NL8901994A - Aminopeptidase. - Google Patents
Aminopeptidase. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8901994A NL8901994A NL8901994A NL8901994A NL8901994A NL 8901994 A NL8901994 A NL 8901994A NL 8901994 A NL8901994 A NL 8901994A NL 8901994 A NL8901994 A NL 8901994A NL 8901994 A NL8901994 A NL 8901994A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- ala
- aminopeptidase
- leu
- gly
- lys
- Prior art date
Links
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 title claims abstract description 105
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 title claims abstract description 103
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims abstract description 24
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 19
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 66
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 31
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 31
- 241000194034 Lactococcus lactis subsp. cremoris Species 0.000 claims description 22
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 17
- VUUNELJIFNFWJC-NSHDSACASA-N (2s)-2,6-diamino-n-(4-nitrophenyl)hexanamide Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 VUUNELJIFNFWJC-NSHDSACASA-N 0.000 claims description 16
- 235000014962 Streptococcus cremoris Nutrition 0.000 claims description 16
- YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M p-chloromercuribenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([Hg]Cl)C=C1 YFZOUMNUDGGHIW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 9
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 claims description 8
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 claims description 8
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 7
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N L-alanyl-L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DEFJQIDDEAULHB-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 5
- 108010056243 alanylalanine Proteins 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- XXAUOPDVAKGRPR-WYCDGMCDSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-azaniumylpropanoyl]amino]propanoyl]amino]propanoyl]amino]propanoyl]amino]propanoate Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XXAUOPDVAKGRPR-WYCDGMCDSA-N 0.000 claims description 4
- CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N Ala-Gly Chemical compound C[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O CXISPYVYMQWFLE-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN IKAIKUBBJHFNBZ-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 4
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 4
- VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N Leu-Gly-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 4
- LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C LCPYQJIKPJDLLB-UWVGGRQHSA-N 0.000 claims description 4
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 claims description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 claims description 4
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 4
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 claims description 4
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 claims description 4
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 claims description 4
- 108010091798 leucylleucine Proteins 0.000 claims description 4
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 235000016046 other dairy product Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 claims description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 4
- BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 claims description 3
- RFJNDTQGEJRBHO-DCAQKATOSA-N Ala-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)[NH3+] RFJNDTQGEJRBHO-DCAQKATOSA-N 0.000 claims description 3
- DNDWZFHLZVYOGF-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DNDWZFHLZVYOGF-KKUMJFAQSA-N 0.000 claims description 3
- 108010017893 alanyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 3
- 108010050475 glycyl-leucyl-tyrosine Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 108010049589 leucyl-leucyl-leucine Proteins 0.000 claims description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 3
- PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N Ala-Glu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O PAIHPOGPJVUFJY-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 2
- ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N 0.000 claims description 2
- AFWYPMDMDYCKMD-KBPBESRZSA-N Gly-Leu-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AFWYPMDMDYCKMD-KBPBESRZSA-N 0.000 claims description 2
- YFGBQHOOROIVKG-FKBYEOEOSA-N Met-enkephalin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 YFGBQHOOROIVKG-FKBYEOEOSA-N 0.000 claims description 2
- 108010042237 Methionine Enkephalin Proteins 0.000 claims description 2
- 108010084094 alanyl-alanyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 claims description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 59
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 59
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 59
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 17
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HQRSUIDICNOLPX-UHFFFAOYSA-M Mersalyl acid Chemical group O[Hg]CC(OC)CNC(=O)C1=CC=CC=C1OCC(O)=O HQRSUIDICNOLPX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 229960000224 mersalyl Drugs 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 108090001081 Dipeptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000004860 Dipeptidases Human genes 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 3
- 102400000967 Bradykinin Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 3
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 108010034897 lentil lectin Proteins 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 2
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN GGLIDLCEPDHEJO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N Ile-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N L-alanyl-L-prolylglycine zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N L-isoleucyl-L-alanine Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C)C(O)=O RCFDOSNHHZGBOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- IEHDJWSAXBGJIP-RYUDHWBXSA-N Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=CC=C1 IEHDJWSAXBGJIP-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 108010084572 phenylalanyl-valine Proteins 0.000 description 2
- BQVCCPGCDUSGOE-UHFFFAOYSA-N phenylarsine oxide Chemical compound O=[As]C1=CC=CC=C1 BQVCCPGCDUSGOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 235000019640 taste Nutrition 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N (2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-1-[(2R)-2-amino-5-carbamimidamidopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-N-[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-amino-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]pentanediamide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N)C1=CC=CC=C1 QDZOEBFLNHCSSF-PFFBOGFISA-N 0.000 description 1
- XMVYSQUPGXSTJR-AAEUAGOBSA-N (2s)-2-[[(2s)-1-phenylmethoxycarbonylpyrrolidine-2-carbonyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)OCC1=CC=CC=C1 XMVYSQUPGXSTJR-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- LEJTXQOVOPDGHS-YOEHRIQHSA-N (2s)-2-[[(2s)-3-phenyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)propanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)OCC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 LEJTXQOVOPDGHS-YOEHRIQHSA-N 0.000 description 1
- LRCZLURYHGISRZ-LBPRGKRZSA-N (2s)-6-azaniumyl-2-[(2-benzamidoacetyl)amino]hexanoate Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 LRCZLURYHGISRZ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PEZMQPADLFXCJJ-ZETCQYMHSA-N 2-[[2-[[(2s)-1-(2-aminoacetyl)pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O PEZMQPADLFXCJJ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N Ala-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- JDIQCVUDDFENPU-ZKWXMUAHSA-N Ala-His-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CNC=N1 JDIQCVUDDFENPU-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IPZQNYYAYVRKKK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- GMGWOTQMUKYZIE-UBHSHLNASA-N Ala-Pro-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 GMGWOTQMUKYZIE-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010033547 Carbonic Anhydrase I Proteins 0.000 description 1
- 102100025518 Carbonic anhydrase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- FVGOGEGGQLNZGH-DZKIICNBSA-N Glu-Val-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 FVGOGEGGQLNZGH-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N Gly-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN XPJBQTCXPJNIFE-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N Isophenergan Chemical compound C1=CC=C2N(CC(C)N(C)C)C3=CC=CC=C3SC2=C1 PWWVAXIEGOYWEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000922202 Lactococcus lactis subsp. cremoris HP Species 0.000 description 1
- 241000194041 Lactococcus lactis subsp. lactis Species 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 1
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400001103 Neurotensin Human genes 0.000 description 1
- 101800001814 Neurotensin Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N Phe-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 108010065081 Phosphorylase b Proteins 0.000 description 1
- HAAQQNHQZBOWFO-LURJTMIESA-N Pro-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 HAAQQNHQZBOWFO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000014969 Streptococcus diacetilactis Nutrition 0.000 description 1
- 102400000096 Substance P Human genes 0.000 description 1
- 101800003906 Substance P Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- LTFLDDDGWOVIHY-NAKRPEOUSA-N Val-Ala-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LTFLDDDGWOVIHY-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- 102100039662 Xaa-Pro dipeptidase Human genes 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- GICLSALZHXCILJ-UHFFFAOYSA-N ctk5a5089 Chemical group NCC(O)=O.NCC(O)=O GICLSALZHXCILJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014048 cultured milk product Nutrition 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N dihydroxy(oxo)silane Chemical compound O[Si](O)=O IJKVHSBPTUYDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 150000004662 dithiols Chemical class 0.000 description 1
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 1
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 108010073628 glutamyl-valyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010026364 glycyl-glycyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010043293 glycyl-prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010082286 glycyl-seryl-alanine Proteins 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000010983 kinetics study Methods 0.000 description 1
- PLBWRAWSHVJPTL-JTQLQIEISA-N l-methionine p-nitroanilide Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 PLBWRAWSHVJPTL-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- -1 leu3 Chemical compound 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 1
- PCJGZPGTCUMMOT-ISULXFBGSA-N neurotensin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 PCJGZPGTCUMMOT-ISULXFBGSA-N 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010064486 phenylalanyl-leucyl-valine Proteins 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 108010066823 proline dipeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108010020755 prolyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- SPOMEWBVWWDQBC-UHFFFAOYSA-K tripotassium;dihydrogen phosphate;hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].OP(O)([O-])=O.OP([O-])([O-])=O SPOMEWBVWWDQBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/11—Aminopeptidases (3.4.11)
- C12Y304/11011—Aminopeptidase (3.4.11.11)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
- A23C19/02—Making cheese curd
- A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
- A23C19/0328—Enzymes other than milk clotting enzymes, e.g. lipase, beta-galactosidase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
- A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
- A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
- A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
- A23L13/40—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof containing additives
- A23L13/48—Addition of, or treatment with, enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/21—Streptococcus, lactococcus
- A23V2400/215—Cremoris
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
TITEL: Aminopeptidase.
De uitvinding heeft betrekking op een aminopeptidase van më.kzuurbacteriën in geïsoleerde vorm, d.w.z. in een overwegend zuivere toestand in verhouding tot de toestand waarin het in vivo in melkzuurbacteriën aanwezig is.
Verder heeft de uitvinding betrekking op getransformeerde organismen, in het bijzonder micro-organismen (bacteriën, maar ook schimmels en gisten), die in staat zijn tot expressie van het desbetreffende aminopeptidase (d.w.z. het aminopeptidase kunnen vormen); op een recombinant polynucleotide, meer in het bijzonder recombinant DNA, d.at de voor het aminopeptidase coderende genetische informatie omvat, alsmede op het gebruik van zo'n recombinant polynucleotide als transformatie-merker; op een werkwijze voor het bereiden van het aminopeptidase door isolatie uit een ruw celvrij extract van een organisme waarin het aminopeptidase tot expressie komt; op het gebruik van het aminopeptidase voor het bereiden van polyklonale en monoklonale antilichamen tegen het aminopeptidase (d.w.z. met affiniteit en/of specificiteit voor het aminopeptidase), alsmede op dergelijke antilichamen als zodanig en op hun gebruik voor het detecteren, verwijderen en/of isoleren van het aminopeptidase; op een werkwijze voor het bereiden van levensmiddelen, zoals kaas en andere zuivelprodukten, vleesprodukten en eiwit-hydrolysaten, waarbij het aminopeptidase wordt toegepast, alsmede op de aldus verkregen levensmiddelen.
Melkzuurbacteriën, in het bijzonder melkzuur-lactococcen zoals Lactococcus lactis subsp. cremoris, lactis en diacetylactis, alsmede andere melkzuurbacteriën zoals Leuconostoc species worden op grote schaal gebruikt in de levensmiddelenindustrie, in het bijzonder in de zuivelindustie voor het bereiden van gefermenteerde melkprodukten zoals kaas. Door de produktie van melkzuur uit lactose wordt het voedingsprodukt verzuurdwaardoor bederf van het voedingsprodukt wordt tegengegaan. Bovendien zijn de bacteriën betrokken bij de ontwikkeling van geur en smaak van het voedingsprodukt. Een belangrijk proces daarbij is de afbraak van eiwitten.
De bacteriën hebben voor groei en voor melkzuur-produktie een voedingsmedium nodig, dat essentiële groeifactoren zoals vitaminen en aminozuren levert.
Melk is een geschikt voedingsmedium en maakt groei tot hoge celdichtheden mogelijk. Het gehalte aan vrije aminozuren is hiervoor in melk echter onvoldoende, zodat de bacteriën voor hun behoefte aan aminozuren aangewezen zijn op hun proteolytisch systeem voor het afbreken van melkeiwitten, in het bijzonder caseïne. Het proteolytisch systeem van melkzuurbacteriën blijft ook na het einde van de groei actief, bijv. in de kaasrijpingsfase waarbij de afbraak van caseïne tot peptiden en vervolgens aminozuren bijdraagt aan de aroma- en smaakontwikkeling van de kaas.
Het proteolytisch systeem van melkzuurlactococcen (ook wel aangeduid als melkzuurstreptococcen; de species Lactococcus lactis subsp. cremoris is identiek aan Streptococcus lactis subsp. cremoris of Streptococcus cremoris) omvat verschillende proteasen en verschillende peptidasen. De proteasen zijn gelocaliseerd in de celwand en binnen de cel van de bactariën, terwijl de peptidasen zich in het medium, in de celwand, en binnen de cel kunnen bevinden.
Totnogtoe zijn slechts enkele peptidasen van lactococcen geïsoleerd en gekarakteriseerd.
Door Hwang et al, Agric. Biol. Chem. ^5_,1981, 159-165 en _46_, 1982, 3049-3053 is een dipeptidase met brede substraatspecificiteit uit Lactococcus lactis subspecies cremoris H61 geïsoleerd. Door Geiss et al., Appl.Micro-biol. Biotechnol. 23, 1985, 79-84 is een celwandgebonden aminopeptidase van _S. cremoris AC^ geëxtraheerd en gezuiverd. Door Desmazeaud en Zevaco, Milchwissen-schaft _34, 1979, 606-610 zijn twee intracellulaire nog niet gekarakteriseerde aminopeptidasen van Lactococcus lactis subspecies diacetylactis geïsoleerd.
Door Exterkate et al., Appl. Environ. Microbiol.
15, 1987, 577-583 is een extracellulair aminopeptidase geïsoleerd uit Lactococcus lactis subsp. cremoris.
Door Kaminogawa et al., Agric. Biol. Chem. 48, 1984, 3035-3040 is een prolidase geïsoleerd uit Lactococcus lactis subsp. cremoris H61. Door Yan et al., Eur. J. Biochem. 163, 1987, 259-265 en Appl. Environ. Microbiol. 53_, 1987, 2296-2302 zijn twee nieuwe endopeptidasen geïsoleerd uit Lactococcus lactis subsp. cremoris H61. Door van Boven et al.,
Appl. Environ. Microbiol. 5_4, 1988, 43-49 is een dipeptidase geïsoleerd uit LactoCoccus lactis subsp. cremoris Wg2.
In de Nederlandse kaasindustrie is Lactococcus lactis subspecies cremoris de belangrijkste melkzuur-bacteriesoort. Een goed inzicht in het proteolytisch systeem van melkzuurlactococcen zoals Lactococcus lactis subspecies cremoris kan bijdragen aan een verbetering van de zuursels (starter cultures) en aan een betere regeling van het rijpingsproces, waardoor bijv. een versnelde kaasrijping kan worden gerealiseerd of het ontstaan van een bittere smaak (vorming van bitterpeptiden) kan worden verhinderd.
Veel basisinformatie wordt gegeven in het proefschrift van R. Otto: "An ecophysiological study of starter streptococci", Rijksuniversiteit te Groningen (1981) en in het proefschrift van J. Hugenholtz: "Population dynamics of mixed starter cultures", Rijksuniversiteit te Groningen (1986). In laatstgenoemde proefschrift, en in het proefschrift van A. van Boven: "The uptake and hydrolysis of peptides by S.cremoris", wordt een nader onderzoek naar het proteolytisch systeem van Lacto- coccus lactis subspecies cremoris Wg2 beschreven.
De onderhavige uitvinding is gebaseerd op een nader onderzoek naar de peptidasen van hactococcus lactis subspecies cremoris Wg2, waarbij een bepaald aminopeptidase werd geïsoleerd en gekarakteriseerd dat nog niet eerder is beschreven. Het aminopeptidase werd uit een ruw celvrij extract van Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2 gezuiverd door DEAE-Sephacel kolomchromatografie gevold door phenyl-Sepharose chromatografie, gelfiltratie en anionenuitwisselings-chromatografie (HPLC). Het aminopeptidase vertoont hydrolyse activiteit ten aanzien van verscheidene peptiden en is, gezien zijn gevoeligheid voor de metaalchelaten vormende verbindingen EDTA en 1,10-phenanthroline een metallo-enzym dat een pH optimum bij ca. 7 en een temperatuuroptimum bij ca. 40°C vertoont. Bij SDS-PAA gel electroforese van het gezuiverde enzym wordt één enkele eiwit band gevonden met een molekuulgewicht van ca. 95 kD. Het enzym ondervindt sterke inhibitie van verbindingen zoals p-chloromercuribenzoaat (pCMB), p-chloromercuribenzeen-sulfonaat (pCMBS), 0-(3-hydroxymercuri-2-methoxypropyl) carbamylphenoxyacetaat (mersalyl), N-ethylmaleimide (NEM) en iodoacetamide, die sulfhydrylgroepen kunnen blokkeren, en is ongevoelig voor disulfidebindingen-reducerende stoffen zoals β-mercaptoethanol en dithiotreitol, alsmede voor phenylarsine oxyde en PMSF. Een kinetiek-onderzoek van de lysine-p-nitro-anilide (lys-pNA) hydrolyse laat zien dat het enzym een relatief lage affiniteit voor dit substraat bezit (Km 0,55 mM), maar een zeer hoog hydrolysesnel- heidsmaximum heeft (Vmax 1000/umol/min. mg. eiwit).
Deze waarde correspondeert met een turnover getal van ca. 1580 sec“l. De pi (isoelektrisch punt) van het enzym is ca. 6,2.
Het nieuwe aminopeptidase volgens de uitvinding verschilt van het door Geiss et al. uit Lactococcus lactis subsp. cremoris AC^ geïsoleerde aminopeptidase in molekuulgewicht en in reactiviteit met metaalionen. Het verschilt in substraatspecificiteit van de eerder door Hwang et al. en van Boven et al. beschreven dipeptidasen en van het door Exterkate et al. uit Lactococcus lactis subsp. cremoris HP geïsoleerde aminopeptidase in molgewicht, substraatspecificiteit, reactiviteit met divalente metaalionen en activiteit in tegenwoordigheid van DTT en β-mercaptoethanol.
Het nieuwe aminopeptidase hydrolyseert verscheidene peptiden, waaronder leu-leu, leu-gly, glu-ala, gly-lys, ile-ala, leu-gly-gly, leu3, ala-val-leu, ala-pro-ala, ala-pro-phe, ala-his-ala, ala-pro-gly, gly-pro-ala, ala3, ala4, alas, lys-pNA, leu-pNA, metenkephaline en bradykinine. Daarentegen blijkt het nieuwe aminopeptidase niet in staat tot significante hydrolyse van dipeptiden, zoals ala-glu, ala-gly, ala-ala, phe-leu en phe-val, die ala en phe als N-terminaal aminozuur bevatten, en tripeptiden die N-terminaal gly-gly bevatten.
Het nieuwe aminopeptidase volgens de uitvinding heeft met de eerder beschreven bekende peptidasen van melkzuurlactococcen gemeen, dat de metaalchelaten-vormer o-phenanthroline een sterke inhibitie van de hydrolyse activiteit geeft, welke activiteit vervolgens kan worden hersteld door toevoeging van bepaalde tweewaardige kationen zoals Zn++ en Co++. Verrassenderwijze blijken echter hogere concentraties van Zn++ weer inhiberend te werken.
Het nieuwe aminopeptidase zou gebruikt kunnen worden om de vorming van een ongewenste bittere smaak tijdens de kaasrijping te voorkomen. Sommige Lactococcus lactis subsp. cremoris stammen blijken immers na afbraak van caseïne verschillende graden van bitterheid te produceren, kennelijk als gevolg van het ophopen van peptiden met een hoog gehalte aan hydrofobe aminozuren die door de peptidasen van de in het zuursel aanwezige bacteriën maar langzaam worden afgebroken. Gebruik van het onderhavige aminopeptidase zou dit probleem kunnen mitigeren.
Verder kan gedacht worden aan gebruik van het aminopeptidase voor andere doeleinden, zoals de klaring van bier en frisdranken, en natuurlijk ook aan gebruik in de DNA-technologie in ruime zin.
De uitvinding wordt op de eerste plaats belichaamd in het aminopeptidase zelf, d.w.z. een aminopeptidase van melkzuurbacteriën in geïsoleerde vorm, gekenmerkt door een molekuulgewicht van 95 kD _+ 5 kD; een isoelektrisch punt van 6,2 + 0,4; een substraatbereik dat diverse dipeptiden, tripeptiden en hoger omvat, waaronder leu-leu, leu-gly, glu-ala, gly-lys, leu-gly-gly, leu-leu-leu, ala-val-leu, gly-leu-tyr, ala-ala-ala, ala-ala-ala-ala, tyr-gly-gly-phe-met, ala-ala-ala-ala-ala, en ala-ala-ala-ala-ala-ala, maar niet ala-ala, ala-glu, en ala-gly? een hydrolyse activiteit ten opzichte van lysyl-p-nitroanilide met een temperatuur optimum bij 40°C +_ 5°C en een pH optimum bij 7 + 0,5; en gevoeligheid voor zowel de metaalchelaatvormers EDTA en 1,10-phenanthroline als voor de sulfhydrylblokkers p-chloromercuribenzoaat, p-chloromercuribenzeensulfonaat, en 0-(3-hydroxymer-curi-2-methoxypropyl)carbamylphenoxyacetaat.
Het aminopeptidase volgens de uitvinding kan verder worden gekenmerkt door de volgende amino-zuursequentie aan het N-terminale uiteinde; ala-val- lys-arg-leu-ile-glu-thr-phe-val-pro-glu-asn-tyr, meer in het bijzonder door de volgende aminozuursequentie aan het N-terminale uiteinde: ala-val-lys-arg-leu- ile-glu-thr-phe-val-pro-glu-asn-tyr-lys-ile-phe-leu- asp-ile-asp-arg-lys, en nog meer in het bijzonder door de volgende aminozuursequentie aan het N-terminale uiteinde: ala-val-lys-arg-leu-ile-glu-thr-phe-val- pro-glu-asn-tyr-lys-ile-phe-leu-asp-ile-asp-arg-lys-
X-thr-lys-ile-lys-gly-gln-val-ala-ile, waarin X
een nog niet bepaald aminozuur voorstelt.
Hoewel het aminopeptidase, dat volgens het experimentele gedeelte feitelijk is geïsoleerd en gekarakteriseerd, afkomstig is van één bepaald organisme, nl. een proteïnase negatieve variant van Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2, omvat de uitvinding ook de overeenkomstige aminopeptidasen van andere melkzuurbacteriën aangezien deze overeenkomstige eigenschappen bezitten en op overeenkomstige wijze uit de bacteriën kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd. Met "overeenkomstige aminopeptidasen" wordt niet bedoeld dat de peptidasen exact gelijk zijn, d.w.z. dezelfde aminozurensequentie hebben, maar wordt veeleer bedoeld dat ze aan de bovenstaand vermelde karakterisering van het aminopeptidase voldoen.
Een meer specifieke uitvoeringsvorm van de uitvinding betreft het aminopeptidase dat afkomstig is van melkzuurlactococcen, in het bijzonder Lactococcus lactis subsp. cremoris, liefst Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2.
Met de woorden "in geïsoleerde vorm" en "afkomstig van" wordt niet beoogd de uitvinding te beperken tot aminopeptidase, dat uit zijn natuurlijke omgeving is geïsoleerd. De uitvinding creëert nl. de mogelijkheid om het aminopeptidase-gen op te sporen en vervolgens met behulp van recombinant DNA technologie produktie van het aminopeptidase in getransformeerde cellen of organismen te realiseren. Daartoe zou men bijv. eerst de aminozuursequentie van het aminopeptidase, of van een deel daarvan (zoals in casu is geschied), kunnen bepalen. Op basis daarvan kunnen met behulp van de genetische code corresponderende DNA sequenties worden afgeleid, waarna geschikte DNA probes kunnen worden gesynthetiseerd waarmee aminopeptidase boodschapper RNA (mRNA) van de cellen kan worden gedetecteerd en geïsoleerd. Dit mRNA kan volgens op zichzelf bekende technieken worden gebruikt voor het bereiden van kopie DNA (cDNA) onder toepassing van enzymen zoals reverse transcriptase en DNA polymerase.
Dit cDNA kan dan met behulp van geschikte vectoren (meestal plasmiden) worden gekloneerd en tot expressie worden gebracht in geschikte gastheercellen, waaruit het geproduceerde aminopeptidase gemakkelijk kan worden gewonnen.
Het aminopeptidase volgens de uitvinding kan derhalve zijn verkregen door isolatie daarvan uit een celmassa, een cultuurmedium of een uitschei-dingsprodukt van melkzuurbacteriën, waarin het aminopeptidase van nature tot expressie komt, of uit een celmassa, een cultuurmedium of een uitschei-dingsprodukt van een organisme, dat door genetische manipulatie het vermogen om het aminopeptidase tot expressie te brengen heeft verworven.
De uitvinding wordt voorts mede belichaamd in organismen, in het bijzonder microorganismen, welke door middel van genetische manipulatie hetzij het voor hen vreemde vermogen hebben verworven om een aminopeptidase volgens de uitvinding tot expressie te brengen, hetzij het vermogen van een sterkere expressie van een aminopeptidase volgens de uitvinding dan zij van nature bezitten, hebben verworven.
Ook wordt de uitvinding belichaamd in een recombinant polynucleotide, in het bijzonder recombinant DNA, omvattende de genetische informatie welke codeert voor een aminopeptidase volgens de uitvinding.
Dit recombinant polynucleotide kan bestaan uit het voor het aminopeptidase coderende gen alleen, of kan tevens regulatiesequenties, zoals bijv. een geschikte transcriptie-promoter, en/of een vectorgedeelte omvatten.
De uitvinding omvat verder het gebruik van een dergelijk recombinant polynucleotide als trans-formatie-merker, waarbij een geslaagde transformatie van een aminopeptidase-negatief organisme wordt geconcludeerd uit expressie van het aminopeptidase, waarvoor het polynucleotide de genetische informatie omvat, welke expressie wordt gedetecteerd met behulp van een geschikt substraat van het aminopeptidase of met behulp van polyklonale of monoklonale antilichamen met affiniteit en/of specificiteit voor het aminopeptidase. Ook het gebruik als transformatie-merker in de vorm van een plasmide dat het aminopeptidase als gen bevat, welk gen door inbrengen van een ander gewenst gen geïnactiveerd wordt behoort tot de uitvinding. Voor de levensmiddelenindustrie biedt deze transformatie-merker (het aminopeptidase-gen) het grote voordeel, dat hij afgeleid is van een bacteriesoort die algemeen als veilig wordt beschouwd (d.w.z. een GRAS organisme).
De uitvinding omvat voorts een werkwijze voor het bereiden van een aminopeptidase volgens de uitvinding, welke werkwijze gekenmerkt wordt doordat een ruw celvrij extract van een organisme, in het bijzonder een microorganisme, waarin het aminopeptidase tot expressie komt, aan een of meer ionenuitwisselaarkolomchromatografie en gelfiltratie stappen wordt onderworpen, waarbij van het in fracties opgevangen eluaat telkens een of meer van de fracties met hydrolyse activiteit ten opzichte van lysyl-, leucyl- of methionyl-p-nitroanilide worden geselecteerd.
Ook creëert de uitvinding de mogelijkheid om antilichamen tegen het aminopeptidase te produceren en vervolgens te gebruiken om het aminopeptidase uit zijn natuurlijke omgeving of uit de bovenstaand bedoelde getransformeerde cellen of organismen te verwijderen of te isoleren.
De uitvinding wordt dan ook mede belichaamd in het gebruik van het nieuwe aminopeptidase voor het bereiden van polyklonale of monoklonale antilichamen met affiniteit en/of specificiteit voor het aminopeptidase, in deze polyklonale en monoklonale antilichamen zelf, en in hun gebruik om het aminopeptidase te detecteren in, dan wel te verwijderen of isoleren uit een mengsel dat het aminopeptidase bevat.
Vanzelfsprekend wordt de uitvinding verder belichaamd in een werkwijze voor het bereiden van levensmiddelen, zoals kaas en andere zuivelprodukten, vleesprodukten en eiwithydrolysaten, waarbij gebruik wordt gemaakt van een aminopeptidase en/of van een organisme volgens de uitvinding. Hierbij kunnen specifieke hydrolyse eigenschappen van het aminopeptidase worden benut, bijv. om de vorming van een bitter aroma tegen te gaan of om een versnelde kaasrijping te realiseren. De werkwijze kan ook het voordeel van lagere produktiekosten hebben, bijv. doordat minder zuursel nodig is. Ook de door deze werkwijze verkregen levensmiddelen worden door de uitvinding omvat, met name wanneer ze zich door een hogere kwaliteit (betere smaak of, meer in het algemeen, betere organoleptische eigenschappen) van bekende produkten onderscheiden.
De uitvinding zal hierna aan de hand van het experimentele gedeelte nader worden toegelicht.
Materialen en methoden
Organisme en bereiding van een celvrij extract.
In de experimenten werd een proteinase-negatieve variant van Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2 gebruikt. Het organisme werd routinematig bewaard in 10% (gew./vol.) steriele gereconstitueerde taptemelk welke 0,1% (gew./vol.) trypton bevatte, bij een temperatuur van -20°C. Voor het kweken van Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2 werd MRS medium (De Man et al., J.Appl.Bacteriol. 23_, 1960, 130-135 ) gebruikt, waarbij de groei plaats vond bij een gecontroleerde pH van 6,3 in een 5 liter fermentor. Cellen werden geoogst bij een Aggonm van 0,8, gewassen in 200 ml 0,05 M kaliumfosfaat (pH 7) en opnieuw gesuspendeerd in 50 ml van deze buffer. Cellen werden door sonicatie (soniprep 150; MSE Scientific Instruments, Crawley, Engeland) gedurende 480 sec.
(8x 15 sec. sonicatie en 45 sec. rust) bij 10 micrometer bij 4°C onder een constante stikstofstroom opengebroken. Door centrifugatie van de opengebroken cellen gedurende 10 min. bij 20.000 g en 4°C werd celextract verkregen.
Enzymbepalingen
Hydrolyse van lysyl-p-nitroanilide werd bepaald volgens de methode van Exterkate, Neth. Milk Diary J. 29^, 1975, 303-318. Een 2 mM oplossing van lysyl-p-nitroanilide werd gedurende 15 minuten geïncubeerd met een geschikte hoeveelheid enzym. De reactie werd gestopt door een toevoeging van azijnzuur tot een eindconcentratie van 10% en de hoeveelheid p-nitroanilide werd gemeten bij 410 nm (Hitachi U-1100 spectrofotometer).
Alle metingen van enzym activiteiten werden uitgevoerd bij 30°C in 20 mM HEPES pH 7, tenzij anders is vermeld.
Hydrolyse van verscheidene peptiden werd gedetecteerd met dunne laag chromatografie (TLC). Peptidase activiteit werd als volgt bepaald: het reactiemengsel dat 2 mM substraat in 20 mM 4-(2-hydroxy-ethyl)-l-piperazine-ethaansulfonzuur (HEPES) pH 7 en een geschikte hoeveelheid enzym bevatte, werd gedurende 60 min. bij 30°C geincubeerd. Het reactiemengsel (10 microliter) werd daarna op een voorbeklede silicagel 60 plaat met een laagdikte van 0,25 cm (Merck, Darmstadt, West Duitsland) aangebracht.
Een 75% (gew./vol.) phenol/water mengsel en in sommige gevallen 4/1/1 (vol./vol./vol.) mengsel van n-butanol, azijnzuur en water werd als mobiele fase gebruikt.
Als controle werd ook 2 mM van elk standaard peptide op de plaat aangebracht. De silicagels werden gekleurd door ze te besproeien met 0,1% (gew./vol.) ninhydrine in 99% ethanol. Peptiden en aminozuren werden zichtbaar na de silicagel gedurende 5 min. bij 80°C in een oven te incuberen.
DEAE-Sephacel kolom chromatografie
Een DEAE-Sephacel kolom (1,6 x 20 cm) werd geëquilibreerd met 10 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 7,0 met 0,12 M NaCl. Het celextract dat na sonicatie en centrifugatie van L.lactis subsp. cremoris Wg2 werd verkregen, werd met gedestilleerd water verdund tot dezelfde ionsterkte als de buffer die gebruikt was voor het equilibreren van de DEAE-Sephacel kolom, en werd vervolgens op de kolom aangebracht.
Na wassen van de kolom met 2 volume-hoeveelheden equilibratie buffer, werd het enzym geëlueerd (40 ml/uur) met een lineaire gradiënt van 0,12 M tot 0,4 M NaCl in dezelfde buffer. Fracties van 3 ml werden verzameld en getest voor lysyl-p-nitroanilide hydrolyse activiteit. De fracties met de hoogste enzym activiteit werden gecombineerd.
Phenyl sepharose chromatografie
Een phenyl-sepharose (CL-4B) kolom (1,8 x 8,5 cm) werd geëquilibreerd met 10 mM K2HP04-KH2P04 pH 7, die 4 M NaCl bevatte. NaCl werd aan de gecombineerde enzymfracties toegevoegd tot dezelfde molariteit als de equilibratie buffer en de enzymoplossing werd op de kolom aangebracht. Na wassen van de kolom met 2 volume hoeveelheden equilibratie buffer, werd het enzym geëlueerc. (35 ml/uur) met een lineaire gradiënt van 4 M NaCl tot 0 M NaCl in 10 mM ^HPO^-Kï^PO^ pH 7. Fracties van 2,5 ml werden verzameld en getest op lysyl-p-nitroanilide-hydrolyse activiteit. Fracties met de hoogste enzymactiviteit werden gecombineerd.
Gel chromatografie op Sephadex G-100 Super Fine
De van de fenyl-sepharose CL-4B kolom verkregen enzym fracties werden geconcentreerd in een Amicon filtratie eenheid met PM-10 en YM-10 membranen (met een grens bij een molekuulgewicht van 10.000;
Amicon Corp., Lexington, Mass.) tot een eindvolume van ongeveer 2 ml en vervolgens aangebracht op een Sephadex G-100 SF kolom die geëquilibreerd werd met 10 mM K^HPC^-KH^C^ (pH 7) die 0,1 M NaCl bevatte. Elutie werd uitgevoerd met dezelfde buffer met een stroomsnelheid van 4 ml/uur, en er werden porties van 2 ml opgevangen. Fracties met de hoogste peptidase activiteiten werden gecombineerd.
High Performance vloeistofchromatografie'? ahionenuitwisse-lingschromatografie
De uit de gelfiltratie verkregen gecombineerde fracties werden opnieuw geconcentreerd tot een volumehoeveelheid van 2,5 ml. In elke gang werd 400 microliter enzyme aangebracht op een HRLC MA7P anionenuitwisselingskolom (50x7,8 mm; Bio-Rad Lab. Richmond, USA) door 4x 100 microliter met tussenpozen van 2 minuten in te spuiten in een constante stroom equilibratie buffer van 20 mM Tris/HCl (pH 7,5) die 125 mM NaCl bevatte. De kolom werd gewassen met 2 ml van dezelfde buffer, en de enzym activiteit werd geëlueerd met een lineaire gradiënt van 0,125 M tot 0,4 M NaCl in 20 mM Tris/HCl pH 7,5. De stroomsnelheid bedroeg 1 ml/min. en piekfracties werden verzameld en getest op peptidase activiteit. HPLC werd uitgevoerd met een Waters 600 Multisolvent Delivery System met een U6K universele vloeistofchromatograaf injector en A280 werd nm gemeten met een lambda Max model 481 LC spectrofotometer (Millipore, Waters Associates, Milford, Mass., USA).
SP S-PAGE
Natriumdodecylsulfaat (SDS)-polyacrylamide gelelectroforese (PAGE) werd uitgevoerd zoals beschreven door Laemmli en Faure, J.Mol.Biol. 80^, 1973, 575-599.
De eiwit monsters werden 4 : 1 gemengd met monster buffer (0,45 M Tris-HCl pH 6,8, 0,75% SDS, 22% glycerol, 2,5% 8-mercaptoethanol en 0,18% broomfenol blauw) en op de gels aangebracht.
Het molekuulgewicht van de enzymen werd geschat met behulp van de volgende referentie-eiwitten: myosine (200 kD), beta-galactosidase (116,2 kD), fosforylase b (97,4 kD), runderserum albumine (66,2 kD), ovalbumine (42,7 kD), runderkoolzuuranhydrase (31 kD), sojabonentrypsine-inhibitor (21,5 kD) en lysozyme (14,4 kD).
De zilverkleuring van de gels werd uitgevoerd volgens Wray et al, Anal. Biochem. 118, 1981, 197-203.
Isoelektrisch focusseren
Voor het isoelektrisch focusseren (IEF) op slab gels werd een Pharmacia Phast Systeem met een kant en klare 5% PAA-gel die pharmalyt 3-10 bevatte (Phastgel; Pharmacia) gebruikt. Het isoelektrisch punt van het enzym werd bepaald onder toepassing van de volgende referenties: linze lectine basisch (pi 8,65), linze lectine-midden (pi 8,45), linze lectine-zuur (pi 8,15), myoglobine-basisch (pi 7,35), humaan koolzuuranhydrase B (pi 6,55 ), runder-koolzuuranhydrase (pi 5,85), beta-lactoglobuline A (pi 5,2). De gels werden automatisch gekleurd volgens het Phast Systeem met Coomassie brilliant blauw.
Effect van tweewaardige kationen en chemische stoffen op de enzym activiteit
Gezuiverd enzym (lS^g/ml) werd gedurende 10 minuten bij 20°C geincubeerd met 200/*iM 1,10-phenanthroline in 20 mM N-2-hydroxyethyl piperazine-N'-2-morfolinoethaansulfonzuur (HEPES) pH 7. Na equilibratie in een cuvette gedurende 5 min. bij 30°C werd 1 mM lysyl-p-nitroanilide toegevoegd. Verscheidene concentraties van tweewaardige kationen werden toegevoegd en de enzym activiteit werd gemeten aan de afgifte van p-nitroanilide, welke spectrofoto-metrisch bij 410 nm in een Hitachi 1100 spectrofoto-meter werd gevolgd.
De effecten van chemische stoffen werden bepaald door 300^1 van een geschikte enzym oplossing (15^g/ml) gedurende 10 minuten bij 20°C te incuberen met verschillende concentraties van verschillende chemische stoffen.
De enzym activiteit werd bepaald volgens de bovenstaand beschreven methode.
Heractivering van de enzym activiteit door reducerende middelen
Gezuiverd enzym (15yU.g/ml) werd gedurende 10 min. bij 20°C vóórgeïncubeerd met 5/UM pCMB of 5mersalyl. Een deel van het behandelde enzym werd opnieuw gedurende 10 min. bij 20°C geincubeerd met lOO^M dithiotreitol (DTT) of ΙΟΟ,ηΜ β -mercapto-ethanol, voordat lysyl-p-nitroanilide werd toegevoegd.
De enzym activiteit werd bepaald (15 min. 30°C) aan de afgifte van p-nitroanilide en spectrofotometrisch gemeten bij 410 nm.
Bepaling van de aminozuurvolgorde aan de N-terminus van het eiwit.
De eiwitsequentie werd bepaald door middel van de Edman afbraakmethode onder toepassing van een Applied Biosystems model 477A puls-vloeistof sequencer. Monsters werden bereid door electroblotten op polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen volgens Matsudaira, J.Biol.Chem.262, 1987, 10035-10038; en na kleuren met Coomas blauw werd direct de aminozuurvolgorde bepaald.
Eiwitbepaling
Eiwitconcentraties werden bepaald met de methode van Lowry et al., J.Biol.Chem. 193, 1951, 265-275; met behulp van runderserum albumine als standaard.
Chemicaliën
Alle toegepaste chemicaliën waren in de handel verkrijgbare stoffen van reagent kwaliteit.
RESULTATEN
Met behulp van verschillende methoden kon een aminopeptidase van Lactococcus lactis subsp. cremoris Wg2 tot homogeniteit worden opgezuiverd.
Een snelle en gemakkelijke procedure bestond uit de volgende stappen.
Enzymzuivering Stap a.
Het ruwe celvrije extract werd aangebracht op een DEAE-Sephacel kolom. Na elutie met een NaCl gradiënt werden lysyl-p-nitroanilide hydrolyse activiteiten verkregen in verschillende fracties bij 0,18-0,2 M NaCl.
Stap b.
De actieve fracties werden gecombineerd, 4M NaCl werd toegevoegd waarna de enzym oplossing werd aangebracht op een fenyl-Sepharose kolom. Na elutie met een omgekeerde NaCl gradiënt (4 M-0 M) werd de activiteit ten opzichte van lysyl-p-nitroanilide gevonden in een piek die bij 50 mM NaCl was geëlueerd. Stap c.
De aminopeptidase bevattende fracties werden gecombineerd en geconcentreerd in een filtratieëenheid met een PM-10 en YM-10 membraan (met een grens bij een molekuulgewicht van 10000; Amicon Corporation, Lexington, Mass.) tot een volume van 2,1 ml. Vervolgens werd 0,5 ml glycerol toegevoegd en werd het monster verder gezuiverd over een G-100 SF gelfiltratiekolom. Stap d.
Voor de laatste stap werden de gecombineerde aminopeptidasefracties geconcentreerd tot een volume van 2,6 ml en aangebracht op een HPLC MA7P anionenuit-wisselingskolom (Bio Rad). Het zuivere enzym werd geëlueerd bij 0,35 M NaCl in Tris/HCl (pH 7,5) bij een retentietijd van 13 tot 15 min. De resultaten van de enzymopzuivering zijn in Tabel A samengevat.
Met behulp van deze procedure kon het enzym ongeveer 32-voudig worden opgezuiverd met een opbrengst van 12% uit het ruwe extract.
Molekuulgewicht en isoelektrisch punt
Op SDS-PAGE gaf het gezuiverde enzym slechts één band, zelfs in tegenwoordigheid van β-mercapto-ethanol. Het molekuulgewicht werd geschat op 95000. Hetzelfde resultaat werd verkregen onder denaturerende en natieve omstandigheden, hetgeen erop wijst dat het enzym waarschijnlijk een uit één enkele subeenheid bestaand monomeer is.
De pi van het enzym werd geschat op 6,2 volgens isoelektrisch focusseren op een Pharmacia Phast systeem 5% PAA-gel welke pharmalyt 3-10 bevatte.
Temperatuursafhankelijkheid en invloed van de pH op de en2ym activiteit
Het effect van de temperatuur op de aminopepti-daseactiviteit werd gemeten in het bereik van 5 tot 80°C. Het enzym mengsel werd geëquilibreerd gedurende 5 min. bij de testtemperaturen voordat lysyl-p-nitroanilide werd toegevoegd. De optimale temperatuur voor de lysyl-p NA-hydrolyse activiteit bleek 40°C te zijn. Bij 55°C werd een activiteit gemeten die slechts 10% van de optimale activiteit bedroeg.
Het effect van de pH werd bepaald in het pH bereik van 4 tot 10 onder toepassing van een buffer die bestond uit 20 mM van elk van de stoffen appelzuur, 2-(N-morfolino.) ethaansulfonzuur (MES), HEPES en boorzuur, en met kaliumhydroxyde werd ingesteld op de geschikte pH waarde De optimale pH voor hydrolyse van lysyl-pNA bleek een pH van 7 te zijn. Bij waarden beneden pH 5 en boven pH 9 kon geen hydrolyseactiviteit van het enzym worden gedetecteerd.
Substraat specificiteit
De specificiteit van het aminopeptidase ten opzichte van verscheidene peptiden wordt in Tabel B samengevat. De hydrolyseprodukten werden geanalyseerd met dunne laag chromatografie (TLC). Het enzym was actief ten opzichte van verscheidene peptiden, maar niet ten opzichte van dipeptiden die aan het N-uiteinde proline, alanine of phenylalanine bevatten. Ook kon een hydrolyseactiviteit van ver- scheidene tripeptiden worden waargenomen, maar niet bij tripeptiden die aan het N-uiteinde proline of glycine-glycine bevatten.
In tegenstelling tot de hydrolysewerking ten opzichte van dipeptiden met N-terminaal alanine, bleek het aminopeptidase wel in staat tot hydrolyse van tripeptiden met N-eindstandig alanine, hetgeen aangeeft dat het enzym meer affiniteit voor oligopep-tiden dan voor dipeptiden heeft. Deze aanname wordt ondersteund door de waarneming dat het enzym actief is ten opzichte van verschillende poly-alanines maar niet ten opzichte van alanyl-alanine.
Het enzym kan ook werken op verschillende grote biologisch actieve peptiden zoals metenkaphaline en bradykinine, maar lijkt niet in staat tot hydrolyse van specifieke carboxypeptidase substraten zoals benzoyl-glycyl-lysine, carbobenzoxy-phenylalanyl-alanine en carbobenzoxy-prolyl-alanine. Tabel C laat de relatieve hydrolysesnelheden door het enzym van verschillende substraten met C-terminaal p-nitroanilide zien. De hoogste activiteit werd gevonden voor lysyl-p-nitroanilide en in een mindere mate voor leucyl-p-nitroanilide. Deze waarneming duidt erop dat dit enzym een aminopeptidase is.
De affiniteit van het enzym voor lysyl-p-nitro-anilide werd bepaald. De Lineweaver-Burk plot duidt op een Km voor lysyl-pNA van 0,55 mM met een maximale peptidehydrolysesnelheid van 1 millimol/min./mg.
Invloed van metaalionen op de enzymactiviteit
Behandeling van het enzym met de metaalchelaten-vormende middelen EDTA en 1,10-phenantroline leidde tot een volledig inhibitie van de enzym activiteit.
De activiteit van het met 1,10-phenantroline behandelde enzym kon voor resp. 88% en 80% worden hersteld door de toevoeging van ZnCl2 resp. 50^Μ CoCl2-
Zinkionen bleken de meest effectieve stimulator te zijn, maar bij concentraties van meer dan 100/UM leidden ze tot inhibitie. Andere metaalionen zoals Cu++,Ca++, Mg++, Mn++ en Fe++ konden de enzymactiviteit niet herstellen. Aan de andere kant kon met geen van de tweewaardige kationen de activiteit worden hersteld wanneer het enzym behandeld was met EDTA.
De inhibitoire werking van verschillende tweewaardige kationen op de enzym activiteit werd eveneens onderzocht. Toevoegingen van 25/hM CUCI2 en 25pK Cd(NC>3)2 gaven een inhibitie van de activiteit van resp. 8% en 35%. ZnC^ en FeClj (ÏOO^M) gaven eveneens inhibitie van de enzymactiviteit, maar in een mindere mate van resp. 32% en 60%. Divalente calcium, magnesium en mangaanionen hadden in het geheel geen inhibitoire werking. Alle metaalionen behalve Cd++ werden toegevoegd in de vorm van chloriden om een eventuele invloed van de anionen te verhinderen. De resultaten geven aan dat de aminopeptidase activiteit afhankelijk is van de tweewaardige kationen Zn++ en Co++.
Effect van verscheidene chemische reagentia
De effecten op de aminopeptidase activiteit van verschillende reagentia op sulfhydrylgroepen en thiolgroepen werden onderzocht. De aminopeptidase activiteit werd volledig geremd door de sulfhydrylgroepen blokkerende reagentia p-chloromercuribenzoaat (pCMB), p-chloromercuribenzeensulfonaat (p-CMBS) en 0-(3-hydroxymercuri-2-methoxypropyl) carbamyl-phenoxyacetaat (mersalyl). Sulfhydrylgroep reagentia zoals jodoacetamide en N-ethylmaleimide (NEM) hadden eveneens een inhibitoire werking op de enzym activiteit, maar alleen bij hogere concentraties.
Fenylarsineoxyde, een dithiol reagens, had bij 2,5 mM in het geheel geen effect op de hydrolyse activiteit van het enzym. Disulfide reducerende middelen zoals dithiotreitol (DTT) en beta-mercapto-ethanol hadden eveneens geen inhibitoire werking op de enzym activiteit. Deze resultaten suggereren dat de hydrolyse activiteit afhankelijk is van één of meerdere reactieve SH'groepen in het eiwit.
Dit werd bevestigd door experimenten waarbij de inactiverende invloeden van pCMB en mersalyl volledig teniet werden gedaan door DTT of beta-mercaptoethanol.
De resultaten zijn samengevat in Tabel D.
Bepaling van de aminozuurvolqorde aan de N-terminus van het peptidase
In Tabel Ewordt de sequentie van het N-terminale deel van het gezuiverde enzym weergegeven. De sequentie-bepaling werd uitgevoerd met een puls-vloeistof ("gasfase") sequencer. Tot op heden konden 33 amino-zuurresten worden geanalyseerd, waarvan de onderstreepte aminozuren nog niet helemaal zeker zijn.
Tabel A; Zuivering van een lysyl-p-nitroanilide aminopep-tidase van L.lactis subsp. cremoris Wg2
Zuiverings- Totaal Totale * Opbrengst Speci- Zuive- stap eiwit activiteit (%) fieke ring activi- (voudig) (mg) x 103 teit **
Celextract 904 108 100 120 1 DEAE-Sephacel 81.8 65.6 61 800 6.6
Phenyl-Seph. 27.4 35.7 33 1300 10.8 G-100 SF. 15.4 21.5 20 1400 11.6 MA7P (HPLC) 3.3 12.7 12 3900 31.6 * ) Totale activiteit is uitgedrukt als ,umol p-nitroanilide, vrijkomend per minuut ' ** ) Specifieke activiteit is uitgedrukt als ,umol p-nitroanilide, vrijkomend per mg eiwit per minuut
Tabel B: Substraat specificiteit van een aminopeptidase van L.lactis subsp. cremoris Wg2. Hydrolyse van peptiden werd geanalyseerd door dunnelaag chroma-tografie (TLC).
Substraat Activiteit Substraat activiteit
Leu-Leu + Leu-Gly-Gly +
Leu-Gly + Leu-Leu-Leu +
Ala-Glu - Ala-Val-Leu +
Ala-Gly - Ala-Pro-Ala +
Ala-Ala - Ala-Pro-Phe +
Glu-Val - Ala-His-Ala +
Glu-Ala + Ala-Pro-Gly +
Gly-Lys + Glu-Val-Phe
Ile-Ala + Gly-Pro-Ala +
Phe-Leu - Gly-Leu-Tyr +
Phe-Val - Gly-Phe-Leu +
Pro-Met - Gly-Ser-Ala
Gly-Gly-Leu
Ala2 - Gly-Gly-Phe
Ala3 + Gly-Gly-Gly
Ala^ + Pro-Gly-Gly
Ala,- + Phe-Gly-Gly
Ala^ + Gly-Pro-Gly-Gly
Metenkaphaline + Neurotensine +
Bradykinine + Glucagon +
Stof P + + : hydrolyse - : geen hydrolyse waarneembaar
Tabel C; Relatieve activiteit van het peptidase t.o.v. verscheidene X-p-nitroanilide peptiden.
Substraat relatieve Substraat relatieve activiteit activiteit (%) (%)
Lys-pNA 100 Phe-pNA 4
Leu-pNA 24 Gly-pNA < 1
Met-pNA 8
Glu-pNA < 1 Gly-Arg-pNA < 1
Ala-pNA 4 Ala-Pro-pNA 4
Pro-pNA < 1 Ala-Ala-Ala-pNA < 1
Tabel D: Effect van pCMB/DTT en mersalyl/β -mercaptoethanol op de peptidase activiteit.
Gezuiverd enzym (15 ,ug/ml) werd voorgeïncubeerd gedurende 10 min bij 20°C met 5,uM pCMB of 5 ,uM mesalyl. Een deel van het behandelde enzym werd opnieuw gedurende 10 min bij 20°C geincubeerd met 100 ,uM di-thiotreitol (DTT) of 100,uM β-mercaptoethanol, voordat lysyl-p-nitroanilide/werd toegevoegd.
De afgifte van p-nitroanilide werd spectrofotometrisch gevolgd bij 410 nm.
Toevoegingen % activiteit geen toevoegingen 100 5/UM pCMB 29 5/UM pCMB + 100/UM DTT 105 5^uM mersalyl 34 5^.uM mersalyl + lOO^uM β-merc.eth. 110
Tabel E: De N-terminale aminozuren sequentie van het gezuiverde aminopeptidase van L.lactis subsp. cremoris Wg2.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Ala-Val-Lys-Arg-Leu-Ile-Glu-Thr-Phe-Val-Pro-Glu-Asn-Tyr-Lys-16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Ile-Phe-Leu-Asp-Ile-Asp-Arq-Lys- ? -Thr-Lys-Ile-Lys-Gly-Gln-31 32 33
Val-Ala-Ile.......
Claims (18)
1. Aminopeptidase van melkzuurbacteriën in geïsoleerde vorm, gekenmerkt door een molekuulgewicht van 95 kD ± 5 kD; een iso-elektrisch punt van 6,2 ± 0,4; een substraatbereik dat diverse dipeptiden, tripeptiden en hoger omvat, waaronder leu-leu, leu-gly, glu-ala, gly-lys, leu-gly-gly, leu-leu-leu, ala-val-leu, gly-leu-tyr, ala-ala-ala, ala-ala-ala-ala, tyr-gly-gly-phe-met, ala-ala-ala-ala-ala, en ala-ala-ala-ala-ala-ala, maar niet ala-ala, ala-glu, en ala-gly; een hydrolyse activiteit ten opzichte van lysyl-p-nitroanilide met een temperatuur optimum bij 40 °C ± 5 °C en een pH optimum bij 7 ± 0,5; en gevoeligheid voor zowel de metaalchelaatvormers EDTA en 1,10-phenanthroline als voor de sulfhydrylblokkers p-chloromercuribenzoaat, p-chloromercuriben-zeensulfonaat, en 0-(3-hydroxymercuri-2-methoxypropyl)carbamyl-phenoxyacetaat.
2. Aminopeptidase volgens conclusie 1, gekenmerkt door de volgende aminozuursequentie aan het N-terminale uiteinde: ala-val-lys-arg-leu-ile-glu-thr-phe-val-pro-glu-asn-tyr.
3. Aminopeptidase volgens conclusie 1, gekenmerkt door de volgende aminozuursequentie aan het N-terminale uiteinde: ala-val-lys-arg-leu-ile-glu-thr-phe-val-pró-glu-asn-tyr-lys-ile-phe-leu-asp-ile-asp-arg-lys.
4. Aminopeptidase volgens conclusie 1, gekenmerkt door de volgende aminozuursequentie aan het N-terminale uiteinde: ala-val-lys-arg-leu-ile-glu-thr-phe-val-pro-glu-asn-tyr-lys-ile-phe-leu-asp-ile-asp-arg-lys-X-thr-lys-ile-lys-gly-gln-val-ala-ile, waarin X een nog niet bepaald aminozuur voorstelt.
5. Aminopeptidase volgens een van de conclusies 1-4, afkomstig van melkzuur lactococcen.
6. Aminopeptidase volgens conclusie 5, dat afkomstig is van de melkzuur lactococ Lactococcus lactis.
7. Aminopeptidase volgens conclusie 5, dat afkomstig is van de melkzuur lactococ Lactococcus lactis subsp. cremoris.
8. Aminopeptidase volgens conclusie 5, dat afkomstig is van de melkzuur lactococ Lactococcus lactis subsp. cre.mO.Els Wg2.
9. Aminopeptidase volgens een van de conclusies 1-8, verkregen door isolatie daarvan uit een celmassa, een cultuurmedium of een uitscheidingsprodukt van melkzuurbacteriën, waarin het aminopeptidase van nature tot expressie komt, of uit een celmassa, een cultuurmedium of een uitscheidingsprodukt van een organisme, dat door genetische manipulatie het vermogen om het aminopeptidase tot expressie te brengen heeft verworven.
10. Organismen, in het bijzonder microorganismen, welke door middel van genetische manipulatie hetzij het voor hen vreemde vermogen hebben verworven om een aminopeptidase volgens een van de conclusies 1-9 tot expressie te brengen, hetzij het vermogen van een sterkere expressie van een aminopeptidase volgens een van de conclusies 1-9 dan zij van nature bezitten, hebben verworven.
11. Recombinant polynucleotide, in het bijzonder recombinant DNA, omvattende de genetische informatie welke codeert voor een aminopeptidase volgens een van de conclusies 1-9.
12. Werkwijze voor het bereiden van een aminopeptidase volgens een van de conclusies 1-9, met het kenmerk, dat een ruw celvrij extract van een organisme, in het bijzonder een mieroorganisme, waarin het aminopeptidase tot expressie komt, aan een of meer ionenuitwisselaar-kolomchromatografie en gelfiltratie stappen wordt onderworpen, waarbij van het in fracties opgevangen eluaat telkens een of meer van de fracties met hydrolyse activiteit ten opzichte van lysyl-p-nitroanilide worden geselecteerd.
13. Gebruik van een aminopeptidase volgens een van de conclusies 1-9 voor het bereiden van polyklonale of monoklonale antilichamen met affiniteit en/of specificiteit voor het aminopeptidase.
14. Polyklonale en monoklonale antilichamen met affiniteit en/of specificiteit voor een aminopeptidase volgens een van de conclusies 1-9.
15. Gebruik van polyklonale of monoklonale antilichamen volgens conclusie 14 voor het detecteren, verwijderen en/of isoleren van het aminopeptidase.
16. Gebruik van een recombinant polynucleotide volgens conclusie 11 als transformatie-merker, waarbij de expressie van het aminopeptidase, waarvoor het polynucleotide de genetische informatie omvat, gedetecteerd wordt met behulp van een geschikt substraat van het aminopeptidase of met behulp van polyklonale of monoklonale antilichamen met affiniteit en/of specificiteit voor het aminopeptidase.
17. Werkwijze voor het bereiden van levensmiddelen, zoals kaas en andere zuivelprodukten, vleesprodukten en eiwithydrolysaten, met het kenmerk, dat daarbij gebruik wordt gemaakt van een aminopeptidase volgens een van de conclusies 1-9 en/of van een organisme volgens conclusie 10.
18. Levensmiddelen, zoals kaas en andere zuivelprodukten, vleesprodukten en eiwithydrolysaten, welke verkregen zijn onder toepassing van een aminopeptidase volgens een van de conclusies 1-9 en/of van een organisme volgens conclusie 10.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8901994A NL8901994A (nl) | 1989-08-02 | 1989-08-02 | Aminopeptidase. |
| ES90202098T ES2068993T3 (es) | 1989-08-02 | 1990-08-01 | Aminopeptidasa. |
| DE69015737T DE69015737T2 (de) | 1989-08-02 | 1990-08-01 | Aminopeptidase. |
| EP90202098A EP0415470B1 (en) | 1989-08-02 | 1990-08-01 | Aminopeptidase |
| DK90202098.1T DK0415470T3 (da) | 1989-08-02 | 1990-08-01 | Aminopeptidase |
| AT90202098T ATE116685T1 (de) | 1989-08-02 | 1990-08-01 | Aminopeptidase. |
| GR940403513T GR3015205T3 (en) | 1989-08-02 | 1995-02-28 | Aminopeptidase. |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8901994 | 1989-08-02 | ||
| NL8901994A NL8901994A (nl) | 1989-08-02 | 1989-08-02 | Aminopeptidase. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8901994A true NL8901994A (nl) | 1991-03-01 |
Family
ID=19855136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8901994A NL8901994A (nl) | 1989-08-02 | 1989-08-02 | Aminopeptidase. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0415470B1 (nl) |
| AT (1) | ATE116685T1 (nl) |
| DE (1) | DE69015737T2 (nl) |
| DK (1) | DK0415470T3 (nl) |
| ES (1) | ES2068993T3 (nl) |
| GR (1) | GR3015205T3 (nl) |
| NL (1) | NL8901994A (nl) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2694766B1 (fr) * | 1992-08-13 | 1994-12-23 | Agronomique Inst Nat Rech | Clônage du gène de structure d'une aminopeptiddase de lactococcus lactis, production et utilisations de ladite aminopeptidase. |
| WO1996038549A1 (en) | 1995-05-31 | 1996-12-05 | Gist-Brocades B.V. | Production of aminopeptidases from aspergillus niger |
| NL1005037C2 (nl) * | 1997-01-17 | 1998-07-20 | Nl Zuivelonderzoek Inst | Werkwijze voor het selectief afbreken van melkeiwit, in het bijzonder voor het selectief hydrolyseren van caseïne/caseïnaat in aanwezigheid van andere melkeiwitten, in het bijzonder wei-eiwitten. |
| WO2000040746A1 (en) * | 1999-01-08 | 2000-07-13 | Medical Analysis Systems, Inc. | Compositions and methods for stabilizing thiol-containing biomolecules |
| EP1223813B1 (en) * | 1999-10-28 | 2013-04-10 | DSM IP Assets B.V. | Process for producing cheese by using attenuated kluyveromyces lactis cells |
| CN115702908A (zh) * | 2021-08-05 | 2023-02-17 | 香港中文大学 | 用于治疗和预防结肠直肠癌的益生菌组合物 |
| CN116218711B (zh) * | 2022-12-21 | 2024-02-06 | 陕西省微生物研究所 | 一株乳酸乳球菌pz1及其在制备富硒低聚肽中的应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8700767A (nl) * | 1987-04-01 | 1988-11-01 | Groningen Science Park | Dipeptidase, isolering daarvan uit melkzuurbacterien, antilichamen tegen het dipeptidase, gebruik van het dipeptidase en van de antilichamen daartegen. |
-
1989
- 1989-08-02 NL NL8901994A patent/NL8901994A/nl not_active Application Discontinuation
-
1990
- 1990-08-01 EP EP90202098A patent/EP0415470B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-01 ES ES90202098T patent/ES2068993T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-01 DE DE69015737T patent/DE69015737T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-01 AT AT90202098T patent/ATE116685T1/de active
- 1990-08-01 DK DK90202098.1T patent/DK0415470T3/da active
-
1995
- 1995-02-28 GR GR940403513T patent/GR3015205T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0415470T3 (da) | 1995-03-13 |
| DE69015737T2 (de) | 1995-07-06 |
| DE69015737D1 (de) | 1995-02-16 |
| GR3015205T3 (en) | 1995-05-31 |
| ATE116685T1 (de) | 1995-01-15 |
| EP0415470A3 (en) | 1991-03-27 |
| ES2068993T3 (es) | 1995-05-01 |
| EP0415470B1 (en) | 1995-01-04 |
| EP0415470A2 (en) | 1991-03-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gobbetti et al. | The proteolytic system of Lactobacillus sanfrancisco CB1: purification and characterization of a proteinase, a dipeptidase, and an aminopeptidase | |
| Van Boven et al. | Purification and characterization of a dipeptidase from Streptococcus cremoris Wg2 | |
| YAN et al. | Purification and characterization of a novel metalloendopeptidase from Streptococcus cremoris H61: A metalloendopeptidase that recognizes the size of its substrate | |
| Yan et al. | Purification and characterization of a substrate-size-recognizing metalloendopeptidase from Streptococcus cremoris H61 | |
| Miyakawa et al. | Purification and characterization of an aminopeptidase from Lactobacillus helveticus LHE-511 | |
| NL8901994A (nl) | Aminopeptidase. | |
| Khalid et al. | Partial purification and characterization of an aminopeptidase from Lactobacillus helveticus CNRZ 32 | |
| Tan et al. | Purification and characterization of a dipeptidase from Lactobacillus helveticus SBT 2171 | |
| Magboul et al. | Purification and characterization of an aminopeptidase from Lactobacillus curvatus DPC2024 | |
| Bockelmann et al. | Purification and characterization of a new tripeptidase from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus B14 | |
| CA1311203C (en) | Dipeptidase, its isolation from lactic acid bacteria, antibodies against the dipeptidase, the use of the dipeptidase and of the antibodies against it | |
| Rattray et al. | Purification and characterization of an intracellular esterase from Brevibacterium linens ATCC 9174 | |
| Fuke et al. | The purification and characterization of prolyl aminopeptidase from Penicillium camemberti | |
| Habibi-Najafi et al. | Purification and characterization of proline iminopeptidase from Lactobacillus casei ssp. casei LLG | |
| Fernandez-Espla et al. | Purification and characterization of a dipeptidase from Lactobacillus casei ssp. casei IFPL 731 isolated from goat cheese made from raw milk | |
| EP0522203A1 (en) | Protein from lactic acid bacteria | |
| Macedo et al. | Purification and characterization of an intracellular aminopeptidase from a wild strain of Lactobacillus plantarum isolated from traditional Serra da Estrela cheese | |
| Simitsopoulou et al. | Purification and partial characterization of a tripeptidase from Pediococcus pentosaceus K9. 2 | |
| Fernández et al. | Purification and properties of two intracellular aminopeptidases produced by Brevibacterium linens SR3 | |
| NL9000241A (nl) | Tripeptidase. | |
| Vitale et al. | An intracellular aminopeptidase from Streptomyces rimosus that prefers basic amino acids | |
| Wohlrab et al. | Purification and characterization of a new aminopeptidase from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus B14 | |
| Cholette et al. | Influence of pH on the properties of Lactobacillus helveticus aminopeptidase | |
| McDONNELL et al. | Purification and characterization of a lysine-p-nitroanilide hydrolase, a broad specificity aminopeptidase, from the cytoplasm of Lactococcus lactis subsp. cremoris AM2 | |
| de Palencia et al. | Purification and characterization of an aminopeptidase (Pep C-like) from Lactobacillus casei subsp. casei IFPL 731 isolated from raw goat's milk cheese |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1B | A search report has been drawn up | ||
| BV | The patent application has lapsed |