TW201725047A - 熱休克蛋白於治療異位性皮膚炎之用途 - Google Patents

Abstract

異位性皮膚炎是常見的兒童及成人免疫疾病。本發明揭示熱休克蛋白70可有效抑制TSLP的轉錄和轉譯，以及抑制TSLP被運輸至細胞外，進而抑制免疫反應；另揭示熱休克蛋白可抑制NF-κB以及IκBα的活化。因此，熱休克蛋白係可用於治療TSLP相關疾病以及異位性皮膚炎。

Description

熱休克蛋白於治療異位性皮膚炎之用途

本發明係利用熱休克蛋白70的用途，可抑制TSLP的產生，進一步治療異位性皮膚炎。

異位性皮膚炎(atopic dermatitis)會引起皮膚紅腫、搔癢、以及表皮剝落結痂等症狀，是一種與遺傳高度相關的皮膚過敏疾病，主要好發於嬰幼兒時期，在台灣約有40%的患者是未滿20歲，但也可見於任何年齡層。患有異位性皮膚炎的幼兒隨著年齡的增長，異位性皮膚炎的問題可緩解或消失。但是皮膚可能仍然乾燥，易於發炎。患者由於異位性皮膚炎所引起的搔癢，可能導致過敏處表皮破裂，嚴重可能引起細菌感染以及流膿。

異位性皮膚炎的成因複雜，目前認為可能的原因包含遺傳因子、免疫能力異常、環境因子、以及皮膚通透性等，居住於大城市以及乾燥型氣候之環境罹患比率較高；此外，日常情緒壓力可能也是成因之一。常見的環境刺激物，例如毛料、清潔劑、灰塵、或是空氣汙染，可能是異位性皮膚炎發病的因素；另也可能肇因於過敏原，例如食物、塵蟎、黴菌、花粉、或是寵物等。

由於異位性皮膚炎於台灣是常見的疾病，且有較高比例是幼兒或青少年患者，對於生活造成一定程度的影響，包括就學或是就業的困 擾，或是造成情緒上的影響等。目前大多使用固醇類藥物治療異位性皮膚炎，但目前所知的藥物治療並無法有效且長時間地減緩症狀，因此改善患者生活環境亦為可能的療法之一。

表皮細胞會因為接觸抗原而產生多種細胞激素或是抗菌胜肽，以誘發免疫反應，其中包含胸腺基質淋巴生成素(TSLP，thymic stromal lymphopoietin)，一種類IL-7的細胞激素，已有先前研究報導TSLP於異位性皮膚炎患者表皮大量表現(Rochman et al.J Immunol 2007，Liu J Exp Med 2006)；TSLP亦可刺激T細胞產生誘發免疫反應的蛋白質，如TNF-α(Ebner et al.J Allergy Clin Immunol 2007)。另有報導指出，TSLP可藉由JAK/STAT的訊息傳導，活化多種免疫細胞(Ziegler J Allergy Clin Immunol 2012)。

熱休克蛋白為細胞接收到外在壓力刺激時會產生的蛋白質種類，其具有多種功能，包括做為伴護蛋白(chaperone)，可修復細胞接收外在壓力刺激造成的蛋白質變性或錯誤折疊。其命名主要依照該蛋白質分子量，例如Hsp70、Hsp80、以及Hsp90等，係指該蛋白質分子量為70、80、或90kDa。Hsp70與免疫反應高度相關，可與抗原結合，並將該抗原表現予抗原表現細胞(APC)(Nishikawa et al.Int J Pharm 2008)，誘發免疫反應。

Hsp70包含三個蛋白質結構域(doman)：N-terminal ATPase domain、Substrate binding domain、C-terminal domain，Hsp70蛋白質家族皆具有相同的蛋白質域結構。Substrate binding domain可最多與7個胺基酸之胜肽交互作用，若有胜肽存在於Substrate binding domain之中，即可活化ATP酶的活性，提升Hsp70的修飾功能。

TSLP可用於多種免疫相關用途：美國專利US7731953揭示 TSLP可用於活化CD4+ T細胞；此外，US8163284揭示TSLP的拮抗物可用於治療免疫失調的疾病，特別是可使用抗體抑制TSLP的活性；US8097705亦揭示可使用抗體拮抗TSLP受體，以治療TSLP相關之疾病。

另，熱休克蛋白也被揭示可用於免疫相關之疾病。US6007821揭示熱休克蛋白gp96、hsp90、hsp70等可用於治療自體免疫所引起的糖尿病；US8932651揭示自苜蓿草(alfalfa)中所萃取的熱休克蛋白可用於治療關節炎。

有鑑於TSLP與異位性皮膚炎有高度相關，若能自TSLP的抑制進而治療異位性皮膚炎等TSLP相關疾病，則對於該疾病的患者將有莫大幫助。

本發明之目的係提供一種使用熱休克蛋白70藉由抑制TSLP，進而用於治療免疫疾病的用途。

為達上述之發明目的，本發明提供一種熱休克蛋白70用於製備治療皮膚炎之醫藥組合物之用途，該醫藥組合物包含治療有效量之熱休克蛋白70。

其中，該皮膚炎係異位性皮膚炎。

其中，該醫藥組合物進一步包括藥學上可接受之載劑，該載劑係選自賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、黏結劑、崩解劑、潤滑劑、油性或非油性的基質、表面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、佐劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、色素或香料，或上述之任意組合所組成之群組。

其中，該醫藥組合物係以靜脈注射、皮下注射、口服、或塗抹方式施予患者。

其中，該醫藥組合物之劑型包含溶液、乳劑、懸浮液、粉末、錠劑、油劑、軟膏、口含錠、膠囊。

其中，該醫藥組合物包含0.005至0.1μg/ml之熱休克蛋白70。

本發明另提供一種熱休克蛋白70用於製備治療TSLP相關疾病之醫藥組合物之用途，該醫藥組合物包含治療有效量之熱休克蛋白70。

其中，該TSLP相關疾病係選自異位性皮膚炎、癌細胞增生、類風溼性關節炎(rheumatoid arthritis)、食道炎(esophagitis)、濾泡性胃炎(follicular gastritis)、潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、過敏(allergy)、氣喘(asthma)所組成之群組。

其中，該治療TSLP相關疾病之醫藥組合物係抑制NF-κB之活化進而抑制TSLP產生。

其中，該醫藥組合物進一步包括藥學上可接受之載劑，該載劑係選自賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、黏結劑、崩解劑、潤滑劑、油性或非油性的基質、表面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、佐劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、色素或香料，或上述之任意組合所組成之群組。

其中，該醫藥組合物係以靜脈注射、皮下注射、口服、或塗抹方式施予患者。

其中，該醫藥組合物之劑型包含溶液、乳劑、懸浮液、粉末、錠劑、油劑、軟膏、口含錠、膠囊。

其中，該醫藥組合物包含0.005至0.1μg/ml之熱休克蛋白70。

第1圖 (a)HaCa T細胞於熱休克處理之後，Hsp70表現量與其時間序列，β-actin為內控制組(internal control)(*p<0.05)；(b)HaCa T細胞經細胞激素處理之後，TSLP表現量與其時間序列(C：無熱休克對照組，H：熱休克，S：細胞激素刺激；*p<0.05，**p<0.01；#p<0.05，##p<0.01；n=6)。

第2圖 以ELISA測定HaCa T細胞經細胞激素刺激後所分泌之胞外TSLP(**p<0.01；##p<0.01；n=6)。

第3圖 以qPCR測定TSLP mRNA表現量(**p<0.01；##p<0.01，ns：無顯著差異；n=6)。

第4圖 熱休克處理對於細胞激素刺激之p-NF-κB以及p-IκBα的抑制效果(**p<0.01；#p<0.05，##p<0.01；n=6)。

第5圖 外源Hsp70於0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.1μg/ml濃度之下，對於TSLP的抑制效果(C：無熱休克對照組，H：熱休克，S：細胞激素刺激；n=6)。

第6圖 外源Hsp7對於p-NF-κB以及p-IκBα的抑制效果(C：無熱休克對照組，H：熱休克，S：細胞激素刺激，R：Hsp70刺激；***p<0.001；#p<0.05，##p<0.01；n=5)。

第7圖 Hsp70及其下游訊息的表現量之0-24小時時間序列分析。

本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但僅為例示而非限制，本發明不受下述實施例所限制。除非另有說明，本發明所用之材料皆市售易於取得，下列僅為示例可取得之管道。

術語「治療」、「用於治療」以及其類用語係指稱延緩、改善、減少、或逆轉患者所罹患之可診斷病症以及該病症造成之相關症狀的方法以及預防該病症或任何其所屬之相關症狀的方法。

術語「藥學上可接受」係指稱物質或組合物必須與其藥學上調配物之其他成分相容，且不加劇患者之症狀。

本發明提供之化合物或組合物係可利用本發明所屬技術領域具有通常知識者所詳知的技術，將本案所提供之化合物或組合物、與至少一藥學上可接受之載劑(vehicle)，製備一適用本發明組合物之劑型。其中該劑型包含但不限於：溶液、乳劑、懸浮液、粉末、錠劑、口含錠、藥片、口嚼膠、膠囊以及其他類似或適用本發明之劑型。

術語「藥學上可接受之載劑」包含一或多種選自於下列的成分類型：溶劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤滑劑、表面活性劑、及其他類似或適用於本發明之載劑。

前述組合物中，亦可依需適宜地添加一或多種以上製劑領域內通常使用之溶解輔助劑、緩衝劑、著色劑、調味劑等。

術語「藥學上可接受之賦形劑」包括但不限於，聚合物、樹脂、增塑劑、填料、潤滑劑、稀釋劑、黏合劑、崩解劑、溶劑、共一溶劑、界面活性劑、防腐劑、甜味劑、調味劑、藥學級的染料或顏料、及黏度劑至少一者。

術語「醫藥組合物」係指稱一固體或液體組成物，其形式、濃度和純度程度適合投予給患者，在投予之後，其可誘發所欲生理變化； 醫藥組成物為無菌及/或非發熱性者(non-pyrogenic)。

術語「有效量」係指稱產生、造成預期之生物體反應所必須之劑量，且非以治療痊癒所需為定量。本發明所屬技術領域具通常知識者可理解，醫藥組合物之有效量可視諸如下列等因素而變化：期望生物終點、擬遞送生物活性劑、囊封基質(encapsulating matrix)之組成、目標組織等等。

實施例1 測定熱休克處理細胞Hsp70表現量

依據Goldbaum et al.(J Neurochem 2001)揭示之方法培養人類角質細胞(Homo sapiens keratinocyte cell)之細胞株：HaCa T細胞(ATCC)，並且將HaCa T細胞於45℃培養20分鐘以模擬熱休克(heat shock)。熱休克蛋白70(Hsp70)以西方墨點轉漬法(western blot)測定其表現量，結果顯示，Hsp70於上述模擬熱休克培養之後蛋白質表現量升高，並於熱休克處理後8小時達到最高點，之後表現量漸減(第1圖(a))。

實施例2 測定熱休克和細胞激素對於TSLP表現量之影響

模擬熱休克之細胞，於熱休克後培養6小時，並以細胞激素，包含腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNFα)(20ng/ml)、介白素4(interleukin(IL)-4)(100ng/ml)、以及IL-13(100ng/ml)，刺激細胞產生胸腺基質淋巴生成素(TSLP、thymic stromal lymphopoietin)。未經熱休克處理的對照組HaCa T細胞，於前述細胞激素刺激後4-6小時開始逐漸增加其細胞內TSLP蛋白質表現亮，其表現量於刺激後16小時顯著提高；相較之下，經熱休克處理的HaCa T細胞，於前述細胞激素刺激後，其細胞內TSLP表現量並未提高，且明顯少於對照組(第1圖(b))。另以酵素免疫測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定細胞外、即細胞所分泌之TSLP。以ELISA 實驗套組(eBioscience,San Diego,CA,USA,88-7497)測定之結果顯示，未經熱休克處理的對照組HaCa T細胞，其細胞外TSLP亦於刺激後4-8小時顯著增加，並且延續至24小時；但經熱休克處理的HaCa T細胞，於刺激後24小時皆未觀察到顯著變化。

實施例3測定熱休克和細胞激素對於TSLP mRNA表現量之影響

抽取細胞激素刺激後4小時和8小時之HaCa T細胞的mRNA，並且以定量核酸聚合酶連鎖反應(quantitative PCR，qPCR)定量TSLP，以GAPDH為內控制組，該TSLP之聚合反應正向引子為SEQ ID NO：1、反向引子為SEQ ID NO：2；該GAPDH之聚合反應正向引子為SEQ ID NO：3、反向引子為SEQ ID NO：4。qPCR的DNA放大於ABI7300 Realtime PCR System進行(Applied Biosystems)。

TSLP mRNA定量結果顯示，於細胞激素刺激後4小時TSLP mRNA表現量於未經熱休克的HaCa T細胞顯著提高，且顯著高於經熱休克處理的實驗組，但刺激後8小時未經熱休克與經熱休克處理的TSLP mRNA表現量則無顯著差異(第3圖)。此結果說明TSLP mRNA的表現會因為熱休克之處理而被抑制。

實施例4 Hsp70藉由NF-κB抑制TSLP的表現

已有先前文獻報導NF-κB可活化TSLP的啟動子(Cultrone et al.Eur J Immunol 2013)。

比較未經熱休克與經熱休克處理的細胞，經熱休克處理之後NF-κB的磷酸化(p-NF-κB)以及IκBα的磷酸化(p-IκBα)皆被抑制(第4圖)，IκBα的去磷酸化可抑制NF-κB的磷酸化，即抑制NF-κB的活性。另以Hsp70(RefSeq： NP_005336.3，SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6)(0.1μg/ml)(Enzo Life Sciences)刺激HaCa T細胞2小時，再洗去Hsp70並加入TNFα(20ng/ml)、IL-4(100ng/ml)、以及IL-13(100ng/ml)，分別觀察其下游訊息傳導路徑的變化。於外源的Hsp70刺激後，相較於未經Hsp70處理的細胞，其TSLP表現量明顯被抑制(第5圖)。此外，Hsp70下游的訊息傳導，NF-κB和IκBα，其磷酸化皆被Hsp70的刺激所抑制，因此處於不活化狀態(第6圖)。

分析前述結果，p-NF-κB、TSLP mRNA、TSLP蛋白質、以及Hsp70的表現量與時間序列顯示，經熱休克處理16小時之後，細胞內TSLP的表現量有顯著地被抑制；但相對地，細胞外的TSLP卻於熱休克處理初期即有顯著地被抑制(第7圖)。說明Hsp70的刺激對於細胞將TSLP運輸至胞外的影響較大，而對於TSLP於轉錄及轉譯層次的影響較小且較慢。

綜本發明實施例所揭示，Hsp70於mRNA以及蛋白質層次皆有效地抑制人類角質細胞的TSLP的生成，以及顯著地降低胞內以及胞外的TSLP；並且可藉由抑制NF-κB的活化而抑制TSLP。本發明提供一Hsp70之用途，可用於抑制表皮細胞TSLP的產生，並且可進一步用於治療異位性皮膚炎。

<110> 彰化基督教醫療財團法人彰化基督教醫院

<120> 熱休克蛋白於治療異位性皮膚炎之用途

<160> 6

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

<210> 5

<211> 641

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 641

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Claims (13)

1. 熱休克蛋白70用於製備治療皮膚炎之醫藥組合物之用途，該醫藥組合物包含治療有效量之熱休克蛋白70。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，該皮膚炎係異位性皮膚炎。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，該醫藥組合物進一步包括藥學上可接受之載劑，該載劑係選自賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、黏結劑、崩解劑、潤滑劑、油性或非油性的基質、表面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、佐劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、色素或香料，或上述之任意組合所組成之群組。
4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，該醫藥組合物係以靜脈注射、皮下注射、口服、或塗抹方式施予患者。
5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，該醫藥組合物之劑型包含溶液、乳劑、懸浮液、粉末、錠劑、油劑、軟膏、口含錠、膠囊。
6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，該醫藥組合物包含0.005至0.1μg/ml之熱休克蛋白70。
7. 熱休克蛋白70用於製備治療TSLP相關疾病之醫藥組合物之用途，該醫藥組合物包含治療有效量之熱休克蛋白70。
8. 如申請專利範圍第7項所述之用途，該TSLP相關疾病係選自異位性皮膚炎、癌細胞增生、類風溼性關節炎、食道炎、濾泡性胃炎、潰瘍性結腸炎、過敏、氣喘所組成之群組。
9. 如申請專利範圍第7項所述之用途，該治療TSLP相關疾病之醫藥組合物係抑制NF-κB之活化進而抑制TSLP產生。
10. 如申請專利範圍第7項所述之用途，該醫藥組合物進一步包括藥學上可接受之載劑，該載劑係選自賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、黏結劑、崩解劑、潤滑劑、油性或非油性的基質、表面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、佐劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、色素或香料，或上述之任意組合所組成之群組。
11. 如申請專利範圍第7項所述之用途，該醫藥組合物係以靜脈注射、皮下注射、口服、或塗抹方式施予患者。
12. 如申請專利範圍第7項所述之用途，該醫藥組合物之劑型包含溶液、乳劑、懸浮液、粉末、錠劑、油劑、軟膏、口含錠、膠囊。
13. 如申請專利範圍第7項所述之用途，該醫藥組合物包含0.005至0.1μg/ml之熱休克蛋白70。