CN115702908A - 用于治疗和预防结肠直肠癌的益生菌组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗结肠直肠癌或用于降低个体中发展所述疾病的风险的组合物和方法。

Description

用于治疗和预防结肠直肠癌的益生菌组合物

发明背景

结肠直肠癌(CRC)是世界范围内第三最常见的癌症和癌症死亡率的第三主要原因，估计发病率为每年1百万新病例，死亡率>500000例死亡。几个内在(例如，年龄、男性性别、种族、糖尿病、肥胖和炎性肠病)和外在(例如，吸烟、纤维摄入不充分、酒精消耗高、红肉和高脂肪饮食)因素与CRC风险增加有关。CRC的流行病学由于风险因素的流行和分布的变化而处于动态变化中。在这方面，在过去二十年中，许多发展中国家，包括亚洲国家的CRC发病率增加了2至4倍，现在已经达到了警示率，其中饮食的西方化发挥了关键作用。

已经证实约38万亿种细菌存在于人类肠道中。由于它们与人体的共生和协作关系，这些细菌与CRC的发病机制和进展密切相关。已经在不同的人群中研究了CRC与改变的肠道微生物群的关联，鉴定了某些细菌种类在肿瘤发生中的潜在作用(有益的或有害的)。

已经设计了包括手术、化疗、放射疗法和靶向疗法(例如，西妥昔单抗和贝伐单抗)在内的几种治疗方式来管理CRC。然而，患有转移性CRC的患者的预后仍然较差，这突出了预防以及早期治疗这种疾病的重要性。CRC从细胞转化到全面转移性病变的长期，逐步进展已经使得能够通过天然化合物或药物阻止或逆转该过程来预防。特别地，经济分析表明，当靶向息肉切除术后的中等风险人群时，化学预防可以是成本有效的干预。为此，已经显示非甾体抗炎药(NSAID)和环加氧酶-2(COX-2)抑制剂降低高风险个体中CRC或其癌前病变的发生。然而，长期使用这些药剂与心血管事件的风险增加有关，这引起了对推荐这些药剂用于CRC化学预防的高风险受益比的关注。还探索了包括叶酸、钙、维生素D和抗氧化剂在内的其它药剂的化学预防作用，但是它们的功效仍有待完全确立。益生菌是人类肠道中的共生微生物。通过改变肠道微生物谱来管理CRC风险和疾病结果因为其高功效，低成本和低副作用风险而是高度期望的医疗干预手段。因此，对于开发可用于预防和治疗CRC目的的新的、有效的方法和组合物存在迫切的需要。本发明满足了这种需要和其它相关的需要。

发明内容

本发明人在他们的研究中发现，某些肠道微生物种类及其代谢物对于预防和治疗CRC是有效的。这样鉴定的微生物和代谢物现在用于提供新的方法和组合物，其用于在以后的时间降低个体发展为CRC的风险和/或用于治疗已经诊断患有疾病的个体中的CRC。

在第一方面，本发明提供了用于预防或治疗人类受试者中的CRC的组合物，所述人类受试者例如，由于家族史或过去患有结肠囊肿或息肉的个人病史而没有患有CRC但具有增加的CRC风险的人，或已经被诊断患有CRC的人。所述组合物包含有效量的(1)活细菌母鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、吲哚-3-乳酸(ILA)或由乳酸乳球菌分泌的分子量大于100kDa的氨肽酶；和(2)一种或多种生理学上可接受的赋形剂或载体。在一些情况下，除了母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌、ILA或由乳酸乳球菌产生的大于100kDa分子量的氨肽酶之外，所述组合物还包含有效量的活细菌麦芽香肉杆菌(Carnobacterium maltaromaticum)。在一些实施方案中，所述组合物包含组合有效量的(a)母鸡乳杆菌和/或乳酸乳球菌和(b)麦芽香肉杆菌。在一些实施方案中，所述组合物被配制用于经口摄入，例如以食品或饮料物品的形式，或作为食品或饮料的添加剂。在一些实施方案中，所述组合物为粉末剂、液体、糊剂、霜剂、片剂、胶囊剂或囊片剂的形式。在一些实施方案中，所述组合物含有每克组合物重量约1×10⁸至约1×10¹²个菌落形成单位(CFU)范围内的母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌。在一些实施方案中，所述组合物含有每克组合物重量约1×10⁸至约1×10¹²个CFU范围内的活细菌麦芽香肉杆菌。在一些实施方案中，所述组合物包含这样的CFU比的母鸡乳杆菌(或乳酸乳球菌)与麦芽香肉杆菌：三种细菌种类中的任意两种细菌种类之间的CFU比范围为约1:5至约5:1，例如约1:3至约3:1、或约1:2至约2:1、或约1:1。在一些实施方案中，所述组合物被配制成多个包装，每个包装在日剂量中。

在第二方面，本发明提供了用于治疗或预防受试者中的CRC的方法，所述方法通过向受试者施用有效量的上述和本文所述的组合物，即含有有效量的(1)母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌、ILA或由乳酸乳球菌分泌的分子量大于100kDa的氨肽酶；和(2)一种或多种生理学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，受试者已经被诊断患有CRC。在其它实施方案中，受试者尚未被诊断患有CRC。在一些情况下，所述组合物包含有效量的(i)活细菌母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌；(ii)母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌培养物上清液；或(iii)ILA或由乳酸乳球菌产生并具有大于100kDa的分子量的氨肽酶。在一些实施方案中，所述组合物还包含有效量的活细菌麦芽香肉杆菌。在一些实施方案中，所述方法包括作为施用步骤向受试者施用第一组合物，并且向受试者施用包含有效量的活细菌麦芽香肉杆菌的第二组合物，所述第一组合物包含有效量的(i)活细菌母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌；(ii)母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌培养物上清液；或(iii)ILA或由乳酸乳球菌分泌的分子量大于100kDa的氨肽酶。在一些情况下，母鸡乳杆菌培养物上清液是分子量<3kDa的级分。在一些情况下，乳酸乳球菌培养物上清液是分子量>100kDa的级分。在一些实施方案中，用于所述方法中的组合物包含活细菌母鸡乳杆菌(或乳酸乳球菌)和麦芽香肉杆菌，各自在每克组合物重量约1×10⁸至约1×10¹²个CFU的范围内，并且在三种细菌种类中的任意两种细菌种类之间的CFU比为约1:5至约5:1的范围内，例如，约1:3至约3:1，或约1:2至约2:1，或约1:1。在一些实施方案中，施用一种单一组合物，其包含(1)ILA或母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌、ILA或由乳酸乳球菌分泌的分子量大于100kDa的氨肽酶和(2)麦芽香肉杆菌。在一些实施方案中，施用两种或更多种分开的组合物，每种组合物包含活细菌母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌、ILA、由乳酸乳球菌产生的分子量大于100kDa的氨肽酶、和麦芽香肉杆菌中的一种或多种。在一些实施方案中，施用步骤包括经口摄入所述组合物。在一些实施方案中，所要求保护的方法中的受试者未被诊断患有先前已知需要施用母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌、ILA或麦芽香肉杆菌的任何疾病或病况。这种疾病/病况的一个示例是结肠炎。

在相关的方面，本发明提供了用于治疗或预防受试者中的CRC的组合物的新用途以及制备这种组合物的方法。所述组合物含有有效量的(1)母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌、ILA或乳酸乳球菌产生的分子量大于100kDa的氨肽酶；和(2)一种或多种生理学上可接受的赋形剂。任选地，所述组合物还包含有效量的活细菌麦芽香肉杆菌。所述组合物可以用作药物或食品/饮料补充剂，其用于治疗或预防患有疾病的受试者或没有疾病但有随后发展成疾病的风险的受试者中的CRC。所述组合物可以通过将有效量的以下各项中的任一项或多项与至少一种可能的生理学或药学上可接受的赋形剂或载体组合以形成混合物来产生：(i)活细菌母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌；(ii)母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌培养物上清液；(iii)ILA；或(iv)乳酸乳球菌产生的分子量大于100kDa的氨肽酶，所述混合物可以采用从液体、半液体到固体或粉末的多种形式中的任一种。在一些情况下，母鸡乳杆菌培养物上清液是培养液中<3kDa分子量的级分。在一些情况下，培养物上清液是乳酸乳球菌培养液中>100kDa分子量的级分。任选地，所述混合物中进一步组合适当量的活细菌麦芽香肉杆菌，优选构成有效量的与母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌、ILA或乳酸乳球菌产生的>100kDa分子量的氨肽酶的组合。在一些实施方案中，所述组合物包含活细菌母鸡乳杆菌(或乳酸乳球菌)和麦芽香肉杆菌，各自在每克组合物重量约1×10⁸至约1×10¹²个CFU的范围内，并且在三种细菌种类中的任意两种细菌种类之间的CFU比为约1:5至约5:1的范围内，例如，约1:3至约3:1，或约1:2至约2:1，或约1:1。在一些情况下，将组合物配制用于经口摄入，例如，已经掺入食品或饮料物品中，或作为食品或饮料的添加剂。在一些实施方案中，所述组合物为粉末剂、液体、糊剂、霜剂、片剂、胶囊剂或囊片剂的形式。

在第三方面，本发明提供了用于治疗或预防受试者中的CRC的试剂盒，其包含(1)含有第一组合物的第一容器和(2)含有第二组合物的第二容器，所述第一组合物包含有效量的母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌、ILA或乳酸乳球菌产生的>100kDa分子量的氨肽酶，所述第二组合物包含有效量的麦芽香肉杆菌。在一些实施方案中，所述试剂盒包含第一组合物和第二组合物，所述第一组合物含有以每克第一组合物重量约1×10⁸至约1×10¹²个CFU范围内存在的活细菌母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌，所述第二组合物含有以每克第二组合物重量约1×10⁸至约1×10¹²个CFU范围内存在的活细菌麦芽香肉杆菌。在一些情况下，活细菌母鸡乳杆菌(或乳酸乳球菌)和麦芽香肉杆菌在三种细菌种类中的任意两种细菌种类之间的CFU比为约1:5至约5:1的范围内，例如，约1:3至约3:1，或约1:2至约2:1，或约1:1，或约1:1，存在于待一起被施用的第一和第二位置中。在一些实施方案中，所述组合物为粉末剂、液体、糊剂、霜剂、片剂、胶囊剂或囊片剂的形式。所述试剂盒通常还包括说明书手册，所述手册为使用者根据预定的剂量和频率向适当的接受者(例如，处于CRC风险但没有患结肠炎的接受者)施用所述组合物提供指示。

附图的简要说明

图1显示了麦芽香肉杆菌在患有CRC的患者的粪便样品中消耗并预测总体存活。(A)来自正常对照(n＝39)和CRC患者(n＝39)的临床粪便样品中麦芽香肉杆菌的丰度。(B)麦芽香肉杆菌的丰度与CRC患者存活之前的关系。结果表示为平均值±S.D.。每个点代表一名受试者。通过学生t检验评估统计学显著性。

图2显示了麦芽香肉杆菌抑制结肠癌细胞的活力并诱导G₂/M期细胞周期停滞。(A)在与或不与麦芽香肉杆菌共孵育后，CRC细胞(HCT116、DLD1)和正常结肠细胞(NCM460)的活力。大肠杆菌用作细菌对照。(B)在与或不与麦芽香肉杆菌共孵育后，结肠细胞的细胞周期分布。大肠杆菌用作细菌对照。结果表示为平均值±S.D.。视情况通过单向ANOVA或双向ANOVA确定统计学显著性。

图3显示了麦芽香肉杆菌在Apc^min/+小鼠中防止肠肿瘤发生。(A)显示在不同处理下Apc^min/+小鼠的实验设计、时间线和代表性结肠形态的示意图。(B)结肠镜检查下结肠肿瘤的代表性图像(上图)和来自不同处理的Apc^min/+小鼠的代表性H&E染色的组织学图像(下图)。比例尺＝100μm。(C)在不同处理下的Apc^min/+小鼠的结肠和小肠肿瘤数目(上三图)和肿瘤负荷(下三图)。(D)小鼠结肠中Ki-67⁺细胞的免疫组织化学染色，以及Ki-67⁺指数的定量分析。结果表示为平均值±S.D.。通过单向ANOVA确定统计学显著性。C.M,麦芽香肉杆菌；SI，小肠；W，周。

图4显示了麦芽香肉杆菌在偶氮甲烷(AOM)诱导的CRC小鼠中防止肠肿瘤发生。(A)显示在不同处理下AOM诱导的CRC小鼠模型的实验设计、时间线和代表性结肠形态的示意图。(B)结肠镜下结肠肿瘤的代表性图像(上图)和来自在不同处理的AOM诱导的CRC小鼠模型的代表性H&E染色的组织学图像(下图)。比例尺＝100μm。(C)在不同处理下AOM诱导的CRC小鼠的结肠肿瘤数目(左图)和肿瘤负荷(右图)。(D)小鼠结肠中Ki-67⁺细胞的免疫组织化学染色，以及Ki-67⁺指数的定量分析。结果表示为平均值±S.D.。通过单向ANOVA确定统计学显著性。C.M，麦芽香肉杆菌；AOM，偶氮甲烷；W，周。

图5显示了麦芽香肉杆菌在Apc^min/+小鼠和AOM诱导的CRC小鼠中保持肠道屏障功能，抑制促炎反应。(A)在不同处理下Apc^min/+小鼠结肠组织中肠道屏障相关基因Tjp1(ZO-1)、Ocln和Cdh1的mRNA表达水平。(B)Apc^min/+小鼠结肠组织中肠道屏障相关蛋白ZO-1、闭合蛋白和E-钙粘蛋白的表达水平。(C)Apc^min/+小鼠的血清中的LPS浓度。(D)Apc^min/+小鼠的结肠细胞间连接的代表性超微结构图像。(E)来自Apc^min/+小鼠的代表性AB-PAS染色的内粘液层图像。(F)Apc^min/+小鼠结肠组织中促炎基因IL-1β、IL-6、Cxcr-2和抗炎细胞因子IL-10的mRNA表达水平。(G)在不同处理下AOM诱导的CRC小鼠的结肠组织中肠道屏障相关基因Tjp1(ZO-1)、Ocln和Cdh1的mRNA表达水平。(H)在AOM诱导的CRC小鼠的结肠组织中肠道屏障相关蛋白ZO-1、闭合蛋白和E-钙粘蛋白的表达水平。(I)来自AOM诱导的CRC的代表性AB-PAS染色的内粘液层图像。(J)AOM诱导的CRC小鼠的结肠组织中促炎基因IL-1β、IL-6、Cxcr-2和抗炎细胞因子IL-10的mRNA表达水平。结果表示为平均值±S.D.。通过单向ANOVA确定统计学显著性。C.M,麦芽香肉杆菌；AOM，氮氧甲烷。

图6显示了麦芽香肉杆菌在Apc^min/+小鼠中调节肠道微生物群。(A)在不同处理下Apc^min/+小鼠中肠道微生物群的种类丰富度的主坐标分析(PCoA)。(B)在Apc^min/+小鼠中在属水平上的调节细菌的热图表示。(C)Apc^min/+小鼠中差异丰富的细菌OTU的热图表示。截止值＝|Log2[倍数变化(FC)]|>1&FDR<0.05。结果表示为平均值±S.D.。通过单向ANOVA确定统计学显著性。OUT，操作分类单位；C.M,麦芽香肉杆菌。

图7显示了麦芽香肉杆菌增加Apc^min/+小鼠和AOM诱导的CRC小鼠的肠道中维生素D代谢物的丰度。(A)在不同处理下的Apc^min/+小鼠中的肠道代谢组改变的主坐标分析(PCoA)。(B)Apc^min/+小鼠中差异代谢物的热图表示。(C)Apc^min/+小鼠中差异富集的代谢途径的途径分析。(D)Apc^min/+小鼠中的结肠粘膜1α,25-二羟基维生素D₃(1,25(OH)₂D₃)浓度。(E)在Apc^min/+小鼠的结肠组织中负责1,25(OH)₂D₃生物合成的酶(CYP2R1、CYP27A1和CYP27b1)的水平。(F)在不同处理下的AOM诱导的CRC小鼠中增强的维生素D代谢物的热图表示。(G)AOM诱导的CRC小鼠中的结肠粘膜1,25(OH)₂D₃浓度。(H)AOM诱导的CRC小鼠的结肠组织中负责1,25(OH)₂D₃生物合成的酶(CYP2R1、CYP27A1和CYP27b1)的水平。结果表示为平均值±S.D.。通过单向ANOVA确定统计学显著性。C.M,麦芽香肉杆菌；AOM，氮氧甲烷。

图8显示了麦芽香肉杆菌在Apc^min/++小鼠中诱导维生素D信号传导。(A)在不同处理下的Apc^min/+小鼠结肠组织中差异表达基因的热图表示。(B)Apc^min/+小鼠结肠组织中胆汁酸受体的mRNA表达水平。(C)Apc^min/+小鼠中差异表达基因的基因集富集分析(GSEA)。(D)Apc^min/+小鼠结肠组织中VDR的mRNA(左图)和蛋白质表达水平(右图)。(E)在Apc^min/+小鼠的结肠组织中CRAMP(一种VDR靶基因)的mRNA表达水平。(F)Apc^min/+小鼠结肠中的核VDR⁺细胞的免疫荧光染色，以及MFI的定量分析。(G)TCGA COAD肿瘤样品中VDR的mRNA表达水平。(H)Apc^min/+小鼠中VDR靶基因表达的热图表示。结果表示为平均值±S.D.。通过单向ANOVA确定统计学显著性。MFI，平均荧光强度；C.M,麦芽香肉杆菌。

图9显示了麦芽香肉杆菌在AOM诱导的CRC小鼠中诱导维生素D信号传导。(A)AOM诱导的CRC小鼠的结肠组织中的VDR的mRNA(左图)和蛋白质表达水平(右图)。(B)AOM诱导的CRC小鼠的结肠组织中CRAMP的mRNA表达水平。(C)AOM诱导的CRC小鼠结肠中的核VDR⁺细胞的免疫荧光染色，以及MFI的定量分析。结果表示为平均值±S.D.。通过单向ANOVA确定统计学显著性。MFI，平均荧光强度；C.M,麦芽香肉杆菌；AOM，氮氧甲烷。

图10显示了麦芽香肉杆菌抑制Apc^min/+小鼠中的促炎反应。(A)在不同处理下的Apc^min/+小鼠结肠组织中多种炎症相关基因的表达。(B)在Apc^min/+小鼠的结肠组织中多种炎症相关途径的富集。结果表示为平均值±S.D.。统计学差异显著性基因表达被确定为截止值＝|Log2(FC)|>1&FDR<0.05。C.M,麦芽香肉杆菌。

图11显示了母鸡乳杆菌在Apc^Min/+小鼠中防止肠肿瘤发生。(A)显示Apc^Min/+小鼠模型的实验设计、时间线的示意图。(B)来自Apc^Min/+小鼠模型的结肠肿瘤的代表性图像。结肠镜检查证实，母鸡乳杆菌组中的结肠肿瘤大小在视觉上小于大肠杆菌MG1655或PBS对照组中的肿瘤。在大肠杆菌MG1655和PBS对照组中，结肠镜不能通过肿瘤。(C)在灌服期间，三组小鼠之间的体重没有显著差异。(D)在灌服8周后，母鸡乳杆菌组的血便数和发病率均低于肉汤对照组。(E)在不同处理下的Apc^Min/+小鼠中的结肠肿瘤数目和肿瘤大小。(F)在不同处理下的Apc^Min/+小鼠中的小肠肿瘤数目和肿瘤大小。每个黑色三角形表示一个肿瘤位置。通过单向ANOVA计算P值。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。L.c，干酪乳杆菌；L.g,母鸡乳杆菌；SI，小肠。

图12显示了在AOM/硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导的CRC小鼠中，母鸡乳杆菌防止肠肿瘤发生。(A)显示雄性AOM/DSS小鼠模型的实验设计、时间线的示意图。(B)来自雄性AOM/DSS小鼠模型的结肠肿瘤的代表性图像。(C)在不同处理下的雄性AOM/DSS小鼠中的结肠肿瘤数目和肿瘤大小。每个黑色三角形表示一个肿瘤位置。通过单向ANOVA计算P值。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。L.c，干酪乳杆菌；L.g,母鸡乳杆菌；SI，小肠。

图13显示了母鸡乳杆菌调节Apc^Min/+小鼠的肠道微生物群。(A)管腔微生物群操作分类单位(I)在各种分类等级的α-多样性分析。(B)基于Bray-Curtis不相似矩阵IOTU水平组成谱的β-多样性的主坐标分析(PCoA)。省略号代表95％置信区间。黑色的实心菱形点表示使用VEGAN R-CRAN包计算的种类得分。(C)使用单向方差分析的差异丰富的细菌OTU的热图，在p<0.05。L.g,母鸡乳杆菌。

图14显示了母鸡乳杆菌上清液抑制结肠癌细胞的活力。用MTT测定测量细胞的增殖。将不同浓度的培养物上清液用于培养CRC细胞系HCT116(5％,10％,20％)和LoVo(5％,10％,20％)以及正常结肠上皮细胞系NCM460(5％,10％,20％)。(A)从第4天至第5天，母鸡乳杆菌(尤其是10％和20％的)的培养物上清液，显著抑制HCT116的细胞生长。(B)不同浓度的母鸡乳杆菌培养物上清液也显著抑制LoVo的细胞生长；5％和10％均从第4天到第5天，并且20％从第3天到第5天。(C)在正常结肠上皮细胞系NCM460中未观察到细胞生长的变化。(D)20％LGCS抑制CRC细胞的菌落形成。通过双向ANOVA计算P值。***p<0.001,****p<0.0001。ECCS，大肠杆菌培养物上清液；LGCS,母鸡乳杆菌培养物上清液。

图15显示了母鸡乳杆菌上清液促进CRC细胞中的细胞凋亡而不是细胞周期停滞。(A)LGCS在两种CRC细胞系HCT116和(B)LoVo中显著促进细胞凋亡，包括早期和晚期，但在正常结肠上皮细胞系NCM460中没有(C)。(D)在含有10％LGCS的培养基中，CRC患者来源的类器官的大小和数量从视觉上降低了。(E)LGCS显著促进CRC患者来源的类器官中的细胞凋亡，包括早期和晚期。(F)LGCS对HCT116、(G)LoVo和(H)NCM460中的细胞周期分布没有影响。通过单向ANOVA计算P值。**p<0.01,****p<0.0001。ECCS，大肠杆菌培养物上清液；LGCS,母鸡乳杆菌培养物上清液。

图16显示了从母鸡乳杆菌产生的抗肿瘤分子是分子量<3kDa的非蛋白。(A)低分子量(LMW)-LGCS而不是HMW-LGC显著抑制HCT116和LoVo的细胞生长。(B)在热灭活的LGCS中观察到CRC细胞增殖的降低。(C)在蛋白酶k灭活的LGCS中观察到CRC细胞增殖的降低。通过双向ANOVA计算P值。*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。ECCS，大肠杆菌培养物上清液；LGCS，母鸡乳杆菌培养物上清液；PK，蛋白激酶K。

图17显示了母鸡乳杆菌诱导Try代谢。(A)PCA的得分图揭示了母鸡乳杆菌、大肠杆菌MG1655和对照肉汤组的培养物-上清液中代谢物的清楚分离。(B)热图分析揭示了来自培养物上清液的LGCS、ECCS和对照肉汤组中的不同代谢物的丰度。(C)PCA的得分图揭示了母鸡乳杆菌、大肠杆菌MG1655和对照肉汤处理的Apc^Min/+小鼠之间的清楚分离。(D)热图分析揭示了在不同处理下的Apc^Min/+小鼠肠道中不同代谢物的丰度。通过学生t检验计算P值。*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。ECCS，大肠杆菌培养物上清液；LGCS，母鸡乳杆菌培养物上清液；PK，蛋白激酶K。

图18显示了母鸡乳杆菌分解代谢Try以产生ILA从而防止CRC。对不同培养物上清液和来自不同处理下的Apc^Min/+小鼠的粪便样品进行L-色氨酸的靶向代谢组学。(A)PCA的得分图揭示了母鸡乳杆菌、大肠杆菌MG1655和对照肉汤组的培养物上清液之间的清楚分离。(B)PCA的得分图揭示了来自母鸡乳杆菌处理的、大肠杆菌MG1655处理的和对照Apc^Min/+小鼠的粪便样品之间的清楚分离。(C)热图分析揭示了LGCS、ECCS和对照肉汤组中不同代谢物的丰度。(D)热图分析揭示了在不同处理下的Apc^min/+小鼠肠道中不同代谢物的丰度。(E)ILA显著抑制CRC细胞的细胞生长。视情况通过双向ANOVA或学生t检验计算P值。*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001。ECCS，大肠杆菌培养物上清液；LGCS，母鸡乳杆菌培养物上清液；ILA，吲哚-3-乳酸。

图19显示了组合的母鸡乳杆菌和麦芽香肉杆菌在AOM/DSS诱导的CRC小鼠中协同地防止肠肿瘤发生。(A)显示AOM/DSS小鼠模型的实验设计、时间线的示意图。(B)来自AOM/DSS小鼠模型的结肠肿瘤的代表性图像。(C)在不同处理下的雄性AOM/DSS小鼠中的结肠肿瘤数目和肿瘤大小。每个黑色三角形表示一个肿瘤位置。通过单向ANOVA计算P值。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。C.M,麦芽香肉杆菌；L.G,母鸡乳杆菌。

图20显示了组合的母鸡乳杆菌和麦芽香肉杆菌协同地改变AOM/DSS诱导的CRC小鼠中的肿瘤免疫微环境。

图21显示了乳酸乳球菌在Apc^Min/+小鼠中防止肠肿瘤发生。(A)显示在不同处理下的Apc^Min/+小鼠的实验设计、时间线和代表性结肠形态的示意图。(B)结肠镜检查下结肠肿瘤的代表性图像(上图)和来自不同处理的Apc^min/+小鼠的代表性H&E染色的组织学图像(下图)。(C)在不同处理下的Apc^min/+小鼠的总肿瘤数目和肿瘤负荷。结果表示为平均值±S.D.。通过单向ANOVA确定统计学显著性。L.L，乳酸乳球菌；W，周。

图22显示了乳酸乳球菌条件培养基(LL.CM)抑制结肠癌细胞的活力。用MTT测定测量细胞的增殖。(A)5％浓度的LL.CM显著抑制CRC细胞(HCT116和HT29)生长，但不抑制正常结肠上皮细胞系NCM460。(B)5％LL.CM显著抑制患者来源的类器官的大小。视情况通过双向ANOVA或单向ANOVA计算P值。*****p<0.0001。Ec.CM，大肠杆菌条件培养基；LL.CM，乳酸乳球菌条件培养基。

图23显示了由乳酸乳球菌产生的抗肿瘤分子是分子量>100kDa的蛋白质。(A)在热灭活和PK灭活的LL.CM中未观察到CRC细胞增殖的降低。(B)在热灭活和PK灭活的LL.CM中未观察到CRC细胞菌落形成的降低。(C)仅在LL.CM>100kDa中观察到CRC细胞增殖的降低。视情况通过双向ANOVA或单向ANOVA计算P值。****p<0.0001。Ec.CM，大肠杆菌条件培养基；LL.CM，乳酸乳球菌条件培养基；PK，蛋白激酶K。

图24显示了由乳酸乳球菌产生的抗肿瘤分子含有氨肽酶。L.L，乳酸乳球菌。

定义

在本公开中，术语“结肠直肠癌(CRC)”和“结肠癌”具有相同的含义，并且是指大肠(结肠)，即人类消化系统的下部的癌症，尽管直肠癌经常更具体地是指结肠的最后几英寸(直肠)的癌症。“结肠直肠癌细胞”是具有结肠癌特征的结肠上皮细胞，并且包括癌前细胞，其处于转化成癌细胞的早期阶段或其易于转化成癌细胞。这种细胞可表现出癌细胞的一种或多种表型性状特征。

本文中使用的术语“吲哚-3-乳酸”或ILA是指小分子，其是色氨酸的代谢物，由某些细菌种类分泌，具有如下所示的化学结构：

如本文所用的，“培养物上清液”是指细菌培养物的水性部分，其已被置于允许细菌细胞对数期增殖的合适条件下(例如，在约28至37℃下持续12-24小时)，并且随后例如通过在约5,000或更高rpm，例如约5,000-10,000rpm下离心至少约5分钟，例如约5-10分钟，来基本上去除细菌细胞。细菌培养物上清液的概念还涵盖已经进行稀释或浓缩或基于上清液中存在的化合物的分子量进行分级的水性产物。

如本申请中所用的，“增加”或“减少”是指与比较对照(例如，已建立的标准对照)在量上可检测的正或负变化。增加是正变化，即其通常为对照值的至少10％，或至少20％，或50％，或100％，并且可以高达对照值的至少2倍，或至少5倍，或甚至10倍。类似地，降低是负变化，即其通常为对照值的至少10％，或至少20％、30％或50％，或甚至高达对照值的至少80％或90％。在本申请中以与上述相同的方式使用表示与比较基础的定量变化或差异的其它术语，诸如“更多”、“更少”、“更高”和“更低”。相比之下，术语“基本上相同”或“基本上没有变化”表示与标准对照值相比在量上变化很小或没有变化，通常在标准对照的±10％内，或在标准对照的±5％、2％、1％内，或甚至更少的变化。

本文所用的术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指对靶生物过程，例如靶基因的RNA/蛋白表达、靶蛋白的生物活性、细胞信号转导、细胞增殖、生物体特别是微生物的存在/水平、任何可测量的生物标志物、生物参数或受试者中的症状等的任何可检测的负面影响。通常，抑制反映在当与对照相比时，靶过程(例如受试者的体重，或血糖/胆固醇水平，或受试者中的任何可测量的症状或生物标志物，例如受试者中的致病性传染物的感染率或疾病发病率)或上述下游参数中的任一个中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高的降低。“抑制”还包括100％的降低，即完全清除、预防或消除靶生物过程或信号或疾病/症状。其它相对术语如“阻抑(suppressing)”、“阻抑(suppression)”、“降低(reducing)”和“降低(reduction)”在本公开中以类似的方式使用，是指降低至不同的水平(例如，与对照水平相比，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的降低)，直至完全清除靶生物过程或信号或疾病/症状。另一方面，本公开中使用的术语如“活化(activate)”、“活化(activating)”、“活化(activation)”、“增加(increase)”、“增加(increasing)”、“促进(promote)”、“促进(promoting)”、“增强(enhance)”、“增强(enhancing)”或“增强(enhancement)”涵盖不同水平的正变化(例如，在靶过程、信号或症状/疾病发病率方面，与对照水平相比，至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或更高，例如3、5、8、10、20倍的增加)。

本文所用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括针对疾病或病况的存在或在后来的时间发展此类疾病或病况的风险所采取的治疗和预防措施。其涵盖用于减轻进行中的症状、抑制或减缓疾病进展、延迟症状发作或清除或减少由此类疾病或病况引起的副作用的治疗或预防措施。本背景下的预防措施及其变型不需要100％清除事件的发生；相反，它们是指抑制或降低这种发生的可能性或严重程度或延迟这种发生。

术语疾病的“严重程度”是指疾病发展对患有该疾病的患者的福祉和健康造成有害影响的水平和程度，例如短期和长期的身体、精神和心理残疾，直到并且包括患者的死亡。疾病的严重程度可以反映在必需的治疗和维持措施的性质和数量，患者恢复所需的持续时间，可能的恢复程度，患者完全恢复的百分比，需要长期护理的患者的百分比，和死亡率中。

接受本发明的组合物或治疗方法的“患者”或“受试者”是任何年龄、性别和民族背景的人，包括成年人和未成年人，其可能没有被诊断患有任何特定的疾病或病症(例如结肠癌或CRC)，但需要针对该疾病的预防性或治疗性治疗。通常，接受根据本发明方法的治疗以预防或改善CRC或其任何症状的患者或受试者本来不需要相同治疗剂的治疗。例如，如果受试者正在接受根据所要求保护的方法的益生菌组合物，则受试者未患有已知用相同治疗剂治疗的任何疾病。尽管患者可以是任何年龄的，但在一些情况下，患者是至少40、45、50、55、60、65、70、75、80或85岁的年龄；在一些情况下，患者可以为40至45岁，或50至65岁，或65至85岁。“儿童”受试者是18岁年龄以下的受试者，例如，约5至17岁、9或10至17岁，或12至17岁，包括“婴儿”，其小于约12个月，例如，小于约10、8、6、4或2个月，而“成年人”受试者是18岁以上的受试者。

本文所用的术语“有效量”是指施用物质产生预期(例如，治疗或预防)效果的量。所述效果包括预防、校正或抑制特定疾病/病况的症状和相关并发症的进展至任何可检测的程度，例如疾病和相关病症(例如CRC)的发病率。确切的量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如，Lieberman,Pharmaceutical DosageForms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding(1999)；和Pickar,Dosage Calculations(1999))。

术语“约”在用于提及给定值时表示涵盖该值的±10％的范围。例如，“约10”涵盖9至11的范围。

“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”赋形剂为不是生物有害的或不合需要的物质，即赋形剂可以与生物活性剂一起施用于个体而不引起任何不合需要的生物效应。赋形剂也不会以有害的方式与其中包含赋形剂的组合物的任何组分相互作用。

术语“赋形剂”是指可存在于本发明组合物的最终剂型中的任何本质上是辅助的物质。例如，术语“赋形剂”包括媒介物、粘合剂、崩解剂、填充剂(稀释剂)、润滑剂、助流剂(流动增强剂)、压缩助剂、着色剂、甜味剂、防腐剂、悬浮剂/分散剂、成膜剂/包衣剂、调味剂和印刷油墨。

当用于描述含有活性成分或多种活性成分的组合物的上下文中时，术语“基本上由……组成”是指组合物不含有具有活性成分的任何类似或相关生物活性或能够增强或抑制该活性的其它成分，而一种或多种非活性成分如生理上或药学上可接受的赋形剂可存在于组合物中。例如，基本上由有效治疗或预防受试者中的CRC的活性剂(例如，母鸡乳杆菌和麦芽香肉杆菌的组合)组成的组合物是不含有任何其它试剂的组合物，所述其它试剂可以对相同的靶过程具有任何可检测的积极或消极作用(例如，抑制结肠的肿瘤发生或进展)或可以将接受受试者的疾病严重程度增加或降低至任何可测量的程度。

发明的详细描述

I.引言部分

使用粪便鸟枪宏基因组测序，本发明人以前已经鉴定出母鸡乳杆菌是结肠直肠癌(CRC)患者粪便中消耗最多的益生菌种类之一。该研究旨在确定母鸡乳杆菌任选地与另外一种或两种细菌种类(如乳酸乳球菌或麦芽香肉杆菌)组合在结肠直肠肿瘤发生中的潜在抗肿瘤发生作用。

具体而言，每天给Apc^min/+小鼠和偶氮甲烷/硫酸葡聚糖钠处理的小鼠灌服母鸡乳杆菌，大肠杆菌MG1655(对照细菌)或纯培养基肉汤，直到肿瘤病变发展。处死后测定肠肿瘤数目和大小。将CRC类器官和CRC细胞系(HCT116和LoVo)与母鸡乳杆菌或大肠杆菌MG1655培养物上清液一起培养，以评价细胞增殖，细胞凋亡和细胞周期分布。通过16S rRNA测序评估肠道微生物群。通过液相色谱质谱(LC-MS/MS)和靶向质谱测定鉴定从母鸡乳杆菌产生的抗肿瘤分子。

在雄性和雌性鼠肠肿瘤发生模型中，与大肠杆菌MG1655和纯培养基肉汤相比，母鸡乳杆菌显著减少了肠肿瘤的数量和大小。粪便微生物谱分析揭示了母鸡乳杆菌处理的小鼠中益生菌的富集和致病细菌的消耗。用母鸡乳杆菌培养物-上清液(5％、10％和20％)培养CRC细胞，浓度依赖性地抑制细胞增殖和菌落形成。母鸡乳杆菌培养物-上清液显著促进CRC细胞和患者来源的类器官的细胞凋亡，但在正常结肠上皮细胞中则并非如此。只有级分大小<3kDa的母鸡乳杆菌培养物-上清液抑制了CRC细胞中的细胞增殖。使用LC-MS/MS，鉴定出L-色氨酸在母鸡乳杆菌培养物上清液和母鸡乳杆菌处理的小鼠肠道中都增加。进一步的高通量色氨酸靶向的代谢组学揭示了吲哚-3-乳酸(ILA)是由母鸡乳杆菌分泌的最显著增加的低分子量代谢物(<3kDa)之一。

总之，该研究提供了以下观察结果：(1)母鸡乳杆菌抑制Apc^min/+小鼠和偶氮甲烷/硫酸葡聚糖钠处理的小鼠中的结肠直肠肿瘤发生；(2)母鸡乳杆菌增加了肠道益生菌的丰度并消耗了潜在的肠道病原体；(3)母鸡乳杆菌培养物-上清液抑制细胞增殖并诱导患者来源的类器官和CRC细胞系中的细胞凋亡；和(4)分子量<3kDa的来自母鸡乳杆菌的非蛋白分泌分子介导抗CRC作用。吲哚-3-乳酸(一种具有已知抗炎特性的小分子)被鉴定为由母鸡乳杆菌分泌的最丰富的代谢物。类似地，乳酸乳球菌和在乳酸乳球菌培养物中的具有氨肽酶活性的至少一种高分子量(>100kDa)蛋白已经显示对CRC细胞具有抑制活性。因此得出结论，通过产生能够促进CRC细胞上的细胞凋亡的保护代谢物，母鸡乳杆菌以及乳酸乳球菌防止肠肿瘤发生。

II.药物组合物和施用

本发明提供了药物组合物，其包含有效量的活细菌母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌、ILA或由乳酸乳球菌产生的>100kDa分子量的氨肽酶，任选地进一步与活细菌麦芽香肉杆菌组合，其用于施用于人以降低随后发展为CRC的风险或治疗已经患有CRC的人。本发明的药物组合物适用于多种药物递送系统。用于本发明的合适制剂可见于Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA，第17版(1985)。关于药物递送方法的简要综述，参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。

本发明的药物组合物可以通过各种途径施用，例如通过经口摄入的全身施用或使用直肠栓剂的局部递送。优选的施用药物组合物的途径是以约10⁸至约10¹²个CFU的日剂量经口施用活细菌母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌，或活细菌母鸡乳杆菌(或乳酸乳球菌)和麦芽香肉杆菌的组合，其中细菌种类中的任意两种之间的比率的范围为约1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1至约5:1。这两种或三种细菌种类可在一种单一组合物中或在多种组合物中施用。任选地，将ILA的小分子(由母鸡乳杆菌分泌的L-色氨酸(Try)的下游代谢物)，或由乳酸乳球菌产生的分子量大于100kDa的氨肽酶，代替活细菌母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌施用于受试者。通常，ILA或氨肽酶可以以每kg患者体重约0.5至约50或100，或约1至约20或25，或约2至约10或15，或约5至约10mg存在于用于施用的组合物中。作为另一种选择，母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌培养物上清液可以被进一步处理，例如被分级处理以分别捕获小于约3kDa或大于约100kDa的分子量范围。

为了制备含有活细菌母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌、ILA或乳酸乳球菌产生的分子量大于约100kDa的氨肽酶，任选地与活细菌麦芽香肉杆菌组合的药物组合物，使用一种或多种惰性和药学上可接受的载体。药物载体可以是固体或液体。固体形式制剂包括，例如，粉末剂、片剂、可分散颗粒、胶囊剂、扁囊剂和栓剂。固体载体可以是一种或多种还可以充当稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂或片剂崩解剂的物质；它也可以是封装材料。

在粉末剂中，载体通常是精细分散的固体，其与精细分散的活性组分，例如母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌、ILA或乳酸乳球菌分泌的分子量大于约100kDa氨肽酶，任选地进一步组合麦芽香肉杆菌在混合物中。在片剂中，将活性成分与具有所需结合特性的载体以合适的比例混合，并压制成所需的形状和大小。

为了制备栓剂形式的药物组合物，首先将低熔点蜡如脂肪酸甘油酯和可可脂的混合物熔化，并通过例如搅拌将活性成分分散在其中。然后将熔化的均质混合物倒入合适大小的模具中并使其冷却和固化。

粉末剂和片剂优选含有约5％至约100％重量比的活性成分(例如，母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌、ILA或乳酸乳球菌分泌的分子量>100kDa的氨肽酶，任选地进一步与麦芽香肉杆菌组合)。合适的载体包括，例如，碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、乳糖、糖、果胶、糊精、淀粉、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。

药物组合物可以包括活性成分(一种或多种)(例如，母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌、ILA或乳酸乳球菌分泌的分子量>100kDa的氨肽酶，任选地进一步与麦芽香肉杆菌组合)，与作为提供胶囊剂的载体的封装材料的制剂，其中活性成分(一种或多种)(具有或不具有其他载体)被载体包围，从而使得载体与活性成分结合。以类似的方式，也可以包括药囊剂(sachet)。片剂、粉末剂、药囊剂和胶囊剂可用作适于经口施用的固体剂型。

液体药物组合物包括，例如，适于经口施用或局部递送的溶液，悬浮液和适于经口施用的乳剂。活性组分(例如母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌、ILA或乳酸乳球菌分泌的分子量>100kDa的氨肽酶，任选地进一步与麦芽香肉杆菌组合)的无菌水溶液或活性组分在包括水，缓冲水，盐水，PBS，乙醇或丙二醇的溶剂中的无菌溶液是适于经口施用或局部递送(例如通过直肠栓剂)的液体或半液体组合物的实例。所述组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等。

无菌溶液可以通过以下来制备：将活性组分(例如，母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌、ILA或乳酸乳球菌分泌的分子量>100kDa的氨肽酶，任选地进一步与麦芽香肉杆菌组合)溶解在期望的溶剂系统中，然后使所得溶液通过膜滤器以对其进行灭菌，或者可替代地，通过在无菌条件下将无菌活性组分溶解在预先灭菌的溶剂中。可以将所得水溶液包装以原样使用，或冻干，在施用前将冻干制剂与无菌水性载体组合。制剂的pH通常为3-11，更优选5-9，最优选7-8。

组合物的单次或多次施用可以由治疗医师选择剂量水平和模式来进行。在任何情况下，药物制剂应提供足以有效增强疫苗效力和/或减少或清除疫苗的不良负作用的量的活性剂。

III.试剂盒

本发明还提供了根据本文公开的方法用于降低个体中随后发展为CRC的风险或用于抑制个体中疾病的进展/降低疾病症状的严重程度的试剂盒。所述试剂盒通常包括多个容器，每个容器包含组合物，所述组合物包含一种或多种活性剂，例如活细菌母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌和麦芽香肉杆菌，或由所述细菌分泌的一种或多种蛋白质，例如ILA或由乳酸乳球菌产生的>100kDa分子量的氨肽酶。例如，第一容器含有有效量的活细菌母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌，第二容器含有有效量的活细菌麦芽香肉杆菌。作为另一个实例，第一容器含有有效量的ILA或氨肽酶，或母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌培养物的上清液，第二容器含有有效量的活细菌麦芽香肉杆菌。作为另一个实例，试剂盒包括一个单一容器，其含有以用于预期目的的有效量混合的活细菌母鸡乳杆菌(或乳酸乳球菌)和活细菌麦芽香肉杆菌。此外，已知对预防和/或治疗疾病，包括改善症状和减轻疾病的严重程度以及促进疾病恢复在治疗上有效的另外的药剂或药物可以包括在试剂盒中。试剂盒的多个容器各自可以包含不同的活性剂/药物或两种或更多种活性剂或药物的不同组合。试剂盒可以进一步包括提供关于如何分配药物组合物的说明的信息材料，包括对可以治疗的患者的类型、施用的剂量，频率和方式等的描述，所述可以治疗的患者的类型例如，已经被认为具有发展疾病的高风险的人类患者(例如，由于遗传易感性、癌症(特别是结肠癌)的家族史和/或个人特征和医学背景，例如年龄(50岁或更大)、性别(男性)、糖尿病、肥胖和炎性肠病，以及吸烟和某些饮食选择，例如纤维摄入不充分，酒精，红肉和高盐或高脂肪或防腐食品的高消耗)，以及不包括在所要求保护的方法中的患者的类型，例如已经被诊断患有预先存在的病况如结肠炎的那些，这已经需要施用活性组分，例如母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌、ILA、乳酸乳球菌分泌的分子量>100kDa的氨肽酶，或麦芽香肉杆菌。

实施例

以下实施例仅以说明的方式，而不是以限制的方式提供。本领域技术人员将容易认识到可改变或修改以产生基本上相同或类似结果的各种非关键参数。

实施例Ⅰ：麦芽香肉杆菌调节肠道微生物群并增强维生素D相关代谢物以防止结肠直肠肿瘤发生

发明背景

结肠直肠癌(CRC)是世界范围内最常被诊断的且致命的恶性肿瘤之一。在过去的数十年中，与遗传，表观遗传和环境因素一起，肠道微生物群在CRC的起始和进展中的作用已经被认识到¹。在肠肿瘤发生的长期，逐步进展期间，通过消耗CRC消耗的益生菌及其代谢物的微生物失调能够通过维持肠微生物平衡从而实现可能的CRC预防²。

到目前为止，基于益生菌的疗法由于其高度的安全性而引起了医学界的兴趣。已经发现施用益生菌，例如干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(菌株BL23)、丁酸梭菌和两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bigidum)，通过减少病原体的定殖来重新建立肠道微生物平衡³。临床研究还表明，经口双歧杆菌和乳杆菌益生菌可以减轻CRC患者中的失调，从而支持使用益生菌作为预防剂以最小副作用维持健康微生物群状态的可能性⁴。除了微生物相互作用外，益生菌分泌的促进健康的代谢物可以发挥直接的抗癌作用⁵。来自先前研究的宏基因组谱型分析已经证明嗜热链球菌(一种CRC消耗的益生菌)通过分泌β-半乳糖苷酶来预防肠肿瘤发生⁶。这些发现支持确定其它CRC消耗的细菌的肿瘤抑制作用的重要性，以提供用于CRC预防的新策略。

使用来自255名CRC患者和271名健康对照的526个多群组粪便样品的鸟枪宏基因组测序，本发明人已经鉴定了益生菌种类，即麦芽香肉杆菌，其在CRC患者的粪便中显著消耗。在此，阐明了麦芽香肉杆菌在减轻小鼠模型和培养的CRC细胞中结肠直肠肿瘤发生中的功能作用。这种肿瘤抑制作用已被揭示为归因于维生素D的活化生物合成途径。

材料和方法

人粪便样品中的麦芽香肉杆菌定量

从78名成年人中收集人粪便样品，如前所述提取粪便DNA。使用Universal SYBRGreen Master反应进行麦芽香肉杆菌的扩增和检测，并通过QuantStudio ^TM 7Flex System(Thermo Fisher Scientific Waltham,MA)分析反应。该研究方案由联合CUHK-NTEC临床研究伦理委员会批准。书面知情同意书是从个人获得的。

细菌菌株和生长条件

麦芽香肉杆菌(ATCC B270)和大肠杆菌菌株MG1655(ATCC700926)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas,VA)。在使用之前，将它们在脑心浸液(BHI)肉汤(CM1135B；Thermo Fisher Scientific,West Palm Beach,FL)中在37℃下在有氧条件下培养24小时。

细胞培养

结肠癌细胞系HCT116和DLD1获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。正常结肠上皮细胞系NCM460获自INCELL公司(San Antonio,TX)。将所有细胞系在补充了10％(vol/vol)胎牛血清(FBS)(Thermo Fisher Scientific),1％青霉素/链霉素的高葡萄糖达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM)(Thermo FisherScientific)中，在含有5％CO₂的潮湿气氛中培养。对于上皮细胞与细菌的共培养，除去培养基中的青霉素/链霉素，并将细胞暴露于感染复数(MOI)为200的细菌2小时。以与我们以前报道的相同方式测定细胞活力和细胞周期。

腺瘤性结胞多发息肉病/多发肠瘤形成CRC模型

将自发发展出肠息肉的C57BL/6J-ApcMin/J小鼠用作自发肠瘤形成的模型。它们购自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME,USA)，并在香港中文大学的动物设施中保存。将4-5周龄的小鼠分成3组-将1×10⁸个菌落形成单位(CFU)的麦芽香肉杆菌或大肠杆菌MG1655，或者将相同体积的BHI每天一次对它们进行灌服，持续12周。通过小鼠结肠镜(Coloview,Karl Stroz，Germany)监测结肠直肠肿瘤的形成。每周收集粪便样品。

致癌物诱导的结肠癌模型

对5周龄雄性常规C57BL/6野生型小鼠，以1周间隔进行6次连续注射偶氮甲烷(AOM；10mg/kg，腹膜内注射)，以诱导散发性CRC。在该AOM模型中使用与Apc^min/+小鼠相同的处理方案。将小鼠饲养至26周以评价益生菌处理功效。所有实验程序都遵循香港中文大学动物伦理委员会批准的指南。

16S rRNA基因测序

通过使用Quick-DNA^TM粪便/土壤微生物微量制备试剂盒(Zymo Research,Irvine,CA)进行小鼠粪便DNA提取和纯化。DNA文库在Illumina MiSeq平台上构建，如我们以前的研究所述⁷。将靶向16S rRNA基因V3-V4高变区的通用引物341F(SEQ ID NO:1:5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和806R(SEQ ID NO:2:5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3')用于测序。P<0.05和log2[倍数变化(FC)]|>1(FC>2或FC<0.5)的细菌OUT被认为是统计学显著的。

代谢组学谱型分析和代谢物分析

代谢组学是由中国上海的BIOTREE进行的。将代谢物转移到新鲜的玻璃小瓶中用于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析。使用装配有UPLC BEH酰胺柱的1290Infinity系列UHPLC系统(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)进行超高效液相色谱(UHPLC)分离。在LC-MS/MS实验过程中，使用TripleTOF 6600质谱(AB Sciex,Foster City,California)以信息依赖为基础获得串联质谱(MS/MS)光谱。代谢物鉴定基于内部MS2数据库、人类代谢组数据库(HMDB，参见网站：hmdb.ca)和METLIN代谢物数据库(参见网站：Metlin.scrippps.edu)。

结肠粘膜中的维生素D浓度

将结肠样品在PBS中洗涤并在匀浆之前在提取缓冲液(2:1甲醇：二氯甲烷)中切开。然后将样品涡旋并以10,000×g离心10分钟。小心地收集上清液，并在37℃在温和的氮气流下蒸发。用ELISA缓冲液重构干燥的样品，并根据制造商的说明书使用维生素D ELISA试剂盒(Cayman，MI，USA)测量1α,25-二羟基维生素D₃(1,25(OH)₂D₃)水平。用放射免疫沉淀测定缓冲液(RIPA)再提取剩余的蛋白质，用于维生素D浓度标准化。

逆转录-定量PCR(RT-qPCR)

使用TRIzol试剂(Life Technologies)从细胞沉淀或结肠组织中提取总RNA。使用具有gDNA Eraser的PrimeScript RT试剂试剂盒(Takara,Shiga,Japan)制备互补DNA(cDNA)。通过QuantStudio^TM 7Flex实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)测定特定基因的相对水平。

蛋白质印迹

分离来自细胞沉淀或结肠组织的总蛋白并通过SDS-PAGE(6％-12％)分离。然后将SDS-PAGE中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(EMD Millipore,Billerica,MA,USA)上约1-2小时，然后在室温下用含10％脱脂奶的0.05％Tris-基盐水-Tween 20封闭2小时。将膜与第一抗体在4℃下孵育过夜，然后与第二抗体在室温孵育1小时。通过ECL Plus蛋白质印迹检测试剂(GE Healthcare)检测蛋白质条带强度。

透射电子显微镜(TEM)

将结肠组织切成小块并固定在含2.0％戊二醛的0.1M二甲胂酸钠(ElectronMicroscopy Sciences,Hatfield,PA)中。在Reichert Ultracut E超微切片机上制备超薄切片。使用Philips CM100 TEM获得组织的超微结构图像。

结肠通透性测定

根据制造商的说明书，通过小鼠LPS酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(中国武汉Cusabio)测量血清中脂多糖(LPS)的水平来测定结肠通透性。

阿尔新蓝-高碘酸希夫(AB-PAS)染色

准备卡诺伊溶液固定的结肠组织用于AB-PAS染色，如我们先前所描述的⁸。简言之，将含有粘液的结肠切片染色为紫红色。在显微镜下以100×放大率，从上皮边缘到粘液分泌层的最外部分垂直于粘膜表面测量粘液分泌层的厚度。对每个样品计数5个随机显微镜视野。

Ki-67免疫组织化学(IHC)染色

石蜡包埋的结肠切片用于Ki-67(Abcam,16667)IHC染色。Ki-67阳性细胞的比例用于测定细胞增殖指数。对每个样品计数五个随机显微镜视野中的一千个细胞。

VDR免疫荧光(IF)染色

将石蜡包埋的结肠切片脱蜡，抗原回收，封闭，并与第一VDR抗体(CellSignaling,12550)一起孵育。在激光扫描共聚焦显微镜(LEICA TCS SP8,Wetzlar，Germany)下测量核VDR的平均荧光强度(MFI)。

癌症基因组图谱(TCGA)数据集中来自RNA-Seq的基因表达谱型分析

结肠腺癌样品的基因表达数据使用TCGAbiolinks R程序包⁹从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中检索。从癌症基因组图谱(TCGA)数据库(The Cancer Genome Altas(TCGA)database)¹⁰下载Fastq格式的结肠腺癌的未比对RNA-seq数据。用Pathseq¹¹管线将那些未比对的RNA-seq读数映射到减去人类读数和低质量之后的肠道相关细菌。预先构建的宿主基因组从/bundle/pathseq/中的GATK Resource Bundle FTP服务器获得。本文所用的微生物参考物包括1520种培养的细菌基因组¹²以及结肠癌的相关细菌，其通过广泛的和统计学严格的验证得到了鉴定^7,13。将由pathseq产生的归一化得分用作每个种类的相对转录物组丰度。本研究满足TCGA提供的出版物指南(参见在网站上的详细描述：cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines)。

统计学分析

对于体内和体外实验，数值表示为平均值±标准偏差(SD)。使用双侧学生t检验进行两组之间的比较。方差分析(ANOVA)用于比较多个组之间的差异，并通过Tukey的多重比较检验进行事后分析。P值<0.05表示统计学显著性。

结果

麦芽香肉杆菌在患有CRC的患者的粪便样品中被消耗

为了进一步验证CRC中麦芽香肉杆菌的丰度降低，用来自39名患有CRC的患者和39名健康个体的粪便样品进行qPCR。如图1A所示，与来自正常受试者的粪便样品相比，来自CRC患者的粪便样品中的麦芽香肉杆菌(P＝0.0055)显著消耗。来自TCGA的存活概率数据进一步揭示，麦芽香肉杆菌的高丰度与CRC患者的更好存活有关(图1B)，表明麦芽香肉杆菌可能的抗CRC作用。

麦芽香肉杆菌抑制结肠癌细胞的活力

为了研究麦芽香肉杆菌在体外的直接肿瘤抑制作用，将CRC细胞系DLD1和HCTLL6以及结肠正常上皮细胞系NCM460分别与麦芽香肉杆菌在有氧条件下以100、200和400的MOI共孵育2小时。大肠杆菌菌株MG1655用作细菌对照。发现麦芽香肉杆菌显著减少了活CRC细胞的数目，但在MOI为200时对正常结肠上皮细胞则没有(图2A-2C)。与此相一致，在MOI为200时的麦芽香肉杆菌处理延缓了处于G₂/M期的CRC细胞的细胞周期进程(图2D)。这些结果表明，CRC消耗的麦芽香肉杆菌可直接抑制CRC细胞增殖。

麦芽香肉杆菌在Apc^min/⁺小鼠中防止肠肿瘤发生

为了验证麦芽香肉杆菌在体内对结肠直肠肿瘤发生的抑制作用，将含有1×10⁸个CFU的麦芽香肉杆菌的200μl细菌悬浮液每天经口灌服5周龄的Apc^min/⁺小鼠，连续12周。使用相同体积的BHI或相同量的大肠杆菌(菌株MG1655)作为对照，并以与麦芽香肉杆菌相同的方式对小鼠施用(图3A)。在收获前进行小鼠结肠镜检查。与大肠杆菌菌株MG1655或BHI处理相比，在麦芽香肉杆菌灌服的小鼠中观察到视觉上减小的肿瘤大小(图3B，上图)。处死后，在麦芽香肉杆菌处理的Apc^min/⁺小鼠的结肠和小肠中都观察到肿瘤数目和肿瘤负荷的显著减少(图3C)。进一步检查肿瘤组织学(图3B，下图)，并且与BHI-和大肠杆菌菌株MG1655处理组相比，在经麦芽香肉杆菌处理的Apc^min/⁺小鼠中也观察到降低比例的Ki-67⁺结肠上皮细胞(图3D)，表明麦芽香肉杆菌可以在Apc^min/⁺小鼠中防止肠肿瘤发生。

麦芽香肉杆菌在AOM诱导的CRC小鼠中防止肠肿瘤发生

为了进一步验证麦芽香肉杆菌的CRC抑制作用，建立了AOM诱导的CRC模型，其中5周龄C57BL/6小鼠每周一次注射致癌物AOM(10mg/kg)，持续6周，随后经口施用麦芽香肉杆菌、大肠杆菌菌株MG1655或BHI，持续26周(图4A)。在结肠镜检查期间在麦芽香肉杆菌处理的小鼠中观察到肿瘤大小的视觉减小(图4B，上图)。在麦芽香肉杆菌处理的小鼠中，肿瘤数目和肿瘤负荷也降低(图4C)。进一步证实了CRC的组织学发生(图4B，下图)，并且还发现在麦芽香肉杆菌处理的小鼠中Ki-67阳性细胞降低(图4D)。这些发现表明麦芽香肉杆菌也可以抑制AOM诱导的CRC小鼠的肠肿瘤发生。

麦芽香肉杆菌在小鼠CRC模型中保持肠道屏障功能并抑制促炎反应

已知肠道屏障功能障碍及其相关炎症反应与CRC3的起始和进展有关³。为了评估麦芽香肉杆菌参与调解肠道屏障功能，分别用RT-qPCR和蛋白质印迹检测了关键紧密连接基因和蛋白质的mRNA和蛋白质表达水平。在Apc^min/⁺小鼠中，施用麦芽香肉杆菌在mRNA(图5A)和蛋白质(图5B)水平显著增加结肠紧密连接调节剂，包括Tjp1(ZO-1)、Ocln(闭合蛋白)和Cdh1(E-钙粘蛋白)。然后测量肠道细菌脂多糖(LPS)向体循环的泄漏以推断肠道屏障功能。发现用麦芽香肉杆菌灌服的Apc^min/+小鼠具有显著较低的LPS血清水平(图5C)。用TEM可视化细胞-细胞连接进一步表明，麦芽香肉杆菌可缩短连接宽度(图5D)。与此同时，通过AB-PAS染色的内粘液层的厚度证实了在麦芽香肉杆菌处理的Apc^min/⁺小鼠中含粘液层的厚度增加(图5E)。为了检测麦芽香肉杆菌在调节炎症反应中的作用，测定了结肠组织中可溶性因子的表达水平。与BHI和大肠杆菌菌株MG1655处理的小鼠相比，施用麦芽香肉杆菌显著降低关键促炎基因(包括白介素(IL)-1β、IL-6和CXC趋化因子受体2(Cxcr-2))的表达。相反，抗炎细胞因子IL-10显著增加(图5F)。一致地，在AOM诱导的CRC模型中观察到由麦芽香肉杆菌引起的编码紧密连接蛋白的基因的表达增加(图5G-5H)，粘液层增厚(图5I)以及促炎反应的降低(图5J)，这证实了麦芽香肉杆菌可以在CRC小鼠中保持肠道屏障功能，表明麦芽香肉杆菌可以在CRC小鼠中降低促炎反应。

麦芽香肉杆菌调节Apc^min/⁺小鼠中的肠道微生物群

为了确定麦芽香肉杆菌接种对肠道微生物群组成的影响，用Apc^min/⁺小鼠粪便样品进行了16S rRNA基因测序。如主坐标分析(PCoA)所揭示的，每日施用麦芽香肉杆菌引起β-多样性的不同趋势(图6A)。与BHI和大肠杆菌菌株MG1655相比，脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)的细菌属在麦芽香肉杆菌灌服的小鼠中显著富集(图6B)。在麦芽香肉杆菌处理的小鼠中，一些充分表征的共生益生菌(包括双歧杆菌，产生丁酸的Rosebutia和梭菌)的丰度显著增加。相反，某些致病性种类，包括分节丝状菌(Candidatus Arthromitus)、普氏菌属、粪球菌属和Dorea，在麦芽香肉杆菌灌服的小鼠中显示出显著降低的丰度(图6C)，这表明麦芽香肉杆菌对肠道微生物群的调节作用与其CRC预防作用有关。

麦芽香肉杆菌增加CRC小鼠模型中维生素D代谢物的丰度

为了确定麦芽香肉杆菌是否可以对代谢组发挥任何作用，通过LC-MS/MS对来自麦芽香肉杆菌处理的Apc^min/⁺小鼠的粪便代谢物进行谱型分析。在Apc^min/⁺小鼠模型中，在麦芽香肉杆菌和对照组中观察到肠道代谢物的显著的总体组成改变(图7A)。与BHI-和大肠杆菌菌株MG1655处理的组相比，发现42种代谢物在经麦芽香肉杆菌处理的Apc^min/⁺小鼠中富集(图7B)。据报道，这些代谢物中的大多数，例如29-正环菠萝烷(norcycloartane)-3,24-二酮、4,4’-亚甲基双(2,6-二叔丁基苯酚)、3-叔丁基-5-甲基儿茶酚、(-)-娃儿藤碱、桦木酸和肉桂酰丙酸酯(cinmyl propiote)具有抗炎/抗癌作用。特别地，在麦芽香肉杆菌处理的小鼠的粪便样品中观察到维生素D代谢物库的富集。进一步的代谢途径富集分析揭示了与两个对照组相比，在麦芽香肉杆菌处理的Apc^min/⁺小鼠中粪便维生素D₃代谢的显著变化(图7C)。1,25(OH)₂D₃是维生素D₃的活性形式，在癌症预防和治疗中起重要作用¹⁴。结肠细胞中相当量的1,25(OH)₂D₃的积累可以达到局部诱导CRC细胞生长抑制的水平¹⁵。由于细胞内1,25(OH)₂D₃浓度可驱动维生素D在细胞生长调节中的生物学作用，进一步检测了麦芽香肉杆菌处理后Apc^min/⁺小鼠中1,25(OH)₂D₃的结肠浓度。如图7D所示，麦芽香肉杆菌显著增加结肠1,25(OH)₂D₃浓度。负责1,25(OH)₂D₃生物合成的酶(CYP2R1、CYP27A1和CYP27B1)也在接受麦芽香肉杆菌的Apc^min/⁺小鼠的结肠组织中上调(图7E)，这表明维生素D代谢在介导麦芽香肉杆菌的CRC抑制作用中的潜在贡献。为了进一步验证这一观察结果，使用来自AOM诱导的CRC模型的粪便样品对粪便代谢变化进行谱型分析。一致地，发现维生素D代谢物，特别是1,25(OH)₂D₃的活性形式在麦芽香肉杆菌处理的AOM诱导的CRC小鼠的粪便样品中显著增加(图7F)。结肠1,25(OH)₂D₃水平(图7G)和负责1,25(OH)₂D₃生物合成的酶(图7H)在麦芽香肉杆菌处理后也显著增加。这些结果表明，麦芽香肉杆菌施用增加了维生素D相关代谢物的粪便丰度，这些代谢物被结肠细胞的酶活化，从而在小鼠CRC模型中诱导1,25(OH)₂D₃的局部累积。

麦芽香肉杆菌在小鼠CRC模型中诱导结肠维生素D受体活性

1,25(OH)₂D₃在结肠细胞中合成和降解，并且当与其受体结合时，具有抗增殖活性¹⁵。为了研究麦芽香肉杆菌对维生素D受体(VDR)的转录活化，在来自不同处理下的Apc^min/⁺小鼠的结肠组织中进行转录组测序(图8A)。发现VDR是唯一改变的胆汁酸受体，与BHI-和大肠杆菌菌株MG1655处理组相比，其在麦芽香肉杆菌处理的Apc^min/⁺小鼠结肠中显著上调(图8B)。一致地，转录物组谱的基因集富集分析(GSEA)揭示，与两个对照组相比，在麦芽香肉杆菌处理的Apc^min/⁺小鼠的结肠组织中VDR信号传导显著富集(图8C)。在麦芽香肉杆菌处理的Apc^min/⁺小鼠中，在mRNA和蛋白水平上进一步证实了VDR的上调(图8D)。然后通过增加的CRAMP水平(图8E)(一种熟知的VDR靶基因⁸)和VDR在麦芽香肉杆菌处理的Apc^min/⁺小鼠结肠组织中的核易位(图8F)来证实了活化的VDR(图8E)。该发现在TCGA群组中进一步验证，其显示出具有较高丰度的麦芽香肉杆菌的CRC患者表现出较高水平的VDR(图8H)。因此，20种VDR靶基因在麦芽香肉杆菌处理的Apc^min/+小鼠中上调，如通过转录组测序所揭示的(图8G)。其中的5种(SLC35A4、ELF4、ELL、AGPAT1和DENND6B)与TCGA数据集中的麦芽香肉杆菌丰度显著相关(图8H)，这表明麦芽香肉杆菌增加结肠1,25(OH)₂D₃水平以诱导Apc^min/+小鼠中VDR的活化。在AOM诱导的CRC模型中进一步验证了VDR的活化。在Apc^min/⁺小鼠中观察到一致的结果，即麦芽香肉杆菌施用增加了结肠组织中的VDR(图9A)及其靶基因(CRAMP)(图9B)的表达并诱导VDR易位进入细胞核(图9C)。总之，这些数据表明麦芽香肉杆菌的肿瘤抑制作用与增加的维生素D代谢物和VDR信号传导的活化有关。

讨论

在本研究中，本发明人证实了麦芽香肉杆菌在CRC患者中消耗并且是预测CRC患者存活的潜在标志物。麦芽香肉杆菌与结肠细胞的共孵育显著抑制CRC细胞中的增殖并诱导细胞周期停滞，但在正常结肠上皮细胞中则没有。在两个鼠CRC动物模型中经口施用麦芽香肉杆菌延缓了肠肿瘤发生，支持了麦芽香肉杆菌的抗CRC功效。

粘膜屏障功能的功能障碍是CRC的共同特征。渗漏的肠道导致共生病原体和抗原不受控制地转移到身体中¹⁶。在本研究中，发现麦芽香肉杆菌通过以下来恢复肠道屏障功能：在小鼠CRC模型中增加包括ZO-1、闭合蛋白和E-钙粘蛋白在内的多种肠道屏障相关生物标志物的表达；增强结肠内粘液层(物理屏障)的厚度，以及降低麦芽香肉杆菌处理的小鼠中的旁细胞间隙和血清LPS水平。健康的屏障功能是肠道内稳态的前提₁₇。屏障的任何扰乱或甚至轻微破坏可触发炎症₃。一致地，在两种小鼠模型中，通过麦芽香肉杆菌处理，IL-1β、IL-6和Cxcr-2的促炎基因显著降低，而抗炎细胞因子IL-10增加。在麦芽香肉杆菌处理组的RNA测序数据中也观察到涉及炎症和癌发生的促炎细胞因子(Spp1、Ccl4、Cxcl9和Ccl5)的表达降低和下调的NF-κB信号传导¹⁸(图10)，这表明麦芽香肉杆菌参与抑制促炎信号传导途径。因此，麦芽香肉杆菌的肿瘤抑制作用与保留的肠道屏障功能和减少的炎症有关是生物学上可行的。

肠道微生物群失调促进CRC的发展^1,19。微生物谱型分析揭示，施用麦芽香肉杆菌显著富集了充分表征的益生菌的丰度，例如脱硫弧菌科，已知其减少硫化氢产生²⁰。理研菌科与促炎细胞因子呈负相关，与肠道屏障蛋白表达呈正相关²¹，其也在属水平上增加了。此外，双歧杆菌，产丁酸盐的Rosebutia、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)和梭菌科在麦芽香肉杆菌灌服的Apc^min/⁺小鼠中在丰度上也增加。另一方面，一些致病种类，包括分节丝状菌²²、普氏菌属²³、粪球菌属²⁴和Dorea²⁵，其可引发过度炎症并促进癌症进展，在麦芽香肉杆菌处理后显著消耗。因此，麦芽香肉杆菌通过增强益生菌的定殖并消耗潜在的CRC相关病原体，至少部分地通过恢复肠道微生物群内稳态来防止CRC。

通过小鼠粪便样品的代谢组谱型分析进一步检验了麦芽香肉杆菌在调节肠道代谢组学中的作用。发现向两种小鼠模型接种麦芽香肉杆菌增加了维生素D代谢物的所有组成成分的水平。维生素D补充已经被认为是CRC预防的潜在策略²⁶。维生素D缺乏与CRC的风险增加有关²⁷。此外，负责肾外产生1,25(OH)₂D₃的酶，包括CYP2R1、CYP27A1和CYP27B1由麦芽香肉杆菌诱导。负责维生素D的大部分生物作用的结肠1,25(OH)₂D₃在麦芽香肉杆菌消耗后显著增加，表明麦芽香肉杆菌通过增加粘膜的1,25(OH)₂D₃浓度抑制肠肿瘤发生的可能性。实际上，CYP27B1(用于生物合成1,25(OH)₂D₃的酶)的多态性决定了CRC的风险²⁸。

VDR是一种转录因子，其参与多种生物学过程，包括调节正常组织中的细胞增殖和分化以及肿瘤细胞中的细胞凋亡²⁹。在CRC中，已经报道VDR通过p21、p27和E-钙粘蛋白的调节参与肿瘤起始和促进³⁰。维生素D₃的活性形式，即1,25(OH)₂D₃通过VDR介导细胞功能³¹。一致地，发现在用麦芽香肉杆菌处理后，Apc^min/⁺小鼠中的VDR信号传导显著上调。因此，这一观察结果支持了麦芽香肉杆菌提高结肠组织中1,25(OH)₂D₃水平，从而活化VDR受体以诱导下游抗CRC信号传导的观点。

总之，本研究揭示了麦芽香肉杆菌的抗CRC作用。麦芽香肉杆菌的肠肿瘤抑制作用与调节的肠道微生物群和代谢物以及保留的肠道屏障功能和减少的粘膜炎症有关。特别地，这种作用与维生素D相关代谢物的诱导和VDR的活化有关。总之，麦芽香肉杆菌可用作预防CRC的新的基于益生菌的预防剂。

实施例Ⅱ：母鸡乳杆菌调节肠道微生物群并产生抗癌代谢物以防止结肠直肠肿瘤发生

发明背景

结肠直肠癌(CRC)是世界第三常被诊断的恶性肿瘤和癌症死亡的第二主要原因³²。存在许多与CRC致癌作用相关的风险因素，包括遗传改变，生活方式和环境因素³³。在过去的十年中，肠道微生物群已经显示出在CRC发展中起关键作用。某些益生菌如嗜热链球菌和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)具有抗致癌特性^34,35。

大多数乳杆菌属种类被分类为乳酸细菌(LAB)。LAB通常存在于发酵食品，例如腐烂的植物和乳制品中，并且它们被广泛接受用作人的益生菌³⁶。LAB对疾病的有益效果已被广泛报道^37,38，临床前研究显示其减少与癌症发展有关的慢性炎症的能力^39,40。使用鸟枪宏基因组测序，本发明人鉴定了益生菌种类母鸡乳杆菌在CRC患者的粪便中显著消耗，表明它可能在抑制CRC中起作用。在本研究中，母鸡乳杆菌显示通过促进细胞凋亡而在小鼠模型、人CRC衍生的类器官和CRC细胞系中消除结肠直肠肿瘤发生。这种肿瘤抑制作用归因于吲哚-3-乳酸，一种由母鸡乳杆菌产生的代谢物。

材料和方法

动物实验

将雄性Apc^Min/+C57B/6转基因小鼠用作自发CRC的小鼠模型⁴¹。将5-6周龄的Apc^Min/+小鼠分成3组：(1)对照；(2)大肠杆菌MG1655；和(3)母鸡乳杆菌。在MRS肉汤(DifcoLaboratories,Detroit,MN)和BHI肉汤中分别培养母鸡乳杆菌和大肠杆菌MG1655。1天后，收集1.0×10⁸个菌落形成单位(CFU)的细菌，并重悬于100μl PBS中。每天给小鼠灌服一次，持续8周，每周检查体重和粪便。

对于偶氮甲烷(AOM)/硫酸葡聚糖钠(DSS)模型，6周龄的雄性C57BL/6小鼠腹膜内注射单剂量10mg/kg AOM(Merck,Darmstadt，Germany)，随后2％DSS(MP Biomedicals,Solon,OH)施用1周。AOM/DSS诱导的CRC小鼠按照相同的时间表灌服上述母鸡乳杆菌和大肠杆菌MG1655悬浮液。

在处死前进行小鼠结肠镜检查(Karl Storz Endoskope,Tuttlingen，Germany)。将结肠镜插入肛门并在直接可视化下向近侧推进，通过吹气促进，并且记录来自每组的结肠肿瘤的代表性图像。灌服8周后，将小鼠麻醉并处死。将小鼠的小肠和结肠纵向打开并用PBS冲洗。记录小肠和结肠中肿瘤的总数。使用先前公开的公式测量每个肿瘤的大小⁴²。所有动物研究根据香港中文大学动物实验伦理委员会批准的指南进行。

母鸡乳杆菌灌服后，Apc^Min/+小鼠粪便样品的DNA提取、16S核糖体DNA基因扩增

Apc^Min/+小鼠粪便样品在用变溶菌素(10U/μl,Sigma-Aldrich)和溶菌酶酶混合物消化后通过珠子打浆来破坏，如我们以前的研究中所述⁷。使用DNeasy PowerSoil试剂盒(Qiagen,Hilden，Germany)进行DNA提取和纯化。使用靶向跨16S rRNA基因V3-V4高变区的通用引物341f(SEQ ID NO:3),5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'和806r(SEQ ID NO:4),5'-GGACTACNNNGGGTATCTAAT-3'，构建了Illumina MiSeq平台上的双向(466bp)测序的扩增子文库。使用NEBNext Ultra DNA Library Pre试剂盒(New England Biolabs,Ipswich,MA)进行文库整理和标准化。

16S rRNA基因序列分析

在Mothur中对原始解复用的FASTQ文件进行预处理⁴³。使用默认参数的Needleman-Wunsch比对算法产生重叠群⁴⁴，并使用NAST算法与SILVA数据库(版本123)比对^45,46。除去具有大于8个核苷酸的均聚物的任何重叠群，并保留映射在相同坐标内的所有重叠群。为了减少扩增子的测序噪声，任何错配差≤2的序列对都被预先聚类。使用从头UChime挑选嵌合序列⁴⁷。使用Greengenes 16S rRNA数据库(13.8)对质量控制后的序列进行分类。真核生物，古细菌，线粒体，叶绿体或未知来源的后序列都被丢弃，然后以97％的同一性阈值归入到操作分类单位(OTU)中。OTU的最低分类注释被定义为具有≥80的共识分配得分。将序列计数表稀释到每个样品的最小读取数(即，44,845个读取)，以减少可变测序深度对下游分析的影响。用单向方差分析进行差异丰度分析。在用于统计学计算的R项目中计算每个OTU和热图的平均倍数变化⁴⁸。

细菌菌株和培养条件

母鸡乳杆菌(ATCC 33199)购自美国型培养物保藏中心(ATCC；Manassas,VA)。大肠杆菌菌株MG1655(ATCC 700926)，一种非致病性人共生肠细菌，被包括作为阴性对照⁴⁹。将母鸡乳杆菌和大肠杆菌MG1655分别在MRS肉汤(Difco Laboratories,Detroit,MN)和BHI肉汤中在37℃下在有氧条件下培养。将细菌以5,000rpm离心10分钟以获得细菌沉淀并重悬于BHI中，然后向小鼠灌服。

母鸡乳杆菌培养物上清液

在培养母鸡乳杆菌或大肠杆菌MG1655 1-2天后，使用NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE)测量各培养基中的细菌浓度。稀释BHI培养物以确保相等浓度的母鸡乳杆菌和大肠杆菌。然后通过以5,000rpm离心10分钟收集培养物上清液，然后用0.22-μm膜无菌过滤。收集滤液并称之为母鸡乳杆菌培养物上清液(LGC)或大肠杆菌MG1655培养物上清液(ECCS)。

使用孔径为3千道尔顿(kDa,Millipore,Bedford,MA)的Amicon Ultra-15离心过滤器单元将细菌培养物上清液分离成低分子量(LMW)和高分子量(HMW)。在摆桶式转子中以4,000g离心30分钟后，在含有LGCS、ECCS或对照肉汤(LMW,10％；HMW，1％)的培养基中培养细胞。将细菌上清液在100℃加热30分钟，或用蛋白酶k(50μg/ml；QIAGEN GmbH,Hilden，Germany)处理。将10％热灭活或蛋白酶k处理的细菌培养物上清液用于MTT测定。

细胞培养物

结肠癌细胞系HCT116和LoVo购自ATCC。正常结肠上皮细胞系NCM460获自INCELL公司(San Antonio,TX)作为对照。将所有细胞在补充了10％胎牛血清(FBS)(Thermo FisherScientific),2mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的高葡萄糖达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Thermo Fisher Scientific)中，在含有5％CO₂的潮湿气氛中培养。

CRC患者来源的类器官培养物

来源于2名患者的CRC类器官(74和816)获自Princess Margaret Living Biobank(Toronto,Ontario,Canada)，并包埋在Matrigel(Corning Inc,Corning,NY)中。每2天更换培养基。培养5天后，通过机械应力和/或TrypLE消化(Sigma-Aldrich)除去Matrigel以暴露类器官。然后收集类器官用于进一步的实验。

细胞活力测定

通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT,Sigma-Aldrich)测定测量细胞活力。将细胞以5.0×10²、1.0×10³和3.0×10³个细胞/孔接种于96孔板上，并在处理前孵育24小时。将细胞在DMEM中培养，其中加入不同浓度(5％、10％或20％)的细菌上清液或单独的细菌(感染复数：MOI 50、100)。对于细菌共培养处理，在有氧条件下共培养2小时后，在MTT测定之前，用补充有10％FBS、1％青霉素-链霉素和20μgml^-1庆大霉素的DMEM替换培养基。通过MTT测定连续5天测量细胞增殖。通过用酶标仪(Multiskan GOMicroplate Spectrophotometer,Thermo Scientific,Vantaa,Finland)测量570nm波长(OD570)的吸光度来测定MTT甲瓒产物的量。

菌落形成测定

将细胞以5.0×10²、1.0×10³和3.0×10³个细胞/孔接种在12孔微量培养板上过夜。然后将20％的LGCS、ECCS或BHI肉汤加入到培养基中并培养14至21天。细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并在甲醇中固定，然后用0.5％结晶紫染色。人工计数菌落并使用公式计算相对菌落形成：相对菌落形成(％)＝(形成的菌落数/对照组中的平均菌落数)×100％。

细胞凋亡测定和细胞周期分析

在处理前24小时将细胞接种在6孔板上，并在含有10％LGCS、ECCS或对照肉汤的培养基中培养。在6孔板上培养CRC患者来源的类器官，并将10％LGCS、ECCS或对照肉汤加入Matrigel和生长培养基。处理后，细胞和类器官分别在0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco-Invitrogen Corp.,Grand Island,NY)和TrypLE中消化。对于细胞凋亡测定，通过用膜联蛋白V-PE和7-氨基放线菌素D(7-AAD)(BD Pharmingen,San Jose,CA)双重染色来评价凋亡细胞的比例。膜联蛋白V-PE和7-AAD染色的组合区分早期凋亡细胞(膜联蛋白V+,7-AAD-)和晚期凋亡细胞(膜联蛋白V+,7-AAD+)。对于细胞周期分析，用10％LGCS、ECCS或对照肉汤处理1天的细胞被固定并用50μg/ml碘化丙啶(PI)(BD Pharmingen)染色。使用FASAria细胞分类器(BD Biosciences,San Jose,CA)分析所有染色细胞的细胞周期。

液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析

代谢组学由中国上海的BIOTREE进行，如实施例I中所述。

色氨酸的高通量靶向代谢组学

通过溶解或稀释每种标准物质以得到1mmol/L的最终浓度来单独制备储备溶液。将每种储备溶液的等分试样转移到Eppendorf管中，形成混合的工作标准溶液。然后通过逐步稀释该混合标准溶液(含有与样品相同浓度的同位素标记的内标混合物)制备一系列校准标准溶液。提取粪便和LGCS-LMW的代谢物，并进行UHPLC-MS/MS分析(BIOTREE,Shanghai,China)。

统计学分析

对于体内和体外实验，数值表示为平均值±标准偏差(SD)。使用双侧学生t检验进行两组之间的比较。ANOVA用于比较多个组之间的差异，并通过Tukey的多重比较检验进行事后分析。P值<0.05表示统计学显著性。

结果

母鸡乳杆菌在Apc^Min/+小鼠中防止肠肿瘤发生

为了研究母鸡乳杆菌对结肠直肠肿瘤发生的作用，首先使用Apc^Min/+小鼠。用母鸡乳杆菌(1.0×10⁸个CFU/小鼠)，非致瘤性大肠杆菌菌株MG1655(1.0×10⁸个CFU/小鼠)作为细菌对照，或纯培养基肉汤每天一次对小鼠灌服8周(图11A)。在灌服期间，各组之间的体重没有差异(图11C)。灌服8周后，母鸡乳杆菌组的血便发病率低于肉汤对照组(p<0.05)(图11C)。结肠镜检查鉴定，母鸡乳杆菌组中的结肠肿瘤大小在视觉上小于大肠杆菌MG1655或肉汤对照组(图11B)。处死后，在用母鸡乳杆菌处理的Apc^Min/+小鼠的结肠中观察到肿瘤数目的显著减少(大肠杆菌，p＝0.034；肉汤对照，p＝0.005)和肿瘤大小的显著减小(大肠杆菌，p<0.05；肉汤对照，p<0.05)(图11E)。在Apc^Min/+小鼠的小肠中，母鸡乳杆菌也显著减少肿瘤数目(大肠杆菌，p＝0.003；肉汤对照，p<0.05)和肿瘤大小(大肠杆菌，p＝0.0012；p<0.05)(图11F)。这些结果表明母鸡乳杆菌在Apc^Min/+小鼠中消除了肠肿瘤发生。

母鸡乳杆菌在AOM/DSS诱导的CRC小鼠中防止肠肿瘤发生

为了验证母鸡乳杆菌对结肠直肠肿瘤发生的肿瘤抑制作用，建立了与结肠炎相关的CRC模型，其中6周龄C57BL/6小鼠经腹膜内注射10mg/kg AOM，随后2％DSS施用1周(图12A)。母鸡乳杆菌显著降低结肠直肠肿瘤数目(大肠杆菌，p<0.05；肉汤对照，p＝0.007)和肿瘤大小(大肠杆菌，p＝0.019；肉汤对照，p＝0.0013)(图12B和12C)，这表明母鸡乳杆菌也抑制AOM/DSS诱导的CRC小鼠中的肠肿瘤发生。

母鸡乳杆菌调节Apc^Min/+小鼠的肠道微生物群

为了研究母鸡乳杆菌对肠道微生物群的影响，对母鸡乳杆菌灌服8周后的Apc^Min/+小鼠粪便样品进行了16S rRNA基因测序。与肉汤对照相比，母鸡乳杆菌组中的微生物丰度显著增加(p<0.05)，而母鸡乳杆菌和大肠杆菌组之间没有差异(图13A)。类似地，尽管与其它两个组相比，来自母鸡乳杆菌灌服的小鼠的粪便的β-多样性具有明显的趋势，但没有统计学显著性(图13B)。然而，母鸡乳杆菌可以增强一些充分表征的共生益生菌的丰度，所述共生益生菌包括瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)和来自拟杆菌门(Bacteroidetes phylum)的OTU(图13C)。此外，与对照组相比，在用母鸡乳杆菌处理的小鼠中，具有致病潜能的种类的一些属，如Alistipes、Allobacullum、Dorea、Odoribacter、Parabacteroides和瘤胃球菌属(Ruminococcus)，显示出显著降低的丰度(图13C)。总之，尽管母鸡乳杆菌不改变总肠道微生物组成，但它丰富了益生菌的丰度并潜在地消减了肠道病原体。

母鸡乳杆菌上清液抑制结肠癌细胞的活力

为了验证母鸡乳杆菌在体内的肿瘤抑制作用，使用两种CRC细胞系(HCT116和LoVo)和正常结肠上皮细胞系(NCM460)作为对照进行体外功能分析。用母鸡乳杆菌的培养物上清液处理以浓度依赖性方式显著降低CRC细胞系的活力，但在正常结肠上皮细胞系中不是这样，如通过细胞活力测定所测定的(图14A-C)。在菌落形成测定中观察到类似的结果，其中与ECCS或肉汤对照组相比，HCT116(ECCS，p＝0.0002；对照肉汤，p＝0.0003)和LoVo(ECCS，p＝0.0001；对照肉汤，p＝7.6×10^-5)显示出菌落显著减少(图14D)。这些数据表明从母鸡乳杆菌分泌的分子可以抑制CRC细胞的活力和菌落形成能力。

母鸡乳杆菌上清液促进CRC细胞的细胞凋亡

为了确定LGCS抑制CRC细胞活力的机制，通过流式细胞术用膜联蛋白V-PE和7-AAD染色定量评估LGCS对细胞凋亡和细胞周期分布的影响。发现了LGCS在CRC细胞系HCT116(ECCS,p＝3.3×10^-6；对照肉汤，p＝5.1×10^-6(图15A)和LoVo(ECCS,p＝1.4×10^-6；对照肉汤，p＝3.6×10^-6)(图15B)中显著促进细胞凋亡，而它对正常上皮结肠细胞NCM460没有影响(图15C)。此外，LGCS的这种凋亡诱导特性在来源于2名患者的CRC类器官上得到证实，74个(ECCS,p＝1.2×10^-5；对照肉汤，p＝0.0001)和816个(ECCS，p＝0.0013；对照肉汤，p＝0.0016)(图15D和15E)。相比之下，LGCS对CRC细胞中的细胞周期分布没有影响(图15F-H)。

从母鸡乳杆菌产生的抗肿瘤分子是分子量<3kDa的非蛋白

为了研究由母鸡乳杆菌产生的负责抗CRC活性的分子的特征，使用3-kDa过滤器单元将细菌培养物上清液分离成LMW(<3kDa)和HMW(>3kDa)级分。仅在用LGCS LMW级分处理的细胞中观察到CRC细胞活力的降低，而LGCS HMW级分对CRC细胞没有抑制作用(图16A)。同时，热灭活的LGCS(图16B)和蛋白酶K处理的LGCS都保留了降低CRC细胞的细胞活力的能力(图16C)。总的来说，这些结果表明，母鸡乳杆菌的抗CRC特性可以由分子量<3kDa的非蛋白分子诱导。

母鸡乳杆菌产生并分解代谢L-色氨酸以释放吲哚-3-乳酸来防止CRC

接下来进行LC-MS/MS以鉴定LGCS-LMW级分中的抗CRC代谢物。主成分分析(PCA)的得分图显示具有LMW的LGCS、ECCS和对照肉汤组的LMW级分之间的清楚分离(图17A)。差异丰度分析显示从母鸡乳杆菌产生的关键产物可能有助于抗CRC作用(图17B)。为了证明母鸡乳杆菌产生的LMW肿瘤抑制分子在某种程度上负责母鸡乳杆菌在体内的抗CRC作用，然后通过使用来自Apc^Min/+小鼠在不同处理下的粪便样品检查肠代谢组学。如PCoA所揭示的，每日施用母鸡乳杆菌引起肠道代谢物的显著的总体组成改变(图17C)。在鉴定的关键产物中，发现四种代谢物，包括棕榈酸、4-吡哆酸、L-色氨酸(Try)和γ-L-谷氨酰-L-谷氨酸在细菌培养物上清液和Apc^Min/+小鼠中重叠(图17D)。值得注意的是，Try是唯一的一种代谢物，其在LGC-LMW级分和母鸡乳杆菌处理的Apc^Min/+小鼠中显著富集，这表明Try可以直接从母鸡乳杆菌分泌的可能性。Try是宿主的必需氨基酸，从饮食中摄入Try可以到达结肠，在结肠中细菌将它们降解成其分解代谢物⁵⁰。一致地，发现母鸡乳杆菌施用在Apc^Min/+小鼠中引起Try分解代谢物，尤其是吲哚衍生物的富集(图17E)。假设母鸡乳杆菌是Try和/或Try分解代谢物生产者。

接下来，通过高通量的靶向Try的代谢谱型分析，寻求进一步证实Try从母鸡乳杆菌的分解代谢和/或产生。关于Try及其下游代谢物的PCA在对照，ECCS和LGCS组之间显示出明显的分离(图18A)。差异丰度分析显示LGCS-LMW中的Try水平降低(图18B)，这表明母鸡乳杆菌的Try分解代谢能力。然后检查Try的分解代谢，并且发现吲哚-3-乳酸(ILA)(其是来自Try的下游分解代谢物之一)，在LGCS-LMW和来自母鸡乳杆菌-处理的Apc^Min/+小鼠的粪便样品富集(图18B-18D)。当暴露于与从母鸡乳杆菌产生的相同量的ILA时，CRC细胞的细胞活力显著降低(图18E)，这表明母鸡乳杆菌可产生Try，并且同时可使用Try产生Try分解代谢物。由母鸡乳杆菌产生的ILA可以至少部分地介导母鸡乳杆菌的肿瘤抑制作用。

讨论

本研究首次证实，经口施用母鸡乳杆菌在Apc^Min/+小鼠中降低了肠肿瘤数目和大小，并且在DSS/AOM诱导的CRC小鼠模型中得到证实，表明母鸡乳杆菌抑制CRC肿瘤发生。从体外实验中，观察到由母鸡乳杆菌产生的小的非蛋白代谢物通过促进细胞凋亡来抑制CRC细胞和CRC患者来源的类器官的生长。

某些益生菌在临床前实验中可以抑制CRC的进展^51-56。例如，活的和热灭活的鼠李糖乳杆菌GG(LGG)通过促进人CRC细胞中的细胞凋亡而具有抗CRC作用⁵⁷。在动物模型中，LGG可以通过增加促凋亡蛋白如Bax、casp3和p53的表达来抑制CRC的发展⁵⁸。几项研究已经表明，定期食用益生菌可以改善不平衡的肠微生物群，从而在肠失调过程中减少慢性炎症的机会和致癌化合物的产生^59-61。

在本研究中，发现母鸡乳杆菌显著富集了充分表征的共生益生菌(例如瑞士乳杆菌和罗伊氏乳杆菌)的丰度，而在用母鸡乳杆菌处理的小鼠中，一些致病潜能种类(例如Alistipes、Allobacullum、Dorea、Odoribacter、Parabacteroides和瘤胃球菌属^62-64)显著消耗。已知罗伊氏乳杆菌通过产生组胺来抑制炎症相关的结肠癌变65。因此，母鸡乳杆菌至少部分地通过富集益生菌的丰度和消耗潜在的CRC病原体来抑制CRC。肠道微生物群在CRC致瘤作用中起关键作用。一项以前的研究表明，移植CRC患者的粪便可促进无菌小鼠(germ-free mice)和接受致癌物AOM的小鼠的肿瘤发生⁶⁶。另一项研究表明，将来自AOM/DSS小鼠的粪便样品移植到无菌小鼠中，与那些含有来自初生健康小鼠的粪便样品的小鼠相比，导致了增加的肿瘤发展⁶⁷。这些研究表明，肠道失调促进肿瘤易感性并且肠微生物群的改变是结肠肿瘤发生的重要决定因素。同时，一些研究发现，益生菌可以改变微生物群的组成以缓解癌症进展。例如，唾液乳杆菌Ren可以通过调节肠微生物群来抑制CRC肿瘤发生^68,69。这些发现共同推断，益生菌如母鸡乳杆菌通过调节肠道微生物组成来抑制CRC发展。

本研究还证明，由母鸡乳杆菌产生的代谢物通过诱导细胞凋亡来抑制CRC细胞生长。使用代谢组分析，揭示了母鸡乳杆菌不仅能产生Try，而且还能分解代谢Try来产生Try分解代谢物。最近的数据表明，肠道微生物群产生的Try分解代谢物是维持肠稳态的重要因素⁵⁰。进一步鉴定，ILA(Try分解代谢物之一)，在LGCS和母鸡乳杆菌处理的Apc^Min/+小鼠中显著增加。ILA被鉴定为由益生菌长双歧杆菌(bifidobacterium longum)分泌的母乳色氨酸的代谢物，以防止肠炎症⁷⁰。此外，据报道，通过肠道微生物产生的ILA通过抑制上皮自噬来减轻小鼠中的结肠炎。CRC受到促进健康的代谢物(例如，短链脂肪酸)的微生物产生与潜在致癌的代谢物(例如，次级胆汁酸)之间的平衡的影响⁷¹。先前的研究已经证明了，益生菌代谢物，特别是由LAB产生的那些的抗致癌特性^72,73。例如，由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)产生的代谢物通过激发抗增殖活性并诱导针对恶性癌细胞的细胞凋亡而表现出选择性细胞毒性⁷⁴。来源于干酪乳杆菌的高铁色素通过抑制JNK信号传导通路对CRC细胞具有强的肿瘤抑制作用⁷⁵。因此，母鸡乳杆菌的抗CRC特征也可以至少部分地有助于其释放的保护性代谢物。然而，从母鸡乳杆菌分泌的ILA是否是CRC抑制的主要代谢物需要进一步研究。

总之，本研究首次证实了母鸡乳杆菌的抗CRC作用。母鸡乳杆菌防止肠的肿瘤发生。这种作用与肠道微生物组成的调节和包括ILA在内的促进癌细胞中的细胞凋亡的保护性代谢物的分泌有关。这些发现可以促进使用益生菌化学预防CRC的治疗策略的发展。

实施例III：母鸡乳杆菌和麦芽香肉杆菌在防止结肠直肠肿瘤发生中的协同作用

发明背景

已经证明单一的CRC消耗的益生菌在小鼠中作为CRC预防的新的预防剂起作用，具有最小的副作用。不同益生菌种类之间的潜在机制是完全不同的。鉴于肿瘤的复杂性和异质性，将不同的益生菌相结合以探讨其协同作用可能是对抗CRC的有力武器。

材料和方法

动物实验

对6周龄的雄性C57BL/6小鼠腹膜内注射10mg/kg AOM(Merck,Darmstadt，Germany)的单剂量，然后施用2％DSS(MP Biomedicals,Solon,OH)1周。DSS处理后，将所有小鼠随机分成5组：(1)BHI；(2)大肠杆菌MG1655(1.0×10⁸个菌落形成单位(CFU))；(3)母鸡乳杆菌(1.0×10⁸个CFU)；(4)麦芽香肉杆菌(1.0×10⁸个CFU)；和(5)母鸡乳杆菌(0.5×10⁸个CFU)+麦芽香肉杆菌(0.5×10⁸个CFU)。每天一次对小鼠灌服，持续20周。在处死前进行小鼠结肠镜检查(Karl Storz Endoskope,Tuttlingen，Germany)。处死后，纵向打开小鼠的结肠并用PBS冲洗。记录结肠中肿瘤的总数。所有程序按照香港中文大学动物实验伦理委员会批准的指南进行。

细菌菌株和培养条件

所有的细菌菌株和培养条件与实施例I和II中使用的相同。

多色流式细胞术分析

如前所述进行多色流式细胞术⁸。简言之，将结肠组织切成小块，并在37℃下在摇床上用含有0.1mg/ml胶原酶D和50U/ml DNase I的汉克氏平衡盐溶液消化30分钟。通过70μm细胞滤器过滤细胞悬浮液，并在500g下离心20分钟。将细胞沉淀重悬于加有1％胎牛血清(FCS)的汉克氏培养基中，用于细胞表面标志物分析。

统计学分析

结果表示为平均值±标准偏差(SD)。ANOVA用于比较多个组之间的差异，并通过Tukey的多重比较检验进行事后分析。P值<0.05表示统计学意义。

母鸡乳杆菌和麦芽香肉杆菌联合协同地防止AOM/DSS诱导的CRC小鼠中的肠肿瘤发生

为了研究母鸡乳杆菌和麦芽香肉杆菌对结肠直肠肿瘤发生的协同作用，将DSS促进的AOM诱导的CRC小鼠随机地用单独的母鸡乳杆菌、单独的麦芽香肉杆菌以及母鸡乳杆菌+麦芽香肉杆菌的组合处理。BHI和非致瘤性大肠杆菌菌株MG1655分别用作纯培养基肉汤和细菌对照(图19A)。在20周灌服后，结肠镜鉴定到益生菌处理组中的结肠肿瘤大小在视觉上小于大肠杆菌MG1655或肉汤对照组(图19B)。根据这一观察结果，在益生菌处理组中观察到结肠炎症的减轻，如结肠长度增加所反映的。施用益生菌显著降低结肠AOM/DSS诱导的CRC小鼠中的肿瘤数目和肿瘤大小(图19C)。最引人注目的是，与单独的母鸡乳杆菌或麦芽香肉杆菌处理相比，组合的母鸡乳杆菌/麦芽香肉杆菌导致结肠肿瘤数目和肿瘤大小的明显降低，这表明组合的母鸡乳杆菌/麦芽香肉杆菌协同地消除AOM/DSS诱导的CRC小鼠中的肠肿瘤发生。

母鸡乳杆菌与麦芽香肉杆菌联合协同地修饰AOM/DSS诱导CRC小鼠中的肿瘤免疫微环境

为了直接解决益生菌对CRC结肠肿瘤免疫微环境的影响，在不同的处理下研究了从AOM/DSS诱导的CRC小鼠结肠分离的肿瘤浸润免疫细胞的组成。与BHI处理或大肠杆菌处理的小鼠相比，在单独用母鸡乳杆菌处理后，观察到B细胞，肿瘤浸润的CD8⁺细胞毒性T细胞的富集和骨髓来源的抑制细胞(MDSC)的消耗。由此，在麦芽香肉杆菌处理的小鼠中积累的可用作“肿瘤杀伤”的天然杀伤(NK)细胞没有渗入母鸡乳杆菌处理的小鼠。此外，单独的麦芽香肉杆菌处理降低了MDSC。值得注意的是，组合的母鸡乳杆菌/麦芽香肉杆菌导致普遍的抗癌免疫调节作用，如通过B细胞、NK细胞、CD8⁺细胞毒性T细胞的上调和MDSC的下调所揭示的(图20)。总的来说，结果表明组合的母鸡乳杆菌/麦芽香肉杆菌影响多种类型的免疫细胞，这将至少部分地介导其协同的肿瘤抑制作用。

讨论

在本研究中，首次证实了经口施用组合的母鸡乳杆菌/麦芽香肉杆菌益生菌混合液以协同方式抑制AOM/DSS小鼠模型中的肿瘤形成，与单独的益生菌处理组相比，在混合液组中观察到肿瘤数目和肿瘤大小的显著降低。此外，许多免疫细胞，包括B细胞，细胞毒性T细胞，NK细胞和MDSC被鉴定为参与混合液处理的小鼠，其将部分介导益生菌混合液的肿瘤抑制作用。这些结果强烈推荐组合的母鸡乳杆菌/麦芽香肉杆菌益生菌混合液作为预防和治疗CRC的治疗策略。

实施例IV：乳酸乳球菌通过分泌氨肽酶抑制结肠直肠肿瘤发生

发明背景

结肠直肠癌(CRC)是世界范围内的第三种最常见的癌症并且构成主要的健康负担。高度保证了开发具有最小毒性的新预防策略。直接与结肠上皮细胞相互作用的益生菌支持了通过使用CRC消耗的益生菌来预防CRC发展的关键作用。使用鸟枪宏基因组测序，与健康受试者相比，乳酸乳球菌被鉴定为在CRC患者的粪便中消耗，这表明在CRC中潜在的保护作用。

在本研究中，乳酸乳球菌在Apc^Min/+小鼠模型，人CRC来源的类器官和CRC细胞系中显示出抑制结肠直肠肿瘤发生。肿瘤抑制作用归因于乳酸乳球菌分泌氨肽酶。

材料和方法

动物实验

5周龄雄性C57BL/6J-Apc^Min/J小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME,USA)，并维持在香港中文大学的动物设施中。将28只小鼠随机分为3组。每天向其施用1.0×10⁸个菌落形成单位(CFU)的乳酸乳球菌、大肠杆菌MG1655或相同体积的BHI，持续12周。在处死前进行小鼠结肠镜检查(Karl Storz Endoskope,Tuttlingen，Germany)。处死后记录小肠和结肠中肿瘤的总数。所有动物研究根据香港中文大学动物实验伦理委员会批准的指南进行。

细菌菌株分离和培养条件

收集健康的人粪便样品并在30分钟内悬浮在PBS中。将获得的悬浮液在打浆机中匀浆并通过100μm滤器过滤以除去更大的颗粒。然后将粪便悬浮液铺板在M17琼脂板上，并在37℃的有氧培养箱中孵育24小时。通过划线板法纯化所有菌落，并且在37℃下在有氧培养箱中在M17肉汤(Thermo Fisher Scientific，West Palm Beach，FL)中单独培养24小时，并且通过PCR用通用引物341F(SEQ ID NO：1：5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’)和806R(SEQ IDNO：2：5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3')，扩增每种分离物的16S rDNA。将PCR产物送去进行DNA测序。乳酸乳球菌是通过对GenBank中的16S rDNA进行blasting而鉴定的。

乳酸乳球菌和大肠杆菌MG1655在BHI肉汤(Thermo Fisher Scientific,WestPalm Beach,FL)中在37℃下在有氧条件下培养。将细菌以5,000rpm离心10分钟以获得细菌沉淀并重悬于BHI中，然后灌服至小鼠。

乳酸乳球菌的培养物上清液

使用NanoDrop分光光度计(NanoDrop Technologies,Wilmington,DE)测量乳酸乳球菌或大肠杆菌MG1655的密度。当光密度(OD)₆₀₀达到0.5时，将细菌培养物上清液离心(5,000rpm,10分钟)并用0.22μm膜滤器过滤。收集滤液并称之为乳酸乳球菌条件培养基(LL.CM)或大肠杆菌MG1655条件培养基(ECCM)。将细菌条件培养基在100℃加热30分钟或用蛋白酶k(PK，50μg/ml；QIAGEN GmbH,Hilden，Germany)处理，用于评价乳酸乳球菌分泌的肿瘤抑制分子的特征。

细胞培养物

结肠癌细胞系HCT116和HT29购自ATCC。正常结肠上皮细胞系NCM460得自INCELLCorporation(San Antonio,TX)作为对照。将所有细胞在补充了10％胎牛血清(FBS)(Thermo Fisher Scientific),2mM L-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的高葡萄糖达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)(Thermo Fisher Scientific)中，在含有5％CO₂的潮湿气氛中培养。

CRC患者来源的类器官培养物

来源于2名患者的CRC类器官(74和828)获自Princess Margaret Living Biobank(Toronto,Ontario,Canada)，并包埋在Matrigel(Corning Inc,Corning,NY)中。使用5％的细菌条件培养基处理类器官。每2天更换培养基。通过使用ImageJ计算类器官的大小。

细胞活力测定

通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT,Sigma-Aldrich)测定测量细胞活力。将1000个细胞接种于96孔板上，并并用细菌条件培养基(5％)处理。通过用酶标仪(Multiskan GO Microplate Spectrophotometer,Thermo Scientific,Vantaa,Finland)测量570nm波长(OD570)的吸光度来测定MTT甲瓒产物的量。

菌落形成测定

将500个细胞接种在12孔微量培养板上过夜，并用细菌条件培养基(5％)处理2周。细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并在甲醇中固定，然后用0.5％结晶紫染色。人工计数菌落。

银染和蛋白质鉴定

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(5％)(SDS-PAGE)解析抗肿瘤分子。按照制造商(Thermo Scientific,Rockford,USA)提供的说明进行银染。染色后，用移液管尖端将>100-kDa级分的特异性条带切离进1.5ml塑料管，按照制造商的说明书(ThermoScientific,Rockford,USA)进行凝胶内消化。对所获得的肽混合物进行质谱(MS)分析。使用Bruker Compass Data Analysis软件处理MS光谱数据，并将生成的峰列表转换为针对Swiss-Prot 51.6数据库的Mascot搜索引擎。氨肽酶被鉴定为潜在的功能蛋白。

统计学分析

结果表示为平均值±标准偏差(SD)。ANOVA用于比较多个组之间的差异，并通过Tukey的多重比较检验进行事后分析。P值<0.05表示统计学意义。

乳酸乳球菌防止Apc^Min/+小鼠中的肠肿瘤发生

为探讨乳酸乳球菌对结肠直肠肿瘤发生的潜在保护作用，给5周龄的Apc^Min/+小鼠经口灌服乳酸乳球菌(1.0×10⁸个CFU/小鼠)或大肠杆菌菌株MG1655(1.0×10⁸个CFU/小鼠)，持续12周。BHI用作纯培养基肉汤对照(图21A)。在灌服期间进行结肠镜检查以监测肿瘤形成(图21B，上图)。进一步检查肿瘤组织学(图21B，下图)，并且在乳酸乳球菌处理的Apc^Min/+小鼠中观察到总肿瘤数目和肿瘤大小的明显降低(图21C)。这些结果表明乳酸乳球菌消除了Apc^Min/+小鼠的肠肿瘤发生。

乳酸乳球菌条件培养基(LL.CM)抑制结肠癌细胞的活力

为了确定乳酸乳球菌的体外肿瘤抑制作用，将结肠癌细胞系(HCT116和HT29)和正常结肠上皮细胞系(NCM460)与或不与LL.CM共培养。如图22A所示，与LL.CM共培养显著降低了CRC细胞系的活力，但在正常结肠上皮细胞系中则没有，如通过MTT测定所测定的。进一步证实了LL.CM对CRC患者来源的类器官的这种抑制作用。观察到LL.CM与BHI和Ec.CM相比显著抑制类器官大小的一致结果(图22B)。这些数据表明，从乳酸乳球菌分泌的分子可以体外抑制CRC细胞的活力。

由乳酸乳球菌产生的抗肿瘤分子是分子量>100kDa的蛋白质

为了确定乳酸乳球菌产生的负责抗CRC活性的分子的特征，通过在100℃加热30分钟使LL.CM失活，LL.CM的抑制作用消失(图23A，上图)。一致地，用蛋白酶K(PK，50μg/mL)消化LL.CM进一步中和LL.CM的肿瘤抑制作用(图23A，下图)，这表明LL.CM中抗肿瘤分子的蛋白质性质。进一步进行菌落形成以证实从LL.CM分离的抗肿瘤级分是蛋白质(图23B)。使用100-kDa过滤单元将LL.CM进一步分离成LMW(<100kDa)和HMW(>100kDa)级分。如图23C所示，仅在用LL.CM HMW级分处理的细胞中观察到CRC细胞活力的降低，而LL.CM LMW级分对CRC细胞没有抑制作用。总的来说，这些结果表明乳酸乳球菌的抗CRC特性可以由一种或多种分子量>100kDa的蛋白质诱导。

乳酸乳球菌产生的抗肿瘤分子含有氨肽酶

通过5％SDS-PAGE和凝胶内消化分离潜在的功能性分泌蛋白，然后通过质谱分析。结果显示氨肽酶在LL.CM>100kDa级分中富集(图24)。这些结果表明乳酸乳球菌分泌的抗肿瘤级分可能是一种氨肽酶。

讨论

在本研究中，证明经口施用乳酸乳球菌可降低Apc^Min/+小鼠中的肠肿瘤数量和大小。进一步的体外实验表明，分子量>100kDa的蛋白质贡献了肿瘤抑制作用，并且该蛋白质可能是氨肽酶。这种健康的人分离的益生菌可以用作预防人中CRC的潜在预防剂，同时具有最小的副作用。

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本申请中引用的所有专利，专利申请和其它出版物，包括GenBank登录号和等同物，通过引用整体并入用于所有目的。

Claims (20)

1.用于治疗或预防受试者中的结肠直肠癌(CRC)的组合物，其包含有效量的(1)母鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、吲哚-3-乳酸(ILA)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)或由乳酸乳球菌产生的分子量大于100kDa的氨肽酶；以及(2)生理学上可接受的赋形剂。

2.如权利要求1所述的组合物，其还包含有效量的麦芽香肉杆菌(Carnobacteriummaltaromaticum)。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其包含有效量的(a)母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌以及(b)麦芽香肉杆菌的组合。

4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其被配制用于经口摄入。

5.如权利要求4所述的组合物，其为食品或饮料物品，或食品或饮料添加剂的形式。

6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，所述组合物为粉末剂、液体、糊剂、霜剂、片剂、胶囊剂或囊片剂的形式。

7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌以每克所述组合物重量约1×10⁸至约1×10¹²个CFU的范围存在。

8.如权利要求2-6中任一项所述的组合物，其中麦芽香肉杆菌以每克所述组合物重量约1×10⁸至约1×10¹²个CFU的范围存在。

9.如权利要求2-8中任一项所述的组合物，其中母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌与麦芽香肉杆菌的CFU比在约1:5至约5:1的范围内。

10.如权利要求9所述的组合物，其以日剂量配制。

11.治疗受试者中的结肠直肠癌或降低受试者中的结肠直肠癌风险的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1所述的组合物。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述组合物包含有效量的(i)母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌(ii)母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌培养物上清液；(iii)ILA，或(iv)由乳酸乳球菌产生的分子量大于100kDa的氨肽酶。

13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述组合物还包含有效量的麦芽香肉杆菌。

14.如权利要求11所述的方法，其中所述施用步骤包括向所述受试者施用第一组合物，并且向所述受试者施用包含有效量的麦芽香肉杆菌的第二组合物，所述第一组合物包含有效量的(i)母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌；(ii)母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌培养物上清液；(iii)ILA；或(iv)由乳酸乳球菌产生的分子量大于100kDa的氨肽酶。

15.如权利要求13或14所述的方法，其中母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌与麦芽香肉杆菌的CFU比在约1:5至约5:1的范围内。

16.如权利要求11-15中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括经口摄入所述组合物。

17.如权利要求11所述的方法，其中所述受试者未被诊断患有结肠炎。

18.用于治疗或预防受试者中的结肠直肠癌的试剂盒，其包含(1)含有第一组合物的第一容器，和(2)含有第二组合物的第二容器，所述第一组合物包含有效量的母鸡乳杆菌、乳酸乳球菌、ILA或由乳酸乳球菌产生的分子量大于100kDa的氨肽酶，所述第二组合物包含有效量的麦芽香肉杆菌。

19.如权利要求18所述的试剂盒，其中母鸡乳杆菌或乳酸乳球菌以每克第一组合物重量约1×10⁸至约1×10¹²个CFU的范围存在于所述第一组合物中，麦芽香肉杆菌以每克第二组合物重量约1×10⁸至约1×10¹²个CFU的范围存在于所述第二组合物中。

20.如权利要求18或19所述的试剂盒，其中所述组合物为粉末剂、液体、糊剂、霜剂、片剂、胶囊剂或囊片剂的形式。

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