CN104546944B - 乳酸乳球菌在治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病中的应用 - Google Patents
乳酸乳球菌在治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了乳酸乳球菌在治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病中的用途，还提供了包含乳酸乳球菌的药物组合物、药物、食品和饲料。通过给动物提供乳酸乳球菌，能够有效发挥抗炎的功效，关节发红和肿胀的症状得到有效改善，关节炎症状明显减轻，能够有效用于治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病。
Description
技术领域
本发明涉及微生物学领域，具体地，涉及乳酸乳球菌在治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病中的用途，也涉及包含乳酸乳球菌的药物组合物、药物、食品和饲料。
背景技术
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)简称类风湿，是一种全身性自身免疫性疾病，主要累及关节滑膜，其次为浆膜、心、肺、血管、神经等结缔组织。急性期炎症主要表现为滑膜血管水肿、滑膜炎，若未被及时诊断和治疗，急性炎症反应消退，渗出逐渐吸收，滑膜中血管翳形成，滑膜细胞显著增生。继而引起关节软骨破坏，骨组织炎症、坏死和纤维结缔组织增生。而后发生钙化出现纤维性和骨性关节硬化，关节腔显著狭窄或完全消失。此期慢性炎症过程造成的关节功能障碍，在很大程度上难以恢复，可致永久性残疾。全世界每100～150人中就有1人患有RA，我国患病率为0.32％～0.36％。RA在各年龄皆可发病，成人中多发于中年女性，男女之比约1:3。2003年据WHO报道，在良好的医疗条件下，每人每年的治疗费用约为6000美元，由该病造成的间接损失也不容忽视。
目前，西医主要采用药物治疗和基因治疗等方法。常用西药主要有非甾体抗炎药(NSAIDs)、糖皮质激素、慢作用药、免疫抑制剂及生物制剂等。但西药普遍具有价格高、毒副作用较大的缺点，所以限制了它们的应用。基因治疗的选择性高，其可针对疾病从分子水平进行治疗，同时可以通过限制基因的长期高水平局部表达，为RA患者的治疗开辟了新的途径。但是，目前基因治疗还处于起步阶段，仍存在较多的问题。如缺乏理想的载体、不同的宿主对载体产生不同的免疫反应、导入的基因在机体内是否能稳定表达等都还有待进一步研究探讨。此外，基因治疗的安全性、治疗费用及伦理学问题等也是此项研究需要解决的问题。
已有证据表明，肠道微生物与系统免疫应答和RA存在一定的联系。乳酸菌(lacticacid bacteria，LAB)可以在不影响调控细胞活素水平的前提下降低促炎细胞活素水平，从而发挥抗炎作用，减轻RA症状。因此可以推测，一些使肠道微生态恢复常态的治疗手段，在恢复肠道及免疫系统功能的同时，可能也会对减轻RA症状发挥一定的作用。研究证实，一种LAB(Bacillus coagulans GBI-30,6086)可能成为一种安全高效的减轻RA症状的辅助药物
由于病因与发病机制尚未完全明了，RA的治疗虽取得一定进展，但至今仍处于控制或缓解症状阶段，并无有效治疗或治愈方法。因此本领域迫切需要开发一种有效的新的，无毒副作用的，用于治疗和预防类风湿性关节炎及其相关疾病的药物。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出乳酸乳球菌在治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病中的用途。
在本发明的第一方面，本发明提供了乳酸乳球菌在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病。发明人发现，通过给动物提供该药物，能够有效发挥抗炎的功效，关节发红和肿胀的症状得到有效改善，关节炎症状明显减轻，即能够有效治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为Lactococcus lactis。由此，能够有效发挥治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的功效。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为选自Lactococcus lactissubsp.lactis ATCC 19435、Lactococcus lactis subsp.lactis KF147和Lactococcuslactis subsp.lactis CV56中的至少一种。由此，治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的效果较佳。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包括：乳酸乳球菌；以及药学上可接受的辅料。发明人惊喜地发现，通过对动物提供该药物组合物，能够明显抑制关节炎的发生，关节发红和肿胀明显减退，关节炎症状明显减轻，动物行动灵活，表明该药物组合物能够有效治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为Lactococcus lactis。由此，能够有效发挥治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的功效。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为选自Lactococcus lactissubsp.lactis ATCC 19435、Lactococcus lactis subsp.lactis KF147和Lactococcuslactis subsp.lactis CV56中的至少一种。由此，治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的效果较佳。
根据本发明的实施例，当所述药物组合物呈固态时，所述药物组合物包含1×10-1×1020cfu/g的所述乳酸乳球菌，当所述药物组合物呈液态时，所述药物组合物包含1×10-1×1020cfu/mL的所述乳酸乳球菌。由此，抑制关节炎发生和改善关节炎症状的效果明显，如果乳酸乳球菌含量过低，治疗或预防类风湿性关节炎的效果不理想，如果乳酸乳球菌含量过高，则治疗或预防类风湿性关节炎的的效果无明显提高，造成浪费。
根据本发明的一个优选实施例，当所述药物组合物呈固态时，所述药物组合物包含1×104-1×1015cfu/g的所述乳酸乳球菌，当所述药物组合物呈液态时，所述药物组合物包含1×104-1×1015cfu/mL的所述乳酸乳球菌。
根据本发明的另一个优选实施例，当所述药物组合物呈固态时，所述药物组合物包含1×106-1×1011cfu/g，的所述乳酸乳球菌，当所述药物组合物呈液态时，所述药物组合物包含1×106-1×1011cfu/mL的所述乳酸乳球菌。
根据本发明的实施例，所述药学上可接受的辅料为选自载体、赋形剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂以及香料中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述药学上可接受的辅料为选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油中的至少一种。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种药物。根据本发明的实施例，该药物包括：前面所述的药物组合物。通过对动物提供该药物，能够明显抑制关节炎的发生，关节发红和肿胀明显减退，关节炎症状明显减轻，动物行动灵活，表明该药物能够有效治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病。
根据本发明的实施例，所述药物呈选自颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液和乳剂中的至少一种制剂形式。由此，易于进行给药。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种食品。根据本发明的实施例，该食品包括：乳酸乳球菌；以及食品学上可接受的辅料。发明人发现，通过对动物提供该食品，能够明显抑制关节炎的发生，关节发红和肿胀明显减退，关节炎症状明显减轻，动物行动灵活，表明该食品能够有效治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病。
需要说明的是，本发明所使用的术语“食品”的种类不受特别限制，可以为任何已知的食品，包括但不限于奶制品、饼干、糕点、饮料、保健品等。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为Lactococcus lactis。由此，能够有效发挥治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的功效。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为选自Lactococcus lactissubsp.lactis ATCC 19435、Lactococcus lactis subsp.lactis KF147和Lactococcuslactis subsp.lactis CV56中的至少一种。由此，治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的效果较佳。
根据本发明的实施例，当所述食品呈固态时，所述食品包含1×10-1×1020cfu/g的所述乳酸乳球菌，当所述食品呈液态时，所述食品包含1×10-1×1020cfu/mL的所述乳酸乳球菌。由此，抑制关节炎发生和改善关节炎症状的效果明显，如果乳酸乳球菌含量过低，治疗或预防类风湿性关节炎的效果不理想，如果乳酸乳球菌含量过高，则治疗或预防类风湿性关节炎的的效果无明显提高，造成浪费。
根据本发明的一个优选实施例，当所述食品呈固态时，所述食品包含1×104-1×1015cfu/g的所述乳酸乳球菌，当所述食品呈液态时，所述食品包含1×104-1×1015cfu/mL的所述乳酸乳球菌。
根据本发明的另一个优选实施例，当所述食品呈固态时，所述食品包含1×106-1×1011cfu/g，的所述乳酸乳球菌，当所述食品呈液态时，所述食品包含1×106-1×1011cfu/mL的所述乳酸乳球菌。
根据本发明的实施例，所述食品学上可接受的辅料为选自载体、赋形剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂以及香料中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述食品学上可接受的辅料为选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述食品呈选自固体、乳品、溶液制品、粉末制品和悬浮液制品中的至少一种制剂形式。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种饲料。根据本发明的实施例，该饲料包括：乳酸乳球菌。发明人发现，通过对动物提供该饲料，能够明显抑制关节炎的发生，动物关节发红和肿胀明显减退，关节炎症状明显减轻，动物行动灵活，表明该饲料能够有效治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为Lactococcus lactis。由此，能够有效发挥治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的功效。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为选自Lactococcus lactissubsp.lactis ATCC 19435、Lactococcus lactis subsp.lactis KF147和Lactococcuslactis subsp.lactis CV56中的至少一种。由此，治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的效果较佳。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了根据本发明一个实施例，菌剂1、菌剂2和菌剂3对小鼠关节炎发病的影响宏观评分结果；
图2显示了根据本发明一个实施例，菌剂1、菌剂2和菌剂3对关节炎小鼠脾细胞体外增殖的影响结果；以及
图3显示了根据本发明一个实施例，菌剂1、菌剂2和菌剂3对关节炎小鼠细胞因子的影响结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照《微生物：实验手册》(James Cappuccino 和NatalieSherman编，Pearson Education出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
在本发明的第一方面，本发明提供了乳酸乳球菌在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病。发明人发现，通过给动物提供该药物，能够有效发挥抗炎的功效，关节发红和肿胀的症状得到有效改善，关节炎症状明显减轻，即能够有效治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病。
需要说明的是，本文中所使用的术语“动物”不受特别限制，可以为任何具有肠道的动物，优选哺乳动物，更优选人、兔类或鼠类。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为Lactococcus lactis。由此，能够有效发挥治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的功效。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为选自Lactococcus lactissubsp.lactis ATCC 19435、Lactococcus lactis subsp.lactis KF147和Lactococcuslactis subsp.lactis CV56中的至少一种。由此，治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的效果较佳。
根据本发明的实施例，受试动物经过造模形成关节炎模型动物，模型动物摄入Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC 19435、Lactococcus lactis subsp.lactisKF147和Lactococcus lactis subsp.lactis CV56，均能够明显改善动物关节发红和肿胀状况，减轻关节炎症状。根据本发明的实施例，分别经菌株Lactococcus lactissubsp.lactis ATCC 19435、Lactococcus lactis subsp.lactis KF147和Lactococcuslactis subsp.lactis CV56来治疗的关节炎DBA/1J小鼠，与未接受治疗的对照组相比，关节发红和肿胀明显消退，关节炎症状明显减轻。由此，表明所述菌株能够用以预防和治疗类风湿性关节炎或其相关疾病。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包括：乳酸乳球菌；以及药学上可接受的辅料。发明人惊喜地发现，通过对动物提供该药物组合物，能够明显抑制关节炎的发生，关节发红和肿胀明显减退，关节炎症状明显减轻，动物行动灵活，表明该药物组合物能够有效治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为Lactococcus lactis。由此，能够有效发挥治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的功效。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为选自Lactococcus lactissubsp.lactis ATCC 19435、Lactococcus lactis subsp.lactis KF147和Lactococcuslactis subsp.lactis CV56中的至少一种。由此，治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的效果较佳。
根据本发明的实施例，当所述药物组合物呈固态时，所述药物组合物包含1×10-1×1020cfu/g的所述乳酸乳球菌，当所述药物组合物呈液态时，所述药物组合物包含1×10-1×1020cfu/mL的所述乳酸乳球菌。由此，抑制关节炎发生和改善关节炎症状的效果明显，如果乳酸乳球菌含量过低，治疗或预防类风湿性关节炎的效果不理想，如果乳酸乳球菌含量过高，则治疗或预防类风湿性关节炎的的效果无明显提高，造成浪费。
根据本发明的一个优选实施例，当所述药物组合物呈固态时，所述药物组合物包含1×104-1×1015cfu/g的所述乳酸乳球菌，当所述药物组合物呈液态时，所述药物组合物包含1×104-1×1015cfu/mL的所述乳酸乳球菌。
根据本发明的另一个优选实施例，当所述药物组合物呈固态时，所述药物组合物包含1×106-1×1011cfu/g，的所述乳酸乳球菌，当所述药物组合物呈液态时，所述药物组合物包含1×106-1×1011cfu/mL的所述乳酸乳球菌。
根据本发明的实施例，所述药学上可接受的辅料为选自载体、赋形剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂以及香料中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述药学上可接受的辅料为选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油中的至少一种。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种药物。根据本发明的实施例，该药物包括：前面所述的药物组合物。通过对动物提供该药物，能够明显抑制关节炎的发生，关节发红和肿胀明显减退，关节炎症状明显减轻，动物行动灵活，表明该药物能够有效治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病。
根据本发明的实施例，所述药物呈选自颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液和乳剂中的至少一种制剂形式。由此，易于进行给药。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种食品。根据本发明的实施例，该食品包括：乳酸乳球菌；以及食品学上可接受的辅料。发明人发现，通过对动物提供该食品，能够明显抑制关节炎的发生，关节发红和肿胀明显减退，关节炎症状明显减轻，动物行动灵活，表明该食品能够有效治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病。
需要说明的是，本发明所使用的术语“食品”的种类不受特别限制，可以为任何公知的食品，包括但不限于奶制品、饼干、糕点、饮料、保健品等。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为Lactococcus lactis。由此，能够有效发挥治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的功效。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为选自Lactococcus lactissubsp.lactis ATCC 19435、Lactococcus lactis subsp.lactis KF147和Lactococcuslactis subsp.lactis CV56中的至少一种。由此，治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的效果较佳。
根据本发明的实施例，当所述食品呈固态时，所述食品包含1×10-1×1020cfu/g的所述乳酸乳球菌，当所述食品呈液态时，所述食品包含1×10-1×1020cfu/mL的所述乳酸乳球菌。由此，抑制关节炎发生和改善关节炎症状的效果明显，如果乳酸乳球菌含量过低，治疗或预防类风湿性关节炎的效果不理想，如果乳酸乳球菌含量过高，则治疗或预防类风湿性关节炎的的效果无明显提高，造成浪费。
根据本发明的一个优选实施例，当所述食品呈固态时，所述食品包含1×104-1×1015cfu/g的所述乳酸乳球菌，当所述食品呈液态时，所述食品包含1×104-1×1015cfu/mL的所述乳酸乳球菌。
根据本发明的另一个优选实施例，当所述食品呈固态时，所述食品包含1×106-1×1011cfu/g，的所述乳酸乳球菌，当所述食品呈液态时，所述食品包含1×106-1×1011cfu/mL的所述乳酸乳球菌。
根据本发明的实施例，所述食品学上可接受的辅料为选自载体、赋形剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂以及香料中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述食品学上可接受的辅料为选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述食品呈选自固体、乳品、溶液制品、粉末制品和悬浮液制品中的至少一种制剂形式。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种饲料。根据本发明的实施例，该饲料包括：乳酸乳球菌。发明人发现，通过对动物提供该饲料，能够明显抑制关节炎的发生，动物关节发红和肿胀明显减退，关节炎症状明显减轻，动物行动灵活，表明该饲料能够有效治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为Lactococcus lactis。由此，能够有效发挥治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的功效。
根据本发明的实施例，所述乳酸乳球菌为选自Lactococcus lactissubsp.lactis ATCC 19435、Lactococcus lactis subsp.lactis KF147和Lactococcuslactis subsp.lactis CV56中的至少一种。由此，治疗或预防类风湿性关节炎或其相关疾病的效果较佳。
根据本发明的实施例，当所述饲料呈固态时，所述饲料包含1×10-1×1020cfu/g的所述乳酸乳球菌，当所述饲料呈液态时，所述饲料包含1×10-1×1020cfu/mL的所述乳酸乳球菌。由此，抑制关节炎发生和改善关节炎症状的效果明显，如果乳酸乳球菌含量过低，治疗或预防类风湿性关节炎的效果不理想，如果乳酸乳球菌含量过高，则治疗或预防类风湿性关节炎的的效果无明显提高，造成浪费。
根据本发明的一个优选实施例，当所述饲料呈固态时，所述饲料包含1×104-1×1015cfu/g的所述乳酸乳球菌，当所述饲料呈液态时，所述饲料包含1×104-1×1015cfu/mL的所述乳酸乳球菌。
根据本发明的另一个优选实施例，当所述饲料呈固态时，所述饲料包含1×106-1×1011cfu/g，的所述乳酸乳球菌，当所述饲料呈液态时，所述饲料包含1×106-1×1011cfu/mL的所述乳酸乳球菌。
实施例1确定治疗或预防类风湿性关节炎的有益菌
1.1样品收集和DNA提取
从北京协和医院共采集到212个志愿者的粪便、牙垢及唾液样品，样品信息见表1，其中，分为训练组和试验组。训练组包括157个志愿者，其中77个为没有治疗过的RA病例，80个为健康者(对照)。试验组中，其中34个志愿者形成17个“病例-健康”对，其中有8对有血缘关系，另外9对没有血缘关系；其他21个志愿者为DMARD(disease-modifyingantirheumatic drugs)治疗RA病例。
采集粪便样品后冷冻运输并迅速转移到-80℃保存，进行DNA提取(参考Qin,J.etal.A metagenome-wide association study of gut microbiota in type2diabetes.Nature 490,55–60(2012))。采集牙垢样品时，利用医用钳从牙齿表面刮取3μl的牙垢，转移至200μl 1x裂解缓冲液(10mM Tris,1mM EDTA，0.5％吐温20，200μg/ml蛋白酶K)中，在55℃培养2小时，然后在95℃培养10分钟，终止裂解反应，最后于-80℃保存。采集唾液样品时，取100μl样品至含100μl 2x裂解缓冲液的收集管中，同时，刮取后咽表面样品也加至该管中，后续裂解步骤与牙垢样品相同，同样于-80℃保存。牙垢样品和唾液样品经冷冻运输至深圳华大基因研究院，参照粪便样品进行DNA提取。
当志愿者首次入院时，按照标准程序收集表型信息。21个DMARD治疗病例的粪便样品仅包含在用来构建肠道微生物基因集的212个粪便样品之中，在本文不再进行分析。本研究得到北京协和医院和深圳华大基因研究院伦理审查委员会批准。
表1样品信息
1.2宏基因组测序与组装
利用所提取的DNA样本构建测序文库，在Illumina测序平台上进行双向(Paired-end)宏基因组测序(插入片段350bp，读长100bp)。对测序产生的数据进行过滤(quality-controlled，去除adapter污染序列、去低质量序列和去宿主基因组污染序列)，并利用SOAPdenovo软件(v2.04)进行重头组装。
粪便、牙垢和唾液样品的平均宿主基因组污染分别是0.37％、5.55％和40.85％。
1.3基因集构建
对于组装好的组装片段(contigs)，利用GeneMark软件(v2.7d)进行基因预测，接着利用BLAT软件进行去冗余(比对相似度(identity)在95％以上，比对的覆盖度(overlap)在90％以上，没有缺口(gaps))，对于212个粪便样品(其中包括21个DMARD治疗样品)，得到了包含3,800,011个基因的非冗余基因集；对于203个口腔样品(包括105个牙垢样品和98唾液样品)，得到了包含3,234,997个基因的非冗余基因集。利用BLAT软件将粪便样品基因集进一步补充到已公开的包含430多万个基因的肠道微生物参考基因集中(比对相似度在95％以上，比对覆盖度在90％以上，参考上述文献Qin,J.et al.2012)，最终得到了包含590多万个基因的新基因集。
将高质量测序片段(reads)与肠道或口腔参考基因集进行比对，从而得到基因的相对丰度(参考上述文献Qin,J.et al.2012)。
1.4物种分类注释与丰度计算
通过与IMG(v400)数据库进行比对，对预测的基因进行物种分类(参考上述文献Qin,J.et al.2012)，分别得到门水平的物种分类(比对相似度在65％以上，比对覆盖度在70％以上)，属水平的物种分类(比对相似度在85％以上)及种水平的物种分类(比对相似度在95％以上)。利用基因的相对丰度计算该物种的相对丰度(参考上述文献Qin,J.etal.2012)，并用秩和检验(Wilcoxon rank-sum test)进行统计检验(p<0.05)，确定病例与对照之间的相对丰度存在显著差异的物种。
1.5宏基因组关联分析
通过比较病例与对照的粪便微生物基因集(microbiome)，在3,110,085个基因(每个基因都至少出现在6个样品中，样品n＝157，不含表1所述21个DMARD治疗病例)中，发现83,858个基因的相对丰度具有显著差异(p<0.01,秩和检验，FDR＝0.3285)，这些基因即为标记基因。根据这些标记基因在样品中的相对丰度差异，进一步聚类，得到粪便的宏基因组连锁群(Metagenomic Linkage Group，MLG，一个MLG近似于一个物种，聚类方法参考上述文献Qin,J.et al.2012)。同样的方法，从牙垢的2,247,835个基因(每个基因都至少出现在6个样品中，样品n＝105)中，筛选出209,820个标记基因(p<0.01,秩和检验，FDR＝0.072)，聚类，得到牙垢的MLG。从唾液的2,404,726个基因(每个基因都至少出现在6个样品中，样品n＝98)中，筛选出206,399个标记基因(p<0.01,秩和检验，FDR＝0.088)，聚类，得到唾液MLG。另外，通过比较DMARD治疗前后的粪便微生物基因，从1,538,688个基因(每个基因都至少出现在6个样品中，样品n＝64)中，筛选出86158个标记基因(p<0.05,paired Wilcoxon rank-sum test,FDR＝0.912)，聚类到DMARD治疗病例的粪便MLGs中。
根据MLGs组成基因的分类及相对丰度，进行MLGs物种分类和构建MLGs相对丰度谱(参考上述文献Qin,J.et al.2012)。若要分类到种的水平，需要满足MLGs中90％的基因可以比对到该物种的基因组上(比对相似度在95％以上，比对覆盖度在70％以上)。若要分类到属水平，则需要MLGs中80％的基因，无论是在DNA序列还是蛋白质序列，与该属的相似度都要高于80％。根据所有样品丰度之间的Kendall’s相关性(regardless of case-controlstatus)，可以将MLGs进行进一步地聚类。肠道MLG、唾液MLG、牙垢MLG和DMARD治疗相关MLG的物种分类结果分别见表2、表3、表4、表5。
表2肠道MLG的物种分类信息
表3唾液MLG的物种分类信息
表4牙垢MLG的物种分类信息
表5DMARD治疗相关MLG的物种分类信息
实施例2动物实验验证
为了验证实施例1在表2、表3、表4、表5确定治疗或预防类风湿性关节炎的有益菌，发明人对每个菌种进行动物实验，利用该菌种可获得的菌株验证其功效。
实验方法
1.造模及给药
6～8周龄SPF(Specific pathogen free)级雄性DBA/1J小鼠，购于中国科学院上海实验动物中心，饲养于IVC(individual ventilated cage)鼠笼系统(购自苏州冯氏实验动物设备有限公司)，室内保持温度22～24℃，湿度40％～60％，每日光照12h，自由进食及饮水。适应性饲养2周后随机分为5组(模型对照组、菌剂1组、菌剂2组、菌剂3组、正常对照组)，每组12只。Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC 19435(菌剂1)购自ATCC(American Type Culture Collection)；Lactococcus lactis subsp.lactis KF147(菌剂2)来源于新西兰北帕默斯屯研究中心园艺与食品研究所(Horticulture and FoodResearch Institute,Palmerston North Research Centre,Palmerston North,NewZealand)；Lactococcus lactis subsp.lactis CV56(菌剂3)来源于中科院微生物研究所微生物资源国家重点实验室(State Key Laboratory of Microbial Resources,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences)。于脑心浸液培养液(ATCCMedium 44)中，37℃培养过夜，经16S rDNA测序鉴定无误后开始实验。菌株信息见表6。
表6菌株信息
| 编号 | 菌种名 |
| 菌剂1 | Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC 19435 |
| 菌剂2 | Lactococcus lactis subsp.lactis KF147 |
| 菌剂3 | Lactococcus lactis subsp.lactis CV56 |
参考S.Yoshino的方法(S.Yoshino,E.Sasatomi,M.Ohsawa,Bacteriallipopolysaccharide acts as an adjuvant to induce autoimmune arthritis inmice,2000)的造模方法，简言之：
自实验第1天起，菌剂1组(菌剂1+CIA/LPS)、菌剂2组(菌剂2+CIA/LPS)、菌剂3组(菌剂3+CIA/LPS)分别以500μl/50g.BW剂量，灌胃菌1、菌2、菌3新鲜培养液(109-1010cfu/ml)，模型对照组(M+CIA/LPS)和正常对照组(M+AA+PBS)分别灌胃等体积无菌培养液，隔天给药28天。在第1天、第21天，利用II型胶原(CIA)结合脂多糖(LPS)诱导3个模型组(菌剂1组、菌剂2组及菌剂3组)及模型对照组小鼠关节炎的发生。具体操作为：将100mg II型胶原蛋白(取自小牛关节软骨,Funakoshi Co)溶于100ml 5mM乙酸(AA)，4℃搅拌过夜，腹腔注射小鼠。随后取E.coli 011:B4的脂多糖(上海生物制品研究所)1μg，溶于0.1ml磷酸缓冲液(PBS)，同样经腹腔注射给药。正常对照组在相同时间点经同体积的5mM乙酸及PBS缓冲液腹腔注射。每天观察小鼠足爪状态，每周对关节炎指数进行评分。于实验开始后35天，每组随机选取6只处死，取脾脏细胞进行后续实验。剩余小鼠继续观察关节炎病程进展情况并在实验开始后50天颈椎脱臼处死。
2.关节炎评价
利用肉眼根据红斑的增加以及关节周围组织水肿情况对关节炎的严重程度进行宏观评分得到关节炎指数，具体评分标准描述如下：0：没有关节炎的迹象；1：1个关节肿胀和/或发红；2：2个关节肿胀和/或发红；3：大于2个关节肿胀和/或发红；4：整个足爪发生严重关节炎症。每只小鼠关节炎指数为每只动物4爪得分之和。
3.菌剂1、菌剂2和菌剂3对胶原诱导的关节炎小鼠脾细胞体外增殖的影响
随机选取模型组(菌剂1组、菌剂2组及菌剂3组)、模型对照组和正常对照组每组各6只小鼠，常规分离脾细胞。后续操作参考赵晓辉等的方法(塞隆骨提取物对牛II型胶原诱导的小鼠关节炎的治疗作用及机制研究，赵晓辉，岳会兰，梅丽娟，邵赞，陶燕铎，2008年5月)：用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液将细胞浓度调成4×106cell/ml。于96孔板中每孔加入100μl细胞悬液，100μl胶原蛋白抗原。细胞于含5％CO2的37℃培养箱中培养，培养结束前8h每孔加入25μl 3H-胸腺嘧啶核苷酸。继续培养至实验结束。用细胞收集仪将细胞收集至玻璃纤维膜上，加入闪烁液后于β计数仪上读取细胞DNA中3H-胸腺嘧啶核苷酸量，以每分钟脉冲数(counts per minute，cpm)表示细胞增殖情况。
4.菌剂1、菌剂2和菌剂3对关节炎小鼠炎性细胞因子的影响
常规方法分离脾细胞，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液将细胞浓度调成4×106cell/ml，以脾细胞悬液1ml/孔接种于24孔组织培养板中，其中含1mM谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素，5×10-5M 2-巯基乙醇及1％热灭活自体血清。48h后，收集上清液于-70℃保存，利用ELISA试剂盒(购于上海酶联生物科技有限公司)检测其中细胞因子IL-12，IFN-γ，TNF-α和IL-10水平。
实验结果
1.菌剂1、菌剂2和菌剂3对小鼠关节炎发病的影响。
菌剂1、菌剂2和菌剂3对小鼠关节炎发病的影响的宏观评分结果见表7和图1。由实验结果可知，菌剂1、菌剂2和菌剂3给药4周后，相比模型对照组，能够明显抑制CIA小鼠关节炎的发生，小鼠足肿胀明显减退，关节炎症状明显减轻，小鼠行动较灵活。
表7菌剂1、菌剂2和菌剂3对小鼠关节炎发病的影响结果(每组6只小鼠)
2.菌剂1、菌剂2和菌剂3对关节炎小鼠脾细胞体外增殖的影响
菌剂1、菌剂2和菌剂3对关节炎小鼠脾细胞体外增殖的影响结果见表8和图2，其中，用相同字母标注表示两组间数值经Tukey’s Test检测差异不显著(p>0.05)。由试验结果可知，通过灌服菌剂1、菌剂2和菌剂3，在加抗原的情况下，关节炎小鼠脾细胞体外经抗原刺激后的增殖反应与模型对照组相比明显降低，在不加抗原的条件下，各模型组也显示了不同程度的脾细胞增殖抑制作用。
表8菌剂1、菌剂2和菌剂3对关节炎小鼠脾细胞体外增殖的影响(每组6只小鼠)
3.菌剂1、菌剂2和菌剂3对关节炎小鼠细胞因子的影响
菌剂1、菌剂2和菌剂3对关节炎小鼠细胞因子的影响结果见表9和图3，其中，相同字母标注表示两组间数值经Tukey’s Test检测差异不显著(p>0.05)。由实验结果可知，通过ELISA检测可以发现，与正常对照组比较，3个模型组小鼠细胞抑炎因子IL-10分泌显著减少(p<0.05)，炎症因子IL-12、TNF-α和IFN-γ分泌显著增多(p<0.05)；与模型对照组比较，模型组小鼠细胞IL-10分泌显著增多(p<0.05)，IL-12、IFN-γ、TNF-α分泌显著减少(p<0.05)，且3个模型组之间无显著差异(p>0.05)。说明菌剂1、菌剂2和菌剂3灌胃能够抑制脾细胞培养上清中炎症因子IL-12、IFN-γ、TNF-α的分泌，并提高抑炎因子IL-10的分泌，显示菌剂1、菌剂2和菌剂3对关节炎小鼠脾细胞免疫功能亢进有明显抑制作用。
表9菌剂1、菌剂2和菌剂3对关节炎小鼠细胞因子的影响(每组6只小鼠)
结论
上述结果表明，在CIA小鼠类风湿性关节炎模型上，菌剂1、菌剂2和菌剂3能够明显抑制小鼠关节炎的发病，减轻CIA小鼠的相关症状，显示出较好的抗炎作用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.乳酸乳球菌在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防类风湿性关节炎，
所述乳酸乳球菌选自Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC 19435、Lactococcuslactis subsp.lactis KF147和Lactococcus lactis subsp.lactis CV56中的至少一种。
2.一种用于治疗或预防类风湿性关节炎的药物组合物，其特征在于，包括：
乳酸乳球菌；以及
药学上可接受的辅料，
所述乳酸乳球菌为选自Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC 19435、Lactococcus lactis subsp.lactis KF147和Lactococcus lactis subsp.lactis CV56中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，当所述药物组合物呈固态时，所述药物组合物包含1×10-1×1020cfu/g的所述乳酸乳球菌，
当所述药物组合物呈液态时，所述药物组合物包含1×10-1×1020cfu/mL的所述乳酸乳球菌。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，当所述药物组合物呈固态时，所述药物组合物包含1×104-1×1015cfu/g的所述乳酸乳球菌，
当所述药物组合物呈液态时，所述药物组合物包含1×104-1×1015cfu/mL的所述乳酸乳球菌。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，当所述药物组合物呈固态时，所述药物组合物包含1×106-1×1011cfu/g的所述乳酸乳球菌，
当所述药物组合物呈液态时，所述药物组合物包含1×106-1×1011cfu/mL的所述乳酸乳球菌。
6.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的辅料为选自载体、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂以及香料中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的辅料为选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油中的至少一种。
8.一种药物，其特征在于，包括：
权利要求2-7中任一项所述的药物组合物。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物呈选自颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液和乳剂中的至少一种制剂形式。
10.一种用于治疗或预防类风湿性关节炎的饲料，其特征在于，包括：乳酸乳球菌，
所述乳酸乳球菌为选自Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC 19435、Lactococcus lactis subsp.lactis KF147和Lactococcus lactis subsp.lactis CV56中的至少一种。
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