CN107847529B - 包含细菌菌株的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含细菌菌株的组合物，其用于治疗和预防发炎性和自身免疫性疾病。

Description

包含细菌菌株的组合物

发明领域

本发明属于包含从哺乳动物消化道分离的细菌菌株的组合物和此类组合物用于治疗疾病的用途的领域。

发明背景

虽然认为人类肠道在子宫内是无菌的，但在出生后其立刻暴露于大量的母体和环境微生物。此后，出现微生物定殖和演替的动态期，其受例如分娩模式、环境、饮食和宿主基因型等因素影响，所有因素都影响肠微生物丛的组成，特别是在童年期间。随后，微生物丛稳定化并变成成人样[1]。人类肠微生物丛含有超过500-1000个基本上属于两大细菌分类脆弱拟杆菌(Bacteroidete)和厚壁门菌(Firmicute)的不同种系型[2]。由人类肠的细菌定殖产生的成功共生关系产生多种代谢、结构、保护和其它有益功能。定殖肠部的增强代谢活性确保降解以其它方式无法摄取的饮食组分，同时释放副产物，为宿主提供重要的营养物来源。类似地，充分认识到肠微生物丛的免疫重要性，且在免疫系统减弱的无菌动物中例示，其免疫系统在引入共生细菌后在功能上复原[3-5]。

微生物丛组成的显著变化已经在例如发炎性肠病(IBD)等肠胃病症中证明。举例来说，在IBD患者中梭菌属(Clostridium)XIVa簇细菌的水平降低，而大肠杆菌数目增加，表明肠内共生体与病原性共生体的平衡的变化[6-9]。有趣地，此微生物生态失调也与效应T细胞群体的不平衡相关。

认识到某些细菌菌株对动物肠可能具有潜在的积极作用，已经提议各种菌株用于治疗各种疾病(参见例如[10-13])。也已经提议某些菌株，包括大部分乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)菌株，用于治疗不直接与肠相关的各种发炎性和自身免疫性疾病(综述参见[14]和[15])。然而，不同疾病和不同细菌菌株之间的关系和特定细菌菌株对肠和在全身水平下和对任何特定类型疾病的准确作用尚未很好地表征。

本领域中需要治疗发炎性和自身免疫性疾病的新方法。还需要待表征的肠细菌的潜在作用，以可以研发使用肠细菌的新疗法。

发明概要

本发明人已经研发用于治疗和预防发炎性和自身免疫性疾病的新疗法。具体来说，本发明人已经研发用于治疗和预防由IL-17或Th17通路介导的疾病和病状的新疗法。具体来说，本发明人已经确定来自罗氏菌属(Roseburia)的细菌菌株可以有效减少Th17发炎反应。如实施例中所描述，经口施用包含人罗氏菌(Roseburia hominis)的组合物可以降低哮喘、类风湿性关节炎和多发性硬化的小鼠模型中包括Th17发炎反应在内的发炎反应的严重度。

因此，在第一实施方案中，本发明提供了一种包含罗氏菌属的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防由IL-17或Th17通路介导的疾病或病状的方法中。本发明人已经确定用来自此种属的细菌菌株治疗可以降低包括IL-17在内的作为Th17通路的一部分的细胞因子的水平，可以减轻Th17发炎反应且在由IL-17和Th17通路介导的发炎性和自身免疫性疾病的小鼠模型中可以提供临床益处。

在特定实施方案中，本发明提供了一种包含罗氏菌属的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防选自由以下组成的群组的疾病或病状的方法中：多发性硬化；关节炎，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎或幼年特发性关节炎；视神经脊髓炎(德维克氏病(Devic's disease))；强直性脊柱炎；脊柱关节炎；牛皮癣；系统性红斑狼疮；发炎性肠病，例如克罗恩氏病(Crohn’s disease)或溃疡性结肠炎；乳糜泻；哮喘，例如过敏性哮喘或中性粒细胞性哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；癌症，例如乳癌、结肠癌、肺癌或卵巢癌；葡萄膜炎；巩膜炎；血管炎；白塞氏病(Behcet's disease)；动脉粥样硬化；异位性皮炎；肺气肿；牙周炎；过敏性鼻炎；以及同种异体移植排斥。来自罗氏菌属的细菌菌株展示的对Th17发炎反应的作用可以为由IL-17和Th17通路介导的疾病和病状，例如上列疾病和病状提供治疗益处。

在优选实施方案中，本发明提供了一种包含罗氏菌属的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防例如中性粒细胞性哮喘或过敏性哮喘等哮喘的方法中。本发明人已经确定用罗氏菌属菌株治疗可以减少中性粒细胞和嗜酸细胞募集到肺中，此可以帮助治疗或预防哮喘。此外，本发明人已经测试和证明罗氏菌属菌株在哮喘的小鼠模型中的功效。在某些实施方案中，组合物用于治疗或预防中性粒细胞性哮喘或嗜酸性粒细胞性哮喘的方法中。本发明的组合物展示的对中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的作用意味着其可以特别有效地治疗或预防中性粒细胞性哮喘和嗜酸性粒细胞性哮喘。实际上，在某些实施方案中，组合物用于在哮喘治疗或预防中降低中性粒细胞性发炎反应的方法中，或组合物用于在哮喘治疗或预防中降低嗜酸性粒细胞性发炎反应的方法中。在优选实施方案中，本发明提供了一种包含人罗氏菌物种的细菌菌株的组合物，其用于治疗哮喘以及尤其嗜酸性粒细胞性或过敏性哮喘。人罗氏菌在哮喘模型中展示对嗜酸性粒细胞具有特别深远的作用，并且用人罗氏菌治疗可以特别有效地治疗嗜酸性粒细胞性或过敏性哮喘。

在其它优选实施方案中，本发明提供了一种包含罗氏菌属的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防类风湿性关节炎的方法中。本发明人已经确定用罗氏菌属菌株治疗可以在类风湿性关节炎的小鼠模型中提供临床益处且可以减少关节肿胀。在优选实施方案中，本发明提供了一种包含人罗氏菌物种的细菌菌株的组合物，其用于治疗类风湿性关节炎。使用人罗氏菌的组合物可以特别有效地治疗类风湿性关节炎。

在其它优选实施方案中，本发明提供了一种包含罗氏菌属的细菌菌株的组合物，其用于治疗或预防多发性硬化的方法中。本发明人已经确定用罗氏菌属菌株治疗可以降低多发性硬化的小鼠模型中的发病率和疾病严重度。在优选实施方案中，本发明提供了一种包含人罗氏菌物种的细菌菌株的组合物，其用于治疗多发性硬化。使用人罗氏菌的组合物可以特别有效地治疗多发性硬化。

在某些实施方案中，本发明的组合物用于在由IL-17或Th17通路介导的疾病或病状的治疗或预防中减少IL-17产生或减少Th17细胞分化的方法中。具体来说，本发明的组合物可以用于哮喘、类风湿性关节炎或多发性硬化的治疗或预防中减少IL-17产生或减少Th17细胞分化。优选地，本发明提供了包含人罗氏菌物种的细菌菌株的组合物，其用于哮喘、类风湿性关节炎或多发性硬化的治疗或预防中减少IL-17产生或减少Th17细胞分化。

在某些实施方案中，组合物用于具有高水平的IL-17或Th17细胞的患者中。罗氏菌属菌株展示的对Th17发炎反应的作用可能特别有益于此类患者。

在本发明的优选实施方案中，组合物中的细菌菌株属于人罗氏菌。也可以使用紧密相关的菌株，例如具有与人罗氏菌的细菌菌株的16s rRNA序列至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％一致的16s rRNA序列的细菌菌株。优选地，细菌菌株具有与SEQID NO:1、2或3至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％一致的16s rRNA序列。优选地，序列一致性是针对SEQ ID NO:3。优选地，用于本发明的细菌菌株具有由SEQ ID NO:3表示的16s rRNA序列。

在某些实施方案中，本发明的组合物用于经口施用。经口施用本发明的菌株可以有效地治疗IL-17或Th17通路介导的疾病和病状。此外，经口施用便于患者和开业医师且允许传递到肠和/或部分或全部定殖肠部。

在某些实施方案中，本发明的组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载剂。

在某些实施方案中，本发明的组合物包含已冻干的细菌菌株。冻干是一项制备允许传递细菌的稳定组合物的有效和便利的技术。

在某些实施方案中，本发明提供了一种包含如上所述的组合物的食品。

在某些实施方案中，本发明提供了一种包含如上所述的组合物的疫苗组合物。

另外，本发明提供了一种治疗或预防由IL-17或Th17通路介导的疾病或病状的方法，其包括施用包含罗氏菌属的细菌菌株的组合物。

在研发以上发明时，本发明人已经鉴别和表征特别适用于疗法的细菌菌株。本发明的人罗氏菌菌株展示有效治疗本文中描述的疾病，例如关节炎、哮喘和多发性硬化。因此，在另一个方面中，本发明提供了一种以登记号NCIMB 42383寄存的人罗氏菌菌株或其衍生物的细胞。本发明还提供了包含此类细胞的组合物或此类细胞的生物纯培养物。本发明还提供了一种以登记号NCIMB 42383寄存的人罗氏菌菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗中，尤其用于本文中描述的疾病。

图示简单说明

图1：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-总BAL流体细胞计数。

图2：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-BALF中总嗜酸性粒细胞计数。

图3：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-BALF中嗜酸性粒细胞比例。

图4：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-BALF中总巨噬细胞计数。

图5：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-BALF中巨噬细胞比例。

图6：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-BALF中总中性粒细胞计数。

图7：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-BALF中中性粒细胞比例。

图8：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-BALF中总淋巴细胞计数。

图9：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-BALF中淋巴细胞比例。

图10：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-总BAL流体细胞计数。

图11：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-BALF中总嗜酸性粒细胞计数。

图12：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-BALF中嗜酸性粒细胞比例。

图13：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-BALF中总巨噬细胞计数。

图14：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-BALF中巨噬细胞比例。

图15：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-BALF中总中性粒细胞计数。

图16：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-BALF中中性粒细胞比例。

图17：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-BALF中总淋巴细胞计数。

图18：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-BALF中淋巴细胞比例。

图19：类风湿性关节炎的小鼠模型-体重，第-14天到第0天。数据呈现为初始(第-14天)体重的平均值±SEM百分比。

图20：类风湿性关节炎的小鼠模型-体重，第0天到第42天。数据呈现为初始(第0天)体重的平均值±SEM百分比。

图21：类风湿性关节炎的小鼠模型-临床评分。数据呈现为平均值±SEM。****p<0.0001，当与媒介物处理组中第21天比较时。

图22：类风湿性关节炎的小鼠模型-对II型胶原蛋白的脾细胞增殖反应。基于3H-TdR并入的每分钟减去培养基背景[CII刺激-培养基背景]计数。所有数据呈现为平均值±SEM。与媒介物组相比，***p<0.001。

图23：类风湿性关节炎的小鼠模型-组织培养上清液中IFNγ的水平。线表示组中位值。

图24：类风湿性关节炎的小鼠模型-组织培养上清液中IL-17A的水平。线表示组中位值。

图25：类风湿性关节炎的小鼠模型-组织培养上清液中IL-10的水平。线表示组中位值。

图26：类风湿性关节炎的小鼠模型-组织培养上清液中IL-6的水平。线表示组中位值。

图27：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-血清中总IgE。

图28：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-血清中HDM特异性IgG1。

图29：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-BALF中总IgE。

图30：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-BALF中HDM特异性IgG1。

图31：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-组织学分析-平均细支气管支气管周浸润评分。

图32：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-组织学分析-平均血管周浸润评分。

图33：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-组织学分析-平均发炎评分(细支气管支气管周与血管周浸润评分的平均值)。

图34：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-组织学分析-黏液评分。

图35：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-肺组织中IL-9水平。

图36：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-肺组织中IL-1a水平。

图37：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-肺组织中IFNγ水平。

图38：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-肺组织中IL-17A水平。

图39：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-肺组织中IL-4水平。

图40：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-肺组织中IL-5水平。

图41：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-肺组织中IL-1b水平。

图42：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-肺组织中RANTES水平。

图43：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-肺组织中MIP-1a水平。

图44：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-肺组织中KC水平。

图45：房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型-肺组织中MIP-2水平。

图46：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-血清中HDM特异性IgG1。

图47：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-血清中HDM特异性IgG2a。

图48：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-BALF中HDM特异性IgG1。

图49：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-BALF中HDM特异性IgG2a。

图50：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-组织学分析-平均细支气管支气管周浸润评分

图51：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-组织学分析-平均血管周浸润评分

图52：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-组织学分析-平均发炎评分(细支气管支气管周与血管周浸润评分的平均值)。

图53：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-肺组织中TNFα水平。

图54：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-肺组织中IL-1a水平。

图55：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-肺组织中IFNγ水平。

图56：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-肺组织中IL-17F水平。

图57：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-肺组织中IL-1b水平。

图58：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-肺组织中RANTES水平。

图59：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-肺组织中MIP-2水平。

图60：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-肺组织中KC水平。

图61：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-肺组织中IL-17A水平。

图62：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-肺组织中MIP-1a水平。

图63：严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型-肺组织中IL-33水平。

图64：类风湿性关节炎的小鼠模型-组织病理学评分的目测模板。代表性影像展示胶原蛋白诱发的关节炎研究中来自小鼠跗关节的综合评分。

图65：类风湿性关节炎的小鼠模型-组织病理学：发炎评分。数据呈现为平均值±SEM。

图66：类风湿性关节炎的小鼠模型-组织病理学：软骨评分。数据呈现为平均值±SEM。

图67：类风湿性关节炎的小鼠模型-组织病理学：骨骼评分。数据呈现为平均值±SEM。

图68：类风湿性关节炎的小鼠模型-组织病理学：总评分。数据呈现为平均值±SEM。

图69：类风湿性关节炎的小鼠模型-组织病理学：代表性图。在括号之间指示动物ID(#n.n)和四肢(R为右，L为左)。左影像(媒介物)：发炎和纤维化延伸至关节软组织的大范围关节和骨骼破坏。

图70：多发性硬化的小鼠模型-临床评分。

图71：多发性硬化的小鼠模型-发病率。

发明详述

细菌菌株

本发明的组合物包含罗氏菌属的细菌菌株。所述实施例证明此种属细菌可用于治疗或预防由IL-17或Th17通路介导的疾病和病状。优选的细菌菌株属于人罗氏菌物种。

用于本发明中的罗氏菌属物种的实例包括人罗氏菌、盲肠罗氏菌(Roseburiacecicola)、粪罗氏菌(Roseburia faecis)、肠罗氏菌(Roseburia intestinalis)和大肠罗氏菌(Roseburia inulinivorans)。罗氏菌属细菌是微微弯曲的杆状细胞，其非常厌氧并且是哺乳动物肠所固有的。其属于厚壁菌门内的种系群XIVa。此细菌产生丁酸盐并且通过沿凹侧且在一端成群存在的多个鞭毛而积极运动[16]。人罗氏菌和肠罗氏菌是近来描述的实例。

人罗氏菌的一个实例是the Rowett Research Institute根据布达佩斯条约(theBudapest Treaty)的条款以登记号NCIMB 14029^T人罗氏菌A2-183^T(DSM＝16839^T)于2004年10月21日寄存在英国食品、工业与海洋细菌菌种保藏中心(National Collections ofIndustrial,Food and Marine Bacteria，NCIMB)(NCIMB有限公司,Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,UK,AB21 9YA)的菌株。其它示例性人罗氏菌菌株描述于[17]中。人罗氏菌菌株的16S rRNA基因序列的GenBank/EMBL/DDBJ登记号是AY804148和AJ270482(本文中公开为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。

肠罗氏菌的一个实例是以登记号NCIMB 13810肠罗氏菌L1-82^T(DSM＝14610^T)寄存的菌株。另一个实例是如[17]中描述的肠罗氏菌菌株。参考文献[17]还描述了示例性粪罗氏菌和大肠罗氏菌菌株。

以登记号NCIMB 42383寄存的人罗氏菌细菌在实施例中进行测试并在本文中又称为菌株433。测试的433菌株的16S rRNA序列在SEQ ID NO:3中提供。菌株433由GTBiologics有限公司(Life Sciences Innovation Building,Aberdeen,AB25 2ZS,Scotland)以“人罗氏菌433”在2015年3月12日寄存在国际寄存局NCIMB有限公司(FergusonBuilding,Aberdeen,AB21 9YA,Scotland)并且分配登记号NCIMB42383。GT Biologics有限公司随后将其名称改为4D Pharma Research有限公司。

菌株433的基因组序列提供于SEQ ID NO:4中。此序列使用PacBio RS II平台产生。

还预期与实施例中测试的菌株紧密相关的细菌菌株有效治疗或预防由IL-17或Th17通路介导的疾病和病状。在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与肠罗氏菌的细菌菌株的16s rRNA序列至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％一致的16srRNA序列。优选地，用于本发明的细菌菌株具有与SEQ ID NO:1、2或3至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％一致的16s rRNA序列。优选地，序列一致性是针对SEQ ID NO:3。优选地，用于本发明的细菌菌株具有由SEQ ID NO:3表示的16s rRNA序列。

还预期作为以登记号42383寄存的细菌的生物型的细菌菌株有效治疗或预防由IL-17或Th17通路介导的疾病和病状。生物型是具有相同或极类似的生理和生物化学特性的密切相关菌株。

作为以登记号NCIMB 42383寄存的细菌的生物型且适合用于本发明中的菌株可以通过对以登记号NCIMB 42383寄存的细菌的其它核苷酸序列进行测序来鉴别。举例来说，基本上全基因组可以测序，且用于本发明的生物型菌株可以在其全基因组的至少80％上(例如在至少85％、90％、95％或99％上或在其全基因组上)具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列一致性。用于鉴别生物型菌株的其它适合序列可以包括hsp60或重复序列，例如BOX、ERIC、(GTG)₅或REP或[18]。生物型菌株可以具有与以登记号NCIMB42383寄存的细菌的对应序列至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％序列一致的序列。

在某些实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有与SEQ ID NO:4序列一致的基因组。在优选实施方案中，用于本发明的细菌菌株具有在SEQ ID NO:4的至少60％(例如至少65％、70％、75％、80％、85％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)上与SEQ ID NO:4至少90％序列一致(例如至少92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致)的基因组。举例来说，用于本发明的细菌菌株可以具有在SEQ ID NO:4 70％上与SEQ ID NO:4至少90％序列一致，或在SEQ ID NO:4 80％上与SEQ ID NO:4至少90％序列一致，或在SEQ IDNO:490％上与SEQ ID NO:4至少90％序列一致，或在SEQ ID NO:4 100％上与SEQ ID NO:4至少90％序列一致，或在SEQ ID NO:4 70％上与SEQ ID NO:4至少95％序列一致，或在SEQID NO:4 80％上与SEQ ID NO:4至少95％序列一致，或在SEQ ID NO:4 90％上与SEQ IDNO:4至少95％序列一致，或在SEQ ID NO:4 100％上与SEQ ID NO:4至少95％序列一致，或在SEQ ID NO:4 70％上与SEQ ID NO:4至少98％序列一致，或在SEQ ID NO:4 80％上与SEQID NO:4至少98％序列一致，或在SEQ ID NO:4 90％上与SEQ ID NO:4至少98％序列一致，或在SEQ ID NO:4 100％上与SEQ ID NO:4至少98％序列一致的基因组。

或者，作为以登记号NCIMB 42383寄存的细菌的生物型且适用于本发明中的菌株可以通过使用登记号NCIMB 42383寄存物和限制片段分析和/或PCR分析，例如通过使用荧光增强的片段长度多态现象(fluorescent amplified fragment length polymorphism，FAFLP)和重复DNA组件(rep)-PCR指纹或蛋白质剖析或部分16S或23s rDNA测序来鉴别。在优选实施方案中，此类技术可以用于鉴别其它人罗氏菌菌株。

在某些实施方案中，作为以登记号NCIMB 42383寄存的细菌的生物型且适用于本发明中的菌株是当通过增强的核蛋白体DNA限制分析(amplified ribosomal DNArestriction analysis，ARDRA)分析时，例如当使用Sau3AI限制酶(关于示例性方法和指导参见例如[19])时提供与以登记号NCIMB 42383寄存的细菌相同模式的菌株。或者，生物型菌株被确定是具有与以登记号NCIMB 42383寄存的细菌相同的碳水化合物发酵模式的菌株。

适用于本发明的组合物和方法的其它罗氏菌属菌株，例如以登记号NCIMB 42383寄存的细菌的生物型可以使用任何适当方法或策略，包括实施例中描述的分析鉴别。举例来说，用于本发明中的菌株可以通过在厌氧YCFA中培养和/或将细菌施用到II型胶原蛋白诱发的关节炎小鼠模型并接着评估细胞因子水平来鉴别。具体来说，具有与以登记号NCIMB42383寄存的细菌类似的生长模式、代谢类型和/或表面抗原的细菌菌株可用于本发明。适用菌株将具有与NCIMB42383菌株可比的免疫调节活性。具体来说，生物型菌株将对哮喘、关节炎和多发性硬化疾病模型引起与实施例中所示的作用可比的作用，并且对细胞因子水平引起与实施例中所示的作用可比的作用，其可以通过使用实施例中描述的培养和施用方案来鉴别。

本发明的一种尤其优选的菌株是以登记号NCIMB 42383寄存的人罗氏菌菌株。它是实施例中测试的示例性433菌株并且展示有效治疗疾病。因此，本发明提供以登记号NCIMB 42383寄存的人罗氏菌菌株或其衍生物的细胞，例如分离细胞。本发明还提供了一种组合物，其包含以登记号NCIMB 42383寄存的人罗氏菌菌株或其衍生物的细胞。本发明还提供了一种以登记号NCIMB 42383寄存的人罗氏菌菌株的生物纯培养物。本发明还提供了以登记号NCIMB 42383寄存的人罗氏菌菌株或其衍生物的细胞，其用于治疗中，尤其用于本文中描述的疾病。

以登记号NCIMB 42383寄存的菌株的衍生物可以是子代菌株(子代)或从原始培养(亚克隆)的菌株。本发明菌株的衍生物可以例如在基因水平下修饰，而不消除生物活性。具体来说，本发明的衍生菌株是治疗活性的。衍生菌株将具有与原始NCIMB 42383菌株可比的免疫调节活性。具体来说，衍生物菌株将对哮喘、关节炎和多发性硬化疾病模型引起与实施例中所示的作用可比的作用，并且对细胞因子水平引起与实施例中所示的作用可比的作用，其可以通过使用实施例中描述的培养和施用方案来鉴别。NCIMB 42383菌株的衍生物一般将是NCIMB 42383菌株的生物型。

对以登记号NCIMB 42383寄存的人罗氏菌菌株的细胞的提及涵盖具有与以登记号NCIMB 42383寄存的菌株相同的安全性和治疗功效特性的任何细胞，并且本发明涵盖此类细胞。

在优选实施方案中，本发明组合物中的细菌菌株是活的且能够部分或全部定殖肠部。

治疗用途

如实施例中证明，本发明的细菌组合物有效减少Th17发炎反应。具体来说，用本发明的组合物治疗实现IL-17A水平和其它Th17通路细胞因子减少，和由IL-17和Th17通路介导的病状的动物模型中的临床改善。因此，本发明的组合物可用于治疗或预防发炎性和自身免疫性疾病和尤其由IL-17介导的疾病或病状。具体来说，本发明的组合物可用于减少或预防IL-17发炎反应升高。

Th17细胞是产生例如IL-17A、IL17-F、IL-21和IL-22的T辅助细胞子集。Th17细胞分化和IL-17表达可能由IL-23驱动。这些细胞因子和其它因子形成Th17通路的重要部分，Th17通路是公认的发炎信号传导通路，其促进且引起大量的发炎性和自身免疫性疾病(如例如[20-25]中所述)。Th17通路活化的疾病是Th17通路介导的疾病。Th17通路介导的疾病可以通过抑制Th17通路改善或减轻，Th17通路可以通过减少Th17细胞分化或降低其活性或减少Th17通路细胞因子的水平来抑制。由Th17通路介导的疾病可以通过Th17细胞产生的细胞因子，例如IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-26、IL-9的水平增加表征([26]中评述)。由Th17通路介导的疾病可以通过Th-17相关基因，例如Stat3或IL-23R的表现增加表征。由Th17通路介导的疾病可以与增加的Th17细胞水平相关。

IL-17是一种促发炎细胞因子，其促进若干发炎性和自身免疫性疾病和病状的发病机理。如本文所用，IL-17可以指IL-17家族的任何成员，包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F。IL-17介导的疾病和病状特征在于罹患所述疾病或病状的组织中IL-17的高表达和/或IL-17阳性细胞的累积或存在。类似地，IL-17介导的疾病和病状是因高IL-17水平或IL-17水平增加而加重且因低IL-17水平或IL-17水平减少而减轻的疾病和病状。IL-17发炎反应可以是局部或系统性的。

可能由IL-17或Th17通路介导的疾病和病状的实例包括多发性硬化；关节炎，例如类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎或幼年特发性关节炎；视神经脊髓炎(德维克氏病)；强直性脊柱炎；脊柱关节炎；牛皮癣；系统性红斑狼疮；发炎性肠病，例如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎；乳糜泻；哮喘，例如过敏性哮喘或中性粒细胞性哮喘；慢性阻塞性肺病(COPD)；癌症，例如乳癌、结肠癌、肺癌或卵巢癌；葡萄膜炎；巩膜炎；血管炎；白塞氏病；动脉粥样硬化；异位性皮炎；肺气肿；牙周炎；过敏性鼻炎；以及同种异体移植排斥。在优选实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防这些病状或疾病中的一种或多种。在其它优选实施方案中，这些病状或疾病由IL-17或Th17通路介导。

在某些实施方案中，本发明的组合物用于在由IL-17或Th17通路介导的疾病或病状的治疗或预防中减少IL-17产生或减少Th17细胞分化的方法中。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防发炎性或自身免疫性疾病，其中所述治疗或预防通过减少Th17发炎反应或预防其升高来实现。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗患有发炎性或自身免疫性疾病的患者中，其中所述患者具有高水平的IL-17或升高的Th17细胞或展现Th17发炎反应。在某些实施方案中，患者可以经诊断患有慢性发炎性或自身免疫性疾病或病状，或本发明的组合物可以用于预防发展成为慢性发炎性或自身免疫性疾病或病状的发炎性或自身免疫性疾病或病状。在某些实施方案中，疾病或病状可能对用TNF-α抑制剂治疗不起反应。本发明的这些用途可以应用于前段中列出的任何特定疾病或病状。

IL-17和Th17通路常常与慢性发炎性和自身免疫性疾病相关，因此本发明的组合物可能特别适用于治疗或预防如上列出的慢性疾病或病状。在某些实施方案中，组合物用于患有慢性疾病的患者中。在某些实施方案中，组合物用于预防慢性疾病发展。

本发明的组合物可用于治疗由IL-17或Th17通路介导的疾病和病状且对付Th17发炎反应，因此本发明的组合物可能特别适用于治疗或预防慢性疾病、治疗或预防患者的对其它疗法(例如用TNF-α抑制剂治疗)起反应的疾病，和/或治疗或预防与IL-17和Th17细胞相关的组织损伤和症状。举例来说，已知IL-17活化软骨和骨组织中基质破坏并且IL-17对软骨细胞和成骨细胞中基质产生具有抑制作用，因此本发明的组合物可用于治疗或预防骨质侵蚀或软骨破坏。

在某些实施方案中，用本发明的组合物治疗减少IL-17水平、尤其IL-17A水平或预防其升高。在某些实施方案中，用本发明的组合物治疗减少IFN-γ或IL-6水平或预防其升高。这些细胞因子的水平的此类减少或预防水平升高可用于治疗或预防发炎性和自身免疫性疾病和病状，尤其由IL-17或Th17通路介导的疾病和病状。

哮喘

在优选实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防哮喘。实施例证明本发明的组合物减少敏化和用房尘螨提取物激发后中性粒细胞和/或嗜酸性粒细胞募集到气道中，因此其可用于治疗或预防哮喘。哮喘是一种特征为气道发炎和限制的慢性疾病。哮喘发炎可以由IL-17和/或Th17细胞介导，因此本发明的组合物可以特别有效预防或治疗哮喘。哮喘发炎可以由嗜酸性粒细胞和/或中性粒细胞介导。

在某些实施方案中，哮喘是嗜酸性粒细胞或过敏性哮喘。嗜酸性粒细胞和过敏性哮喘的特征是外周血和气道分泌物中嗜酸性粒细胞数目增加且病理学上与基底膜区域变厚和药理学上与皮质类固醇反应相关[27]。减少或抑制嗜酸性粒细胞募集或活化的组合物可用于治疗或预防嗜酸性粒细胞和过敏性哮喘。

在其它实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防中性粒细胞性哮喘(或非嗜酸性粒细胞性哮喘)。高中性粒细胞数目与可能对皮质类固醇治疗不敏感的严重哮喘有关。减少或抑制中性粒细胞募集或活化的组合物可用于治疗或预防中性粒细胞性哮喘。

嗜酸性粒细胞和中性粒细胞性哮喘并非互斥病状且一般帮助对付任一嗜酸性粒细胞和中性粒细胞反应的治疗可用于治疗哮喘。

增加的IL-17水平和Th17通路活化与严重哮喘有关，因此本发明的组合物可用于预防严重哮喘的发展或用于治疗严重哮喘。

在某些实施方案中，本发明的组合物用于在哮喘治疗或预防中降低嗜酸性粒细胞发炎反应的方法中，或用于在哮喘治疗或预防中降低中性粒细胞性发炎反应的方法中。如上所指出，哮喘中高水平嗜酸性粒细胞在病理学上与基底膜区域变厚相关，因此在哮喘治疗或预防中减少嗜酸性粒细胞发炎反应也许能特别地对付所述疾病的此特征。此外，与升高的嗜酸性粒细胞组合或其不存在的升高的嗜中性粒细胞与严重哮喘和慢性气道变窄有关。因此，减少中性粒细胞性发炎反应可能特别适用于对付严重哮喘。

在某些实施方案中，组合物减少过敏性哮喘中细支气管支气管周浸透，或用于在过敏性哮喘的治疗中减少细支气管支气管周浸透。在某些实施方案中，组合物减少中性粒细胞性哮喘中细支气管支气管周和/或血管周浸透，或用于在过敏性中性粒细胞性哮喘的治疗中减少细支气管支气管周和/或血管周浸透。

在某些实施方案中，用本发明的组合物治疗减少IFNγ水平或预防IFNγ水平升高。

在某些实施方案中，本发明的组合物用于减少嗜酸性粒细胞和/或中性粒细胞性发炎反应的哮喘治疗方法中。在某些实施方案中，待治疗的患者已经或先前已经被鉴别为具有高水平的嗜中性粒细胞或嗜酸性粒细胞，例如如通过采血或唾液分析来鉴别。

本发明的组合物在施用于新生儿或孕妇时可用于预防新生儿中哮喘发展。组合物可用于预防儿童中哮喘发展。本发明的组合物可用于治疗或预防成年发作型哮喘。本发明的组合物可用于管理或减轻哮喘。本发明的组合物可能特别适用于减少与由例如房尘螨等过敏原加重的哮喘相关的症状。

治疗或预防哮喘可以指例如减轻症状严重度或减小对患者而言成问题的恶化频率或触发范围。

关节炎

在优选实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)。实施例证明本发明的组合物减少小鼠模型中RA临床征象，减少软骨和骨骼破坏，并且减少IL-17发炎反应，因此其可用于治疗或预防RA。RA是一种主要影响关节的系统性发炎病症。RA与引起关节肿胀、滑液增生和软骨和骨骼破坏的发炎反应有关。IL-17和Th17在RA中可能具有关键作用，例如因为IL-17抑制软骨细胞和成骨细胞中基质产生，并且活化基质金属蛋白酶的产生和功能，且因为RA疾病活动与IL-17水平和Th-17细胞数相关[28,29]，因此本发明的组合物可特别有效预防或治疗RA。

在某些实施方案中，本发明的组合物用于在RA治疗或预防中降低IL-17水平或预防IL-17水平升高。在某些实施方案中，用本发明的组合物治疗减少IL-17水平、尤其IL-17A水平或预防其升高。在某些实施方案中，用本发明的组合物治疗减少IFN-γ或IL-6水平或预防其升高。

在某些实施方案中，用本发明的组合物治疗减少关节肿胀。在某些实施方案中，本发明的组合物用于关节肿胀的患者或经鉴别处于关节肿胀风险中的患者中。在某些实施方案中，本发明的组合物用于减少RA中的关节肿胀的方法中。

在某些实施方案中，用本发明的组合物治疗减少软骨破坏或骨骼破坏。在某些实施方案中，本发明的组合物用于在RA治疗中减少或预防软骨或骨骼破坏。在某些实施方案中，组合物用于治疗患有严重RA的处于软骨或骨骼破坏风险中的患者。

增加的IL-17水平和Th17细胞数与RA中软骨和骨组织破坏有关[28,29]。已知IL-17活化软骨和骨组织中基质破坏并且IL-17对软骨细胞和成骨细胞中基质产生具有抑制作用。因此，在某些实施方案中，本发明的组合物用于在RA治疗中预防骨质侵蚀或软骨破坏。在某些实施方案中，组合物用于治疗展现骨质侵蚀或软骨破坏的患者或经鉴别处于骨质侵蚀或软骨破坏风险中的患者。

TNF-α也与RA相关，但TNF-α不参与所述疾病后期的发病机理。相比之下，IL-17在整个慢性疾病阶段具有作用[30]。因此，在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗慢性RA或晚期RA，例如包括关节破坏和软骨丧失的疾病。在某些实施方案中，本发明的组合物用于治疗先前已接受抗TNF-α疗法的患者。在某些实施方案中，尚未治疗的患者不或不再对抗TNF-α疗法起反应。

本发明的组合物可用于调节患者的免疫系统，因此，在某些实施方案中，本发明的组合物用于预防已经被鉴别为处于RA风险中或已经被诊断患有早期RA的患者的RA。本发明的组合物可用于预防RA发展。

本发明的组合物可用于管理或减轻RA。本发明的组合物可能特别适用于减少与关节肿胀或骨组织破坏相关的症状。治疗或预防RA可指例如减轻症状严重度或减小对患者而言成问题的恶化频率或触发范围。

多发性硬化

在优选实施方案中，本发明的组合物用于治疗或预防多发性硬化。实施例证明本发明的组合物减少多发性硬化小鼠模型(EAE模型)的发病率和疾病严重度，因此其可用于治疗或预防多发性硬化。多发性硬化是一种与特别脑和脊柱中神经元髓鞘破坏相关的发炎病症。多发性硬化是一种慢性疾病，其逐步丧失活动能力且连串进展。IL-17和Th17细胞在多发性硬化中可能具有关键作用，例如因为IL-17水平可能与多发性硬化病变相关，IL-17会破坏血脑屏障内皮细胞紧密接头，且Th17细胞会迁移到中枢神经系统中并引起神经元丧失[31,32]。因此，本发明的组合物可以特别有效预防或治疗多发性硬化。

在某些实施方案中，用本发明的组合物治疗降低发病率或疾病严重度。在某些实施方案中，本发明的组合物用于降低发病率或疾病严重度。在某些实施方案中，用本发明的组合物治疗预防运动功能衰退或改善运动功能。在某些实施方案中，本发明的组合物用于预防运动功能衰退或用于改善运动功能。在某些实施方案中，用本发明的组合物治疗预防出现瘫痪。在某些实施方案中，本发明的组合物在多发性硬化治疗中用于预防瘫痪。

本发明的组合物可用于调节患者的免疫系统，因此，在某些实施方案中，本发明的组合物用于预防已经被鉴别为处于多发性硬化风险中或已经被诊断患有早期多发性硬化或“复发缓解型”多发性硬化的患者的多发性硬化。本发明的组合物可用于预防出现硬化症。实际上，实施例展示施用本发明的组合物预防许多小鼠中出现疾病。

本发明的组合物可用于管理或减轻多发性硬化。本发明的组合物可能特别适用于减少与多发性硬化相关的症状。治疗或预防多发性硬化可以指例如减轻症状严重度或减小对患者而言成问题的恶化频率或触发范围。

施用模式

优选地，本发明的组合物待施用于胃肠道，以能够传递到肠和/或使本发明的细菌菌株部分或全部定殖肠部。一般地，虽然本发明的组合物经口施用，但其可以直肠、鼻内或通过颊或舌下途径施用。

在某些实施方案中，本发明的组合物可以呈泡沫、喷雾或凝胶形式施用。

在某些实施方案中，本发明的组合物可以呈栓剂，例如直肠栓剂，例如呈可可豆油(可可脂)、合成硬脂(例如suppocire、witepsol)、甘油基-明胶、聚乙二醇或肥皂甘油组合物的形式施用。

在某些实施方案中，本发明的组合物通过管，例如鼻饲管、口胃管、胃管、空肠造口管(J型管)、经皮内窥镜胃造口术(percutaneous endoscopic gastrostomy，PEG)或端口，例如通向胃、空肠和其它适合进入埠的胸壁端口施用胃肠道。

本发明的组合物可以施用一次，或其可以作为治疗方案一部分连续施用。在某些实施方案中，本发明的组合物将每日施用。

在本发明的某些实施方案中，根据本发明的治疗伴随有患者肠微生物丛的评估。如果本发明的菌株传递和/或部分或全部定殖未实现，使得功效未观测到，那么可以重复治疗，如果传递和/或部分或全部定殖成功且观测到功效，那么可以停止治疗。

在某些实施方案中，本发明的组合物可以施用于怀孕动物，例如哺乳动物，例如人类，以预防发炎性或自身免疫性疾病在其子女中在子宫内和/或其出生后出现。

本发明的组合物可以施用于经诊断患有由IL-17或Th17通路介导的疾病或病状或已经被鉴别为处于由IL-17或Th17通路介导的疾病或病状风险中的患者。组合物也可以作为预防措施施用以预防健康患者中由IL-17或Th17通路介导的疾病或病状出现。

本发明的组合物可以施用于已经被鉴别为具有异常肠微生物丛的患者。举例来说，患者可以具有减少或缺乏的罗氏菌属和尤其人罗氏菌的定殖。

本发明的组合物可以作为食品，例如营养增补剂施用。

一般地，本发明的组合物用于治疗人类，不过其可以用于治疗动物，包括单胃哺乳动物，例如家禽、猪、猫、犬、马或兔。本发明的组合物可用于增强动物的生长和效能。若施用于动物，则可以使用经口管饲法。

组合物

一般地，本发明的组合物包含细菌。在本发明的优选实施方案中，组合物呈冻干形式配制。举例来说，本发明的组合物可以包含含有本发明的细菌菌株的颗粒或明胶胶囊，例如硬明胶胶囊。

优选地，本发明的组合物包含冻干细菌。细菌冻干是公知程序且相关指导可于例如参考文献[33-35]中获得。

或者，本发明的组合物可以包含活的活性细菌培养物。

在优选实施方案中，本发明的组合物经囊封以能够传递细菌菌株到肠。囊封保护组合物免于降解，直到通过例如用化学或物理刺激，例如压力、酶活性或物理性崩解(其可以通过pH值改变而触发)进行破裂，在目标位置传递。可以使用任何适当囊封法。示例性囊封技术包括截留在多孔基质内、附着或吸附在固体载体表面上、通过絮凝或利用交联剂而自我凝聚以及机械容纳在微孔膜或微胶囊后。关于可用于制备本发明的组合物的囊封的指导可以于例如参考文献[36]和[37]中获得。

组合物可以经口施用且可以呈片剂、胶囊或散剂形式。囊封产品是优选的，因为罗氏菌是厌氧菌。其它成分(例如维生素C)可以作为除氧剂和益生基质包括以改善活体内传递和/或部分或全部定殖和存活。或者，本发明的益生组合物可以作为食品或营养产品，例如基于牛奶或乳清的发酵乳制品，或作为药品经口施用。

组合物可以配制为益生菌。

本发明的组合物包括治疗有效量的本发明的细菌菌株。治疗有效量的细菌菌株足以对患者发挥有益作用。治疗有效量的细菌菌株可以足够传递到患者肠和/或部分或全部定殖患者肠部。

例如适合于成年人的细菌日剂量可以是约1×10³到约1×10¹¹菌落形成单位(colony forming unit，CFU)；例如约1×10⁷到约1×10¹⁰CFU；在另一实例中，约1×10⁶到约1×10¹⁰CFU。

在某些实施方案中，组合物含有相对于组合物的重量，约1×10⁶到约1×10¹¹CFU/g，例如约1×10⁸到约1×10¹⁰CFU/g的量的细菌菌株。剂量可以是例如1g、3g、5g和10g。

通常，益生菌，例如本发明的组合物，任选与至少一种适合益生化合物组合。益生化合物通常是不易消化的碳水化合物，例如寡糖或多糖，或糖醇，其在上部消化道中不降解或吸收。已知的益生菌包括商业产品，例如菊糖和反式半乳寡糖。

在某些实施方案中，本发明的益生菌组合物包括相对于组合物总重量，约1到约30重量％(例如5到20重量％)的量的益生菌化合物。碳水化合物可以选自由以下组成的群：果寡糖(或FOS)、短链果寡糖、菊糖、异麦芽寡糖、果胶、木寡糖(或XOS)、几丁寡糖(或COS)、β-葡聚糖、阿拉伯胶改性和抗性淀粉、聚葡萄糖、D-塔格糖、阿拉伯胶纤维、角豆树、燕麦和柑桔纤维。在一个方面中，益生菌是短链果糖-寡糖(下文中简单起见展示为FOSs-c.c)；所述FOSs-c.c是不可消化的碳水化合物，一般由甜菜糖转变获得并且包括三个葡萄糖分子键结的蔗糖分子。

本发明的组合物可以包含药学上可接受的赋形剂或载剂。此类适合赋形剂的实例可以见于参考文献[38]中。用于治疗用途的可接受的载剂或稀释剂是医药技术中众所周知的并且描述于例如参考文献[39]中。适合载剂的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇、山梨糖醇等等。适合稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。医药载剂、赋形剂或稀释剂的选择可以针对预期施用途径和标准医药实践来选择。药物组合物可以包含任何适合粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包被剂、增溶剂作为载剂、赋形剂或稀释剂或除载剂、赋形剂或稀释剂之外可以包含所述物质。适合粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖(例如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂)、天然和合成树胶(例如阿拉伯胶、黄蓍胶)或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。适合润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等等。防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂可以提供于药物组合物中。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。

本发明的组合物可以配制为食品。举例来说，除本发明的治疗作用之外，食品可以提供营养益处，例如营养增补剂中。类似地，食品可以被配制成增强本发明组合物的口味，或通过使其更类似于常见食品而非药物组合物，使得组合物食用起来更具吸引力。在某些实施方案中，本发明的组合物被配制为基于牛奶的产品。术语“基于牛奶的产品”意指具有变化脂肪含量的任何基于牛奶或乳清的液体或半固体产品。基于牛奶的产品可以是例如奶牛奶、山羊奶、绵羊奶、脱脂乳、全乳、无任何加工下奶粉与乳清重组的牛奶或加工产品，例如酸奶酪、凝乳、凝块、酸牛奶、酸全乳、酪乳和其它酸牛奶产品。另一重要组包括乳制饮料，例如乳清饮料、发酵牛奶、炼乳、婴儿或婴孩牛奶；增香乳、冰淇淋；含牛奶的食品，例如甜食。

在某些实施方案中，本发明的组合物含有单一细菌菌株或物种且不含有任何其它细菌菌株或物种。此类组合物可以仅仅包含最低限度量或生物学上不相干量的其它细菌菌株或物种。此类组合物可以是基本上不含其它生物体物种的培养物。

根据本发明使用的组合物可能需要或可能不需要销售批准。

在一些情况下，冻干细菌菌株在施用之前复原。在一些情况下，复原是通过使用本文中描述的稀释剂。

本发明的组合物可以包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。

在某些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含：本发明的细菌菌株；和药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂；其中细菌菌株在施用有于需要的受试者时量足够治疗病症；并且其中病症选自由以下组成的群组：哮喘、过敏性哮喘、中性粒细胞性哮喘、骨关节炎、牛皮癣性关节炎、幼年特发性关节炎、视神经脊髓炎(德维克氏病)、强直性脊柱炎、脊柱关节炎、系统性红斑狼疮、乳糜泻、慢性阻塞性肺病(COPD)、癌症、乳癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、葡萄膜炎、巩膜炎、血管炎、白塞氏病、动脉粥样硬化、异位性皮炎、肺气肿、牙周炎、过敏性鼻炎和同种异体移植排斥。

在某些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含：本发明的细菌菌株；和药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂；其中细菌菌株的量足够治疗或预防由IL-17或Th17通路介导的疾病或病状。在优选实施方案中，所述疾病或病状选自由以下组成的群组：类风湿性关节炎、多发性硬化、牛皮癣、发炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、哮喘、过敏性哮喘、中性粒细胞性哮喘、骨关节炎、牛皮癣性关节炎、幼年特发性关节炎、视神经脊髓炎(德维克氏病)、强直性脊柱炎、脊柱关节炎、系统性红斑狼疮、慢性阻塞性肺病(COPD)、癌症、乳癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、葡萄膜炎、巩膜炎、血管炎、白塞氏病、动脉粥样硬化、异位性皮炎、肺气肿、牙周炎、过敏性鼻炎和同种异体移植排斥。

在某些实施方案中，本发明提供以上药物组合物，其中细菌菌株的量是相对于组合物的重量每克约1×10³到约1×10¹¹菌落形成单位。

在某些实施方案中，本发明提供以上药物组合物，其中组合物以1g、3g、5g或10g的剂量施用。

在某些实施方案中，本发明提供以上药物组合物，其中组合物通过选自由口腔、直肠、皮下、鼻、颊和舌下组成的群组的方法施用。

在某些实施方案中，本发明提供以上药物组合物，其包含选自由乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露糖醇和山梨糖醇组成的群组的载剂。

在某些实施方案中，本发明提供以上药物组合物，其包含选自由乙醇、甘油和水组成的群组的稀释剂。

在某些实施方案中，本发明提供以上药物组合物，其包含选自由以下组成的群组的赋形剂：淀粉、明胶、葡萄糖、无水乳糖、自由流动的乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、阿拉伯胶、黄蓍胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠和氯化钠。

在某些实施方案中，本发明提供以上药物组合物，其进一步包含防腐剂、抗氧化剂和稳定剂中的至少一种。

在某些实施方案中，本发明提供以上药物组合物，其包含选自由苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯组成的群组的防腐剂。

在某些实施方案中，本发明提供以上药物组合物，其中所述细菌菌株是冻干的。

在某些实施方案中，本发明提供以上药物组合物，其中当组合物存储在密封容器中约4℃或约25℃下且容器置于具有50％相对湿度的气氛中时，在至少约1个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年时期后如以菌落形成单位测量，至少80％细菌菌株残留。

培养方法

用于本发明的细菌菌株可以使用如例如参考文献[40-42]中详述的标准微生物学技术培养。

用于培养的固体或液体培养基可以是YCFA琼脂或YCFA培养基。YCFA培养基可以包括(每100ml，近似值)：酪胨(1.0g)、酵母提取物(0.25g)、NaHCO₃(0.4g)、半胱氨酸(0.1g)、K₂HPO₄(0.045g)、KH₂PO₄(0.045g)、NaCl(0.09g)、(NH₄)₂SO₄(0.09g)、MgSO₄·7H₂O(0.009g)、CaCl₂(0.009g)、刃天青(0.1mg)、氯化血红素(1mg)、生物素(1μg)、钴胺素(1μg)、对氨基苯甲酸(3μg)、叶酸(5μg)和吡哆胺(15μg)。

用于疫苗组合物中的细菌菌株

本发明人已经确定本发明的细菌菌株可用于治疗或预防由IL-17或Th17通路介导的疾病或病状。此可能是本发明的细菌菌株作用于宿主免疫系统的结果。因此，当作为疫苗组合物施用时，本发明的组合物也可用于预防由IL-17或Th17通路介导的疾病或病状。在某些此类实施方案中，本发明的细菌菌株可以是杀死的、灭活的或减毒的。在某些此类实施方案中，组合物可以包含疫苗佐剂。在某些实施方案中，组合物用于通过注射，例如通过皮下注射施用。

通则

除非另外指明，否则本发明的实施将采用在本领域技能内的常规化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学方法。此类技术在文献中充分解释。参见例如参考文献[43]和[44-50]等。

术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如“包含”X的组合物可以仅仅由X组成，或可以包括其它某物，例如X+Y。

关于数值x的术语“约”是任选选用的并且意指例如x±10％。

词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可完全不含Y。必要时，本发明的定义中可以省略词语“基本上”。

提及两种核苷酸序列之间的序列一致性百分比意指在比对时，比较两种序列中相同的核苷酸百分比。此比对和同源性或序列一致性百分比可以使用本领域中已知的软件程序，例如参考文献[51]的部分7.7.18中描述的软件程序确定。优选比对通过Smith-Waterman同源性搜索算法使用仿射空位搜索(其中开放空位罚分是12且空位延伸罚分是2、BLOSUM 62矩阵)来确定。Smith-Waterman同源性搜索算法在参考文献[52]中公开。

除非特别陈述，否则包括多个步骤的工艺或方法可以在方法开始或结束包括其它步骤，或可以包括其它插入步骤。此外，适当时步骤可以组合，省去或以替代次序进行。

本文中描述本发明的多个实施方案。应了解每个实施方案中说明的特征都可以与其它所说明的特征组合以提供其它实施方案。具体来说，本文中强调为适合、典型或优选的实施方案可以彼此组合(除非其互斥时)。

用于进行本发明的模式

实施例1-房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型中细菌接种物的功效

概述

向小鼠施用包含根据本发明的细菌菌株的组合物，且随后用房尘螨(HDM)提取物激发以引起过敏性发炎反应。对HDM的发炎反应包括嗜酸性粒细胞和中性粒细胞性组分，由IL-17和Th17通路介导，并且是哮喘模型。将用本发明组合物治疗的小鼠所展现的发炎反应的量值和特征与对照组相比。发现本发明的组合物减轻发炎反应，并且减少嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞募集，表明其可用于治疗IL-17和Th17介导的病状，例如嗜酸性粒细胞增多、中性粒细胞增多和哮喘。

菌株

433：人罗氏菌

研究设计

组：

1.阴性对照组。用媒介物对照物处理(经口)。

2.用治疗性细菌接种物菌株433处理(经口)。

7.阳性对照组。用地塞米松处理(腹膜内)。

8.未处理的对照组。

每组小鼠数目＝5

第-14天到第13天：每日经口施用媒介物对照物(组1)。

第-14天到第13天：每日经口施用治疗性细菌接种物(组2-6)。

第0、2、4、7、9、11天，经鼻施用于30ul体积PBS中的15ug HDM(房尘螨提取物-目录号：XPB70D3A25，批号：231897，Greer Laboratories,Lenoir,NC,USA)(组1-8)。

第0、2、4、7、9、11天施用地塞米松(腹膜内，3mg/kg，Sigma-Aldrich，目录号D1159)(组7)。

第14天处死所有动物用于分析。

小鼠总数＝40。

终点和分析

在第14天，通过腹膜内注射致命戊巴比妥(pentabarbitol)(Streuli Pharma AG,Uznach,目录号：1170139A)处死动物，接着立刻进行支气管肺泡灌洗(BAL)。

细胞与BAL(支气管肺泡灌洗)流体分离并进行细胞分类计数(200个细胞计数/样品)。

材料与方法

小鼠。从Charles River Laboratories购买雌性7周龄BALB/c小鼠且随机分配到笼，每笼都5只小鼠(通风笼来源于Indulab AG,Gams,Switzerland笼型：“The SealsafeTM-IVC笼。产品号1248L)。笼标记有研究号、组号和实验开始日期。每周监测小鼠且适应设施7天，接着开始研究(研究第-14天)。在研究第-14天动物是8周龄。饮用水和食物可随意取用。存在笼富集。根据地方特许牌照号2283.1(经Service de la consommation et desaffaires vétérinaires du Canton de Vaud颁予和批准)进行动物的每日护理。饮用水和食物可随意取用且每日补充一次。存在笼富集。观测到如瑞士官方根据FVO(FederalVeterinary Office)关于实验动物饲养管理、遗传修饰动物产生和动物实验方法的条例455.163所给出的动物福利规定。

培养细菌接种物。在无菌工作站内，通过将手套手温热使细菌的低温小瓶解冻且约0.7ml内含物注射到含有8ml厌氧YCFA的亨盖特管(Hungate tube)(目录号1020471，

Ochs,Bovenden-Lenglern,Germany)中。通常每个菌株准备两个管。接着亨盖特管在37℃下培育(静止)长达24-26小时(菌株433)。

培养媒介物对照物。将含有8ml厌氧YCFA的亨盖特管在37℃下培育(静止)16小时。

施用细菌接种物或媒介物对照物。将400ul培养的细菌接种物或媒介物对照物每天根据经口管饲法施用。

鼻内敏化。通过腹膜内注射每公斤9.75mg xylasol和48.75mg ketasol(Dr.E.Graeub AG,Bern,Switzerland)使小鼠麻醉且每个鼻施用于30ul体积PBS中的15ugHDM(目录号：XPB70D3A25，批号：231897，Greer Laboratories,Lenoir,NC,USA)。

制备和施用阳性对照化合物地塞米松。地塞米松21-磷酸二钠盐(Sigma-Aldrich，目录号D1159，货号N°SLBD.1030V)溶解在H₂O中，且以3mg/kg的剂量于200ul体积中在以上研究方案中指示天数经口施用动物。

终末程序。在第14天，通过腹膜内注射致命戊巴比妥(Streuli Pharma AG,Uznach,目录号：1170139A)处死动物，接着立刻进行500ul生理食盐水中支气管肺泡灌洗(BAL)。

测量BAL中的细胞浸润。细胞与BAL流体分离并基于标准形态学和细胞化学标准进行细胞分类计数。

图表和统计分析。所有图表都用Graphpad Prism第6版产生并应用单向ANOVA。来自统计分析的结果具备个别数据表。误差线表示平均标准误差(Standard Error of theMean，SEM)。

结果和分析

实验结果展示于图1-9中。

在用细菌或媒介物处理的小鼠中未记录到发病或死亡。两种对照物媒介物处理(阴性对照)和地塞米松处理(阳性对照)如所预期表现，其中地塞米松处理后记录到嗜酸性粒细胞增多和中性粒细胞增多减弱。

菌株433有效减轻过敏性发炎反应的程度。如图2和3中所示，施用菌株433减少BAL中嗜酸性粒细胞总量和嗜酸性粒细胞的比例，此表明减少的嗜酸性粒细胞增多。此外，如图6和7中所示，相对于仅仅媒介物的对照物，施用菌株433引起BAL中嗜中性粒细胞总量和嗜中性粒细胞的比例统计上显著减少。

实施例2-严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型中细菌接种物的功效

概述

向小鼠施用包含根据本发明的细菌菌株的组合物且随后通过皮下施用房尘螨(HDM)提取物来敏化，并且通过鼻内施用HDM激发，以模拟严重中性粒细胞性哮喘的发炎反应。将用本发明组合物治疗的小鼠所展现的发炎反应的量值和特征与对照组相比。发现本发明的组合物减轻发炎反应，并且尤其减少嗜中性粒细胞的募集，方式与包括施用抗IL-17抗体的阳性对照物相当。因此，数据表明本发明的组合物可用于治疗IL-17和Th17介导的病状，例如中性粒细胞增多和哮喘。

菌株

433：人罗氏菌

研究设计

组：

1.阴性对照组。用媒介物对照物处理(经口)。

2.用治疗性细菌接种物菌株433处理(经口)。

7.阳性对照组。用抗IL-17处理(腹膜内)。

8.未处理的对照组。

9:健康小鼠(基线)。

每组小鼠数目(组1-8)＝5

第-14天到第17天：每日经口施用媒介物对照物(组1)。

第-14天到第17天：每日经口施用治疗性细菌接种物(组2-6)。

第0天：用CFA中HDM敏化(皮下)(组1-8)。

第7天：用CFA中HDM敏化(皮下)(组1-8)。

第13、15、17天：经腹膜内施用抗IL-17中和抗体(组7)。

第14、15、16、17天：经鼻用30ul PBS中HDM激发(组1-8)。

第18天：处死所有动物用于分析。

终点和分析：

在第14天，通过腹膜内注射致命戊巴比妥(Streuli Pharma AG,Uznach,目录号：1170139A)处死动物，接着立刻进行支气管肺泡灌洗(BAL)。细胞与BAL流体分离且进行细胞分类计数(200个细胞计数/样品)。

材料与方法

小鼠。从Charles River Laboratories购买雌性7周龄C57BL/6小鼠且随机分配到笼，每笼都5只小鼠(通风笼来源于Indulab AG,Gams,Switzerland笼型：“The SealsafeTM-IVC笼。产品号1248L)。笼标记有研究号、组号和实验开始日期。每周监测小鼠且适应设施7天，接着开始研究(研究第-14天)。在研究第-14天动物为8周龄。饮用水和食物可随意取用。存在笼富集。根据地方特许牌照号2283.1(经Service de la consommation et desaffaires vétérinaires du Canton de Vaud颁予和批准)进行动物的每日护理。饮用水和食物可随意取用且每日补充一次。存在笼富集。观测到如瑞士官方根据FVO(FederalVeterinary Office)关于实验动物饲养管理、遗传修饰动物产生和动物实验方法的条例455.163所给出的动物福利规定。

培养细菌接种物。在无菌工作站内，通过将手套手温热使细菌的低温小瓶解冻且约0.7ml内含物注射到含有8ml厌氧YCFA的亨盖特管(目录号1020471，

Ochs,Bovenden-Lenglern,Germany)中。通常每个菌株准备两个管。接着亨盖特管在37℃下培育(静止)长达24-26小时(菌株433)。

培养媒介物对照物。含有8ml厌氧YCFA的亨盖特管在37℃下培育(静止)16小时。

施用细菌接种物或媒介物对照物。将400ul培养的细菌接种物或媒介物对照物每天根据经口管饲法施用。

HDM敏化。将PBS中50μg HDM(目录号：XPB70D3A25，批号：231897,GreerLaboratories,Lenoir,NC,USA)在等体积完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA Chondrex Inc.Washington,USA)中乳化，并且在两周内在对侧腰窝上以200μl体积皮下施用两次。第二次免疫接种后一周，通过腹膜内注射每公斤9.75mg xylasol和48.75mgketasol(Dr.E.Graeub AG,Bern,Switzerland)使小鼠麻醉，接着连续4日，以30ul体积PBS中15μg HDM鼻内激发。最终激发后一天进行分析。

阳性对照化合物抗小鼠IL-17抗体的制备和施用。抗IL-17中和抗体来源于Bio XCell且存储在4℃下(克隆17F3，目录号BE0173，Bio X Cell)，且经腹膜内以12.5mg/kg的剂量在以上研究方案中指示天数施用。

终末程序。在第18天，通过腹膜内注射致命戊巴比妥(Streuli Pharma AG,Uznach,目录号：1170139A)处死动物，接着立刻进行500ul生理食盐水中支气管肺泡灌洗(BAL)。

测量BAL中的细胞浸润。细胞与BAL流体分离并基于标准形态学和细胞化学标准进行细胞分类计数。

图表和统计分析。所有图表都用Graphpad Prism第6版产生并应用单向ANOVA。来自统计分析的结果具备个别数据表。误差线表示平均标准误差(SEM)。

结果和分析

实验结果展示于图10-18中。

在用细菌或媒介物处理的小鼠中未记录到发病或死亡。如图11、12、15和16中所示，用菌株433处理的某些小鼠展现减少的嗜酸性粒细胞增多和中性白细胞增多。

实施例3-II型胶原蛋白诱发的关节炎小鼠模型中细菌接种物治疗关节炎的功效

材料与方法

菌株

433：人罗氏菌

细菌培养物

细菌培养物在厌氧工作站(Don Whitley Scientific)中生长用于施用。

细菌菌株#433使用甘油原液生长。甘油原液存储在-80℃下。每周三次，甘油原液在室温下解冻且在YCFA盘上划线。每次使用新的甘油等分试样。使细菌在给定盘上生长多达72小时。

待施用动物的溶液每日制备两次，上午(AM)和下午(PM)处理具有八小时时间间隔。从划线盘挑选菌落，并且转移到含有YCFA培养基的管中。使细菌菌株#433生长24小时，接着AM施用。细菌以1％传代培养到YCFA培养基中进行PM施用。在上午和下午处理制备后记录每一菌株的OD值。

II型胶原蛋白诱发的关节炎小鼠模型

成年雄性DBA/1小鼠随机分配到实验组并使其适应两周。在第0天，通过皮下注射100微升含有100微克II型胶原蛋白(CII)于补充有4mg/ml结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)H37Ra的不完全弗氏佐剂中的乳液来施用动物。在第21天，通过皮下注射含有100μg II型胶原蛋白于不完全弗氏佐剂中的加强乳液来施用动物。

根据以下施用时程给与处理。从第-14天直到第45天实验结束，将动物每周称重三次。从第21天直到实验结束，每周针对关节炎的临床征象，包括后爪和前爪、桡腕(腕)关节和胫跗(踝)关节的肿胀对动物评分三次。

在第45天，挑选小鼠并且取终末血液样品用于细胞因子分析。

在第-14天、第0天和第45天，收集粪便样品用于微生物分析，立刻速冻且存储在-80℃下。

胶原蛋白诱发的关节炎(CIA)小鼠模型是公认的类风湿性关节炎小鼠模型[53]。用CII免疫接种引起包括类风湿性关节炎的若干重要病理学特征，包括滑液增生、单核细胞浸润和软骨退变的发病机理。重要地，CIA的发展由Th17细胞，通过分泌IL-17A介导[54]。潜伏在关节炎模型下的免疫反应通过使用补充有结核分枝杆菌的弗氏佐剂增强。

在第21天，从每组中三个卫星动物收集脾。细胞在II型胶原蛋白存在或不存在下培养72小时。通过Luminex定量培养物上清液中和终末血清中的包括TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17在内的细胞因子。使用氚化胸腺嘧啶并入法定量细胞增殖。

处理组和剂量

所有组n＝15(主要研究组n＝12且卫星组n＝3)。

用于生物治疗剂的媒介物是酵母提取物-酪胨-脂肪酸(YCFA)培养基。

PO：经口管饲法，SC：皮下注射，BID：每天两次，CFA：完全弗氏佐剂

体重

从第-14天直到实验结束，将动物每周称重三次。将数据绘图(平均值±SEM)。

非特定的临床观测结果

从第-14天到实验结束，每日检查动物的非特定临床征象，包括姿势异常(弓背)、异常皮毛情况(竖毛)和异常活动水平(活动减少或增加)。

临床观测结果

从第21天直到第45天实验结束，每周针对关节炎的临床征象，包括后爪和前爪、桡腕(腕)关节和胫跗(踝)关节的肿胀对动物评分三次。使用以下量表对每肢评分：(0)正常，(1)轻微肿胀，(2)轻度肿胀，(3)中度肿胀和(4)严重肿胀。通过加入每肢评分计算临床评分。动物的最大可能临床评分是(16)。挑选两个连续时刻的评分等于(12)的动物和任一时刻评分超过(12)的动物。将数据绘图(平均值±SEM)。

细胞增殖分析

第21天，每组挑选三个卫星动物且将脾解剖出。脾细胞在II型胶原蛋白存在或不存在下培养72小时。72小时后，细胞在氚化胸腺嘧啶存在下脉冲过夜。通过测量胸苷并入来定量细胞增殖。将数据绘图(平均值±SEM)。取上清液并测试关键细胞因子的存在。

细胞因子分析

通过Luminex测试来自脾细胞培养物的终末上清液以定量TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17。将数据绘图(平均值±SEM)。

微生物分析

在第-14天、第0天和第45天，从每个动物收集粪便样品，立刻速冻且存储在-80℃下。盲肠(包括内含物)立刻速冻且存储在-80℃下。每日通过涂铺细菌进行细菌鉴别测试。

组织病理学

在实验结束时，后爪存储在组织固定剂中。样品转移到脱钙溶液中。将组织样品加工，切片，并用苏木精与曙红染色。通过对实验设计不知情的合格组织病理学家，针对关节炎征象，包括发炎、关节软骨破坏和下层干骺端骨骼的破坏，对切片评分。使用详述评分系统(见下文)。将数据绘图(平均值±SEM)。提供原始和分析数据以及代表性图。

表1：组织病理学评分系统

结果和分析

存活和非特异性临床观测结果

一些动物因关节炎的临床征象的严重度或因非特定临床观测结果的严重度而在研究时程结束之前被淘汰。

2只动物在预处理时期(第-14天到第0天)期间被淘汰或发现死亡：组1中的1只动物(媒介物处理的动物从供应者处到达后断腿且淘汰)和组6中的一只动物(生物治疗剂#433处理)。

10只动物因关节炎临床征象的严重度而被淘汰：组1中的5只动物(媒介物处理)和组6中的5只动物(生物治疗剂#433处理)。

4只动物因包括姿势异常(弓背)、异常皮毛情况(竖毛)、异常活动水平(活动减少)在内的非特定临床征象的严重度而淘汰：组1中3只动物(媒介物处理)和组6中1只动物(生物治疗剂#433处理)。

体重

从第-14天直到第0天记录体重数据，且表示为初始(第-14天)体重的百分比，通过双向ANOVA，接着邓尼特事后检验(Dunnett’s post-test)分析，以与第-14天进行多重比较，接着与媒介物处理组进行多重比较。数据呈现于图19中。从分析中排除来自实验时程结束之前被淘汰的动物的数据。

当与第-14天比较时，在媒介物处理组中，在第-9天和第-7天，通过经口管饲法每日施用两次诱发显著体重损失。

从第0天直到第28天记录体重数据，且表示为初始(第0天)体重的百分比，通过双向ANOVA，接着邓尼特事后检验分析，以与媒介物组中第0天进行多重比较，接着与媒介物处理组进行多重比较。数据呈现于图20中。从分析中排除来自实验时程结束之前被淘汰的动物和来自卫星动物的数据。第28天、第35天和第42天数据通过单向ANOVA，接着邓尼特事后检验进一步分析，以与媒介物处理组进行多重比较。

当与媒介物处理组中第0天比较时，在第26天和第28天关节炎临床征象的发作与显著体重丧失有关(p<0.0001)。

临床观测结果

通过双向ANOVA，接着邓尼特事后检验分析临床评分数据，以在媒介物处理组中各天之间进行多重比较，接着在实验组与媒介物处理组之间每天进行多重比较。数据呈现于图21中。从分析中排除从实验结束之前被淘汰的动物记录的数据。当动物因关节炎临床征象的严重度而被淘汰时，报告以下天的最后记录评分且用于统计分析中。

当与第21天比较时，从第28天直到第45天，在媒介物处理组中观测到临床评分显著增加(p<0.0001)。

当从第28天直到第45天与媒介物处理组比较时，生物治疗剂#433诱发临床评分减少，不过差异不显著。

细胞增殖分析

为了使所述分析有效，脾细胞在作为阳性对照刺激物的可溶性抗CD3和抗CD28(抗CD3/CD28)存在下培养以证实细胞的增殖潜能。

在所有实验组中都看到对抗CD3/CD28的强烈增殖反应，展示细胞健康、有活力且能够对活化信号作出反应。

为了测试在II型胶原蛋白(CII)存在下的增殖反应，脾细胞在50μg/ml CII存在下培养。通过双向ANOVA，接着斯达克事后检验(Sydak’s post-test)，分析对CII的脾细胞增殖反应，以在未刺激与CII刺激的脾细胞之间进行多重比较，且通过单向ANOVA，接着邓尼特事后检验分析，以将不同实验组与媒介物处理组中CII刺激的反应进行比较。数据呈现于图22中。

当与媒介物处理组中未刺激脾细胞比较时，CII诱发³H-胸苷并入(cpm)极显著增加(p<0.0001)。

用生物治疗剂#433处理的组证明CII诱发的脾细胞增殖水平显著低于媒介物处理组。

组织培养上清液中细胞因子水平

通过luminex分析，在来源于抗CD3/CD28刺激的培养物的组织培养上清液中，测量每种细胞因子的水平。这些展示所有测量的细胞因子的稳固反应(媒介物组中平均水平如下：IL-4＝6,406pg/ml；IL-6＝306pg/ml；IL-10＝10,987pg/ml；IL-17A＝11,447pg/ml；IFN-γ＝15,581pg/ml；TNF-α＝76pg/ml)。

以下部分概括从II型胶原蛋白刺激的培养物获得的数据。适用时，未刺激和CII刺激的脾细胞的上清液中细胞因子水平之间的差异统计分析使用双向ANOVA，接着斯达克事后检验进行，以进行多重比较，而单向ANOVA、接着邓尼特事后检验用于比较生物治疗剂处理组与媒介物处理组的CII刺激的反应。在两种情况下所述组之间的细胞因子水平无显著差异。此可能归因于使用的样本尺寸小(n＝3)。

为了更精确地呈现细胞因子的数据分布与数据的大体布置，此作为散布图呈现。

在用CII刺激后组织培养上清液中IL-4的组平均值<5pg/ml。这些不视为生物学上显著的且此处不包括。用胶原蛋白刺激后组织培养上清液中TNF-α的组平均值低于定量限度。

上清液的IFN-γ水平(图23)

与IL-17一起，IFN-γ是CIA模型中驱动疾病的主要细胞因子。图23中的散布图证明CII刺激后的IFN-γ水平，与生物治疗剂比较，媒介物处理组的组中位数更高。

上清液的IL-17A水平(图24)

在媒介物处理组的CII刺激的培养物中IL-17A水平是50pg/ml。与媒介物处理比较，在生物治疗剂组中此细胞因子的水平似乎较低。

上清液的IL-10水平(图25)

媒介物处理组中CII刺激和培养基对照培养物的IL-10水平分别是13pg/ml和2.1pg/ml。可预期媒介物处理组的IL-10(其是消炎细胞因子)水平较高，因为发炎和促炎细胞因子诱发可以伴随有消炎反馈机制。

上清液的IL-6水平(图26)

例如IL-6和TNF-α等发炎细胞因子在抗CII培养物中通常产生水平不高。然而，其水平可能由于免疫调节而改变。CII刺激的培养物中IL-6水平少，达到10pg/ml。虽然高于培养基对照培养物，但这些差异太小，以致于无法提供进行统计分析的基本原理。

微生物分析

通过使用光谱仪测量600nm下光密度来证实细菌生长。通过比较划线盘图像与参考图像，证实细菌身份。

在改良的细菌制备方法后，如测量的高OD值所指示，从第-2天和第-3天施用一致高剂量的细菌菌株。

在第-14天、第0天和终止时收集粪便样品并速冻。

组织病理学

组织病理学结果展示于图65-69中。如对此模型所预期，根据关节炎存在/不存在或存在的改变严重度，观测个体内和个体间变化性。

病理性质如针对此模型所预期，滑膜和滑液囊大范围混合型慢性活动性发炎，延伸到涉及关节周围的软组织(肌肉、脂肪组织、皮肤胶原蛋白)。在最严重受影响的关节中，存在关节软骨退化和丧失，具有关节内碎片和发炎以及关节和骨结构因纤维化和发炎而破坏。

组织病理学改变的发生率是：媒介物-80％(16/20)；生物治疗剂#433-55％(12/22)。当与媒介物处理组比较时，用生物治疗剂#433处理减少小鼠后肢中组织病理学评分的发生率(参见图65-68)。通过单向ANOVA，针对非参数数据(克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test))分析组织病理学评分，接着邓尼特事后检验，与媒介物处理组进行多重比较，不过生物治疗剂#433所实现的减少在此分析中非统计学上显著。当与媒介物处理组比较时，生物治疗剂#433诱发在组织病理学中观测到的关节发炎评分减少。当与媒介物处理组比较时，生物治疗剂#433诱发在组织病理学中观测到的软骨破坏评分减少。当与媒介物处理组比较时，生物治疗剂#433诱发在组织病理学中观测到的骨骼破坏评分减少。当与媒介物处理组比较时，生物治疗剂#433诱发总组织病理学评分减少。

概述

如DBA/1小鼠中关节炎模型中所预期，从II型胶原蛋白第一次施用后第28天观测到临床评分增加。生物治疗剂#433展示在此模型中有效治疗关节炎。生物治疗剂#433有效减少临床评分的严重度并且减少关节中的病理性疾病，如组织病理学分析中所证明。

在来自所有实验组的脾细胞培养物中都看到对II型胶原蛋白的增殖回忆反应。胶原蛋白特定的反应在用生物治疗剂#433处理后显著减少(组5)。

大部分所测试的T细胞细胞因子展示在媒介物处理组中II型胶原蛋白刺激的培养基与培养基对照之间可检测的增加。这些增加在生物治疗剂处理组中不如此明显。此广泛证明上述对II型胶原蛋白的增殖回忆反应。

有证据证明抑制Th1/Th17轴，Th1/Th17轴是此模型和人类RA中的病原性反应。降低的细胞因子水平与减少的增殖的相关性暗示免疫调节。无证据证明此调节由Th2相关的IL-4水平增加或免疫调节细胞因子IL-10增加引起。

实施例4-房尘螨诱发的哮喘的小鼠模型中细菌接种物的作用的进一步分析

在实施例1中测试的小鼠进行进一步分析以进一步表征本发明的组合物对过敏性哮喘发炎反应的作用。

材料与方法

在第14天抽血和血清制备。动物的血液样品通过心脏刺穿收集。通过在14000g下离心5分钟，将血清自血液样品分离并存储在-20℃下。

在第14天去除器官。左肺叶收集在福尔马林中以进行改进型组织学分析。收集右肺叶(所有剩余叶)和去除血清以速冻和用于改进型分析。剩余BAL流体速冻用于改进型分析。

血清和BAL流体中抗体水平的测量

通过ELISA分析，在BAL和血清中测量全部IgE和房尘螨(HDM)特异性IgG1抗体产生。

肺分离和组织学分析

左肺叶固定在福尔马林中，接着埋入石蜡中，切片，且用苏木精和曙红和PAS染色。如下盲法进行随后组织学评分：针对发炎(支气管周浸润和血管周浸润)和粘液产生，对每个样品的5个随机视场评分。发炎浸润用以下分级系统评分：

0-正常

1-轻度发炎浸润

2-中度发炎浸润

3-显著发炎浸润

4-严重发炎浸润

5-非常严重发炎浸润

在每个视场中，气道以尺寸测量且粘液细胞数以um定量。

测量肺组织中发炎介体

分离用于定量发炎介体的右肺叶(所有剩余叶)速冻，用于随后通过市售多任务分析(Merck-Millipore)测量CCL11、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-9、IL-17A、CXCL1、CCL3、CXCL2和CCL5。根据制造商的说明书进行分析。

结果和分析

实验结果展示于图27-45中。

支持实施例1中描述的发现，用菌株433处理的小鼠的肺组织中细胞浸润物的分析展示平均发炎评分显著和统计上显著的减少(参见图31和33)。

分析BAL流体和血清中抗体水平(参见图27-30)。观测到细菌处理对血清抗体水平无明确作用。此可以反映实验失败，因为数据的散布和每一处理的误差线大，并且阳性和阴性对照物似乎未如预期起作用。此外，基线血清抗体水平可能已屏蔽任何改变。

类似地，观测到细菌处理对肺组织中细胞因子水平无明确作用(参见图35-45)。再次，此可以反映实验失败，因为数据的散布和每一处理的误差线大，并且阳性和阴性对照似乎未如预期起作用。也可能涉及的作用机制影响较早细胞因子反应，所述细胞因子反应在最终HDM气道激发后第4天不再可检测。归因于所检测的水平的变化性，当解释当前研究中细胞因子数据时应谨慎一些。此变化性可以通过以下事实解释：分离肺组织用于不同分析，且归因于发炎的分布不规则，因此一个肺叶可能不具充分代表性或可与其它小鼠中相同叶匹敌。

实施例5-严重中性粒细胞性哮喘的小鼠模型中细菌接种物的作用的进一步分析

在实施例2中测试的小鼠进行进一步分析以进一步表征本发明的组合物对与严重哮喘相关的中性粒细胞性反应的作用。

材料与方法

在第18天去除器官。左肺叶收集在福尔马林中以进行改进型组织学分析。收集右肺叶(所有剩余叶)和去除血清以速冻和用于改进型分析。剩余BAL流体速冻用于改进型分析。

肺组织中发炎介体的测量(改进型分析)。分离用于定量发炎介体的右肺叶(所有剩余叶)速冻，用于随后通过市售多任务分析(Merck-Millipore)测量IFN-γ、IL-1α、IL-1β、CXCL1、CCL3、CXCL2、CCL5、IL-17A、TNF-α、IL-17F、IL-23和IL-33。根据制造商的说明书进行分析。

血清和BAL流体中抗体水平的测量(改进型分析)。通过ELISA分析，在BAL和血清中测量房尘螨(HDM)特异性IgG1和IgG2a抗体产生。

肺分离和组织学分析(改进型分析)。左肺叶固定在福尔马林中，接着埋入石蜡中，切片，且用苏木精和曙红和PAS染色。如下盲法进行随后组织学评分：针对发炎(支气管周浸润和血管周浸润)和粘液产生，对每个样品的5个随机视场评分。发炎浸润用以下分级系统评分：

0-正常

1-轻度发炎浸润

2-中度发炎浸润

3-显著发炎浸润

4-严重发炎浸润

5-非常严重发炎浸润

结果和分析

实验结果展示于图46-63中。

抗体水平的进一步分析揭露细菌菌株433的功效也反映在BAL流体和血清中HDM特异性IgG1水平降低(参见图46和48)。关于对IgG2a水平的作用的确定结论无法绘图。总体来说，来自抗体分析的数据表明与对抗体同型切换的选择性作用相对比，与总体减少的发炎反应相关的减少。

关于细胞因子水平，如针对实施例4，数据的散布和每一处理的误差线大，且阳性和阴性对照物似乎未如预期必要地起作用。也可能涉及的作用机制影响较早细胞因子反应，所述细胞因子反应在最终HDM气道激发后第4天不再可检测。归因于所检测的水平的变化性，当解释当前研究中的细胞因子数据时应谨慎一些。此变化性可以通过以下事实解释：分离肺组织用于不同分析，且归因于发炎的分布不规则，因此一个肺叶可能不具充分代表性或可以与其它小鼠中相同肺叶匹敌。尽管此变化性，展示菌株433对细胞因子水平的明确消炎作用，且阳性对照物抗IL-17Ab一般如预期起作用。

在以上告诫下，图55中的数据表明用菌株433处理可以实现IFNγ的水平减少，此可以表明与对基质或先天免疫细胞的趋化因子释放(和因此细胞募集)的影响相关的作用机制。IFNγ与Th17通路相关。将此数据集联系在一起，可以得出以下明确结论：在严重中性粒细胞性哮喘的此小鼠模型中菌株433有效保护小鼠避免发炎。

实施例6-多发性硬化的小鼠模型中细菌接种物的功效

概述

向小鼠施用包含根据本发明的细菌菌株的组合物且随后用髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白将小鼠免疫接种以诱发实验自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。EAE是人类多发性硬化最常用的实验模型。发现本发明的组合物对发病率和疾病严重度具有显著作用。

菌株

433：以登记号NCIMB 43283寄存的细菌

研究设计

组：

1.阴性对照组。用媒介物对照物处理(经口)。

5.用治疗性细菌接种物菌株433处理(经口)。

9.阳性对照组。用地塞米松处理(腹膜内)。

10.未处理的对照组。

每组小鼠数目＝10

第-14天到第27天：每日经口施用媒介物对照物(组1)。

第-14天到第27天：每日经口施用治疗性细菌接种物(组5)。

第0-28天：一周施用地塞米松(腹膜内)三次(组9)

第0天：MOG35-55(髓磷脂少突神经胶质细胞糖蛋白-2mg/ml)和CFA(2mg/ml MTB)1:1混合，产生1mg/ml溶液。100μl肽-CFA混合物皮下注射到每个后腿中。腹膜内施用百日咳毒素(300ng)。

第1天：腹膜内施用百日咳毒素(300ng)。

第7天-向前：测量发病率和称重，一周三次。

终点和分析

分析小鼠的发病率和疾病严重度，一周三次。评分盲法进行。使用在0到5范围内的临床评分评估疾病严重度，其中5指示小鼠死亡(参见以下临床评分系统)。

监测

在指示天数，将小鼠称重并观测疾病活动评分和发病率。

疾病活动评分观测结果：

0-与未免疫接种小鼠比较，运动功能无明显变化。

0.5-尾部尖端无力。

1.0-尾巴无力。

1.5-尾巴无力和后腿抑制。

2.0-尾巴无力和后腿虚弱。

或-当观测行走时存在明显头部倾斜征象。平衡性差。

2.5-尾巴无力和后腿打滑。

-或-存在强烈头部倾斜，引起小鼠有时跌倒。

3.0-尾巴无力和后腿完全麻痹。

3.5-尾巴无力和后腿完全麻痹。

外加：小鼠绕笼移动，但当放在其侧面上时，不能恢复常态。

后腿一起在身体一侧上。

4.0-尾巴无力、后腿完全瘫痪和前腿部分瘫痪。

-小鼠最低限度地绕笼移动，但似乎警觉且进食

4.5-后腿完全瘫痪和前腿部分瘫痪，不绕笼运动。

立刻对小鼠执行安乐死并从笼去除。

5.0因严重瘫痪而对小鼠执行安乐死。

当动物具有等于或大于1的疾病活动评分时，认为其具有正发病评分。

结果

研究结果展示于图70和71中。

阴性对照组中疾病诱发成功，其中媒介物对照物和未处理的对照展示高分。用菌株433处理的作用显著并且用菌株433处理的小鼠展现显著降低的发病率和疾病严重度。这些数据指示菌株433可用于治疗或预防多发性硬化。

实施例7-稳定性测试

含有至少一种本文中描述的细菌菌株的本文中描述的组合物存储在密封容器中25℃或4℃下并且容器置于具有30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％相对湿度的气氛中。1个月、2个月、3个月、6个月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年后，至少50％、60％、70％、80％或90％的细菌菌株应残留，如以通过标准规方案测定的菌落形成单位测量。

序列

SEQ ID NO:1(人罗氏菌菌株A2-181 16S核糖体RNA基因，部分序列-AY804148)

SEQ ID NO:2(人罗氏菌A2-183 16S rRNA基因，模式菌株A2-183T-AJ270482)

SEQ ID NO：3(人罗氏菌菌株433的共有16S rRNA序列)

AAGAGTTTGGGHCAGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGAAGCACTTTAATTGATTTCTTCGGAATGAAGTTTTTGTGACTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGTAACCTGCCTCATACAGGGGGATAACAGTTGGAAACGACTGCTAATACCGCATAAGCGCACAGGATTGCATGATCCAGTGTGAAAAACTCCGGTGGTATGAGATGGACCCGCGTCTGATTAGCCAGTTGGCGGGGTAACGGCCCACCAAAGCGACGATCAGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGCGAAGAAGTATTTCGGTATGTAAAGCTCTATCAGCAGGGAAGAAGAATGACGGTACCTGACTAAGAAGCACCGGCTAAATACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTATGGTGCAAGCGTTATCCGGATTTACTGGGTGTAAAGGGAGCGCAGGCGGTACGGCAAGTCTGATGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGTACTGCATTGGAAACTGTCGGACTAGAGTGTCGGAGGGGTAAGTGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTAGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGACGATTACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTCGGGGAGCATTGCTCTTCGGTGCCGCAGCAAACGCAATAAGTATNCCACCTGGGGAGTACGTTCGCAAGAATGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCNTGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGTCTTGACATCCCACTGACAGAGTATGTAATGTACTTTCTCTTCGGAGCAGTGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTCTTAGTAGCCAGCGGTTTGGCCGGGCACTCTAGGGAGACTGCCAGGGATAACCTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGTAAACAAAGGGAAGCAATCCCGCGAGGGGGAGCAAATCTCAAAAATAACGTCTCAGTTCGGACTGTAGTCTGCAACTCGACTACACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTAATGCCCGAAGTCAGTGACCCAACCGCAAGGAGGGAGCTGCCGAAGGCAGGACTGATAACTGGGGTGAAGTCTACRSAGGGTAGCCGTRMMC

SEQ ID NO：4(菌株433基因组序列)-参见电子序列表。

参考文献

[1]Spor et al.(2011)Nat Rev Microbiol.9(4)：279-90.

[2]Eckburg et al.(2005)Science.10；308(5728)：1635-8.

[3]Macpherson et al.(2001)Microbes Infect.3(12)：1021-35

[4]Macpherson et al.(2002)Cell Mol Life Sci.59(12)：2088-96.

[5]Mazmanian et al.(2005)Cell 15：122(1)：107-18.

[6]Frank et al(2007)PNAS 104(34)：13780-5.

[7]Scanlan et al.(2006)JCin Microbiol.44(11)：3980-8.

[8]Kang et al.(2010)Inflamm Bowel Dis.16(12)：2034-42.

[9]Machiels et al.(2013)Gut.63(8)：1275-83.

[10]WO 2013/050792

[11]WO 03/046580

[12]WO 2013/008039

[13]WO 2014/167338

[14]Goldin and Gorbach(2008)Clin Infect Dis.46 Suppl 2：S96-100.

[15]Azad et al.(2013)BMJ.347：f6471.

[16]Stanton and Savage(1983)Appl Environ Microbiol.45(5)：1677-84

[17]Duncan et al.(2006)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.56：2437-2441

[18]Masco et al.(2003)System atic and Apphed Microbiology，26：557-563.

[19]Srutková et al.(2011)J.Microbiol.Methods，87(1)：10-6.

[20]Ye et al.(2015)PLoS One.10(1)：e0117704.

[21]Fabro et al.(2015)Immunobiology.220(1)：124-35.

[22]Yin et al.(2014)Immumogenetics.66(3)：215-8.

[23]Cheluvappa et al.(2014)Clin Exp Immunol.175(2)：316-22.

[24]Schieck et al.(2014)J Allergy Clin Immunol.133(3)：888-91.

[25]Balato et al.(2014)J Eur Acad Dermatol Venereol.28(8)：1016-24.

[26]Monteleone et al.(2011)BMC Medicine.2011，9：122.

[27]Fahy(2009)Proc Am Thorac Soc 6.256-259

[28]Miossec and Kolls(2012)Nat Rev Drug Discov.11(10)：763-76.

[29]Yang et al.(2014)Trends Pharmacol Sci.35(10)：493-500.

[30]Koenders et al(2006)J.Immunol.176：6262-6269.

[31]Amedei et al.(2012)Int J Mol Sci.13(10)：13438-60.

[32]Shabgah et al.(2014)Postepy Dermatol Alergol.31(4)：256-61.

[33]Miyamoto-Shinohara et al.(2008)J.Gen.Appl.Microbiol.，54.9-24.

[34] Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols，ed.by Day andMcLellan，Humana Press.

[35]Leslie et al.(1995)Appl.Environ.Microbiol.61，3592-3597.

[36]Mitropoulou et al.(2013)J Nutr Metab.(2013)716861.

[37]Kailasapathy et al.(2002)Curr Issues Intest Microbiol.3(2)：39-48.

[38]Handbook of Pharmaceutical Excipients，2nd Edition，(1994)，Editcdby A Wade and PJ Weller

[39] Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaroedit.1985)

[40]Hanabook of Microbiological Media，Fourth Edition(2010)RonaldAtlas.CRC Press.

[41]Maintaining Cultures for Biotechnology and Industry(1996)JennieC.Hunter-Cevera，Academic Press

[42]Strobel(2009)MethodsMol Biol.581：247-61.

[43]Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy.20thedition.ISBN：0683306472.

[44]Molecular Biology Techniques：An Intensive Laboratory Course，(Reamet al.，eds.，1998，Academic Press).

[45]Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan，eds.，AcademicPress.Inc.)

[46]Handbook of Experimental Immunology，Vols.I-IV(D.M.Weir andC.C.Blackwell.eds，1986，BlackwellScientific Publications)

[47]Sambrook et al.(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rdedition(Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[48]Handbook of Surface and Colloidal Chemistry(Birdi，K.S.ed.，CRCPress，1997)

[49]Ausubel et al.(eds)(2002）Short protocols in molecular biology，5thedition(Current Protocols).

[50]PCR(Introduction to Biotechniques Series)，2nd ed(Newton&Grahameds.，1997，Springer Verlag)

[51]Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.，eds.，1987)Supplement30

[52]Smith&Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489.

[53]Brand et al.(2007)Nature Protocols.2(5)：1269-1275

[54]Jiao et al.(2014)Immunopathology and Infectious Diseases.184(4)：1085-93.

Claims (13)

1.人罗氏菌(Roseburia hominis)物种的细菌菌株在制备用于治疗或预防哮喘的药物中的用途，所述细菌菌株具有减轻IL-17或Th17发炎反应的作用，其中所述药物被配制为施用于胃肠道，并且所述细菌菌株是以登记号NCIMB 42383保藏的人罗氏菌菌株的细胞或生物纯培养物。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述哮喘是过敏性哮喘或中性粒细胞性哮喘。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述药物用于在哮喘治疗中减少中性粒细胞增多或嗜酸性粒细胞增多。

4.如权利要求1所述的用途，其中所述药物用于在哮喘的治疗或预防中减少IL-17产生或减少Th17细胞分化。

5.如权利要求1所述的用途，其中所述药物用于具有高水平的IL-17或Th17细胞的患者中。

6.如权利要求1所述的用途，其中所述药物用于经口施用。

7.如权利要求1所述的用途，其中所述药物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或载剂。

8.如权利要求1所述的用途，其中所述细菌菌株是冻干的。

9.如权利要求1所述的用途，其中所述药物是疫苗组合物。

10.一种以登记号NCIMB 42383保藏的人罗氏菌菌株的细胞。

11.一种组合物，其包含如权利要求10所述的细胞。

12.如权利要求11所述的组合物，其包含药学上可接受的载剂或赋形剂。

13.一种以登记号NCIMB 42383保藏的人罗氏菌菌株的生物纯培养物。

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