CN107249611A

CN107249611A - 活化的双歧杆菌及其应用方法

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Publication number: CN107249611A
Application number: CN201580071135.XA
Authority: CN
Inventors: D·凯尔; D·米尔斯; S·弗里曼-夏基
Original assignee: Evolutionary Biological System Ltd By Share Ltd
Current assignee: Evolutionary Biological System Ltd By Share Ltd
Priority date: 2014-10-24
Filing date: 2015-10-23
Publication date: 2017-10-13
Also published as: AU2021204822A1; SG11201703298SA; BR112017008284A8; CN114376234A; CA2965663A1; WO2016065324A1; MX2017005260A; US10716816B2; EP3209308B1; US20200397837A1; EP3209308A4; CA2965663C; SG10202002593SA; DK3209308T3; EP3209308A1; BR112017008284A2; US20170304375A1; AU2015335601A1

Abstract

本发明的一些实施方式包括一种组合物和治疗婴儿生态失调的方法。本组合物可能包括活化的双歧杆菌和复合寡糖的混合物，其中复合寡糖可来自人或非人源。

Description

活化的双歧杆菌及其应用方法

发明领域

本发明通常涉及改善健康，更具体地，涉及改善人微生物组群(microbiome)。此外，本发明的实施方式涉及活化的双歧杆菌组合物，制备活化的双歧杆菌的方法，以及组合物的应用，以启动和维持富集双歧杆菌物种的人肠道微生物组群，以推动人类婴儿的胃肠道(GI)和免疫功能的发育。

技术背景

当一个通过阴道分娩的人类婴儿经母乳喂养的时候，他/她会具有与他们生命中任何其它时间相比在组合和多样性方面独特的胃肠道微生物组群。GI微生物组被单一生物所支配，所述单一生物可以高浓度(高达并超过总微生物组的70％)存在。然而，如今一般医院的产科护理标准包括剖腹产手术(C手术)和阴道分娩，之后给予喂养婴儿的人乳或婴儿配方。在许多现代医院环境中，手术套件和母亲手术前后的清洁水平使得在许多情况下，婴儿诞生时不会带有通常在母亲阴道或胃肠道微生物组群中发现的细菌，导致无论是剖腹产还是阴道分娩，无论是母乳喂养还是婴儿配方喂养，婴儿都会生态失调。此外，由于疾病或医疗干涉(例如，抗生素治疗)，婴儿缺少有益双歧杆菌也可能引起生态失调。婴儿微生物组群的生态失调导致增加的胃肠道问题以及延迟或改变的免疫学过程和耐受。认为早期生态失调的结果是对该个体的整个生命周期都有影响。

人乳包含大量复合寡糖(高达总干重的15％)，其形式不能用作婴儿的能量源，也不能用作婴儿肠道中大多数微生物的能量源。某些微生物，例如长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.Infantis)[婴儿双歧杆菌或BI]，具有消耗诸如那些发现于人或牛乳中的特定复合寡糖的独特能力(美国专利号8,198,872和美国公开号2013/0195803，其内容通过引用纳入本文)。当婴儿双歧杆菌与某些复合寡糖接触时，细菌中许多基因被特异性诱导，其蛋白质产物为酶和结合蛋白，负责那些复合寡糖的吸收和内部解构，然后单独的糖组分将被分解代谢，为生物体的生长和繁殖提供能量(Sela等，2008，PNAS，105(48)：第18964-69页)。

发明内容

本发明提供组合物，其包含来自于哺乳动物乳源的分离的复合寡糖组分，任选地，补充了纯化的岩藻糖化/唾液酸化寡糖。哺乳动物乳可来自于人或牛来源，并包括，但不限于，牛来源来自于牛初乳。岩藻糖化寡糖可包括合成生产和纯化的2’-岩藻糖乳糖，3-岩藻糖乳糖，二岩藻糖乳糖，或乳糖-N-岩藻糖戊糖。

在一些实施方式中，所述组合物还包括双歧杆菌，所述双歧杆菌在复合寡糖或膳食聚糖水解和代谢前使其内化。双歧杆菌和复合寡糖的组合可导致双歧杆菌转化为活化的双歧杆菌(ABI)。双歧杆菌优选选自长双歧杆菌(B.longum)，短双歧杆菌(B.breve)，两歧双歧杆菌(B.bifidum)或假小链双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)，并且更优选地，长双歧杆菌是长双歧杆菌婴儿亚种(B.longum subsp.infantis)。

在其它实施方式中，本文所述的任何组合物提供了改善哺乳动物健康的方法，包括将包含来自于哺乳动物乳源的复合寡糖的组合物给予哺乳动物，任选地补充岩藻糖化和/或唾液酸化寡糖，以及在复合寡糖水解前使其内化的双歧杆菌，并且其中岩藻糖化寡糖可以是2’-岩藻糖化乳糖，3-岩藻糖化乳糖，二岩藻糖化乳糖，或乳糖-N-岩藻糖化戊糖的合成生产和纯化形式，其中双歧杆菌优选选自长双歧杆菌，短双歧杆菌，两歧双歧杆菌或假小链双歧杆菌，更优选地，长双歧杆菌是长双歧杆菌婴儿亚种。双歧杆菌通常以1万-1千亿cfu的日剂量提供，更优选地是10亿-500亿，最优选地是50亿-250亿，并且寡糖以1-20g的日剂量提供，更优选地以1-10g的日剂量提供。

附图简述

附图1是描述全基因组表达分析的示意图，证明了在牛乳寡糖(BMO)或乳糖存在下生长的婴儿双歧杆菌细胞差异基因表达。

附图2是证明在牛乳寡糖(BMO)或乳糖存在下生长期间，婴儿双歧杆菌中差异表达的乳寡糖簇基因的选择的示意图。

优选实施方式详述

I.导言

人乳聚糖包含大量人乳寡糖(本文中称为“HMO”)(大约为总重的15％)，其形式不能用作婴儿的能量源，也不能用作婴儿肠道中大多数微生物的能量源。发现HMO可作为游离寡糖(膳食聚糖)或与蛋白质或脂质结合。除了岩藻糖化寡糖，例如2-岩藻糖乳糖(2FL)，3-岩藻糖乳糖(3FL)，或乳糖-N-岩藻糖化戊糖(lacto-N-fucopentaoses)I、II和III，乳中主要的HMO包括乳糖-N-四糖(lacto-N-tetraose)(LNT)，乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)(LNnT)和乳糖-N-己糖(lacto-N-hexaose)，这些是中性HMO。酸性HMO包括唾液酸-乳糖-N-四糖，3’和6’唾液酸乳糖(6SL)。HMO特别高度富集岩藻糖化寡糖(Mills等，美国专利号8,197,872)。在乳腺中生产HMO的酶是由岩藻糖基转移酶2(FUT2)基因编码的酶，其催化岩藻糖残基以α1，2键连接到人乳中发现的寡糖上。已知岩藻糖化寡糖抑制肠道中病原菌的结合。HMO，特别是岩藻糖化的HMO与已知为病原体受体的婴儿肠上皮细胞上的聚糖共享共同的结构基序(German等，WO 2012/009315)。

HMO是哺乳动物肠道中某种双歧杆菌的选择性生长的底物。某种双歧杆菌，例如，但不限于，长双歧杆菌婴儿亚种，具有致力于HMO内化和解构的基因簇。当这种细菌与HMO相互作用时，该基因簇被上调，所述基因簇包含运输和分解代谢岩藻糖化寡糖的基因。已证明某些HMO与长双歧杆菌婴儿亚种的相互作用通过诱导许多基因的表达活化细菌，所述基因包括但不限于HMO基因簇中编码捕获和内化HMO的蛋白以及编码完全分解代谢HMO的酶的那些基因，从而向微生物提供生长繁殖的能量和底物(Underwood，2015，PediatricResearch，77(1-2)：229-35)。上调基因的产物也使长双歧杆菌婴儿亚种移植到肠道粘膜内衬，从而阻止病原微生物的结合(Underwood等，2015，Pediatr.Res.，77：229-235)。已证明活化的细菌具有增加的对肠上皮细胞的结合(Chichlowski等，2012，J.PediatricGastroenteral Nur，55：321-327)。活化的长双歧杆菌婴儿亚种也能够生产推动婴儿粘膜内衬和免疫系统发育的短链脂肪酸(Underwood等，2015，Pediatr.Res.，77：229-235)。因此，新生儿肠道中ABI的增殖对于该婴儿的短期健康和长期存活是有巨大好处的，所述ABI的增殖由母乳中提供的HMO触发且唯一地活化。因此，ABI对新生儿提供巨大的好处，包括，但不限于，相较于在预活化状态下的生物，更高的肠道粘膜结合亲和力，更高的GI移植从而防止其它细菌分化枝生长，更高的短链脂肪酸生产，更高的复合寡糖消耗，以及通过免疫应答标志物的阳性改变测量的更大的免疫应答刺激(Lewis等，2015，Microbiome，3：13；Huda等，2014，Pediatrics，134：2e362-e372)。

在活化的形式中，婴儿双歧杆菌成为人乳寡糖(HMO)的唯一消耗者，并且已被证明可将其在人类婴儿的肠道微生物中的相对比例增加至比其出生时，或者在那些只喂食不含乳寡糖的商业婴儿配方的婴儿中的水平至少高10倍的水平(在消耗HMO之前)，达到母乳喂养婴儿的远端结肠的微生物总量的70％的水平。当婴儿双歧杆菌存在于婴儿的肠道中，并且也提供该婴儿母乳作为唯一的营养来源时，通过粪便的微生物定量测量，婴儿双歧杆菌的量可增加至肠道细菌总量的90％的水平。只要将选择性复合寡糖(例如，给人类婴儿的HMO)的膳食来源提供给婴儿，ABI就会在肠道中保持高浓度，并保持是活化的。一旦复合寡糖源从膳食(例如，在断奶和引入固体食物时)中撤出，婴儿双歧杆菌不再有是活化的，它不再能成功地与其它肠道微生物竞争肠道中的营养物质，并且它的量减少至低于总微生物组群的1％。婴儿双歧杆菌通常在断奶的婴儿、儿童或成人的肠道中不超过总微生物组群的1％的水平。

令人惊讶的是，已证明婴儿双歧杆菌也在从牛乳中分离的寡糖上生长(German，等，WO 2012/009315；Ward，2009，Open Glyceroscience，2：9-15)。牛乳寡糖(称为“BMO”)中选择性支持婴儿双歧杆菌生长的寡糖浓度，相较于人乳，在成熟牛乳中较低。乳中寡糖绝对浓度的差异可能是归因于成熟牛乳中BMO初始水平低，或者由于牛乳中存在将BMO降解为更简单的糖的酶。此外，BMO的结构组合物与HMO的不同(Aldredge等，2013，Glycobiology，(6)：664-76；Mehra等，2014，PLoS One，9(5)：e96040)。例如，BMO在富含唾液酸的组分中比HMO高，而在富含岩藻糖的组分中比HMO低(Zivkovic和Barile，2011，Advance Nutrition，(3)：284-289)。

近来，本发明人已发现与人相关的细菌婴儿双歧杆菌和短双歧杆菌被牛初乳寡糖(BCO)活化，例如在牛初乳寡糖浓缩物(BCOC)中发现的那些。初乳是一种在产后前几天来源于哺乳动物乳房的特殊液体。初乳的组合物与哺乳前儿天取代初乳的成熟乳的组合物有很大的不同。牛初乳寡糖(BCO)或牛初乳寡糖浓缩物(BCO)具有一种与HMO和BMO不同的组合物(美国临时申请号62/155,553，通过引用纳入本文；Tao等，2009，Journal of DairyScience，92：2991-3001)。例如，相较于成熟乳BMO，BCO高度富含唾液酸残基但缺乏许多岩藻糖化寡糖。本发明人还发现，除了HMO基因簇外还存在大量的基因，所述基因簇在长双歧杆菌婴儿亚种与不同寡糖的相互作用上被上调或下调。这些基因中的一些由HMO调控，一些由BMO、BCO或BCOC调控，一些，像HMO簇，由两者调控。

II.定义

术语“寡糖”是指含有通过糖苷键共价连接的3-20个单糖的聚合碳水化合物。在一些实施方式中，寡糖是从人或牛乳/乳清/奶酪/乳制品中纯化的，(例如，从牛乳/乳清/奶酪/乳制品中纯化去除寡糖降解酶)。

术语“分离的”，当应用于寡糖时，是指与哺乳动物乳中的一种或多种其它组分相比，至少富集寡糖的寡糖组合物。在一些实施方式中，纯化寡糖，例如使得寡糖至少部分地与乳中一种或多种其它组分分离。

术语“双歧杆菌”及其同义词是指一种对人体有益的厌氧细菌。双歧杆菌是构成肠道菌群的主要分类群之一，双歧杆菌是位于胃肠道的有益共生细菌，并对其宿主具有健康益处。

术语“合成的”组合物是指通过化学合成步骤生产的且与天然相同的组合物。例如，组合物可包括化学合成并纯化或分离的成分。这不包括哺乳动物天然合成的组合物。

术语“残基”，当应用于寡糖时，是指通过糖苷键连接的寡糖的单糖残基，其可通过酶或酸水解以得到组成性单糖单元。

III.组合物

本文所述组合物包含非病原微生物和/或至少一种诱导非病原微生物变化复合寡糖，使得复合寡糖随后成为微生物的能量源，并且当被哺乳动物摄取时，诱导或活化的微生物为该哺乳动物的肠道提供益处。

A.复合寡糖

在多种实施方式中，组合物包含大量寡糖。寡糖组合物可能源于人或非人聚糖原，并且可能以游离聚糖或蛋白结合聚糖存在。在一些实施方式中，寡糖可以是牛或人乳寡糖。在一些实施方式中，寡糖组合物包含牛乳寡糖(BMO)。牛寡糖可包含来自成熟乳、早期乳、初乳或其浓缩物的寡糖。在一些实施方式中，寡糖可包含，但不局限于，岩藻糖、唾液酸、N-乙酰葡萄糖胺和/或葡萄糖酸残基。

在多种实施方式中，复合乳寡糖包括包含3个己糖(Hex)部分、4个N-乙酰己糖胺(HexNAc)部分和1个岩藻糖(Fuc)部分的寡糖；包含4个己糖部分、4个N-乙酰已糖胺部分和1个岩藻糖部分的寡糖；包含3个己糖部分、5个N-乙酰己糖胺部分和1个岩藻糖部分的寡糖；包含5个己糖部分、4个N-乙酰己糖胺部分和1个岩藻糖部分的寡糖；包含4个己糖部分、5个N-乙酰己糖胺部分和1个岩藻糖部分的寡糖；包含3个己糖部分、6个N-乙酰己糖胺部分和1个岩藻糖部分的寡糖；包含3个己糖(Hex)部分和6个N-乙酰己糖胺(HexNAc)部分的寡糖；包含4个己糖部分和3个N-乙酰己糖胺部分的寡糖；包含3个己糖部分和4个N-乙酰己糖胺部分的寡糖；一种包含6个己糖部分和2个N-乙酰己糖胺部分的寡糖；包含4个己糖部分和4个N-乙酰己糖胺部分的寡糖；包含3个己糖部分和5个N-乙酰己糖胺部分的寡糖；包含5个己糖部分和4个N-乙酰己糖胺部分的寡糖；包含4个己糖部分和5个N-乙酰已糖胺部分的寡糖；以及包含3个己糖部分和6个N-乙酰己糖胺部分的寡糖。示范性的寡糖包括乳糖-N-四糖，乳糖-N-新四糖，乳糖-N-岩藻糖化戊糖I，乳糖-N-岩藻糖化戊糖II，乳糖-N-岩藻糖化戊糖III，乳糖-N-岩藻糖化戊糖V，乳糖-N-己糖，对-乳糖-N-己糖，乳糖-N-新己糖(Lacto-N-Neohexaose)，对-乳糖-N-新己糖，单岩藻糖乳糖-N-己糖(Monofucosyllacto-N-Hexaose)II，异构岩藻糖化乳糖-N-己糖(Isomeric Fucosylated Lacto-N-Hexaose)(1)，单岩藻糖乳糖-N-己糖，异构岩藻糖化乳糖-N-己糖(3)，异构岩藻糖化乳糖-N-己糖(2)，二岩藻糖-对-乳糖-N-新己糖(Difucosyl-Para-Lacto-N-Neohexaose)，二岩藻糖-对-乳糖-N-己糖(Difucosyl-Para-Lacto-N-Hexaose)，二岩藻糖乳糖-N-己糖(Difucosyllacto-N-Hexaose)，乳糖-N-新辛糖(Lacto-N-Neoocataose)，对-乳糖-N-辛糖(Para-Lacto-N-Octanose)，异-乳糖-N-辛糖，乳糖-N-辛糖，单岩藻糖乳糖-N-新辛糖，单岩藻糖乳糖-N-辛糖，二岩藻糖乳糖-N-辛糖I，二岩藻糖乳糖-N-辛糖II，二岩藻糖乳糖-N-新辛糖II，二岩藻糖乳糖-N-新辛糖I，乳糖-N-癸糖(Lacto-N-Decaose)，三岩藻糖乳糖-N-新辛糖，三岩藻糖乳糖-N-辛糖，以及三岩藻糖-异-乳糖-N-辛糖。

在一些实施方式中，本文所述寡糖包含三种或更多种单糖(即，至少为三糖)，并且可以是牛或人乳聚糖，或化学合成的其等同物。复合寡糖可以是，但不局限于，(3Hex，4HexNAc，1Fuc)，(1Gal，1GlcNAc，1NeuAc)和/或(1Glu，1Gal，1NeuAc(3′或6′))。

在一些实施方式中，本文所述寡糖包含Hex(4)；Hex(4)HexNAc(2)；和Hex(3)HexNAc(1)NeuAc(1)中任意一种，其水平高于1％。在另一种实施方式中，所述至少一种寡糖包含以下成分比例之一：1)Hex(2)NeuAc(1)：Hex(2)HexNAc(1)的比例低于5.0；2)Hex(2)HexNAc(1)：Hex(3)HexNAc(1)的比例高于1.0；3)Hex(2)HexNAc(1)：Hex(3)HexNAc(2)的比例高于2.0；4)Hex(3)：Hex(3)HexNAc(1)NeuAc(1)的比例低于100；5)Hex(2)HexNAc(1)：Hex(4)NeuAc(2)NeuGc(1)的比例高于10。

可从任意数量来源中，并使用本领域技术人员已知的方法分离的复合哺乳动物乳寡糖(MMO)。例如，可用本领域已知的方法从人乳中获得HMO。人乳可由国际乳库(美国内华达州斯帕克斯(Sparks，NV，USA))或任意这样等同的乳库提供。人乳可被巴氏杀菌，然后离心脱脂，将其分成奶油(主要是脂肪)和脱脂乳(脱脂产品)。然后可用具有5-10kDa截留值的膜过滤脱脂乳，以浓缩包含复合HMO的蛋白质组分(主要为乳清)和渗透物。所述干燥的HMO组分的组成为约50％的乳糖和约30％的HMO，其余的主要是肽和灰。HMO组分主要是岩藻糖化的。渗透可进一步通过具有1kDa截留值的膜，以去除乳糖，并使渗余物中具有更富集的HMO组分，然后进行喷雾干燥。用任意数量来源和本领域技术人员已知的方法，可类似地分离BMO。例如，可使用在美国公开号20130035481中揭示的纯化方案来分离BMO，其内容通过引用纳入本文。

初乳寡糖(CO)可从哺乳动物来源中分离，例如，但不限于牛(BCO)，人(HCO)，山羊(CCO)，或绵羊(OCO)，并用于本发明。初乳可用作整个初乳或加工，以选择性富集CO组分。方法步骤可包括，但不限于巴氏杀菌，离心，沉淀，超滤和喷雾干燥。一般来说，选择方法以去除、抑制或破坏降解CO的酶。在一些实施方式中，可使用额外的方法步骤消毒产品，以消除任何潜在的细菌或病毒污染。这样的步骤包括，但不局限于常规的巴氏杀菌，超高温(UHT)处理，伽马照射，冷冻和复苏，超声处理，以及微流体破坏。在其它实施方式中，可用本领域已知的方法减少BCO的乳糖含量，例如，但不限于用酶处理提取物以降解乳糖，或通过机械或生物方法选择性去除乳糖。在本发明的其它实施方式中，液体CO混合物用一些方法浓缩和/或干燥，所述方法例如，但不局限于喷雾干燥，冷冻干燥，流化床干燥，隧道干燥和圆筒干燥。

在多种实施方式中，复合寡糖包含所述组合物干重的至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或至少95％。

在可选的实施方式中，复合寡糖还包含合成生产的寡糖，包含岩藻糖乳糖(SPF)和/或合成生产的唾液酸乳糖(sialyllactose)(SPS)或其衍生物，包括，但不局限于2’-岩藻糖乳糖，3-岩藻糖乳糖，二岩藻糖乳糖，乳糖-N-岩藻糖戊糖I，乳糖-N-岩藻糖戊糖II，乳糖-N-岩藻糖戊糖III，乳糖-N-岩藻糖戊糖V，3’-唾液酸乳糖，6’-唾液酸乳糖，3′-唾液酸-3-岩藻糖乳糖，唾液酸乳糖-N-四糖，以及6′-唾液酸乳糖胺(6′-sialyllactosamine)。可使用任何大量来源和本领域技术人员已知的方法获得合成生产的寡糖(SPO)。例如，可使用在美国公不号20130035481中揭示的方案来生产SPF，其内容通过引用纳入本文。

合成生产的寡糖(SPO)可添加于生物生产的哺乳动物乳寡糖(MMO)中，并占组合物干重的至少5％-至少80％。在一些实施方式中，组合物包含MMO和SPF和/或SPS的混合物。在多种实施方式中，SPO占所述组合物干重的1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，或90％。在一些实施方式中，SPF占所述组合物干重的1-50％。在其它实施方式中，SPO占所述组合物干重的5-30％。在其它实施方式中，SPO占所述组合物干重的10-20％。MMO包含所述组合物干重的至少1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或至少95％。在一些实施方式中，MMO包含BCO，其中BCO包含所述组合物干重的至少20％。在另一个优选的实施方式中，BCO包含所述组合物干重的至少50％。在另一个优选的实施方式中，BCO包含所述组合物干重的至少70％。在一些实施方式中，MMO∶SPO的质量比为20∶1至1∶10。在一些实施方式中，该比例为10∶1至1∶2，并且在另一个实施方式中，该比例为5∶1至1。在一些实施方式中，该比例大约为10∶1，大约为9∶1，大约为8∶1，大约为7∶1，大约为6∶1，大约为5∶1，大约为4∶1，大约为3∶1，大约为2∶1，大约为10∶1，大约为1∶2，大约为1∶4，大约为1∶5，大约为1∶6，大约为1∶3，大约为1∶3，10∶2，大约为9∶2，大约为8∶2，大约为7∶2，大约为6∶2，大约为5∶2，大约为4∶2，或大约为3∶2。

B.非病原微生物

在多种实施方式中，所述组合物包含一种或多种非病原微生物，其中一种非病原微生物是来自于其基因编码转运系统的物种，所述转运系统能够在寡糖内部水解之前将一种或多种复合寡糖内化。在多种实施方式中，所述微生物是来自于双歧杆菌属。所述物种可以是，但不局限于，长双歧杆菌，两歧双歧杆菌，短双歧杆菌，假小链双歧杆菌，链状双歧杆菌(B.catenulatum)，或任何表达岩藻糖苷酶的双歧杆菌菌株，或这些双歧杆菌种的任何组合。在一些实施方式中，其中一种物种是长双歧杆菌，并且在优选的实施方式中，其中一种或两种物种是长双歧杆菌婴儿亚种。

在多种实施方式中，双歧杆菌可包含活化的双歧杆菌(ABI)。所述活化的双歧杆菌在本文定义为由上调或下调基因测量的细胞的状态，所述基因包括，但不限于编码寡糖结合蛋白、转运蛋白和负责降解复合寡糖的酶的那些基因，这为新生儿提供了巨大的益处。ABI的这种益处特点包括，但不限于，相较于在预活化的状态下的生物，更高的肠道粘膜结合亲和力，更高的GI移植从而防止其它细菌分化枝生长，更高的短链脂肪酸生产，更高的复合寡糖消耗，以及通过免疫应答标志物的阳性改变测量的更大的免疫应答刺激(Lewis等，2015，Microbiome，3：13；Huda等，2014，Pediatrics，134：2e362-e372)。

在多种实施方式中，双歧杆菌编码含有HMO利用中涉及的ATP结合盒(ABC)转运子和糖基水解酶的基因簇，通常包括一个或多个编码岩藻糖苷酶的基因。在一些实施方式中，双歧杆菌包含编码复合寡糖转运子的基因。在一些实施方式中，双歧杆菌包含编码岩藻糖转运了的基因。在一些实施方式中，双歧杆菌包含编码岩藻糖或唾液酸转运子的基因。在许多实施方式中，编码这些组分的基因被上调或表达。所述基因可被组成型上调或诱导。

可诱导和/或抑制某种生物学标志物作为标志物来预测双歧杆菌物种的活化的状态，由此细菌被最佳地准备好用于复合寡糖的消耗。识别长双歧杆菌婴儿亚种的合适的生物标志物包括上调基因和下调基因。示范性上调基因包括Blon_0042(调控蛋白)；Blon_R0015(tRNA)；Blon_R0017(tRNA)；Blon_R0021(tRNA)；以及Blon_R0022(tRNA)。示范性下调基因包括Blon_0518(假拟蛋白)；Blon_0785(膜脂蛋白(可能的转运组分))；Blon_2167(假拟蛋白)；以及Blon_2168(噬菌体激蛋白C(phage shock protein C))。以前，不知道这些基因与活化的细胞有关。

在一些实施方式中，活化的双歧杆菌包含Blon_0042基因，其中Blon_0042基因已被上调。活化的双歧杆菌可包含Blon_2168基因，其中Blon_2168基因已被下调。在一个实施方式中，活化的双歧杆菌包含Blon_0042基因和Blon_2168基因，其中Blon_0042基因已被上调，且Blon_2168基因已被下调。技术人员可以容易地适应定量蛋白质组学方法来确定这些基因的基因产物(例如，mRNA和蛋白质)的表达水平，以确认活化。

ABI通过在包含上述复合寡糖中的至少一种寡糖的培养基中培养足够的时间，以进行至少一种代谢酶的诱导和生物合成而被活化。所述寡糖通常来源于，或等同于那些哺乳动物乳寡糖(MMO)，包括但不限于，源于人乳和牛乳的那些寡糖。在一些实施方式中，寡糖可以是牛或人乳寡糖。在另一个实施方式中，寡糖是从哺乳动物初乳中获得的。在一些实施方式中，寡糖组合物包含牛乳寡糖(BMO)。牛寡糖可包含来自成熟乳、早期乳、初乳或其浓缩物的寡糖。在一些实施方式中，寡糖包含岩藻糖作为组分糖残基在另一个实施方式中，MMO由合成生产并纯化的寡糖补充，所述寡糖包含岩藻糖化和/或唾液酸化寡糖。在一些本发明的实施方式中，使用合成生产的岩藻糖乳糖(SPF)，唾液酸乳糖(SPS)或其衍生物以比通过BMO单独活化时更似人的方式活化双歧杆菌。在另一个实施方式中，使用所述组合物上调非HMO簇的操纵子。

本文所述的任何组合物可通过在无菌培养基(例如，具有遗传同质性的培养基)上培养双歧杆菌制备，包含牛乳聚糖(例如，从牛初乳浓缩)的培养基变成“活化的”。在多种实施方式中，本文所述的任何组合物可通过分离双歧杆菌；纯化细菌；用纯化的双歧杆菌菌株接种发酵罐；以及在复合牛或人寡糖存在的情况下培养双歧杆菌；并收获细胞来制造。双歧杆菌的发酵可在商业体积(例如1-500m³)的搅拌发酵罐中进行，其在整个发酵过程中保持厌氧条件。发酵可包括在发酵过程中的任何时间向液体培养基中提供至少一种复合寡糖作为唯一或补充的碳源以活化细胞，所述复合寡糖的水平至少为1g/L，通常约为1-50g/L，或2-20g/L，或5-10g/L。

可测试本文所述的双歧杆菌将牛或人乳寡糖用于生长的能力。在一些实施方式中，双歧杆菌能够在哺乳动物乳聚糖上生长，其中，在组合物的培养物不再生长后，保留少于20％的唾液酸含量和20％的岩藻糖含量的乳聚糖。在一些实施方式中，组合物能够在哺乳动物乳寡糖上生长，其中，在组合物的培养物不再生长后，保留少于10％的唾液酸含量和10％的岩藻糖含量的乳聚糖。在一个优选的实施方式中，组合物能够在乳聚糖上生长，其中，在组合物的培养物不再生长后，保留少于5％的唾液酸和5％的岩藻糖的乳寡糖。在一个具体优选的实施方式中，组合物能够在乳聚糖上生长，其中，在组合物的培养物不再生长后，保留少于1％的唾液酸和1％的岩藻糖的乳寡糖。

在其它实施方式中，组合物可包含活菌总量大约为10万-5000亿个菌落形成单位(cfu)每克干重。在其它实施方式中，活菌总量包含50亿-1000亿cfu每克干重。在其它实施方式中，活菌总量包含100亿-500亿cfu每克干重。在一些实施方式中，ABI浓度为10-100g干重每升。发酵产物也可通过过滤或离心来浓缩。ABI可通过可控的干燥方法来干燥，例如但不限于，冷冻干燥。

IV.配置组合物

包含MMO和ABI的组合物可通过将两种组分混合在一起制备。可选地，可将收获的和/或干燥的活化的双歧杆菌细胞与复合牛或人乳寡糖的粉末形式组合。所述收获的和/或干燥的活化的双歧杆菌细胞与复合牛或人乳寡糖的粉末形式可以是单剂量包装，其可含有约1000万-1000亿cfu的细菌，以及可选地，大约0.5g-5g的复合寡糖。复合牛寡糖可存在于粉末状的组合物中，其中活化的双歧杆菌细胞对复合寡糖的混合比例是300亿cfu每1.5g复合寡糖，以粉末形式混合。

本文所述的任何组合物还可包含次级代谢物。所述次级代谢物可以是短链脂肪酸，例如乙酸，乳酸，或其组合。本文所述的组合物还可包含稳定剂，例如流动剂。流动剂可包括淀粉，二氧化硅，磷酸三钙，粉末状纤维素，硬脂酸镁，碳酸氢钠，亚铁氰化钠，亚铁氰化钾，亚铁氰化钙，骨质磷酸盐，硅酸钠，硅酸钙，三硅酸镁，滑石粉，铝硅酸钠，铝硅酸钾，铝硅酸钙，膨润上，硅酸铝，硬脂酸，以及聚二甲基硅氧烷。所述稳定剂可以是乳蛋白或其它合适的药物级或婴儿配方级稀释液(例如，乳糖)。所述乳蛋白可包含脱脂干乳的蛋白质组分。

本文所述的任何组合物还可包含表面碳水化合物结合蛋白(例如溶质结合蛋白)。所述表面碳水化合物结合蛋白可通过结合肠黏膜和/或粘膜层的细胞表面糖基化来使与肠黏膜的结合和相互作用更有效。然后这种表面碳水化合物的结合可排除病原菌的结合。

在多种实施方式中，本文所述的任何组合物可以被干燥(例如，通过喷雾干燥或通过冷冻干燥)，并被配置成单位剂量药物，例如小包装、药囊、口腔崩解片、食品、胶囊、锭剂、泡腾片等。所述单位剂量药物可以由各种材料形成，包括，但不限于塑料或纸。在一些实施方式中，所述单位剂量药物包含隔潮和/或隔氧层。或者，所述组合物可以肛门递送的形式提供，例如栓剂或灌肠剂。优选地，将所述组合物包装在用水和/或氧不透性聚合物制成的药囊中。

在多种实施方式中，本文所述的任何组合物可以干粉制剂、溶液、悬液或片剂或含有或不含有肠衣的胶囊形式提供。所述干粉可以被冷冻干燥或喷雾干燥。所述冷冻干燥的组合物优选地在有合适的冷冻保护剂存在的条件下被冷冻。所述冷冻保护剂可以是，例如，葡萄糖、乳糖、棉子糖、蔗糖、海藻糖、侧金盏花醇(adonitol)、甘油、甘露醇、甲醇、聚乙二醇、丙二醇、核糖醇(ribitol)、海藻酸盐、牛血清白蛋白、肉碱、柠檬酸盐、半胱氨酸、葡聚糖、二甲亚砜、谷氨酸钠、甘氨酸甜菜碱、糖原、亚牛磺酸(hypotaurine)、蛋白胨、聚乙烯吡咯烷酮或牛磺酸。所述肠衣包括，但不限于，脂肪酸、腊、虫胶、塑料、植物纤维、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、琥珀酸乙酸纤维素(cellulose acetate succinate)、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯(hydroxy propyl methyl celluloseacetate succinate)、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯(polyvinyl acetate phthalate)(PVAP)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸偏苯三酸纤维素(cellulose acetatetrimellitate)、海藻酸钠、以及玉米醇溶蛋白(Zein)。

在一些实施方式中，将微生物与冷冻保存剂(例如，但不限于海藻糖或甘油)在厌氧的条件下混合，并通过例如但不限于，快速冷冻(用液氮冷却)的方法或通过可控的温度降低在冷冻保存冷冻系统中将其冷冻。一旦冷冻，微生物可在真空下用以最佳方式保持微生物完整性的方法脱水。干粉中微生物的浓度可以为100万-5000亿cfu/g。在一些实施方式中，所述干粉可以是50亿-1000亿cfu/g，并且在最优选的实施方式中，所述干粉可以是100亿-500亿cfu/g。

在本发明的一些实施方式中，粉状的微生物在食用油中重悬，例如，但不限于甘油三酯油(例如，蔬菜油、橄榄油、以及中链甘油三酯)，甘油二酯油，甘油单酯油，以及硅油。

在一些实施方式中，所述寡糖组合物可溶解于极性液体中，例如，但不限于，水、生理盐水、哺乳动物乳、或婴儿配方，并且可以以液体形式提供给婴儿，而双歧杆菌作为粉末或悬液分别提供到含有寡糖溶液的载体液体中。

在多种实施方式中，所述微生物和寡糖组合物可组合提供或分别提供。在一些实施方式中，微生物与寡糖以单剂量包装组合，所述包装包含大约10-1000亿cfu的微生物和大约0.5-5g的寡糖。

V.用于改善哺乳动物健康的组合物的应用

在多种实施方式中，本文所述的组合物作为预活化和纯化的双歧杆菌组合物递送至有需要的对象，基本上同时将化合物递送至哺乳动物肠道，以使肠道环境成为对上述纯化的双歧杆菌组合物更为有利的小生境，其中所述化合物可包含上文所述的复合寡糖，合成生产和纯化的寡糖，和/或由于肠道发酵所产生的次级代谢产物。

在一些实施方式中，本文所述的应用包含在给予本文所述的组合物之前、期间和/或之后，监测对象的肠道微生物。各种监测技术是本领域的普通技术人员已知的。例如，对象粪便的常规样品可以通过本领域熟知的标准方法定性和/或定量地分析微生物(参见例如，Le Pare等，2014，Food and Nutrition Sciences，5：第71-78页)。

在一些实施方式中，将本文所述的组合物以在对象胃肠道中有效建立高水平的双歧杆菌群体的量和持续时间，给予有需要的对象。在一些实施方式中，将本文所述的组合物以在对象胃肠道中有效维持高水平的双歧杆菌群体的量和持续时间，给予给予有需要的对象。在一些实施方式中，所述组合物以有效的量每天给予，以维持对象肠道中双歧杆菌群体高于哺乳动物总粪便微生物的至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或至少90％。

在一些实施方式中，将包含活化的双歧杆菌的组合物给予有需要的对象。在其它的实施方式中，将包含有合成生产和纯化的寡糖补充的复合寡糖的组合物给予有需要的对象。在一其它实施方式中，将既包含活化的双歧杆菌又包含复合寡糖的组合物给予有需要的对象。在其它的实施方式中，将包含双歧杆菌和有合成生产和纯化的寡糖补充的复合寡糖的组合物给予有需要的对象。

在多种实施方式中，所述双歧杆菌以10亿-1000亿cfu的双歧杆菌和1-20g的复合寡糖每天的剂量给予。在一些实施方式中，给予的剂量为50-500亿cfu/天。在其它实施方式中，给予的剂量为50-1000亿cfu/天。在其它实施方式中，给予的剂量为100-250亿cfu/天。在多种实施方式中，复合寡糖以0.5g-5.0g/天的剂量给予。在一些实施方式中，给予的剂量为1.0g-3.0g/天。

一般地，本发明的组合物以每天给予一次的单个单位剂量包装存在。然而，所述剂量可以以全天适当间隔给予的多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个，或更多)亚剂量存在。或者，它们可以以同样的组成给予，或者可以依次给予组成性成分。在一些实施方式中，治疗持续至少1周，2周，3周，或至少4周的时间。在其它实施方式中，给予治疗至少2个月，4个月，6个月，8个月，10个月，或至少12个月的时间。

有需要的对象可以是，例如，从出生到怀孕后约36个月的婴儿。在其它实施方式中，可将本文所述的组合物给予至少怀孕三个月的孕妇。孕期给予的组合物可包含双歧杆菌或寡糖，或包含两者。在其它实施方式中，将本文所述的组合物以治疗量给予通过阴道分娩或通过剖腹产分娩的婴儿。本文所述的组合物在分娩后立即给予婴儿，并在此后婴儿生命的第一个月至六个月给予。所述组合物可直接给予婴儿，或与液体混合，包括但不限于，母乳、婴儿配方、生理盐水，或水。对于不是母乳喂养的婴儿，本文所述的组合物可选择的以婴儿配方给予，并且这样的组合物可优选的包含活化的婴儿双歧杆菌和乳衍生的寡糖。对于经由剖腹产出生的婴儿，可给予包含活化的双歧杆菌和/或复合寡糖的组合物。对于通过阴通分娩的婴儿，可给予包含活化的双歧杆菌和/或复合寡糖的组合物。

呈现上文描述的本发明的实施方式是出于说明的目的而不是限制。虽然已经参考许多特定细节描述本发明的这些实施方式，但是本领域普通技术人员将认识到，在不脱离本发明的精神的情况下，本发明可以以其它特定形式实施。因此，本领域普通技术人员会理解，本发明不受上述说明性细节的限制，而是由所附权利要求限定。

实施例

提供以下实施例以说明而非限制所要求的发明。

实施例1.某种双歧杆菌专用的人乳寡糖(HMO)组合物的制备

通过与Fournell等(美国专利申请20150140175)描述的相似方法来获得HMO的浓缩混合物。将人乳巴氏杀菌，然后离心脱脂，将其分成乳脂(主要是脂肪)和脱脂乳(脱脂产品)。然后用具有5-10kDa截留值的膜超滤所述脱脂乳，以浓缩蛋白质组分(主要是乳清)。来自超滤的渗透物(包含复合HMO)通过喷雾干燥来干燥。这一干燥部分的组成为约50％的乳糖和约30％的复合寡糖(HMO)，其余的主要是肽和灰。所述HMO组分主要是岩藻糖化的。

这一方法或相似的方法可用于从任何哺乳动物乳源中获得包含分离复合寡糖的组合物。例如，可使用在美国公开号20130035481中揭示的纯化方案来分离复合寡糖，其内容通过引用纳入本文。这类组合物适用于本发明的实施方式。

实施例2.某种双歧杆菌专用的牛初乳寡糖(BCO)组合物和补充有合成生产和纯化的岩藻糖化寡糖(SPF)的组合物的制备

通过如Christiansen等(2010)International Dairy Journal，20：630-636描述的方法来获得牛初乳寡糖的浓缩混合物。牛初乳(主要来源于第一次挤奶)通过加热至145°F持续30分钟进行巴氏杀菌，冷却并离心脱脂，将其分成乳脂(主要是脂肪)和脱脂乳(脱脂产品)。然后用具有5-10kDa截留值的膜超滤所述脱脂乳，以浓缩蛋白质组分(主要是乳清)。乳清渗透物用具有1kDa截留位的膜进一步微滤，以去除一些乳糖并浓缩渗余物中的寡糖。将最终的组合物喷雾干燥，以生产干燥的寡糖组分，其具有大约40％的乳糖和大约40％的复合寡糖(BCO)，其余的主要是肽和灰。所述BCO组分主要是岩藻糖化的。

合成生产和纯化的岩藻糖化寡糖(SPF)可在市场上从任何大量来源获得，或者通过本领域技术人员已知的方法得到。将100g纯化的3-岩藻糖乳糖(SPF；Elicityl SA，法国克洛尔)加入1kg BCO制品中，并充分混合以生产BCO/SPF组合物，其中BCO∶SPF的比例大约为4∶1。分析样品，并且复合寡糖组分是约20％的岩藻糖化的寡糖。

这一方法或相似的方法可用于从任何补充有具体合成寡糖的哺乳动物乳源中获得包含复合寡糖的组合物。这样的组合物适合用于本发明的实施方式中。

实施例3.BCO，BCOC，BMO和HMO组分间的差异

BCOC组分作为Immunel(美国斯特林技术公司(Sterling Technology，USA))可在市场上获得，并采用Tao等，(2008)，J Dairy Science，92：2991-3001的HPLC-MS方法进行分析，并在表1中与源于人乳(HMO)、成熟牛乳(BMO)和牛初乳(BCO)的寡糖组分进行比较。表1中的四个组合物彼此间有显著不同，并且立即显现了几个特征。BCOC包含BMO、BCO或HMO中没有发现的若干寡糖，例如Hex(4)和Hex(3)HexNAc(1)NeuAc(1)，并且在BCO和BMO中发现的若干寡糖在BCOC中不存在，例如Hex(2)HexNAc(1)NeuAc(1)，Hex(3)HexNAc(2)，以及Hex(4)NeuAc(2)NeuGc(1)。

表1.区分如Tao(2009)中揭示的初乳和BMO组分，如Mills等(2012)揭示的HMO组分，以及本发明的牛初乳寡糖浓缩物(BCOC；Immunel)的关键寡糖。列出的值是总样品寡糖的百分比。

此外，如表2所示，各种牛寡糖间的比例在牛源之间也十分不同。BCOC的Hex(3)：Hex(3)NeuAc(1)的比例高于1.0，BCOC的Hex(3)：Hex(4)HexNAc(2)的比例低于20，且BCOC的Hex(2)HexNAc(1)：Hex(4)的比例低于20。另外，这些牛寡糖组合物全部与HMO不同，不同之处在于，除了比例差异外，所有牛寡糖样品的其它特征是低于50％的岩藻糖化。此外，大约70％的牛早期乳寡糖是唾液酸化的，相比之下BMO、HMO中为50％，并且成熟BMO中完全不存在构成牛早期乳中70％的唾液酸的N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid)(Tao，2009)。甚至没有指定岩藻糖化或唾液酸化，甚至考虑所有牛和人寡糖时，也存在本发明的BCOC中独特的复合寡糖的一些比例。这种独特的BCOC寡糖的特征包括；1)Hex(2)NeuAc(1)：Hex(2)HexNAc(1)的比例低于5.0；2)Hex(2)HexNAc(1)：Hex(3)HexNAc(1)的比例高于1.0；3)Hex(2)HexNAc(1)：Hex(3)HexNAc(2)的比例高于2.0；4)Hex(3)：Hex(3)HexNAc(1)NeuAc(1)的比例低于100；以及5)Hex(2)HexNAc(1)：Hex(4)NeuAc(2)NeuGc(1)的比例高于10(表2)。

寡糖比例	BCO	BCOC	BMO	HMO
					Hex(2)NeuAc(1)：Hex(2)HexNAc(1)	7.8	1.5	14.2	182.0
Hex(2)HexNAc(1)：Hex(3)HexNAc(1)	0.6	2.5	0.2	0.0
					Hex(2)HexNAc(1)：Hex(30HexNAc(2)	0.6	1710.0	0.6	1.0
Hex(3)：Hex(3)HexNAc(1)NeuAc(1)	227.0	17.5	1870.0	148.0
					Hex(2)HexNAc(1)：Hex(4)NeuAc(2)neuGc(1)	1.0	1710.0	6.1	1.0

					Hex(3)：Hex(3)NeuAc(1)	0.5	7.1	0.8	148.0
Hex(3)：Hex(4)HexNAc(2)	227.0	5.0	36.0	3.6
					Hex(2)HexNAc(1)：Hex(4)	26.2	12.2	159.0	1.0

					岩藻糖化寡糖(总量的％)	0.00	0.00	0.00	0.00

表2.在源于表1的BCO、BCOC、BMO和HMO中发现的特定寡糖的比例。

这一实施例说明了HMO、BMO、BCO和BCOC具有显然不同的组分。然而，这四种混合物都能够活化婴儿双歧杆菌。

实施例4.专用某种复合寡糖的活化的双歧杆菌(ABI)组合物的制备。

将长双歧杆菌婴儿亚种(本文可选择地婴儿双歧杆菌)从通过阴道分娩的、母乳喂养的人类婴儿的粪便中分离并纯化，并且通过DNA分析证实其鉴定，所述鉴定反映了与该生物体特异性相关的基因集的存在(Sela等，2008，PNAS，105(48)：第18964-69页)。或者，可从商业培养物保藏中心中获得婴儿双歧杆菌的菌株，如华盛顿特区的美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

在500L搅拌发酵罐中，将这一生物的种子培养物加入包含葡萄糖和BCO组合物以及其它标准盐和维生素的生长培养基中，所述BCO组合物是使用实施例2中所述的方法制备的。在厌氧条件下生长3大后，测试该培养物样品中ABI的存在。通过表达的岩藻糖苷酶或唾液酸酶基因转录物的存在鉴定ABI。通过离心收获发酵罐，并将浓缩的细胞与冷冻保护剂(如海藻糖加上乳蛋白)混合并冷冻干燥。最终的干燥产物为5.5kg的细菌，计数为130×10⁹cfu/g。

这一实施例说明了，可通过将双歧杆菌与复合牛乳寡糖共培养来活化双歧杆菌。虽然本文使用了BCO，可使用这一方法或相似的方法，通过与源于任何哺乳动物乳的MMO共培养来获得ABI。这样的ABI适合用于本发明的实施方式。

实施例5.活化生长在复合寡糖上的双歧杆菌用于乳寡糖的消耗

婴儿双歧杆菌ATCC 15679在包含2％的乳糖或牛乳寡糖(BMO)的MRS肉汤中生长。在指数期收集细胞，纯化RNA并转化成cDNA并在Illumina平台上测序。结果清晰显示了在BMO上生长期间的差异表达。

图1描述了整个基因组表达分析。该图表显示了所有婴儿双歧杆菌表达的基因的主要组分分析。该图表清晰的显示了生长于BMO上的细胞与生长与乳糖上的细胞的差异表达。577个基因差异表达，这表明比起在乳糖上的生长，在乳寡糖上的生长诱导婴儿双歧杆菌中不同的生理状态。

进一步分析表明，如图2所示，比起在乳糖上生长，先前在婴儿双歧杆菌中鉴定的40kb乳寡糖消耗基因簇在BMO上生长期间被优先诱导。这些结果清晰显示，生长在BMO上的婴儿双歧杆菌被活化用于乳寡糖的消耗，并且上调一些列参与新生儿结肠定殖和宿主界面的其它基因，包括Blon_2334，Blon_2335，Blon_2336，Blon_2337，Blon_2338，Blon_2339，Blon_2344，Blon_2346，Blon_2347，以及Blon_2331。

实施例6.用于治疗孕妇的治疗性组合物的制备。

制品1是通过如下方式制备：首先将实施例4的ABI产品用药物级乳糖稀释，以提供每克250亿cfu长双歧杆菌婴儿亚种的剂量。然后将这一稀释的ABI产品包装在由胃耐受聚合物(如果胶)制造的2片凝胶胶囊(1g/凝胶胶囊)中，以递送形式，在远离胃的胃肠道内释放其内含物，提供每胶囊250亿cfu活化的长双歧杆菌婴儿亚种的剂量。

制备制品2是通过将实施例4的ABI产物与实施例2的BMO/SPF组合物混合，从而将250亿cfu的长双歧杆菌婴儿亚种(干燥产物的170mg)与5g实施例2的BMO/SPF组合物混合。制品2提供了250亿cfu长双歧杆菌婴儿亚种与约2.5g BCO/SPF的比例，并且将这一混合物包装在用水和氧不透性的聚合物制成的药囊中。

实施例7.向孕妇给予组合物

生产实施例6(ABI)的制品1的组合物，并且将产品包装在由胃耐受聚合物(如果胶)制造的2片凝胶胶囊(1g/凝胶胶囊)中，以提供每胶囊250cfu亿活化的长双歧杆菌婴儿亚种的剂量。使用实施例6的制品2的干燥产物制造第二制品，并且将该产品包装在用水和氧不透性的聚合物制成的药囊中，以提供每药囊250亿重复长双歧杆菌婴儿亚种加上2gBMO/SPF(5g实施例2的BMO/SPF组合物)的剂量。

妇女在除怀孕的至少妊娠未三个月的妊娠期间口服本文所述的组合物。对于初期处理，如实施例6所述，在处理的前两周，向孕妇每日提供两胶囊的制品1。这一步骤在妇女肠道中建立长双歧杆菌婴儿亚种群体。对于处理的后续几周，向妇女提供每日4个药囊的实施例6的制品2，以在其肠道中将长双歧杆菌婴儿亚种维持在高水平。全天服用4个药囊，每餐一个，以及睡前一个。药囊的内含物可与牛奶、酸奶或布丁混合，以帮助口服。如果通过粪便微生物分析测出长双歧杆菌婴儿亚种的水平降至低于用实施例6的制品1进行2周预处理结束时建立的水平的25％，则将受试对象返回额外2周的制品2的处理。根据可选的实施方式，本发明的组合物可类似的被给予。应当持续给予，直到婴儿出生。处理导致通过阴道分娩的婴儿具有高得多的适当接种有源于母亲的长双歧杆菌婴儿亚种的可能性。

实施例8.组合物的应用，所述组合物包含双歧杆菌，其具有表达的岩藻糖苷酶，以改善婴儿的健康。

将实施例4(活化的长双歧杆菌婴儿亚种——细菌计数为130×10⁹cfu/g)的最终干燥产物与药物级乳糖混合，以达到细菌计数为约25×10⁹cfu/g，并且将其以每药囊500mg(12.5×10⁹cfu)的质量包装在用抗水和氧性材料制成的药囊中。将一个药囊的内含物提供给每天只接收母乳达6个月的新生儿。打开包装，将内含物腾到加有几滴母乳的小杯子中，以制成水样糊(watery paste)。然后用钝端的塑料滴管或父母的指尖将其提供给婴儿。如果婴儿每天消耗日常组分的至少75％，就可获得最佳结果。婴儿粪便微生物的监测将指示粪便中婴儿双歧杆菌的水平将占粪便总微生物量的20％以上。无论婴儿是通过阴道分娩的，还是尤其是通过剖腹产出生的，都应该向所有婴儿提供该组合物。

一些正在哺育她们婴儿的母亲，通过基因测试测定，可能由于缺乏α1-2-岩藻糖转移酶(FUC-2)，而在其母乳中缺乏某种复合岩藻糖化寡糖。对于具有基因型FUC-2的母亲，含有实施例4的ABI产品的药囊应该补充有包含合成生产和纯化的岩藻糖化寡糖(SPF)的BCO组合物，如实施例2所述，其BCO∶SPF的比例约为2∶1。制备这些药囊来递送每药囊12.5×10⁹cfu的ABI和1g BCO加上0.5g岩藻糖乳糖(即，每药囊100mg实施例4的未稀释的ABI加上2.5g实施例2的BCO加上0.5g岩藻糖乳糖)。如上所述，该组合物仅以ABI的药囊每天提供持续6个月。

对于接受混合喂养(母乳和婴儿配方)或仅接受婴儿配方的婴儿，将实施例4的ABI产品与实施例2的牛初乳寡糖浓缩组合物混合。包含约40％乳糖和约40％复合寡糖(BCO)的干燥牛初乳寡糖的组合物是根据实施例2制备的，并将其以5g/药囊(12.5×10⁹cfu)的剂量(即，2g BCO/约囊)——BCO药囊，包装在抗水性药囊中。包含实施例4的ABI产品的混合物的额外药囊导致递送每药囊12.5×10⁹cfu ABI和2g BCO(约100mg实施例4的未稀释的ABI加上5g实施例2的BCO)——掺混(BLEND)药囊。向接受混合喂养或仅接受婴儿配方的婴儿每天提供一个掺混药囊的内含物，通过打开药囊，并将其内含物溶解于准备的液体婴儿配方中，并在晨间喂食中将其提供给婴儿。12小时后，重复该步骤，但是用BMO药囊(无ABI)与婴儿配方一起递送，如掺混药囊所述。该日常循环(晨间用掺混，晚上用BMO)重复至少生命的最初6个月。婴儿粪便微生物的监测将指示，粪便中婴儿双歧杆菌的水平将占粪便总微生物量的20％以上。对所有婴儿，无论他们是阴道分娩，或是剖腹产的，只要他们不是纯母乳喂养的，都应该维持这个例行程序。或者，每天两次仅向该婴儿提供掺混药囊，提供的掺混药囊仅由每药囊6×10⁹cfu ABI制备。

这些膳食补充会将婴儿下肠道中的长双歧杆菌婴儿亚种的浓度增加至通过阴道分娩的、母乳喂养的婴儿中历史观察到的水平，并且将显著降低可能引起婴儿绞痛的病原菌爆发的可能性。这种补充也会显著提高婴儿胃肠粘膜和粘膜免疫应答的发展速度。根据可选的实施方式，本发明的组合物可类似的被给予。

参考文献

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Claims

1.一种包含活化的双歧杆菌(Bifidobacterium)的组合物。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述活化的双歧杆菌包含转运系统，所述转运系统能够在所述寡糖被水解前内化一种或多种寡糖，并且还能水解所述内化的寡糖，其中所述寡糖具有在哺乳动物乳中发现的寡糖的结构。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述哺乳动物乳是人、牛、猪、兔、山羊、绵羊、骆驼、水牛乳，或其混合物。

4.如权利要求1-3中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述活化的双歧杆菌已经在至少一种哺乳动物乳寡糖存在的情况下培养。

5.如权利要求1-4中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述活化的双歧杆菌与在缺少复合寡糖的情况中培养的同种双歧杆菌相比，具有对哺乳动物粘膜细胞更高的结合亲和力。

6.如权利要求1-5中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述双歧杆菌包含上调的选自下组的基因：Blon_0042，Blon_R0015，Blon_R0017，Blon_R0021，Blon_R0022，及其组合。

7.如权利要求1-6中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述双歧杆菌包含下调的选自下组的基因：Blon_0518，Blon_0785，Blon_2167，Blon_2168，及其组合。

8.如权利要求1-7中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述双歧杆菌包含上调的Blon_0042基因。

9.如权利要求1-8中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述双歧杆菌包含下调的Blon_2168基因。

10.如权利要求1-9中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述双歧杆菌包含上调的选自下组的基因：Blon_2334，Blon_2335，Blon_2336，Blon_2337，Blon_2338，Blon_2339，Blon_2344，Blon_2346，Blon_2347，和Blon_2331。

11.如权利要求1-10中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述双歧杆菌表达编码唾液酸酶或岩藻糖苷酶的基因。

12.如权利要求1-11中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述双歧杆菌表达编码唾液酸或岩藻糖转运子的基因。

13.如权利要求1-12中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述双歧杆菌以10亿cfu/g-5000亿cfu/g的浓度存在。

14.如权利要求1-13中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述双歧杆菌以10亿cfu/g-1000亿cfu/g的浓度存在。

15.如权利要求1-14中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述双歧杆菌以100亿cfu/g-500亿cfu/g的浓度存在。

16.如权利要求1-15中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述双歧杆菌是长双歧杆菌(B.longum)、短双歧杆菌(B.breve)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)或假小链双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)。

17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述双歧杆菌是长双歧杆菌婴儿亚种(B.longum subsp.infantis)。

18.如权利要求1-17中任何一项所述的组合物，其特征在于，还包含分离的复合寡糖。

19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述复合寡糖是从哺乳动物乳源中分离的。

20.如权利要求19所述的组合物，其特征在于，所述哺乳动物乳源是人、牛、猪、兔、山羊、绵羊或骆驼。

21.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述牛来源是来自于牛乳、牛初乳、牛初乳浓缩物，或其混合物。

22.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述复合寡糖来自于乳清渗透物。

23.如权利要求19-22中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述复合寡糖包含以下至少一种：(3Hex，4HexNac，1Fuc)，(1Gal，1GlcNAc，1NeuAc)，或(1Glu，1Gal，1NeuAc(3’或6’))。

24.如权利要求19-23中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述复合寡糖小于50％被岩藻糖化。

25.如权利要求19-24中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述牛初乳寡糖包含Hex(4)，Hex(4)HexNAc(2)，或Hex(3)HexNAc(1)NeuAc(1)中任意一种，其水平高于1％。

26.如权利要求19-25中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述复合寡糖包含以下组成比例的一种：1)Hex(2)NeuAc(1)：Hex(2)HexNAc(1)的比例低于5.0；2)Hex(2)HexNAc(1)：Hex(3)HexNAc(1)的比例高于1.0；3)Hex(2)HexNAc(1)：Hex(3)HexNAc(2)的比例高于2.0；4)Hex(3)：Hex(3)HexNAc(1)NeuAc(1)的比例低于100；或5)Hex(2)HexNAc(1)：Hex(4)NeuAc(2)NeuGc(1)的比例高于10。

27.如权利要求19-26中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述复合寡糖是所述组合物重量的至少20％。

28.如权利要求19-27中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述复合寡糖是所述组合物重量的至少50％。

29.如权利要求19-28中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述复合寡糖是所述组合物重量的至少80％。

30.如权利要求19-29中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述复合寡糖还包含岩藻糖乳糖、唾液酸乳糖或其衍生物。

31.如权利要求30所述的组合物，其特征在于，所述岩藻糖乳糖、唾液酸乳糖或其衍生物是以下合成生产和纯化的寡糖：2’-岩藻糖乳糖，3-岩藻糖乳糖，二岩藻糖乳糖，乳糖-N-岩藻糖戊糖I，乳糖-N-岩藻糖戊糖II，乳糖-N-岩藻糖戊糖III，乳糖-N-岩藻糖戊糖V，3’-唾液酸乳糖，6’-唾液酸乳糖，3’-唾液酸-3-岩藻糖乳糖，唾液酸乳糖-N-四糖，6′-唾液酸乳糖胺，或其混合物。

32.如权利要求30-31所述的组合物，其特征在于，所述岩藻糖乳糖和/或唾液酸乳糖包含总寡糖的1-5％。

33.如权利要求30-31中任一项所述的组合物，其特征在于，所述岩藻糖乳糖和/或唾液酸乳糖包含总寡糖的5-20％。

34.如权利要求30-31中任一项所述的组合物，其特征在于，所述岩藻糖乳糖和/或唾液酸乳糖包含总寡糖的20-50％。

35.如权利要求31-34中任一项所述的组合物，其特征在于，复合寡糖与岩藻糖乳糖和/或唾液酸乳糖的质量比为20∶1-1∶10。

36.如权利要求1-35中任何一项所述的组合物，其特征在于，还包含次级代谢物。

37.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述次级代谢物包含短链脂肪酸。

38.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述次级代谢物包含乙酸盐、乳酸盐，或其组合。

39.如权利要求1-38中任何一项所述的组合物，其特征在于，还包含稳定剂。

40.如权利要求39所述的组合物，其特征在于，所述稳定剂是流动剂。

41.如权利要求40所述的组合物，其特征在于，所述稳定剂是乳蛋白。

42.如权利要求1-41中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物是干燥粉末，悬浮于油中的干燥粉末，或是溶液的形式。

43.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述组合物是喷雾干燥或冷冻干燥的。

44.如权利要求43所述的组合物，其特征在于，所述组合物是在合适的冷冻保护剂存在的情况下冷冻干燥的。

45.如权利要求44所述的组合物，其特征在于，所述合适的冷冻保护剂是葡萄糖、乳糖、棉子糖、蔗糖、海藻糖、核糖醇、甘油、甘露醇、甲醇、聚乙二醇、丙二醇、核糖醇、海藻酸盐、牛血清白蛋白、肉碱、柠檬酸盐、半胱氨酸、葡聚糖、二甲亚砜、谷氨酸钠、甘氨酸甜菜碱、糖原、亚牛磺酸、蛋白胨、聚乙烯吡咯烷酮或牛磺酸。

46.如权利要求1-45中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物是小包装、药囊、口腔崩解片、食品、胶囊、锭剂、泡腾片、栓剂或灌肠剂形式。

47.如权利要求46所述的组合物，其特征在于，所述胶囊或片剂具有肠衣。

48.如权利要求47所述的组合物，其特征在于，所述肠衣包括以下一种或多种：脂肪酸、腊、虫胶、塑料、植物纤维、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、琥珀酸乙酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯、聚乙烯乙酸邻苯二甲酸酯(PVAP)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸偏苯三酸纤维素、海藻酸钠、以及玉米醇溶蛋白。

49.一种改善哺乳动物胃肠道健康的方法，包括向有需要的对象给予治疗有效量的如权利要求1-18中任一项所述的组合物。

50.一种提高哺乳动物胃肠道中双歧杆菌的浓度的方法，所述方法通过向对象给予治疗有效量的如权利要求1-18中任一项所述的组合物来进行，从而增加所述哺乳动物粪便中所述给予的双歧杆菌的水平至大于该粪便中发现的微生物总量的10％。

51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物粪便中所述给予的双歧杆菌的水平的增加是高于该粪便中发现的微生物总量的20％。

52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物粪便中所述给予的双歧杆菌的水平的增加是高于该粪便中发现的微生物总量的50％。

53.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物粪便中所述给予的双歧杆菌的水平的增加是高于该粪便中发现的微生物总量的70％。

54.如权利要求49-53中任何一项所述的方法，其特征在于，还包括向所述对象给予复合寡糖。

55.如权利要求54中任何一项所述的方法，其特征在于，一起或分开提供所述复合寡糖和双歧杆菌。

56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖作为溶液提供，且所述双歧杆菌作为肠衣片或胶囊提供。

57.如权利要求54-56中任何一项所述的方法，其特征在于，所述组合物在液体组合物中提供，并包含约1g/L-50g/L水平的复合寡糖。

58.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖和述双歧杆菌以干燥形式，并作为肠衣片或胶囊提供。

59.如权利要求54-58中任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖来自于分离的哺乳动物乳源。

60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物乳源是人、牛、猪、兔、山羊、绵羊或骆驼。

61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述牛来源是牛乳、牛初乳或牛初乳浓缩物。

62.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖来自于乳清渗透物。

63.如权利要求54-62中任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖包含以下至少一种：(3Hex，4HexNac，1Fuc)，(1Gal，1GlcNAc，1NeuAc)，或(1Glu，1Gal，1NeuAc(3’或6’))。

64.如权利要求54-63中任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖小于50％被岩藻糖化。

65.如权利要求61-64中任何一项所述的方法，其特征在于，所述牛初乳寡糖包含Hex(4)，Hex(4)HexNAc(2)，或Hex(3)HexNAc(1)NeuAc(1)中任意一种，其水平高于1％。

66.如权利要求54-65中任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖包含以下组成比例的一种：1)Hex(2)NeuAc(1)：Hex(2)HexNAc(1)的比例低于5.0；2)Hex(2)HexNAc(1)：Hex(3)HexNAc(1)的比例高于1.0；3)Hex(2)HexNAc(1)：Hex(3)HexNAc(2)的比例高于2.0；4)Hex(3)：Hex(3)HexNAc(1)NeuAc(1)的比例低于100；或5)Hex(2)HexNAc(1)：Hex(4)NeuAc(2)NeuGc(1)的比例高于10。

67.如权利要求54-66中任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖是所述组合物重量的至少20％。

68.如权利要求54-67中任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖是所述组合物重量的至少50％。

69.如权利要求54-68中任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖是所述组合物重量的至少80％。

70.如权利要求54-69中任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖还包含岩藻糖乳糖、唾液酸乳糖或其衍生物。

71.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述岩藻糖乳糖、唾液酸乳糖或其衍生物是以下合成生产和纯化的寡糖：2’-岩藻糖乳糖，3-岩藻糖乳糖，二岩藻糖乳糖，乳糖-N-岩藻糖戊糖I，乳糖-N-岩藻糖戊糖II，乳糖-N-岩藻糖戊糖III，乳糖-N-岩藻糖戊糖V，3’-唾液酸乳糖，6’-唾液酸乳糖，3’-唾液酸-3-岩藻糖乳糖，唾液酸乳糖-N-四糖，6′-唾液酸乳糖胺，或其混合物。

72.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述岩藻糖乳糖和/或唾液酸乳糖包含总寡糖的1-5％。

73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述岩藻糖乳糖和/或唾液酸乳糖包含总寡糖的5-20％。

74.如权利要求73所述的方法，其特征在于，所述岩藻糖乳糖和/或唾液酸乳糖包含总寡糖的20-50％。

75.如权利要求71-74中任一项所述的方法，其特征在于，复合寡糖与岩藻糖乳糖和/或唾液酸乳糖的质量比为20∶1-1∶10。

76.如权利要求54-75中任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖在给予双歧杆菌之前给予。

77.如权利要求54-76中任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖与双歧杆菌同时给予。

78.如权利要求54-77中任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖在双歧杆菌之后给予。

79.如权利要求54-78中任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖以1-20克的日剂量提供。

80.如权利要求54-79中任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖以1-10克的日剂量提供。

81.如权利要求49-80中任何一项所述的方法，其特征在于，所述双歧杆菌以10亿-1000亿菌落形成单位(CFU)的日剂量提供。

82.如权利要求49-81中任何一项所述的方法，其特征在于，所述双歧杆菌以100亿-500亿CFU的日剂量提供。

83.如权利要求49-82中任何一项所述的方法，其特征在于，所述有需要的对象经每天一剂量给药，或全天以适当的间隔多次(如两次、三次、四次、五次、六次或更多次)亚剂量给药。

84.如权利要求49-83中任何一项所述的方法，其特征在于，所述组合物是口服或直肠给药的。

85.如权利要求49-84中任何一项所述的方法，其特征在于，还包括监测哺乳动物粪便中双歧杆菌的水平。

86.如权利要求49-85中任何一项所述的方法，其特征在于，所述组合物给予至少5天。

87.如权利要求49-86中任何一项所述的方法，其特征在于，所述组合物给予30-360天。

88.如权利要求49-87中任何一项所述的方法，包括向有需要的对象以一定量和持续一定时间给予如权利要求1-48中任何一项所述的组合物的剂量，其中双歧杆菌群体在所述对象的肠中建立。

89.如权利要求88所述的方法，还包括向对象以一定量和持续一定时间给予如权利要求1-48中任何一项所述的组合物的剂量，其中双歧杆菌群体在所述对象的胃肠道中维持。

90.如权利要求79-89所述的方法，其特征在于，所述剂量给予至少10天，以维持双歧杆菌的水平高于该哺乳动物总粪便微生物的至少5％。

91.如权利要求79-90所述的方法，其特征在于，所述剂量给予至少10天，以维持双歧杆菌的水平高于该哺乳动物总粪便微生物的至少20％。

92.如权利要求79-91所述的方法，其特征在于，所述剂量给予至少10天，以维持双歧杆菌的水平高于该哺乳动物总粪便微生物的至少50％。

93.如权利要求49-92中任何一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人、牛、猪、兔、山羊、绵羊、猫、狗、马、水牛或骆驼。

94.如权利要求93所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人类婴儿。

95.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述婴儿是经由剖腹产分娩的。

96.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述婴儿是通过阴道分娩的。

97.如权利要求94-96中任何一项所述的方法，其特征在于，所述婴儿是用不含有可察觉量的哺乳动物乳寡糖的婴儿配方喂养的。

98.如权利要求94-97中任何一项所述的方法，其特征在于，所述婴儿是从出生到怀孕后36个月。

99.如权利要求94-97中任何一项所述的方法，其特征在于，所述婴儿是从出生到断奶的年龄。

100.如权利要求94-99中任何一项所述的方法，其特征在于，所述婴儿由母亲喂养，所述母亲经基因测试检测为FUC-2缺乏型或其母乳中缺少复合岩藻糖化的寡糖。

101.如权利要求93所述的方法，其特征在于，所述人类是孕妇。

102.如权利要求101所述的方法，其特征在于，所述孕妇处于至少怀孕末三个月。

103.如权利要求49-101中任何一项所述的方法，其特征在于，所述对哺乳动物健康的改善是婴儿腹绞痛的减少。

104.如权利要求49-103中任何一项所述的方法，其特征在于，所述对哺乳动物健康的改善是加速婴儿免疫系统的发育。

105.如权利要求49-104中任何一项所述的方法，其特征在于，所述对哺乳动物健康的改善是婴儿双歧杆菌(B.infantis)在婴儿胃肠道定殖的结果，通过粪便分析测量，所述婴儿双歧杆菌的水平高于肠道总微生物的20％。

106.一种制备活化的双歧杆菌的方法，所述方法包括通过在使Blon_0042基因上调，使Blon_2168基因下调，或其组合的条件下孵育双歧杆菌来培养该细菌。

107.一种制备活化的双歧杆菌的方法，所述方法包括通过在特定条件下孵育双歧杆菌来培养该细菌，所述特定条件使基因Blon_2334，Blon_2335，Blon_2336，Blon_2337，Blon_2338，Blon_2339，Blon_2344，Blon_2346，Blon_2347，以及Blon_2331中的任一种上调。

108.一种制备活化的双歧杆菌组合物的方法，包括(a)从婴儿粪便中分离双歧杆菌，(b)纯化所述细菌，(c)用纯化的细菌菌株接种发酵罐，(d)在发酵罐中，在从哺乳动物乳源中分离的哺乳动物乳寡糖存在的条件下，孵育细菌，(e)收获细胞，和(f)纯化(e)中所得的细菌。

109.如权利要求108所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物乳寡糖来自于人类。

110.如权利要求108所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物乳寡糖来自于牛源。

111.如权利要求110所述的方法，其特征在于，所述牛源是牛初乳。

112.如权利要求108所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖在孵育期间至少存在于后对数期。

113.如权利要求108-112中任何一项所述的方法，其特征在于，所述复合寡糖以约1g/L-50g/L的水平，作为碳源存在。

114.如权利要求108-113中任何一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将步骤(e)中所得的纯化的双歧杆菌与复合寡糖组合。

115.如权利要求108-114中任何一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括测量岩藻糖苷酶或唾液酸酶的基因表达，其中检测岩藻糖苷酶或唾液酸酶的存在是活化的双歧杆菌的指示。

116.如权利要求108-115中任一项所述的方法，所述方法还包括干燥细胞。