CN105358164B - 治疗和/或预防慢性炎症疾病的菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗和/或预防慢性炎症疾病，尤其是慢性炎症性风湿病的以保藏号I‑2745保藏于国家培养物和微生物保藏中心的益生菌菌株枯草芽孢杆菌CU1，通过培养所述菌株获得的细胞和包含通过培养所述菌株获得的细胞的组合物。

Description

治疗和/或预防慢性炎症疾病的菌株

技术领域

本发明涉及炎症疾病领域。其尤其涉及益生菌菌株在治疗和/或预防慢性炎症疾病，特别是慢性炎症性风湿病中的用途。

背景技术

炎症是响应对人体内源性或外源性攻击的机体防御机制。物理、化学或感染性因素可以是炎症外源性因子的来源。代谢因素、血管形成问题或异常免疫反应可以是炎症内源性因子的来源。在这些因子之一存在的情况下，炎症机制将通过一系列顺次步骤反应：

–血管渗出性反应造成阻塞(充血)，即炎性水肿和白细胞渗出，

–由炎性肉芽肿形成组成的细胞反应，

–清创术，和

–受损区域的修复和愈合。

然而，由于病原菌或内源性因子的持久性，炎症有时候可以是有害的，例如类风湿性关节炎中的自身免疫疾病。随后其对机体的损害继续发展，引起不受控的免疫反应和伴有组织(例如关节组织)损坏的慢性炎症。

类风湿性关节炎是一种自身免疫的进展的慢性炎症性风湿性疾病，它影响全身的关节，造成醒来时关节疼痛、肿胀和僵硬。其称之为进展性的，因为在大多数情况下，它通过穿插或多或少长时间平静的炎症期发生进展。

它也可以发生在其他组织，这些关节外表现可能危及患者的生命。

类风湿性关节炎影响大约1％的人群，其中主要是女人，每3个案例中有一个是男性，且已知发病率随年龄增长而增长。

第一种症状出现在手指或脚的小关节。随着时间的推移，慢性炎症导致骨和软骨的破坏和进展性残疾。如果炎症持续，它可以破坏软骨、周围的骨组织、肌腱和关节韧带。因此，该疾病常常导致关节变形和残疾。

更具体地，类风湿性关节炎的特征是关节滑膜的炎症，其导致炎症细胞在滑膜液中的异常渗透。

最初，血管的异常增殖允许促炎性细胞(淋巴细胞，包括CD4、单核细胞、多形核白细胞和中性粒细胞)大量涌入滑膜和关节内空间。

滑膜成纤维细胞增生以及淋巴细胞(T、CD4和B)和巨噬细胞的渗透随后导致形成滑膜血管翳，其引起滑膜炎症，也称为滑膜炎。这些不同的细胞异常增殖、侵入骨和软骨、产生大量促炎性细胞因子和金属蛋白酶，并触发破骨细胞的形成和活化。特别丰富的促炎性细胞因子有：TNF-α(肿瘤坏死因子α)、IL-1、IL-6、IL-12和IL-17,术语IL是指白细胞介素。

关节的破坏继发于骨的侵蚀和软骨的退化。细胞因子RANKL促进所述侵蚀，金属蛋白酶促进软骨溶解。这两种分子由组成滑膜的细胞在TNF-α和IL-1的作用下产生。

然后该细胞将试图反击这种退化，但破骨细胞(其作用是制造骨)将以不受控的方式产生该细胞，从而造成关节变形和骨化。

类风湿性关节炎的治疗应当在发现该疾病后尽早开始，以减缓炎症进程，防止关节损伤和变形。

传统的治疗由施用抗炎药来抑制关节炎症和细胞因子产生组成。也使用免疫系统的免疫调节药物。

目前的新疗法尤其关注TNF-α或IL-1阻断剂，例如依那西普、英夫利昔单抗、阿达木单抗和赛妥珠单抗。

对治疗的反应在个体之间和疾病阶段之间有所不同。因此，寻找替代治疗从而为对已有治疗有抗性的患者提供新的解决方案非常重要。

此外，由于非常昂贵的抗炎治疗以及可能造成的患者残疾，类风湿性关节炎的治疗对社会而言成本很高。实际上，炎症疾病需要长时期治疗来得到效果，换言之，来阻止疾病进展、炎症复发并将疾病稳定保持在缓解状态。

类似地，患者长期使用抗炎药可能引起副作用，例如体重增加、肠胃紊乱，和/或骨质疏松和高血压风险增加。

因此，益生菌可能是令人感兴趣的替代物。

术语“益生菌”用来定义当以足够的量加入时，对健康、舒适和幸福产生传统营养效果之外的积极效果的活的微生物。

WO2007/133188公开了包含至少一种选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的细菌的抗真菌细菌组合物在刺激抗真菌反应并治疗从孤独症到阴道感染和子宫内膜异位症的完全不同病理的用途，其中提到了类风湿性关节炎。该文献没有公开可用于抗真菌组合物的特定细菌菌株。

WO2009/026306公开了用于治疗和/或预防从孤独症到阴道感染和子宫内膜异位症的完全不同病理的包含三种细菌菌株(即枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、屎肠球菌(Enterococcus faecium)或粪肠球菌)的组合物，其中提到了类风湿性关节炎。该文献没有公开可用于所述组合物的特定细菌菌株。

然而，已知给定菌株，无论是酵母菌株或细菌菌株，的益生效果对该菌株是特定的，而不考虑类型甚至是种。

并且，除已有疗法之外，仍然需要发现用于预防和/或治疗慢性炎症疾病的，较经济且具有较少副作用的新疗法。

发明详述

因此，本发明涉及用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的细菌益生菌菌株。

发明人出乎意料地发现，枯草芽孢杆菌菌株CU1在治疗和/或预防慢性炎症疾病中具有有益效果。

枯草芽孢杆菌菌株CU1以保藏号I-2745于2001年10月25日保藏于CNCM，国家培养物和微生物保藏中心，巴斯德研究所，25rue du Docteur Roux,F-75725 Paris Cedex 15。

FR2837835首次描述了枯草芽孢杆菌菌株CU1。该文献将枯草芽孢杆菌菌株CU1描述为免疫系统的免疫调节剂，并描述了其用于生产针对幽门螺旋杆菌(H.Pylori)的重组活疫苗的用途。

“菌株”是指相对均匀的细胞群。

特别地，菌株从分离克隆获得，克隆是指从单个细胞获得的细胞群。

术语“枯草芽孢杆菌菌株CU1”、“益生菌菌株CU1”、“以保藏号I-2745保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株”和“菌株CU1”是同义词。

因此，本发明涉及用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的以保藏号I-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1。

本发明还涉及通过培养以保藏号I-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1获得的用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的细胞。

本发明还涉及包含通过培养以保藏号I-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1获得的细胞，用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的组合物。

术语“通过培养以保藏号I-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1获得的细胞”、“生物质CU1”、“通过培养菌株CU1获得的细胞”或“细胞CU1”在本文中是同义词。

菌株CU1和通过培养所述菌株获得的细胞CU1构成用于预防和/或治疗慢性炎症疾病的替代疗法，其较为经济且不具有常规疗法的副作用。

术语“慢性炎症疾病”是指选自以下的疾病：慢性炎症性风湿病、牛皮癣、慢性胰腺炎、腹腔疾病、桥本氏甲状腺炎、克罗恩病、红斑狼疮、硬皮病、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎和血管炎。

术语“治疗疾病”是指通过降低炎症强度治疗疾病以治愈它、缓解它的症状或不适，或稳定疾病以使其保持在缓解状态。

术语“缓解状态”是指炎症发作之间的间隔。

术语“预防疾病”是指例如在有发展疾病风险的受试者中避免疾病发作，或当它已经存在时延迟疾病的炎症发作。

本发明尤其涉及用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的枯草芽孢杆菌菌株CU1或通过培养所述菌株获得的细胞或包含通过培养所述菌株获得的细胞的组合物，其特征在于所述慢性炎症疾病是慢性炎症性风湿病。

“慢性炎症性风湿病”是指选自以下的疾病：类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、脊柱关节病、系统性红斑狼疮、斯耶格伦氏综合征、白塞病、硬皮病、幼年特发性关节炎和慢性萎缩性。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗和/或预防类风湿性关节炎的枯草芽孢杆菌菌株CU1，或通过培养所述菌株获得的细胞，或包含通过培养所述菌株获得的细胞的组合物。

发明人出乎意料地发现，使用益生菌枯草芽孢杆菌菌株CU1，尤其是通过培养所述菌株获得的细胞，允许：

–减少促炎性细胞因子例如TNF-α、IL-1、IL-12、IL-17的产生，如实施例1和2所证实；

–刺激抗炎性细胞因子例如IL-10的产生，如实施例2所证实；

–延迟和/或减少宏观症状，例如炎症的严重程度或类风湿性关节炎中受影响关节的数量，如实施例1所证实；

–减少滑膜液中免疫细胞的渗透，如实施例1所证实；

–减少导致软骨、骨的破坏和关节变形的关节损伤，如实施例1所证实。

实际上，TNF-α和白细胞介素IL-1、IL-12和IL-17是在炎症疾病中起重要作用的促炎性细胞因子。它们的过量分泌将产生慢性炎症，在类风湿性关节炎的情况下，将导致不可逆的关节损伤和它们的变形。

术语“宏观症状”是指根据1987年美国风湿病协会(ACR)修订的标准(参见ArnettFC等,Arthritis Rheum.1988；31:315-24)肉眼可见的症状，例如炎症的严重程度、受炎症影响的关节数量和关节变形。

术语“免疫细胞”是指巨噬细胞、淋巴细胞、循环多形核和单核白细胞。

免疫细胞渗透进入关节，更具体地进入滑膜将产生涉及软骨和周围骨组织的破坏的滑膜血管翳。

因此，发明人发现，施用CU1细胞具有降低和预防滑膜血管翳形成的效果，如实施例1所述。

“关节损伤”是指蛋白聚糖在软骨基质中的损失引起的软骨和关节骨的逐渐破坏、以及所述关节的逐渐变形。关节变形是由于破骨细胞引起的关节的不受控骨化。这种变形通过造成患者失去自主权和残疾而可能具有严重后果。

因此，本发明还涉及用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的枯草芽孢杆菌菌株CU1或通过培养所述菌株获得的细胞或包含通过培养所述菌株获得的细胞的组合物，其特征在于它诱导至少一种促炎性细胞因子生产的降低和/或至少一种抗炎性细胞因子生产的增加。

通过枯草芽孢杆菌菌株CU1或通过培养所述菌株获得的细胞或包含通过培养所述菌株获得的细胞的组合物降低生产的促炎性细胞因子选自：TNF-α、白细胞介素IL-1、白细胞介素IL-12或白细胞介素IL-17。

通过枯草芽孢杆菌菌株CU1或通过培养所述菌株获得的细胞或包含通过培养所述菌株获得的细胞的组合物增加生产的抗炎性细胞因子是，例如白细胞介素IL-10。

本发明还涉及用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的枯草芽孢杆菌菌株CU1或通过培养所述菌株获得的细胞或包含通过培养所述菌株获得的细胞的组合物，其特征在于它诱导至少两种促炎性细胞因子，优选至少三种促炎性细胞因子生产的降低和/或至少一种抗炎性细胞因子，例如白细胞介素IL-10生产的增加。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的枯草芽孢杆菌菌株CU1或通过培养所述菌株获得的细胞或包含通过培养所述菌株获得的细胞的组合物，其特征在于它诱导TNF-α、白细胞介素IL-1、白细胞介素IL-12和白细胞介素IL-17生产的降低和白细胞介素IL-10生产的增加。

本发明还涉及用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的枯草芽孢杆菌菌株CU1或通过培养所述菌株获得的细胞或包含通过培养所述菌株获得的细胞的组合物，其特征在于它意欲供人和/或兽使用。

兽的使用涉及农场动物，例如猪、牛、绵羊或山羊，但也涉及家畜，例如猫、狗、马或兔。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的枯草芽孢杆菌菌株CU1或通过培养所述菌株获得的细胞或包含通过培养所述菌株获得的细胞的组合物，其特征在于它意欲供人使用。

根据本领域技术人员公知的方法，例如在名为Biotechnology,5th Edition,R.Scriban,Tec.&Doc.Edition,1999 ISBN:2-7430-0309-X的书中所述的方法通过在培养基中培养枯草芽孢杆菌菌株CU1获得细胞CU1。通常，通过培养菌株CU1获得细胞CU1的生产方法包括以下步骤：

–用菌株CU1的接种物接种培养基；

–在需氧条件下培养以使细胞增殖；

–从培养基中分离生物质，获得细胞CU1。

因此获得的细胞CU1主要是繁殖体。

细菌的“繁殖体”是指处于有利条件下的细菌形式。

术语“主要是繁殖体”是指至少70％的细胞是繁殖体，优选至少80％，更优选至少90％。

有利条件的一个实例是在有利于细菌繁殖的温度和pH下的非限制性培养基。

非限制性培养基包含细胞增殖所需的所有营养物。

细胞CU1的生产方法还可以在需氧条件下的培养步骤和从其培养基分离生物质的步骤之间包括中间步骤，即将细胞置于不利条件。因此在该方法结束时所得的细胞CU1主要是孢子体(sporulated form)。

细菌的“孢子体”是指处于不利条件下的细菌形式。

表述“主要是孢子体”是指至少70％的细胞是孢子体，优选至少80％，更优选至少90％。

因此，孢子体是使细胞能够经受困难培养基，例如缺乏营养(即限制营养的培养基)、水分胁迫、pH或温度的大变或当通过消化道时的抵抗形式。

将细胞CU1置于不利条件通过以下实现，例如：不更新细菌培养基、停止向培养基进料、使用限制性培养基、改变温度、改变pH、控制通风和/或搅拌以将培养基中的O₂压力维持在高于20％、将输出气体中的CO₂压力维持在低于1.5％、或它们的组合。

还可以通过在培养基中加入约0.75g/L的谷氨酸来获得主要是孢子体的细胞CU1。

因此，本发明还涉及用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的通过培养菌株CU1获得的细胞或包含所述细胞的组合物，其特征在于所述细胞是孢子体和/或繁殖体。

在一个优选的实施方案中，细胞CU1主要是孢子体。

细胞CU1的生产方法还可以包括干燥细胞CU1以获得干燥形式的细胞CU1的后续步骤。

干燥是，例如冷冻干燥、流化床干燥或喷雾干燥。

因此，本发明涉及用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的通过培养菌株CU1获得的细胞或包含所述细胞的组合物，其特征在于所述细胞是干燥形式。

“干燥形式的细胞”是指在细胞CU1的生产方法结束时所得的生物质包含超过90％的干物质，优选超过95％的干物质。

每日剂量取决于动物的类型、其体重、施用方式以及处理类型，是治疗型或预防型。

本发明进一步涉及如上定义的细胞或组合物，当意欲供人使用时，细胞CU1的每日用量为1.10⁸CFU至1.10¹¹CFU，优选5.10⁸CFU至1.10¹⁰CFU。

本发明进一步涉及如上定义的细胞或组合物，当意欲供兽使用时，细胞CU1的每日用量为1.10⁵CFU至1.10¹¹CFU，优选1.10⁷CFU至1.10¹⁰CFU。

术语CFU是指菌落形成单位。

本发明还涉及如上定义的用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的组合物，其特征在于所述组合物是食品组合物、膳食补充剂或药物组合物。

食品组合物是指任何食物、饮料或甜食。

食品组合物可以是，例如饮料、谷物棒、口香糖、乳制品例如发酵乳制品。

术语“膳食补充剂”是指其目的在于补充日常饮食的食物，其是具有营养效应或生理效应的营养物或其他物质(单独或组合)的浓缩来源。

膳食补充剂以剂量形式出售，这种形式是胶囊、锭剂、片剂、药丸和其他类似形式，粉包、充满液体的安瓿、带有滴管的小瓶和意欲以测定的小量单位服用的液体或粉末制剂的类似形式。

药物组合物进一步包含药学上可接收的载体。

本发明还涉及如上定义的用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的组合物，其特征在于所述组合物意欲口服或局部施用，优选口服施用。

因此，本发明涉及如上定义的用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的组合物，其特征在于所述组合物是胶囊、锭剂、药丸、片剂、软胶囊、粉末、悬浮液、液体溶液、颗粒、凝胶或霜剂的形式。

本发明还涉及如上定义的用于治疗和/或预防慢性炎症疾病的组合物，其特征在于它进一步包含另一种活性成分。

其他活性成分优选选自具有抗炎性活性、对免疫系统的免疫调节活性和/或镇痛活性的活性成分。

在一个有利的实施方案中，其他活性成分不是枯草芽孢杆菌，优选不是细菌菌株，更优选不是益生菌菌株。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含通过培养菌株CU1获得的细胞，不含任何其他细菌菌株。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含通过培养菌株CU1获得的细胞，不含任何其他酵母或细菌菌株。

在另一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含通过培养菌株CU1获得的细胞作为唯一的活性成分。

本发明还涉及治疗和/或预防患者的慢性炎症疾病的方法，包括向所述患者施用有效量的通过培养菌株CU1获得的细胞或包含所述细胞的组合物。

更具体地，本发明涉及治疗和/或预防患者的慢性炎症疾病的方法，包括向所述患者施用有效量的通过培养菌株CU1获得的细胞或包含所述细胞的组合物，其特征在于所述慢性炎症疾病是慢性炎症性风湿病。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防患者的类风湿性关节炎的方法，包括向所述患者施用有效量的通过培养菌株CU1获得的细胞或包含所述细胞的组合物。

现在，本发明将通过以下实施例和附图说明，其通过举例说明给出，而不以任何方式限制。

附图说明

图1：根据测试1在50天的研究中每组所有大鼠的累积临床评分。

图2：从第一次免疫至D+7，在测试2期间G2和G4组大鼠的平均临床评分的演变。

图3：根据测试2在43天的研究中每组所有大鼠的累积临床评分。

图4：根据测试3在50天的研究中每组所有大鼠的累积临床评分。

图5：根据测试2的各组中大鼠血清中的TNF-α(pg/ml)分析。

图6：根据测试3的各组中大鼠血清中的TNF-α(pg/ml)分析。

图7：根据测试2的各组中大鼠血清中的白细胞介素IL-17(pg/ml)分析。

图8：根据测试3的各组中大鼠血清中的白细胞介素IL-17(pg/ml)分析。

图9：在用乳酪分支杆菌(Mycobacterium butyricum)刺激人PBMC之后回收的各组上清液中的TNF-α(pg/ml)分析。

图10：在用乳酪分支杆菌刺激人PBMC之后回收的各组上清液中的白细胞介素1(pg/ml)分析。

图11：在用乳酪分支杆菌刺激人PBMC之后回收的各组上清液中的白细胞介素12(pg/ml)分析。

图12：在用乳酪分支杆菌刺激人PBMC之后回收的各组上清液中的白细胞介素10(pg/ml)分析。

具体实施方式

实施例1：枯槁芽孢杆菌CU1对大鼠中诱导的实验性关节炎模型的影响。

材料和方法

1-动物模型

使用六周大的Lewis雌鼠。通过施用作为佐剂的在油溶液中的乳酪分支杆菌(Mb)乳液来诱导关节炎。

所得模型比较忠实于人关节炎的临床症状：涉及关节的对称性、外周关节优先受影响、滑膜增生、炎性细胞渗透、边缘关节侵蚀和女性对该疾病有更高的敏感性。在炎症部位也发生原位免疫炎症级联。

乳酪分支杆菌(Difco，USA)以冻干形式购得，并通过加热灭活。随后以每毫升Vaseline、Tween 80和PBS缓冲液中180ng杀死的Mb的量乳化。

2-所用样品

待测试的枯草芽孢杆菌细胞CU1(下文称CU1)以孢子体的冻干形式使用。将细胞悬浮在生理盐水中用于测试，通过喂食向大鼠施用的每日剂量为5x 10⁹个细菌/天。

3-处理/方案

测试持续50天，并进行三次重复：前两次测试每批5只大鼠，第三次一批12只用CU1处理的大鼠，三次测试间隔时间进行。

计划：

–D0：将大鼠分为几个批次：

→第1组(G1):阴性对照，健康大鼠；

→第2组(G2):具有实验性关节炎的大鼠，不用CU1处理；

→第3组(G3):从D0开始并在整个研究期间通过喂食使健康大鼠接受每日剂量的CU1；

→第4组(G4):从D0开始并在整个研究期间通过喂食使具有实验性关节炎的大鼠接受每日剂量的CU1。

–D+7：通过在尾巴根部第一次皮内注射300μl灭活Mb乳液或54ng剂量的灭活Mb乳液免疫第G2和G4组的大鼠。

–D+14：在相同条件下第二次免疫第G2和G4组的大鼠。

炎症的临床评分

在诱导关节炎的大鼠中，第一个临床体征在D+23出现。大鼠很快在外周关节(主要是后爪)出现关节炎体征，其中在滑膜腔内有强烈炎症反应，导致受影响的关节附近瘫痪以及破坏性的骨组织侵蚀。如在很多病理模型中一样，动物体重明显降低。

炎性症状根据预先确定的临床评分“打分”并总结于表1。

表1

每日称重大鼠并评分。

组织学方案

将爪子在4％甲醛中固定，然后在脱钙缓冲液(Bayer Diagnostics,Puteau,France)中通过电泳脱钙3小时。然后，用石蜡浸渍爪子，用切片机获得组织学切片。

使用常规方案将5-mm切片染色。

各组所得的组织学切片用两种不同染料染色：

–用苏木精-曙红(HE)染色，其将胶原蛋白染成淡粉色，将肌肉染成深粉色，将嗜酸性细胞质染成红色，将嗜碱性细胞质染成紫色，将细胞核染成蓝色，将红细胞染成樱桃红色；

–用突出结缔组织的马洛里苯胺蓝或马洛里三重染剂(MA)染色：将胶原原纤维染成蓝色，将肌肉纤维染成红色，将弹性纤维染成粉色或黄色。

在光学显微镜下以x100和x400的放大倍率观察切片。

炎性细胞因子的分析方案

用eBioscience(San Diego,Ca,USA)提供的抗体试剂盒和标准以及供货商规定的方案(Rat IL-17A ELISA Ready-Set-Go；Rat TNF alpha ELISA Ready-Set-Go)通过ELISA进行细胞因子分析。

结果

1-炎性症状：炎症的临床评分

接受或没有接受益生菌菌株的健康大鼠(G1和G3)没有出现炎性症状；因此它们的临床评分是零，没有显示在曲线上。

测试1：

在用Mb第一次免疫后19天(D+26)，第G2组大鼠出现实验性关节炎。仅在第一次临床体征出现后10天(D+33)，它们的临床评分就变成平均3-4分。这个评分随后在整个研究期间保持稳定且高。

相反，接受细胞CU1的第4组大鼠没有出现炎性症状或比第2组出现得晚。此外，第4组的临床评分明显较低，受影响的爪子的严重程度和数量仍然低于第2组。

根据图1，观察到第2组大鼠的总累积评分达到426，而用CU1处理的第4组大鼠为231。因此，CU1将病理体征的重要性降低了46％。

测试2：

在用Mb第一次免疫后25天(D+32)，第2组大鼠出现实验性关节炎。仅在第一次临床体征发作后15天(D+38)，它们的临床评分就快速变成平均3分。这个评分随后在整个研究期间保持稳定且高。

接受细胞CU1的第4组大鼠也出现炎性症状，但较晚，在第28天(D+35)且明显少得多。在第一次免疫后的第33天(D+40)，症状减少，随后直到研究结束保持稳定。

尽管发炎，受影响爪子的严重程度和数量仍然低于第2组。

因此，可以观察到炎性症状的发作和严重程度的明显差异(图2)。

根据图3，可以观察到第2组大鼠的总累积评分达到176，而用CU1处理的第4组的4只大鼠为31。因此，CU1将病理体征的重要性降低了82％。

测试3：

第4组使用两组6只大鼠，称为a和b。

根据图4，观察到第2组和第4a/b组的累积评分之间有明显差异。第G2组的6只大鼠的总累积评分达到251，而用CU1处理的6只大鼠(G4a)为98，用CU1处理的6只大鼠(G4b)为80。因此，CU1将病理体征的重要性降低了61％(G4a)和68％(G4b)。

2-大鼠后爪的肉眼分析

通过肉眼观察不同组大鼠后爪的炎症存在进行肉眼分析。

第1组(没有进行任何处理)大鼠的爪子不显示炎症。第2组大鼠的爪子显示肉眼可见的明显炎症。第4组大鼠的爪子不显示炎性体征，或远低于第2组。

3-大鼠后爪的组织学分析

与第1组和第3组相比，HE染色的第2组切片显示关节组织的分界以及免疫细胞在关节处的强烈渗透。观察HE染色的第4组切片显示较少的免疫细胞渗透进入关节，和总体上关节组织较少改变。

MA染色的第2组切片显示结缔组织侵入关节间隙，在x400放大倍率下可见强烈渗透的白细胞、关节结构丧失和骨侵蚀。观察MA染色的第4组切片显示一些动物没有或几乎没有出现关节损伤，如果有病变，也比第2组的受影响动物中观察到的病变轻。因此，预防了血管翳形成、滑膜炎症、软骨的破坏和关节变形。

4-大鼠血清中的炎性细胞因子的分析

TNF-α的分析：

图5和图6分别说明测试2和测试3中各组大鼠的血清中TNF-α的分析结果。各动物的血清重复分析两次，然后显示对应组中所有动物的总体平均。

TNF-α的分析以pg/ml表示。

测试2：根据图5，第1组和第3组显示较低的TNF-α比率，接近200pg/ml。第2组大鼠的血清显示约2000pg/ml的TNF-α比率。第4组大鼠的血清显示约500pg/ml的TNF-α比率，比第2组少4倍。

测试3：根据图6，第1组显示约600pg/ml的TNF-α比率，第3组显示约1000pg/ml的TNF-α比率。观察到与第1组和第3组相比，第4组显示较低的TNF-α比率，约1400pg/ml，而第2组显示较高的TNF-α比率，约4400pg/ml，比第4组高三倍。

白细胞介素IL-17的分析：

图7和图8分别说明测试2和测试3中各组大鼠的血清中IL-17的分析结果。

IL-17的分析以pg/ml表示。

测试2：根据图7，第1组和第3组的大鼠IL-17平均比率较低，接近试剂盒的检测极限(50pg/ml)。可以观察到第2组的IL-17平均比率较高，约625pg/ml，而第4组的IL-17平均比率较低，约100pg/ml。

测试3：根据图8，第1组和第3组的大鼠IL-17平均比率较低，接近试剂盒的检测极限(50pg/ml)。可以观察到第2组的IL-17平均比率较高，超过2000pg/ml，而第4组的两批中IL-17平均比率较低，接近试剂盒的检测极限。

结论

采用的关节炎诱导模型表明，CU1能够预防疾病的诱导，或非常显著地降低其效果。

一方面，肉眼可以观察到大鼠爪子没有炎症或具有较低的炎症评分。因此，施用CU1降低了这种病理体征的重要性。

另一方面，大鼠爪子的组织学分析表明与没有用CU1处理的大鼠(G2)相比，用CU1处理的关节炎大鼠(G4)显示很不明显的关节损伤，很少的骨侵蚀，以及渗透进入关节的免疫细胞降低或消失。

此外，向关节炎大鼠(G4)施用CU1引起促炎性细胞因子(TNF-α和IL-17)的明显降低。

实施例2：枯槁芽孢杆菌CU1对用乳酪分支杆菌刺激的从健康供体的血液提取的人免疫细胞(PBMC)的影响。

材料和方法

1-所用动物模型

在该实施例中使用PBMC(外周血单核细胞)作为模型。

从4个健康志愿者供体获得血液，提前检测没有HIV感染或肝炎(EFS Aquitaine,Bordeaux Blood Bank)。通过在Ficoll^TM梯度中离心分离PBMC。洗涤后，在完全RPMI基质中以1×10⁶个PBMC/ml的浓度重新悬浮细胞。

将它们与乳酪分支杆菌(Mb)(Difco,USA)接触以诱导炎症反应。

通过在PBS缓冲液中稀释实施例1中的冻干物来制备Mb原液，在PBS中的浓度为1mg/ml。然后，在显微镜下用Malassez细胞计数原液中的Mb细胞数，从而在PBMC刺激过程中使用比例为10的Mb和免疫细胞(MOI 10:1)。术语MOI是指感染复数。

2-所用样品

使用孢子体(CUsp)或繁殖体(CUv)的待测试的枯草芽孢杆菌细胞CU1(下文称CU1)。使用无菌生理盐水中2x 10⁸CFU/ml的工作溶液。

3-刺激PBMC

通过以每个免疫细胞10个细菌的比例共培养PBMC和CU1菌株进行刺激实验。对于PBMC刺激的细胞因子生产，使用脂多醣(LPS)作为阳性对照。

所有实验重复进行三次。将接触18小时后收集的培养上清液离心，并储存于-80℃直到细胞因子分析(IL-1、TNF-α、IL-12和IL-10)。

4-制备各个测试组：

–第1组(G1)：只存在PBMC；

–第2组(G2)：将PBMC与孢子体的CU1接触；

–第3组(G3)：将PBMC与繁殖体的CU1接触；

–第4组(G4)：将PBMC与Mb接触；

–第5组(G5)：将PBMC与孢子体的CU1和Mb接触；

–第6组(G6)：将PBMC与繁殖体的CU1和Mb接触；

–第7组(G7)：在加入Mb之前，将PBMC与孢子体的CU1预孵育1小时；

–第8组(G8)：在加入Mb之前，将PBMC与繁殖体的CU1预孵育1小时。

用eBioscience(San Diego,Ca,USA)提供的试剂盒、抗体和标准以及供货商规定的方案通过ELISA进行细胞因子分析。

结果

1-TNF-α的分析：

图9示出了从以上各组的PBMC中回收的上清液中TNF-α的分析(pg/ml)。

在第4组中观察到的TNF-α比率约为2000pg/ml，而在与CU1接触的组(G5和G6)中，TNF-α的量减半。此外，观察到在加入Mb之前1小时与CU1预孵育(G7和G8)，当CU1是孢子体(G7)时最有效，其将TNF-α比率降低至约500pg/ml(少4倍)。

2-白细胞介素IL-1的分析：

图10示出了从以上各组的PBMC中回收的上清液中IL-1的分析(pg/ml)。

在第4组中观察到的IL-1比率在1250pg/ml范围内，而在第5组中该比率为约400pg/ml(少三倍)，与第6组相同。在加入Mb之前用CU1预孵育的情况下(G7和G8)，没有观察到提高。

3-白细胞介素IL-12的分析：

图11示出了从以上各组的PBMC中回收的上清液中IL-12的分析(pg/ml)。

在第4组中观察到的IL-12比率为约32pg/ml，而在于CU1接触的第5组和第6组中观察到IL-12显著降低，少于12pg/ml。此外，观察到与第5组和第6组相比，加入Mb之前用CU1预孵育(G7和G8)进一步降低IL-12。

4-白细胞介素IL-10的分析：

图12示出了从上述各组的PBMC中回收的上清液中抗炎性细胞因子IL-10的分析(pg/ml)。

在Mb组中观察到的IL-10为约55pg/ml，而在与CU1接触的第5组和第6组中观察到该抗炎性细胞因子的生产增加至约120pg/ml(2倍多)。此外，观察到加入Mb之前用CU1预孵育(G7和G8)似乎没有效果，因为IL-10比率(75-95pg/ml)低于第5组和第6组。

结论

所得结果表明，施用枯草芽孢杆菌细胞CU1总体上降低了促炎性细胞因子的生产并增加了抗炎性细胞因子IL-10的生产。

Claims (12)

1.以保藏号I-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株CU1在制备用于治疗和/或预防类风湿性关节炎的药物中的用途。

2.通过培养以保藏号I-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1获得的细胞在制备用于治疗和/或预防类风湿性关节炎的药物中的用途。

3.权利要求2所述的用途，其中所述细胞是芽孢体和/或繁殖体。

4.权利要求2所述的用途，其中所述细胞是干燥形式。

5.组合物在制备用于治疗和/或预防类风湿性关节炎的药物中的用途，其中所述组合物包含通过培养以保藏号I-2745于2001年10月25日保藏于CNCM的枯草芽孢杆菌菌株CU1获得的细胞。

6.权利要求5所述的用途，其中所述组合物是食品组合物、膳食补充剂或药物组合物。

7.权利要求5所述的用途，其中所述组合物用于口服或局部施用。

8.权利要求5所述的用途，其中所述组合物是胶囊、药丸、锭剂、片剂、粉末、液体溶液、颗粒、凝胶或霜剂的形式。

9.权利要求5所述的用途，其中所述组合物是软胶囊或悬浮液的形式。

10.权利要求5所述的用途，其中所述组合物进一步包含另一种活性成分。

11.权利要求5所述的用途，其中所述细胞是芽孢体和/或繁殖体。

12.权利要求5所述的用途，其中所述细胞是干燥形式。

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