, machos, sin patógenos específicos, (Broekman Institute, Someren, Países Bajos) fueron anestesiados con una única inyección intraperitoneal de 0.1 ml de solución salina conteniendo 1 mg de fluanisona y 0.03 mg de fentanil citrato (Hypnorm, Janssen Pharmaceutics, Tilburg, Países Bajos). Antes de la escintigrafía, se administró una inyección subcutánea de 0.1 ml, conteniendo 0.2 mg de diazepam (Valium, Hoffmann-La Roche, Mijdrecht, Países Bajos). Inmediatamente después, 1 x 10^{7} CFU de S. aureus resistente a los antibióticos o K. pneumoniae en 0.1 ml de solución salina fueron inyectados en el músculo del muslo derecho. Veinticuatro horas después, 0.2 ml de solución salina, conteniendo varias cantidades de ^{99m}Tc-hLF o péptidos radiomarcados (0.3-30 \mumol), fueron inyectados por vía intravenosa. Como un control, los ratones fueron inyectados con 0.2 ml de solución salina conteniendo BSA o solución salina sin ningún péptido. 24 h después de inyectar la hLF o los péptidos relacionados, los ratones fueron sacrificados mediante una inyección intraperitoneal de 0.25 ml de solución salina conteniendo 12 mg de sodio pentobarbital (Sanofi BV, Div. Algin, Maassluis, Países Bajos). A continuación, los músculos del muslo infectados fueron extraídos y, después de ser pesados, fueron homogenizados en 4 ml de PBS. Se aplicaron unas diluciones apropiadas de los homogenizados sobre placas de prueba de sensibilidad diagnóstica (Oxoid), y el número de colonias fue contado después de un cultivo durante toda la noche a 37ºC. Los resultados están expresados como el número de CFUs por gramo de tejido infectado. Se asignó a todos los cultivos negativos los valores de 100 CFU/mL de homogenizado, que es el límite inferior de detección.

F. Farmacología

La farmacología de las preparaciones de hLF radiomarcada y de los péptidos relacionados en los ratones infectados con S. aureus resistente a los antibióticos fue evaluada realizando la escintigrafía utilizada en los péptidos marcados con ^{99m}Tc anteriormente descritos. Los ratones fueron colocados en posición supina en una cámara gamma plana (Toshiba GCA 7100/UI, Tokio, Japón) con ambas patas posteriores extendidas y fijadas con cinta quirúrgica. Se hicieron tomas continuas del cuerpo entero de los ratones cada 60 s durante la primera hora después de inyectar el trazador con la cámara gamma, equipada con un colimador con agujeros paralelos de baja energía de uso general. La cámara fue conectada a un ordenador (GMS 5500 UI, Toshiba) y se almacenaron las imágenes de alta resolución de los animales como una matriz de 256 x 256. El valor máximo de la energía fue establecido a 140 keV con una ventana del 20%.

En los escintigramos, las regiones ajustadas anatómicamente (ROI) de interés fueron extraídas de los distintos órganos y ambos muslos proporcionaron datos sobre la depuración de los péptidos con ^{99m}Tc y la acumulación en el sitio de infección. La depuración de la hLF marcada con ^{99m}Tc o de los péptidos péptidos relacionados de la circulación durante la primera hora después de la inyección fue evaluada para determinar el periodo (t_{1/2}) de radioactividad en las ROI que se ha tenido lugar en el corazón en varios intervalos de tiempo. Se corrigió la desintegración por la cantidad de radioactividad en el corazón y se expresó como un porcentaje de dosis inyectada (% ID). La acumulación de hLF y de los péptidos relacionados en el sitio de infección está expresada como la proporción de las cuentas en el músculo del muslo infectado (objetivo, T) y no infectado (no objetivo, NT), posteriormente denominada proporción T/NT.

G. Análisis estadístico

Las diferencias entre los valores para hLF, hLF^{-3N} y BSA así como para los distintos péptidos relacionados con la hLF y el péptido de control negativo fueron analizadas usando la prueba U de Mann-Whitney. El nivel de importancia fue establecido en p<0.05.

Ejemplo III Actividad antimicrobiana de hLF, hLF^{-3N} y péptidos sintéticos relacionados

Este experimento fue diseñado para comparar la actividad antibacteriana de hLF^{-3N} y hLF natural y para identificar qué aminoácidos N-terminales de hLF fueron importantes matando bacterias. La actividad antimicrobiana fue determinada como se describe en el Ejemplo II. Como se muestra en las Figs. 1A-1E, los resultados revelaron que ambas formas de la hLF mataron L. monocytogenes y S. aureus resistente a los antibióticos y K. pneumoniae en una forma dosis dependiente, siendo la hLF más potente (p<0.05) que la hLF^{-3N} (figs. 1A-1B). Además, la hLF natural fue más rápida (p<0.05) que la hLF^{-3N} matando a estas bacterias (figs. 1C-1E). Por el contrario, E. coli no fue matada por hLF o hLF^{-3N} (Tabla 1), incluso con concentraciones de hasta 12 \muM (resultados no mostrados).

Para averiguar qué aminoácidos N-terminales de hLF son importantes para matar bacterias, los efectos antibacterianos in vitro de péptidos sintéticos correspondientes a los primeros once residuos N-terminales de hLF y sus fragmentos fueron determinados, nuevamente según los métodos expuestos en el Ejemplo II. Los resultados revelaron que hLF(1-11), hLF(2-11), hLF(3-11), y hLF(4-11) manifestaron actividad bactericida contra las distintas bacterias, mientras que hLF(5-11) y hLF(6-11) fueron inefectivas (Ver Figs. 2A-2D). Estudios de dosis-efecto revelaron que la hLF(1-11) y hLF(2-11) fueron considerablemente (p<0.05) más eficaces que hLF(3-11), que fue significativamente (p<0.05) más eficaz que la hLF(4-11) matando L. monocytogenes y S. aureus resistente a los antibióticos (Ver Figs. 3A-3C). Estos datos indican que las dos primeras argininas son importantes para la actividad bactericida de la hLF contra estas bacterias, y que al menos una de estas argininas es fundamental para la actividad bactericida de los polipéptidos. Además, hLF(1-11), hLF(2-11) y hLF( 3-11), pero no los otros péptidos, mataron K. pneumoniae y E. coli (figs. 2A-2D y 3A-3C). Las actividades bactericidas de hLF(21-31), incluyendo el segundo dominio catiónico de la hLF, y hLF(1-11) fueron luego determinadas contra L. monocytogenes, S. aureus resistente a los antibióticos y E. coli. Los resultados revelaron que hLF(1-11) es al menos diez veces más eficaz (p<0.05) que hLF(21-31) (figs. 3A-3C).

Ejemplo IV Efecto de hLF natural, hLF^{-3N} y péptidos relacionados en la permeabilidad de la membrana y actividad esterasa intracelular no específica de bacterias

Para llegar a comprender los mecanismos subyacentes a la actividad antibacteriana de la hLF al igual que de los péptidos relacionados, el efecto de estos polipéptidos en la permeabilidad de la membrana y la actividad esterasa no específica de las bacterias fue determinada según los procedimientos anteriormente descritos en el Ejemplo II. Los resultados revelaron que la incubación de hLF natural y hLF^{-3N} con L. monocytogenes y E. coli no fue seguida por un cambio significante de la permeabilidad de la membrana durante el periodo de análisis, es decir, 4 h después de la adición de estas proteínas (Fig. 4). Curiosamente, la hLF natural y hLF^{-3N} inhibieron la actividad esterasa intracelular no específica de L. monocytogenes, pero no de E. coli en un periodo de 1-2 horas después de la adición de estas proteínas (Fig. 4). Estos datos indican que los efectos intracelulares de hLF (al igual que hLF^{-3N}) en L. monocytogenes no van seguidos por la ruptura de la integridad de la membrana.

De acuerdo con esta posibilidad, se descubrió que hLF y hLF^{-3N} a 4ºC no tuvieron influencia en el número de bacterias viables ni en la actividad esterasa no específica, mientras que sí la tuvo la protegrina-1. La protegrina-1 mata a las bacterias a través de otro mecanismo, es decir, la permeabilización de la membrana. A diferencia de hLF natural y hLF^{-3N}, los fragmentos hLF(1-11), hLF(2-11), hLF(3-11) y hLF(4-11), pero no hLF(5-11) y hLF(6-11), influyeron en la permeabilidad de la membrana (figs. 3A-3C) en una forma dosis y tiempo-dependiente. Cuando se estudiaron a concentraciones que no aumentaron la permeabilidad de la membrana, estos péptidos no afectaron a la actividad esterasa no específica de las bacterias. Finalmente, estudios de dosis-efecto revelaron que hLF(1-11) fue considerablemente (p<0.05) más eficaz que hLF(21-31) aumentando la permeabilidad de la membrana de las bacterias (figs. 3A-3C).

Ejemplo V Actividad antibacteriana de hLF natural, hLF^{-3N} y de los péptidos relacionados en infecciones musculares del muslo experimentales

La actividad antibacteriana de la hLF y de varios fragmentos derivados en el tratamiento de infecciones que se inició en los ratones fue determinada usando los métodos descritos en el Ejemplo II. En las 24 h posteriores a la inyección de hLF natural, hLF^{-3N}, hLF(1-11), hLF(4-11) o hLF(21-31), el número de bacterias viables en los ratones con una infección con S. aureus resistente a los antibióticos fue reducida en una forma dosis dependiente: se vieron efectos máximos con 1 nmol de hLF, 10 nmol de hLF^{-3N}, 0.1 nmol de hLF(1-11) y 10 nmol de hLF(21-31) (ver Fig. 5). Se encontraron resultados similares (reducción de 2-3 log) en ratones infectados con K. pneumoniae (resultados no mostrados). La cantidad máxima de hLF(4-11) ejerció alguna actividad antibacteriana en ratones con una infección con S. aureus resistente a los antibióticos (Fig. 5).

Estudios farmacológicos revelaron que hLF natural, hLF^{-3N} y hLF(1-11), hLF(4-11) y hLF(21-31) fueron rápidamente retirados de la circulación de estos ratones con unos valores medios de t_{1/2} de aproximadamente 19 min, 22 min, 9 min, 1 min y 2 min, respectivamente (n = 3) (ver Fig. 6 y Tabla 2). Incluso dentro del primer min después de la inyección de 1 nmol de hLF natural, hLF^{-3N}, hLF(1-11), hLF(4-11) o hLF(21-31) radiomarcados en ratones infectados con S. aureus resistente a los antibióticos, se observó en el sitio de infección una cantidad significante del péptido radiomarcado, es decir, aproximadamente 1-1.5% de la dosis inyectada (ID). Además, la cantidad de hLF radiomarcada o del péptido relacionado en el sitio de infección permaneció constante durante el periodo de análisis, es decir, los primeros 60 min después de la inyección de la proteína o péptido radiomarcados (Fig. 6), indicando que la hLF natural, hLF^{-3N} y los péptidos relacionados alcanzaron y se acumularon rápidamente en este sitio.

Ejemplo VI Formación de imágenes de infecciones microbianas

Usando hLF y péptidos relacionados marcados con ^{99m}Tc junto con los métodos escintigráficos descritos en la sección de farmacología supra, fue posible detectar la acumulación de los péptidos radiomarcados en el sitio de infección.

La hLF y algunos polipéptidos de la invención fueron comparados con un marcador establecido de infección/infla-
mación, (es decir, IgG (23) humana policlonal radiomarcada), por su utilidad en la formación de imágenes de una infección bacteriana. Los resultados indicaron claramente que la hLF y los péptidos relacionados radiomarcados mostraban la infección mucho más rápido que la IgG radiomarcada. Además, HLF(1-11) fue también superior que los otros péptidos y que la propia hLF.

Conclusiones

Los ejemplos precedentes demuestran que las argininas N-terminales, Arg^{2} y Arg^{3}, de la hLF representan un papel importante en su actividad bactericida. Esta conclusión se basa en las conclusiones siguientes. Primero, la actividad bactericida de hLF^{-3N}, es decir, hLF carente de los tres primeros aminoácidos, fue significativamente inferior que la de hLF, ambas en estudios in vitro y en animales con una infección muscular del muslo experimental con S. aureus resistente a los antibióticos y K. pneumoniae. En gran medida, la cantidad de hLF y hLF^{-3N} en el sitio de infección no varió, excluyendo la posibilidad de que la actividad bactericida de estas proteínas en los ratones se deba a la cantidad de proteína en el sitio de infección en vez de a su acción. Segundo, la comparación de las actividades bactericidas de hLF(1-11) y de los péptidos carentes de uno o más de los cinco primeros residuos reveló que Arg^{2} y Arg^{3} son importantes para matar bacterias. De acuerdo con estos datos in vitro, HLF(1-11) resultó ser mucho más eficaz que hLF(4-11) para reducir el número de bacterias viables en ratones infectados con S. aureus resistente a los antibióticos.

La interacción de hLF y hLF^{-3N} con bacterias inhibió la actividad esterasa no específica de las bacterias sin afectar a la permeabilidad de la membrana de las bacterias. Aunque no se pretende regirse por esta teoría particular, estas observaciones sugieren que la hLF es tomada por las bacterias donde ejerce sus efectos, tales como la interacción con ATP (28) y/o mitocondrios, como se ha indicado recientemente para la histatina (29). Estas acciones intracelulares de la hLF podrían suponer la ruptura de la actividad metabólica y posteriormente la muerte de las bacterias. De acuerdo con esta perspectiva, se descubrió que a 4ºC la hLF no puede matar a las bacterias ni afectar a la actividad esterasa no específica de las bacterias, mientras que la protegrina-1 sí puede. En cuanto a la actividad bactericida de los péptidos derivados de la hLF descritos en la presente, el tamaño y estructura terciaria de los péptidos puede diferir considerablemente de las mismas secuencias de aminoácidos en hLF natural.

Los estudios descritos en la presente con hLF(21-31) conteniendo el segundo dominio catiónico (es decir, los residuos 28-31) mostraron que este polipéptido fue considerablemente menos eficaz para matar bacterias que hLF(1-11), lo cual sugiere que el primer dominio catiónico es significativamente más importante que el segundo dominio catiónico para matar bacterias. De acuerdo con esta conclusión, hLF(21-31) resultó ser menos eficaz que hLF(1-11) para reducir el número de bacterias viables en el músculo del muslo de los ratones infectados con S. aureus resistente a los antibióticos. Estos resultados son contrarios a otros informes que enfatizan la importancia del segundo dominio catiónico con respecto a la actividad antibacteriana de la lactoferrina.

Se entiende que los ejemplos y las formas de realización descritos en la presente están destinados a fines ilustrativos únicamente y que varias modificaciones o cambios a la vista de éstos serán sugeridos por los expertos en la técnica y deben de ser incluidos dentro del núcleo y el ámbito de esta aplicación y objetivo de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patente citadas en la presente están expresamente incorporadas por referencia en su totalidad para todos los objetivos en la misma medida que si se indicara que cada publicación, patente o solicitud de patente individual está incorporada específicamente e individualmente por referencia.

Tablas TABLA 1

Comparación de la actividad antibacteriana de hLF natural y hLF^{-3N}
Proteína	CFU de bacterias
		S. aureus
	L. monocytogenes	resistente a los	K. pneumoniae	E. coli
		antibióticos
Nada	4.4 \pm 1.3 x 10^{6}	1.2 \pm 1.5 x 10^{6}	2.6 \pm 1.2 x 10^{6}	1.1 \pm 1.4 x 10^{6}
BSA	3.5 \pm 0.6 x 10^{6}	1.1 \pm 2.8 x 10^{6}	2.1 \pm 0 x 10^{6}	1.1 \pm 0.5 x 10^{6}
hLF	2.4 \pm 0.9 x 10^{4} *.**	6.9 \pm 2.1 x 10^{4} *.**	2.1 \pm 0.2 x 10^{4}*.**	3.0 \pm 0.3 x 10^{6}
hLF^{-3N}	4.8 \pm 2.4 x 10^{5}*	5.6 \pm 1.9 x 10^{5}*	6.8 \pm 1.5 x 10^{5}*	9.5 \pm 8.2 x 10^{5}
\begin{minipage}[t]{157mm}Aproximadamente 1 x 10^{6} CFU de L. monocytogenes, S. aureus resistente a los antibióticos, K. pneumoniae, o E. coli fueron incubados con 4 \mu M de hLF natural o hLF^{-3N}, o como control con 8 \mu M de BSA. en PBS-Tw (pH 6.0) durante 3 h a 37^{o}C, lavados, y luego el número de bacterias viables fue determinado microbiológicamente. Los resultados son medias y SD de 3-5 experimentos.\end{minipage}
* indica p<0.05 para la diferencia entre la actividad bactericida de hLF natural o hLF^{-3N} versus control (BSA).
** indica p<0.05 para la diferencia entre la actividad bactericida de hLF^{-3N} y hLF natural.

TABLA 2

Toma de hLF natural, hLF^{-3N}, y péptidos relacionados marcados con ^{99m}tecnecio por varios órganos de ratones
lnfectaros con S. aureus resistente a los antibióticos
Intervalo (min)	órgano	Proteína/péptido (% ID)
		HLF	hLF^{-3N}	HLF(1-11)	hLF(21-31)
1	riñones	16 \pm 1.9	15 \pm 1.3	18 \pm 3.8	14 \pm 1.1
	vejiga	15 \pm 0.2	15 \pm 1.7	10 \pm 1.5	20 \pm 3.2
	hígado	11 \pm 1.9	17 \pm 2.0	20 \pm 1.6	28 \pm 1.5
15	riñones	11 \pm 0.1	14 \pm 1.0	21 \pm 9.3	25 \pm 2.5
	vejiga	31 \pm 0.6	24 \pm 2.1	11 \pm 7.5	34 \pm 0.8
	hígado	10 \pm 2.6	15 \pm 0.7	20 \pm 4.9	13 \pm 7.8
30	riñones	13 \pm 0.8	14 \pm 1.1	17 \pm 5.7	27 \pm 6.6
	vejiga	37 \pm 1.2	28 \pm 2.8	21 \pm 5.7	37 \pm 1.1
	hígado	7 \pm 1.8	17 \pm 1.4	20 \pm 1.6	14 \pm 11.8

TABLA 2 (continuación)

Intervalo (min)	órgano	Proteína/péptido (% ID)
		HLF	hLF^{-3N}	HLF(1-11)	hLF(21-31)
60	riñones	11 \pm 1.7	14 \pm 0.7	14 \pm 0.4	18 \pm 9.9
	vejiga	40 \pm 0.3	29 \pm 3.4	22 \pm 5.6	38 \pm 2.3
	hígado	4 \pm 0.6	10 \pm 0.6	27 \pm 0.6	20 \pm 6.3
\begin{minipage}[t]{157mm} Los ratones infectados con S. aureus resistente a los antibióticos fueron inyectados con 1 nmol de hLF, hLF^{-3N}, péptidos hLF(1-11), hLF(4-11) o hLF(21-31) marcados con ^{99m}tecnecio y a varios intervalos después de la inyección, se determinó la cantidad de radioactividad en los riñones, vejiga, hígado y otros órganos usando una cámara gamma plana equipada con un colimador usando las regiones de interés ocurridas sobre los distintos órganos. Las cantidades de radioactividad están expresadas como un porcentaje de la dosis inyectada (% ID). Los valores son medias y SD de tres ratones. \end{minipage}

Referencias

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<110> Pharming Intellectual Property B.V.

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<120> Actividad antimicrobiana de la primera agrupación catiónica de lactoferrina humana

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<130> péptido de hLF

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<140>

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<141>

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<150> 99203775.4

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<151> 1999-11-11

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<160> 6

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 692

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

1

2

3

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<210> 2

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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\sa{Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala}

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<210> 3

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<211> 27

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\sa{Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser Gln Pro Glu}

\sac{Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met}

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<210> 4

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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\sa{Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg}

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<210> 5

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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\sa{Arg Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Val Cys Val}

\sac{Val Gly Arg}

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<210> 6

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1

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<400> 6

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\sa{Arg Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu}

\sac{Glu Val Val}

Claims (14)

1. Uso de un polipéptido seleccionado del grupo consistente en:

a) un polipéptido que comprende al menos 8 pero no más de 18 aminoácidos contiguos del segmento N-terminal de la proteína lactoferrina humana (SEC ID NO:1), donde el N-terminal de dicho polipéptido es el residuo 1 de la SEC ID NO:1;

b) un polipéptido que comprende al menos 7 pero no más de 27 aminoácidos contiguos del segmento N-terminal de la proteína lactoferrina humana (SEC ID NO:1), donde el N-terminal de dicho polipéptido es el residuo 2 de la SEC ID NO:1; y,

c) un polipéptido que comprende al menos 6 pero no más de 27 aminoácidos contiguos del segmento N-terminal de la proteína lactoferrina humana (SEC ID NO:1), donde el N-terminal de dicho polipéptido es el residuo 3 de la SEC ID NO:1;

como agente antimicrobiano único para la producción de un medicamento para tratar a un paciente infectado con un microbio.

2. Uso según la reivindicación 1, donde el polipéptido comprende no más de 11 aminoácidos contiguos del segmento N-terminal de la proteína lactoferrina humana (SEC ID NO:1).

3. Uso según las reivindicaciones 1 o 2, donde el microbio es una bacteria, un hongo, un virus o un parásito.

4. Uso según la reivindicación 3, donde la bacteria está seleccionada del grupo consistente en Listeria, Escherichia, Chlamydia, bacterias rickettsiales, Micobacterias, Estafilococos, Estreptococos, Pneumonococos, Meningococos y Gonococos, Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, Legionella, difteria, Salmonella, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, plaga, Leptospirosis, y bacterias de la enfermedad de Lymes.

5. Uso según la reivindicación 3, donde el hongo está seleccionado del grupo consistente en Candida, Cryptococcus, Aspergillus, Mucorales, Sporothrix, Blastomyces, Paracoccidioides, Coccidioides e Histoplasma.

6. Uso según la reivindicación 5, donde el hongo está seleccionado del grupo consistente en Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Mucor, Absidia, Rhizopus, Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasilienses, Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum.

7. Uso según la reivindicación 3, donde el virus está seleccionado del grupo de virus patógenos consistente en virus de la Hepatitis (A, B o C), Herpes virus (VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, CMV, EBV), Adenovirus, Virus influenza, Flavivirus, Ecovirus, Rinovirus, Virus coxsackie, Coronavirus, Virus sincitial respiratorio, Virus de las paperas, Rotavirus, Virus del sarampión, Virus de la rubeola, Parvovirus, Virus Vaccinia, Virus HTLV, Virus del Dengue, Virus del papiloma, Virus Molluscum, Virus de la polio, Virus de la rabia, Virus JC, Virus de encefalitis arbovírica y Virus de la inmunodeficiencia humana (virus VIH tipo I y II).

8. Uso según la reivindicación 3, donde el parásito está seleccionado del grupo de parásitos patógenos consistentes en Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleria, Fowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii y Plasmodium falciparis.

9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el medicamento debe de ser administrado por vía oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intranasal.

10. Uso de un polipéptido tal y como se define en las reivindicaciones 1 o 2 en la producción de una composición para detectar una infección microbiana, donde el polipéptido es marcado.

11. Uso según la reivindicación 10, donde el polipéptido marcado debe de ser administrado a un sujeto o espécimen infectado con, o con sospechas de estar infectado con, un microbio, donde el polipéptido es capaz de interactuar con el microbio, y donde el polipéptido marcado es detectado en un sitio de infección.

12. Uso según la reivindicación 10 u 11, donde el marcador es un isótopo radioactivo y la presencia del polipéptido marcado es detectada con una cámara gamma:

13. Un polipéptido seleccionado del grupo consistente en:

(a) polipéptido que comprende 8, 9, 10, o 12 o más pero no más de 18 aminoácidos contiguos de la proteína lactoferrina humana (SEC ID NO:1), donde el N-terminal de dicho polipéptido es el residuo 1 de la SEC ID NO:1;

(b) un polipéptido que comprende al menos 7 pero no más de 27 aminoácidos contiguos de la proteína lactoferrina humana (SEC ID NO:1), donde el N-terminal de dicho polipéptido es el residuo 2 de la SEC ID NO:1; y,

(c) un polipéptido que comprende al menos 6 pero no más de 27 aminoácidos contiguos de la proteína lactoferrina humana (SEC ID NO:1), donde el N-terminal de dicho polipéptido es el residuo 3 de la SEC ID NO:1.

14. Un polipéptido según la reivindicación 13, donde el polipéptido comprende no más de 11 aminoácidos contiguos de la proteína lactoferrina humana (SEC ID NO:1).